Диссертации » Биологические науки » Молекулярная биология

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Создание рекомбинантных аденовирусов, экспрессирующих гены факторов роста кровеносных сосудов и изучение влияния этих вирусов на ангиогенез in vivo
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Создание рекомбинантных аденовирусов, экспрессирующих гены факторов роста кровеносных сосудов и изучение влияния этих вирусов на ангиогенез in vivo"

На правах рукописи

Авдеева Светлана Владимировна

СОЗДАНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ АДЕНОВИРУСОВ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ГЕНЫ ФАКТОРОВ РОСТА КРОВЕНОСНЫХ СОСУДОВ И ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ЭТИХ ВИРУСОВ НА АНГИОГЕНЕЗIN VIVO.

03. 00. 03. - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2005

Работа выполнена в Лаборатории молекулярной биотехнологии ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, а также на кафедре органической и биологической химии Московского Педагогического Государственного Университета

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук, профессор

Народицкий Борис Савельевич

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских наук,

профессор, академик РАЕН Альтштейн Анатолий Давыдовыч

доктор биологических наук Забережный Алексей Дмитриевич

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ - Медико-генетический научный центр РАМН (адрес: 115478, г. Москва, ул. Москворечье, 1)

диссертационного Совета Д 001.20.01 при ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (адрес: 123098 г. Москва, ул. Гамалеи, 16)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ вирусологии им. Д.И Ивановского РАМН

Защита диссертации состоится у^л/ъ

2005 г. в

12

часов на заседании

Ученый секретарь диссертационного Совета, доктор медицинских наук

Н.П. Коеякова

ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время для доставки различных терапевтических генов в органы и ткани млекопитающих широко применяются векторы на основе вирусов человека и животных. Вирусные векторные системы являются перспективными, поскольку вирус эффективно проникает в клетки и не требует использования дополнительных средств улучшения эффективности трансфекции Широко используемым инструментом для доставки генов в клетки млекопитающих являются векторы на основе аденовирусов

Наше исследование направлено на создание генно-инженерных конструкций, индуцирующих рост кровеносных сосудов в конечностях млекопитающих в результате доставки в ткани конечностей аденовирусных векторов, несущих гены факторов роста кровеносных сосудов. В качестве средства доставки данных генов в мышцы лабораторных животных нами были использованы вирусные векторы на основе аденовируса человека типа 5 (Ad5) и аденовируса птиц CELO Аденовирусные векторы широко применяются для транзиентной экспрессии генов в клетках млекопитающих in vivo и in vitro. Исследуется применение векторов на основе аденовирусов человека и животных в качестве живых рекомбинантных вакцин для ветеринарии и медицины, а также для генной терапии.

В качестве целевых генов для доставки в мышцы лабораторных животных мы использовали гены факторов роста кровеносных сосудов, поскольку возможность регуляции роста кровеносных сосудов это одна из задач, стоящих перед медицинской наукой и практикой Атеросклероз с постепенным сужением полости артерий и последующем уменьшением кровяного тока до сих пор остается одной из самых серьезных проблем в мире В человеческом организме в большей мере заболеваемости подвержены сердце (заболевание венечной артерии) и нижние конечности (периферическое сосудистое заболевание).

Известно, что в организме человека имеются естественные регуляторы роста кровеносных сосудов, способствующие образованию коллатсралей, обходящих места закупорки артерий. Такие белки можно использовать для индукции роста сосудов в пораженных органах. Однако белки-факторы роста кровеносных сосудов, при введении в организм, имеют короткий период полураспада, а для индукции роста сосудов нужно поддерживать необходимый уровень белка - ангиогена продолжительное время. По этому, для лечения ишемических заболеваний перспективными являются генно-терапевтические методы. Генная терапия предоставляет возможность для повышения в организме уровня белков - факторов роста кровеносных сосудов и поддержания его длительный период времени.

Существует множество факторов роста кровеносных сосудов, доставка которых в организм при помощи методов генной терапии, могла бы привести к лечебной неоваскуляризации. У большинства ангиогенных факторов уже исследуется механизм действия и эффективность индукции роста новых кровеносны* -сосудов^!} нщем исследовании мы использовали ген фактора роста эндотелия сосудов ^^^^пй^йМй^ЛКО).

1.

Цель н задачи исследования. Целью настоящей работы являлось получение рекомбинавтных аденовирусов на основе Ad5 и CELO, несущих гены ANG и VEGF, и исследование возможности индукции неоваскуляризации в результате внутримышечного введения полученных нами вирусов: CELO-ANG, CELO- VEGF и Ad-ANG лабораторным животным.

В связи с этим, в процессе работы предстояло решить следующие задачи-

1. Создание векторов на основе аденовируса птиц CELO, несущих гены ANG и VEGF, методом гомологичной рекомбинации в культуре клеток LMH (гепатома кур).

2. Создание вектора на основе аденовируса человека типа 5, несущего ген ANG методом гомологичной рекомбинации в культуре клеток 293 (эмбриональная почка человека).

3. Изучение действия VEGF и ANG, экспрессируемых рекомбинантными аденовирусами, на ангиогенез в конечностях лабораторных животных.

4. Разработка системы проверки биологической активности генов факторов роста кровеносных сосудов, находящихся в плазмидных векторах, при помощи трансфекции хорио-аллантоисной мембраны куриных эмбрионов.

5. Исследование антимикробной активности ангиогенина.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Созданы рекомбинантяые вирусы на основе аденовируса человека типа 5 и на основе аденовируса птиц CELO, несущие гены факторов роста кровеносных сосудов (VEGFi2i и ANG).

2. Показано, что созданные нами рекомбинашяые аденовирусы индуцируют прирост кровеносных сосудов в мышечной ткани конечностей лабораторных животных.

3. Отработана система проверки биологической активности генов факторов роста кровеносных сосудов, находящихся в плазмидных векторах, при помощи трансфекции хорио-аллантоисной мембраны куриных эмбрионов

4. Показано, что ANG не проявляет специфической антимикробной активности.

Научная новизна. Нами впервые были получены рекомбинантные аденовирусы CELO-ANG, CELO- VEGF и Ad-ANG, экспрессирующие факторы роста кровеносных сосудов.

Для проверки биологической активности генов факторов роста кровеносных сосудов, находящихся в плазмидных векторах, нами была отработана тест-система на основе

трансфекции хорио-аллантоисной мембраны куриных эмбрионов рекомбинантными плазмидами.

Была продемонстрирована возможность индукции неоваскуляризации в мышцах крыс после введения им рехомбинантных аденовирусов, несущих гены факторов роста кровеносных сосудов.

Нами проведено исследование антимикробной активности ангиогенина, в ходе которого показано, что ANG не проявляет специфической антимикробной активности.

Практическая значимость. Работа представляет не только научный, но и в перспективе практический интерес. Нами показано, что аденовирусные векторы, в том числе и векторы на основе Ad птиц CELO, осуществляют эффективный перенос терапевтических генов в мышечные клетки. В нашей работе была продемонстрирована возможность использования векторной системы на основе генома аденовируса птиц CELO в генной терапии ишемических заболеваний. Можно ожидать, что векторная конструкция на основе ДНК аденовируса птиц CELO после соответствующей модификации (инактивировации области GAM-1) окажется эффективной для использования в медицине, в частности в терапии ишимизированных конечностей у человека.

Апробация работы.

Отдельные положения работы представлялись на XV - м съезде зимней международной молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, февраль 2003). В завершенном виде результаты диссертационной работы были доложены на заседании кафедры органической и биологической химии Московского Педагогического Государственного Университета 21 марта 2005 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано пять печатных работ.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, глав: «Обзор литературы» (45 стр.), «Материалы и методы» (14 стр.), «Результаты» (29 стр.), «Обсуждение результатов» (10 стр.), выводов и списка литературы, включающего 216 библиографических ссылок. Работа изложена на 141 машинописных страницах, включая 7 таблиц и 23 рисунка.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Работа была проведена в лаборатории молекулярной биотехнологии ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им Н.Ф. Гамалеи РАМН, а также на кафедре органической и биологической химии Московского Педагогического Государственного Университета.

1. Материалы и методы исследования.

В экспериментальной части работы использован рекомбинантный аденовирус CELO-GFP, любезно предоставленный Шмаровым М.М. (ГУНИИЭМ им. Н Ф. Гамалеи), рекомбинантный аденовирус CELO-SEAP, любезно предоставленный Логуновым ДЮ. (ГУНИИЭМ им Н.Ф Гамалеи), аденовирус человека Ad5 - прототипный штамм, аденовирус птиц CELO штамм FELPS .

В работе использован лабораторный штамм Esherichia coli DH5a.

В работе использован клинический штамм Candida albicans и штамм Streptococcus pneumoniae №7465 (работа с данными штаммами проводилась в лаборатории молекулярной эпидемиологии госпитальных инфекций ГУНИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи).

В работе использовались клеточные линии: LMH (leghorn male hepatoma) предоставленная доктором М. Коттен (Австрия) и 293 (клетки эмбриональной почки человека, трансформированные Ad5).

Для биолошческих экспериментов использованы крысы линии Wistar (работа проводилась в виварии ИМГ)-

В работе использовались стандартные плазмидные векторы pCDNA3.1Zeo+ ("Promega"), pGREEN-la ("Gibco BRL"). Плазмиды pJM-17 и pFG140 получены от Dr. F Graham (McMaster University, Hamilton, Канада). Плазмида pAng3 любезно предоставлена д б н. Тарантулом В.З. (ИМГ).

Синтез дезоксиолигонуклеотидов проведен ЗАО «СИНТОЛ».

Трансфекцию клеточных линий проводили методом кальций-фосфатной преципитации (Graham & van der Eb, 1973) Все манипуляции, связанные с получением рекомбинантных аденовирусов проводили согласно Graham & Prevec (1991). Все генно-инженерные манипуляции проводились по стандартным методикам, изложенным в Maniatis et al. (1982).

Аденовирусы птиц CELO накапливали в куриных эмбрионах.

Детекцию экспрессируемых белков проводили методом электрофореза в ПААГ-ДСН в буферной системе Laemmli (1970) с последующим иммуноблоттингом Работа проводилась совместно с к.б.н. Верховской Л.В. (ГУНИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи).

Хирургические манипуляции с лабораторными животными проводились совместно с к м.н. Вороновым Д.А. (Российский научный центр хирургии) и с к.б.н. Хайдаровой Н.В. (ИМГ).

Гистологический анализ срезов мышц проводился совместно с к.м.н. Шереметьевой Г.Ф. (Российский научный центр хирургии).

Определение влияния ангиогенина на рост микроорганизмов проводилось совместно с к.м.н. Чернухой М.Ю. (ГУНИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи) и с д.м.н. Шагинян И.А. (ГУНИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи).

2. Результаты.

2.1. Конструирование рекомбинантных аденовирусов на основе генома аденовируса птиц CELO и генома аденовируса человека 5 серотипа.

2.1.1. Создание плазмидных конструкций, несущих гены ANG и VEGF.

Для создания плазмидной конструкции pS415ANG, несущей ген ангиогенина человека в составе фрагмента генома аденовируса CELO, нами была использована плазмйда p415CD, любезно предоставленная Логуновым Д.Ю, несущая фрагмент генома CELO от 88,8 до 100 ед. карты. В сайте делеции, несущественной для репликации вируса области (от 95,3 до 99,7 ед. карты) находится экспрессирующая кассета (эукариотический промотор ранней области цитомегаловируса - CMV, ген секретируемой щелочной фосфатазы - SEAP, сигнал полиаденилирования гормона роста КРС). Из данной плазмиды был выделен ген SEAP (вырезание по сайтам Nhe I, EcoR V) и на ej о место под промотор был клонирован ген ангиогенина из плазмвды pAng3, любезно предоставленной Тарантулом В 3. (вырезание по сайтам Nhe I, Sma I).

Для создания плазмидной конструкции pS415VEGF121, несущей ген VEGF в составе фрагмента генома аденовируса CELO нами была проведена серия клонирований Ген VEGFm был выделен из плазмиды pAdCMWEGF121, которая была любезно предоставлена R G. Crystal (США), по сайтам Kpn I, Sma I и по этим же сайтам клонирован в плазмиду pCDNA3.1Zeo+. Далее из полученной ялазмиды pCDNAVEGF121 ген VFGF121 был выделен по сайтам Afl II, Not I и по этим же сайтам клонирован в описанную выше плазмиду р415CD под эукариотический промотор вместо гена SEAP.

Для создания плазмидной конструкции pSAdANG51, несущей ген ангиогенина человека в составе фрагмента генома аденовТируса человека 5 серотипа, ген ANG из плазмиды pAng3 (вырезание по сайтам Nhe I, Sma I) был клонирован в плазмиду р51. Данная плазмида содержит фрагмент генома аденовируса человека 5 серотипа от 0 до 16,! ед. карты, в месте делеции El области генома Ad5 находится экспрессирующая кассета, состоящая из промотора ранней области цитомегаловируса, гена SEAP и сигнала полиаденилирования гормона роста КРС. Ген SEAP был выделен из плазмиды р51 по сайтам Nhe I, EcoR V и под CMV промотор был клонирован ген ANG.

2.1.2. Анализ экспрессии гевов ANG и VEGF, содержащихся в плазмидных

векторах.

Нами отработана система проверки биологической активности генов, находящихся в плазмидных векторах, при помощи трансфекции хорио-аллантоисной мембраны (ХАМ) куриных эмбрионов. Ранее в статье Мертвецова Н.П. и др. сообщалось об использовании для этих целей рекомбинантной плазмиды, несущей ген ангиогенина, но не описывалась

методика нанесения плазмидной ДНК, и не приводились конкретные данные по результату опыта Для определения эффективности проникновения мы использовали плазмвду рОЯЕЕЫ-1а 50 мкл препарата плазмиды, содержащей 50 мкг ДНК, наносили на бумажный фильтр, который помещали на ХАМ куриных эмбрионов В качестве контроля на бумажный фильтр, помещенный на ХАМ куриных эмбрионов, наносили буфер ТЕ без плазмиды Как следует из результатов эксперимента (рис 1), плазмида, нанесенная на ХАМ, проникает в ее клетки и экспрессируегся, о чем свидетельствует появление клеток с зеленым свечением Аналогичное свечение наблюдалось и при введении меньшего количества (20 мкг/50 мкл) рОНЕЕШа Таким образом, было показано, что предложенный нами метод введения рекомбинантной плазмиды обеспечивает доставку и экспрессию репортерного гена

УФ ФАЗА

Рис 1 Экспрессия гена вРР в клетках хорио-аллантоисной мембраны куриных эмбрионов

УФ - ХАМ, обследованная в люминисценгном микроскопе при длине волны 490 нм, ФАЗА - ХАМ, обследованная в световом микроскопе

Далее мы провели испытание плазмиды р8415АНО, содержащей ген ангиогенина 8-ми дневные вРР куриные эмбрионы делили на 3 группы На ХАМ эмбрионов из первой группы помещали бумажные фильтры, пропитанные 50 мкл препарата плазмиды р5415А>ГС (концентрация ДНК 1 мкг/мкл) 2-ой группе аналогично наносили эквивалентные количества плазмиды рОНЕЕШа Для 3-ей группы использовался буфер ТЕ

Для каждого эмбриона определяли число кровеносных сосудов 1, 2 и 3 порядка, до и после опыта Прирост сосудов оценивали по разнице между этими значениями и сравнивали

для опытной и контрольной групп.

После 4-х дней инкубации мы наблюдали прирост сосудов в 1-ой (опытной) группе. Зва'йггельно меньший прирост наблюдался в 2-х контрольных 1руппах (рис 2). Сосудистая плотность в месте нанесения была значительно увеличена в опытной группе. Причем сосуды располагались подобно "спицам колеса", что совпадает с литературными данными по индукции роста кровеносных соудов в ХАМ белками-ангиогенами. Аналогичные результаты были получены для плазмид рБ415УК}Р и р8А«Ш>Ю51.

А-р5415АЫО Б-рС1ШгМ-1а В-ТЕ

Рис 2. Хорио-аллантоисная мембрана куриных эмбрионов, сфотографированная через 4 дня после помещения на нее бумажных фильтров, пропитанных препаратами плазмид.

Чтобы свести к минимуму влияние того, что хорио-аллантоисные мембраны куриных эмбрионов, взятых для опыта, изначально отличаются друг от друга по сосудистой плотности, подсчет сосудов был произведен как до, так и после опыта, а эффективность действия факторов оценивалась по приросту сосудов (разница между числом сосудов на 12 и на 8 дни инкубации). Таким образом, мы считали реальные цифры увеличения количества сосудов в каждом эмбрионе (таб. 1).

Таблица 1. Среднее число кровеносных сосудов, а также средний прирост сосудов, вычисленный по разнице между их числом до нанесения препаратов плазмид р8415Ап§, рОЮШЬМа, буфера ТЕ (8-ой день инкубации) и по окончании опыта (12-ый день инкубации).

Среднее число сосудов на 8-ой день инкубации Среднее число сосудов на 12-ый день инкубации Средний прирост кровеносных сосудов

1 порядок 2 порядок 3 порядок 1 порядок 2 порядок 3 порядок 1 порядок 2 поря -док 3 поря -док

pS415Ang 1.2 5.4 10 2.2 9.4 35 0.8 4 27

pGREEN-la 1.6 7.6 12 1.6 9.2 20 - 1.6 8

ТЕ 1.6 7.2 13 1.8 9.2 23 0.2 2 9

Общий прирост сосудов в опытной группе в 3 раза превышал результаты, полученные для контрольных групп (рис 3).

pS415Ang pGREBí-la

Рис. 3. Общий прирост кровеносных сосудов на ХАМ куриных эмбрионов.

Из полученных данных следует, что ангиогенин вызывает увеличение числа сосудов всех порядков, причем для 1 и 2-го порядка прирост двукратный, а для капилляров 3-го порядка трехкратный. По-видимому, ангиогенин прежде всего индуцирует рост сосудов с меньшим диаметром.

Приведенные выше результаты демонстрируют, что проникновение рекомбинантной плазмиды, содержащей ген ангиогенина человека и фрагмент генома аденовируса птиц CELO, эффективно индуцирует рост кровеносных сосудов в клетках хорио-аллантоисной мембраны куриных эмбрионов. Полученные данные позволяют использовать разработанную нами методику для тестирования биологической активности продуктов экспрессии генов факторов роста кровеносных сосудов, находящихся в составе рекомбинантных плазмид.

2.1.3. Получение аденовирусов CELO-ANG, CELO- VEGF и Ad-ANG методом гомологичной рекомбинации в культуре клеток.

Для получения аденовирусов CELO-ANG, CELO- VEGF, плазмидами pS415ANG и pS415VEGF121, совместно с фрагментом генома ДНК аденовируса птиц CELO от 0 до 99.7

ед. карты, полученным в результате гидролиза геномной ДНК CELO по эндонуклеазе рестрикции Swa I, трансфицировали клетки LMH. В результате гомологичной рекомбинации восстанавливалась инфекционность вирусного генома с включением экзогенной последовательности (промотора, гена фактора роста кровеносных сосудов и сигнала полиаденилирования), что приводило к генерации рекомбинантных вирусов CELO-ANG и CELO- VEGF (рис. 4).

Геномная ДНК адежяифуса птиц CELO |-1

Гнфодю

рестриитюой

Swal

h

Рекомбинация гомологичных участков лямцюй вирус»ойДНК

Ген ANG (VEGF)

Восстановление целостности

генома CELO

Геномная ДНК рскоыбинаитного аде*о»ируса CELO-ANC (CELO-VEGF)

Рис. 4. Схема получения рекомбинантных аденовирусов CELO-ANG и CELO- VEGF с использованием процесса гомологичной рекомбинации.

Для устранения контаминации препаратов CELO-ANG и CELO- VEGF вирусом CELO "дикого" типа (возможной из-за неполного гидролиза геномной ДНК CELO рестриктазой Swa I) была проведена их очистка методом повторного получения индивидуальных аденовирусных бляшек на культуре клеток LMH. Для доказательства отсутствия контаминации очищенных препаратов CELO-ANG и CELO- VEGF проводили ПЦР анализ с использованием двух пар праймеров (pSAAl/ р4 и р4/р5 или pVEGFl/ р4 и р4/р5).

Пара праймеров pSAAl/ р4 комплементарна участау гена ангиогенина и участку генома аденовируса птиц CELO после вставки.

Пара праймеров pVEGFl/ р4 комплементарна участку гена VEGF и участку генома

аденовируса птиц CELO после вставки

Пара праймеров р4/р5 комплементарна участку делегированного фрагмента генома CELO и участку генома CELO после вставки

Электрофореграммы результатов ПЦР представлены на рис 5-6

1 2 3 4 S 6 7 8 9 10 И 12

Рис 5 Электрофореграмма ПЦР анализа очищенных препаратов рекомбинантных вирусов (1-11 ПЦР анализ на наличие рекомбинангного вируса CELO-ANG с использованием пары праймеров pSAAl/ р4, 13-22 ПЦР анализ на наличие вируса CELO "дикого" типа с использованием пары праймеров р4/р5)

1 Отрицательный контроль - вода

2 Отрицательный контроль - ДНК из клеток LMH

3 Отрицательный контроль - ДНК вируса CELO "дикого" типа

4 Положительный контроль - плазмида pS415ANG

5-11 Пробы ДНК из клеток, зараженных вирусом CELO-ANG

12 Маркер молекулярных масс - ДНК фага \ гидролизованная рестриктазой Pst I

13 Отрицательный контроль-вода

14 Отрицательный контроль - ДНК из клеток LMH

15 Положительный контроль - ДНК вируса CELO "дикого" типа

16-22 Пробы ДНК из клеток, зараженных вирусом CELO-ANG

23 Маркер молекулярных масс - ДНК фага X, гидролизованная рестриктазой Pst I

l 2 5 4 5 6 7 8

I

9 10 i! 12 П 14 15

¡¡в

Рис 6 Элекгрофореграмма ПЦР анализа очищенных препаратов рекомбинантных вирусов (1-7 ПЦР анализ на наличие рекомбинантного вируса CELO- VEGF с использованием пары праймеров pVEGFl/ р4, 9-14 ПЦР анализ на наличие вируса CELO "дикого" типа с использованием пары праймеров р4/р5)

1 Отрицательный контроль - вода

2 Отрицательный контроль - ДНК из клеток LMH

3. Отрицательный контроль - ДНК вируса CELO "дикого" типа 4 Положительный коетроль - плазмида pS415VEGF121 5-7 Пробы ДНК из клеток, зараженных вирусом CELO- VEGF

8 Маркер молекулярных масс - ДНК фага \ гидролизованная рестрикгазой Pst I

9 Отрицательный контроль - вода

10 Отрицательный контроль-ДНК го клеток LMH

11 Положительный контроль - ДНК вируса CELO "дикого" типа 12-14 Пробы ДНК из клеток, зараженных вирусом CELO- VEGF

15 Маркер молекулярных масс - ДНК фага X, гидролизованная рестриктазой Pst I

Очевиден положительный результат в пробах, проанализированных на наличие ДНК рекомбинантных вирусов CELO-ANG и CELO- VEGF и отрицательный результат на присутствие ДНК вируса "дикого" типа в этих же пробах (Амплификация фрагмента ДНК размером ~ 950 п о в присутствии праймеров pSAAl/ р4 происходит при наличии в пробе ДНК рекомбинантного аденовируса CELO-ANG, фрагмент ~ 900 п о синтезируется в присутствии праймеров pVEGFl/ р4 при наличии в пробе ДНК рекомбинантного аденовируса CELO- VEGF, а фрагмент = 500 п о синтезируется в присутствии праймеров р4/р5 при наличии в пробе ДНК вируса CELO "дикого" типа)

Для получения аденовируса Ad-ANG, полученной плазмидой pSAdANG51 совместно с плазмидой pJM17, несущей полноразмерный геном делеционного мутанта dl309, котрансфицировали клетки линии 293 В результате гомологичной рекомбинации

получили вирус Ад5АЖт

Рекомбинантную природу генома Ас1-АМО подтверждали методом ПЦР с использованием праймеров, специфичных к рекомбинантной ДНК, а также к ДНК вируса без вставки.

Пара праймеров р8АА1/рАсНМ1Е1 комплементарна участку гена ангиогенина и участку генома Аё5

Пара праймеров рулЕ1К/рК1)25 комплементарна участку делегированного фрагмента генома АЛ5

Результат анализа показал наличие в препаратах вирусов Аб-АКО и отсутствие примеси вируса без вставки (Рис. 7)

ИМ 5 « 7 « * II 12 П 14 1$

Рис 7 Электрофореграмма ПЦР анализа очищенных препаратов рекомбинантных вирусов (1-7 ПЦР анализ на наличие рекомбинангного вируса Ad-ANG с использованием пары праймеров pSAAl/pAdRdlEl; 9-15 ПЦР анализ на наличие вируса Ad5 без вставки с использованием пары праймеров pwtElR/pKD25)

1. Отрицательный контроль - вода

2 Отрицательный контроль - ДНК из клеток линии 293

3. Отрицательный контроль - плазмида pJM17

4 Отрицательный контроль - плазмида pFG140 (инфекционная плазмида, несущая полный геном Ad5).

5 Положительный контроль-плазмида pSAdANG51

6-7 Пробы ДНК из клеток, зараженных вирусом Ad-ANG.

8 Маркер молекулярных масс - ДНК фага "К, гидролизованная рестриктазой Pst I

9. Отрицательный контроль - вода.

10. Отрицательный контроль - ДНК из клеток линии 293

11 Отрицательный контроль - плазмида pS AdANG51

12. Положительный контроль - плазмцца pJMl 7.

13. Положительный контроль - плазмида pFG140.

14-15 Пробы ДНК из клеток, зараженных вирусом Ad-ANG

Очевиден положительный результат в пробах, проанализированных на наличие ДНК рекомбинангного вируса Ad-ANG и отрицательный результат на присутствие ДНК вируса

Ad5 без вставки в этих же пробах (Амплификация фрагмента ДНК размером 850 п.о. в присутствии праймеров pSAAI/pAdRdlEl происходит при наличии в пробе ДНК рекомбинантного аденовируса Ad-ANG, а фрагмент ~ 950 п.о. синтезируется в присутствии праймеров pwtE!R/pKD25 при наличии в пробе ДНК вируса Ad5 без вставки).

Таким образом, нами впервые получены рекомбинантные аденовирусы CELO-ANG, CELO- VEGF и Ad-ANG Схема структуры геномов данных рекомбинантных вирусов представлена на рис. 8.

9с*.

и ASC СИУ Ä

a* VBGF ему

■4**>...............................•ттШЯШт^' ~-.ФтЗГ

Смь IM«* Wm

ЩУ

В IWI,—I.............

Рис. 8. Структурная организация геномов рекомбинантных аденовирусов CELO-ANG (A), CELO- VEGF (Б) и Ad-ANG (В). CMV - промотор ранней области цитомегаловируса человека; рА - сигнал полиаденилирования гормона роста быка; ANG -ген ангиогенина человека; е к - единицы физической карты; VEGF - ген VEGF121

2.1.4. Детекция экспрессия генов АЧв я \T5GF в культуре клеток, зараженных рекомбннантными аденовирусами СЕЬО-АКС и СЕЬО-УЕСР.

Определение экспрессии ангиогенина в культуре клеток Г.МН, зараженных CELO-АЫО, проводили с помошыо метода Вестерн-блотгинга с использованием моноклональных антител к ангиогенину человека. Для этого линия клеток ЬМН была трансдуцирована рекомбинантным аденовирусом CELO-ANG в дозе 10 б.о.е./клетку. Затем через 48 часов отбирали аликвоты культуральной среды и клеток. В качестве отрицательного контроля использовали аликвоты культуральной среды и клеток, зараженных вирусом СЕЕО-вЕАР. По данным анализа рекомбинантный ангиогенин детектировался как в клетках LMH, так и в

культуральной среде (рис 9)

12 3 4

Рис. 9 Иммунореплика детекции экспрессии рекомбинантного ангиогеиина человека в культуральной жидкости и клетках линии LMH, инфицированных рекомбинантными вирусами

Дорожка 1 - препарат белков культуральной жидкости (клетки LMH заражены вирусом CELO-ANG), дорожка 2 - препарат белков культуральной жидкости (клетки LMH заражены вирусом CELO- SEAP), дорожка 3 - препарат внутриклеточных белков (клетки LMH заражены вирусом CELO-ANG), дорожка 4 - препарат внутриклеточных белков (клетки LMH заражены вирусом CELO- SEAP)

Таким образом, нами была продемонстрирована экспрессия гена ангиогенина, находящегося в составе рекомбинантного вируса CELO-ANG, и способность ангиогенина секретироваться во внеклеточное пространство

Аналогично проводили определение экспрессии VEGF в культуре клеток LMH, зараженных вирусом CELO-VEGF (рис 10)

1 2 3

«fjMt, ¿ütfüttfe

* J- ^¿^¿Щрф'

Рис 10 Иммунореплика детекции экспрессии рекомбинантного VEGF121 человека в клетках линии LMH, инфицированных р екомби нантными вирусами

Дорожка 1 - положительный контроль - белок VEGF человека (производство фирмы Sigma, США), дорожка 2 - препарат внутриклеточных белков (клетки LMH заражены вирусом CELO-SEAP), дорожка 3 - препарат внутриклеточных белков (клетки LMH заражены вкусом CELO-VEGF).

Работа проводилась совместно с кбн Верховской JIB (ГУНИИЭМ им НФ Гамалеи)

2.2. Индукция неоваскуляризации в конечностях лабораторных животных после введения рекомбинантных аденовирусов, несущих гены факторов роста кровеносных сосудов.

2.2.1. Введение репортерных генов GFP и SEAP в клетки мышцы крысы при помощи рекомбинантных аденовирусов.

Все хирургические манипуляции с лабораторными животными проводились совместно с к м.н Вороновым Д А (Российский научный центр хирургии) и с к б.н

Хайдаровой Н В (ИМГ).

Переднюю большеберцовую мъшцу крыс линии Wistar однократно инъецировали вирусами CELO-GFP и Ad-GFP (109 б о е на животное) (рис 11), контрольным животным был введен буфер PBS На 3-ий день после инъекции срезы мышц исследовали в люминесцентном микроскопе и в видимом свете В клетках мышц животных, инъецированных рекомбинангными вирусами, при исследовании в люминесцентном микроскопе при длине волны 490 нм наблюдалась характерная для GFP флуоресценция (зеленое свечение) В клетках мышц животных контрольной группы такое свечение полностью отсутствовало

УЛЬТРАФИОЛЕТ ФАЗОВЫЙ КОНТРАСТ

Рис 11 Экспрессия гена GFP в клетках передней большеберцовой мышцы крысы УЛЬТРАФИОЛЕТ - передняя болыпеберцовая мышца крысы, обследованная в люминисцентном микроскопе при длине волны 490 нм, ФАЗОВЫЙ КОНТРАСТ - передняя болыпеберцовая мышца крысы, обследованная в световом микроскопе А - введение вируса Ad-GFP Б - введение вируса CELO-GFP В - введение буфера PBS,

После однократной инъекции рекомбинангного аденовируса CELO-SEAP (109 бое на животное) в переднюю большеберцовую мышцу крыс, активность SEAP в сыворотке крови крыс была максимальна на 3 день, постепенно уменьшаясь до 7 дня В качестве контроля использовалась сыворотка крови крыс, инъецированных вирусом CELO-GFP Активность SEAP на 3-ий день после инъекции составляла 0,825 мЕд/мл в опытной группе и 0,165 мЕд/мл в контрольной

Таким образом, используя вирусы CELO-GFP, Ad-GFP и CELO-SEAP, мы показали

способность векторов на основе аденовируса птиц CELO осуществлять доставку генов в клетки мышечной ткани и возможность экспрессии этих генов под контролем регуляторных элементов CMV.

2.2.2. Индукция неоваскуляризации в мышцах крыс после введения рекомбинантных аденовирусов, несущих гены факторов роста кровеносных сосудов.

Рекомбинантные аденовирусы CELO-ANG, CELO- VEGF и Ad-ANG были инъецированы крысам линии Wistar в переднюю болыпеберцовую мьппцу. В качестве контроля другим группам мышей проводили инъекцию рекомбинантного аденовируса CELO-SEAP, несущего ген секретируемого белка термостабильной щелочной фосфатазы или Ad-GFP, несущего ген зеленого флуоресцирующего белка. Препараты мышцы фиксировали в 10% растворе формалина, затем заключали в парафин. Срезы препарата окрашивали азокармином по Гейденгайну. Из исследуемой мышцы от каждой крысы получали 3 блока. Из каждого блока делали 3 среза и считали капилляры в 30 полях окулярной квадратной сетки. В каждой из исследуемых групп проводился непосредственный подсчет количества капилляров вне зоны продуктивного воспаления в 150 полях зрения окулярной квадратной сетки (по 5 животных в группе). Полученные данные обрабатывали методом вариационной статистики с использование критерия Стьюдента.

Гистологический анализ срезов мышц проводился совместно с к.м.н, Шереметьевой Г.Ф. (Российский научный центр хирургии).

На рис. 12 приведена типичная картина, наблюдаемая при анализе срезов под микроскопом.

В

мышечное волокно

кровеносный сосуд

Рис, 12. Гистологические срезы передней болыпеберцовой мышцы крыс, инъецированных рекомбинантными аденовирусами CELO-SEAP (А) и CELO-ANG (Б).

Срезы окрашены азокармином. Подсчет количества кровеносных сосудов проводили при-увеличении х280.

Очевидно преобладание количества кровеносных сосудов в одном из участков поля окулярной квадратной сетки среза из мышцы, инъецированной вирусом CELO-ANG, над количеством капилляров на аналогичном участке из мышцы, инъецированной CELO-SEAP. Аналогичная картина наблюдалась в мышцах, инъецированных рекомбинантными вирусами CELO- VEGF и Ad-ANG.

Прирост кровеносных сосудов оценивали по отношению количества капилляров в срезах мышц мышей из групп, инъецированных вирусами к количеству капилляров в срезах мышц мышей из контрольной группы, которой был введен буфер PBS. Гистологический анализ показал, что рекомбинантные аденовирусы CELO-ANG, CELO- VEGF и Ad-ANG вызвали заметный прирост кровеносных сосудов в М. tibialis anterior по сравнению со всеми контрольными группами животных (табл. 2, 3, 4, 5).

Прирост капилляров в мышцах животных, которым вводили вирусы, содержащие гены факторов роста кровеносных сосудов, по сравнению с количеством капилляров в мышцах животных из контрольных групп, статистически достоверен (р<0,01)

Таблица 2 Количество капилляров на срезах передней болыпеберцовой мышцы крыс, инъецированных рекомбинантными вирусами CELO (р<0,01)._

Группы животных (введенный вирус) Количество введенного вируса (в б.о.е.) Дни эксперимента Число сосудов в поле окулярной квадратной сетки

PBS 14 21

CELO-SEAP 3-10" 14 27,85

CELO-ANG 3-10* 14 33,03

CELO-VEGF з-юу 14 37

CELO-ANG+ CELO-VEGF з-ю" 14 35

Таблица 3. Количество капилляров на срезах передней большеберцовой мышцы крыс, инъецированных рекомбинантными вирусами CELO (в зависимости от времени проведения эксперимента) (р<0,01)._

Группы животных (введенный вирус) Количество введенного вируса (в б.о.е.) Дни эксперимента Число сосудов в поле окулярной квадратной сетки

CELO-SEAP 3-Ю9 14 27,1

CELO-SEAP 310" 28 30,08

CELO-ANG 3-Ю9 14 33,45

CELO-ANG 3-10" 28 34,9

Таблица 4. Количество капилляров на срезах передней большеберцовой мышцы крыс, инъецированных рекомбинантным вирусом CELO-ANG (в зависимости от дозы введенного вируса) (р<0,01)_

Группы животных (введенный вирус) Количество введенного вируса (в б.о.е.) Дни эксперимента Число сосудов в поле окулярной квадратной сетки

PBS 14 24

CELO-ANG ЭТО* 14 34,1

CELO-ANG 3 10" 14 31

Рекомбинантный аденовирус АсЬАЫО также вызвал прирост кровеносных сосудов в мышцах лабораторных животных по сравнению с контрольным вирусом АсНЮРР.

Таблица 5 Количество капилляров на срезах передней большеберцовой мышцы крыс, инъецированных рекомбинантными вирусами А<15. (р<0,01)___

Группы животных (введенный вирус) Количество введенного вируса (в б.о.е.) Дни эксперимента Число сосудов в поле окулярной квадратной сетки

PBS 14 23

Ad-GFP 10" 14 32

Ad-ANG 108 14 44

Таким образом, нами показано, что СЕТО-АЫО и СЕЕО-УЕОР индуцируют неоваскуляризацию в мышечной ткани лабораторных животных, однако индукция прироста кровеносных сосудов вирусом СЕЬО-УЕОР более значительна. УЕОР в качестве ангиогенного фактора в мировой науке исследуется уже давно. Известно, что он является мощным индуктором неоваскуляризации, но вызывает прирост «незрелых»

кровеносных сосудов. Ангиогенные свойства ANG только начинают исследоваться in vivo. Известные по литературным данным свойства ангиогенина позволяют предположить, что он индуцирует не только рост новых сосудов но и их созревание. По этому, не смотря на меньшую эффективность по сравнению с VEGF, использование ANG может являться эффективным для повышения качества новообразованных капилляров.

2.3. Исследование антимикробной активности ангиогенина.

В 2003 году группа ученых опубликовало статью "Ангиогенины новый класс антимикробных белков, вовлеченных во врожденный иммунитет". В данной статье описывается серия экспериментов с мышиным ангиогенином и ANG человека, в ходе которых доказывается способность данных белков угнетать рост различных условно патогенных микроорганизмов Это свойство человеческого ангиогенина показалось нам привлекательным для собственных исследований. Чтобы использовать открытие LV. Ноорег и коллег в наших исследованиях, необходимо было повторить описанный опыт Однако после постановки аналогичного опыта нами были получены результаты, не соответствующие результатам, описанным в статье L.V Ноорег.

В нашей работе мы использовали клинический штамм Candida albicans и штамм Streptococcus pneumoniae №7465. Для данных штаммов определяли логфазу Она оказалась равна 5 ч. Для определения влияния ангиогенина на рост данных микроорганизмов культуры засевали в L-бульон в концентрации 105 к.о.е./мл. Через 5 часов брали пробы объемом 1 мл, центрифугировали и добавляли к ним либо 10mM Na-P буфер, либо буфер PBS. Данные буферы либо не содержали никаких белков, либо содержали ангиогенин человека, либо бычий сывороточный альбумин (BSA) Пробы инкубировали в течение 2-х часов при 37°С, после этого проводили высев на плотные питательные среды (5%-ный кровяной агар для С. Albicans и candida-arap для S. pneumoniae), инкубировали в течение 48 часов (С. Albicans при 26°С и S pneumoniae при 37°С) и проводили подсчет колоний.

В исследовании L.V. Ноорег Candida albicans и Streptococcus pneumoniae, подращенные до логфазы, ресуспендировали в 10тМ натрий -фосфатном буфере с 70пМ и с 2цМ ANG, соответственно. После инкубации в течение 2-х часов при 37°С микроорганизмы раститровывали на чашках с питательной средой. В результате эксперимента наблюдали угнетение образования к.о е. С. Albicans и S. pneumoniae более чем на 99% по сравнению с группами, где в 10тМ натрий -фосфатный буфер ANG не f добавлялся. Кроме того, авторы обращают внимание на то, что угнетение образования к.о.е.

С. Albicans и S. pneumoniae прогрессивно уменьшается при увеличении концентрации NaCl в буфере от 75 до 150тМ (при 150тМ угнетение менее 1 %).

В нашем исследовании мы полностью повторили все условия опыта, описанного L.V. Ноорег. Мы использовали ANG человека производства фирмы "Sigma" (США), грибковый

микроорганизм Candida albicans и грамм- положительный бактериальный

микроорганизм Streptococcus pneumoniae. Мы исследовали влияние ANG человека на рост С Albicans и S pneumoniae с использованием 10тМ натрий -фосфатного буфера и буфера PBS (концентрация соли 150тМ). Однако, кроме контрольной группы, в которой использовался буфер без ANG, мы взяли контрольную группу, в которой в буфер был добавлен другой белок - бычий сывороточный альбумин (BSA). Результаты опытов представлены в таблице 6.

Таблица 6. Условия экспериментов и общее количество к.о.е. С. Albicans и S. pneumoniae в контрольных и опытных группах, в опытах, проведенных нами и L.V. Ноорег.

Микроорганизм № группы буфер белок Концентрация белка Результаты нашего эксперимента (число колоний) Результаты нашего эксперимента в% Результаты эксперимента L.V. Ноорег

Streptococcus pneumoniae 1 Na-P Буфер 10mM ANG 2цМ МО4 Угнетение роста на 82,14% Угнетение роста более чем на 99%

2 Na-P Буфер lOmM BSA 2цМ 2-Ю4 Угнетение роста на 64,3%

3 Na-P Буфер ЮшМ 5,6-104

4 Na-P Буфер lOmM ANG 0,2цМ 5,12-10'' Угнетение роста на 57,33%

5 Na-P Буфер lOmM BSA 0,2ц.М 3-104 Увеличение роста на 150%

6 Na-P Буфер lOmM 1,2-Ю4

7 Буфер PBS ANG 0,2цМ 3,52-103 Угнетение роста на 85,33%

8 Буфер PBS BSA 0,2цМ 4,6 104 Увеличение роста на 91,67%

9 Буфер PBS 2,4-104

Candida albicans 1 Na-P Буфер lOmM ANG 70пМ 0,39-10' Угнетение роста на 61% Угнетение роста более чем на 99%

2 Na-P Буфер 10тМ BSA 70nM 0,53 10J Угнетение роста на 47%

3 Na-P Буфер 10mM MO'

4 Буфер PBS ANG 70nM 1,8'103 Увеличение роста на 85,57% Угнетение роста менее чем на 1%

5 Буфер PBS BSA 70nM 2-103 Увеличение роста на 106,2%

6 Буфер PBS 0,97-103

PBS - буфер, содержащий 145mMNaC!

Na-P буфер lOmM - буфер, не содержащий NaCl

ANG - белок ангиогенина человека; BSA - бычий сывороточный альбумин

Ошибка титрования ±0,45 - ±0,12

Таким образом, по результатам наших экспериментов, в 10 тМ натрий- фосфатном буфере ANG в концентрации 2 цМ, использованной в работе Hooper L.V, действительно ингибирует рост С. albicans (на 61%), что соответствует опубликованным данным. Однако в контрольном эксперименте при тех же условиях BSA также ингибирует рост грибка (на 47%). Поскольку разница в ингибировании между ANG и BSA не является статистически достоверной, можно сделать вывод, что описанное ранее ингибирующее действие ангиогенина в концентрации 2 цМ на рост микроорганизмов неспецифично. Это первое несоответствие наших результатов с ранее опубликованными данными.

Более существенное несоответствие с ранее опубликованными данными было получено нами при работе с S. pneumoniae. В этом случае ингибирование роста микроорганизмов в присутствии 2 цМ ангиогенина в 10 тМ натрий - фосфатном буфере также оказалось не специфичным, поскольку соизмеримо с ингибированием роста S. pneumoniae при такой же концентрации BSA. При концентрации ANG на порядок более низкой (ОД рМ) (данная концентрация белка не была исследована L.V. Hooper и коллегами) действительно имеет место достоверное подавление роста этого грибка ANG. В буфере PBS как при добавлении ANG, так и при добавлении BSA мы наблюдали даже увеличение роста микроорганизмов, что также указывает на неспецифическое действие ANG и противоречит ранее опубликованным данным

Принципиальные различия наших результатов и данных, описанных в работе Hooper L.V., возможно, связаны с качеством использованных препаратов ANG человека (в работе L.V. Hooper и коллег использовался белок, выделенный из Е. coli в их лаборатории, а в нашем эксперименте использовался ANG производства фирмы Sigma (США)).

(Работа проводилась совместно с к м.н. Чернухой М.Ю. и д.м н. Шагинян И.А.)

3. Обсуждение.

Ишемическим заболеваниям подвержена значительная часть взрослого населения Земли. По этому, разработка эффективных и безопасных способов лечения ишемических заболеваний крайне важна.

Одним из способов лечения ишемических заболеваний является восстановление ангиогенеза путем повышения уровня белков - ангиогенов в организме. Для этого широко используется генная терапия. При помощи генно-терапевтических методов можно осуществлять доставку генов факторов роста сосудов в организм и поддерживать их экспрессию необходимый период времени Единожды трансфецированная клетка может экспрессировать генный продукт дни, недели, месяцы и даже более, в зависимости от используемого вектора и промотора. Для ангиогенной терапии этого вполне достаточно.

В настоящее время доставка и экспрессия генов in vivo наиболее эффективно осуществляется при помощи вирусных векторных систем, поскольку вирус более эффективно проникает в клетки и не требует использования дополнительных средств стимуляции трансфекции. Из вирусных векторов наиболее распространены векторы на основе геномов аденовирусов человека (особенно на основе Ad5 и Ad2) Однако, векторы на основе аденовирусов человека имеют некоторые недостатки они вызывают предсуществующий иммунный ответ в организме человека, векторы первого поколения имеют небольшую емкость генома, а также наращивание рекомбинантных аденовирусов человека в культуре клеток достаточно трудоемкий и материалоемкий процесс.

Векторная система на основе аденовируса птиц CELO также обещает стать эффективным средством генной терапии кардио-васкулярных заболеваний. Преимуществами использования вектора на основе птичьего аденовируса CELO являются:

1. Отсутствие в организме человека предсуществующего иммунного ответа против данного вируса. Показано, что иммунный ответ является одним из факторов, ограничивающих время экспрессии различных трансгенов, встроенных в геном векторов на основе Ад5 и других серотипов аденовирусов человека. Кроме того, известно, что CELO не способен к полноценному циклу репликации в клетках человека или млекопитающих и является по отношению к данным хозяевам дефектным.

2. Достаточная для вставки чужеродных генов пакующая емкость генома. В правой части генома вируса CELO возможна делеция, максимальный размер которой составляет 3619 пар оснований (п.о.). В область данной делеции может быть встроена экспрессирующая кассета (CMV-промотор, целевой ген и сигнал полиаденилирования).

3. Относительно низкая себестоимость получения терапевтического препарата. Известной особенностью аденовируса птиц CELO, обусловленной биологией вируса, является его способность расти в куриных эмбрионах. При заражении в дозе 107

б.о.е./эмбрион выход вируса составляет 109-10ю б.о.е, из одного эмбриона, что делает наращивание препаративных количеств рекомбинантных векторов CELO в куриных эмбрионах высокотехнологичным процессом с относительно низкой себестоимостью (куриные SPF эмбрионы являются хорошо изученной и безопасной системой для получения биологических препаратов)

Описанные свойства векторной системы на основе аденовируса птиц CELO позволяют рассматривать ее как дополнительную или альтернативную векторам на основе аденовирусов человека и других млекопитающих

Не менее важно, кроме выбора системы доставки, выбрать ген какого из факторов роста кровеносных сосудов использовать В настоящее время исследуются ангиогенные возможности таких факторов роста кровеносных сосудов как ангиогенин, VEGF, FGF-2, ростовой фактор гепатоцитов, инсулиноподобный ростовой фактор, PIGF, ангиопоэтан, освобождаемый тромбоцитами ростовой фактор, Hif-la, определенные интерлекины и др Наиболее часто и успешно в мировой науке используется система: аденовирус человека типа 5 и ген VEGF. В США завершена первая фаза клинических испытаний рекомбинантного вируса на основе генома Ad5 человека, являющегося репликационно дефектным и содержащего в месте делеции ранней El области ген, кодирующий VEGF 121 человека Идет подготовка ко второй фазе клинических испытаний данного рекомбинантного аденовируса.

В качестве генов факторов роста кровеносных сосудов нами были использованы ген широко изучаемого фактора роста эндотелия сосудов (VF.GF121) и ген пока недостаточно исследованного ангиогенина (ANG) Свойства данных ангиогенных белков и их биологическая активность сильно отличаются

Сконструированные нами рекомбинантные аденовирусы CELO-ANG, CELO- VEGF и Ad-ANG проявили статистически достоверный ангиогенный эффект in vivo Однако нельзя не обратить внимание на прирост капилляров в мышцах крыс, инъецированных CELO-SEAP и Ad-GFP, по сравнению с группой, инъецированной PBS Данный эффект прироста сосудов можно объяснить тем, что введенные вирусы сами по себе являются агентами, индуцирующими иммунный ответ, который сопровождается вовлечением факторов роста кровеносных сосудов, что может вызвать их прирост после введения вирусного вектора с репортерным геном. Нельзя исключить и эффект действия секретируемого белка щелочной фосфатазы, который также может вызывать определенный ответ иммунной системы организма.

Данные по индукции неоваскуляризации в мышцах крыс после введения рекомбинантных аденовирусов, несущих гены факторов роста кровеносных сосудов, показывают, что вирус CELO-ANG не имеет преимуществ в стимуляции роста сосудов по сравнению с вирусом CELO- VEGF. Однако нельзя говорить о нецелесообразности использования гена ANG, поскольку его биологические свойства, известные по литературным данным, позволяют предположить, что он не только стимулирует рост новых

капилляров, но и способствует их созреванию. Тем самым, ANG содействует не только количественному увеличению, но и качественному улучшению кровеносных сосудов Для VEGF индукция прироста «незрелых» кровеносных сосудов является существенным недостатком, который приводит к побочным эффектам VEGF - терапии, таким как образование отеков в инъецированных органах и тканях из-за «протекания» новообразованных сосудов. При введении в мышцы Ad-ANG эффективность индукции анпюгенеза значительно выше, чем при введении вирусов на основе CELO. Это можно объяснить тем, что эффективность проникновения вирусов на основе Ad5 в клетки мышц млекопитающих выше, чем вирусов на основе CELO. Повысить эффективность грансдукции CELO можно введя аминокислотную последовательность RGD (арг-гли-асп) в концевую часть фибера CELO.

Используемая нами векторная система на основе вируса CELO имеет ряд преимуществ в использовании, о которых говорилось выше, по сравнению с векторной системой на основе Ad5. Однако для того чтобы использовать рекомбинантные вирусы CELO в медицине, необходимо инактивировать некоторые гены, которые экспрессируют вирусные белки, являющиеся транскрипционными факторами. В частности необходимо модифицировать область GAM-1, экспрессирующую факторы, регулирующие транскрипцию генов в клетках кур и Orf 22, которая по современным представлениям отвечает за трансформацию клеток грызунов. Можно ожидать, что после модификации рекомбинантные вирусы на основе CELO окажутся эффективными для использования в генной терапии, в частности в терапии ишимизированных конечностей у человека. Что касается вируса Ad-ANG, то в настоящее время нет препятствий для клинических испытаний данного вируса

выводы

. 1. Впервые созданы рекомбинантные аденовирусы CELO, содержащие под контролем CMV-промотора гены ANG и VEGF In vitro в клетках линии LMH показана эффективная экспрессия генов ANG и VEGF, находящихся в составе геномов рекомбинантных вирусов.

2. Впервые создан рекомбинантный аденовирус человека 5 серотипа, несущий ген

ANG.

3 Показано, что рекомбинантные аденовирусы CELO-ANG, CELO- VEGF и Ad-ANG вызвали заметный прирост (18-37%) кровеносных сосудов в М. tibialis anterior крысы по сравнению с контрольными группами животных.

4. Разработана тест-система проверки биологической активности генов факторов роста кровеносных сосудов, находящихся в плазмидных векторах, при помощи трансфекции хорио-аллантоисной мембраны куриных эмбрионов. Показано, что проникновение рекомбинантных плазмвд, содержащих гены VEGF и ANG человека, эффективно индуцируют рост кровеносных сосудов в клетках хорио-аллантоисной мембраны куриных эмбрионов.

5. Исследована антимикробная активность ангиогенина. Показано, что ANG не проявляет специфической антимикробной активности.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Авдеева C.B., Хайдарова Н.В, Логунов Д.Ю., Неугодова Г.Л., Севастьянова Г.А, Тарантул В.З., Народнцкий B.C. "Индукция неоваскуляризации в хорио-аллантоисной мембране куриных эмбрионов, трансфецированной рекомбинантной плазмидой, содержащей ген ангиогенина человека". Мол. Ген. Микробиол. Вирусол 2003;(4):32-35.

2. Авдеева C.B., Воронов Д.А., Хайдарова Н.В., Шмаров М.М, Логунов Д.Ю., Черенова Л.В., Верховская Л В., Шереметьева Г.Ф., Гавриленко A.B., Тарантул В.З., Народицкий Б.С., Бочков Н.П., Константинов Б.А., Свердлов Е.Д. "Рекомбинантный аденовирус птиц CELO-ANG, несущий ген ангиогенина человека, индуцирует неоваскуляризацию в передней большеберцовой мышце крысы". Мол Ген Микробиол. Вирусол 2004;(4):38-40.

3. Авдеева C.B., Логунов Д.Ю., Севастьянова Г.А. "Трансфекция клеток хорио-аллантоисной мембраны куриных эмбрионов плазмидными векторами, несущими репортерные гены GFP и SEAP". XV зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 2003.

4. Авдеева C.B., Хайдарова Н.В., Севастьянова Г.А. "Ангиогенез в хорио-аллантоисной мембране куриных эмбрионов после трансфекции плазмидными векторами, несущими гены ангиогенина и VEGF,2i". XV зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 2003.

5. Хайдарова Н.В., Суркова И.К., Авдеева C.B., Воронов Д.В., Шереметьева Г.Ф., Кочарян Е.З. "Создание генно-инженерных конструкций, содержащих ген ангиогенина и изучение их ангиогенного эффекта". 3-ий съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГиС) «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития», Москва, 2004.

Принято к исполнению 25/04/2005 Исполнено 26/04/2005

Заказ №791 Тираж 90 экз

ООО «13-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 ^»чу.аЩогеГега! ги

Р-8259

РНБ Русский фонд

2006-4 5676

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Авдеева, Светлана Владимировна

Принятые сокращения

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Аденовирусы как векторы для переноса генетической информации.

1.1.1. Общая характеристика аденовирусов человека.

1.1.2. Векторы на основе аденовирусов человека.

1.1.3. Особенности структурно-функциональной организации аденовируса птиц CELO.

1.1.4. Векторы на основе аденовируса птиц CEL0.

1.2. Факторы роста кровеносных сосудов.

1.2.1. Ангиогенин.

1.2.1.1. История открытия и свойства белка ангиогенина.

1.2.1.2. Роль ангиогенина в неоваскуляризации.

1.2.1.3. Внутриклеточные функции ангиогенина.

1.2.1.4. Другие функции белка.

1.2.2. VEGF (фактор роста эндотелия сосудов).

1.2.2.1. Свойства и функции белка.

1.2.2.2. VEGF А.

1.2.2.3. Другие члены семейства VEGF.

1.2.2.4. Исследование способности VEGF индуцировать ангиогенез в организме животных и человека.

1.2.3. Другие факторы роста кровеносных сосудов.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы.

2.1.1. Вирусы и бактериальные штаммы.

2.1.2. Клеточные линии.

2.1.3. Плазмидные векторы.

2.1.4. Ферменты и другие реактивы.

2.1.5. Животные.

2.2. Методы.

2.2.1. Выделение и очистка плазмидной ДНК.

2.2.2. Выделение аналитических количеств плазмидной ДНК.

2.2.3. Гидролиз ДНК специфическими эндодезоксирибонуклеазами.

2.2.4. Фракционирование фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле.

2.2.5. Препаративное разделение фрагментов ДНК и элюция их из геля.

2.2.6. Лигирование фрагментов ДНК.

2.2.7. Трансформация клеток E.coli.

2.2.8. Определение нуклеотидной последовательности ДНК.

2.2.9. Полимеразная цепная реакция.

2.2.10. Синтез дезоксиолигонуклеотидов.

2.2.11. Трансфекция клеток линии 293 или LMH для получения рекомбинантных аденовирусов.

2.2.12. Накопление вирусов.

2.2.13. Очистка и концентрирование аденовирусов.

2.2.14. Титрование вирусов.

2.2.15. Выделение вирионной ДНК.

2.2.16. Выделение ДНК из клеток, зараженных аденовирусом.

2.2.17. Трансфекция хорио-аллантоисной мембраны.

2.2.18. Определение активности секретируемой щелочной фосфатазы.

2.2.19. Электрофорез белков в ПААГ-ДСН (PAGE-SDS).

2.2.20. Иммуноблоттинг (Western blot immunoassay).

2.2.21. Хирургические манипуляции с лабораторными животными.

2.2.22. Введение рекомбинантных вирусов в мышечные клетки.

2.2.23. Гистологический анализ.

2.2.24. Определение логфазы для микроорганизмов.

2.2.25. Определение влияния ангиогенина на рост микроорганизмов.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Конструирование рекомбинантных аденовирусов на основе генома аденовируса птиц CELO и генома аденовируса человека 5 серотипа.

3.1.1. Создание плазмидных конструкций, несущих гены ANG и VEGF.

3.1.2. Анализ экспрессии генов ANG и VEGF, содержащихся в плазмидных векторах.

3.1.3. Получение аденовирусов CELO-ANG, CELO- VEGF и Ad-ANG методом гомологичной рекомбинации в культуре клеток.

3.1.4. Детекция экспрессии генов ANG и VEGF в культуре клеток, зараженных рекомбинантными аденовирусами CELO-ANG и CELO- VEGF.

3.2. Индукция неоваскуляризации в конечностях лабораторных животных после введения рекомбинантных аденовирусов, несущих гены факторов роста кровеносных сосудов.

3.2.1. Введение репортерных генов GFP и SEAP в клетки мышцы крысы при помощи рекомбинантных аденовирусов.

3.2.2. Индукция неоваскуляризации в мышцах крыс после введения рекомбинантных аденовирусов, несущих гены факторов роста кровеносных сосудов.

3.3. Исследование антимикробной активности ангиогенина.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Создание рекомбинантных аденовирусов, экспрессирующих гены факторов роста кровеносных сосудов и изучение влияния этих вирусов на ангиогенез in vivo"

В настоящее время для доставки различных терапевтических генов в органы и ткани млекопитающих широко применяются векторы на основе вирусов человека и животных. Вирусные векторные системы являются перспективными, поскольку вирус эффективно проникает в клетки и не требует использования дополнительных средств улучшения эффективности трансфекции. Широко используемым инструментом для доставки генов в клетки млекопитающих являются векторы на основе аденовирусов.

Наше исследование направлено на создание генно-инженерных конструкций, индуцирующих рост кровеносных сосудов в конечностях млекопитающих в результате доставки в ткани конечностей аденовирусных векторов, несущих гены факторов роста кровеносных сосудов. В качестве средства доставки данных генов в мышцы лабораторных животных нами были использованы вирусные векторы на основе аденовируса человека типа 5 (Ad5) и аденовируса птиц CELO. Аденовирусные векторы широко применяются для транзиентной экспрессии генов в клетках млекопитающих in vivo и in vitro. Исследуется применение векторов на основе аденовирусов человека и животных в качестве живых рекомбинантных вакцин для ветеринарии и медицины, а также для генной терапии.

В качестве целевых генов для доставки в мышцы лабораторных животных мы использовали гены факторов роста кровеносных сосудов, поскольку возможность регуляции роста кровеносных сосудов это одна из задач, стоящих перед медицинской наукой и практикой. Атеросклероз с постепенным сужением полости артерий и последующем уменьшением кровяного тока до сих пор остается одной из самых серьезных проблем в мире. Не смотря на то, что почти каждый орган в человеческом организме может быть поврежден, в большей мере заболеваемости подвержены: сердце (поражение венечной артерии), мозг (поражение церебральных сосудов) и нижние конечности (поражение периферических сосудов) [Rasmussen H.S. et al., 2002].

Известно, что в организме человека имеются естественные регуляторы роста кровеносных сосудов, способствующие образованию коллатералей, обходящих места закупорки артерий. Однако белки факторов роста кровеносных сосудов, при введении в организм, имеют короткий период полураспада [Takeshita S. et al. , 1994] , а для индукции роста сосудов нужно поддерживать необходимый уровень белка - ангиогена продолжительное время. Поэтому, для лечения ишемических заболеваний перспективными являются генно-терапевтические методы. Генная терапия предоставляет возможность для повышения в организме уровня белков - факторов роста кровеносных сосудов и поддержания его длительный период времени.

Существует множество факторов роста кровеносных сосудов, доставка которых в организм при помощи методов генной терапии, могла бы привести к лечебной неоваскуляризации. У большинства ангиогенных факторов уже исследуется механизм действия и эффективность индукции роста новых кровеносных сосудов. В нашем исследовании мы использовали ген фактора роста эндотелия сосудов (VEGF12i) и ген ангиогенина (ANG) .

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Целью настоящей работы являлось получение рекомбинантных аденовирусов CELO-ANG, CELO- VEGF и Ad-ANG, несущих гены факторов роста кровеносных сосудов, и исследование возможности индукции неоваскуляризации в результате внутримышечного введения вирусов CELO-ANG, CELO- VEGF и Ad-ANG лабораторным животным.

В связи с этим, в процессе работы предстояло решить следующие задачи:

1. Создание векторов на основе аденовируса птиц CELO, несущих гены ANG и VEGF, методом гомологичной рекомбинации в культуре клеток LMH.

2. Создание вектора на основе аденовируса человека 5, несущего ген ANG, методом гомологичной рекомбинации в культуре клеток 293.

3. Изучение действия VEGF и ANG, экспрессируемых с генов в составе рекомбинантных аденовирусов, на ангиогенез в мышечной ткани конечностей лабораторных животных.

4. Разработка системы проверки биологической активности генов факторов роста кровеносных сосудов, находящихся в плазмидных векторах, при помощи трансфекции хорио-аллантоисной мембраны куриных эмбрионов.

5. Исследование антимикробной активности ангиогенина.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Созданы рекомбинантные вирусы на основе аденовируса человека типа 5 и на основе аденовируса птиц CELO, несущие гены факторов роста кровеносных сосудов (VEGF121 и ANG) .

2. Показано, что созданные нами рекомбинантные аденовирусы индуцируют прирост кровеносных сосудов в мышечной ткани конечностей лабораторных животных.

3. Отработана система проверки биологической активности генов факторов роста кровеносных сосудов, находящихся в плазмидных векторах, при помощи трансфекции хорио-аллантоисной мембраны куриных эмбрионов.

4. Показано, что ANG не проявляет специфической антимикробной активности.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

Нами впервые были получены рекомбинантные аденовирусы CELO-ANG, CELO- VEGF и Ad-ANG, несущие гены факторов роста кровеносных сосудов.

Была продемонстрирована экспрессия генов ANG и VEGF в составе рекомбинантных аденовирусов.

Для проверки биологической активности генов факторов роста кровеносных сосудов, находящихся в плазмидных векторах, нами была разработана тест-система на основе трансфекции хорио-аллантоисной мембраны куриных эмбрионов рекомбинантными плазмидами.

Была продемонстрирована возможность индукции неоваскуляризации в мышцах крыс после введения им рекомбинантных аденовирусов, несущих гены факторов роста кровеносных сосудов.

Нами проведено исследование антимикробной активности ангиогенина, в ходе которого показано, что ANG не обладает антимикробной активностью.

Работа представляет не только научный, но и практический интерес. Нами показано, что аденовирусные векторы, в том числе и векторы на основе Ad птиц CELO, осуществляют эффективный перенос терапевтических генов в мышечные клетки и могут быть использованы в генной терапии ишемических заболеваний. Можно ожидать, что векторная конструкция на основе ДНК аденовируса птиц CELO после соответствующей модификации (инактивирования области GAM-1) окажется эффективной для использования в медицине, в частности в терапии ишимизированных конечностей у человека.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Авдеева, Светлана Владимировна

выводы

1. Впервые созданы рекомбинантные аденовирусы CELO, содержащие под контролем CMV-промотора гены ANG и VEGF. In vitro в клетках линии LMH показана эффективная экспрессия генов ANG и VEGF, находящихся в составе геномов рекомбинантных вирусов.

2. Впервые создан рекомбинантный аденовирус человека 5 серотипа, несущий ген ANG.

3. Показано, что рекомбинантные аденовирусы CELO-ANG, CELO- VEGF и Ad-ANG вызвали заметный прирост кровеносных сосудов в М. tibialis anterior крысы по сравнению с контрольными группами животных.

4. Разработана тест-система проверки биологической активности генов факторов роста кровеносных сосудов, находящихся в плазмидных векторах, при помощи трансфекции хорио-аллантоисной мембраны куриных эмбрионов. Показано, что проникновение рекомбинантных плазмид, содержащей гены VEGF и ANG человека, эффективно индуцируют рост кровеносных сосудов в клетках хорио-аллантоисной мембраны куриных эмбриов.

5. Исследована антимикробная активность ангиогенина. Показано, что ANG не обладает антимикробной активностью.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Авдеева, Светлана Владимировна, Москва

1. Автандилов Г.Г., Яблучанский Н.И., Губенко В. Г. /Система стереометрии в изучении патологического процесса// М., "Медицина", 1981.

2. Григорьев В.П., Хилько С.Н., Тихоненко Т.И. Условия стабильности четвертичной структуры и антигенная активность гексона аденовирусов. // Биохимия. 1985. т50. с. 258-263.

3. Гублер Е.Б. /Вычислительные методы анализа и распознавания патологических процессов // J7., Медицина, 1978 .

4. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование.// М., "Мир", 1982.

5. Плохинский Н.А. /Биометрия// М., Наука, 1970.

6. Хорвиц М.С. Аденовирусы и их репликация. // "Вирусология" ред.Филдс, "Мир", 198 9.

7. Acharya KR, Shapiro R, Allen SC, Riordan JF, Vallee BL. /Crystal structure of human angiogenin reveals the structural basis for its functional divergence from ribonuclease. / / Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Apr 12;91(8) :2915-9.

8. Alestrom, P., A. Stenlund, P. Li, A. Bellett, and U. Pettersson./ Sequence homology between avian and human adenoviruses.// J. Virol. 1982 V.-42, PP.- 306-310.

9. Allouche M, Bikfalvi A. /The role of fibroblast growth factor-2 (FGF-2) in hematopoiesis.//Prog Growth Factor Res. 1995;6 (1) :35-48 .

10. Alon T, Hemo I, Itin A, Pe'er J, Stone J, Keshet E. /Vascular endothelial growth factor acts as a survival factor for newly formed retinal vessels and has implications for retinopathy of prematurity. //Nat Med. 1995 Oct;1(10):1024-8.

11. Amalfitano А, Веду С Chamberlain J./ Improved adenovirus packaging cell lines to support the growth of replication-defective gene-delivery vectors.// Proc Natl Acad Sci USA 1996; v.-93, pp.- 3352-3356.

12. Amalfitano A, Hauser MA, Ни H, Serra D, Веду CR, Chamberlain JS. Production and characterization of improved adenovirus vectors with the El, E2b, and E3 genes deleted. // J. Virol., 1998, v.- 72(2), pp.- 926933 .

13. Asahara T, Chen D, Takahashi T, Fujikawa K, Kearney M, Magner M, Yancopoulos GD, Isner JM. /Tie2 receptor ligands, angiopoietin-1 and angiopoietin-2, modulate VEGF-induced postnatal neovascularization. //Circ Res. 1998 Aug 10; 83 (3):233-40

14. Ausprunk DH, Knighton DR, Folkman J. /Differentiation of vascular endothelium in the chick chorioallantois: a structural and autoradiographic study.// Dev Biol. 1974 Jun;38(2):237-48.

15. Badet J, Soncin F, Guitton JD, Lamare O, Cartwright T, Barritault D. /Specific binding of angiogenin to calf pulmonary artery endothelial cells.//Proc Natl Acad Sci USA. 1989 Nov;86(21):8427-31.

16. Baird A, Florkiewicz RZ, Maher PA, Kaner RJ, Hajjar DP. /Mediation of virion penetration into vascular cells by association of basic fibroblast growth factor with herpes simplex virus type 1. //Nature. 1990 Nov 22;348 (6299) :344-6

17. Belt A, Prevec L, Graham F./ Packaging capacity and stability of human adenovirus type 5 vectors.// J Virol 1993; v.-67, pp.- 5911-5921.

18. Ben AJ, Haddara W. Prevec L, Graham FL, / An efficient and flexible system for construction .of adenovirus vectors with insertions or deletions in early regions 1 and 3.// Proc. Natl Acad Sri USA 1994; v.-91, pp.- 8802-8806.

19. Benihoud K, Yeh P, Perricaudet M./ Adenovirus vectors for gene delivery.// Curr Opin Biatechnol 1999; v.-Ю, pp.- 440-447.

20. Berardi AC, Wang A, Abraham J, Scadden DT. /Basic fibroblast growth factor mediates its effects on committed myeloid progenitors by direct action and has no effect on hematopoietic stem cells.// Blood. 1995 Sep 15; 86(6) :2123-9.

21. Bergelson J.M., Cunningham J.A., Droguett G., Kurt-Jones E.A., Krithivas A., Hong J.S., Horwitz M.S., Crowell R.L., Finberg R.W. /Isolation og a common receptor for coxsackie В viruses and adenoviruses 2 and 5. // Science, 1997, v.-286, pp.-1579-1583.

22. Berger J, Hauber J, Hauber R, Geiger R, Cullen BR /Secreted placental alkaline phosphatase: apowerful new quantitative indicator of gene expression in eukaryotic cells.// Gene. 1988 Jun 15; 66 (1) :1-10.

23. Berkner K./ Development of adenovirus vectors for the expression of heterologous genes.// Biotehniques 1988; v.-6, pp.- 6-629.

24. Bett A.J., L.A. Prevec, and F.L. Graham. /Packaging capacity and stability of the human adenovirus type 5 vector. //J.Virol. 1983, v67, p 59115921.

25. Bond MD, Strydom DJ, Vallee BL. /Characterization and sequencing of rabbit, pig and mouse angiogenins: discernment of functionally important residues and regions.// Biochim Biophys Acta. 1993 Mar 5; 1162(1-2) : 177-86.

26. Bouri K. , Feero W.G., Myerburg M.M., Wickham T.J., Kovesdi I., Hoffman E.P., Clemens P.R./ Polylysine modification of adenoviral fiber protein enhances muscle cell transduction. // Hum. Gene Ther., 1999, v.-Ю, pp.-1633-1640 .

27. Brody SL, Crystal RG/ Adenovirus-mediated in vivo gene transfer.// Ann NY Acad Sci 1994, v.-716, pp.- 90-103.

28. Cai, F., and J. Weber./ Organization of the avian adenovirus genome and the structure of its endopeptidase.// Virology 1993 V.-196, PP.-358-362.

29. Cantor G.H., McElwain T.F., Birkebak T.A., Palmer G.H. /Ribozyme cleaves rex/tax mRNA and inhibits bovine leukemia virus expression. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, v.- 90, pp.- 10932-10936.

30. Cao Y, Linden P, Farnebo J, Cao R, Eriksson A, Kumar V, Qi JH, Claesson-Welsh L, Alitalo K. /Vascularendothelial growth factor С induces angiogenesis in vivo. //Proc Natl Acad Sci USA. 1998 Nov 24; 95 (24) :14389-94.

31. Caravokuri C., K.N.Leppard. /Constitutive episomal expression of a polipeptide pIX in a 293-based cell line complements the defiency of pIX mutant adenovirus type 5.// J. Virol. 1995, v69, p 6627-6633.

32. Carmeliet P, Collen D. /Molecular basis of angiogenesis. Role of VEGF and VE-cadherin. //Ann N Y Acad Sci. 2000 May;902:249-62; discussion 262-4.

33. Chamoux M, Dehouck MP, Fruchart JC, Spik G, Montreuil J, Cecchelli R. /Characterization of angiogenin receptors on bovine brain capillary endothelial cells.// Biochem Biophys Res Commun. 1991 Apr 30;176(2):833-9.

34. Chiocca S., Robert Kurzbauer, Gotthold Schaffner, Adam Baker, Vivien Mautner, Matt Cotten. The complette DNA sequence and genomic organization of the avian adenivirus CELO. //J. Virol. 1996, v70, p 29392949.

35. Chiocca, S., A. Baker, M. Cotten. /Identification of a novel antiapoptotic protein, GAM-1, encoded by the CELO adenovirus. // J Virol 1997 v.-71, pp.3168-3177.

36. Couch RB, Chanock RM, Gate TR, Lang DJ, Knight V, Huebner RJ / Immunization with types 4 and 7 adenovirus by selective infection of the intestinal tract, in Conference on Newer Respiratory Disease Viruses, 1962 pp.- 394-403.

37. Cowen B, Calnek BW, Menendez NA, Ball RF./ Avian adenoviruses: effect on egg production, shell quality, and feed consumption. // Avian Dis., 1978, v.-22 (3), pp.- 459-470.

38. D'Alessio G, Di Donato A, Parente A, Piccoli R./ Seminal RNase: a unique member of the ribonuclease superfamily. //Trends Biochem Sci. 1991 Mar;16(3):104-6. Review.

39. D'Alessio G./ New and cryptic biological messages from RNases. //Trends Cell Biol. 1993 Apr;3(4):106-9.

40. Danthinne X, Imperiale MJ. /Production of first generation adenovirus vectors: a review. //Gene Ther. 2000 Oct;7(20):1707-14.

41. Dodge AB, Lu X, D'Amore PA. /Density-dependent endothelial cell production of an inhibitor of smooth muscle cell growth. //J Cell Biochem. 1993 Sep;53 (1) :21-31.

42. Drescher U./ The Eph family in the patterning of neural development.// Curr Biol. 1997 Dec 1;7(12) :R7 99-8 07

43. Dumont DJ, Yamaguchi TP, Conlon RA, Rossant J, Breitman ML./ tek, a novel tyrosine kinase gene located on mouse chromosome 4, is expressed in endothelial cells and their presumptive precursors. //Oncogene. 1992 Aug;7(8):1471-80.

44. Fallaux F et al. / Characterization of 911, a new helper cell line for the titration and propagation of early region 1-deleted adenoviral vectors.// Hum Gene Ther 1996; v.-7, pp.-215-222.

45. Fallaux F et al./ New helper cells end matched early region 1-deleted adenovirus vectors prevera generation of replication-competent adenoviruses. //Hum Gene Ther 1998; v.-9. pp.- 1909-1917.

46. Ferrara N, Chen H, Davis-Smyth T, Gerber HP, Nguyen TN, Peers D, Chisholm V, Hillan KJ, Schwall RH. /Vascular endothelial growth factor is essential for corpus luteum angiogenesis. //Nat Med. 1998 Mar;4(3):336-40.

47. Ferrara N, Houck K, Jakeman L, Leung DW/ Molecular and biological properties of the vascular endothelial growth factor family of proteins.// Endocr Rev 1992, v.-13, pp.- 18-32.

48. Ferrara N, Leung DW, Cachianes G, Winer J, Henzel WJ. /Purification and cloning of vascular endothelial growth factor secreted by pituitary folliculostellate cells. //Methods Enzymol. 1991;198:391-405.

49. Ferrara N, Longobardi G, Leosco D, Rosiello R, Abete P, Cacciatore F, Guerra N, Furgi G, Rengo F. /Verapamil reduces dipyridamole-induced myocardial ischemia in patients with coronary artery disease. //J Cardiovasc Pharmacol. 1999 Mar;33(3):383-7.

50. Ferrari F.K., Samulski Т., Shenk Т., Samulski R.J./ Second-strand synthesis is a rate-limiting step for efficient transduction by recombinant adeno-associated virus vectors. // J.Virol., 1996, v.-70, pp.- 3227-3234.

51. Fett JW, Strydom DJ, Lobb RR, Alderman EM, Bethune JL, Riordan JF, Vallee BL. /Isolation and characterization of angiogenin, an angiogenic protein from human carcinoma cells. //Biochemistry. 1985 Sep 24;24(20):5480-6.

52. Fisher К et al./ Recombinant adenovirus deleted of all viral genes for gene therapy of cystic fibrosis.// Virology 1996; v.-217, pp.- 11-22.

53. Folkman J, Shing Y. /Angiogenesis. //J Biol Chem. 1992 Jun 5;267 (16) :10931-4 .

54. Gerber HP, Ferrara N. /The role of VEGF in normal and neoplastic hematopoiesis. //J Mol Med. 2003 Jan;81(1):20-31. Epub 2002 Dec 14.

55. Gerwins P, Skoldenberg E, Claesson-Welsh L. /Function of fibroblast growth factors and vascular endothelial growth factors and their receptors in angiogenesis. //Crit Rev Oncol Hematol. 2000 Jun;34(3):185-94

56. Ghosh-Choudhury G, Haj-Ahmed Y, Graham FL / Protein IX component of the human adenovirus capsid is essential for the packaging of full length genomes.// EMBO 1987 V.-6, PP.-1733-1739.

57. Glotzer JB, Saltik M, Chiocca S, Michou Al, Moseley P, Cotten M. /Activation of heat-shock response by an adenovirus is essential for virus replication. // Nature 2000 v.- 407(6801), pp.207-211.

58. Gorziglia M et at./ Generation of an adenovirus vector lacking 11, B2a, E3, and all of E4 except open reading frame 3.// J Virol 1999; v.-73, pp.- 6048-6055.

59. Graham F.L. and Prevec L. /Manipulation of adenovirus vectors. // Methods in Mol.Biol., 1994, v.-7, pp.-109-127. (Ed.), The Humana Press Inc., Clifton, NJ.

60. Graham F.L. and van der Eb A., J. /А new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. // Virology, 1973, v.- 52, pp.- 456467 .

61. Graham FL, Smiley J, Russel WC, Nairn R./ Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5.// J Gen Virol 1977; v.-36, pp.- 59-74.

62. Green K.Y., Wold W.S.M./ Human adenoviruses: growth, purification and transfection assay.// Methods Enzymology, 1980, v.-80, pp.- 425-431.

63. Hanahan D. /Studies of transformation of Escherichia coli with plasmids. // Journal of Molecular Biology, 1983, v.166, pp.- 557-580.

64. Harui A, Suzuki S, Kochanek S, Mitani K./ Frequency and stability of chromosomal integration of adenovirus vectors. // J Viral 1999; v.-73, pp.- 61416146.

65. Hatzi E, Badet J. /Expression of receptors for human angiogenin in vascular smooth muscle cells. //Eur J Biochem. 1999 Mar;260(3):825-32.

66. Hay R.T., Freeman A., Leith I., Monaghan A., and Webster A./ Molecular interactions during adenovirus DNA replication. // The molecular repertoire of adenoviruses., 1995, pp.-31-48.

67. Hayashi K, Yanagihara T, Hata Т./ Serum angiogenin levels during menstrual cycle and pregnancy. //Gynecol Obstet Invest. 2000;50 (1):7-12.

68. He H, Venema VJ, Gu X, Venema RC, Marrero MB, Caldwell RB. /Vascular endothelial growth factor signals endothelial cell production of nitric oxide and prostacyclin through flk-l/KDR activation of c-Src. //J Biol Chem. 1999 Aug 27;274 (35) :25130-5 .

69. He Z, Tessier-Lavigne M. /Neuropilin is a receptor for the axonal chemorepellent Semaphorin III.// Cell. 1997 Aug 22; 90 (4) :739-51

70. Heath WF Jr, Moore F, Bicknell R, Vallee BL. /Modulation of mitogenic stimuli by angiogenin correlates with in vitro phosphatidylinositol bisphosphate synthesis.//Proc Natl Acad Sci USA. 1989 Apr;86(8):2718-22.

71. Henry TD. /Therapeutic angiogenesis.// BMJ. 1999 Jun 5;318(7197):1536-9. Review. No abstract available.

72. Hess, M., A. Cuzange, R. W. H. Ruigrok, J. Chroboczek, and B. Jacrot./ The avian adenovirus penton: two fibres and one base.// J. Mol. Biol. 1995 v.-252, pp.- 379-385.

73. Heubner RJ, Chanock RM, Rubin BA, Casey MJ / Induction by adenovirus type 7 of tumors in hamsters having the antigenic characteristics of SV40 virus.//

74. Proc Nad Acad Sci USA 1964 V.-52, PP.-1333-1340.

75. Hillerman M.R., Werner J.H./ Recovery of new agents from patientes with acute respiratory illness. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1954, v.- 85, pp.- 183188 .

76. Hiltunen MO, Ruuskanen M, Huuskonen J, Mahonen AJ, Ahonen M, Rutanen J, Kosma VM, Mahonen A, Kroger H, Yla-Herttuala S./ Adenovirus-mediated VEGF-A gene transfer induces bone formation in vivo.// FASEB J. 2003 Jun;17(9):1147-9

77. Hooper LV, Stappenbeck TS, Hong CV, Gordon JI. /Angiogenins: a new class of microbicidal proteins involved in innate immunity.// Nat Immunol. 2003 Mar;4 (3) :269-73.

78. Horwitz M.S. /(1990) Adenoviruses, in Virology 2nd Edn (Fields B.N., Knipe D.M., Chanock R.M., Melnick J.L., Hirsch M.S., Monath T.P., Roizman В., eds). Raven Press

79. Houck KA, Ferrara N, Winer J, Cachianes G, Li B, Leung DW. /The vascular endothelial growth factor family: identification of a fourth molecular species and characterization of alternative splicing of RNA. //Mol Endocrinol. 1991 Dec;5(12):1806-14.

80. Houck PR, Reynolds CF 3rd, Mazumdar S, Kupfer DJ. /Receiver operating characteristic analysis for validating EEG sleep discrimination of elderly depressed and demented patients. //J Geriatr Psychiatry Neurol. 1991 Jan-Mar;4(1):30-3.

81. Hu G, Riordan JF, Vallee BL./ Angiogenin promotes invasiveness of cultured endothelial cells by stimulation of cell-associated proteolytic activities.// Proc Natl Acad Sci USA. 1994 Dec 6;91 (25) :12096-100.

82. Hu G, Xu C, Riordan JF./ Human angiogenin is rapidly translocated to the nucleus of human umbilicalvein endothelial cells and binds to DNA. //J Cell Biochem. 2000 Jan;76(3):452-62.

83. Hu GF, Chang SI, Riordan JF, Vallee BL. / An angiogenin-binding protein from endothelial cells.// Proc Natl Acad Sci USA. 1991 Mar 15;88 ( 6) :2227-31. .

84. Hu GF, Riordan JF, Vallee BL. /А putative angiogenin receptor in angiogenin-responsive human endothelial cells.// Proc Natl Acad Sci USA. 1997 Mar 18;94 (6) :2204-9. .

85. Hu GF, Riordan JF. /Angiogenin enhances actin acceleration of plasminogen activation.// Biochem Biophys Res Commun. 1993 Dec 15; 197 (2) :682-7. .

86. Hu GF, Strydom DJ, Fett JW, Riordan JF, Vallee BL./ Actin is a binding protein for angiogenin.//Proc Natl Acad Sci USA. 1993 Feb 15;90 (4):1217-21.

87. Hu GF. /Neomycin inhibits anglogenin-lnduced angiogenesis. //Proc Natl Acad Sci USA. 1998 Aug 18;95(17):9791-5.

88. Hu H, Serra D, Amalfitano A./ Persistence of an E1-, polymerase-. adenovirus vector despite transduction of a neoantigen into immune-competent mice. // Hum. Gene Ther., 1999, v.- 10(3), pp.- 355364 .

89. Hussain FM, Heilbron M Jr./ A review of the literature: Transmyocardial laser revascularization.// J Clin Laser Med Surg 1997, v.-15, pp.- 57-63.

90. Ikuta T, Ariga H, Matsumoto KI. /Effect of tenascin-X together with vascular endothelial growth factor A on cell proliferation in cultured embryonic hearts. //Biol Pharm Bull. 2001 Nov;24(11):1320-3.

91. Jiang BH, Zheng JZ, Aoki M, Vogt PK. /Phosphatidylinositol 3-kinase signaling mediates angiogenesis and expression of vascular endothelial growth factor in endothelial cells. //Proc Natl Acad Sci USA. 2000 Feb 15; 97 (4) :1749-53.

92. Jimi S, Ito K, Kohno К, Ono M, Kuwano M, Itagaki Y, Ishikawa H./ Modulation by bovine angiogenin of tubular morphogenesis and expression of plasminogen activator in bovine endothelial cells.// Biochem Biophys Res Commun. 1995 Jun 15;211(2):476-83.

93. Joukov V, Kaipainen A, Jeltsch M, Pajusola K, Olofsson B, Kumar V, Eriksson U, Alitalo K. /Vascular endothelial growth factors VEGF-B and VEGF-C. //J Cell Physiol. 1997 Nov;173(2):211-5.

94. Ju DW, WANG BM, Cao X. /Adenovirus-mediated combined suicide gene and interleukin-2 gene therapy for the treatment of established tumor and induction of antitumor immunity. // J Cancer Res Clin Oncol 1998 v.-124(12), pp.683-9

95. Kallio PJ, Wilson WJ, O'Brien S, Makino Y, Poellinger L. /Regulation of the hypoxia-inducible transcription factor lalpha by the ubiquitin-proteasome pathway. //J Biol Chem. 1999 Mar 5;274 (10) :6519-25.

96. Kelly T.J., Lewis, A.M. /Use of nondefective adenovirus-simian virus 40 hybrids for mapping the SV40 genome. // J. Virol., 1973, v.- 12, pp.- 643-652.

97. Kim IH, Jozkowicz A, Piedra PA, Oka K, Chan L /Lifetime correction of genetic deficiency in mice with a single injection of helper-dependent adenoviral vector. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001, v.-98(23), pp.- 13282-13287.

98. Kolodkin AL, Ginty DD. /Steering clear of semaphorins: neuropilins sound the retreat. //Neuron. 1997 Dec;19(6):1159-62

99. Kozlowska U, Blume-Peytavi U, Kodelja V, Sommer C, Goerdt S, Majewski S, Jablonska S, Orfanos CE. /Expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in various compartments of the human hair follicle. //Arch Dermatol Res. 1998 Dec;290(12):661-8.

100. Kurachi K, Rybak SM, Fett JW, Shapiro R, Strydom DJ, Olson KA, Riordan JF, Davie EW, Vallee BL.

101. Expression of human angiogenin in cultured baby-hamster kidney cells.// Biochemistry. 1988 Aug 23;21 (17) :6557-62.

102. Laemmli U.K. /Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature. 1970. V. 227. P. 680-685.

103. Lagercrantz J, Farnebo F, Larsson C, Tvrdik T, Weber G, Piehl F. /А comparative study of the expression patterns for vegf, vegf-b/vrf and vegf-c in the developing and adult mouse. //Biochim Biophys Acta. 1998 Jun 16;1398(2):157-63.

104. Laver WG, Younghusband HB, Wrigley NG/ Purification and properties of chick embryo lethal orphan virus (an avian adenovirus).// Virology 1971, V.-45, PP.- 598- 614.

105. Lee FS, Vallee BL. /Characterization of ribonucleolytic activity of angiogenin towards tRNA. //Biochem Biophys Res Commun. 1989 May 30;161 (1):121-6.

106. Legerski R., Robberson D. /Analysis and optimization of recombinant DNA joining reactions. // Journal of Molecular Biology, 1985, v.- 181, pp.- 297312 .

107. Lehrmann, H., and M. Cotten./ Characterization of CELO virus proteins that modulate the pRb/E2F pathway. // J Virol 1999 v.- 73, pp.6517-6525.

108. Leonidas DD, Shapiro R, Subbarao GV, Russo A, Acharya KR. /Crystallographic studies on the role of the C-terminal segment of human angiogenin in defining enzymatic potency. //Biochemistry. 2002 Feb 2 6;41(8) :2552-62. .

109. Leppard K.N./ E4 gene function in adenovirus, adenovirus vector and adeno-associated virus infections. // J. Gen. Virology., 1997, v.-78, pp.-2131-2138.

110. Leung DW, Cachianes G, Kuang W-J, Goeddel DV, Ferrara N/ Vascular endothelial growth factor is a secreted angiogenic mitogen.// Science 1989, v.-246, pp.- 1306-1309.

111. Lewis AM Jr, Baum SG, Prigge КО, Rowe WP / Occurrence of adenovirus SV40 hybrids among monkey kidney cell adapted strains of adenovirus.// Proc Soc Exp Biol Med 1966 V.-122, PP.-214-218.

112. Lewis AM, Levine AS, Crumpacker CS, Levin MJ, Samaha RJ, Henry PH /Studies of nondefective adenovirus 2-SV40 specific biological properties.// J Virol 1973 V.-ll, PP.- 655-664.

113. Li P. et al./ The structural proteins of chick embrio lethal orphan virus (FAV-1).// J.Gen.Virol. 1984, v.-65, pp.- 1803-1815.

114. Li, P., A. J. D. Bellett, and C. R. Parish./ A comparison of the terminal protein and hexon polypeptides of avian and human adenoviruses.// J. Gen.Virol. 1983 V.-64, PP.- 1375-1379.

115. Looney D. and Yu, M. /Clinical aspects of ribozymes as therapeutics in gene therapy. // Methods Mol. Biol., 1997, v.- 74, pp.- 469-486.

116. Losordo DW, Vale PR, Hendel RC, Milliken CE, Fortuin FD, Cummings N, Schatz RA, Asahara T, Isner JM,

117. Kuntz RE/ Phase I/II placebo-controlled, double-blind, dose-escalating trial of myocardial vascular endothelial growth factor 2 gene transfer by catheter delivery in patients with chronic myocardial ischemia.// Circulation 2002, v.-105, pp.- 2012-2018.

118. Lyons RM, Gentry LE, Purchio AF, Moses HL. /Mechanism of activation of latent recombinant transforming growth factor beta 1 by plasmin. //J Cell Biol. 1990 Apr;110(4):1361-7.

119. Maes P, Damart D, Rommens C, Montreuil J, Spik G, Tartar A. /The complete amino acid sequence of bovine milk angiogenin.// FEBS Lett. 1988 Dec 5;241(1-2):41-5.

120. Maisonpierre PC, Suri C, Jones PF, Bartunkova S, Wiegand SJ, Radziejewski C, Compton D, McClain J,

121. Aldrich TH, Papadopoulos N, Daly TJ, Davis S, Sato TN, Yancopoulos GD./ Angiopoietin-2, a natural antagonist for Tie2 that disrupts in vivo angiogenesis.// Science. 1997 Jul 4;277 (5322) :55-60.

122. Malamitsi-Puchner A, Sarandakou A, Giannaki G, Rizos D, Phocas I. /Changes of angiogenin serum concentrations in the perinatal period.// Pediatr Res.1997 Jun;41(6):909-11.

123. Mayr GA, O'Donnell V, ChinsANGaram J, Mason PW, Grubman MJ./ Immune responses and protection against foot-and-mouth disease virus (FMDV) challenge in swine vaccinated with adenovirus-FMDV constructs. // Vaccine, 2001, v.- 19(15-16), pp.- 2152-2162.

124. Melese T, Xue Z./ The nucleolus: an organelle formed by the act of building a ribosome. // Curr Opin Cell Biol. 1995 Jun;7(3):319-24.

125. Migdal M, Huppertz B, Tessler S, Comforti A, Shibuya M, Reich R, Baumann H, Neufeld G./ Neuropilin-1 is a placenta growth factor-2 receptor.// J Biol Chem.1998 Aug 28;273(35):22272-8

126. Moenner M, Gusse M, Hatzi E, Badet J. /The widespread expression of angiogenin in different human cells suggests a biological function not only related to angiogenesis.// Eur J Biochem. 1994 Dec 1;226 (2) :483-90.

127. Moore F, Riordan JF./ Angiogenin activates phospholipase С and elicits a rapid incorporation of fatty acid into cholesterol esters in vascular smooth muscle cells. //Biochemistry. 1990 Jan 9;29 (1) :228-33. .

128. Moorhead JW, Clayton GH, Smith RL, Schaack J./ A replication-incompetent adenovirus vector with the preterminal protein gene deleted efficiently transduces mouse ears. //J. Virol., 1999, v.- 73(2), pp.- 10461053.

129. Moroianu J, Riordan JF./ Identification of the nucleolar targeting signal of human angiogenin.// Biochem Biophys Res Commun. 1994 Sep 30;203 (3) :1765-72. .

130. Moroianu J, Riordan JF./ Nuclear translocation of angiogenin in proliferating endothelial cells is essential to its angiogenic activity. //Proc Natl Acad Sci USA. 1994 Mar 1; 91 ( 5):1677-81.

131. Moscatelli D, Rifkin DB./ Membrane and matrix localization of proteinases: a common theme in tumor cell invasion and angiogenesis.//Biochim Biophys Acta. 1988 Aug 3; 948 (1) :67-85.

132. Nag S, Eskandarian MR, Davis J, Eubanks JH. /Differential expression of vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A) and VEGF-B after brain injury. //J Neuropathol Exp Neurol. 2002 Sep;61(9):778-88.

133. Nakane P.K., Kawaio A.S. /Peroxidase-labeled antibody. A new method of conjugation. // J.Histochem.Cytochem. 1974. V. 22. P. 1084-1091.

134. Nermut M.V./ The architecture of adenoviruses. // The Adenoviruses, ed. By H.S. Ginsberg, 1984.

135. Neufeld G, Cohen T, Gengrinovitch S, Poltorak Z. /Vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptors. //FASEB J. 1999 Jan;13(1):9-22.

136. Okuda Y, Ono M, Yazawa S, Shibata I, Sato S. /Experimental infection of specific-pathogen-free chickens with serotype-1 fowl adenovirus isolated from a broiler chicken with gizzard erosions. // Avian Dis 2001 v.- 45(1), pp.19-25.

137. Ono M, Okuda Y, Yazawa S, Shibata I, Tanimura N, Kimura K, Haritani M, Mase M, Sato S /Epizootic outbreaks of gizzard erosion associated with adenovirusinfection in chickens. // Avian Dis 2001 v.- 45(1), pp.268-275.

138. Orlidge A, D'Amore PA. /Inhibition of capillary endothelial cell growth by pericytes and smooth muscle cells.// J Cell Biol. 1987 Sep;105(3):1455-62.

139. Parks R et at,/ A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal.// Proc Natl Acad Sci USA 1996; v.-93, pp.- 13565-13570.

140. Payet V, Arnauld C, Picault JP, Jestin A, Langlois P / Transcriptional organization of the avian adenovirus CELO.// J Virol 1998, v.-72, pp.- 9278-9285.

141. Peltekian E., Garcia L., Danos O. /Neurotropism and retrograde axonal transport of a canine adenoviral vector: a tool for targeting key structures undergoing neurodegenerative processes. // Mol. Ther., 2002, v.- 5(1), pp.- 25-32.

142. Pinedo HM, Verheul HM, D'Amato RJ, Folkman J. /Involvement of platelets in tumour angiogenesis //Lancet 1998 Nov 28;352(9142):1775-7.

143. Poltorak Z, Cohen T, Sivan R, Kandelis Y, Spira G, Vlodavsky I, Keshet E, Neufeld G. /VEGF145, a secreted vascular endothelial growth factor isoform that binds to extracellular matrix. //J Biol Chem. 1997 Mar 14;272 (11) :7151-8.

144. Puri MC, Rossant J, Alitalo K, Bernstein A, Partanen J. /The receptor tyrosine kinase TIE is required for integrity and survival of vascular endothelial cells.// EMBO J. 1995 Dec 1; 14 (23) :5884-91

145. Rabson AS, O'Connor GT, Berezesky IK, Paul FJ / Enhancement of adenovirus growth in African green monkey kidney cell cultures by SV40.// Proc Soc Exp Biol Med 1964 V.-116, PP.-187-190.

146. Rajagopalan S., Lederman R.J., Annex B.H. // Cardiac Vascular Regen-2002-Vol.1-P. 114-125.

147. Rajashekhar G, Loganath A, Roy AC, Wong YC./ Expression and localization of angiogenin in placenta: enhanced levels at term over first trimester villi.// Mol Reprod Dev. 2002 Jun;62(2):159-66.

148. Rasmussen HS, Rasmussen CS, Macko J, Yonehiro G./ Angiogenic gene therapy strategies for the treatment of cardiovascular disease. //Curr Opin Mol Ther. 2002 Oct;4(5):476-81. Review.

149. Ribatti D, Nico B, Vacca A, Roncali L, Burri PH, Djonov V. / Chorioallantoic membrane capillary bed: a useful target for studying angiogenesis and anti-angiogenesis in vivo.// Anat Rec. 2001 Dec 1;2 6 4(4) : 317-24.

150. Ribatti D, Urbinati C, Nico B, Rusnati M, Roncali L, Presta M. /Endogenous basic fibroblast growth factor is implicated in the vascularization of the chick embryo chorioallantoic membrane. //Dev Biol. 1995 Jul;170(1):39-49.

151. Russo N, Shapiro R, Acharya KR, Riordan JF, Vallee BL. /Role of glutamine-117 in the ribonucleolytic activity of human angiogenin.// Proc Natl Acad Sci USA. 1994 Apr 12; 91 (8) :2920-4. .

152. Rustam'ian IuL, Komolova GS. /Penetration of cow milk angiogenin into the blood after peroral administration in mice. //Izv Akad Nauk Ser Biol. 2002 Mar-Apr;(2):205-8. Russian.

153. Rybak SM, Fett JW, Yao QZ, Vallee BL./ Angiogenin mRNA in human tumor and normal cells.//Biochem Biophys Res Commun. 1987 Aug 14;146(3):12 4 0-8.

154. Sanger F., Nicklen S., Coulson A./ DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, v.74, pp.-5463-5467.

155. Sato TN, Tozawa Y, Deutsch U, Wolburg-Buchholz K, Fujiwara Y, Gendron-Maguire M, Gridley T, Wolburg H, Risau W, Qin Y. /Distinct roles of the receptor tyrosine kinases Tie-1 and Tie-2 in blood vessel formation.// Nature. 1995 Jul 6;376(6535):70-4

156. Seno M, Futami J, Tsushima Y, Akutagawa K, Kosaka M, Tada H, Yamada H. /Molecular cloning and expression of human ribonuclease 4 cDNA. //Biochim Biophys Acta. 1995 Apr 26;1261(3):424-6.

157. Shapiro R, Harper JW, Fox EA, Jansen HW, Hein F, Uhlmann E./ Expression of Met-(-l) angiogenin in Escherichia coli: conversion to the authentic less than Glu-1 protein.// Anal Biochem. 1988 Dec;175(2):450-61.

158. Shapiro R, Riordan JF, Vallee BL. /Characteristic ribonucleolytic activity of human angiogenin.// Biochemistry. 1986 Jun 17;25(12):3527-32. Erratum in: Biochemistry 1986 Oct 21;25 (21) :6730.

159. Shapiro R, Strydom DJ, Olson KA, Vallee BL. /Isolation of angiogenin from normal human plasma. //Biochemistry. 1987 Aug 11;26 (16) :5141-6.

160. Shayakhmetov D.M., Papayannopoulou Т., Stamatoyannopoulos G., Lieber A./ Efficient gene transfer into human CD34(+) cells by a retargeted adenovirus vector. // J. Virol., 2000, v.-74, pp.-2567-2583.

161. Shibuya M, Ito N, Claesson-Welsh L. /Structure and function of vascular endothelial growth factor receptor-1 and -2. //Curr Top Microbiol Immunol. 1999;237:59-83.

162. Shinagawa, M., T. Ishiyama, R. V. Padmanabhan, K. Fujinaga, M. Kamada, and G. Sato./ Comparative sequence analysis of the inverted terminal repetition in the genomes of animal and avian adenoviruses.// Virology 1983 V.-125, PP.- 491-495.

163. Sholley MM, Ferguson GP, Seibel HR, Montour JL, Wilson JD. /Mechanisms of neovascularization. Vascular sprouting can occur without proliferation of endothelial cells.//Lab Invest. 1984 Dec; 51 ( 6) :624-34.

164. Sierra-Honigmann MR, Nath AK, Murakami C, Garcia-Cardena G, Papapetropoulos A, Sessa WC, Madge LA, Schechner JS, Schwabb MB, Polverini PJ, Flores

165. Riveros JR. /Biological action of leptin as an angiogenic factor. // Science. 1998 Sep11;2 81(5383) :1683-6

166. Soker S, Takashima S, Miao HQ, Neufeld G, Klagsbrun M. /Neuropilin-1 is expressed by endothelial and tumor cells as an isoform-specific receptor for vascular endothelial growth factor.//Cell. 1998 Mar 20;92(6):735-45.

167. Soncin F. /Angiogenin supports endothelial and fibroblast cell adhesion. //Proc Natl Acad Sci USA. 1992 Mar 15;89(6):2232-6.

168. St Clair DK, Rybak SM, Riordan JF, Vallee BL. /Angiogenin abolishes cell-free protein synthesis by specific ribonucleolytic inactivation of 40S ribosomes. //Biochemistry. 1988 Sep 20; 27(19) :7263-8.

169. Stevenson SC, Rollence M, Marshall-Neff J, McClelland A. /Selective targeting of human cells by a chimeric adenovirus vector containing a modified fiber protein. // J Virol 1997 v.- 71(6), pp.4782-4790

170. Strydom DJ, Fett JW, Lobb RR, Alderman EM, Bethune JL, Riordan JF, Vallee BL. / Amino acid sequence of human tumor derived angiogenin. //Biochemistry. 1985 Sep 24;24 (20) :5486-94.

171. Sussenbuch J.S. /The Structure of the genome. // The Adenoviruses, ed. by H.S.Ginsberg, 1984.

172. Tomanek RJ, Holifield JS, Reiter RS, Sandra A, Lin JJ. /Role of VEGF family members and receptors in coronary vessel formation. //Dev Dyn. 2002 Nov;225(3):233-40.

173. Tschesche H, Kopp C, Horl WH, Hempelmann U. /Inhibition of degranulation of polymorphonuclear leukocytes by angiogenin and its tryptic fragment. //J Biol Chem. 1994 Dec 2; 269 (48):30274-80.

174. Vacca A, Iurlaro M, Ribatti D, Minischetti M, Nico B, Ria R, Pellegrino A, Dammacco F. /Antiangiogenesis is produced by nontoxic doses of vinblastine. //Blood. 1999 Dec 15;94 (12) :4143-55.

175. Van der Eb A. J., Mulder C., Graham F.L., Houwelling A. /Transformation with specific fragments of adenovirus DNA. I. Isolation of specific fragments with transforming activity of adenovirus 2 and 5 DNA. // Gene, 1977, v.- 2, pp.- 115-132.

176. Van der Eb A.J., van Kesteren J.W., van Bruggen E.F.J. /Structural properties of adenovirus

177. DNAs. // Biochem. Biophys. Acta, 1969, v.- 182, pp. -530-541.199 van Ormondt H, Galibert F / Nucleotide sequences of adenovirus DNAs, in Current Topics in Microbiology (Doerfler W, ed) , 1984 pp.- 73-142.

178. Wang H, Keiser JA. /Vascular endothelial growth factor upregulates the expression of matrix metalloproteinases in vascular smooth muscle cells: role of flt-1. //Circ Res. 1998 Oct 19; 83 (8):832-40.

179. Wang HU, Chen ZF, Anderson DJ. /Molecular distinction and angiogenic interaction between embryonic arteries and veins revealed by ephrin-B2 and its receptor Eph-B4. //Cell. 1998 May 29; 93 ( 5) :741-53

180. Washietl S, Eisenhaber F. /Reannotation of the CELO genome characterizes a set of previously unassigned open reading frames and points to novel modes of host interaction in avian adenoviruses. // BMC Bioinformatics. 2003 Nov 07;4(1):55.

181. Weiner HL, Weiner LH, Swain JL. /Tissue distribution and developmental expression of the messenger RNA encoding angiogenin. //Science. 1987 Jul 17;237 (4812) :280-2.

182. Weiss RS, Lee SS, Prasad BV, Javier RT / Human adenovirus early region 4 open reading frame 1 genes encode growth-transforming proteins that may be distantly related to dUTP pyrophosphatase enzymes.// J Virol 1997, v.-71, pp.- 1857-1870.

183. Wickham T.J., Mathias P., Cheresh D.A., Nemerow G.R. /Integrins avp3 and avPs promote adenovirus internalization but not virus attachment. // Cell., 1993, v.-73, pp.-309-319.

184. Wickham TJ, Segal DM, Roelvink PW, Carrion ME, Lizonova A, Lee GM, Kovesdi I. /Targeted adenovirus gene transfer to endothelial and smooth muscle cells by using bispecific antibodies. // J Virol 1996 v.-70(10), pp.6831-6838

185. Wold S.M., Tollef son A. E. /Adenovirus E3 proteins: 14,7K, RID, and gpl9K inhibit immune-induced cell death; adenovirus death protein promotes cell death. // Seminars in virology., 1998, v.-8, pp.-515-523.

186. Wold W, Tollef son A, Hermiston Т./ ЕЗ transcription unit of adenovirus. In: Doerfler W, Bohai P {eds).// The Molecular Repertoire of Adenoviruses, Springer-Verlag; Berlin, 1995, pp.- 237-274.

187. Xiao Y, Bicknell R, Vallee BL. /Angiogenin depresses aortic smooth muscle cell cAMP by a pertussis toxin sensitive mechanism. //Biochem Biophys Res Commun. 1989 Sep 15;163 (2) :902-7.

188. Xu Z, Monti DM, Hu G. /Angiogenin activates human umbilical artery smooth muscle cells. //Biochem Biophys Res Commun. 2001 Jul 27;285(4):909-14.

189. Xu ZP, Tsuji T, Riordan JF, Hu GF. /The nuclear function of angiogenin in endothelial cells is related to rRNA production. //Biochem Biophys Res Commun. 2002 Jun 7;294(2):28 7-92.

190. Yates V.J., Fry D.E./ Observations on a chicken embryo lethal orphan (CELO) virus. // Am. J. Vet. Res., 1957, v.- 18, pp.- 657-660.

191. Zabner J, Chillon M, Grunst T, Moninger TO, Davidson BL, Gregory R, Armentano D. /А chimeric type 2 adenovirus vector with a type 17 fiber enhances gene transfer to human airway epithelia. // J Virol 1999 v.-73(10), pp.8689-8695

192. Zabner J, Couture LA, Gregory RJ, Graham SM, Smith AE, Welsh MJ. /Adenovirus-mediated gene transfer transiently corrects the chloride transport defect innasal eplthelia of patients with cystic fibrosis. // Cell, 1993, v.- 75(2), pp.- 207-216.

193. Zhou H, O'Neal W, Morral N, Beaudet A./ Development of a complementing cell line and a system for construction of adenovirus vectors with El and E2a deleted.// J Virol 1996; v.-70, pp.- 7030-7038.

Информация о работе
  • Авдеева, Светлана Владимировна
  • кандидата биологических наук
  • Москва, 2005
  • ВАК 03.00.03
Диссертация
Создание рекомбинантных аденовирусов, экспрессирующих гены факторов роста кровеносных сосудов и изучение влияния этих вирусов на ангиогенез in vivo - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно
Автореферат
Создание рекомбинантных аденовирусов, экспрессирующих гены факторов роста кровеносных сосудов и изучение влияния этих вирусов на ангиогенез in vivo - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации
Похожие работы