Разработка системы продукции лактоферрина человека in ovo и in vivo с использованием рекомбинантных аденовирусов

Тутыхина, Ирина Леонидовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка системы продукции лактоферрина человека in ovo и in vivo с использованием рекомбинантных аденовирусов
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка системы продукции лактоферрина человека in ovo и in vivo с использованием рекомбинантных аденовирусов"

На правах рукописи

□□3454714

ТУТЫХИНА ИРИНА ЛЕОНИДОВНА

РАЗРАБОТКА СИСТЕМЫ ПРОДУКЦИИ ЛАКТОФЕРРИНА ЧЕЛОВЕКА IN OVO И IN VIVO С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РЕКОМБИНАНТНЫХ АДЕНОВИРУСОВ.

03.00.07. - микробиология 03.00.04. - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2008

003454714

Работа выполнена в ГУ научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи РАМН (ГУ НИИ ЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН) и Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский педагогический государственный университет» (ГОУ ВПО МПГУ).

Научные руководители: доктор биологических наук, доцент

Севастьянова Галина Андреевна

кандидат биологических наук, Шмаров Максим Михайлович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Пименов Николай Викторович

доктор биологических наук Топунов Алексей Федорович

Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение науки Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.

Защита состоится «28» ноября 2008 года в 11 часов на заседании диссертационного совета в ГУ НИИ ЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (123098, Москва, ул. Гамалеи, 18).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ ЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Автореферат разослан «_» октября 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Русакова Е.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Рекомбинантные аденовирусы широко используются в молекулярно-биологических, биомедицинских и микробиологических исследованиях. Аденовирусные векторы, несущие в составе генома чужеродные гены, например, антигенов микроорганизмов, являются удобным инструментом для исследования соответствующих белков in vitro и in vivo, а также служат основой для разработки нового поколения генно-инженерных вакцин. В последние годы активно разрабатываются различные схемы использования аденовирусных векторов для продукции рекомбинантных аналогов белков, применяемых с целью терапии и профилактики различных заболеваний человека (цитокинов, иммуномодуляторов, антител и др.), поскольку белки, полученные из природных источников, являются дорогостоящими и, зачастую, небезопасными для использования в биомедицинских целях. Применение векторов на основе аденовирусов человека и животных особенно актуально для продукции таких биологически-активных рекомбинантных аналогов белков человека, которые невозможно получить в системах экспрессии на основе клеток прокариот и низших эукариот (Е. coli, Sacharomyces cerevisiae, Aspergillus sp. и др.). В настоящее время разработаны способы получения рекомбинантного фактора роста нервов ß (Xiao В., 2008) и антител к коронавирусу (Havenga M.J., 2008) в клетках, трансдуцированных аденовирусными векторами, содержащими в составе генома экспрессирующую кассету с геном соответствующего белка. Использование в этих работах векторов на основе аденовируса человека 5-го серотипа обусловлено безопасностью и высокой эффективностью такого типа векторов, что доказано в результате многочисленных исследований, в том числе и I, II и III фаз клинических испытаний. Однако все разрабатываемые в настоящее время на основе рекомбинантных аденовирусов 5-го серотипа системы экспрессии для получения препаративного количества белка характеризуются высокой себестоимостью. В этой связи, актуальным является разработка новых подходов к продукции рекомбинантных белков человека. Одним из таких подходов является синтез рекомбинантных белков в куриных эмбрионах. Куриные эмбрионы - одна из наиболее экономичных и безопасных (в случае использования SPF-эмбрионов) биотехнологическая система, применяемая на протяжении уже не одного десятка лет. Важной характеристикой данной системы служит схожесть аппарата транскрипции и трансляции с таковым

млекопитающих, что необходимо для получения биологически-активных белков человека.

Для доставки и экспрессии генов в курином эмбрионе перспективным является использование векторов на основе аденовируса птиц 1-го серотипа (chicken embryo lethal orphan) -CELO. В работе JI.B. Череновой (2004 г.) показано, что при размножении в курином эмбрионе рекомбинантного вируса CELO, в аллантоисной жидкости происходило накопление продукта экспрессии гена интерлейкина-2, включенного в состав его генома. Данный факт служит предпосылкой для разработки на основе CELO эукариотической системы продукции рекомбинантных белков в курином эмбрионе.

Примером белков человека, нуждающихся в разработке для его продукции новых систем экспрессии, является лактоферрин. Он обладает перспективными в биофармацевтическом плане свойствами: антибактериальной, иммуномодулирующей, противовоспалительной и антиоксидантной активностью. Многогранность физиологических функций Лф обусловливает перспективность создания на его основе лекарственных средств широкого спектра действия. В настоящее время в клинике используется лактоферрин, выделяемый из донорского женского молока. В связи с этим, широкое его применение ограничивается недостаточностью сырья. Поэтому получение рекомбинантного аналога лактоферрина человека аутентичного природному белку в препаративных количествах является актуальной задачей.

Серьезной проблемой при использовании белков в качестве лекарственных средств для парентеральном введения, является их быстрая элиминация из организма за счет действия протеолитических ферментов и клеток иммунной системы. Например, при внутривенной инфузии лактоферрина человека период его полураспада в организме составляет всего несколько часов. Пролонгация действия препарата в организме достигается путем его регулярного введения в течение 5-7 дней через каждые 12-24 часа, что зачастую является причиной токсических состояний реципиентов. Новым подходом к решению данной проблемы может стать доставка и длительная экспрессия гена целевого белка непосредственно в организме, осуществляемая аденовирусными векторами. Наиболее целесообразно использование вектора на основе аденовируса 5-го серотипа.

Таким образом, получение рекомбинантных аденовирусов человека и птиц, экспрессирующих ген лактоферрина человека, для

продукции биологически-активного белка in vivo и в курином эмбрионе, является актуальным направлением исследований.

Цель исследования: получение рекомбинантных аденовирусов млекопитающих и птиц, экспрессирующих ген лактоферрина человека, для продукции биологически-активного рекомбинантного лактоферрина в эукариотических клетках in ovo и in vivo. В процессе работы предстояло решить следующие задачи:

1. Создание вектора на основе генома аденовируса птиц CELO, обеспечивающего повышенный уровень экспрессии целевого гена в пермиссивной и непермиссивной системе.

2. Конструирование рекомбинантных аденовирусов CELO-Lf и Ад5-Lf, экспрессирующих ген лактоферрина человека.

3. Анализ экспрессии рекомбинантного лактоферрина человека в культуре эукариотических клеток, инфицированных полученными аденовирусными векторами.

4. Изучение продукции рекомбинантного лактоферрина человека в клетках млекопитающих in vivo на модели лабораторных животных.

5. Получение рекомбинантного лактоферрина человека в куриных эмбрионах, инфицированных аденовирусным вектором CELO-Lf.

6. Изучение физико-химических, антигенных и биологических свойств (антиоксидантная активность) рекомбинантного лактоферрина человека.

Научная новизна.

- Впервые был получен рекомбинантный аденовирус птиц CELO, обеспечивающий повышенный уровень экспрессии целевого гена в пермиссивной и непермиссивной системе in vitro, in ovo и in vivo. Для этой цели впервые были использованы регуляторные 5'-нетранслируемые элементы поздней области транскрипции генома вируса CELO - двучастный лидер и лидер гена гексона. В результате проведенных экспериментов по трансфекции плазмидными конструкциями p415BPL-SEAP и p415BPLwhl-SEAP, а также трансдукции вирусом CELO-BPLwhl-SEAP пермиссивных и непермиссивных клеточных культур показана функциональная независимость двучастного лидера от цис-транс взаимодействия с вирусом CELO.

- Впервые было установлено на примере 5'-нетранслируемой области гена гексона, что подобные структурные элементы генов поздней области транскрипции генома аденовируса имеют важное значение в процессе экспрессии чужеродных белков.

- Сконструирован рекомбинантный аденовирус птиц CELO-Lf, несущий экспрессирующую кассету с геном лактоферрина человека

под контролем HCMV-промотора, двучастного лидера и 5'-нетранслируемой области гена гексона вируса CELO.

Разработана новая эукариотическая система продукции рекомбинантного лактоферрина человека в клетках куриного эмбриона in ovo с использованием аденовирусного вектора CELO-Lf. Была показана аутентичность рекомбинантного Лф человека природному белку.

- В экспериментах in vivo определена длительность и уровень экспрессии лактоферрина человека в составе рекомбинантных аденовирусов CELO-Lf и Aa5-Lf после системного введения препаратов данных вирусов лабораторным животным. Произведено сравнение содержания лактоферрина в сыворотке крови крыс по временным и количественным характеристикам после введения препаратов рекомбинантных вирусов и препарата белка лактоферрина, выделенного из женского молока.

Практическая значимость.

Рекомбинантный аденовирус АдЗ-Lf в перспективе может стать основой для разработки генно-инженерного препарата, который обеспечит экспрессию и длительную циркуляцию рекомбинантного Лф человека в организме, что позволит заменить его регулярное введение. В дальнейшем на основе векторов Ад5 и CELO могут быть созданы эффективные системы экспрессии других биологически-активных рекомбинантных белков человека как ш vivo, в организме реципиента, так и in ovo, в курином эмбрионе.

Получено положительное решение о выдаче патента по заявке № 2007120447 от 1 июня 2007 года «Способ получения биологически активного рекомбинантного белка лактоферрина человека».

Внедрение результатов работы в практику.

Экспрессирующая кассета, содержащая двучастный лидер и 5'-нетранслируемую область гена гексона, внедрена в работу лаборатории молекулярной биотехнологии ГУ НИИ ЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН для создания плазмид и рекомбинантных аденовирусных векторов на основе генома аденовируса птиц CELO, обеспечивающих повышенный уровень экспрессии целевых генов.

Коллекция рекомбинантных аденовирусов: CELO-BPLwhl-SEAP, CELO-Lf, CELOdDKb и АдЗ-Lf - хранится в музее лаборатории молекулярной биотехнологии ГУ НИИ ЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Препарат рекомбинантного лактоферрина человека, экспрессированного в клетках куриного эмбриона in ovo с использованием аденовирусного вектора CELO-Lf, и препарат

рекомбинантного аденовируса Адб-Lf подготовлены к предклиническим испытаниям.

Материалы диссертации используются в лекциях для студентов ГОУ ВПО «Московский государственный университет прикладной биотехнологии» в рамках курса молекулярной биотехнологии.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на XVIII зимней молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии " (Москва, 2006), XX зимней молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии " (Москва, 2008), расширенном заседании кафедры органической и биологической химии Московского Педагогического Государственного Университета 16 июня 2008 года. Апробация диссертации состоялась на совместном заседании отдела «Генетики и молекулярной биологии бактерий» и отдела «Медицинской микробиологии» 13 октября 2008 г. ГУ НИИ ЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 научных работы, в том числе 2 в журналах, рекомендованных ВАК, и 3 статьи в сборниках международных конференций.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 144 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы и список используемой литературы (264 источника, из которых 13 отечественных и 251 иностранных). Работа содержит 5 таблиц и 25 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Работа выполнена в период с 2003 по 2008 год на кафедре органической и биологической химии МПГУ и в лаборатории молекулярной биотехнологии ГУ НИИ ЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН. Эксперименты по определению экспрессии рекомбинантного лактоферрина человека в культуральной среде, аллантоисной жидкости и в сыворотке крови лабораторных животных, а также эксперименты по очистке рекомбинантного лактоферрина человека из культуральной и аллантоисной жидкостей были выполнены совместно с лабораторией модификаторов и протекторов противоопухолевой терапии ФГУ МНИОИ им. П.А. Герцена.

В работе были использованы: - аденовирус птиц CELO штамм Phelps (полученный от д-ра А. Ван Дер Эба, лаборатория физиологической химии Лейденского

университета), плазмида pCMV-Lf, несущая ген лактоферрина человека, была любезно предоставлена Шиловым И.А. (лаборатория анализа геномов, ВНИИСБ РАСХН), плазмида pBPL была любезно предоставлена к.б.н. Грабко В.И. (лаборатория биологически-активных наноструктур, IT НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН);

- лабораторные штаммы Escherichia coli DH5a и BJ5183; клеточная линия LMH (leghorn male hepatoma), любезно предоставленная М. Cotten (Австрия);

- плазмидные векторы pBssk (+) ("Fermentas MBP'), pcDNA3.1/Zeo(+) ("Invitrogen"), плазмидная система pGEM-T-Easy (Promega); плазмида pCMV-Lf была любезно предоставлена Шиловым H.A. (ВНИИСБ РАСХН); плазмида pBPL была любезно предоставлена к.б.н. Грабко В.И. (ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН).

- коммерческие препараты специфических эндодезоксирибонуклеаз и других ферментов фирм "Fermentas MBI" (Литва), "Promega" (США) и «NE BioLabs» (США). Для постановки реакции обратной транскрипции использовали набор Reverse Tpanscription System («Invitrogene», США). Синтез праймеров был выполнен в ООО «Синтол». Секвенирование проводилось в НПФ «Литех».

Эксперименты проводились на мышах линии BALB\c и С57В16, возраст 8 недель, самки массой 20-22 г; беспородных крысах, самки массой 200-250 г и 9-дневных куриных SPF эмбрионах.

Все генно-инженерные манипуляции проводились по стандартным методам, изложенным в Maniatis et al. (1982). Все манипуляции, связанные с работой с аденовирусами, проводили согласно Graham & Prevec (1991). Анализ антигенных свойств рекомбинантного лактоферрина человека и оценку уровня его экспрессии проводили с использованием методов иммуноблоттинга и сэндвич-ИФА. Очистку рекомбинантного лактоферрина человека из культуральной и аллантоисной жидкости проводили методом аффинной хроматографии на матрице активированной CNBr сефарозы 4В с ковалентно связанными высокоочищенными антителами к лактоферрину человека. Статистическую обработку результатов проводили общепринятыми методами с использованием программы Microsoft Excel. В работе использованы материалы, полученные лично автором, а также в соавторстве с к.б.н. Логуновым Д.Ю., к.б.н. Шмаровым М.М., к.б.н. Верховской Л.В. - сотрудниками лаборатории молекулярной биотехнологии ГУ НИИ ЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, сотрудниками лаборатории модификаторов и протекторов противоопухолевой терапии ФГУ МНИОИ им. П.А. Герцена д.б.н. Немцовой Е.Р. и к.б.н. Безбородовой O.A., которым выражаю глубокую благодарность за помощь и поддержку.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ Конструирование вектора на основе генома аденовируса птиц CELO, обеспечивающего повышенный уровень экспрессии гена секретируемой щелочной фосфатазы в пермиссивной и непермиссивной системе in vitro и in vivo.

С целью определения оптимального состава регуляторных элементов экспрессирующей кассеты, обеспечивающих повышенный уровень экспрессии гена в клетках млекопитающих и птиц необходимо было оценить влияние на уровень экспрессии репортерного гена SEAP дополнительных регуляторных элементов -BPL и нетранслируемой области гена гексона, включенных в состав экспрессирующей кассеты. Для этого было сконструировано два плазмидных вектора. В составе экспрессирующей кассеты одного из векторов содержался BPL и лидер гена гексона (p415BPLwhl-SEAP), другого - только BPL (p415BPL-SEAP) (рис. 1).

P415CD

СН-О-1 ^_CELO-a

* с-"1" i

p4]5BPtw)H-SE«P

j.BPl

AmpR

Рис. 1. Схема плазмидных конструкций, содержащих ген секретируемой щелочной фосфатазы (SEAP).

Условные обозначения: CMV- промотор El области цитомегаловируса человека; BPL -двучастный лидер вируса CELO; HL -5'-нетранслируемая область гена гексона; BGHp(A) -сигнал полиаденилирования гена бычьего гормона роста; AmpR - ген устойчивости к ампициллину; CELO-1 - участок генома вируса CELO от 43685 до 43804 п.н.; CELO-2 -участок генома вируса CELO от 38897 до 41731 п.н.

В результате серии экспериментов было выявлено, что экспрессирующая кассета с геном SEAP под контролем промотора CMV и BPL с нетранслируемой областью гена гексона обеспечивает повышение уровня экспрессии трансгена в пермиссивной и непермиссивной для вируса CELO культуре клеток в 3 раза.

Исходя из полученного результата, при дальнейших исследованиях с целью создания вектора на основе генома аденовируса птиц CELO, обеспечивающего повышенный уровень

экспрессии гена в непермиссивной системе, было решено использовать экспрессирующую кассету плазмидной конструкции р415BPLwhl-SEAP.

Для получения рекомбинантного аденовируса CELO, несущего экспрессирующую кассету с BPL и 5 '-нетранслируемой областью гена гексона, проводили котрансфекцию клеток линии LMH плазмидой p415BPLwhl-SEAP совместно с фрагментом геномной ДНК вируса CELO от 0 до 99,5 ед. карты. Данный фрагмент был получен из ДНК CELO после ее гидролиза рестриктазой Swa I. Процесс рекомбинации гомологичных участков геномной и плазмидной ДНК в клетках приводил к генерации рекомбинантного вируса CELO-BPLwhl-SEAP, несущего экспрессирующую кассету с геном SEAP под контролем промотора CMV с BPL и 5'-нетранслируемой областью гена гексона в области делеции "несущественного" участка генома.

Чистоту полученного препарата рекомбинантного вируса CELO-BPLwhl-SEAP определяли полимеразно-цепной реакцией. В результате было показано, что исследованный препарат содержит ДНК рекомбинантного вируса и не содержит примеси ДНК вируса CELO дикого типа.

В!

та

í ™

щ ^¡ш

. JfJI", * ;ЙЙВ£

ч 2Q

I «

, j*8,

ИЧ+РЧР

ПШЛ-5НР

■5Е|_0-ВИ-«|№5ЕАР

Рис. 2. Уровень активности вЕАР в культуральной среде клеток 293 линии, Н1299 и ЬМН, трансдуцированных рскомбинантными аденовирусами СЕЬО-вЕАР и СЕЬО-BPLwhl-SEAP.

На следующем этапе работы клетки линий LMH, 293 и Н1299 были трансдуцированы оптимальными дозами вирусов СЕЕО-BPLwhl-SEAP и СЕЕО-8ЕАР, содержащего ген БЕАР под контролем промотора СМУ без 5'-нетранслируемых регуляторных элементов. Количество копий геномов обоих вирусов, проникших в клетки, было определено методом ПЦР в реальном времени. Полученные данные позволяют сравнивать уровень экспрессии БЕАР в клетках,

трансдуцированных двумя вирусами с одинаковой степенью. Сравнение уровня экспрессии щелочной фосфатазы проводили в образцах культуральной жидкости, которую отбирали в течение трех дней каждые 24 часа.

Увеличение уровня экспрессии SEAP за счет влияния дополнительных регуляторных элементов в составе экспрессирующей кассеты было выявлено и в пермиссивных для вируса CELO клетках, и в непермиссивных (рис. 2). Включение в экспрессируюшую кассету BPL и 5'-нетранслируемой области гена гексона позволило увеличить экспрессию фермента в клетках 293 линии в 2,5 раза, в клетках линии Н1299 - в 2,8 раза, а в клетках линии LMH - в 2 раза (рис. 2).

На следующем этапе работы для определения величины прироста уровня экспрессии трансгена на примере SEAP, обеспечиваемого наличием в составе экспрессирующей кассеты вируса CELO BPL и нетранслируемой области гена гексона, in ovo, была произведена инфекция вирусом CELO-BPLwhl-SEAP 9-дневных куриных эмбрионов. Заражение эмбрионов производилось в аллантоисную полость вируссодержащей культуральной жидкостью в титре 5*107 БОЕ на эмбрион. Аллантоисная жидкость отбиралась из каждого эмбриона в течение четырех дней инкубации с периодичностью в 24 часа. Максимум активности SEAP наблюдался на 3 сутки инкубации в случае инфекции и вирусом CELO-SEAP и CELO-BPLwhl-SEAP. Однако в случае заражения куриных эмбрионов вирусом CELO-BPLwhl-SEAP уровень экспрессии репортерного гена был в 2 раза выше, чем при заражении вирусом CELO-SEAP (рис. 3).

Рис. 3. Уровень активности ЭЕАР в аллантоисной жидкости куриных эмбрионов, инфицированных аденовирусами СЕЬО-вЕАР (1) и СЕЬО-ВР1луЫ-8ЕАР (2).

В качестве отрицательного контроля (К(-)) был использован аллантоис из неинфицированных эмбрионов.

Таким образом, в ходе эксперимента было установлено, что использование экспрессирующей кассеты, содержащей BPL и

нетранслируемую область гена гексона в составе рекомбинантного вируса CELO, позволяет увеличить уровень экспрессии трансгена в клетках куриного эмбриона in ovo в 2 раза.

Для определения уровня экспрессии секретируемой щелочной фосфатазы рекомбинантным аденовирусом CELO-BPLwhl-SEAP in vivo самкам мышей линии BALB/c в глазной венозный синус были введены рекомбинантные аденовирусы CELO: одной группе из десяти мышей был введен вирус CELO-BPLwhl-SEAP, второй -контрольный вирус CELO-SEAP. Доза вводимого препарата составляла 5><108 БОЕ на мышь в объеме 100 мкл. Третья группа мышей использовалась в качестве отрицательного контроля. Отбор крови производился через 48,72 и 96 часов после инъекции. Уровень активности SEAP был измерен в сыворотке крови. Уровень активности SEAP в сыворотке крови мышей контрольной группы находился в пределах 1±0,8 (Р<0,5).

В результате было выяснено, что рекомбинантный вирус CELO-BPLwhl-SEAP, содержащий в составе экспрессирующей кассеты BPL и 5'-нетранслируемую область лидера гексона позволяет повысить уровень экспрессии целевого гена in vivo в 3,5 раза по сравнению с контрольным вирусом CELO-SEAP (рис.4).

48 72 ВО

«реи. часы | OCaO-SEAP «CaftBPt-SEAP

Рис. 4. Уровень активности SEAP в сыворотке крови мышей после инъекции вирусов CELO-SEAP и CELO-BPLwhl-SEAP.

Таким образом, нами был сконструирован рекомбинантный аденовирус птиц CELO, несущий экспрессирующую кассету с дополнительными регуляторными элементами - BPL и нетранслируемой областью гена гексона вируса CELO. Использование рекомбинантного вируса CELO с предложенной нами экспрессирующей кассетой в пермиссивной для вируса CELO

системе - культуре клеток LMH и курином эмбрионе in ovo позволяет увеличить уровень экспрессии трансгена в 2 раза. При трансдукции вирусом непермиссивной системы - культуры клеток млекопитающих - уровень экспрессии трансгена возрастает в 3 раза. При внутривенном введении вируса CELO с усиленной экспрессирующей кассетой млекопитающим (мышам) in vivo эффект возрастает до 3,5 раз.

Использование такой экспрессирующей кассеты в составе рекомбинантных аденовирусов птиц CELO, позволит увеличить выход продукта экспрессии целевого гена in vitro, in ovo и in vivo.

Конструирование рекомбинантного аденовируса птиц CELO, несущего экспрессирующую кассету с геном Лф человека.

Схема конструирования челночного плазмидного вектора, несущего фрагменты генома Ад CELO от 36248 - 40065 п.н. и 4368543804 п.н. представлена на рисунке 5.

Рис. 5. Схема конструирования челночного плазмидного вектора, несущего фрагменты генома Ад CELO от 36248 - 40065 п.н. и 43685-43804 п.н.

сы

36248 пл.

Kpnl *ХЫ n.M.

Еюэа 43804 пл 43665 rui mteuaCELO

Конструирование челночного плазмидного вектора pCBEdl3Kb, обеспечивающего встраивание чужеродного генетического материала в область делении генома вируса CELO, составляющую 3620 п.н., проводили с использованием фрагмента генома аденовируса CELO от 36248 п.н. до 40065 п.н., полученного путем гидролиза ДНК вируса птиц CELO по сайтам для рестриктаз Clal и Kpnl и клонированного в плазмидный вектор pBluescript II KS(+) по сайтам для рестриктаз Clal и Kpnl. Из полученного плазмидного вектора pBS-CELO-R указанный фрагмент аденовирусного генома субклонировали в плазмиду pCBEdlRV, несущую фрагмент генома аденовируса CELO 43685-43804 п.н. по сайтам для рестриктаз Kpnl и Есо321 (рис. 5). Для конструирования челночного плазмидного вектора pCBEdl3K-BPL/Lf в полученный плазмидный вектор pCBEdl3Kb по сайту EcoR32I клонировали экспрессирующую кассету, содержащую промотор цитомегаловируса человека (CMV), BPL, нетранслируемую область гена гексона и сигнал полиаденилирования BGH р(А). В результате была получена плазмидная конструкция pCBEdl3Kb-BPL. Далее в плазмиду pCBEdl3Kb-BPL из плазмиды pCMV-Lf был клонирован ген лактоферрина человека.

Таким образом, был получен челночный плазмидный вектор pCBEdl3Kb-BPL/Lf содержащий фрагменты генома вируса птиц CELO 36248-40065 н.п. и 43685-43804 н.п., необходимые для гомологичной рекомбинации в клетках линии LMH с ДНК вируса CELO, и экспрессирующую кассету с геном лактоферрина человека.

Конструирование рекомбинантных аденовирусных векторов CELO-Lf и CELOdl3Kb проводили по схеме, аналогичной описанной ранее схеме получения рекомбинантного аденовируса CELO-BPLwhl-SEAP.

Препаративное количество вируса было получено в результате инфекции десятидневных SPF куриных эмбрионов культуральным препаратом. Титр препаратов вирусов CELO-Lf и CELOdBKb составил 2х Ю10 БОЕ/мл и Ю10 БОЕ/мл, соответственно.

Чистоту препаратов рекомбинантных вирусов CELO-Lf и CELOdDKb определяли полимеразно-цепной реакцией. В результате было показано, что исследованные препараты содержат ДНК рекомбинантных вирусов и не содержат примеси ДНК вируса CELO дикого типа.

Конструирование рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа, экспрессируюшего ген лактоферрина человека.

Получение рекомбинантного аденовируса Afl5-Lf проводили в соответствии с методикой, прилагаемой к коммерческой системе для

получения рекомбинантных Ад5 «AdEasy™». Контрольный вирус Ад5-пи11, содержащий в области делеции генома вируса экспрессирующую кассету без гена, был получен аналогично.

Для получения A«5-Lf методом гомологичной рекомбинации в клетках Е. coli ген Лф человека был клонирован в челночный плазмидный вектор pShuttle-CMV. В результате была получена плазмидная конструкция pShuttle-lf, содержащая в своем составе участки генома аденовируса человека 5-го серотипа, необходимая для гомологичной рекомбинации, и экспрессирующая кассету с геном рекомбинантного Лф человека. Далее производилась гомологичная рекомбинация в клетках Е. coli штамма BJ5183 между плазмидами pShuttle-lf или pShuttle-CMV и pAd-Easy, в результате чего было получено две плазмидные конструкции: рАдЗ-Lf и рАд5-null. Плазмида рАдЗ-Lf содержит полноразмерный геном Ад5 со вставкой экспрессирующей кассеты с геном Лф человека в области делеции ранней области транскрипции генома El, плазмида рАд5-null - полноразмерный геном Ад5 со вставкой экспрессирующей кассеты без гена. Затем производилась трансфекция клеток линии 293 плазмидой рАдЗ-Lf или рАд5-пи11. В результате получали вирусы A«5-Lf и Ад5-пи11.

Чистоту препаратов рекомбинантных вирусов Afl5-Lf и Ад5-null определяли полимеразно-цепной реакцией. В результате было показано, что препараты Afl5-Lf и Ад5-пи11 содержали ДНК рекомбинантных вирусов и не содержали примеси ДНК вирусов дикого типа.

Анализ экспрессии Лф человека рекомбинантными аденовирусами CELO-Lf и Aj5-Lf in vivo.

Целью данной серии экспериментов было оценить потенциальную возможность применения аденовирусных векторов для продукции Лф непосредственно в организме реципиента при системном введении. Для этого необходимо было произвести анализ уровня и динамики экспрессии рекомбинантного Лф человека in vivo в организме лабораторных животных (мышей и крыс).

Изучение зависимости уровня экспрессии Лф человека от дозы вводимых рекомбинантных аденовирусов CELO-Lf и Ad5-Lf in vivo.

Эксперимент по изучению зависимости уровня экспрессии Лф человека от дозы вводимого рекомбинантного Ад производился по следующей схеме. Мышам линии С57В16 внутривенно вводились рекомбинантные аденовирусы CELO-Lf и Afl5-Lf. Каждый вирус

вводился в дозах: 1х109, 1хЮ8 и 1х107 БОЕ/мышь. В контрольные группы вошли животные, которым вводили Ад5-пи11, несущий экспрессирующую кассету без гена Лф человека, в дозе 1хЮ9 БОЕ/мышь, и СЕШсИЗКЬ без экспрессирующей кассеты в области делеции генома 40065 - 43685 н.п. в той же дозе.

Максимальный уровень экспрессии трансгена при внутривенном введении в организм мышей рекомбинантных аденовирусов наблюдается на 3 сутки после введения. Поэтому при изучении зависимости уровня рекомбинантного белка от дозы вводимой конструкции забор крови проводили на 3 сутки. Для оценки переносимости конструкций наблюдение за животными продолжали до 21 суток, регистрируя их общее состояние.

В результате проведенного анализа выявили (рис. 6), что продукция рекомбинантного Лф человека в сыворотке крови возрастает с увеличением дозы любого из введенных рекомбинантных аденовирусов с геном Лф. Максимальная концентрация рекомбинантного Лф человека (1135,8±534,3 мкг/мл) выявлялась при введении вируса Ад5-Ь£ в дозе 1><109 БОЕ/мышь. Снижение вводимой дозы Ад до 1хЮ8 БОЕ/мышь приводило к 10-и кратному уменьшению уровня Лф в крови (130,6±42,3мкг/мл), а при введении 1хЮ7 БОЕ/мышь уровень рекомбинантного Лф человека в сыворотке крови был минимальным - 0,5±0,1мкг/мл. В сыворотке крови мышей контрольной группы (Ад5-пи11) Лф отсутствовал.

CELO'Lf

АД54.Г

Не группы животных

Нг группы животных

Рис. 6. Экспрессия рекомбинантного Лф человека в сыворотке крови мышей при введении рекомбинантных аденовирусов CELO-Lf и Ад5-ЬГ в разных дозах.

Рекомбинантные аденовирусы CELO-Lf и Afl5-Lf вводились в дозах: 1x10® БОЕ/мышь (1), 1х108 БОЕ/мышь (2), 1хЮ7 БОЕ/мышь (3), контрольные вирусы Ад5- null и CELOdl3Kb в дозе 1 х 1 о® БОЕ/мышь (4); опытные и контрольные группы состояли из 5 животных.

При введении рекомбинантного Ад CELO-Lf животным максимальная концентрация рекомбинантного Лф человека выявлялась также в группе мышей, где доза вируса была наибольшей -1x10 БОЕ/мышь. Уровень Лф в крови животных, которым вводился

вирус СЕЬО-ЬГ, был на 0,5-1 порядок ниже, чем в крови животных, которым вводился Ад5-Ь£ в той же дозе. При введении 1x10 БОЕ/мышь вируса СЕЬО-Ы- и контрольного вируса СЕЬОсНЗКЬ рекомбинантный Лф человека в сыворотке крови не детектировался. Наблюдение за животными в течение всего времени экспериментов не выявило токсического действия конструкций: не отмечено гибели мышей от токсичности и различий в поведенческих реакциях животных контрольной и опытных групп.

Изучение динамики продукции рекомбинантного Лф в сыворотке крови животных после введения рекомбинантных аденовирусов СЕЮ-Ь/иАд5-Ь

Динамику продукции рекомбинантного Лф в сыворотке крови животных изучили на инбредных крысах, которые были трансдуцированы рекомбинантными аденовирусами СЕЬО-ЬГ и Ад5-ЬГ с геном Лф в дозе 1х109 БОЕ/крыса. Длительность эксперимента составляла 48 суток, в течение которых производили отбор крови животных, после чего в сыворотке определяли уровень рекомбинантного Лф.

В группы сравнения вошли крысы, которым вводили внутривенно Лф человека, выделенный из женского молока (препарат Лапрот), в дозе 5 мг/крыса. Отбор крови животных, которым был введен белковый препарат (в группах сравнения), производили в течение первых 24-х часов.

На рисунке 7 представлены типичные профили экспрессии рекомбинантного Лф человека в сыворотке крови крыс. Как видно из представленных данных, после введения препарата Ад5-ЬГ Лф детектировался в сыворотке крови крыс вплоть до 28 дня, а при введении СЕЬО-Ь£ - до 21-го дня. В сыворотке крови крыс контрольных групп (Ад5-пи11 и СЕЬОсНЗКЬ) Лф детектирован не был. При этом динамика продукции рекомбинантного Лф в крови отдельных животных была сходной, однако максимальная концентрация и длительность экспрессии различались. Так, у крыс с максимальной концентрацией Лф (200±50 мкг/мл) наблюдалась и наиболее длительная экспрессия - до 48 суток, тогда как у животных с меньшей концентрацией (не более 140 мкг/мл) Лф выявлялся лишь в течение 28 суток (рис. 7). В сыворотке крови крыс группы сравнения, которым вводили Лф человека (Лапрот), его уровень можно было определить методом иммуноферментного анализа лишь в течение 3-х часов (рис. 7).

Следует отметить, что в течение первых 10-ти суток после введения препаратов рекомбинантных вирусов в организм,

содержание Лф человека в крови животных, трансдуцированных Ад5-1/, составляло более 100 мкг/мл, а трансдуцированных СЕЬО-ЬГ - более 30 мкг/мл. Показано, что концентрация Лф человека в крови животных, получивших инъекцию препарата Лф в виде белка, более 30 мкг/мл наблюдается только в течение первых 3-х часов.

(А)

(Б)

время, дай

0 5 10 15 20 25

вре|м,дки

Рис. 7. Концентрация Лф человека в сыворотке крови крыс (п=5) после введения Лф человека, выделенного из женского молока (препарат «Лапрот») (А) и рекомбинантных аденовирусов Ад5-Ы (Б) и СЕЬО-ЬГ (В).

Наблюдение за крысами, также как за мышами, не выявило токсического действия рекомбинантных аденовирусов: не отмечено гибели животных от токсичности и отличий в поведенческих реакциях животных из опытных и контрольных групп.

Таким образом, полученные нами на лабораторных животных данные свидетельствуют о перспективности применения аденовирусных векторов для разработки генно-инженерного препарата, который обеспечит экспрессию и длительную циркуляцию

рекомбинантного Лф человека в организме, что позволит заменить его регулярное введение.

Анализ экспрессии ЛФ человека рекомбинантным аденовирусом CELO-Lf in ovo.

Целью данной серии экспериментов была разработка системы продукции рекомбинантного Лф человека в курином эмбрионе in ovo с использованием аденовирусных векторов.

После определения оптимальной дозы инфекции куриных эмбрионов вирусом CELO-Lf, которая составила 10 БОЕ/эмбрион и оптимального периода инкубации инфицированных эмбрионов, соответствующего максимальному уровню экспрессии рекомбинантного Лф в аллантоисной жидкости (72 часа), был произведен эксперимент по определению максимальной концентрации рекомбинантного Лф человека в аллантоисной жидкости одного куриного эмбриона.

Для этого две партии куриных яиц с эмбрионами 9-го дня развития были инфицированы оптимальной дозой вируса CELO-Lf (107 БОЕ/эмбрион). Контрольную группу куриных эмбрионов инфицировали вирусом CELOdBKb. Через 24, 48 и 72 часа после инфекции у 5-ти эмбрионов каждой группы тотально отбиралась аллантоисная жидкость, объем которой измерялся. В результате было показано, что содержание рекомбинантного Лф человека в аллантоисной жидкости одного эмбриона составляет в среднем 0,8±0,2 мг/эмбрион (рис. 8).

1400 j 120D

I 1000 || 600

II еоо

f * 400

0 12 3

время инсубэции.дш

Рис. 8. Содержание рекомбинантного Лф человека в аллантоисной жидкости куриных эмбрионов, инфицированных вирусом CELO-Lf в дозе 107 БОЕ/эмбрнон.

Результаты проведенных экспериментов позволяют говорить о том, что аденовирусный вектор CELO-Lf можно использовать для создания системы продукции рекомбинантного Лф человека в курином эмбрионе in ovo. Концентрация рекомбинантного Лф в аллантоисной жидкости куриных эмбрионов, инфицированных вирусом CELO-Lf, достигает 100 мг/л.

Анализ аутентичности рекомбинантного Лф, экспрессируемого рекомбинантными аденовирусными векторами, природному.

Для анализа аутентичности была произведена очистка методом аффинной хроматографии рекомбинантного Лф, экспрессируемого рекомбинантными векторами Ад5-ЬГ и СЕЬО-Ь£ Очистку Лф производили по схеме, разработанной в МНИОИ им. П.А. Герцена коллективом авторов под руководством Якубовской Р.И.

Рекомбинантный Лф человека выделяли из культуральной жидкости клеток, инфицированных Ад5-1^ в дозе 5 БОЕ/кл, и из аллантоисной жидкости куриных эмбрионов, инфицированных вирусом СЕЬО-ЬГ в дозе 10 БОЕ на эмбрион. Предварительно в белоксодержащих жидкостях была измерена концентрация Лф («сэндвич» - ИФА), которая в случае культуральной жидкости составила 19,5 мкг/мл, а в случае аллантоисной - 74,4 мкг/мл. Выход белка после очистки в обоих случаях составил более 80% (таблица 1).

№ Образец Общее количество Лф, мкг Выход после очистки

мкг %

1. Лф, выделенный из аллантоисной жидкости куриных эмбрионов, инфицированных СЕШ-Ь£ 7440 6570 88

2. Лф, выделенный из культуральной жидкости клеток линии 293, инфицированных Ад5-Ь£ 1164 1000 85,9

Таблица 1. Эффективность очистки рчЛф из культуральной и аллантоисной жидкости.

После очистки был произведен анализ препаратов Лф на присутствие в них инфекционных вирусных частиц и ДНК аденовирусов методами ПЦР и титрования по бляшкам. После доочистки путем обработки ДНКазой и ультрафильтрации через мембранный фильтр 300 КДа в материале, содержащем рекомбинантный Лф, вирусного материала не выявлено. Содержание Лф человека в исследуемых образцах, выделенных из культуральной и аллантоисной жидкости до этапа доочистки, составляло 335 мкг/мл и 1314 мкг/мл, после - 289 мкг/мл и 1116 мкг/мл, соответственно.

Полученные препараты очищенного Лф были проанализированы методом электрофореза в ПААГ и методом иммуноблоттинга (рис. 9, 10). По данным электрофоретического анализа было выявлено, что препараты Лф, очищенные из культуральной и аллантоисной жидкости, содержат белок, молекулярная масса которого составляет 78 Kda, что соответствует молекулярной массе образцов Лф из донорского женского молока («Лапрот» и «Sigma»). В результате

иммуноблоттинга взаимодействуют человека.

было показано, что эти белки специфически с моноклональными антителами против Лф

(А) (В)

1 2 3 4 1 2 3

м 38 Юа

Рис. 9. Электрофоретический (А) и Western-Blot (Б) анализ Лф, выделенного из культуральной жидкости клеток, инфицированных Ад5-Ь£

1- Лф из культуральной жидкости;

2- Лф из женского молока;

3- Лф «Sigma»;

4- Маркеры молекулярной массы.

(А) (Б)

Рис. 10. Электрофоретический (А) и Western-Blot (Б) анализ Лф, выделенного из аллантоисной жидкости куриных эмбрионов, инфицированных CELO-Lf.

1- Лф из аллантоисной жидкости;

2- Лф из женского молока;

3- Лф «Sigma».

1 2 3 4 5 17

Лф из Лф из

аллантоисной женского жидкости молока

Рис. 11. Электрофоретический анализ обработанного PNGase Р Лф, выделенного из аллантоисной жидкости куриных эмбрионов, инфицированных СЕИ5-Ь:С.

1 - маркеры молекулярной массы;

2, 5 - денатурированный Лф, обработанный дегликозидазой;

3, б - денатурированный Лф;

4, 7 - неденатурированный Лф.

Полученный препарат очищенного рекомбинантного Лф из аллантоисной жидкости был проанализирован методом дегликозилирования с использованием PNGase Б. Обработанные РИОазе Б белки были проанализированы методом электрофореза в ПААГ, в результате чего было выявлено, что степень гликозилирования Лф, выделенного из аллантоисной жидкости соответствует таковой Лф, выделенного из женского молока (рис. 11).

Таким образом, было показано, что Лф, экспрессируемый рекомбинантными аденовирусами, аутентичен по физико-химическим свойствам природному белку, выделенному из женского молока.

№ Образец 50% ингибирование ПОЛ

Моль/мл Ед. акт.

1. Лф, выделенный из аллантоисной жидкости куриных эмбрионов, инфицированных СЕЬО-Ь£ 1,32хЮ"6 758

2. Лф, выделенный из культуральной жидкости клеток линии 293, инфицированных Ад5-Ь£ 1,4x10'6 714

3. Лф из женского молока. 1,4x10'6 714

Таблица 2. Антиоксидантная активность рекомбинантного Лф человека.

На следующем этапе работы была исследована функциональная активность Лф, полученного в результате очистки из культуральной и аллантоисной жидкости на примере его антиоксидантных свойств. Антиоксидантную активность Лф оценивали по его способности ингибировать перекисное окисление липидов (ПОЛ) в гомогенате печени мышей in vitro. Для оценки активности исследуемых препаратов белков использовали в качестве образца сравнения Лф, выделенный из женского молока (таблица 2).

Как видно из представленных в таблице 2 данных, исследуемые образцы Лф, выделенные из культуральной и аллантоисной жидкости, аутентичны по антиоксидантной активности Лф из женского молока.

Исходя из полученных данных о наличии у Лф, экспрессированного рекомбинантными аденовирусами, антиоксидантных свойств, можно предполагать наличие у него всего спектра свойств, в основе которых лежит механизм связывания железа.

выводы

1) Сконструирован рекомбинантный аденовирус птиц CELO, несущий в составе экспрессирующей кассеты 5'-нетранслируемые регуляторные элементы, которые обеспечивают повышение в 2-3 раза уровня экспрессии трансгена.

2) Получены рекомбинантные аденовирусы CELO-Lf и Afl5-Lf, эффективно экспрессирующие ген лактоферрина человека.

3) Показана возможность использования рекомбинантного аденовируса АдЗ-Lf для синтеза лактоферрина человека непосредственно в клетках млекопитающих in vivo, что обеспечивает поддержание терапевтической концентрации белка в крови более 10 суток после однократного введения вирусного вектора.

4) Отработаны условия продукции рекомбинантного лактоферрина человека в куриных эмбрионах, инфицированных рекомбинантным аденовирусом птиц CELO-Lf. Уровень продукции бежа составил 0,8 мг на эмбрион.

5) Анализ физико-химических, антигенных и биологических свойств (антиоксидантная активность) рекомбинантного Лф человека полученного in ovo выявил его полную аутентичность природному белку, выделенному из донорского женского молока.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Тутыхина И.Л., Шмаров М.М, Логунов Д.Ю., Грабко В.И., Народицкий Б.С., Гинцбург А.Л. Конструирование вектора на основе генома аденовируса птиц CELO, обеспечивающего повышенный уровень экспрессии гена секретируемой щелочной фосфатазы в непермиссивной системе in vitro и in vivo // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 2008, №4, с. 26-30.

2. Logunov D.Y., Zubkova O.V., Karyagina-Zhulina A.S, Shmarov M.M., Shuvalova E.A., Karpov A.P., Tutykhina I.L et al. Identification of HI-like loop in CELO adenovirus fiber for incorporation of receptor-binding motifs // J. Virol., 2007, v. 81(18), p. 9641-9652.

3. Тутыхина И.Л., Шмаров M.M., Севастьянова Г.А. 5'-нетранслируемая область (двучастный лидер) повышает эффективность экспрессии трансгена в составе рекомбинантного аденовируса птиц CELO // Материалы XVIII зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". Москва, 07-10 февраля 2006 г.

4. Тутыхина И.Л., Шмаров М.М., Логунов Д.Ю., Безбородова О.А., Немцова Е.Р., Якубовская Р.И., Народицкий Б.С., Севастьянова Г.А. Исследование биологических и физико-химических свойств рекомбинантного лактоферрина человека, экспрессированного клетками куриного эмбриона in ovo Н Материалы XX зимней международной молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии ". Москва, 11-15 февраля 2008 г.

5. Tutykhina I., Bezborodova О., Shmarov М., Logunov D., Nemtsova E., Yakubovskaya R., Naroditsky В., Gintsburg A. Application of recombinant avian adenovirus CELO for production of functional active lactoferrin in chicken embryos // XIV International Congress of Virology. Istanbul, 10-15 August 2008.

6. Чиссов В.И., Якубовская Р.И., Немцова E.P., Безбородова О.А., Логунов Д.Ю., Народицкий Б.С., Тутыхина И.Л., Шмаров М.М., Токарская Е.А. Способ получения биологически активного рекомбинантного белка лактоферрина человека. Заявка на получение Патента Российской Федерации № 2007120447 от 1 июня 2007 года.

Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ПД № 1-00007 от 25.09.2000 г. Подписано в печать 23.10.08. Тираж 100 экз. Усл. п.л 1,5 Печать авторефератов: 730-47-74,778-45-60

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Тутыхина, Ирина Леонидовна

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Вирусные системы доставки генов в клетки эукариот.

1.2. Свойства аденовирусных векторов.

1.3. Структурно-функциональная организация аденовируса птиц CELO.

1.4. Векторы на основе аденовируса птиц CELO.

1.5. Структура, свойства и способы получения лактоферрина человека.

1.5.1.Структурная характеристика лактоферрина.

1.5.2. Связывание лактоферрина с лигандами и рецепторами.

1.5.3. Функции лактоферрина.

1.5.3.1. Активация и ингибирование иммунной системы лактоферрином.

1.5.3.2. Влияние лактоферрина на воспалительный процесс.

1.5.3.3. Бактерицидные свойства лактоферрина.

1.5.4. Способы получение лактоферрина человека.

1.5.5. Применение лактоферрина.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Вирусы и бактериальные штаммы.

2.1.2. Клеточные линии.

2.1.3. Плазмидные векторы.

2.1.4. Ферменты и другие реактивы.

2.1.5. Лабораторные животные.

2.1.6. Лабораторное оборудование.

2.2. Методы.

2.2.1. Подготовка компетентных клеток Е. coli штамма DH5a.

2.2.2. Подготовка компетентных клеток Е. coli штамма BJ5183.

2.2.3. Трансформация компетентных клеток Е. coli штамма DH5a.

2.2.4. Трансформация компетентных клеток Е. coli штамма BJ5183.

2.2.5. Гомологичная рекомбинация в клетках Е. coli.

2.2.6. Выделение аналитических количеств плазмидной ДНК.

2.2.7. Выделение и очистка плазмидной ДНК.

2.2.8. Рестрикционный анализ ДНК специфическими эндодезоксирибонуклеазами.

2.2.9. Обработка ДНК Фрагментом Кленова.

2.2.10. Фракционирование фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле.

2.2.11. Препаративное разделение фрагментов ДНК и элюция ДНК из геля.

2.2.12. Лигирование фрагментов ДНК.

2.2.13. Идентификация рекомбинантных клонов.

2.2.14. Полимеразная цепная реакция.

2.2.15. ПЦР в режиме реального времени.

2.2.16. Выделение тотальной РНК из культуры клеток.

2.2.17. Реакция обратной транскрипции.

2.2.18. Трансфекция культур клеток методом липофекции.

2.2.19. Трансфекция культур клеток методом кальциево-фосфатной преципитации.

2.2.20. Получение рекомбинантных аденовирусов человека 5-го серотипа.

2.2.21. Котрансфекция клеток линии LMH для получения рекомбинантных аденовирусов CELO.

2.2.22. Накопление вирусов.

2.2.23. Очистка и концентрирование аденовирусов CELO.

2.2.24. Очистка и концентрирование аденовирусов человека 5-го серотипа.

2.2.25. Выделение ДНК из клеток, инфицированных аденовирусами.

2.2.26. Титрование вирусов.

2.2.27. Выделение вирионной ДНК.

2.2.28. Электрофорез белков в ПААГ-ДСН (PAGE-SDS).

2.2.29. Иммуноферментный анализ.

2.2.30. Иммуноблоттинг (Western Blot Immunoassay).

2.2.31 . Получение аффинно-чистых антител к лактоферрину человека.

2.2.32 . Очистка рекомбинантного лактоферрина человека из культуральной и аллантоисной жидкости.

2.2.33 . Обработка лактоферрина человека дегликозидазой.

2.2.34 . Анализ антиоксидантной активности лактоферрина человека.

2.2.35. Определение ферменативной активности SEAP (секретируемой плацентарной щелочной фосфатазы) в образцах культуральной жидкости сыворотки крови мышей.

2.2.36. Проточная цитофлуорометрия.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Конструирование рекомбинантных аденовирусных векторов на основе генома аденовируса птиц CELO и генома аденовируса человека 5-го серотипа.

3.1.1. Конструирование вектора на основе генома аденовируса птиц CELO, обеспечивающего повышенный уровень экспрессии гена секретируемой щелочной фосфатазы в пермиссивной и непермиссивной системе in vitro и in vivo.

3.1.1.1. Конструирование плазмидных векторов, содержащих в экспрессирующей кассете последовательности BPL и лидера гена гексона вируса CELO.

3.1.1.2. Изучение влияния BPL и нетранслируемой области гена гексона вируса птиц CELO на экспрессию гена SEAP в составе челночных плазмидных векторов в клетках млекопитающих и птиц.

3.1.1.3. Получение рекомбинантного аденовируса CELO-BPLwhl-SEAP методом гомологичной рекомбинации в культуре клеток LMH.

3.1.1.4. Экспрессия SEAP при трансдукции клеточных культур рекомбинантным аденовирусом CELO-BPLwhl-SEAP.

3.1.1.5. Экспрессия секретируемой щелочной фосфатазы в клетках куриных эмбрионов, инфицированных рекомбинантным аденовирусом CELO-BPLwhl-SEAP.

3.1.1.6. Экспрессия секретируемой щелочной фосфатазы рекомбинантным аденовирусом CELO-BPLwhl-SEAP in vivo.

3.1.2. Конструирование рекомбинантных аденовирусных векторов, экспрессирующих ген лактоферрина человека.

3.1.2.1. Конструирование рекомбинантного аденовируса птиц CELO, несущего экспрессирующую кассету с геном Лф человека.

3.1.2.2. Конструирование рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа, экспрессирующего ген лактоферрина человека.

3.1.2.3. Определение уровня экспрессии гена Лф человека в составе рекомбинантных аденовирусов CELO-Lf и Afl5-Lf.

3.2. Анализ экспрессии Лф человека рекомбинантными аденовирусами CELO-Lf и Afl5-Lf in ovo и in vivo.

3.2.1. Анализ экспрессии Лф человека рекомбинантными аденовирусами CELO-Lf и Afl5-Lf in vivo.

3.2.2. Анализ экспрессии Лф человека рекомбинантными аденовирусами CELO-Lf и Afl5-Lf in ovo.

3.2.3. Анализ аутентичности рекомбинантного Лф, экспрессируемого рекомбинантными аденовирусными векторами, природному.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка системы продукции лактоферрина человека in ovo и in vivo с использованием рекомбинантных аденовирусов"

1. Актуальность проблемы.

Рекомбинантные аденовирусы широко используются в молекулярно-биологических, биомедицинских и микробиологических исследованиях. Аденовирусные векторы, несущие в составе генома чужеродные гены, например, антигенов микроорганизмов, являются удобным инструментом для исследования соответствующих белков in vitro и in vivo, а также служат основой для разработки нового поколения генно-инженерных вакцин. В последние годы активно разрабатываются различные схемы использования аденовирусных векторов для продукции рекомбинантных аналогов белков, применяемых с целью терапии и профилактики различных заболеваний человека (цитокинов, иммуномодуляторов, антител и др.), поскольку белки, полученные из природных источников, являются дорогостоящими и, зачастую, небезопасными для использования в биомедицинских целях. Применение векторов на основе аденовирусов человека и животных особенно актуально для продукции таких биологически-активных рекомбинантных аналогов белков человека, которые невозможно получить в системах экспрессии на основе клеток прокариот и низших эукариот (Е. coli, Sacharomyces cerevisiae, Aspergillus sp. и др.). В настоящее время разработаны способы получения рекомбинантного фактора роста нервов Р [253] и антител к коронавирусу [112] в клетках, трансдуцированных аденовирусными векторами, содержащими в составе генома экспрессирующую кассету с геном соответствующего белка. Использование в этих работах векторов на основе аденовируса человека 5-го серотипа обусловлено безопасностью и высокой эффективностью такого типа векторов, что доказано в результате многочисленных исследований, в том числе и I, II и III фаз клинических испытаний. Однако все разрабатываемые в настоящее время на основе рекомбинантных аденовирусов 5-го серотипа системы экспрессии для получения препаративного количества белка характеризуются высокой себестоимостью. В этой связи, актуальным является разработка новых подходов к продукции рекомбинантных белков человека. Одним из подходов является синтез белков в куриных эмбрионах. Куриные эмбрионы - одна из наиболее экономичных и безопасных (в случае использования SPF-эмбрионов) биотехнологическая система, применяемая на протяжении уже не одного десятка лет. Важной характеристикой данной системы служит схожесть аппарата транскрипции и трансляции с таковым млекопитающих, что необходимо для получения биологически-активных белков человека.

Для доставки и экспрессии генов в курином эмбрионе перспективным является использование векторов на основе аденовируса птиц 1-го серотипа (chicken embryo lethal orphan) - CELO. В работе JI.B. Череновой [49] показано, что при размножении в курином эмбрионе рекомбинантного вируса CELO, в аллантоисной жидкости происходило накопление продукта экспрессии гена интерлейкина-2, включенного в состав его генома. Данный факт служит предпосылкой для разработки на основе CELO эукариотической системы продукции рекомбинантных белков в курином эмбрионе.

Таким образом, получение рекомбинантных аденовирусов человека и птиц, экспрессирующих ген лактоферрина человека, для продукции биологически-активного белка in vivo и в курином эмбрионе, является актуальным направлением исследований.

Цели и задачи исследования.

Целью настоящей работы являлось получение рекомбинантных аденовирусов млкопитающих и птиц, экспрессирующих ген лактоферрина человека, для продукции биологически активного рекомбинантного лактоферрина в эукариотических клетках in ovo и in vivo.

В процессе работы предстояло решить следующие задачи:

2. Конструирование рекомбинантных аденовирусов CELO-Lf и Ад5-Е£ экспрессирующих ген лактоферрина человека.

3. Анализ экспрессии рекомбинантного лактоферрина человека в культуре эукариотических клеток, инфицированных полученными рекомбинантными аденовирусами.

5. Получение лактоферрина человека в куриных эмбрионах, инфицированных рекомбинантным аденовирусом CELO-Lf.

3. Научная новизна и практическая значимость.

В результате проведенной работы нами впервые был получен рекомбинантный аденовирус птиц CELO, обеспечивающий повышенный уровень экспрессии целевого гена в пермиссивной и непермиссивной системе in vitro, in ovo и in vivo. Для этой цели впервые были использованы регуляторные 5'-нетранслируемые элементы поздней области транскрипции генома вируса CELO — двучастный лидер и лидер гена гексона. В результате проведенных экспериментов по трансфекции плазмидными конструкциями p415BPL-SEAP и р415BPLwhl-SEAP, а также трансдукции вирусом CELO-BPLwhl-SEAP пермиссивных и непермиссивных клеточных культур была показана функциональная независимость двучастного лидера от цис-транс взаимодействия с вирусом CELO. Впервые было установлено на примере 5'-нетранслируемой области гена гексона, что подобные структурные элементы генов поздней области транскрипции генома аденовируса имеют большое значение в процессе экспрессии.

Впервые был сконструирован рекомбинантный аденовирус птиц CELO-Lf, несущий экспрессирующую кассету с геном лактоферрина человека под контролем HCMV-промотора, двучастного лидера и 5'-нетранслируемой области гена гексона вируса CELO.

Была разработана новая эукариотическая система продукции рекомбинантного лактоферрина человека в клетках куриного эмбриона in ovo с использованием аденовирусного вектора CELO-Lf. Была показана аутентичность рекомбинантного Лф человека природному белку.

В экспериментах in vivo определена длительность и уровень экспрессии лактоферрина человека в составе рекомбинантных аденовирусов CELO-Lf и Ad5-Lf после системного введения препаратов данных вирусов лабораторным животным. Произведено сравнение содержания лактоферрина в сыворотке крови крыс по временным и количественным характеристикам после введения препаратов рекомбинантных вирусов и препарата белка лактоферрина, выделенного из женского молока.

Работа представляет как научный, так и практический интерес. Рекомбинантный аденовирус Ad5-Lf в перспективе может стать основой для разработки генно-инженерного препарата, который обеспечит экспрессию и длительную циркуляцию рекомбинантного Лф человека в организме, что позволит заменить его регулярное введение.

В дальнейшем на основе векторов Ад5 и CELO могут быть созданы эффективные системы экспрессии других биологически активных рекомбинантных белков человека как in vivo, в организме реципиента, так и in ovo, в курином эмбрионе.

Коллекция рекомбинантных аденовирусов: CELO-BPLwhl-SEAP, CELO-Lf, CELOdl3Kb и АдЗ-Lf - хранится в музее лаборатории молекулярной биотехнологии ГУ НИИ ЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Препарат рекомбинантного лактоферрина человека, экспрессированного в клетках куриного эмбриона in ovo с использованием аденовирусного вектора CELO-Lf, и препарат рекомбинантного аденовируса АдЗ-Lf подготовлены к предклиническим испытаниям.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Тутыхина, Ирина Леонидовна

выводы.

2) Получены рекомбинантные аденовирусы CELO-Lf и АдЗ-Lf, эффективно экспрессирующие ген лактоферрина человека.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тутыхина, Ирина Леонидовна, Москва

1. Канышкова Т.Г., Бунева В.Н., Невинский Г.А. Лактоферрин и его биологические функции //Биохимия. 2001. - Том 66. - вып. 1. - С. 5-13.

2. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. -М.:Мир, 1982.

3. Немцова Е.Р., Сергеева Т.В., Безбородова О.А., Якубовская Р.И. Антиоксиданты — место и роль в онкологии // Российский онкологический журнал. 2003. - №5. - С. 48-53.

4. Немцова Е. Р., Эделева Н. В., Осипова Н. А., Якубовская Р. П., Бойко А. В., Демидова Л. В., Чиссов В. И. Детоксицирующее, противовоспалительное и иммуномодулирующее действие лапрота // Российский онкологический журнал. 2006. - № 4. - С. 29-33.

5. Фомина Н.В. Аденовирусная инфекция животных. М.: Колос, 1995.

6. Эделева Н.В., Осипова Н.А., Якубовская Р.И. Новые возможности профилактики и коррекции послеоперационных гнойно-септических осложнений и полиорганной недостаточности в онкохирургии// Анестезиология и реаниматология.-1997, №3, С.36-41.

7. Якубовская Р.И., Немцова Е.Р., Коростелева М.Д. К методике синтезааффинных сорбентов // Лабораторное дело. — 1987. № 7, С. 536-539.

8. Якубовская Р.И., Немцова Е.Р., Сургай В.В. Коррекция гомеостаза у онкологических больных препаратом Лапрот// Российский онкологический журнал.- 1996, № 2.- С.10-13

9. Afeltra A., Caccavo D., Ferri G. M., Adessi M. A., De Rosa F. G., Amoroso A. et al. Expression of lactoferrin on human granulocytes: analysis with polyclonal and monoclonal antibodies. // Clin. Exp. Immunol. 1997. - V. 109. - P. 279285.

10. Akopian T.A., Doronin K.K., Karpov V.A., Naroditsky B.S. Sequence of the avian adenovirus FAV-1 (CELO) DNA encoding the hexon-associated protein pVI and hexon. //Arch.Virol. 1996. - V. 141. - P. 1759-1765.

11. Anderson J., V.J. Yates, et al. The in vitro transformation by an avian adenovirus (CELO). I.Hamster-embryo fibroblastic cultures. J. Natl.Cancer Inst. 1969. V. 42.-P. 1-7.

12. Anderson J, Yates VJ, Jasty V, Mancini LO. In vitro transformation by an avian adenovirus (CELO). II. Hamster kidney cell cultures. // J Natl Cancer Inst. — 1969.-V. 43.-P. 65-70.

13. Anderson BF, Baker HM, Norris GE, Rice DW, Baker EN. Structure of human lactoferrin: crystallographic structure analysis and refinement at 2.8 A resolution. // J. Mol. Biol. 1989. - V. 209.-P. 711-734.

14. Anderson C.W., Young M.E., Flint S.J. Characterization of the adenovirus 2 virion protein, mu. // Virology.-1989. -V. 172. P. 506-512.

15. Anderson BF, Baker HM, Norris GE, Rumball SV, Baker EN. Apolactoferrin structure demonstrates ligand-induced conformational change in transferrins.// Nature. 1990. - V. 344. - P. 784-787.

16. Appelmelk В J, An YQ, Geerts M, Thijs BG, de Boer HA, MacLaren DM, de Graaff J, Nuijens JH. Lactoferrin is a lipid A-binding protein. // Infect Immun. — 1994. V. 62. - P. 2628-2632.

17. Arnold RR, Cole MF, McGhee JR. A bactericidal effect for human lactoferrin. // Science. 1977. - V. 97. - P. 263-265.

18. Arnold SB, Byrd RC, Meister W, Melmon K, Cheitlin MD, Bristow JD, Parmley WW, Chatterjee K. Long-term digitalis therapy improves left ventricular function in heart failure. // N Engl J Med. 1980. - V. 303. - P. 1443-1448.

19. Ashida K, Sasaki H, Suzuki YA, Lonnerdal B. Cellular internalization of lactoferrin in intestinal epithelial cells. // Biometals. — 2004. V. 17. - P. 311315.

20. Barnett BG, Crews CJ, Douglas JT. Targeted adenoviral vectors. // Biochim Biophys Acta. 2002. - V. 1575. - P. 1-14.

21. Bauerschmitz GJ, Lam JT, Kanerva A, Suzuki K, Nettelbeck DM, Dmitriev I, Krasnykh V, Mikheeva GV, Barnes MN, Alvarez RD, Dall P, Alemany R,

22. Curiel DT, Hemminki A. Treatment of ovarian cancer with a tropism modified oncolytic adenovirus. // Cancer Res. 2002. - V. 62. - P. 1266-1270.

23. Bellamy W, Takase M, Yamauchi K, Wakabayashi H, Kawase K, Tomita M. Identification of the bactericidal domain of lactoferrin. // Biochim Biophys Acta. 1992. - V. 1121.-P. 130-136.

24. Bennett RM, Kokocinski T. Lactoferrin content of peripheral blood cells. // Br J Haematol. 1978,-V. 39. - P.509-521.

25. Bennett RM, Davis J. Lactoferrin interacts with deoxyribonucleic acid: a preferential reactivity with double-stranded DNA and dissociation of DNA-anti-DNA complexes. // J Lab Clin Med. 1982. - V. 99. - P. 127-138.

26. Berger J, Hauber J, Hauber R, Geiger R, Cullen BR Secreted placental alkaline phosphatase: a powerful new quantitative indicator of gene expression in eukaryotic cells.// Gene. 1988. V.66. - P. 1-10.

27. Bett AJ, Haddara W, Prevec L, Graham FL. An efficient and flexible system for construction of adenovirus vectors with insertions or deletions in early regions 1 and 3. // Proc Natl Acad Sci USA.- 1994. V. 91. - P. 8802-8806.

28. Bischoff JR, Kirn DH, Williams A, Heise C, Horn S, Muna M, Ng L, Nye JA, Sampson-Johannes A, Fattaey A, McCormick F. An adenovirus mutant that replicates selectively in p53-deficient human tumor cells. // Science. — 1996. — V. 274.-P. 373-376.

29. Bouri K, Feero WG, Myerburg MM, Wickham TJ, Kovesdi I, Hoffman EP, Clemens PR. Polylysine modification of adenoviral fiber protein enhances muscle cell transduction. // Hum Gene Ther. 1999. - V. 10. - P. 1633-1640.

30. Brandenburg К, Jiirgens G, Muller M, Fukuoka S, Koch MH. Biophysical characterization of lipopolysaccharide and lipid A inactivation by lactoferrin. // Biol Chem. 2001. -V. 382.- P. 1215-1225.

31. Britigan BE, Lewis TS, Waldschmidt M, McCormick ML, Krieg AM. Lactoferrin binds CpG-containing oligonucleotides and inhibits their immunostimulatory effects on human В cells. // J Immunol. — 2001. V. 167. -P. 2921-2928.

32. Bruder JT, Jie T, McVey DL, Kovesdi I. Expression of gpl9K increases the persistence of transgene expression from an adenovirus vector in the mouse lung and liver. // J. Virol. 1997. - V. 71. - P. 7623-7628.

33. Buchschacher GL Jr, Wong-Staal F. Development of lentiviral vectors for gene therapy for human diseases. // Blood. 2000. - V. 95. - P. 2499-2504.

34. Bullen JJ. Iron-binding proteins in milk and resistance to Escherichia coli infection in infants. // Proc R Soc Med. 1972. - V. 65. - P. 1086.

35. Bullen JJ, Rogers HJ, Griffiths E. Role of iron in bacterial infection. // Curr Top Microbiol Immunol. 1978. - V. 80. - P. 1-35.

36. Caccavo D, Sebastiani GD, Di Monaco C, Guido F, Galeazzi M, Ferri GM, Bonomo L, Afeltra A. Increased levels of lactoferrin in synovial fluid but not in serum from patients with rheumatoid arthritis. // Int J Clin Lab Res. — 1999. — V. 29. P. 30-35.

37. Caccavo D, Pellegrino NM, Altamura M, Rigon A, Amati L, Amoroso A, Jirillo E. Antimicrobial and immunoregulatory functions of lactoferrin and its potential therapeutic application. // J Endotoxin Res. 2002. - V. 8. - P. 403-417.

38. Chen CY, Bessesen DH, Jackson SM, Hoeffler JP. Overexpression and purification of transcriptionally competent CREB from a recombinant baculovirus.// Protein .Expr Purif. 1991. - V. 2. - P. 402-411.

39. Chen HH, Mack LM, Kelly R, Ontell M, Kochanek S, Clemens PR. Persistence in muscle of an adenoviral vector that lacks all viral genes. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997. V. 94.-P. 1645-1650

40. Chiocca S., Kurzbauer R., Schaffner J., Baker A., Maunter V., Cotten M. The complete DNA sequence and genomic organization of the avian adenovirus CELO. // J. Virol. 1996. - V. 70. - P. 2939-2949.

41. Chiocca, S., A. Baker, and M. Cotten. Identification of a novel antiapoptotic protein, GAM-1, encoded by the CELO adenovirus. // J. Virol. 1997. - V. 71. -P. 3168-3177.

42. Choi SM, Lee OS, Kwon SY, Kwak SS, Yu DY, Lee HS. High expression of a human lactoferrin in transgenic tobacco cell cultures.// Biotechnol. Lett. — 2003. -V. 25.-P. 213-218.

43. Chu G, Hayakawa H, Berg P. Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA. // Nucleic Acids Res. 1987. - V. 15. - P. 13111326.

44. Cohen P. The role of protein phosphorylation in the hormonal control of enzyme activity. // Eur. J. Biochem. 1985. - Y. 151. - P. 439-448.

45. Cotten M, Wagner E, Zatloukal K, Birnstiel ML. Chicken adenovirus (CELO virus) particles augment receptor-mediated DNA delivery to mammalian cells and yield exceptional levels of stable transformants. // J. Virol. 1993. - Y.67. -P. 3777-3785.

46. Cowen B, Calnek BW, Menendez NA, Ball RF./ Avian adenoviruses: effect on egg production, shell quality, and feed consumption. // Avian Dis. 1978. - V. 22. - P. 459-470.

47. Cuesta R, Xi Q, Schneider RJ. Structural basis for competitive inhibition of eIF4G-Mnkl interaction by the adenovirus 100-kilodalton protein. // J. Virol. -2004. V. 78. - P. 7707-7716.

48. Culver KW, Blaese RM. Gene therapy for cancer. // Trends Genet. — 1994. V. 10.-P. 174-178.

49. Curiel DT, Agarwal S,' Wagner E, Cotten M. Adenovirus enhancement of transferrin-polylysine-mediated gene delivery. // Proc. Natl. Acad. Sci. US A.-1991.-V. 88.-P. 8850-8854.

50. Curiel DT. High-efficiency gene transfer employing adenovirus-polylysine-DNA complexes. // Nat. Immun. 1994. - V. 13. - P. 141-164.

51. Davison A J, Benko M, Harrach B. Genetic content and evolution of adenoviruses. // J Gen Virol. 2003. - V. 84. - P. 2895-2908.

52. Deriy LV, Chor J, Thomas LL. Surface expression of lactoferrin by resting neutrophils. // Biochem Biophys Res Commun. 2000. - V. 275. - P. 241-246.

53. Deryckere F, Burgert HG. Early region 3 of adenovirus type 19 (subgroup D) encodes an HLA-binding protein distinct from that of subgroups В and C. // J Virol. 1996. - V. 70. - P. 2832-2841.

54. Dial EJ, Dohrman AJ, Romero JJ, Lichtenberger LM. Recombinant human lactoferrin prevents NSAID-induced intestinal bleeding in rodents. // J Pharm Pharmacol. 2005. - V. 57. - P. 93-99.

55. Doronin K, Kuppuswamy M, Toth K, Tollefson AE, Krajcsi P, Krougliak V, Wold WS. Tissue-specific, tumor-selective, replication-competent adenovirus vector for cancer gene therapy. //J Virol. 2001. - V. 75. - P. 3314-3324.

56. Douglas JT. Adenoviral vectors for gene therapy.// Mol. Biotechnol. 2007. -V. 36.-P. 71-80.

57. Elass-Rochard E, Legrand D, Salmon V, Roseanu A, Trif M, Tobias PS, Mazurier J, Spik G. Lactoferrin inhibits the endotoxin interaction with CD 14 by competition with the lipopolysaccharide-binding protein. // Infect. Immun. — 1998.-V. 66.-P. 486-491.

58. Ellison R. T. 3rd, Giehl T. J. and LaForce F. M. Damage of the outer membrane of enteric gram-negative bacteria by lactoferrin and transferrin. // Infect. Immun.- 1988. V. 56. - P. 2774-2781

59. Engelhardt JF, Litzky L, Wilson JM. Prolonged transgene expression in cotton rat lung with recombinant adenoviruses defective in E2a. // Hum Gene Ther. — 1994.- V. 5.-P. 1217-1229.

60. Fallaux F et al./ Characterization of 911, a new helper cell line for the titration and propagation of early region 1-deleted adenoviral vectors.// Hum Gene Ther. 1996. - V.7.- P. 215-222.

61. Feigner PL. Improvements in cationic liposomes for in vivo gene transfer. 11 Hum Gene Ther. 1996.-V. 7.-P. 1791-1793.

62. Ferrari F.K., Samulski Т., Shenk Т., Samulski R.J. Second-strand synthesis is a rate-limiting step for efficient transduction by recombinant adeno-associated virus vectors. // J.Virol. 1996. - V. 70. - P. 3227-3234.

63. Flotte TR, Carter BJ. Adeno-associated virus vectors for gene therapy. // Gene Ther. 1995. - V. 2. - P. 357-362.

64. Francois A, Eterradossi N, Delmas B, Payet V, Langlois P.// Construction of avian adenovirus CELO recombinants in cosmids. J.Virol. 2001. - V. 75. - P. 5288-5301.

65. Francois, A., Chevalier, C., Delmas, B. et al. // Vaccine. 2004. - V. 2. - P. 2351-2360.

66. Fransson GB, Lonnerdal B. Iron in human milk. // J Pediatr. 1980. - V. 96. — P. 380-384.

67. Freund CT, Tong XW, Block A, Contant CF, Kieback DG, Rowley DR, Lerner SP. Adenovirus-mediated suicide gene therapy for bladder cancer: comparison of the cytomegalovirus- and Rous sarcoma virus-promoter. // Anticancer Res. -2000.-V. 20.-P. 2811-2816.

68. Fujihara T, Hayashi K. Lactoferrin inhibits herpes simplex virus type-1 (HSV-1) infection to mouse cornea. // Arch Virol. 1995. - V. 140. - P. 1469-1472.

69. Fujiyama К, Sakai Y, Misaki R, Yanagihara I, Honda T, Anzai H, Seki T. N-linked glycan structures of human lactoferrin produced by transgenic rice. // Biosci Biotechnol Biochem. 2004. - V. 68. - P. 2565-2570.

70. Furmanski P, Li ZP, Fortuna MB, Swamy CV, Das MR. Multiple molecular forms of human lactoferrin. Identification of a class of lactoferrins that possess ribonuclease activity and lack iron-binding capacity. // J Exp Med. 1989. - V. 170.-P. 415-429.

71. Gall J, Kass-Eisler A, Leinwand L, Falck-Pedersen E. Adenovirus type 5 and 7 capsid chimera: fiber replacement alters receptor tropism without affecting primary immune neutralization epitopes. // J. Virol. — 1996. V. 70. - P. 21162123.

72. Gao GP, Yang Y, Wilson JM. Biology of adenovirus vectors with El and E4 deletions for liver-directed gene therapy. // J. Virol. 1996. - V. 70. - P. 89348943.

73. Glasgow JN, Everts M, Curiel DT. Transductional targeting of adenovirus vectors for gene therapy. // Cancer Gene Ther. 2006. - V. 13. - P. 830-844.

74. Glotzer JB, Saltik M, Chiocca S, Michou AI, Moseley P, Cotten M. Activation of heat-shock response by an adenovirus is essential for virus replication. // Nature. 2000. - V. 407. - P. 207-211.

75. Gomez HF, Ochoa TJ, Carlin LG, Cleary TG. Human lactoferrin impairs virulence of Shigella flexneri. // J Infect Dis. 2003. - V. 187, N 1. - P. 87-95.

76. Gordon D., Davis J., Fox P., Malech H., Gallin J., Baraniuk J. et al. Glandular secretion of lactoferrin in a patient with neutrophil lactoferrin defi ciency. // J. Allergy Clin. Immunol. 1989. -V. 84. - P. 914-919.

77. Gorziglia M et at./ Generation of an adenovirus vector lacking 11, B2a, E3, and all of E4 except open reading frame 3.// J. Virol. 1999. - V. 73. - P. 6048-6055.

78. Graham FL, Smiley J, Russel WC, Nairn R./ Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5.11 J. Gen. Virol. — 1977. -V. 36. P. 59-74.

79. Graham F.L. and van der Eb A.,J. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA.// Virology. 1973. - V. 52. - P. 456-467.

80. Graham F.L., and Prevec L. Manipulation of adenovirus vectors. // Methods in Mol. Biol. 1991.-V. 7.-P. 109-127.

81. Green K.Y., Wold W.S.M. Human adenoviruses: growth, purification and transfection assay.// Methods Enzymology. 1980. - V. 80. - P. 425-431.

82. Guillen C, Mclnnes IB, Vaughan DM, Kommajosyula S, Van Berkel PH, Leung BP, Aguila A, Brock JH. Enhanced Thl response to Staphylococcus aureus infection in human lactoferrin-transgenic mice. // J Immunol. 2002. - V. 168. -P. 3950-3957.

83. Han ZS, Li QW, Zhang ZY, Xiao B, Gao DW, Wu SY, Li J, Zhao HW, Jiang ZL, Hu JH. High-level expression of human lactoferrin in the milk of goats byusing replication-defective adenoviral vectors. // Protein Expr Purif. 2007. - V. 53.-P. 225-231.

84. Han ZS, Li QW, Zhang ZY, Yu YS, Xiao B, Wu SY, Jiang ZL, Zhao HW, Zhao R, Li J. Adenoviral vector mediates high expression levels of human lactoferrin in the milk of rabbits. //J. Microbiol. Biotechnol. -2008. V. 18. - P. 153-159.

85. Hanahan D. Studies of transformation of Escherichia coli with plasmids. // J. Mol. Biol. 1983. - V. 166. - P. 557-580.

86. Haversen L, Ohlsson BG, Hahn-Zoric M, Hanson LA, Mattsby-Baltzer I. Lactoferrin down-regulates the LPS-induced cytokine production in monocytic cells via NF-kappa B. // Cell Immunol. 2002. - V. 220. - P. 83-95.

87. Hawkins LK, Lemoine NR, Kim D. Oncolytic biotherapy: a novel therapeutic plafform. // Lancet Oncol. 2002. - V. 3. - P. 17-26.

88. Hendrixson DR, Qiu J, Shewry SC, Fink DL, Petty S, Baker EN, Plaut AG, St Geme JW 3rd. Human milk lactoferrin is a serine protease that cleaves Haemophilus surface proteins at arginine-rich sites. // Mol Microbiol. — 2003. — V. 47.-P. 607-617.

89. Hess, M., A. Cuzange, R. W. H. Ruigrok, J. Chroboczek, and B. Jacrot./ The avian adenovirus penton: two fibres and one base.// J. Mol. Biol. 1995. - V. 252. - P. 379-385.

90. Hodgson CP. The vector void in gene therapy. 11 Biotechnology (N Y). 1995. -V. 13.-P. 222-225.

91. Holmes D., Quigley M. A rapid boiling method for the preparation of bacterial plasmids. // Anal. Biochem. 1981. - V. 114. - P. 193-197.

92. Horiguchi Y, Larchian WA, Kaplinsky R, Fair WR, Heston WD. Intravesical liposome-mediated interleukin-2 gene therapy in orthotopic murine bladder cancer model. // Gene Ther. 2000. - V. 7. - P. 844-851.

93. Huang, W., Flint, SJ. The tripartite leader sequence of subgroup С adenovirus major late mRNAs can increase the efficiency of mRNA export. // J. Virol. -1998.-V.72.-P. 225-235.

94. Hwang SA, Kruzel ML, Actor JK. Lactoferrin augments BCG vaccine efficacy to generate T helper response and subsequent protection against challenge with virulent Mycobacterium tuberculosis. // Int Immunopharmacol. 2005. - V. 5. -P. 591-599.

95. Ishikado A, Imanaka H, Kotani M, Fujita A, Mitsuishi Y, Kanemitsu T, Tamura Y, Makino T. Liposomal lactoferrin induced significant increase of the interferon-alpha (IFN-alpha) producibility in healthy volunteers. // Biofactors. -2004.-V. 21.-P. 69-72.

96. Ju DW, WANG BM, Cao X. Adenovirus-mediated combined suicide gene and interleukin-2 gene therapy for the treatment of established tumor and induction of antitumor immunity. // J Cancer Res Clin Oncol. 1998. V. 124. P. 683-689.

97. Kane SV, Sandborn WJ, Rufo PA, Zholudev A, Boone J, Lyerly D, Camilleri M, Hanauer SB. Fecal lactoferrin is a sensitive and specific marker in identifying intestinal inflammation. // Am J Gastroenterol. 2003. - V. 98. - P. 1309-1314.

98. Kaplan JM, Armentano D, Scaria A, Woodworth LA, Pennington SE, Wadsworth SC, Smith AE, Gregory RJ. Novel role for E4 region genes in protection of adenovirus vectors from lysis by cytotoxic T lymphocytes. // J. Virol. 1999. - V. 73. - P. 4489-4492.

99. Kawaguchi T, Nomura K, Hirayama Y, Kitagawa T. Establishment and characterization of a chicken hepatocellular carcinoma cell line, LMH. // Cancer Res. 1987. - V. 47. - P. 4460-4464.

100. Kay MA, Li Q, Liu TJ, Leland F, Toman C, Finegold M, Woo SL. Hepatic gene therapy: persistent expression of human alpha 1-antitrypsin in mice after direct gene delivery in vivo. II Hum Gene Ther. 1992. - V. 3. — P. 641-647.

101. Kim SJ, Yu DY, Рак KW, Jeong S, Kim SW, Lee KK. Structure of the human lactoferrin gene and its chromosomal localization. // Mol Cells. — 1998. — V. 8. — P. 663-668.

102. Kochanek S, Schiedner G, Volpers C. High-capacity 'gutless' adenoviral vectors. // Curr Opin Mol Ther. 2001. - V. 3. - P. 454-463.

103. Krasnykh VN, Mikheeva GV, Douglas JT, Curiel DT. Generation of recombinant adenovirus vectors with modified fibers for altering viral tropism. // J. Virol. 1996. - V. 70. - P. 6839-6846.

104. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature. 1970. - V. 227. - P. 680-685.

105. Larsen A, Hovdenak N, Karlsdottir A, Wentzel-Larsen T, Dahl O, Fagerhol MK. Faecal calprotectin and lactoferrin as markers of acute radiation proctitis: a pilot study of eight stool markers. // Scand J Gastroenterol. 2004. - V. 39. — P. 11131118.

106. Laver WG, Younghusband HB, Wrigley NG/ Purification and properties of chick embryo lethal orphan virus (an avian adenovirus).// Virology. — 1971. V. 45. - P. 598-614.

107. Le Goff F, Mederle-Mangeot I, Jestin A, Langlois P. Deletion of open reading frames 9, 10 and 11 from the avian adenovirus CELO genome: effect on biodistribution and humoral responses. // J Gen Virol. 2005. - V. 86. - P. 2019-2027.

108. Lee RJ, Low PS. Delivery of liposomes into cultured KB cells via folate receptor-mediated endocytosis. // J Biol Chem. 1994. - V. 269. - P. 31983204.

109. Lee WJ, Farmer JL, Hilty M, Kim YB. The protective effects of lactoferrin feeding against endotoxin lethal shock in germfree piglets. // Infect Immun. — 1998.-V. 66. -P.1421-1426.

110. Lee Y. В., Glover C. P., Cosgrave A. S. Bienemann A, Uney J. B. Optimizing regulatable gene expression using adenoviral vectors.// Uney. J.B. Exp. Physiol. -2005-V.90.-P. 33-37.

111. Legerski R., Robberson D. Analysis and optimization of recombinant DNA joining reactions. I I Journal of Molecular Biology. 1985. - V. 181. - P. 297312.

112. Legrand D, Salmon V, Coddeville B, Benaissa M, Plancke Y, Spik G. Structural determination of two N-linked glycans isolated from recombinant human lactoferrin expressed in BHK cells. // FEBS Lett. 1995. - V. 365. - P. 57-60.

113. Legrand D, Elass E, Pierce A, Mazurier J. Lactoferrin and host defence: an overview of its immuno-modulating and anti-inflammatory properties. // Biometals. 2004. - V. 17. - P. 225-229.

114. Lehrmann, H., and M. Cotten. Characterization of CELO virus proteins that modulate the pRb/E2F pathway. // J Virol. 1999. - V. 73. - P.6517-6525.

115. Leppard K.N. E4 gene function in adenovirus, adenovirus vector and adeno-associated virus infections. // J. Gen. Virology. 1997. - V. 78. - P. 2131-2138.

116. Levay PF, Viljoen M. Lactoferrin: a general review. // Haematologica. 1995. -V. 80.-P. 252-267.

117. Leveugle B, Mazurier J, Legrand D, Mazurier C, Montreuil J, Spik G. Lactotransferrin binding to its platelet receptor inhibits platelet aggregation. // Eur J Biochem. 1993,- V. 213.-P. 1205-1211.

118. Li P. et al./ The structural proteins of chick embrio lethal orphan virus (FAV-1).// J.Gen.Virol. 1984. - V. 65. - P. 1803-1815.

119. Li Z.L., Tian P. X., Xue W.J.et al Co-expression of sCD40LIg and CTLA4Ig mediated by adenovirus prolonged mouse skin allograft survival. // Univ. Sci. B. -2006.-V.7.-P. 436-444.

120. Lichtenberg D, Barenholz Y. Liposomes: preparation, characterization, and preservation. // Methods Biochem Anal. 1988. - V. 33. - P. 337-462.

121. Litzinger DC, Huang L. Phosphatidylethanolamine liposomes: drug delivery, gene transfer and immunodiagnostic applications. // Biochim Biophys Acta. — 1992.-V. 1113.-P. 201-227.

122. Liu T, Zhang YZ, Wu XF. High level expression of functionally active human lactoferrin in silkworm larvae. // J. Biotechnol. 2005. - V. 118. - P. 246-256.

123. Liu T, Zhang YZ, Wu XF. Recombinant functional human lactoferrin expressed in baculovims system. // Acta Biochim. Biophys. Sin. (Shanghai).- 2006. - V.38.-P. 201-206.

124. Logan, J., Shenk, T. Adenovirus tripartite leader sequence enhances translation of mRNAs late after infection. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1984. V.81. -P. 3655-3659.

125. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagenW/ J. Biol. Chem. 1951. - V. 193. - P. 265-275.

126. Maaks S., Yan H. Z. and Wood W. G. Development and evaluation of luminescence based sandwich assay for plasma lactoferrin as a marker for sepsis and bacterial infections in pediatric medicine. J. // Biolumines. Chemilumines. -1989.-V. 3.-P. 221-226.

127. Mancini LO, J. Anderson, V.Jasty, V.J. Yates. Tumor induction in hamster inoculated with an avian adenovirus (CELO). Arch. Gesamte Virusforsch. -1970.- V. 30.-P.261-262.

128. Maneva AI, Sirakov LM, Manev VV. Lactoferrin binding to neutrophilic polymorphonuclear leucocytes. // Int J Biochem. 1983. - V. 15. - P. 981-984.

129. Mann DM, Romm E, Migliorini M. Delineation of the glycosaminoglycan-binding site in the human inflammatory response protein lactoferrin. // J Biol Chem. 1994. — V. 269.-P. 23661-23667.

130. Marchetti M, Longhi C, Conte MP, Pisani S, Valenti P, Seganti L. Lactoferrin inhibits herpes simplex virus type 1 adsorption to Vero cells. // Antiviral Res. — 1996.-V. 29.-P. 221-231.

131. Markert JM, Gillespie GY, Weichselbaum RR, Roizman B, Whitley RJ. ' Genetically engineered HSV in the treatment of glioma: a review. // Rev Med Virol. 2000. - V. 10. - P. 17-30.

132. Matthews DA, Russell WC. Adenovirus protein-protein interactions: molecular parameters governing the binding of protein VI to hexon and the activation of the adenovirus 23K protease. // J Gen Virol. 1995. - V. 76. - P. 1959-69.

133. Mattsby-Baltzer I, Roseanu A, Motas C, Elverfors J, Engberg I, Hanson LA. Lactoferrin or a fragment thereof inhibits the endotoxin-induced interleukin-6 response in human monocytic cells. // Pediatr Res. 1996. - V. 40. — P. 257-62.

134. Medin JA, Fowler DH. Post-transduction events in retrovirus-mediated gene therapy involving hematopoietic stem cells: beyond efficiency issues. // J Cell Biochem Suppl. 2002. - V. 38. - P. 46-54.

135. Michael SI, Hong JS, Curiel DT, Engler JA. Addition of a short peptide ligand to the adenovirus fiber protein. // Gene Ther. 1995. - V. 2, N 9. - P. 660-668.

136. Michou A-I. et al. Mutational analysis of the avian adenovirus CELO, which provides a basis for gene delivery vectors. // J. Virol. 1999. - V. 73. - P. 1399-1410.

137. Mincheva-Nilsson L, Hammarstrom S, Hammarstrom ML. Activated human gamma delta T lymphocytes express functional lactoferrin receptors. // Scand J Immunol. 1997.-V. 46.-P. 609-618.

138. Mittereder N, March KL, Trapnell ВС. Evaluation of the concentration and bioactivity of adenovirus vectors for gene therapy. // J Virol. — 1996. — V. 70. — P. 7498-7509.

139. Miyazawa N, Leopold PL, Hackett NR, Ferris B, Worgall S, Falck-Pedersen E, Crystal RG. Fiber swap between adenovirus subgroups В and С alters intracellular trafficking of adenovirus gene transfer vectors. // J. Virol. 1999. -V. 73.-P. 6056-6065.

140. Motoi F, Sunamura M, Ding L, Duda DG, Yoshida Y, Zhang W, Matsuno S, Hamada H. Effective gene therapy for pancreatic cancer by cytokines mediatedby restricted replication-competent adenovirus. // Hum Gene Ther. 2000. - V. 11.-P. 223-235.

141. Na YJ, Han SB, Kang JS, Yoon YD, Park SK, Kim HM, Yang KH, Joe CO. Lactoferrin works as a new LPS-binding protein in inflammatory activation of macrophages. // Int Immunopharmacol. 2004. - V. 4. — P. 1187-1199.

142. Nakane PK., Kawaio A.S. Peroxidase-labeled antibody. A new method of conjugation. // J Histochem Cytochem. 1974. - V. 22. - P. 1084-1091

143. Nguyen JT, Wu P, Clouse ME, Hlatky L, Terwilliger EF. Adeno-associated virus-mediated delivery of antiangiogenic factors as an antitumor strategy. // Cancer Res. 1998. - V. 58. - P. 5673-5677.

144. Noureddini SC, Curiel DT. Genetic targeting strategies for adenovirus. // Mol. Pharm. 2005. - V. 2. - P. 341-347.

145. Ono M, Okuda Y, Yazawa S, Shibata I, Tanimura N, Kimura K, Haritani M, Mase M, Sato S Epizootic outbreaks of gizzard erosion associated with adenovirus infection in chickens. // Avian Dis. — 2001. V. 45. - P. 268-275.

146. Orsi N. The antimicrobial activity of lactoferrin: current status and perspectives. //Biometals. 2004. - V. 17.-P. 189-196.

147. Ott VD, Diukareva SV, Melnikov OR. Lactoferrin and perspectives for dietary prevention of anemia. // Vopr Pitan. 1993. - N 1. - P. 6-13.

148. Pay et V, Arnauld C, Picault JP, Jestin A, Langlois P / Transcriptional organization of the avian adenovirus CELO.// J Virol. 1998. - V. 72. - P. 92789285.

149. Plaut AG, Qiu J, St Geme JW 3rd. Human lactoferrin proteolytic activity: analysis of the cleaved region in the IgA protease of Haemophilus influenzae. // Vaccine. -2000. V. 19.-P. 148-152.

150. Poeschla EM, Wong-Staal F, Looney DJ. Efficient transduction of nondividing human cells by feline immunodeficiency virus lentiviral vectors. // Nat Med. -1998.-V. 4.-P. 354-357. •

151. Qiu J, Hendrixson DR, Baker EN, Murphy TF, St Geme JW 3rd, Plaut AG. Human milk lactoferrin inactivates two putative colonization factors expressed , , by Haemophilus influenzae. // Proc Natl Acad Sci USA.- 1998. V. 95. - P. " "" 12641-12646.t

152. Rainard P. Bacteriostatic activity of bovine milk lactoferrin against mastitic bacteria. // Vet Microbiol. 1986. - V. 11. - P. 387-392.

153. Reghunathan R, Jayapal M, Hsu LY, Chng HH, Tai D, Leung BP, Melendez AJ. Expression profile of immune response genes in patients with Severe Acute Respiratory Syndrome. // BMC Immunol. 2005. - V. 6. - P. 2.

154. Rekosh DM, Russell WC, Bellet AJ, Robinson AJ. Identification of a protein linked to the ends of adenovirus DNA. // Cell. 1977. - V. 11. - P. 283-295.

155. Riley, D., Flint, S.J. RNA-binding properties of a translational activator, the adenovirus L4 100-kilodalton protein. // J. Virol. 1993. - V.67. - P. 3586-3595.

156. Romanczuk H, Galer CE, Zabner J, Barsomian G, Wads worth SC, O'Riordan CR. Modification of an adenoviral vector with biologically selected peptides: a novel strategy for gene delivery to cells of choice. // Hum. Gene Ther. 1999. -V. 10.-P. 2615-2626.

157. Romano G, Pacilio C, Giordano A. Gene transfer technology in therapy: current applications and future goals. // Stem Cells. 1999. - V. 17. - P. 191-202.

158. Rowe W.P., Huebner R.J., Gilmor L.K., Parrott R.H., Ward T.G. Isolation of a cytopathogenic agent from human adenoids undergoigs spontaneous degeneration in tissue culture. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1953. - V. 84. - P. 570-573.

159. Schiaffino MV, Dellambra E, Cortese K, Baschirotto C, Bondanza S, Clementi M, Nucci P, Ballabio A, Tacchetti C, De Luca M. Effective retrovirus-mediated gene transfer in normal and mutant human melanocytes. // Hum Gene Ther. -2002.-V. 13.-P. 947-957.

160. Schneider RJ. Cap-independent translation in adenovirus infected cells. // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1995.-V. 203.-P. 117-129.

161. Shashkova EV, Cherenova LV, Kazansky DB, Doronin K. Avian adenovirus vector CELO-TK displays anticancer activity in human cancer cells and suppresses established murine melanoma tumors. // Cancer Gene Ther. 2005. — V. 12.-P. 617-626.

162. Shayakhmetov D.M., Papayannopoulou Т., Stamatoyannopoulos G., Lieber A. Efficient gene transfer into human CD34(+) cells by a retargeted adenovirus vector. // J. Virol. -2000. V. 74. - P. 2567-2583.

163. Sheay W, Nelson S, Martinez I, Chu TH, Bhatia S, Dornburg R. Downstream insertion of the adenovirus tripartite leader sequence enhances expression in universal eukaryotic vectors. // Biotechniques. 1993. - V. 15. - P. 856-862.

164. Shenk T. Adenoviridae: The viruses and their replication. Philadelphia. 1996. -Raven Publisher. - P. 2115-2119.

165. Shenk T, Williams J. Genetic analysis of adenoviruses. // Curr Top Microbiol Immunol.-1984.-V. 111.-P. 1-39.

166. Sheppard M, Werner W, Tsatas E, McCoy R, Prowse S, Johnson M. Fowl adenovirus recombinant expressing VP2 of infectious bursal disease virus induces protective immunity against bursal disease. // Arch. Virol. — 1998. V. 143.-P. 915-930.

167. Shiau AL, Lin PR, Chang MY, Wu CL. Retro virus-mediated transfer of prothymosin gene inhibits tumor growth and prolongs survival in murine bladder cancer. // Gene Ther. -2001. V. 8.-P. 1609-1617.

168. Shimamura M, Yamamoto Y, Ashino H, Oikawa T, Hazato T, Tsuda H, Iigo M. Bovine lactoferrin inhibits tumor-induced angiogenesis. // Int J Cancer. 2004. -V. 111.-P. 111-116.

169. Siebert PD, Huang ВС. Identification of an alternative form of human lactoferrin mRNA that is expressed differentially in normal tissues and tumor-derived cell lines. // Proc Natl Acad Sci USA.- 1997. V. 94. - P. 2198-2203.

170. Singh PK, Parsek MR, Greenberg EP, Welsh MJ. A component of innate immunity prevents bacterial biofilm development. // Nature. 2002. — V. 417. -P. 552-555.

171. Sorimachi K., Akimoto K., Hattori Y., Leiri T. and Niwa A. Activation of macrophages by lactoferrin: secretion of TNF-a, IL-8 and NO. // Biochem. Mol. Biol. Int. 1997. - V. 43. - P. 79-87.

172. Stewart PL, Fuller SD, Burnett RM. Difference imaging of adenovirus: bridging the resolution gap between X-ray crystallography and electron microscopy. // EMBO J. 1993. - V. 12. - P. 2589-2599.

173. Stowell KM, Rado ТА, Funk WD, Tweedie JW. Expression of cloned human lactoferrin in baby-hamster kidney cells. // Biochem J. 1991. - V. 276. - P. 349-355.

174. Suzuki YA, Lonnerdal B. Characterization of mammalian receptors for lactoferrin. // Biochem Cell Biol. 2002. - V. 80. - P. 75-80.

175. Takakura N, Wakabayashi H, Ishibashi H, Yamauchi K, Teraguchi S, Tamura Y, Yamaguchi H, Abe S. Effect of orally administered bovine lactoferrin on the immune response in the oral candidiasis murine model. // J Med Microbiol. — 2004.-V. 53.-P. 495-500.

176. Tan PK, Michou AI, Bergelson JM, Cotten M. Defining CAR as a cellular receptor for the avian adenovirus CELO using a genetic analysis of the two viral fibre proteins. // J Gen Virol. 2001. - V. 82. - P. 1465-1472.

177. Tani F, Iio K, Chiba H, Yoshikawa M. Isolation and characterization of opioid antagonist peptides derived from human lactoferrin. // Agric Biol Chem. 1990. -V. 54.1-P. 1803-1810.

178. Tartaglia J, Bonnet MC, Berinstein N, Barber B, Klein M, Moingeon P. Therapeutic vaccines against melanoma and colorectal cancer. // Vaccine. -2001.-V. 19.-P. 2571-2575.

179. Valenti P, Antonini G. Lactoferrin: an important host defence against microbial and viral attack. // Cell Mol. Life Sci. 2005. - V. 62. - P. 2576-2587.

180. Van Berkel РН, van Veen HA, Geerts ME, de Boer HA, Nuijens JH. Heterogeneity in utilization of N-glycosylation sites Asn624 and Asnl38 in human lactoferrin: a study with glycosylation-site mutants. // Biochem J. 1996. -V. 319.-P. 117-122.

181. Van der Eb A.J., van Kesteren J.W., van Bruggen E.F.J. Structural properties of adenovirus DNAs. II Biochem. Biophys. Acta. 1969. - V. 182. - P. 530541.

182. Van Hooijdonk AC, Kussendrager KD, Steijns JM. In vivo antimicrobial and antiviral activity of components in bovine milk and colostrum involved in nonspecific defence. // Br J Nutr. 2000. - V. 84. - P. 127-134.

183. Vile R.G. A marriage of viral vectors. // Nature Biotech. -1997. -V. 15. P. ^ 840-841.

184. Volpers C, Kochanek S. Adenoviral vectors for gene transfer and therapy. // J. Gene Med. -2004. V. 6.-P. 164-171.

185. Vorland LH. Lactoferrin: a multifunctional glycoprotein. // APMIS. 1999. - V. 107.-P. 971-981.

186. Wakabayashi H., Takase M. and Tomita M. Lactoferricin derived from milk protein lactoferrin. // Curr. Pharm. Des. 2003. - V. 9. - P. 1277-1287.

187. Wang G, Williams G, Xia H, Hickey M, Shao J, Davidson BL, McCray PB. Apical barriers to airway epithelial cell gene transfer with amphotropic retroviral vectors. // Gene Ther. 2002. - V. 9 - P. 922-931.

188. Wang Q, Greenburg G, Bunch D, Farson D, Finer MH. Persistent transgene expression in mouse liver following in vivo gene transfer with a delta El/delta E4 adenovirus vector. Gene Ther. 1997. -V. 4. - P. 393-400.

189. Ward PP, Lo JY, Duke M, May GS, Headon DR, Conneely OM. Production ofbiologically active recombinant human lactoferrin in Aspergillus oryzae. //I

190. Biotechnology (N Y). 1992. - V. 10. - P. 784-789.

191. Ward PP, May GS, Headon DR, Conneely OM. An inducible expression system for the production of human lactoferrin in Aspergillus nidulans. // Gene. 1992. -V. 122.-P. 219-223.

192. Ward PP, Piddington CS, Cunningham GA, Zhou X, Wyatt RD, Conneely OM. A system for production of commercial quantities of human lactoferrin: a broad spectrum natural antibiotic. // Biotechnology (N Y). 1995. - V. 13. - P. 498503.

193. Ward PP, Uribe-Luna S, Conneely OM. Lactoferrin and host defense. // Biochem. Cell Biol. 2002. - V. 80. - P. 95-102.

194. Washietl S, Eisenhaber F. Reannotation of the CELO genome characterizes a set of previously unassigned open reading frames and points to novel modes of host interaction in avian adenoviruses. // BMC Bioinformatics. 2003. V. 4. - P. 55.

195. Weber J. Genetic analysis of adenovirus type 2 III. Temperature sensitivity of processing viral proteins. // J. Virol. 1976. - V. 17. - P. 462-471.

196. Webster A, Russell WC, Kemp GD. Characterization of the adenovirus proteinase: development and use of a specific peptide assay. // J Gen Virol. —-1989.-V. 70.-P. 3215-3223.

197. Wickham TJ. Targeting adenovirus. // Gene Ther. 2000. - V. 7. - P. 110-114.

198. Wickham TJ, Segal DM, Roelvink PW, Carrion ME, Lizonova A, Lee GM, Kovesdi I. Targeted adenovirus gene transfer to endothelial and smooth muscle cells by using bispecific antibodies. II J. Virol. 1996. - V. 70. - P. 6831-6838.

199. Williams AF, Barclay AN. The immunoglobulin superfamily—domains for cell surface recognition. // Annu Rev Immunol. 1988. - V. 6. - P. 381-405.

200. Wilson DR. Viral-mediated gene transfer for cancer treatment. // Curr. Pharm. Biotechnol. -2002. V. 3.-P. 151-164.

201. Windheim M, Burgert HG. Characterization of E3/49K, a novel, highlyglycosylated E3 protein of the epidemic keratoconjunctivitis-causing adenovirustype 19a.//J. Virol. -2002. V. 76.-P. 755-766.

202. Wu SC, Huang GY, Liu JH. Production of retrovirus and adenovirus vectors for gene therapy: a comparative study using microcarrier and stationary cell culture. // Biotechnol Prog. 2002. - V. 18. - P. 617-622.

203. Xi Q, Cuesta R, Schneider RJ. Regulation of translation by ribosome shunting through phosphotyrosine-dependent coupling of adenovirus protein 100k to viral mRNAs. //J Virol.-2005.-V. 79.-P. 5676-5683.

204. Xiao B, Li QW, Feng B, Han ZS, Gao da W, Li J, Li K, Zhao R, Jiang ZL, Hu JH, Zhi XB. High-level expression of recombinant human nerve growth factor beta in milk of nontransgenic rabbits. // J. Biosci. Bioeng. 2008. - V. 105. - P. 327-334.

205. Yates V.J., Fry D.E. Observations on a chicken embryo lethal orphan (CELO) virus. // Am. J. Vet. Res. 1957. - V. 18. - P. 657-660.

206. Young CS. The structure and function of the adenovirus major late promoter. // Curr Top Microbiol Immunol. 2003. - V. 272. - P. 213-249.

207. Yueh A, Schneider RJ. Translation by ribosome shunting on adenovirus and hsp70 mRNAs facilitated by complementarity to 18S rRNA. // Genes Dev. — 2000.-V. 14.-P. 414-421.

208. Zabner J, Chillon M, Grunst T, Moninger TO, Davidson BL, Gregory R, Armentano D. A chimeric type 2 adenovirus vector with a type 17 fiber enhances gene transfer to human airway epithelia. // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2003. - V. 272. - P. 213-249.

209. Zagulski T, Lipinski P, Zagulska A, Broniek S, Jarzabek Z. Lactoferrin can protect mice against a lethal dose of Escherichia coli in experimental infection in vivo. И Br J Exp Pathol. 1989. - V. 70. - P. 697-704.

210. Zhang GH, Mann DM, Tsai CM. Neutralization of endotoxin in vitro and in vivo by a human lactoferrin-derived peptide. // Infect Immun. 1999. - V. 67. — P. 1353-1358.

211. Zhang J, Li L, Cai Y, Xu X, Chen J, Wu Y, Yu H, Yu G, Liu S, Zhang A, Chen J, Cheng G. Expression of active recombinant human lactoferrin in the milk of transgenic goats. // Protein Expr. Purif. 2008. - V. 57. - P. 127-135.

212. Zimecki M, Kocieba M, Kruzel M. Immunoregulatory activities of lactoferrin in the delayed type hypersensitivity in mice are mediated by a receptor with affinity to mannose. //Immunobiology. 2002. - V. 205. - P. 120-131.

213. Zimecki M, Mazurier J, Machnicki M, Wieczorek Z, Montreuil J, Spik G. Immunostimulatory activity of lactotransferrin and maturation of CD4- CD8-murine thymocytes. // Immunol Lett. 1991. - V. 30. - P. 119-123.

214. Zimecki M, Mazurier J, Spik G, Kapp JA. Human lactoferrin induces phenotypic and functional changes in murine splenic В cells. // Immunology. 1995. — V. 86.-P. 122-127.

Информация о работе

Тутыхина, Ирина Леонидовна
кандидата биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.07

Диссертация

Разработка системы продукции лактоферрина человека in ovo и in vivo с использованием рекомбинантных аденовирусов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы