Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Создание модели для изучения опухолеобразования у редиса Raphanus sativus L. с использованием трансгенных растений по гену IPT

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Создание модели для изучения опухолеобразования у редиса Raphanus sativus L. с использованием трансгенных растений по гену IPT"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

Фролова Надежда Владимировна

СОЗДАНИЕ МОДЕЛИ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ОПУХОЛЕОБРАЗОВАНИЯ У РЕДИСА КАРНАШБ БЛ ПУШ Ь. С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ПО ГЕНУ 1РТ

специальность: 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2006

Работа выполнена в лаборатории генной и клеточной инженерии растений Биологического научно-исследовательского института Санкт-Петербургского Государственного Университе га.

Научный руководитель: профессор, доктор биологических наук

Лутова Людмила Алексеевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Борисов Алексей Юрьевич

доктор биологических наук Гавриленко Татьяна Андреевна

Ведущее учреждение: Московский Государственный

Университет им. М.В. Ломоносова

Защита состоится Ос/гл/п/7 , и 2006 г. часов на заседании

Диссертационного совета4-^.212.232.12 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Санкт-Петербургском Государственном университете по адресу: 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, СПбГУ, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке Санкт-Петербургского государственного университета

Автореферат разослан ¿¿С'.-С г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

Л.А. Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Важным фактором в любом научном исследовании является наличие удобных моделей. В большинстве случаев используются хорошо изученные и удобные с генетической точки зрения виды — модельные объекты. В других случаях необходимо создание новых моделей, с помощью которых возможно адекватно воспроизводить и изучать то или иное явление.

Контроль дифференцировки у высших растений представляет собой сложный многоэтапный процесс, а характер и направление дифференцировки клеток в растении определяется балансом основных гормонов, ауксинов и цитокининов. Выход из-под системного контроля, нарушения на разных этапах онтогенетического развития, могут вызвать переход к недифференцированному росту. Одной из таких моделей, позволяющей детально исследовать процессы роста и развития, являются растения с нарушениями морфогенетического развития, в частности, опухолеобразующие растения - своеобразные «гормональные» мутанты.

Феномен опухолеобразования был описан у многих видов и межвидовых гибридов растений (Байдербек, 1981). Индуцированные опухоли вызываются факторами внешней среды, в том числе фитопатогенными организмами (вирусами, прокариотическими бактериями, грибами, нематодами и другими возбудителями). Из этой группы наиболее подробно изучены корончатые галлы,. индуцируемые Agrobacterium (Weiler and Schroeder, 1987; Zambryski et al., 1989). Другая разновидность опухолей - генетические опухоли — возникают спонтанно у растений, имеющих определенный генотип. Все генетические опухоли растений, как и опухоли, индуцированные Agrobacterium, характеризуются сходным гистологическим строением, неорганизованным ростом и способностью к гормоннезависимому росту in vitro. Для большинства генетических и индуцированных опухолей характерно также изменение уровня фитогормонов, в частности - изменение баланса ауксинов и цитокининов (Байдербек, 1981). Наиболее хорошо изученным классическим примером генетических опухолей у растений является опухолеобразование у межвидовых гибридов табака (Ahuja, 1968; Bayer, 1982; Smith, 1968). Однако в связи с полиплоидностью и стерильностью таких гибридов возникают сложности в использовании их в качестве модельного объекта.

В данной диссертационной работе была использована уникальная генетическая коллекция инбредных линий редиса Raphanus sativas L., которая была создана в 60-е гг. XX века и поддерживается до настоящего времени (Нарбут, 1966). Генетическая коллекция инбредных линий редиса является источником гормональных мутантов и аномалий морфогенетического развития, в том числе опухолеобразующих форм. В отличие от гибридов табака, редис - удобный модельный объект, это ¿аиплоиднъш вид, который может быть легко вовлечен в генетический анализ.

В исследованиях, проводимых в нашей лаборатории, показано, что опухолеобразование у инбредных линий редиса сопряжено с изменением гормонального баланса, однако механизм возникновения таких нарушений остается невыясненным до сих пор (Matveeva et al., 2004). Предполагается, что изменение гормонального баланса может быть следствием мутаций растительных генов, контролирующих гормональный метаболизм, или связано с наличием в геноме растений последовательностей, гомологичных агробактериальным онкогенам (Matveeva et al., 2004; Intrieri and Buiatti, 2001).

Классическим подходом, позволяющим изучать роль гормонов в процессе опухолеобразования, является трансформация клеток растений агробактериальным вектором, содержащим онкогены, кодирующие ферменты, вовлеченные в гормональный метаболизм (Klee and Romano, 1994). Встраивание в геном растений агробактериальных генов биосинтеза фитогормонов и их экспрессия приводит к смещению гормонального баланса растения в целом. Изменение гормонального баланса приводит в свою очередь к нарушению дифференцировки и различным морфогенетическим аномалиям, в том числе опухолеобразованию.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы является создание модели для изучения опухолеобразования у редиса с помощью трансгенных растений по гену фермента биосинтеза цитокинина изопентенилтрансферазы (Apt) и изучение роли цитокинина в процессе опухолевого роста. В задачи работы входило:

1. Разработка метода агробактериальной трансформации редиса in vivo

2. Получение коллекции трансгенных растений редиса, содержащих вставку гена биосинтеза цитокинина изопентенилтрансферазы (ipt).

3. Анализ морфологических и физиологических (чувствительность к гормонам in vitro) признаков трансгенных растений, содержащих вставку гена ipt.

4. Изучение экспрессии гена ipt у трансг енных растений редиса.

5. Определение эндогенного уровня цитокининов и индолилуксусной кислоты у трансгенных растений редиса.

Научная новизна работы. В ходе работы был модифицирован и адаптирован традиционный метод агробактериальной трансформации завязи цветка редиса in vivo. С применением данного метода на основе безопухолевой инбредной линии № 30 была впервые создана коллекция трансгенных растений редиса, содержащих вставку генов ipt и nptlJ. С помощью молекулярно-генетических методов было показано, что вставка Т-ДНК стабильно наследуется на протяжении четырех поколений. По целому ряду признаков: опухолеобразование in vivo, измененная реакция на гормоны, способность к формированию вторичных опухолей in vitro, изменение содержания фитогормонов - трансгенные растения со вставкой гена ipt были близки к растениям опухолеобразующих линий, что является результатом повышения уровня цитокининов вследствие встраивания гена ipt в геном редиса. Таким образом нами смоделирован процесс опухолеобразования у редиса и

показана роль основных фитогормонов (цитокининов и ауксинов) в дифференцировке растений.

Практическая ценность. Результаты, полученные в ходе выполнения работы, имеют значение для понимания механизмов опухолевого роста у растений. Разработан метод агробактериальной трансформации редиса in vivo. Создана коллекция Т-ДНК инсерционных мутантов, содержащих гены ipt и nptll, которая может быть использована для изучения роли цитокинина в опухолеобразовании у редиса.

Результаты, представленные в диссертационной работе, могут быть включены в план учебных курсов: «Генетика развития растений», «Генная инженерия и биотехнология», «Молекулярно-генетические основы растительно-микробных взаимодействий» и других, читаемых на кафедре генетики и селекции СПбГУ.

Апробация работы. По результатам работы сделаны сообщения на следующих конференциях: конференция «Актуальные проблемы генетики», Москва, 20-21 февраля, 2003; 7-й Международный конгресс по молекулярной биологии растений ISPMB, Барселона, Испания, 23-28 июня, 2003; 2-й Международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 10-14 ноября, 2003; 3-й съезд генетиков и селекционеров России «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития», Москва, 6-12 июня, 2004; Международная конференция «Сохранение генетических ресурсов», Санкт-Петербург, 19-22 октября, 2004; 15-й Конгресс FESPB, 17-21 июля, Лион, Франция, 2006; а также на семинарах лаборатории генной и клеточной инженерии растений БиНИИ СПбГУ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей материалы и методы; результаты исследования, обсуждение результатов, выводов, списка литературы, состоящего из 151 источника. Работа изложена на 146 страницах и содержит 34 рисунка и 9 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Растительный материал. В работе была использована высокоинбредная (более 40 поколений инбридинга) безопухолевая линия редиса № 30 из Петергофской коллекции (Нарбут, 1966) и трансгенные растения, полученные на ее основе, содержащие вставку генов nptll и ipt.

Бактериальные штаммы. Дпя трансформации растений был использован штамм Agrobacterium tumefaciens, любезно предоставленный профессором Т. Шмуллингом (Т. Schmuelling, Institute of Biology, Applied Genetics, Freie Universität Berlin, Berlin, Germany). Штамм содержит вектор pGV 3850 с геном ipt под конститутивным промотором 35S вируса мозаики цветной капусты, а также селективный маркерный ген nptll, кодирующий неомицинфосфотрансферазу, определяющую проявление признака "устойчивость к канамицину", под промотором нопалинсинтетазы (Schell et al., 1982).

Для контрольной трансформации был использован штамм Agrobacterium tumefaciens, любезно предоставленный профессором М. Онджеем (М. Ondíej, Institute of Plant Molecular Biology, Czechoslovakia). Штамм содержит вектор pCB 1346 с геном nptll под промотором нопалинсинтетазы (Vlasak and Ondíej, 1992). Метод агробактериальной трансформации in vivo; Для трансформации растений использовали разведенную в 10 раз «ночную культуру» агробактерии в жидкой питательной среде Луриа-Бертани (LB), которая была перенесена при помощи микробиологической петли на рыльце пестика нераспустившихся бутонов. Возраст растений, подвергшихся трансформации (поколение Т0), составил около 60 дней. Соцветия помещали под изоляторы для завязывания семян путем самоопыления.

Молекулярно-биологические методы. В работе использовали стандартные методы генной инженерии (Маниатис и др., 1984). Полимеразные цепные реакции проводили на термоциклере «Applied Biosystems» с использованием полимеразы Т. aquaticus. Последовательности праймеров, использованных в работе были следующие:

nptll (1): GTCGTCTGGTCGGTCA TTTCG nptll (2): GTGA ТСТСА CCTTGCTCCTGCC ipt 1: TA TTCGCCA CAA GTTA CCCGA CCA ipt 2: CTGTTGGCGCGCATGGATGAAATA Изучение реакции на экзогенные фитогормоны in vitro. Реакция трансгенных растений и родительских линий редиса на экзогенные цитокинины: кинетин, 10 мг/л, бензиламинопурин (БАП), 2 мг/л, и ауксины: 2,4 дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4 Д), 10 мг/л, нафтилуксусная кислота (НУК), 2 мг/л, и индолилуксусная кислота (ИУК), 1 мг/л, была изучена с помощью метода асептической культуры изолированных органов растений in vitro. Интенсивность каллусообразования, корнеобразования и некротизации анализировали визуально, оценивая площадь экспланта, вовлеченную в данный морфогенетический процесс. Определение эндогенного содержания фитогормонов: зеатина (Z); зеатннрибозида (ZR) и индолнлуксусной кислоты (ИУК): проводили методом непрямого конкурентного иммуноферментного анализа. Экстракцию ИУК из тканей листа осуществляли этил ацетатом в кислой среде (рН 3,0). Цитокинины были экстрагированы из тканей листьев водонасыщенным бутанолом в слабощелочной среде (рН 8,0) (Кислин, 2000).

Статистическая обработка включала подсчёт процента чувствительных к кинетину (или 2,4 Д) эксплантов и ошибки процента (Лакин, 1990). При построении калибровочных кривых для каждой группы повторностей (п=3) было подсчитано среднее по повторности и стандартное отклонение (программа STAT1STICA, 6.0). Анализ данных по реакции эксплантов на НУК (2 мг/л) и ИУК (1 мг/л) проводили . в виде выборочного распределения с помощью непараметрического критерия Краскела-Уоллеса (программа STATISTICA, 6.0).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Опухолеобразование у растений — многоступенчатый процесс. Причины возникновения опухолей у растений разнообразны. Возникновению опухолей предшествует сбой программы морфогенетического развития, особенно у форм, для которых возможность неопластического роста заложена в генотипе самого растения. Несмотря на то, что опухоли растений описаны достаточно давно, механизмы этого явления изучены недостаточно. Показано, что генетические опухоли межвидовых гибридов табака имеют много общего с опухолями, индуцированными Agrobacterium: в обоих случаях причиной возникновения опухоли считают повышение эндогенного уровня растительных гормонов, ауксинов и цитокининов (Ahuja, 1968).

Наши ранние эксперименты по изучению природы опухолеобразования у инбредных линий редиса подтверждают это предположение. Как было показано в ранних экспериментах, опухолевые и безопухолевые линии обладают различной реакцией на экзогенные цитокинин и ауксин in vitro (Бузовкина и др., 1991; Бузовкина и др., 1993). Изолированные органы (экспланты) безопухолевых линий в основном устойчивы к экзогенным цитокининам и ауксинам, в то время как для большинства опухолеобразующих линий характерна повышенная некротизация в ответ на основные фитогормоны in vitro (Бузовкина и др., 1993). Кроме того, было показано, что опухолевые и безопухолевые линии значительно различаются по содержанию некоторых классов цитокининов в надземных и подземных частях растения. Уровень цитокининов в корнеплодах опухолевых линий существенно возрастает по сравнению с растениями безопухолевых линий (Matveeva et al., 2004). Таким образом, опухолеобразование у инбредных линий редиса связано с нарушением гормонального метаболизма.

Разработка метода агробактериальной трансформации редиса in vivo. Нами была произведена трансформация растений редиса in vivo безопухолевой инбредной линии №30 вектором, содержащим ген фермента биосинтеза цитокининов изопентенилтрансферазы ipt. Следует отметить, что редис плохо поддается традиционным способам агробактериальной трансформации in vitro. Поэтому важным этапом работы была разработка метода трансформации.

В последние несколько лет зарубежными учеными был опубликован ряд работ, посвященных разработке методов трансформации культурных представителей рода Rciphanus — редьки и редиса. Были получены положительные результаты при использовании метода «floral-dip» (погружение соцветий в жидкую суспензию агробактерии), а также ультразвуковой и вакуумной инфильтрации культуры агробактерий в прорастающие семена (Curtis and Num, 2001; Curtis, 2003). В нашей лаборатории ранее неоднократно предпринимались попытки трансформации редиса in vitro. Однако, при трансформации in vitro штаммами с векторами, содержащими единичные бактериальные гены, вовлеченные в метаболизм гормонов, нам не удавалось получить растения-регенеранты. Таким образом, агробактериальная трансформация растений in vivo, в ходе которой были получены трансгенные растения, стала продолжением ранее начатых

экспериментов. В процессе работы нами были подобраны оптимальные условия для трансформации редиса in vivo. Традиционный метод агробактериальной трансформации завязи цветка редиса in vivo был успешно модифицирован и адаптирован. Возраст растений, подвергшихся трансформации, составил около 60 дней, растения находились в стадии бутонизации. С применением данного метода трансформации была впервые создана коллекция трансгенных растений редиса на основе безопухолевой линии № 30 из генетической коллекции.

Получение коллекции трансгенных растений редиса, содержащих вставку гена (ipñ и анализ ее проявления в поколениях Tj-T^. Созданная нами коллекция Т-ДНК инсерционных мутантов включает в себя: 4 поколения растений, содержащих вставку генов ipt, nptll, а также 2 поколения трансформантов, содержащих вставку только маркерного гена nptll (эти растения были использованы нами в качестве контроля). С помощью молекулярно-генетических методов (полимеразная цепная реакция, Саузерн-блот анализ) было показано, что вставка Т-ДНК стабильно наследуется на протяжении четырех поколений (рисунок 1).

У трансгенных растений, содержащих вставку целевого гена ipt, с разной частотой наблюдается опухолевый фенотип, но частота проявления этого признака варьирует в каждом поколении трансгенных растений (таблица 1). У трансгенных растений, содержащих вставку только маркерного гена nptll, а также у растений контрольной безопухолевой линии 30, не было отмечено появления опухолеобразующих растений во всех проанализированных поколениях.

MM1I ПК ПК 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27

Рисунок 1. Результаты полимеразной цепной реакции ДНК трансгенных растений с праймерами к гену маркерному гену nptll A. tumefaciens : дорожка 1 - ММВ -маркер молекулярной массы, стрелкой обозначен фрагмент 0.5 kb; ПК-положительный контроль; НК- отрицательный контроль; 1-27 - ПЦР-продукты трансгенных растений.

Мы предполагаем, что появление опухолей у безопухолевой линии редиса, является результатом повышения уровня цитокининов вследствие встраивания Т-ДНК с геном ipt в геном растения. Этот феномен описан в литературе (Smart, 1991; Smigocki, 1991; Motyka et al., 1996; Redigetal., 1997).

Таблица 1. Характеристика трансгенных растений линии 30 по признаку «опухолеобразование».

Поколение Общее количество растений N Количество трансгенных растений (¡ри ггрП!)

№ семьи

оп+ оп-

т, 47 8 4

Т2№19* 49 7 15

Т3 19-25 29 0 29

Т4 19-25-13 4 0 4

Т3 19-27* 27 6 18

Т419-27-1* 4 2 2

Т4 19-27-4* 4 0 4

Т4 19-27-10* 3 0 3

Т319-28* 28 6 22

Т4 19-28-5* 17 4 13

Т4 19-28-14* 5 2 3

Т419-28-27 5 4 1

Т2№32 1 1 0

Т3 32-50* 9 1 8

Т? №41 3 0 1

Т2№45* 9 2 6

Т3 45-60* 11 2 9

Т4 45-60-5* 6 3 3

Т4 45-60-7* 7 0 7

Т4 45-60-9 3 0 3

* отмечены опухолеобразуюшие растения

Помимо опухолевого роста нами было отмечено существование двух групп трансгенных растений, имеющих сходные фенотипические изменения в антоциановой окраске лепестков венчика и корнеплода. Так, у контрольной группы трансгенных растений, содержащих вставку гена прШ, наблюдали изменение окраски лепестков венчика с розовой на белую. Данные нарушения рассматриваются нами с точки зрения Т-ДНК инсерционного мутагенеза. Известно, что попадание инсерций Т-ДНК в функционально значимые районы растительного генома может приводить к нарушению проявления генов, локализованных в данной области. Изменение антоциановой окраски корнеплода и лепестков венчика с розовой на белую у трансгенных растений, содержащих вставку целевого гена ¿р(, может быть связано с непосредственным влиянием цитокинина на этот признак. Такие случаи были ранее описаны в литературе для

целого ряда растений (Deikman and Hammer, 1995). Таким образом, изменение антоциановой окраски у трансгенных растений по гену ipt может также свидетельствовать о влиянии цитокинина на биосинтез антоциана. Изучение экспрессии гена ipt у трансгенных растений. Анализ фенотипа трансгенных растений со вставкой гена ipt по признаку «опухолеобразование» показал отсутствие опухолей у части проанализированных растений. Согласно нашему предположению, наличие опухолей только у части трансгенных растений, содержащих вставку гена ipt, является следствием «замолкания», т.е. отсутствия экспрессии целевого гена. Для проверки данного предположения мы исследовали экспрессию гена ipt у опухолеобразующих и безопухолевых трансгенных растений методом полимеразной цепной реакции, сопряженной с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Нами показано, что уровень экспрессии гена ipt в геноме опухолеобразующих и безопухолевых трансгенных растений при выровненной концентрации тотальной РНК в образцах различается (таблица 2). Практически у всех опухолеобразующих растений Т4 (за исключением №19-27-1) была отмечена экспрессия встроенного гена ipt. Уровень экспрессии гена ipt у опухолеобразующих растений варьирует от среднего до высокого. Кроме того, показано, что почти у всех безопухолевых растений Т4 и у растений контрольной линии 30 отсутствовала экспрессия целевого гена ipt. Исключение составило безопухолевое растение Т4 19-25-13, однако в данном случае уровень экспрессии гена ipt незначителен, вероятно количество дополнительно синтезируемого цитокинина не достаточно для возникновения гормонального дисбаланса и проявления опухолевого фенотипа.

Таблица 2. Экспрессия гена ipt у опухолеобразующих и безопухолевых трансгенных растений.

Растение Т4 Наличие Наличие Уровень

опухоли экспрессии гена ipt экспрессии

№ 19-25-13 — + +/-

№ 19-27-1 + - —

№19-27-2 + + +

№19-27-4 + + ++

№19-27-5 — - —

№19-28-8 + + ++

№19-28-14 + + ++

№19-28-27 — — -

Линия 30 - - -

Пояснения к таблице: наличие и уровень экспрессии оценивали визуально по количеству ПЦР-продукта, полученного на матрице кДНК при выровненной

концентрации тотальной РНК в образцах, соответственно: +/- низкий, + средний, -Н- высокий уровень экспрессии.

Случаи «замолкания» чужеродных генов среди потомков трансгенных растений описаны у разных видов растений: табака, петунии, арабидопсиса (Mannerlof, Tenning, 1997; Matzke, 1998; Wang, 2000; Дейнеко и др., 1998). Некоторые исследователи считают, что нестабильной экспрессией отличаются трансгены с множественными вставками (тандемными повторами в прямой и, особенно, обратной ориентации), а также с однокопийными встройками чужеродной ДНК, расположенными в дистальных районах (Finnegan and McElroy, 1994). Ряд исследователей связывают потерю экспрессии у трансгенов с метилированием чужеродной ДНК (Prols and Meyer, 1992). В некоторых случаях повышенная нестабильность экспрессии чужеродных генов коррелирует с числом Т-ДНК инсерций в геноме трансгенного растения (Mannerlof and Tenning, 1997; Matzke, 1998; Wang, 2000). Кроме того, известно, что у растений существуют гомологи генов изопентенилтрансферазы - A ti pi (Kakimoto, 2001; Miyawaki et al., 2004; Sakano et al., 2004; Takei et al., 2001). В таком случае, при встраивании агробактериального гена ipt в геном трансгенного растения, возможны случаи инактивирования (замолкания) как гомологичного трансгена, так и собственного гена растения. Поэтому у некоторых трансгенных растений редиса не обнаружено опухолеобразования.

Итак, мы показали, что формирование опухолей на корнеплоде безопухолевой линии редиса 30 связано с трансформацией и внесением гена ipt. Встраивание гена ipt в геном растения приводит к смещению гормонального баланса в сторону цитокининов, а следствием этого является изменение дифференцировки клеток. Изучение реакции на экзогенные Фитогормоны in vitro. Важной характеристикой растений с измененным гормональным статусом является реакция на фитогормоны in vitro. В ходе наших экспериментов была проанализирована реакция опухолеобразующих и безопухолевых трансгенных растений Т2-Т4 по гену ipt на высокие концентрации цитокинина (кинетин 10 мг/л) и ауксина (2,4 Д 10 мг/л) in vitro. Исследования показали наличие связи между вставкой гена биосинтеза цитокинина (опухолеобразованием) и реакцией на гормоны in vitro, которая проявлялась в некротизации эксплантов. Такая реакция на высокие концентрации цитокинина и ауксина характерна для опухолевых линий с нарушенным балансом гормонов. Дополнительным фактом в поддержку нашей гипотезы относительно ключевой роли привнесенного гена биосинтеза цитокинина в реакции на гормон стало вовлечение в анализ контрольной группы растений, содержащих вставку только маркерного гена nptll. Реакция на кинетин и 2,4 Д эксплантов контрольной группы трансгенных растений со вставкой гена nptll достоверно не отличалась от реакции контрольной безопухолевой линии №30. У трансгенных растений, содержащих вставку гена ipt, общая тенденция в проявлении реакции, на кинетин и 2,4 Д in vitro сохраняется для всех проанализированных поколений (рисунок 2, рисунок 3 г, д).

чувствительность ккинетину (•Л эксплантов)

T2npdl T2Na19

■гЬ

гЬИ

¡rh

«.15 I

I

О.<* 19-2»-14 мг-

Ч>«П»И1С.

■ Xh 19-28 ОМ 19-27 от

■ №43-37 пр

■ М19-21 о№ □ М19-Э7ап-

■ №19-20сх»

во.»

М 45-59 oir+ генопи

Рисунок 2. Реакция на кинетин (а - в), 10 мг/л, и 2,4 Д (г), 10 мг/л, семядольных эксплантов трансгенных растений и линии 30.

Таблица 3. Экспрессия гена ipt и чувствительность к кинетину (10 мг/л) in vitro трансгенных растений Т4.

Растение Т4 Наличие экспрессии гена ipt Уровень экспрессии Процент некротизации семядольных эксплантов

№ 19-27-1* - - 57,7±9,90

№19-27-2 * + + 53,1±8,9б

№19-27-5 - - 56±10,13

№19-28-8 * + ++ 85,2±7,00

№19-28-14 * ++ 79,2±8,49

№19-28-27 — — 43,8±12,80

Линия 30 - - 32,5±7,52

Пояснения к таблице: * отмечены опухолеобразуюшие растения

Для ряда растений проведен анализ взаимосвязи между опухолевым фенотипом, экспрессией встроенного гена ipt и реакцией на экзогенный кинетигг. Показано, что для трансгенных растений, несущих вставку гена ipt, характерен высокий процент некротизации эксплантов в ответ на кинетин in vitro, как правило, сопоставимый с опухолеобразующими линиями. Особенно четко выявленная закономерность проявляется для трансгенных растений с высоким уровнем экспрессии встроенного гена.

Отсутствие четкой связи между наличием вставки (опухолевым фенотипом) и чувствительностью к гормону скорее всего является следствием изменений экспрессии привнесенного гена, что для трансгенных растений является нормальным явлением (таблица 3).

Полученные данные подтверждают наше предположение о том, что различия трансгенных растений по признакам «опухолеобразование» и реакции на гормон in vitro, могут быть связаны с различным уровнем экспрессии гена ipt в геноме трансформанта.

В ранних экспериментах, с помощью фитогормонов на корнеплодоподобных структурах (КС), образующихся у опухолевых линий, стало возможным индуцировать образование вторичных опухолей in vitro с помощью фитогормонов (Бузовкинаь и др., 1993). В наших экспериментах, при культивировании контрольных и трансгенных растений на среде с цитокинином БАП (2 мг/л) через неделю мы также наблюдали образование "КС". У опухолеобразующих трансгенных растений нами также отмечено образование вторичных опухолей, которые формировались на 30-40 день после эксплантации (рисунок 2 б). Ни для контрольной группы трансгенных растений по гену nptll, ни для проростков безопухолевой линии 30 не отмечено образование вторичных опухолей на КС. Более того, нами была доказана способность изолированных вторичных опухолей к гормоннезависимому росту. Таким образом, трансгенные растения с геном ipt, как и опухолевые линии редиса, способны формировать вторичные опухоли in vitro (рисунок 3 а, рисунок 3 б).

У проростков трансгенных растений, содержащих ген ipt, помимо образования опухолеподобных структур нами отмечено существование нескольких типов реакций на цитокинин БАП in vitro: интенсивное побегообразование и, некрозообразование. Формирование нескольких типов реакций на цитокинин у трансгенных растений по гену ipt также может быть связано с различной экспрессией встроенного гена.

Известно, что в процессе развития, в растении поддерживается определенный баланс ауксинов и цитокининов. Манипулируя концентрацией ауксина в сочетании с цитокинином, можно индуцировать многие процессы морфогенеза in vitro. Нами в ходе исследований была проанализирована реакция семядольных эксплантов трансгенных растений на ауксины: НУК (2 мг/л) и ИУК (1 мг/л). Показано, что НУК и ИУК в большей степени влияют на процесс корнеобразования (рисунок 3 в). Этот факт нам представляется крайне важным, т.к. и корни, и опухоли возникают в базальной (нижней) части растения, т.е. на

корнеплоде, и формирование пазушных корней также происходит при участии цитокининов. Показано, что интенсивность процесса корнеобразования достоверно различается у эксплантов трансгенных растений с геном ipt но сравнению с контрольной группой (линии № 30 и трансгенных растений по гену прШ). Наибольшей чувствительностью характеризовались трансгенные растения с геном в независимости от того, формировали они опухоль или нет. Различия в реакции на ауксины НУК и ИУК трансгенных и контрольных растений, как мы предполагаем, связаны с наличием вставки гена ipt (т.е. сверхпродукцией цитокининов у трансгенных растений).

Рисунок 3. (а) Образование опухолей у трансгенного растения по гену ipt in vivo; (б) образование вторичных опухолей на среде с цитокинином БАП (2 мг/л); (в) интенсивное корнеобразование на среде ИУК (1 мг/л); некротизация семядольных эксплантов на среде с (г) кинетином (10 мг/л) и (д) 2,4 Д (10 мг/л).

Определение эндогенного уровня цитокининов и индолилуксусной кислоты у трансгенных растений редиса. Известно, что для нормального протекания онтогенеза в растениях должно поддерживаться определенное соотношение (баланс) фитогормонов. Изменения гормонального баланса в растении могут привести к нарушению дифференцировки и, как следствие, к различным аномалиям роста и развития. На следующем этапе исследований мы проверяли предположение о том, что наличие вставки гена ipt является причиной изменений гормонального баланса в сторону цитокининов и, следовательно, вероятной причиной опухолеобразования. Особенно важными нам представляются ранее полученные данные о различиях в балансе гормонов (цитокининов и ИУК) в листьях, корнях и корнеплодах опухолевых и безопухолевых линий редиса (Matveeva et al., 2004). Также убедительным фактом, свидетельствующим в пользу данного предположения, является формирование опухолей на корнеплодах

трансгенных растений с геном ipt от безопухолевой линии и данные по чувствительности к экзогенным фитогормонам in vitro.

Исследования количественного содержания гормонов показали, что в отношении ИУК наблюдается четкая закономерность: содержание ИУК в тканях листовых пластинок минимально у растений безопухолевой линии № 30 (менее 0,1 мкг/г сырого веса). Количество ИУК у растений Т4 из семьи опухолевого трансформанта Тз 32-50 по гену ipt значительно больше, нежели в контрольной безопухолевой линии (1,73±0,39 мкг/г сырого веса) (рисунок 4). Для сравнения можно привести данные параллельных измерений количества ИУК в тканях листа опухолевой линии №19 - 8,0±0,8 мкг/г сырого веса. Полученные нами результаты, по-видимому, отражают гормональный дисбаланс, возникший у растений с опухолевым фенотипом (трансгенных по гену ipt и опухолевой линии). Известно, что в растении существует несколько путей, регулирующих уровень ауксина (несколько путей биосинтеза ИУК и конъюгация гормона). В процесс поддержания ауксинового гомеостаза вовлечено множество генов (Лутова и др., 2000). Кроме того, содержание ауксинов и цитокининов взаиморегулируется, поэтому наблюдаемое увеличение количества ИУК у опухолеобразующих растений может быть связано с увеличением эндогенного уровня цитокининов.

Рисунок 4. Содержание ИУК в листьях растений линии 30 и трансгенных растений с геном ipt.

Рисунок 5. Содержание зеатина (%) и зеатинрибозида ^11) в листьях анализируемых растений. Буквами обозначены образцы: а.— безопухолевая линщ 30; трансгенные растения б - Т427-1-1, в - Т427-1-2, г - Т427-1-4, д - Т428-14-2, ж — Т4 28-14-4 опухолеобразующие; е. - Т4 28-14-3 — безопухолевое

Нами было проанализировано содержание основных групп цитокининов: зеатина, и зеатинрибозида. Анализ содержания цитокининов показал увеличение уровня зеатина в листьях опухолеобразующих трансгенных растений с геном ¡р( (рисунок

5). Так, содержание зеатина (Z) в листьях линии №30 составило 2,3±1,2 нг/г сырого веса, в то время как в листьях опухолеобразующих трансформантов семей Т4 27-1-4; Т4 28-14-2 и Т4 28-14-4 соответственно 5,3±0,8, 12,7±0,8 и 4,1±0,4 нг/г сырого веса. У безопухолевого трансгенного растения Т4 28-14-3 содержание зеатина составило 2,1±0,5 нг/г сырого веса.

Таким образом, по крайней мере, для зеатина и МУК показаны различия в количественном содержании гормонов у контрольной линии №30 и некоторых растений, трансгенных по гену ipt. Подобные закономерности ранее были отмечены только для опухолеобразующих инбредных линий редиса со смещенным гормональным балансом. Полученные нами данные позволяют предположить, что, скорее всего именно повышенный уровень зеатина, как основного цитокинина, является причиной гормонального сдвига в сторону цитокининов у опухолеобразующих растений

Заключение. Цитокинины играют важную роль на многих этапах развития растений и индуцируют различные направления морфогенеза. Инбридинг высокогетерозиготных растений, к которым можно отнести перекрестноопыляемые виды (в том числе редис), приводит к выявлению форм с изменениями и нарушениями в гормональной системе, в частности - по цитокинину. Ярким примером таких форм с нарушениями в морфогенетическом развитии являются опухолеобразующие инбредные линии. В данной работе нами смоделирован процесс опухолеобразования ш vivo с помощью трансформации безопухолевой линии конструкцией, содержащей ген биосинтеза цитокинина ipt. Прямое привнесение гена биосинтеза цитокинина позволило подтвердить гипотезу о том, что опухолевый рост является следствием нарушения гормонального баланса, в частности, повышенного уровня цитокининов. Механизмом такого явления, по-видимому, являются мутации растительных генов, вовлеченных в гормональный метаболизм. Мы предполагаем, что это мутации по генам, контролирующим биосинтез цитокинина. Подтверждением данному факту могут служить результаты, полученные в нашей лаборатории: результатом трансформации опухолеобразующей линии №19 генетической конструкцией, содержащей ген ipt, явилась супрессия опухолевого фенотипа (Власенко, неопубликованные данные). Полученные результаты предполагают, что следующим этапом в изучении механизмов опухолеобразования, должно стать клонирование генов изопентенилтрансферазы у опухолеобразующих и безопухолевых линий и выявление отличий между анализируемыми формами. Разработанная нами модельная система на базе безопухолевой линии из уникальной генетической коллекции редиса позволила доказать роль цитокининов в процессе опухолеобразования у редиса.

Таким образом, в ходе работы мы получили доказательства того, что, изменение гормонального статуса растения, влечет за собой изменение его морфогенеза. Иными словами, манипулируя уровнем гормонов, в ходе трансформации мы можем моделировать и подробно изучать процесс опухолеобразования у растений.

ВЫВОДЫ

1. Модифицирован и апробирован в лабораторных исследованиях метод агробактериальной трансформации завязи редиса Raphanus sativas L. in vivo и получено 63 трансгенных по генам ipt и nptll растений редиса.

2. Создана модель, позволяющая с помощью трансформации редиса in vivo геном ipt, получать растения с измененным фенотипом: опухолеобразованием и изменением антоциановой окраски корнеплода и лепестков венчика.

3. Показана связь между экспрессией гена ipt и опухолеобразованием у трансгенных растений. Изменение уровня экспрессии гена ipt приводит к появлению или отсутствию опухолевого фенотипа.

4. Показано, что опухолеобразующие трансгенные растения редиса, содержащие ген ipt, характеризуются повышенной чувствительностью к гормонам: кинетину (10 мг/л); 2,4 Д (10 мг/л); НУК (2 мг/л) и ИУК (1 мг/л), что проявляется в интенсивной некротизации и корнеобразовании у эксплантов in vitro.

5. По аналогии с опухолеобразующими растениями редиса у трансгенных растений с геном ipt, формирующими опухоль in vivo, с помощью цитокинина (БАП 2 мг/л) смоделировано формирование вторичных опухолей in vitro, которые характеризуются способностью к гормониезависимому росту.

6. Показано, что у опухолеобразующих трансгенных растений, содержащих ген ipt, увеличен уровень цитокининов (на примере зеатина) и ИУК по сравнению с растениями контрольной безопухолевой линии.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Автор выражает искреннюю благодарность Ильиной Елене Леонидовне и

сотрудникам лаборатории физиологии растений Института биологии Уфимского

Научного Центра РАН за помощь в проведении экспериментов по определению

содержания цитокининов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Lutova L. A., Smets R., Matveeva Т. V., Dodueva I.E., Frolova N.V., Buzovkina I.S., Van Onckelen Hormonal control of tumor formation in radish. II Journal of Plant Growth Regulation. - 2004. - V. 23. - № 1. - p. 37-43.

2. Фролова H.B., Матвеева T.B., Лутова Л.А. Использование метода агробактериальной трансформации in vivo для получения фенокопий опухолеобразования у безопухолевой линии редиса (Raphanus sativus L.). II Биотехнология. - 2004. - Т.4. - с. 3 -7.

3. Додуева И.Е., Фролова Н.В., Власенко М.А., Монахова В.А., Лутова Л.А. Трансформация инбредных линий редиса (Raphanus sativus L.) агробактериальными генами Т-ДНК: изменение опухолевого фенотипа и реакции на фитогормоны in vitro. II Вестник биотехнологии и

1 физико-химической биологии. - 2005. - №2: - с.20-25.

4. Frolova N.V., Matveeva T.V., Lutova L.A. Tumor formation in radish and role of cytokinins in this process. // In: 7 th International Congress of Plant Molecular Biology (ISPMB). Barcelona, Spain. - 2003. - June 23-28-p.201. (Abstract)

5. Lutova L.A., Matveeva T.V., Buzovkina I.S., Smets R., Frolova N.V., Dodueva I.E., Kulaeva O.A., Van Onckelen H. Role of cytokinins in some morphogenetic process in radish (Raphanus sativus L.). II In: 7 th International Congress of Plant Molecular Biology (ISPMB). Barcelona, Spain. - 2003. - June 23-28. - p.201. (Abstract)

6. Фролова H.B., Матвеева T.B. и Лутова Л.А. Новый метод агротрансформации редиса Raphanus sativus L. для получения фенокопий опухолеобразования. // Материалы конференции «Актуальные проблемы генетики». Москва, Россия. 20-21 февраля, 2003.-с. 191. (тезисы)

7. Фролова Н.В., Матвеева Т.В., Бузовкина И.С., Додуева И.Е., Лутова Л.А. Подходы для изучения гормональной регуляции опухолеобразования у редиса Raphanus sativus L. Н Материалы VIII Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология». Саратов, Россия, 9-13 сентября, 2003. (тезисы)

8. Лутова Л.А., Матвеева Т.В., Ходжайова Л.Т., Фролова Н.В., Додуева И.Е. Опухолеобразование как модель для изучения роли гормонов в дифференцировке у растений. // Материалы 3-го съезда генетиков и селекционеров России «Генетика в XXI веке: состояние и перспективы развития». Москва, Россия, 6-12 Июня, 2004. - с.385. (тезисы)

9. Додуева И.Е., Фролова Н.В., Власенко М.А., Монахова В.А., Лутова Л.А. Трансформация инбредных линий редиса генами Т-ДНК агробактерии как модель горизонтального переноса генов от агробактерии растениям». // Материалы третьего симпозиума Российского общества биотехнологов. Москва, Россия, 25-27 октября, 2005.-с. 107. (тезисы)

10. Ганзен А.А., Власенко М.А., Монахова В.А., Фролова Н.В. Изменение реакции на цитокинины и ауксины in vitro у трансгенных растений редиса, несущих отдельные гены Т-ДНК агробактерий. // Материалы 10-й Путцинской школы-конференции молодых ученых. Пущино, Россия, 17-21 апреля, 2006. -с. 363. (тезисы)

11. Osipova М.А., Frolova N.V., Dodueva I.E., Ilina E.L., Vlasenko M.A., Monachova V.A., Ganzen A.V., Dolgikh E.A., Lutova L.A. Genetic tumors of radish inbred lines: studying genes involved in the control of tumor formation in higher plants. // In: XVth Congress of Federation of European Societies of Plant Biology FESPB. Lyon, France, 17-21 July, 2006. - p.69. (Abstract)

12. Frolova N. V., Vlasenko M.A., MonakhovaV.A. Transformation of radish inbred line with genetic determinated tumor formation by

Agrobacterium T-DNA genes. // Магериалы I Международной Школы для Молодых Ученых «Эмбриология и биотехнология». - Санкт-Петербург, Россия, 4-9 декабря, 2005 г. - с.37. (тезисы) 13. Власенко М.А. Фролова Н.В. Монахова В.А. Ганзен А.А, Додуева И.Е. Использование трансгенных растений по генам ipt, rol В и rol С. качестве модели для изучения процесса опухолеобразования у редиса. // "Материалы Международной Конференции "Генетика в России и в мире", посвященной 40-летию Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН. - Москва, Россия, 28 июня - 2 июля, 2006. - с. 34. (тезисы)

Подписано в печать 23.10.2006. Формат бумаги 60 х 84 1/16. Бумага офсетная. Печать ризографическая. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 3871.

Отпечатано в отделе оперативной полиграфии НИИХ СПбГУ. 198504, Санкт-Петербург, Старый Петергоф, Университетский пр.26

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Фролова, Надежда Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ ЦИТОКИНИНОВ В МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИХ ПРОЦЕССАХ У РАСТЕНИЙ.

2.1. ЦИТОКИНИНЫ: СТРУКТУРА, ФУНКЦИИ И ЛОКАЛИЗАЦИЯ В РАСТЕНИИ.

2.2. ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ МЕТАБОЛИЗМА ЦИТОКИНИНОВ: БИОСИНТЕЗ И ДЕГРАДАЦИЯ.

2.2.1. АДЕНИЛАТНЫЕ И Т-РНК ИЗОПЕНТЕНИЛТРАНСФЕРАЗЫ - ОСНОВНЫЕ ТИПЫ ФЕРМЕНТОВ БИОСИНТЕЗА ЦИТОКИНИНОВ У РАСТЕНИЙ.

2.2.2. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ИЗОПЕНТЕНИЛТРАНСФЕРАЗ IN VITRO.

2.2.3. ЦИТОКИНИНОКСИДАЗЫ - ФЕРМЕНТЫ ДЕГРАДАЦИИ ЦИТОКИНИНОВ, ИХ ВКЛАД В РЕГУЛЯЦИЮ МЕТАБОЛИЗМА ЦИТОКИНИНОВ В РАСТЕНИИ.

2.3. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ РОЛИ ЦИТОКИНИНОВ В ЖИЗНИ РАСТЕНИЯ.

2.3.1. ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОДХОД: ВЫЯВЛЕНИЕ «ЦИТОКИНИНОВЫХ» МУТАНТОВ У ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ.

2.3.2. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДОВ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ РОЛИ ЦИТОКИНИНОВ В МОРФОГЕНЕЗЕ РАСТЕНИЙ.

2.4. МНОГООБРАЗИЕ ТИПОВ НЕОПЛАСТИЧЕСКОГО РОСТА У РАСТЕНИЙ.

2.4.1. КОРОНЧАТЫЕ ГАЛЛЫ - ОПУХОЛИ РАСТЕНИЙ, ИНДУЦИРУЕМЫЕ Agrobacterium tumefaciens.

2.4.2. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОПУХОЛИ РАСТЕНИЙ.

2.4.3. МЕЖВИДОВЫЕ ГИБРИДЫ КАК МОДЕЛЬ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ОПУХОЛЕОБРАЗОВАНИЯ. НАСЛЕДОВАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ОПУХОЛЕЙ У

МЕЖВИДОВЫХ ГИБРИДОВ РОДА Nicotiana.

2. 5. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КОЛЛЕКЦИЯ ИНБРЕДНЫХ ЛИНИЙ

РЕДИСА - МОДЕЛЬ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ РОЛИ ГОРМОНОВ В ОПУХОЛЕБРАЗОВАНИИ.

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. МАТЕРИАЛЫ.

3.1.1. РАСТИТЕЛЬНЫЙ МАТЕРИАЛ.

3.1.2. БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ШТАММЫ.

3.2. МЕТОДЫ.

3.2.1. МЕТОД АГРОБАКТЕРИАЛЬНОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ IN VIVO.

3.2.2. ИЗУЧЕНИЕ РЕАКЦИИ НА ЭКЗОГЕННЫЕ ФИТОГОРМОНЫ

IN VITRO.

3.2.3. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.2.4. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЦИТОКИНИНОВ И ИУК В РАСТИТЕЛЬНЫХ ЭКСТРАКТАХ.

3.2.5. СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА ДАННЫХ.

ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ.

4.1. ПОЛУЧЕНИЕ КОЛЛЕКЦИИ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ СО ВСТАВКОЙ ГЕНА БИОСИНТЕЗА ЦИТОКИНИНА ИЗОПЕНТЕНИЛТРАНСФЕРАЗЫ (IPT) И НЕОМИЦИНФОСФОТРАНСФЕРАЗЫ (NPTII) МЕТОДОМ АГРОБАКТЕРИАЛЬНОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ БЕЗОПУХОЛЕВОЙ ЛИНИИ №30 IN VIVO.

4.1.1. Получение растений редиса, трансгенных по генам биосинтеза цитокинина изопентенилтрансферазы ipt и неомицинфосфотрансферазы nptll.

4.1.2. Получение растений редиса, трансгенных по гену неомицинфосфотрансферазы nptll.

4.2. ИЗУЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА IPT У ОПУХОЛЕОБРАЗУЮЩИХ И БЕЗОПУХОЛЕВЫХ ТРАНСФОРМАНТОВ.

4.3. ИЗУЧЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К ФИТОГОРМОНАМ IN VITRO

ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ, СОДЕРЖАЩИХ ВСТАВКУ ГЕНА IPT.

4. 3. 1. Исследование чувствительности трансгенных растений редиса линии №30 к цитокинину in vitro.

4.3.2. Изучение реакии на цитокинин БАП (6-бензиламинопурин) трансгенных по гену ipt растений редиса.

4.3.3. Оценка чувствительности эксплантов к ауксинам in vitro.

4.3.3.1. Изучение реакции на ауксин 2,4 Д (10 мг/л).

4.3.3.2. Анализ реакции на ауксины: НУ К в концентрации 2 мг/л и ИУК в концентрации

1 мг/л.

4.4.КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЦИТОКИНИНОВ И ИУК В ТКАНЯХ ОПУХОЛЕВЫХ И БЕЗОПУХОЛЕВЫХ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ПО ГЕНУ IPT.

4.4.1. Количественное определение эндогенного уровня ИУК у некоторых трансгенных по гену ipt растений.

4.4.2. Количественное определение эндогенного уровня основных групп цитокининов у некоторых семей трансгенных по гену ipt растений.

ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Создание модели для изучения опухолеобразования у редиса Raphanus sativus L. с использованием трансгенных растений по гену IPT"

Гормональная система растений является важнейшим регуляторным механизмом, осуществляющим координацию всех морфогенетических процессов. Во-первых, это способность воспринимать гормональный, либо другой сигнал и генерировать быстрый ответ, изменяя концентрацию отдельного гормона или его уровень но отношению к другим гормонам в отдельных клетках. Во-вторых, это способность поддерживать гормональный гомеостаз на определенных стадиях развития растения. Контроль дифференцировки у высщих растений представляет собой сложный многоэтапный процесс, а характер и направление дифференцировки клеток в растении определяется балансом основных гормонов ауксинов и цитокининов. Выход из-под системного контроля, нарущения на разных этапах онтогенетического развития, могут вызвать переход к недифференцированному росту. Одной из таких моделей, позволяющей детально исследовать процессы роста и развития, являются растения с нарушениями морфогенетического развития, в частности, онухолеобразующие растения своеобразные «гормональные» мутанты. Феномен опухолеобразования бьш описан у многих видов и межвидовых гибридов растений (Байдербек, 1981). Традиционно различают индуцированные опухоли и опухоли генетической природы. Индуцированные опухоли вызываются факторами внешней среды, в том числе фитопатогенными организмами (вирусами, бактериями, грибами, нематодами и другими возбудителями). Из этой группы наиболее подробно изучены корончатые галлы, индуцируемые Agrobacterium (Weiler and Schroeder, 1987; Zambryski et al., 1983) Другая разновидность опухолей генетические опухоли возникают спонтанно у растений, имеющих определенный генотип. Все генетические опухоли растений, как и опухоли, индуцированные Agrobacterium, характеризуются сходным гистологаческим строением, неорганизованным ростом, способностью к гормоннезависимому росту in vitro (Байдербек, 1981). Для большинства генетических и индуцированных опухолей характерно также изменение уровня фитогормонов, в частности изменение баланса ауксинов и цитокининов. Наиболее хорошо изученным классическим примером генетических опухолей у растений является опухолеобразование у межвидовых гибридов табака (Ahuja, 1968; Smith, 1988; Bayer, 1982). Однако в связи с полиплоидностью и стерильностью гибридов возникают сложности в использовании их в качестве модельного обьекта. В данной диссертации работа проведена на уникальной генетической коллекции инбредных линий редиса Raphanus sativus L, которая бьша создана в 60-е гг. XX века и поддерживается до настоящего времени (Нарбут, 1966). Генетическая коллекция инбредньк линий редиса представляет собой ценный материал для изучения фундаментальных проблем дифференцировки, т.к. является источником гормональных мутантов и аномалий морфогенетического развития, в том числе опухолеобразуюпщх форм. В отличие от гибридов рода Nicotiana, R. sativus удобный модельный обьект, это диплоидный вид, который может быть легко вовлечен в генетический анализ. В ранних экспериментах по изучению природы опухолеобразования бьшо установлено, что ткани опухолеобразующих линий характеризуются гормоннезависимым ростом и чувствительностью к основным фитогормонам in vitro (Бузовкина, 1993; Бузовкина* и др., 1993). Генетический анализ при скрещивании форм с альтернативным проявлением признака «опухолеобразование» свидетельствует о том, что этот признак рецессивен и контролируется, по крайней мере, одним геном tur (Нарбут и др., 1985). При анализе гибридов между опухолеобразующими линиями отмечена неполная пенетрантность способности к опухолеобразованию, а также роль генетического фона в контроле проявления этого признака (Нарбут и др., 1985; Матвеева и др., 2000). Показано, что опухолеобразование у инбредных линий редиса сопряжено с изменением гормонального баланса, однако механизм возникновения таких нарушений остается невыясненным до сих пор. Ряд исследователей связьшает изменение гормонального баланса с мутациями растительньк генов, контролирующих гормональный метаболизм. Другие с наличием в геноме растений последовательностей, гомологичных агробактериальным онкогенам (Intrieri and Buiatti, 2001). Несмотря на то, что уже многие годы коллекция используется для проведения биохимических и молекулярногенетических исследований, механизмы образования опухолей до сих пор окончательно не ясны. Целью данной работы является создание модели для изучения опухолеобразования у редиса с использованием растений, трансгенных по гену биосинтеза цитокинина ipt (изопентенилтрансферазы), и сравнение полученных трансгенных растений с опухолеобразующими линиями по ряду физиологических признаков. Мы считаем, что использование данной модели будет также способствовать изучению роли цитокинина в процесс опухолевого роста у редиса. В задачи работы входило: 1. Разработка метода агробактериальиой трансформации редиса in vivo. 2. Получение коллекции трансгенньк растений редиса, содержащих вставку гена биосинтеза цитокинина изопентенилтрансферазы (ipt). 3. Анализ морфологических и физиологических (чувствительность к гормонам in vitro) признаков трансгенных растений, содержащих вставку гена ipt. 4. Изучение экспрессии гена ipt у трансгенных растений редиса. 5. Определение эндогенного уровня цитокининов и индолилуксусной кислоты.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Фролова, Надежда Владимировна

выводы.

1. Модифицирован и апробирован в лабораторных исследованиях метод агробактериальной трансформации завязи редиса Raphanus sativus L in vivo и получено 63 трансгенных по генам nptll и ipt растений редиса.

2. Создана модель, позволяющая с помощью трансформации редиса in vivo геном ipt получать растения с измененным фенотипом: опухолеобразованием и изменением антоциановой окраски корнеплода и лепестков венчика.

3. Показана связь между экспрессией гена ipt и опухолеобразованием у трансгенных растений. Изменение уровня экспрессии гена ipt приводит к появлению или отсутствию опухолевого фенотипа.

4. Показано, что опухолеобразующие трансгенные растения редиса, содержащие ген ipt, характеризуются повышенной чувствительностью к гормонам: кинетину (10 мг/л); 2,4 Д (10 мг/л); НУК (2 мг/л) и ИУК (1 мг/л), что проявляется в некротизации и измененной реакции корнеобразования у эксплантов in vitro.

5. По аналогии с опухолеобразующими растениями редиса у трансгенных растений с геном ipt, формирующими опухоль in vivo, с помощью цитокинина (БАП 2 мг/л) смоделировано формирование вторичных опухолей in vitro, которые характеризуются способностью к гормоннезависимому росту.

6. Показано, что у опухолеобразующих трансгенных растений, содержащих ген ipt, увеличен уровень цитокининов (на примере зеатина) и ИУК по сравнению с растениями контрольной безопухолевой линии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итак, цитокинины играют важную роль на многих этапах развития растений и индуцируют различные направления морфогенеза. Инбридинг высокогетерозиготных растений, к которым можно отнести перекрестноопыляемые виды (в том числе редис), приводит к выявлению форм с изменениями и нарушениями в гормональной системе, в частности - по цитокинину. Ярким примером таких форм с нарушениями в морфогенетическом развитая являются опухолеобразующие инбредные линии. Морфофизиологические исследования опухолевых линий показали, что у них нарушен гормональный баланс. В данной работе нами смоделирован процесс опухолеобразования in vivo с помощью трансформации безопухолевой линии конструкцией, содержащей ген биосинтеза цитокинина ipt. Прямое привнесение гена биосинтеза цитокинина позволило подтвердить гипотезу о том, что опухолевый рост является нарушением гормонального баланса, в частности, повышенного уровня цитокининов. Механизмом такого явления, по-видимому, являются мутации растительных генов, вовлеченных в гормональный метаболизм. В данном случае, скорее всего это мутации гена фермента биосинтеза цитокинина изопентенилтрансферазы (ipt). Подтверждением данному факту можно считать проводимые в нашей лаборатории эксперименты по трансформации опухолеобразующей линии генетической конструкцией, содержащей ген ipt. Так, при трансформации растений опухолевой инбредной линии геном ipt нами отмечена супрессия опухолевого фенотипа (Власенко, личное сообщение). Известно, что у ряда растений существуют гомологи генов изопентенилтрансферазы ipt (Kakimoto, 2001; Kakimoto, 2003). Не исключено, что подобные гомологи содержатся и в геноме редиса. Результаты данной работы позволяют утверждать, что следующим этапом в изучении механизмов опухолеобразования, должно стать клонирование генов изопентенилтрансферазы у опухолеобразующих и безопухолевых линий и выявление отличий между анализируемыми формами.

Итак, для доказательства роли цитокининов в процессе опухолеобразования у редиса нами была разработана модельная система на базе безопухолевой линии из уникальной генетической коллекции редиса. Разработанная методика трансформации редиса in vivo была успешно апробирована в нашей лаборатории (Додуева и др., 2005). Так, с помощью данного метода были получены фенокопии опухолевого роста у безопухолевых линий редиса при трансформации другими агробактериальными генами, в частности rol Виго! С (Ильина и др., 2006).

Таким образом, в ходе работы мы получили убедительные доказательства того, что, изменение гормонального статуса растения, влечет за собой изменение его морфогенеза. Иными словами, манипулируя уровнем гормонов, в ходе трансформации мы можем моделировать и подробно изучать процесс опухолеобразования у растений.

Созданная нами модель, ее тщательный физиологический и генетический анализ, способны помочь в изучении роли и механизма действия цитокинина в опухолеобразовании у редиса.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фролова, Надежда Владимировна, Санкт-Петербург

1. Байдербек Р. Опухоли растений. // М.: Колос. 1981. - 303 с.

2. Бузовкина И.С., Лутова Л.А. Генетические, биохимические и физиологические аспекты опухолеобразования у инбредных линий редиса. // Вестник Ленинградского Университета. -1991. Т. 10. - с. 102-107.

3. Бузовкина И.С. Выделение и изучение гормональных мутантов редиса Raphanus sativus L. // Дисс. на соискание учёной степени кандидата биол. наук. Санкт-Петербург, 1993.

4. Бузовкина3 И.С., Кнешке И., Лутова Л.А. Генетический анализ признака "чувствительность к цитокинину in vitro". И Генетика. 1993. - Т. 29. - № 6. -с. 995-1001.

5. Бузовкина И.С., Кнешке И., Лутова Л.А. Моделирование опухолеобразования in vitro у линий и гибридов редиса. // Генетика. 1993. -Т. 29.-с. 1002-1008.

6. Дейнеко Е.В Изучение экспрессии гетерологичных и собственных генов у трансгенных растений (на примере Nicotiana tabacum L.). II Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук. Новосибирск. -2004.

7. Дейнеко Е.В., Загорская А.А., Филиппенко М.Л. Изменение уровня экспрессии и наследование маркерного гена nptll в потомстве трансгенных растений табака // Докл. РАН. -1995. Т.344. - №3. - с.407-411

8. Дейнеко Е.В., Новоселя Е.А., Загорская Ю.В., Филипенко В.К., Шумный В.К. Нестабильность экспрессии чужеродных генов у трансгенных растений табака. // Физиология растений. 2000. - Т. 47. - № 3. - с. 446-452

9. Дрейпер Дж., Скотг Р., Армитидж Ф. Генная инженерия растений. // М.: Мир, 1991.-408 с.

10. Кислин Е.Н. Определение природных фитогормонов с помощью хроматографических методов: учеб.-метод. пособие // СПб: Изд-во Санкт-Петербургского Университета. 2004. - 32 с.

11. Кулаева О.Н. Гормональная регуляция физиологических процессов у растений на уровне синтеза РНК и белка. // М.: Наука. 1982. - 84 с.

12. Кулаева О.Н. Цитокинины, их структура и функция. // М.: Наука. 1973. -246 с.

13. Лакин Г.Ф. Биометрия. // М.:Высшая школа. 1990. - 352 с.

14. Лутова Л.А., Верзина И.И. Наследование способности к каллусо- и корнеобразованию у изолированных семядолей редиса в условиях асептической культуры. // Генетика. 1993. - Т. 29. - с. 995-1001.

15. Лутова Л.А., Проворов Н.А., Тиходеев О.Н., Тихонович И.А., Ходжайова Л.Т., Шишкова С.О. Генетика развития растений. // Санкт-Петербург: Наука. -2000.-538 с.

16. Матвеева Т.В., Додуева И.Е., Бузовкина И.С., Вуд Д., Лутова Л.А., Нестер Е. Роль фитогормонов в опухолеобразовании у редиса. // Генетика. 2000. - Т. 36.-№2.-с. 37-42.

17. Нарбут С. И. Генетическая коллекция инбредных линий редиса. // Генетика. 1966.-№5.-с. 89-100.

18. Нарбут С.И. Генетическая опухоль у редиса, полученная при инбридинге. // Вестник ЛГУ. 1967. -№ 15.-е. 144-149.

19. Нарбут С.И., Войлоков А.В., Кириллова Г.А. Генетическая характеристика линий редиса Raphanus sativus L. var. radicola Pers. II Вестник ЛГУ. 1985. -№24.-с. 75-78.

20. Полевой В.В. Фитогормоны. // Л.: Изд-во Ленингр. Ун-та. 1982. 248 с.

21. Сидоров В.А., Пивень Н.М., Глеба Ю.Ю., Сытник К.М. Соматическая гибридизация пасленовых. // Киев, Наукова думка. -1985. -132 с.

22. Тютерев С.Л., Евстигнеева Т.А. Биохимические методы исследования индуцированной болезнеустойчивости растений. // СПб: изд-во ВИЗР РАН. -2001.-68 с.

23. Фадеева Т.С., Нарбут С.И., Лутова Л.А. Изменчивость по признаку корне- и каллусообразование у изолированных семядолей редиса иморфобиологические особенности растений. // Исследования по генетике. -1975.-№6.-с. 125-135.

24. Фролова Н.В., Матвеева Т.В., Лутова Л.А. Использование метода агробактериальной трансформации in vivo для получения фенокопий опухолеобразования у безопухолевой линии редиса (Raphanus sativus L) II Биотехнология. 2004. - Т.4. - с. 3-7.

25. Шишкова С.О. Изучение спонтанного и индуцированного опухолеобразования у табака Nicotiana tabacum L. и редиса Raphanus sativus L II Дисс. на сосикание ученой степени кандидата биол. наук. Санкт-Петербург, 1991.

26. Ahuja M.R. Genetic control of phuytohormones in tumor and non-tumor genotypes in Nicotiana. И Indian journal of experimental biology. -1971. V. 9. -p. 60-68.

27. Ahuja M.R. A hypothesis and evidence concerning the genetic components controlling tumor formation in Nicotiana. // MGG. 1968. - V. 103. - pp. 176184.

28. Akiyoshi D.E., Klee H., Amasino R.M., Nester E.W., Gordon M.P. T-DNA of Agrobacterium tumefaciens encodes an enzyme of cytokinin biosynthesis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. -V. 81. - pp. 5994-5998.

29. Astot C., Dolezal K., Nordstrom A., Wang Q., Kunkel Т., Moritz Т., Chua N.-H., Sandberg G. An alternative cytokinin biosynthesis pathway. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - V. 97. - № 26. - pp. 14778-14783.

30. Auer C.A. Cytokinin conjugation: recent advances and patterns in plant evolution. // Jornal of Plant Growth Regul. 1997. - V. 23. - pp. 17-32

31. Auer C.A. Discoveries and dilemmas concerning cytokinin metabolism // Journal of Plant Growth Regulation. 2002. - V. 21. - №1. - pp. 24-31

32. Auer C.A., Cohen J.D., Laloue M., Cooke T.J. Comparison of benzyl adenine metabolism in two Petunia hybrida lines differing in shoot organogenesis. // Plant Physiol. 1992. - V. 98. - № 3. - pp. 1035-1041.

33. Azmi A., Dewitte W,, Van Onckelen H., Chriqui D. In situ localization of endogenous cytokinins during shooty tumor development on Eucalyptus globulus Labill. II Planta 2001. - V. 213. - pp. 29-36

34. Barry G.F., Rogers S.G., Fraley R.T., Brand L. Identification of a cloned cytokinin biosynthetic gene. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. - V. 81. - pp. 4776-4780.

35. Bayer M. Genetic tumors: Physiological aspects of tumor formation in interspecies hybrids. In: Bayer M, Molecular biology of plant tumors. // Eds Kahl G., Schell J. New York: Academic. -1982. pp. 33-67.

36. Beinsberger S.E.I., Vajcke R.L.M., Clijsters H.M.M., De Greef J.A. and Van Onckelen H.A. Effect of enchancedcytokinin levels in ipt transgenic tobacco. // In:

37. Kaminek М., Мок D.W.S. and Zazimalova E. (Eds). Phisiology and biochemistry of cytokinins in plants. -1992. pp. 77-82.

38. Binns A.N., Black R.C., Labiola J. Initiation of auxin autonomy in Nicotiana glutinosa cells by the cytokinin byosynthesis gene from Agrobacterium tumefaciens. II Planta. - 1987. - V. 171. - pp. 539-548.

39. Blackwell J.R. and Horgan R. A novel strategy for production of a highly expressed recombinant protein in an active form. // FEBS Lett. -1991. V. 295. -pp. 10-12.

40. Boeijan W., Den Boer В., Van Montagu M. Molecular genetic approaches to plant development. //J. Devel. Biol. 1992. - V.36. - p.59-66.

41. Brandstatter I., Kieber J.J. Two genes with similarity to bacterial response regulators are rapidly and specifically induced by cytokinin in Arabidopsis II Planta. 1998. - V.14. - pp. 337-344.

42. Brinegar A.S., Fox J.E. The developmental expression and molecular cloning of the gene for a wheat embryo cytokinin binding protein. // Plant Genetics. 1985. -pp. 147-155.

43. Brinegar A.S., Stevens A., Fox J.E. Biosynthesis and degradation of a wheat embryo cytokinin binding protein during embryogenesis and germination // Plant Physiol. 1985. - V.79. - p.706-710.

44. Brzbohaty В., Moore I., Palme K. Cytokinin metabolism implications for regulation of plant growth and development. // Plant Mol. Biol. 1994. - V. 26. -p. 1483-1497.

45. Bukhov N.G., Bondar V.V., Drozdova I.S., Kara A.N., Kotov A.A., Maevskaya S.N., Vasil'ev A.A., Voevudskaya S.Yu., Voronin P.Yu., Mokronosov A.T.

46. Development of Storage Roots in Radish (Raphanus sativus) Plants as Affected by Light Quality. // J. Plant Physiol. 1996. - V. 149. pp. 405^12.

47. Burch LR, Horgan R. The purification of cytokinin oxidase from Zea mays kernels. // Phytochemistiy. -1989. V. 28. - pp. 1313-1319.

48. Chang H., Jones M.L., Banowetz G.M. and Clark D.G. Overproduction of cytokinins in Petunia flowers transformed with P SAG Y1-1PT delays corolla senescence and decreases sensitivity to ethylene. // Plant Physiology. 2003. - V. 132.- pp. 2174-2183.

49. Chaudhary A.M., Letham S., Craig S., Dennis E. S. AMP I a mutant with high cytokinin levels and altered embryonic pattern, faster vegetative growth, constitutive photomorphogenesis and precocious flowering. // Plant. - 1993. -V.4 -pp.907-916.

50. Chory J., Reinecke D., Sim S., Washburn Т., Brenner M. A role for cytokinins in de-etiolation in Arabidopsis II Plant. Physiol.- 1994. V. 104. - pp.339-347.

51. Curtis I.S. and Num H.G. Transgenic radish (.Raphanus sativus L Var. Longipinnatus Bailey) by floral-deep method plant development and surfactant are important in optimizing transformation efficiency. // Transgenic Res. - 2001. -V. 10.-pp. 363-371.

52. Curtis I.S. The noble radish: past, present and future. // Trends in plant science. -2003. V. 8 - №7. - pp. 305-306.

53. Deikman J. and Hammer P.E. Induction of anthocyanin accumulation by cytokinins in Arabidopsis thaliana. II Plant Physiol. 1995. - V. 108. - № 1. - pp. 47-57.

54. Deikman J., Ulrich M. A novel cytokinin resistant mutant of Arabidopsis with abbreviated shoot development. // Planta. - 1995. - V.195. - №3. - pp. 440-449.

55. Dietrich M.A., Shumaker K.S. Hormone induced signalling during moss development. // Plant Mol. Biol. - 1998. - V. 49. - pp. 501-523.

56. Ebinuma H., Sugita K., Matsunaga E. and Yamakado M. Selection of marker-free transgenic plants using the isopentenyltransferase gene. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1997. V. 94. - pp. 2117-2121.

57. Emery R.J., Ma Q., Atkins C.A. The forms and sources of cytokinins in developing white lupine seeds and fruits. // Plant Physiol. 2000 - V. 123. - pp. 1593-1604.

58. Estele M. Cytokinin action: two receptors better than one? // Plant Cell. 1998. -pp. 1009-1019.

59. Faiss M., Zalubilova J., Strnad M., Schmuelling T. Conditional transgenic expression of the ipt gene indicates a function for cytokinins in paracrine signaling in whole tobacco plants. I I Plant J. 1997. - V. 12. - pp. 291-300.

60. Finnegan J., McElroy D. Transgene inactivation: Plants fight back! // Bio/Technology. -1994. V. 12. - pp. 883-888.

61. Frank, M. and Schmtilling, T. Cytokinin Cycles Cells. // Trends Plant Res. 1999. -V. 4.-pp. 243-244.

62. Frolova N.V., Matveeva T.V., Lutova L.A. Tumor formation in radish and role of cytokinins in this process. // In: 7 th International Congress of Plant Molecular Biology (ISPMB). Barcelona, Spain. 2003. - June 23-28. - p.201. (Abstract)

63. Frundt C., Meyer A.D., Ichikawa T. et al. A tobacco homologue of the Ri -plasmid ORF 13 gene causes cell proliferation in carrot root discs // Mol Gen Genet. 1998. -V.259. - №6. - pp. 559-568.

64. Fujita T, Ichikawa T, Syono К Changes in morphology, levels of endogenous IAA and protein composition in relation to the development of tobacco genetic tumor induced in the dark. // Plant Cell Physiol. -1991. V.32 - №2. - pp. 169-177

65. Gailet J. and Droogmans L. Molecular cloning of the Escherichia coli miaA gene involved in the formation of delta 2-isopentenyl adenosine in tRNA. // J. Bacterid. 1988. - V. 170. - V.9. - pp. 4147-4152.

66. Gatz C., Frohberg C., Wendenburg R. Stringent repression and homogeneous derepression by tetracycline of a modified CaMV 35S promoter in intact transgenic tobacco plants. // Plant J. -1992. V. 2. - №3. - pp.397-404

67. Golovko A., Sitbon F., Tillberg E., Nicander B. Identification of tRNA isopentenyltransferase gene from Arabidopsis thaliana. // Plant Mol. Biol. 2002. - V. 49. - pp. 161-169.

68. Haberer G., Kieber J. Cytokinins. New insights into a classic phytohormone. // Plant Physiol. 2002. - V. 128, pp. 354-362

69. Heidekamp F., Dirkse W. G., Hille J., van Ormondt H. Nucleotide sequence of the Agrobacterium tumefaciens octopine Ti plasmid-encoded tmr gene // J Nucleic Acids Res. 1983. - V.l 1. - №18. - pp. 6211-6223.

70. Hemerly A.S., Ferreira P., de Almeida Engler J., Van Montagu M., Engler G., Inze D. cdc2a expression in Arabidopsis is linked with competence for cell division. // Plant Cell. -1993. V. 5. -№ 12. - pp. 1711-23.

71. Hobbie L., Timpte S., Estelle M. Molecular genetics of auxin and cytokinin. // Plant Mol. Biol. 1994. - V. 26. - pp. 1499-1519.

72. Hooley R. Plant hormone perception and action: a role for G protein signal transduction?//Biol. Science. - 1998. -V.353. - pp.1499 - 1519.

73. Horgan R. 1984. Cytokinins. In: Advanced Plant Physiology // Wilkins, M.B., ed., London: Longman. pp. 89-101.

74. Hutchison C.E. and Kieber J. Cytokinin signaling in Arabidopsis // The Plant Cell. 2002. - pp.47-59

75. Ichikawa Т., Ozeki Y., Syono K. Evidence for the expression of the rol genes of N. glauca *N. langsdorffii. II Mol Gen Genet. 1990. - V.220. - №2. - pp. 177180.

76. Ichikawa Т., Syono K. Tobacco genetic tumors. // Plant Cell Physiology. -1991. -V.32.- №8.-pp. 1123-1128.

77. Intrieri M.C. and Buiatti M. The Horizontal Transfer of Agrobacterium rhizogenes Genes and the Evolution of the Genus Nicotiana. // Mol. Phyl. Evol. 2001. - V.20.-pp. 100-110.

78. Jameson P.E. Cytokinin metabolism and compartmentation. // In D.W.S. Мок and M.C. Мок (Eds) Cytokinins: Chemistry, activity and function. 1994. - CRC Press, An Arbor, MI. - pp. 113-128.

79. Kakimoto Т. CKI1, a histidin kinase homolog implicated in cytokinin signal transduction. // Science. 1996. - V. 274. - pp. 982-985.

80. Kakimoto T. Identification of plant cytokinin biosynthetic enzymes as dimethylallyl diphosphate: ATP/ADP isopentenyltransferases. // Plant Cell Physiol. 2001. - V. 42. pp. 677-685.

81. Kakimoto T. Biosynthesis of cytokinins. // J. Plant Res. 2003. - V. 116. - pp. 233-239.

82. Kaminek M., Motyka V., Vankova R. Regulation of cytokinin content in plant cells. // Physiologia plantarium. -1997. V. 101. - pp. 689-700.

83. Kende H., Zeevaart J.A.D. The five "classical" plant hormones // Plant Cell. -1997.-V.9.-pp. 1197-1210.

84. Klee J. H., Romano C. P. The roles of phytohormones in development as studied in transgenic plants // Crit. Rev. Plant Sci. 1994. - V. 13. - pp. 311-324.

85. Letham D.S. Cytokinins as phytohormones-sites of biosynthesis, translocation, and function of translocated cytokinin. // In: D.W.S. Мок, and M.C. Мок (Eds) Cytokinins: Chemistry, Activity and Function. 1994. - CRC Press, Ann Arbor, MI.-pp. 129-134.

86. Li Y., Hagen G., Guilfoyle T.J. Altered morphology in transgenic tobacco plants that overproduce cytokinins in specific tissues and organs. // J. Dev. Biol. 1992. -V. 153.-№2.-pp. 386-395.

87. Ma Mi G.S., He-chun Y., Guo-Feng L. Anther-specific expression of ipt gene in transgenic tobacco and its effect on plant development. 11 Transgenic research. -2002.-V. 11.-pp. 269-278.

88. Maniatis Т., Fritch F., Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual. // Cold Spring Harbor 1989,- New York: Cold Spring Harbor Lab.

89. Mannerlof M., Tenning P. Variability of gene expression in transgenic tobacco. // Euphytica. 1997. - V. 98. - pp. 133-139.

90. Matveeva® T.V., Lutova L.A., Wood D., Nester E.W. Search for the sequences homologous to Agrobacterium T-DNA in different plant genomes. // Biology of Plant Microbe Interaction. - 2004. - V.4. - p. 526-529.

91. Matveevab T.V., Frolova N.V., Dodueva I.E. Buzovkina I.S., Lutova L.A., van Onckelen H., Hormonal control of tumor formation in radish. // J. Plant Growth Regul. 2004. - V. 23. - pp. 37-43.

92. Matzke A.G., Matzke M.A. Position effects and epigenetic silencing of plant transgenes. // Curr. Opin. Plant Biol. 1998. - V. 1 - № 2. - pp. 142-148.

93. Mc Cabe M.S., Garrat L.C., Schepers F. Effect of PSAG12-IPT gene expression on development and senescence in transgenic lettuce. // Plant Physiol. -2001. -V. 127.-pp. 505-516.

94. Mc Kenzie M.J., Mett V., Reynolds P.H.S., Jameson P.E. Controlled cytokinin production in transgenic tobacco using a copper-inducible promoter. // Plant Physiol. -1994. V. 116. - pp. 969 - 977.

95. McGaw В.A., Burch L.R. Cytokinin biosynthesis and metabolism. // In: P.J. Davies (Ed) Plant Hormones. 2nd ed. Kluwer Academic, Dordrecht. - 1995. -pp. 98-117.

96. Medford J., Horgan R., El-Sawi Z., Klee H.J. Alteretions of endogenous cytokinins in transgenic plants using a chimeric isopentenil transferase gene. // Plant Cell. 1989. - V. 1. - pp. 403-413.

97. Meins F., Foster R. A cytokinin mutant derived from cultured tobacco cells // Developmental genetics. 1986. - V.7. - №3. - pp. 159-165.

98. Meins F., Foster R., Lutz J.P. Evidence for a Mendelian factor controlling the cytokinin requirement of cultured tobacco cells. // Developmental genetics. -1983.-V. 4.-№2.-pp. 129-141.

99. Miyawaki K., Matsumoto-Kitano M., Kakimoto T. Expression of cytokinin biosynthetic isopentenyltransferase genes in Arabidopsis: tissue specificity and regulation by auxin, cytokin and nitrate. // The Plant Journal. 2004. - V. 37. -pp. 128-138.

100. Moffat В., Somerville C. Positive selection for male sterile mutantsmutants of Arabidopsis lacking adenine phosphoribosyltranspherase gene. // Plant Cell. -1989. -V.l. - pp. 403-413.

101. Мок D.W.S. and Martin R.C. Cytokinin metabolic enzymes. // In: D.W.S. Мок, and M.C. Мок (Eds). Cytokinins: Chemistry, Activity and Function. CRC Press, Ann Arbor, MI. 1994. - pp. 129-134.

102. Мок D.W.S. and Мок M.C. Cytokinin metabolism and action. // Ann. Rev. Plant Physiol. Mol. Biol. 2001. -V. 52. - pp. 89-118.

103. Nooden L.D., Singh S., Letham D.S. Correlation of xylem sap cytokinin levels with macrocarpic senescence in soybean. // Plant Physiol. 1990. - V. 93. - pp. 3339.

104. Oakenfiill E.A., Riou-Khamlichi C., Murray J.A. Plant D-type cyclins and the control of G1 progression. // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 2002. -V. 357.-№1422.- pp. 749-760.

105. Prols F., Meyer P. The methylation patterns of chromosomal integration regions influence gene activity of transferred DNA in Petunia hybrida. II Plant J. -1992. V. 2. - № 4. - pp. 465-475.

106. Ramirez-Parra E., Desvoyes В., Gutierrez C. Balance between cell division and differentiation during plant development. // Int J Dev Biol. 2005. - V. 49. -№5-6.-pp. 467-477.

107. Redig P., Schmuelling Т., Van Onckelen H. Analysis of cytokinin metabolism in ipt transgenic tobacco by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. // Plant Physiol. 1996.-V. 112.-pp. 141-148.

108. Redig P. Regulation of cytokinin oxidase activity in tobacco callus expressing the T-DNA ipt gene. // Physiol. Plant. -1997. V. 99. - pp. 89-96.

109. Sakakibara H. and Takei K. Identification of cytokinin biosynthesis genes in Arabidopsis: a breakthrough for understanding the metabolic pathway and theregulation in higher plants // Journal of Plant Growth Regul. 2002. - V.21. - №1 -pp. 17-23

110. Sakakibara H., Suzuki M., Takei K. A response-regulator homologue possibly involved in nitrogen signal transduction mediated by cytokinin in maize // Plant J. 1998.-V.14 (3). - pp. 337-344.

111. Schell J. and Van Montagu M. The Ti Plasmids as Natural and as Practical Gene Vectors for Plants // Biotechnology. -1983. V. 1. - pp. 175 -180

112. Schmuelling T. New insights into the functions of cytokinins in plant development. // Journal of Plant Growth Regul. 2002. - V. 21 - № 1. - pp. 40-49

113. Schmuelling Т., Beinsberger S., De Greef J., Schell J., Van Onckelen H. Spena A. Construction of heat-inducible chimeric gene to increase the cytokinin content in transgenic plant tissue. // FEBS Lett. -1989. V. 249. - pp. 401-406.

114. Schmuelling Т., Dehio C., Grossmann K., Schell J. Phenotype and hormonal status of transgenic tobacco plants overexpressing the rolA gene of Agrobacterium rhizogenes T-DNA. // Plant Mol.Biol. -1993. V. 23. - № 6. - pp. 1199-1210.

115. Scott M. Plant hormone response mutants. // Physiologia plantarum. 1990. -V. 78.-№l.-pp. 147-152.

116. Smart N. Delayed leaf senescence in tobacco plants transformed with tmr, a gene for cytokinin production in Agrobacterium. II Plant Cell. -1991. V. 3. - pp. 647-656.

117. Smigocki, А. С. Cytokinin content and tissue distribution in plants transformed by a reconstructed isopentenyl transferase gene // Plant Mol. Biol. -1991.-V. 16.-pp. 105-115.

118. Smith H.H. The inheritance of genetic tumor in Nicotiana Hybrids // Journal of Heredity. 1988. - V. 79. - pp. 277-283.

119. Spena A. The idoleacetic acid-lysine synthetase gene of Pseudomonas syringae subsp. savastanoi induces developmental alterations in transgenic tobacco and potato plants. // Mol. Gen. Genet. -1991. V. 227. - pp. 205-212.

120. Su W., Howell S. A single genetic locus, CKR1, defines Arabidopsis mutants in which root growth. I I Plant Physiology. 1992. - V. 99. - pp. 1569-1574.

121. Sun J., Niu Q.W., Tarkowski P., Zhang В., Tarkowska D., Sandberg G., Chua N.H., Zuo J. The Arabidopsis AtIPT8/PGA gene encodes an isopentenyltransferase that involved in de novo cytokinin biosynthesis. // Plant Physiol. 2003 -V. 131. - pp. 167-176.

122. Swarup R., Parry G., Graham N., Allen Т., Bennett M. Auxin cross-talk: integration of signalling pathways to control plant development. // Plant Mol. Biol. 2002. - V. 49. - V. 3. - № 4. - pp. 411-426.

123. Takei K., Sakakibara H., Sugiyama T. Identification of genes encoding adenylate isopentenyltransferase, a cytokinin biosynthesis enzyme, in Arabidopsis thaliana. II J. Biol. Chem. 2001. - V. 276. - pp. 26405-26410.

124. Takei K., Takahashi Т., Sugiyama Т., Yamaya Т., Sakakibara H. Multiple routes communicating nitrogen availability from roots to shoots: a signal transduction pathway mediated by cytokinin. // J. Exp. Bot. 2002. - V. 53. - pp. 971-977.

125. Taller В.J. Distribution, biosynthesis, and function of cytokinins in tRNA. // In: D.W.S. Мок, and M.C. Мок (Eds). Cytokinins: Chemistry, Activity, and Function. - CRC Press, Boca Raton, FL. - 1994. - pp. 101-112.

126. Taniguchi M., Kiba Т., Sakakibara H., Ueguchi C., Mizuno Т., Sugiyama T. Expression of response regulator homologs is induced by cytokinins and nitrate. // FEBS Letters. 1998. - V. 429. - № 3. - pp. 259-262

127. Ullrich C.I., Aloni R. Vascularization is a general requirement for growth of plant and animal tumours. // Journal of Experimental Botany. 2000. - V. 51. - № 353.-pp. 1951-1960.

128. Van Loven K., Beinsberger S.E.I., Valcke R.L.M., Van Onckelen H.A., Clijsters H.M.M. Morphometry analysis of the growth of Phsp70-ipt transgenic tobaco plants. // J Exp.Bot. 1993. - V. 44. - pp. 101-109.

129. Van Staden J., Cook E.L., Nooden L.D. Cytokinins and senescence. // In: Senescence and Aging Plants (Leopold, A.C., Eds.). London. Academic Press. -1998.-pp. 282-328.

130. Vaucheret H., Kronenberger J., Lepingle A., Vilaine F., Boutin J.P., Caboche M. Inhibition of tobacco nitrite reductase activity by expression of antisense RNA.// Plant J. -1994. V.2. - № 4. - pp. 559-569.

131. VlasSk J., Ondrej M. Construction and use of Agrobacterium tumefaciens binary vectors with A. tumefaciens C58 T-DNA genes. // Folia Microbiol. 1992. -V. 37.-№3.-pp. 227-230.

132. Vogel J.P., Schuerman P., Woeste K. Brandstatter I., Kieber J. J. Isolation and characterization of Arabidopsis mutants defective in the induction of ethylene biosynthesis by cytokinin. // Genetics. 1998. - V. 149. - № 1. - p. 417-427.

133. Weiler E.W. and Schroeder J. Hormone genes and crown gall disease. // Trends Biochem. Sci. 1987. - V.12. - pp. 271-275.

134. Werner Т., Motyka V., Strnad M., Schmuelling T. Regulation of plant growth by cytokinin // Proc Natl Acad Sci USA 2001. - V. 98. - № 18. - pp. 1048710492

135. White F.F., Garfinkel D.J., Huffman G.A., Gordon M.P., Nester E.W. Sequence homologous to Agrobacterium rhizogenes T-DNA in the genomes of uninfected plants. // Nature. 1983. - V. 301. - № 5898. - pp. 348-350.

136. Yamada H., Hanaki N., Imamura A. Ueguchi C., Mizuno T. An Arabidopsis protein that interacts with the cytokinin-inducible response regulator, ARR4, implicated in His-Asp phosphorilay signal. // FEBS Lett. 1998. - V.436. - №1. -pp.76-80.

137. Zambryski P., Joos H., Genetello C., Leemans J., Van Montagu M., Schell J. Ti plasmid vector for the introduction of DNA into plant cells without alterationof their normal regeneration capacity. I I EMBO J. 1983. - V. 2. - pp. 2143— 2150.

138. Zhang R., Zhang X., Wang J., Letham D.S., McKinney S.A., Higgins T.J. The effect of auxin on cytokinin levels and metabolism in transgenic tobacco tissue expressing an ipt gene. // Planta. -1995. V. 196. - pp. 84-94.