Получение и анализ трансгенных растений пшеницы (Triticum aestivum L.) с агробактериальным геном изопентенилтрансферазы (ipt)

Терешонок, Дмитрий Викторович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение и анализ трансгенных растений пшеницы (Triticum aestivum L.) с агробактериальным геном изопентенилтрансферазы (ipt)
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Получение и анализ трансгенных растений пшеницы (Triticum aestivum L.) с агробактериальным геном изопентенилтрансферазы (ipt)"

На правах рукописи

Терешонок Дмитрий Викторович

003468981

ПОЛУЧЕНИЕ И АНАЛИЗ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ПШЕНИЦЫ (ТгШсит аЫпит Ь.) С АГРОБАКТЕРИАЛЬНЫМ ГЕНОМ ИЗОПЕНТЕНИЛТРАНСФЕРАЗЫ 0р()

Специальность: 03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2009

003468981

Работа выполнена в лаборатории генетики культивируемых клеток отдела биологии клетки и биотехнологии Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН и на кафедре Экологической и промышленной биотехнологии Московского государственного университета инженерной экологии

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук Степанова Анна Юрьевна

доктор биологических наук, профессор Поляков Алексей Васильевич

кандидат биологических наук Ралдугина Галина Николаевна

Ведущая организация: Российский государственный аграрный университет -МСХА им. К.А.Тимирязева

Защита диссертации состоится «о » С/ Ь 2009 года в /г часов на заседании диссертационного совета Д 006.027.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН по адресу: 127550, Москва, Тимирязевская ул., д. 42; тел.: (495) 976-65-44; факс: (495) 977-09-47; e-mail: iab@iab.ac.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН

Автореферат диссертации разослан «_»_2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета л

кандидат биологических наук // [/ , С.А. Меликова

I -{/Ьи^иК

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Пшеница является ведущей продовольственной культурой в мире, в том числе и на территории Российской Федерации. Фактическая урожайность современных сортов пшеницы во многом лимитируется воздействием абиотических и биотических стрессов. Одним из распространенных абиотических стрессов на территории России является затопление полей, происходящее в весенний и осенний периоды, а также в периоды зимних оттепелей. Затопление полей ливневыми и паводковыми водами приводит к почвенной гипоксии, которая является причиной преждевременного старения растений (Dong et al., 1983), приводит к хлорозу листьев, некрозам, дефолиации (Ginkel et al., 1992), прекращению роста (Huang and Johnson, 1995) и уменьшению урожая (Musgrave, 1994, Boru, 1996). Так в среднем в мире ежегодно подвергаются затоплению 20% площади, используемой для возделывания пшеницы (Setter and Waters, 2003). В результате потеря урожая на затапливаемой территории составляет от 34 до 60%, в основном, за счет уменьшения массы и количества зерна (Setter and Waters, 2003, Musgrave and Ding, 1998).

В литературе имеются данные о положительном влиянии экзогенных цитокининов при затоплении растений (Бахтенко, Платонов, 1999), в связи с чем, Zhang et al. (2000) было выдвинуто предположение, что повышение уровня эндогенных цитокининов должно улучшать выживаемость растений в условиях затопления. Создание трансгенных растений с измененным уровнем цитокининов при встраивании в растения гена ipt, кодирующего изопентенилтрансферазу - ключевой фермент синтеза цитокинина, почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens, могло бы изменить устойчивость растений к почвенной гипоксии и послужить удобной моделью для изучения роли этого гормона в защитных реакциях растений на затопление.

Дели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось получение и анализ трансгенных растений пшеницы с геном изопентенилтрансферазы (ipt).

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать метод агробактериальной трансформации пшеницы.

2. Получить трансгенные растения пшеницы с агробактериальным геном биосинтеза цитокининов ipt.

3. Исследовать морфологические особенности полученных растений.

4. Провести анализ экспрессии и наследования введенных генов.

5. Исследовать устойчивость полученных трансгенных растений к корневому затоплению.

6. Изучить морфогенетический потенциал каллусных линий, полученных от трансгенных растений пшеницы с геном ipt.

Научная новизна. Разработан новый способ агробактериальной трансформации пшеницы in planta с использованием в качестве растительного экспланта прорастающих семян. С применением данного метода были впервые получены трансгенные растения пшеницы, содержащие и экспрессирующие агробактериальный ген ipt. Впервые для пшеницы было показано влияние введенного гена ipt на устойчивость растений к воздействию корневого затопления. Изучена динамика процессов перекисного окисления липидов у трансгенных растений пшеницы в условиях затопления. Проведено исследование морфогенетического потенциала у каллусных линий, полученных от трансгенных растений пшеницы с геном ipt.

Практическая__значимость. Разработан оригинальный

агробактериальный метод трансформации пшеницы, который может быть актуален для получения трансгенных растений различных сельскохозяйственных культур. Полученные растения пшеницы, содержащие

ген ipt, могут служить основой для создания новых форм, обладающих устойчивостью к корневому затоплению.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы докладывались: на Всероссийской выставке научно-технического творчества молодежи НТТМ, Москва, 2004 г.; на III Международном симпозиуме «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, 2004 г.; на IV Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток», Звенигород, 2005 г.; на 2-м Всероссийском симпозиуме «Физиология трансгенного растения и проблемы биобезопасности», Москва 2007 г.; на выставке «РосБиоТех-2007», Москва, ВВЦ, 2007 г.; на IX Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология», Звенигород, 2008 г.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов, списка литературы. Работа изложена на 134 страницах машинописного текста, содержит И таблиц, 25 рисунков. Список использованной литературы включает 261 наименование.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В качестве объекта исследований использовали коммерческий сорт яровой мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) «Энита», созданный совместно НПО «Подмосковье», Рязанским НИИПТИ АПК и Владимирским ГОСХОЗом методом индивидуального отбора из гибридной популяции. В качестве вектора для трансформации использовали штамм Agrobacterium tumefaciens, любезно предоставленный профессором СПбГУ Лутовой Л.А., содержащий плазмиду pGV3850 с целевым геном ipt под промотором 35S вируса мозаики цветной капусты и селективным геном nptll, кодирующим фермент неомицинфосфотрансферазу, под контролем NOS промотора.

Для получения трансгенных растений использовали метод культивирования семян в суспензии агробактерии в условиях вакуумной инфильтрации. Для этого суспензию агробактерии с семенами пшеницы помещали в вакуумную камеру и откачивали воздух (давление -0,8 атм.). Через 40 минут давление постепенно повышали до атмосферного. Затем семена пшеницы проращивали на модифицированной среде Мурасиге-Скуга (MCI) (Murashige and Skoog, 1962), содержащей 'Л нормы макро- и микросолей, 60 мг/л аспарагина, 10 мг/л аскорбиновой кислоты, 50 мг/л мезо-инозита, 1 мг/л глицина, 1 мг/л тиамина, 0,25 мг/л пиридоксина, 0,25 мг/л никотиновой кислоты, 15 г/л сахарозы, 7 г/л агар-агара, без добавления гормонов. Отбор трансформантов и элиминацию агробактерии осуществляли культивированием проростков пшеницы на твердой среде MCI с добавлением антибиотиков канамицина 50 мг/л и цефотаксима 300 мг/л.

Трансформанты и потомки первого семенного поколения - Ть устойчивые к канамицину, проверяли на наличие последовательностей генов ipt и nptll методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). ДНК пшеницы для ПЦР-анализа выделяли методом, описанным Moller et al.(1992).

Транскрипцию гена ipt в растениях Ti определяли с помощью метода обратно-транскрипционной ПЦР (ОТ-ПЦР). Для этого проводили выделение тотальной РНК по методу, описанному Krapp et al. (1993). Синтез первой цепи кДНК осуществляли с помощью набора реагентов К1512 (Fermentas) по методике изготовителя.

Гибридизацию ДНК по Саузерну проводили по общепринятой методике (Maniatis et al., 1989). ДНК для гибридизации выделяли из растений Ti по методике, описанной Deilaporta et el. (1983).

Интенсивность процессов окислительной деструкции мембранных липидов оценивали по содержанию ТБК-активных продуктов, основу которых составляет малоновый диальдегид (МДА), а эффективность системы защиты по активности антиоксидантных ферментов супероксиддисмутазы (СОД) (ЕС 1.15.1.1) и каталазы (КАТ) (ЕС 1.11.1.6). В качестве образцов для

определения накопления МДА, активности СОД и КАТ использовали гомогенаты листьев верхнего яруса от затапливаемых и не затапливаемых нетрансгенных и трансгенных Tt растений. Измерения проводили через каждые два дня, в течение всего периода затопления. Концентрацию МДА определяли по тесту с 2-тиобарбитуровой кислотой в растворе трихлоруксусной кислоты (Стальная, Гаришвили, 1977). Активность СОД определяли фотохимическим методом с использованием метионина, рибофлавина и нитросинего тетразолия (Giannopolitis and Ries, 1977). Активность КАТ определяли по скорости разложения перекиси водорода (Aebi, 1984).

Каллус пшеницы получали из незрелых зародышей, изолированных на 10-14 день после опыления контрольных и трансгенных Ti растений, когда размер зародышей составлял 0,5-1,5 мм. Для каллусообразования в чашку Петри помещали по 20 зародышей щитком вниз на модифицированную агаризованую среду Мурасиге-Скуга (МСЗ), содержащую макро- и микросоли МС, 120 мг/л аспарагина, 20 мг/л аскорбиновой кислоты, 100 мг/л мезо-инозита, 2 мг/л глицина, 2 мг/л тиамина, 0,5 мг/л пиридоксина, 0,5 мг/л никотиновой кислоты, 30 г/л сахарозы, 7 г/л агар-агара и 2,5 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д). Культивирование каллусов на данной среде проводили в течение двух месяцев. Для регенерации растений каллус переносили на среду МСЗ без добавления 2,4-Д.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 1. Обоснование выбора экспланта для трансформации

Выбор экспланта играет существенную роль при проведении процесса агробактериальной трансформации. В работах по получению трансгенных растений пшеницы с помощью Agrobacterium tumefaciens в настоящее время в качестве эксплантов чаще всего используют незрелые зародыши или эмбриогенный каллус (Cheng et al., 1997, Guang-Min and Zhong-Yi, 1999, Ни et a!., 2003). В обоих случаях присутствует этап культивирования тканей in

vitro, что имеет ряд недостатков. Во-первых, появляется зависимость от морфогенетического потенциала культивируемых тканей (Копертех, Бутенко, 1995). Во-вторых, условия in vitro могут привести к появлению сомаклональных вариантов, в том числе и устойчивых к селективному агенту. Кроме этого, растения-регенеранты могут обладать пониженной фертильностью, жизнеспособностью, нести различные уродства (Кагр, 1995). В-третьих, при проведении трансформации с использованием агробактерии необходимо еще учитывать и то, что сама процедура агробактериальной трансформации снижает количество растений-регенерантов (Khanna, Daggard, 2003). В настоящее время осуществляется поиск эксплантов, позволяющих эффективно получать трансгенные растения вне зависимости от морфогенетического потенциала культуры. Так для получения трансгенных растений пшеницы Supartana et al. (2006) использовали апикальные меристемы проростков. К сожалению метод трансформации, основанный на инъекции суспензии агробактерии в апикальные меристемы проростков, из-за своей трудоемкости неприменим для массового получения трансгенных растений.

Чтобы избежать вышеприведенных трудностей, а также сократить сроки получения генетически трансформированных растений, в нашей работе в качестве экспланта для трансформации мы использовали семена.

2. Подбор оптимальной концентрации селективного агента

Плазмида pGV3850. используемая в данной работе для генетической трансформации пшеницы, включала в качестве селективного маркера ген nptll, ответственный за устойчивость к антибиотику канамицину. В связи с этим, для отбора трансгенных растений следовало определить чувствительность проростков пшеницы к этому антибиотику. Действие канамицина приводит к разрушению хлорофилла, в результате чего растения белеют. Количество антибиотика, вносимое в среду для отбора трансформантов, зависит от чувствительности клеток данного вида растения к этому антибиотику, типа экспланта, на который воздействует антибиотик, и

времени культивирования. Для отбора трансгенных растений пшеницы наиболее часто применяют две концентрации канамицина 50 и 100 мг/л (Mooney et al., 1991, Cheng et al., 1997). В нашей работе мы использовали семена пшеницы, которые быстро прорастают, поэтому контакт с антибиотиком ограничивается 7-10 днями, после чего проростки высаживают в почву. Поэтому важно было подобрать такую концентрацию канамицина, которая надежно обеспечивала бы отбор трансгенных растений при кратковременной обработке.

Для определения летальной дозы антибиотика семена пшеницы высаживали в чашки Петри на среду MCI с добавлением канамицина в концентрациях 50 и 100 мг/л. На 3-й, 6-й, 9-й и 14-й дни проведения эксперимента проростки пересаживали в почву и подсчитывали количество побелевших побегов. Из рис. 1 видно, что культивирование на среде с канамицином в течение 14 дней при обеих используемых концентрациях приводило к 100%-му побелению проростков пшеницы. Снижение времени контакта с антибиотиком приводило к уменьшению количества побелевших растений при использовании как той, так и другой концентрации.

JSL

G - 100 мг/л канамицина О - 50 мг/л канамицина

rfel

3 6 9

Продолжительность воздействии канамицина, сут

Рис. 1. Влияние продолжительности обработки канамицином на проростки пшеницы.

После пересадки в почву реакция на 9-дневную обработку проявлялась к 7-му и 10-му дням, а на 6-дневную обработку - к 10-му и 14-му дню после культивирования со 100 и 50 мг/л канамицина, соответственно (рис. 2, рис. 3). Но даже при кратковременном трехдневном воздействии антибиотика в дозе 50 мг/л все растения в течение месяца теряли хлорофилл.

120

г во

0 5 10 15 20 25 30

Время тестирования растений, сут

Рис. 2. Доля побелевших растений после пересадки их в почву при использовании 50 мг/л канамицина: а - после 3 дней взаимодействия с канамицином; б -после 6 дней; в - после 9 дней.

120

1 100 I

е. во

0 5 10 15 20 25 30

Время тестирования растений, сут

Рис. 3. Доля побелевших растений после пересадки их в почву при использовании 100 мг/л канамицина: а - после 3 дней взаимодействия с канамицином; б -после 6 дней; в - после 9 дней.

Из полученных результатов следует, что при отборе канамицин-устойчивых растений можно применять концентрацию антибиотика 50 мг/ л и выдерживать проростки на данной среде в течение 3-х дней.

3. Освобождение от бактериальной инфекции Одним из ключевых моментов трансформации растений с использованием А^оЬас1егшт Ште/аает является освобождение от бактериальной инфекции после кокультивирования. Антибиотиком, рекомендованным для элиминации используемого в работе штамма агробактерии, является цефотаксим. По литературным данным обычно применяемая доза составляет 100-500 мг/л (Данилова, Долгих, 2004). В нашей работе период пребывания растений в селективных условиях был ограничен необходимостью пересадки растений в грунт, поэтому

необходимо было подобрать такую минимальную концентрацию антибиотика и схему пересадок, которые бы обеспечивали полную элиминацию агробактерии к моменту высадки растений в почву. Для освобождения семян от агробактерии в питательную среду для проращивания семян добавляли цефотаксим в концентрации 300 мг/л, через три дня проростки переносили на новую среду, а еще через 3 дня проростки помещали в воду с такой же концентрацией антибиотика. Такая схема позволяла полностью элиминировать агробактерию и исключить возможность контаминации при проведении ПЦР-анализа.

4. Выбор оптимальной схемы агробактсриалыюй трансформации

Для получения трансгенных растений пшеницы нужно было подобрать оптимальную схему агробактериальной трансформации. Мы использовали методику, предусматривающую совместную инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии с последующей посадкой на твердую питательную среду и дополнительным трехдневным культивированием без антибиотиков, с последующей пересадкой на среду с антибиотиками. Для облегчения проникновения Т-ДНК внутрь клеток зародыша при их совместном культивировании с агробактерией, использовали вакуумную инфильтрацию.

Считается, что однодольные невосприимчивы к агробактерии. По этому поводу высказывается ряд предположений, наиболее распространенным из которых является то, что специфические сигнальные молекулы, индуцирующие У1>-область Ту-плазмиды агробактерии, обладают у однодольных недостаточной активностью. Для активации уг'г-области Т1-плазмиды, а также для облегчения проникновения агробактерии семена разрезали на две половины, в опытах использовали часть с зародышем. Также для активирования у;>-области перед трансформацией в суспензионную культуру агробактерии добавляли экстракт из листьев табака.

Было испытано несколько вариантов продолжительности совместного культивирования семян пшеницы в суспензии агробактерии (рис. 4).

Рис. 4. Схема агробаюгериальной трансформации пшеницы

В первом варианте (рис 4, а) разрезанные семена пшеницы вносили в суспензию агробактерии с экстрактом табака и помещали в вакуумную камеру, из которой откачивали воздух (давление -0,8 атм.). Через 40 минут давление постепенно повышали до атмосферного и семена высаживали на твердую среду MCI. Через 3 дня их пересаживали на ту же самую среду, но с добавлением антибиотиков - 50 мг/л канамицина и 300 мг/л цефотаксима. Поскольку все полученные проростки оказались белыми, мы решили увеличить время совместного культивирования эксплантов с агробактерией и в последующих опытах колбу с семенами и суспензией агробактерии после вакуумной инфильтрации помещали на качалку на 24 часа (Рис. 4, б), после чего семена высаживали на твердую питательную среду MCI и через 3 дня пересаживали на ту же среду с добавлением антибиотиков. По этой схеме было проведено четыре опыта. Частота прорастания семян была ниже, чем при использовании первой схемы трансформации, но в этом случае наблюдали появление зеленых проростков (табл. 1 ).

Таблица 1. Результаты отбора устойчивых к канамицину растений пшеницы после инкубации семян в суспензии агробактерии в условиях вакуумной инфильтрации и последующего 24-часового культивирования на качалке.

№ опыта Число семян Число семян, Число Число зеленых

пересаженных на среду с Км+Цф* проростков проростков

1 150 112 69 5

2 104 86 56 10

3 163 143 85 7

4 338 312 178 31

* Км — канамтщин, Цф — цефотаксим.

Нами также была испытана схема агробактериальной трансформации, при которой семена после вакуумной инфильтрации выдерживали в суспензии агробактерии в течение 48 часов на качалке (рис. 1, в), затем также высаживали на твердую питательную среду МС1 и через 3 дня пересаживали на ту же среду с добавлением антибиотиков. Но увеличение совместного культивирования эксплантов в суспензии до 48 часов приводило к резкому снижению доли прорастающих семян из-за токсического действия агробактерии на семена и не давало канамицин-устойчивых растений.

5. Анализ трансформированных растений Известно, что в некоторых случаях наличие сигнала при проведении ПЦР зависит не от встраивания Т-ДНК в геном растений, а от присутствия А. Ште/ааепБ в растительных тканях. Поэтому, для оценки возможности присутствия А. Ште/ас1ет, используемой для трансформации, в растениях пшеницы после культивирования на среде с цефатоксимом проводили ПЦР-анализ полученных растений с праймерами к агробактериальному гену УггЕ. Результаты данного анализа показали, что недельное культивирование на среде с ЗООмг/л цефатоксима приводило к полной элиминации агробактерии на экспланте.

Для доказательства трансгенности полученных после отбора на канамицине зеленых растений пшеницы проводили ПЦР-анализ с праймерами к маркерному гену прШ (рис. 5) и целевому гену \р1 (рис. 6).

Рис 5. Электрофореграмма продуктов ПЦР ДНК растений пшеницы со специфичными к гену прШ праймерами: С- - отрицательный контроль (вода вместо ДНК-содержащей пробы); М -маркер молекулярного веса (100 - 1000 Ь.р.); С+ - положительный контроль (вектор рСУ3850).

Рис 6. Электрофореграмма продуктов ПЦР ДНК растений пшеницы со специфичными к гену ¡р! праймерами: С- отрицательный контроль (вода вместо ДНК-содержащей пробы); М - маркер молекулярного веса (100 - 1000 Ь.р.); С+ положительный контроль (вектор рСУ3850).

Результаты, полученные с помощью ПЦР-анализа, подтвердили данные теста на устойчивость к канамицину. Все растения, оставшиеся на селективной среде зелеными, содержали маркерный ген пр1Л. Частоту трансформации рассчитывали как отношение числа ПЦР-положительных на ген ¿р/ растений к общему количеству используемых в опыте семян (табл. 2).

Таблица 2. Эффективность агробактериальной трансформации пшеницы.

№ Число ПЦР- ПЦР- Частота

опыта канамицин- положительные положительные трансформации,

устойчивых на ген при1 на ген гр; %

растений

1 5 5 5 3,3

2 10 10 7 6,7

3 7 7 7 4,3

4 31 31 27 8,0

Данные результаты показали, что не все растения, имеющие маркерный ген прШ имели и целевой ген - 1р1 Полученные нами результаты согласуются с данными других исследователей (N¥11 е!: а1., 2004), в работах которых также было показано, что трансгенные растения в некоторых случаях содержат неполную генетическую конструкцию.

Надо отметить, что данные о частоте трансгенных растений, равной даже 3%, сопоставимы с данными других авторов (Cheng et al. 1997, Khanna and Daggard, 2002, Wu et al., 2003, Mitil et al., 2004). Таким образом, предложенная нами схема агробактериальной трансформации пшеницы оказалась весьма эффективной по частоте получения трансгенных растений и сопоставима с максимальным уровнем получения трансгенных растений пшеницы.

6. Морфологические особенности трансгенных растений

Полученные трансгенные растения пшеницы высаживали в почву и выращивали в условиях теплицы. Фенотипический анализ трансформированных растений показал их значительную морфологическую неоднородность по сравнению с нетрансгенными растениями контрольной группы, при этом все множество трансформантов по ряду морфологических признаков условно можно было разделить на две неравные группы (табл. 3).

Таблица 3. Основные морфологические характеристики трансгенных растений

пшеницы

Вид Высота растения, мм Количество побегов на одно растение Средний диаметр стебля, мм Количество рядов колосков

Контроль 527,4±48,9 2,9±1,3 2,8±0,7 15,8±3,2

Первая группа трансформантов 612,2±57,6 4,2±1,7 3,2±0,9 16,2±3,1

Вторая группа трансформантов 322,1±22,4 7,2±1,6 2,9±0,3 -

Большинство (более 80%) полученных трансгенных растений (первая группа трансформантов) имели удлиненный стебель, высота которого была на 16% больше, чем у контроля и характеризовались значительным увеличением общей кустистости, которая на 45% была больше, чем у нетрансгенных растений. Все растения этой группы были полностью фертильными. Также растения первой группы характеризовались продленным периодом вегетации. После окончания фазы прорастания,

начиналась фаза кущения, которая у трансгенных растений этой группы была на 2-3 недели продолжительнее, чем у контроля. Длительность следующих фаз развития - выхода в трубку и колошения (выметывания) по времени была сопоставима с аналогичными фазами у контрольных растений. Таким образом, суммарный вегетационный период у этих растений был увеличен на 2-3 недели.

Часть растений-трансформантов (около 20%) были отнесены ко второй группе. Все растения этой группы характеризовались значительной общей кустистостью, которая была на 148% больше, чем у контроля, и на 71% больше, чем у трансформантов первой группы. Также все эти растения были низкорослыми — высота стебля у них составляла только 61% от высоты стебля нетрансгенных растений. Длительность периода вегетации у них была такая же, как у трансгенных растений первой группы. Однако от трансформантов первой группы и контроля эти растения отличались значительными аномалиями в развитии на стадиях выхода в трубку и колошения. Во время фазы выхода в трубку удлинение междоузлий было незначительным. Во время колошения не наблюдалось появление фертильных колосьев. Таким образом, все растения второй группы оказались стерильными.

7. Изучение наследования встроенных генов

Потомки первого семенного поколения - Т] получали от самоопыления фертильных трансгенных растений пшеницы Т0. Отбор растений проводили на среде MCI с добавлением 50 мг/л канамицина. Для изучения наследования было оценено потомство от 9 трансформантов пшеницы. Наследование целевого гена ipt изучали с помощью ПЦР-анализа ДНК, выделенной из канамицин-устойчивых растений Т] (табл. 4).

Линия Общее кол-во растений Число растений, неустойчивых к канамицину Число растений, устойчивых к канамицину ПЦР"+" на цН, среди канамицин-устойчивых растений Отношение, числа растений ПЦР"+" на ген ¡р1, к общему кол-ву растений, %

1 18 18 0 0 0

2 30 30 0 0 0

3 10 10 0 0 0

4 33 31 2 2 6

5 .35 25 10 10 29

6 28 13 15 :5 54

7 103 76 27 27 26

8 57 9 48 42 74

9 88 62 26 12 14

Анализ потомков первого семенного поколения показал наследование генетической вставки гена ¡р! у большинства устойчивых к канамицину растений. У ряда растений наследование трансгенов в первом семенном поколении не происходило. Возможным объяснением этому может быть химерность трансформантов.

Для подтверждения присутствия в ДНК растений пшеницы первого семенного поколения вставки генетической конструкции проводили Саузерн-гибридизацию к маркерному гену пр!П (рис. 7). Для проведения Саузерн-гибридизации использовали ДНК растений Т| линий 6, 7, 8 и 4.

В результате Саузерн-анализа наблюдалась

■ жк'.

п 5 Н

Рис. 7. Саузерн-гибридизация ДНК трансгенных растений с меченым 32Р-зондом к гену прй1\ М - маркер молекулярного веса (1000 - 10000 Ь.р.); 1-4 - трансгенные растения Т| линий 6, 7, 8 и 4 соответственно; 5 -контрольное (нетрансгенное) растение.

гибридизация ДНК ПЦР-проанализированных растений пшеницы линий 6, 7 и 8 с меченым 32Р-зондом к гену прШ. Данный анализ подтвердил трансгенную

природу полученных растений пшеницы.

Транскрипцию целевого гена гр/ в растениях первого семенного поколения оценивали с помощью метода ОТ-ПЦР. Было показано, что интродуцированный ген ¡р! транскрибируется у большинства ПЦР-положительных растений Т].

12 3 4 5 6 7 8 9 10 С+М С-

Рис 8. Элекрофореграмма продуктов амплификации кДНК растений пшеницы первого семенного поколения с праймерами к гену ¡р(: 1-9 кДНК трансгенных растений; 10 - кДНК нетрансгенного растения; К- - отрицательный контроль (вода вместо ДНК-содержащей пробы); М - маркер молекулярного веса (100 - 1000 Ь.р.); К+ -положительный контроль (вектор рСУ3850).

Две биотехнологические линии 6 и 8 растений Ть показавшие стабильную экспрессию гена ¡р1 у всех канамицин-устойчивых растений (рис. 8), были отобраны для проведения эксперимента по корневому затоплению.

8. Анализ устойчивости трансгенных растений пшеницы в условиях корневого затопления.

Растения, предназначенные для затопления, делили на две группы и сажали в вегетационные сосуды емкостью 9 л, содержащих 4 л грунта, по 12 растений в сосуд. В опыте были использованы четыре группы растений: АТ) -растения Ть постоянно находящиеся в условиях нормальной аэрации; ГТ] -затапливаемые растения Ть АК - растения дикого типа, постоянно находящиеся в условиях нормальной аэрации; ГК - затапливаемые растения дикого типа. Затопление начинали во время фазы выхода в трубку после окончания интенсивного роста нижнего междоузлия. Затопление проводилось в течение 14 суток.

Устойчивость растений в условиях почвенной гипоксии оценивали по изменению линейных размеров растений (табл. 5) и показателям урожайности (табл. 6).

Таблица 5. Изменение линейных размеров растений в процессе корневого затопления.

Группа растений Высота растения на момент начала затопления Высота растения ко времени окончания затопления Прирост по высоте за время затопления

мм мм мм % к АК

АК 295,5±30,1 826,5±80,5 , 531,0±54,9 100

ГК 271,5±28,6 470,0±43,4 198,5±20,2 37

%кАТ,

АТ, 373,3±36,6 935,8±88,9 562,5±49,4 100

гт, 354,3±34,9 640,0±56,7 285,7±26,6 51

Из данных таблицы 5 видно, что действие корневого затопления ингибировало рост растений дикого типа и трансгенных растений. При этом прирост за 14 дней затопления группы ГК составлял только 37% от прироста не затапливаемой группы АК, а прирост группы ГТ, - 51% от прироста группы АТ1. Таким образом, к моменту окончания затопления максимальная высота надземных побегов растений группы ГТ, составляла 68% от группы АТ1, а высота ГК всего лишь 57% от АК.

Таблица 6. Показатели урожайности растений.

Группа растений Урожайность Средний вес семени Доля колосьев давших семена

г/м2 % к АК мг % к АК %

АК 126,1 100 28,7±5,9 100 100

ГК 2,7 2 7,6±1,9 26 33

%кАТ, % к АТ,

АТ, 129,1 100 28,9±4,9 100 100

гт, 46,6 36 13,4±1,5 46 89

Снижение урожайности под действием корневого затопления (табл. 6) происходило значительно сильнее, чем замедление роста растений. Средний вес семени растений дикого типа группы ГК составлял только 57% от среднего веса семени трансгенных растений ГТЬ средний вес семени которых в свою очередь составлял 46% от среднего веса семени групп АК и АТЬ различия у которых не наблюдались. Доля колосьев, давшая семена, у группы ГК составляла только 33%, а у ГТ1 - 89% от растений АК и АТЬ где все колосья дали семена. Вследствие этого урожайность затапливаемых растений дикого типа группы ГК составляла всего лишь 2% от урожайности группы АК. При этом трансгенные растения оказались значительно более устойчивыми - урожайность группы ГТ1 составляла 36% от АТ1.

9. Активность антиоксидантной энзиматической системы в растениях

Почвенная гипоксия, как и другие стрессы, приводит к неконтролируемому образованию активных форм кислорода (АФК) в клетках растений и стимулирует перекисное окисление мембранных липидов (ПОЛ) и других чувствительных компонентов клетки (АгЬопа е1 а1., 2008), приводит к повреждениям в геноме и ускоренному старению. В этой связи представляет интерес сравнительное изучение динамики процесса ПОЛ и соответствующей реакции защитных систем у обычных и трансгенных растений.

пшеницы в условиях корневого затопления

450

400

А'П - растения Т1, постоянно находящиеся в условиях нормальной аэрации; ГТ1 - затапливаемые растения Т1; АК - растения дикого типа, постоянно находящиеся в условиях нормальной аэрации; ГК - затапливаемые растения дикого типа.

растения Т1, годящиеся в

100

О 2 4 е 8 10 12 Длительность эксперимента, дни

10 12 14

Интенсивность развития ПОЛ оценивалась по продуктам, реагирующим с тиобарбитуровой кислотой, основу которых составляет малоновый диальдегид (МДА). Как видно из данных, представленных на рис. 9, в процессе затопления у растений групп ГК и ГТ] сначала происходило снижение концентрации МДА, обусловленное активацией ферментов стрессового ответа. Минимальное содержание МДА в листьях было зафиксировано на 6 день группы для ГК и на 8 день затопления для группы ГТ]. Далее происходило повышение концентрации МДА, которая росла вплоть до окончания затопления. Следует замети :ь, что скорость нарастания содержания МДА у растений группы ГТ1 была значительно ниже чем у ГК, и к окончанию эксперимента содержание МДА в листьях группы ГК было на 32% выше чем у трансгенных растений ГТ1.

-»-ГК -4 ГТ,-в-АК .*.-АТ1 -»-ГК *- ГГ,-в-АК ~ АТ,

Рис. 10. Изменение активности СОД в Рис. 11. Изменение активности КАТ в листьях пшеницы листьях пшеницы

Динамику развития перекисного окисления липидов можно также оценить по состоянию антиоксидантной системы защиты, включающей ферменты-детоксикаторы, ингибирующие разные этапы возможной активации ПОЛ, такие как супероксиддисмутаза (СОД), элиминирующая анион-радикалы супероксида, переводя их в перекись водорода, и каталаза (КАТ), снижающая уровень эндогенной Н2О2 в клетке. Результаты эксперимента показали, что активация ферментов антиоксидантной защиты начинается сразу после начала затопления у обеих групп ГТ, и ГК и

сопровождается ростом активности ферментов СОД и КАТ. Активность СОД (рис. 10) достигает максимального значения на 6 день у ГК и на 8 день у ITi. Далее активность СОД начинает падать. Падение активности СОД, в то время как стрессовый фактор все еще продолжает действовать, говорит о неспособности антиоксидантной системы защиты дальше ингибировать развитие ПОЛ (Monk et al., 1987). В этот период начинается активное увеличение содержания МДА и у затопленных растений начинают появляться признаки старения. Все это говорило о переходе реакции растений в фазу истощения, характеризующуюся исчерпанием адаптационных возможностей организма (Барабой, 1991). Поэтому время начала и скорость снижения активности СОД, может говорить о разнице устойчивости растений к почвенной гипоксии. Аналогичная зависимость наблюдается и в динамике изменения активности каталазы (рис. 11).

10. Изучение морфогенетического потенциала каллусных линий, полученных от трансгенных растений пшеницы с геном ipt

Воспроизведение растений в культуре незрелых зародышей пшеницы может идти двумя путями: соматический эмбриогенез и органогенез (Сельдимирова и др., 2007). Органогенез, в свою очередь, может протекать при сопряженном развитии почек и корней (гемморизогенез) либо независимом формировании стеблей (геммогенез) или корней (ризогенез). При этом фитогормоны играют роль основных регуляторов морфогенеза в условиях культуры in vitro (Бутенко, 1999). Следовательно, большой интерес представляло изучение влияния экспрессии гена ipt на морфогенетический потенциал каллусной культуры, полученной от трансгенных растений пшеницы. В ходе эксперимента определяли следующие показатели: количество образовавшихся каллусов, количество морфогенных каллусов, количество ризогенных каллусов, а также количество полученных регенерантов (табл. 7).

Вид растении-доноров Число

Эксплан-тов Каллусов Морфогенных каллусов Ризогенных каллусов Регенерантов

Контроль 120 115 69 22 51

Трансгенные растения 120 116 82 5 127

Данные исследования показали, что при выращивании растений-доноров в теплице и контрольные и трансгенные Т[ растения обладали высокой частотой каллусогенеза в культуре незрелых зародышей. Частота образования клеточных линий для контроля составляла 95,8%, а для растений Т] - 96,7%. Важным показателем для характеристики морфогенетических свойств растений, вводимых в культуру in vitro, является частота образования морфогенных линий, то есть линий, потенциально способных регенерировать растения. Так частота образования морфогенных линий у растений Т] была на 18,8% выше чем у контроля и было получено 82 морфогенных каллуса. Частота ризогенеза у контроля составляла 18,3%, а у трансгенных растений всего 4,2%.

Растения-регенеранты были получены и от контрольных и от Tj растений. Однако их количество существенно различалось. Так от растений Ti было получено 127 регенерантов, а от контроля 51 регенерант. Причиной различия морфогенетического потенциала у каллусных линий, полученных от контрольных и Т] растений пшеницы скорее всего является изменение баланса фитогормонов, за счет повышения содержания эндогенных цитокининов в клетках трансгенных растений.

выводы

Г. Разработан эффективный способ агробактериальной трансформации пшеницы, позволяющий использовать в качестве растительного экспланта прорастающие семена.

2. Получены трансгенные растения пшеницы сорта «Энита», содержащие и экспрессирующие встроенные гены изопентенилтрансферазы (ipt) и неомицинфосфотрансферазы (nptll).

3. Показано наследование встроенных генов в первом семенном поколении.

4. Трансформированные растения Т0 были морфологически неоднородны и составляли две фенотипические группы. Первая группа растений была схожа с нетрансформированными растениями, но имела более высокую кустистость и продленный период вегетации. Вторая группа, характеризовалась очень высокой кустистостью, низкорослостью и отсутствием фертильных колосьев.

5. Показано, что после корневого затопления трансгенные растения Ti превосходили нетрансгенные по росту и продуктивности.

6. Фаза истощения адаптационных возможностей к образовавшимся во время затопления активным формам кислорода у трансгенных растений наступала позже, чем у нетрансгенных, и характеризовалась снижением активности ферментов антиоксидантной защиты супероксиддисмутазы и каталазы и ростом концентрации малонового диальдегида.

7. Показано, что каллусные ткани, полученные от трансгенных растений пшеницы, показали большую способность к морфогенезу in vitro, чем каллусы от нетрансгенных растений.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Степанова А.Ю., Терешонок Д.В., Гладков Е.А., Долгих Ю.И. Осипова Е.С. Получение трансгенных растений пшеницы (Triticum aestivum L.) методом агробактериальной трансформации. // Биотехнология. - 2006. -№ 2. -С. 20-27.

2. Майсурян А.Н., Овчинникова В.Н., Степанова А.Ю., Долгих Ю.И., Терешонок Д.В., Мартиросян Ю.Ц., Харченко П.Н. Агробактериальная трансформация ячменя. // Биотехнология. - 2006. - № 6. - С. 57-61.

3. Степанова А.Ю., Терешонок Д.В., Гладков Е. А., Осипова Е.С, Долгих Ю.И Способ получения трансгенных однодольных растений in vitro. Патент на изобретение №2301519. Опубликован 27.06.2007 г., бюллетень № 18.

4. Stepanova A.Yu., Osipova E.S., Tereshonok D.V., Gladkov E.A., Dolgikh Yu.I. Optimization of a method Agrobacterium-mediated transformations of wheat and lawn grass Festuca rubra. // Abstract III Intern. Symposium "Biotechnology in plant industries, animal industries and veterinary science". Moscow. Russia. October 18-19. - 2004. - P. 80-81.

5. Степанова А.Ю., Терешонок Д.В., Гладков E.A., Долгих Ю.И. Сравнение исходных и трансгенных растений, содержащих ген ipt по морфологическим характеристикам. // Тезисы докладов IV Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток». Звенигород. 12-16 декабря. - 2005. - С. 86.

6. Терешонок Д.В., Степанова А.Ю., Осипова Е.С., Долгих Ю.И. Генетическая трансформация пшеницы. // Тезисы докладов 2-го Всероссийского симпозиума «Физиология трансгенного растения и проблемы биобезопасности». Москва. 22-25 октября. - 2007. - С. 69.

7. Терешонок Д.В., Степанова А.Ю. Разработка генноинженерной биотехнологии получения растений пшеницы (Triticum aestivum L.), устойчивых к затоплению. // Тезисы докладов Научной конференции студентов и молодых ученых МГУИЭ. - 2008. - С. 4.

Подписано в печать:

22.04.2009

Заказ № 1912 Тираж -130 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Терешонок, Дмитрий Викторович

ВВЕДЕНИЕ.-5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.- 8

1.1. Влияние переувлажнения почвы на растения.- 8

1.2. Механизмы адаптации растений к анаэробному стрессу.- 12

1.2.1. Морфолого-анатомические приспособления растений к анаэробному стрессу.- 13

1.2.2. Метаболическая адаптация растений к гипоксии и аноксии.- 14

1.3. Гормональная регуляция при гипоксии и аноксии.- 15

1.4. Образование активных форм кислорода при анаэробном стрессе- 17

1.5. Биотехнологические подходы создания устойчивых к анаэробному стрессу растений.- 19

1.5.1. Клеточная селекция.- 19

1.5.2. Генетическая инженерия.- 20

1.6. Методы, применяемые при получении трансгенных растений пшеницы.- 25

1.6.1. Поглощение ДНК протопластами пшеницы.- 25

1.6.2. Электропорация.- 27

1.6.3. Баллистическая трансформация пшеницы.;.- 29

1.6.4. Агробактериальная трансформация пшеницы.- 32

1.7. Фитогормоны.- 35

1.8. Общая характеристика цитокининов.- 36

1.8.1. История открытия.-371.8.2. Химическая структура и функции.- 38

1.8.3. Биосинтез цитокининов.- 42

1.8.3.1. Прямой путь биосинтеза цитокининов.- 42

1.8.3.2. Биосинтез цитокининов из тРНК.- 45

1.8.4. Метаболизм цитокининов в растениях.- 47

1.8.4.1. Конъюгация цитокининов в растении.- 48

1.8.4.2. Разрушение цитокининов в растениях.- 50

1.9. Получение трансгенных растений с геном ipt.- 52

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.- 55

2.1. Растительный материал.- 55

2.2. Среды для культивирования растений и растительных тканей. - 56

2.3. Получение каллуса и регенерация растений пшеницы.- 57

2.4. Характеристика вектора для трансформации.- 58

2.5. Среды и условия для культивирования агробактерии.- 58

2.6. Методы молекулярной биологии.- 59

2.6.1. ПЦР-атализ ДНК трансгенных "растений.- 59

2.6.2. Анализ транскрипции генов методом ОТ-ПЦР.- 60

2.6.3. Гибридизация ДНК по Саузерну.- 60

2.7. Определение содержания МДА.- 61

2.8. Определение активности супероксиддисмутазы.- 61

2.9. Определение активности каталазы.- 62

2.10. Статистическая обработка результатов.- 62

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ.- 64

3.1. Получение трансгенных растений пшеницы.- 64

3.1.1. Обоснование выбора экспланта для трансформации.- 64

3.1.2. Подбор оптимальной концентрации селективного агента.- 66

3.1.3. Освобождение от бактериальной инфекции.- 69

3.1.4. Выбор оптимальной схемы агробактериальной трансформации. - 69

3.2. Анализ трансформированных растений.- 75

3.3. Морфологические особенности трансгенных растений.- 80

3.4. Изучение наследования встроенных генов.- 84

3.5. Анализ транскрипции введенных генов.- 87

3.6. Анализ устойчивости трансгенных растений пшеницы в условиях корневого затопления.- 90

3.6.1. Создание условий корневого затопления.- 90

3.6.2. Анализ воздействия корневого затопления на рост и развитие растений.

3.6.3. Активность антиоксидантной энзиматической системы в растениях пшеницы в условиях корневого затопления.

3.7. Изучение морфогенетического потенциала каллусных линий, полученных от трансгенных растений пшеницы с геном ipt.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение и анализ трансгенных растений пшеницы (Triticum aestivum L.) с агробактериальным геном изопентенилтрансферазы (ipt)"

Актуальность проблемы. Пшеница является ведущей продовольственной культурой в мире, в том числе и на территории Российской Федерации. Фактическая урожайность современных сортов пшеницы во многом лимитируется воздействием абиотических и биотических стрессов. Одним из распространенных абиотических стрессов на территории России является затопление полей, происходящее в весенний и осенний периоды, а также в периоды зимних оттепелей. Затопление полей ливневыми и паводковыми водами приводит к почвенной гипоксии, которая является причиной преждевременного старения растений (Dong et al., 1983), приводит к хлорозу листьев, некрозам, дефолиации (Ginkel et al., 1992), прекращению роста (Huang and Johnson, 1995) и уменьшению урожая (Musgrave, 1994, Boru, 1996).

Так в среднем в мире ежегодно подвергаются затоплению 20% площади, используемой для возделывания пшеницы (Setter, T.L., Waters, I., 2003). В результате потеря урожая на затапливаемой территории составляет от 34 до 60%, в основном, за счет уменьшения массы и количества зерна (Setter, T.L., Waters, 2003; Musgrave I., M.E., Ding N, 1998).

Известно, что за формирование устойчивости у растений к таким неблагоприятным факторам как засоление, недостаток или избыток влаги отвечает множество различных генов и регуляторных систем (Agarwal and Grover, 2006). С развитием генетической инженерии стало возможным изучение механизмов стрессового ответа путем манипуляции с единичными генами, не затрагивая другие характеристики растений. Благодаря этому можно оценить вклад конкретных признаков в формирование комплексного механизма устойчивости растений к различным стрессам окружающей среды.

В литературе имеются данные о положительном влиянии экзогенных цитокининов при затоплении растений (Бахтенко, Платонов, 1999), в связи с чем, Zhang et al. (2003) было выдвинуто предположение, что повышение уровня эндогенных цитокининов должно улучшать выживаемость растений в условиях затопления. Создание трансгенных растений с измененным уровнем цитокининов при встраивании в растения гена ipt, кодирующего изопентенилтрансферазу - ключевого фермента синтеза цитокинина, почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens, могло бы изменить устойчивость растений к почвенной гипоксии и послужить удобной моделью для изучения роли этого гормона в защитных реакциях растений на затопление.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось получение и анализ трансгенных растений пшеницы с геном изопентенилтрансферазы {ipt).

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать метод агробактериальной трансформации пшеницы.

2. Получить трансгенные растения пшеницы с агробактериальным геном биосинтеза цитокининов ipt.

3. Исследовать морфологические особенности полученных растений.

4. Провести анализ экспрессии и наследования введенных генов.

5. Исследовать устойчивость полученных трансгенных растений к корневому затоплению.

Научная новизна работы. Разработан новый способ агробактериальной трансформации пшеницы in planta с использованием в качестве растительного экспланта прорастающих семян. С применением данного метода были впервые получены трансгенные растения пшеницы, содержащие и экспрессирующие агробактериальный ген ipt. Впервые для пшеницы было показано влияние введенного гена ipt на устойчивость растений к воздействию корневого затопления. Изучена динамика процессов перекисного окисления липидов у трансгенных растений пшеницы в условиях затопления. Проведено исследование морфогенетического потенциала у каллусных линий, полученных от трансгенных растений пшеницы с геном ipt.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Терешонок, Дмитрий Викторович

выводы

1. Разработан эффективный способ агробактериальной трансформации пшеницы, позволяющий использовать в качестве растительного экспланта прорастающие семена.

2. Получены трансгенные растения пшеницы сорта «Энита», содержащие и экспрессирующие встроенные гены изопентенилтрансферазы {ipt) и неомицинфосфотрансферазы (nptll).

3. Показано наследование встроенных генов в первом семенном поколении.

4. Трансформированные растения Т0 были морфологически неоднородны и составляли две фенотипические группы. Первая группа растений была схожа с ^трансформированными растениями, но имела более высокую кустистость и продленный период вегетации. Вторая группа, характеризовалась очень высокой кустистостью, низкорослостью и отсутствием фертильных колосьев.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Современные методы биотехнологии, такие как генетическая инженерия, открывают новые возможности для создания растений с заранее заданными свойствами, в том числе и устойчивых к абиотическим стрессам. Трансгенные растения пшеницы были получены в ряде лабораторий мира, при этом большинство современных методик по получению трансгенных растений пшеницы предусматривают этап культивирования тканей in vitro, что имеет ряд недостатков. Во-первых, появляется зависимость от морфогенетического потенциала культивируемых тканей. Во-вторых, условия in vitro могут привести к появлению сомаклональных вариантов, в том числе, и устойчивых к селективному агенту. Кроме этого, растения-регенеранты могут обладать пониженной фертильностью, жизнеспособностью, нести различные уродства.

В настоящей работе в качестве эксплантов для трансформации было предложено использовать прорастающие семена пшеницы, что позволяло исключить из метода стадии культивирования тканей in vitro и регенерации растений. На основании этого был разработан новый способ агробактериальной трансформации пшеницы in planta. Эффективность и универсальность предложенного нами метода трансформации была подтверждена для других однодольных и двудольных растений: ячменя (Майсурян и др., 2006), томатов и газонной травы овсяницы (Степанова и др., 2006, 2008).

При использовании данного метода были получены трансгенные растения пшеницы сорта «Энита», содержавшие и экспрессирующие встроенные гены изопентенилтрансферазы {ipt) и неомицинфосфотрансферазы {nptll). Частота трансформации составляла от 3,6 до 8,0 %. Наличие и экспрессия генов были доказаны различными методами, включающими: ПЦР, гибридизацию по Саузерну и ОТ-ПЦР.

Введение целевого гена ipt в растения пшеницы положительно сказывалось на их устойчивости к корневому затоплению, выражавшееся значительно меньшим снижением ростовых процессов и урожайности по сравнению с растениями дикого типа. Известно, что во время корневого затопления нарушаются кооперативные связи побегов и корней, и надземные части, несмотря на то, что находятся в аэробных условиях, также страдают от стресса, поэтому нам было важно оценить состояние надземных побегов во время затопления. Процесс перекисного окисления липидов ускоряется в результате действия практически всех неблагоприятных факторов, в том числе и затопления, и может являться универсальным критерием, оценивающим состояние клеток. Нами было показано, что во время затопления процессы перекисного окисления липидов в листьях трансгенных растений происходили менее интенсивно, чем у обычных растений, что говорило о более высокой стабильности клеточных мембран этих растений. Таким образом, трансгенные растения могли значительно дольше сохранять свою жизнеспособность и функциональность при воздействии анаэробного стресса.

Данные результаты указывают на перспективность биотехнологических методов для получения толерантных к дефициту кислорода растений, которые можно использовать как в практической деятельности, так и для изучения механизмов устойчивости к кислородной недостаточности.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Терешонок, Дмитрий Викторович, Москва

1. Альмейда A.M., Вризен В.Х., ван дер Стрэтен Д. Молекулярные и физиологические механизмы избегания затопления и приобретения выносливости к нему у риса // Физиология растений. 2003. Т. 50. С. 832-840.

2. Андрейцева Е.А., Лутова Л.А. Устойчивость к солям меди и никеля у IPT-трансгенных растений картофеля. // Экологическая генетика, 2004. Т. 2. № 3. С. 25-31.

3. Баврина Т.В., Ложникова В.Н., Махачкова И., Грянко Т.И. Трансформанты Табаков модель для изучения роли фитогормонов в цветении и плодоношении // Физиология, растений. 1999. Т. 46. С. 226-230.

4. Барабой В.А. Механизмы стресса и перекисное окисление липидов. // Успехи соврем, биологии. 1991. Т. 111. Вып. 6. С. 923.

5. Батыгина Т.Б. Эмбриогенез и морфогенез половых и соматических зародышей // Физиология растений. 1999. Т. 46. № 6. С. 884-898.

6. Бахтенко Е.Ю., Платонов А.В. Динамика цитокининов при почвенном затоплении. // Агрохимия. 2004. № 6. С. 51-55.

7. Бахтенко Е.Ю., Скоробогатова И.В., Карсункина Н.П. Роль гормонального баланса при адаптации растений к затоплению. // Известия РАН серия биол. 2007. № 6. С. 682-690.

8. Бекина P.M., Гусейнова В.Е. Фотосинтез и фотоокислительные процессы // Физиология растений. 1986. Вып. 1. с 171.

9. Брагина Т.В., Родионова Н.А., Гринева Г.М. Образование этилена и активация гидролитических ферментов при адаптации проростков кукурузы к частичному затоплению // Физиология растений. 2003. 'Т. 50. С. 886-890.

10. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М.: ФБК-ПРЕСС 1999 - 160 с.

11. Веселов С.Ю., Кудоярова Г.Р., Мустафина А.Р., Вальке Р. Динамика содержания цитокининов в трансгенных и нетрасформированных проростках табака под влиянием теплового шока. // Физиология растений. 1995. Т. 42. № 5. С. 696-699

12. Владимиров Ю.А., Арчаков А.Н. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М: Наука 1972. — 252 с.

13. Гринева Г.М. Регуляция метаболизма у растений при недостатке кислорода: М.: Наука 1975. - 278 с.

14. Гринева Г.М., Борисова Т.А., Гарковенкова А.Ф., Ахриф Г.М, Брагина Т.В. Влияние длительного затопления на экссудацию, дыхание и анатомическое строение корней кукурузы // Физиология растений. 1986. Т. 33. № 5. С. 987-995.

15. Гринева Г.М., Брагина Е.И. Структурные и функциональные параметры формирования адаптаций к затоплению у кукурузы // Физиология растений. 1993. Т. 40. № 4. С.662-667.

16. Данилова С.А., Долгих Ю.И. Стимуляция регенерации растений в культуре тканей кукурузы под действием антибиотика цефотаксима // Физиология растений. 2004. Т. 51. № 4. С. 621-625.

17. Ежова Т.А. Генетический контроль тотипотентности растительных клеток в культуре in vitro. // Онтогенез. 2003. Т. 34. № 4. С. 245-252.

18. Емельянов В.В., Кирчихина Н.А., Ласточкин В.В., Чиркова Т.В. Гормональный баланс проростков пшеницы и риса в условиях аноксии. // Физиология растений. 2003. Т. 50. № 6. С. 1-8.

19. Емельянов В.В., Чиркова Т.В. Свободные формы гормонов в растениях различающихся по устойчивости к недостатку кислорода, в условиях аэрации и анаэробиоза // Вестн. СПбГУ. 1996. Сер. 3. Вып. 2. № 10. С. 73-81.

20. Калашников Ю.Е., Балахнина Т.И., Закржевский Д.А. Действие почвенной гипоксии на активацию кислорода и систему защиты от окислительной деструкции в корнях и листьях ячменя. // Физиологиярастений. 1994. Т. 41. № 4. С. 583-588.

21. Копертех Л.Г., Бутенко Р.Г. Нативные фитогормоны экспланта и морфогенез пшеницы in vitro II Физиология растений. 1995. Т. 42. № 4. С. 555-558.

22. Круглова Н.Н. Морфогенез в культуре пыльников пшеницы: эмбриологический подход. Уфа: Гилем. 2001. - 203 с.

23. Кулаева О.Н. Гормональная регуляция физиологических процессов у растений на уровне синтеза РНК и белка. 41-е Тимирязевское чтение. М.: Наука,- 1982.- 83 с.

24. Кулаева О.Н. Цитокинины, их структура и функция. М.: Наука. -1973.-264 с.

25. Кулаева О.Н., Кузнецов В.В. новейшие достижения и перспективы в области изучения цитокининов. // Физиология растений. 2002. Т. 49. № 4. С. 626-640.

26. Кучук Н.В. Генетическая инженерия высших растений Киев: Наукова думка. 1997. - 152 стр. ;

27. Лутова Л.А., Проворов Н.А., Тиходеев О.Н., Тихонович И.А., Ходжайова Л.Т., Шишкова С.О. Генетика развития растений. СПб.: Наука. 2000. - 539 с.

28. Майсурян А.Н., Овчинникова В.Н., Степанова А.Ю., Долгих Ю.И., Терешонок Д.В., Мартиросян Ю.Ц., Харченко П.Н. Агробактериальная трансформация ячменя. // Биотехнология. 2006. № 6. С. 56-61.

29. Муромцев Г.С., Чкаников Д.И., Кулаева О.Н., Гамбург К.З. Основы химической регуляции роста и продуктивности растений. М.: ВО Агропромиздат. 1987. - С. 80-133.

30. Осипов А.Н., Азизова О.А., Владимиров Ю.А. Активные формы кислорода и их роль в организме. Успехи биол. химии. М.: Наука — 1972 — Т. 31, С. 181.

31. Пирузян Э.С. Основы генетической инженерии растений Москва:I1. Наука 1988 -304 стр.

32. Ралдугина Г.Н., Горелова С.В., Кожемякин А.В. Стабильность и наследование трансгеннов в растениях рапса. // Физиология растений. 2000. Т. 47. № 3. С. 437-445.

33. Романов Г.А. Международный симпозиум «Ауксины и цитокинины в развитии растений» (хроника) // Физиология растений. 2000. Т. 47. С. 166-169.

34. Романов Г.А. Цитокинины и тРНК: новый взгляд на старую проблему // Физиология растений. 1990. Т. 37. С. 1196-1210.

35. Сельдимирова О.А., Веселова С.В., Катасонова А.А., Зайцев Д.Ю., Круглова Н.Н. Иммуноферментный анализ каллусов яровой мягкой пшеницы. // Известия Челябинского научного центра. 2007. Вып. 1, С. 131-135.

36. Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты Современные методы в биохимии. М.: Медицина. - 1977. - С.66-68.

37. Степанова А.Ю., Полякова Л.И., Долгих Ю.И., Вартапетян Б.Б. Реакция культивируемых клеток сахарного тростника Saccharum officinarum на аноксию и отбор устойчивой клеточной линии. // Физиология растений. 2002. Т. 49. С. 451-458.

38. Степанова А.Ю., Терешонок Д.В., Гладков Е.А., Долгих Ю.И. Осипова Е.С. Получение трансгенных растений пшеницы (Triticum aestivum) методом агробактериальной трансформации. Биотехнология. 2006 г. №2. С.20-27

39. Терентьев П.В., Ростова Н.С. Практикум по биометрии. JL: Издательство ЛГУ. 1977. - 152 с.

40. Фролова Н.В., Матвеева Т.В., Лутова Л.А. Использование метода агробактериальной трансформации in vivo для получения фенокопий опухолеобразования у безопухолевой линии редиса Raphanus sativus L. // Биотехнология. 2004. № 4. С. 3-7.

41. Харинарайн Р.П., Долгих Ю.И., Гужов Ю.Л. Выбор оптимальных сред для массовой регенерации растений сахарного тростника из каллусной культуры // Физиология растений. 1996. Т. 43. С. 111-115.

42. Чернядьев И.И. Онтогенетические изменения фотосинтетического аппарата и влияние цитокининов // Прикладная биохимия и микробиология. 2000а. Т. 36. С. 611-625.

43. Чернядьев И.И. Фотосинтез и цитокинины: Обзор // Прикл. биохимия и микробиология. 1993. Т. 29. № 5. С. 644-674

44. Чернядьев И.И. Фотосинтез листьев сахарной свеклы в онтогенезе при обработке растений 6-бензиламинопурином и метрибузином // Физиология растений. 20006. Т. 47. № 2. С. 183-189.

45. Чиркова Т.В., Белоногова В.А. Активность нитратредуктазы зерновых культур в условиях переувлажнения // Агрохимия. 1991. № 5. С. 56-65.

46. Чиркова Т.В., Новицкая Л.О., Блохина О.Б. Перекисное окисление липидов и активность антиоксидантных систем при аноксии у растений с разной устойчивостью к недостатку кислорода //Физиология растений. 1998. Т. 45. № 1. С. 65-73.

47. Шепеляковская А.О., Доронина Н.В., Ламан А.Г., Бровко Ф.А., Троценко Ю.А. Новые данные о способности аэробных метилтрофных бактерий синтезировать цитокинины. // ДАН. 1999. Т. 368. С. 555-557.

48. Adams A., Zachau H.G. Serine specific transfer ribonucleic acids. 15. Some properties of the aggregates from serine specific transfer ribonucleicacids. // Eur. J. Biochem. 1968. V. 24. № 5. P. 556-558.

49. Aebi H. Catalase in vitro. И Methods Enzymology. 1984. V. 105. P. 121126.

50. Akiyoshi D.E., Klee H., Amasino R.M., Nester E.W., Gordon N.W. T-DNA of Agrobacterium tumefaciens encocodes an enzyme of cytokinin biosynthesis. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. V. 81. P. 5994-5998.

51. Altpeter F., Diaz I., McAuslane H., Gaddour K., Carbonero P. and Vasil I.K. Increased insect resistance in transgenic wheat stably expressing trypsin inhibitor CMe. // Molecular Breeding. 1999. V. 5. P. 53-63.

52. Altpeter F., Vasil V., Srivastava V. and Vasil I.K. Integration and expression of the high-molecular-weight glutenin subunit lAxl gene into wheat. //Nature Biotechnology. 1996a. V. 14. P. 1155-1159.

53. Altpeter F., Vasil V., Srivastava V., Stoger E. and Vasil I.K. Accelerated production of transgenic wheat (Triticum aestivum L.) plants. // Plant Cell Reports. 19966. V. 16. P. 12-17.

54. Amoah B.K., Wu H., Sparks C. and Jones H.D. Factors influencing Agrobacterium-mediated transient expression of uidA in wheat inflorescence tissue. // Journal of Experimental Botany. 2001. V. 52. P. 1135-1142.

55. Arbona V., Hossain Z., Lopez-Climent M.F., Perez-Clemente R.M., Gomes-Cadenas A. Antioxidant enzymatic activity is linked to waterlogging stress tolerance in citrus. // Physiologia Plantarum 2008. V. 132. P. 452-466.

56. Armstrong D.J. Cytokinin oxidase and the regulation of cytokinin degradation. In DWS Мок, MC Мок, eds, Cytokinins: Chemistry, Activity, and Function. // CRC Press, Boca Raton, FL. 1994. P. 139-154

57. Armstrong W., Brandle R., Jackson M.B. Mechanisms of flood tolerance in plants // Acta Bot. Neerl. 1994. V. 43. № 4. P. 307-358.

58. Astot C., Dolezal K., Nordstrom A., Wang Q., Kunkel Т., Moritz Т., Chua N.H., Sandberg G. An alternative cytokinin biosynthesis pathway. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. № 26. P. 14778-14783.

59. Atwell B.J., Thomson C.J., Greenway H., Ward G., Waters I. A study of the impaired growth of roots Zea mays seedlings at low oxygen concentrations // Plant Cell and Environment. 1985. V. 8. P. 179-188.

60. Barry G.F., Rogers S.G., Fraley R.T., Brand L. Identification of a cloned cytokinin biosynthetic gene. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. V. 81. P. 4776-4780.

61. Bates G.W. Electroporation of plant protoplasts and tissues. // Methods in Cell Biology V. 50 / Eds. D.W. Galbraith, D.P. Bourque, H.J. Bohnert -New York: Acad. Press. 1995. P. 363 - 373.

62. Bieri S. Potrykus I. and Futterer J. Expression of active barley seed ribosome-inactivating protein in transgenic wheat. // Theoretical and Applied Genetics. 2000. V. 100. P. 755-763.

63. Blechl A.E. and Anderson O.D. Expression of a novel high-molecular-weight glutenin subunit gene in transgenic wheat. // Nature Biotechnology. 1996. V. 14. P. 875-879.

64. Bliffeld M., Mundy J., Potrykus I. and Futterer J. Genetic engineering of wheat for increased resistance to powdery mildew disease. // Theoreticaland Applied Genetics. 1999. V. 98. P. 1079-1086.

65. Blokhina O., Virolainen E., Fagerstedt K.V. Antioxidants, oxidative damage and oxygen deprivation stress: a Review // Annals of Botany. 2003. V. 90. P. 179-194.

66. Blokhina O.B., Virolainen E., Fagerstedt K.V., Hoikkala A., Wahala K., Chirkova T.V. Antioxidant status of anoxia-tolerant and -intolerant plant species under anoxia and reaeration // Physiologia Plantarum. 2000. V. 109.P. 396-403.

67. Bommineni V.R., Jauhar P.P. and Peterson T.S. Transgenic durum wheat by microprojectile bombardment of isolated scutella. // Journal of Heredity. 1997.V. 88.P. 301-313.

68. Born G. Expression and Inheritance of Tolerance to Waterlogging Stresses in Wheat (Triticum aestivum L.). // Ph. D. Thesis, Oregon State University, Corvallis, OR. 1996 - 88 pp.

69. Brandle R. Kohlehydratgehalte und vitalitat isolierter rhizome von Phragmites australis, Schoenoplectus lacustris und Tupha latifilia nach mehrwochigen 02 mangelstress // Flora. 1985. V. 177. P. 317-321.

70. Brzobohaty В., Moore I., Kristoffersen P., Bako L., Campos N., Schell J., Palme K. Release of active cytokinin by a beta-glucosidase localized to the maize root meristem. // Science. 1993. V. 262. № 5136. P. 1051-1054.

71. Brzobohaty В., Moore I., Palme K. // Cytokinin metabolism: implications for regulation of plant growth and development. // Plant Mol. Biol. 1994. V. 26. №5. P. 1483-1497.

72. Bucher M., Brandle R., Kuhlemeier C. Ethanolic fermentation in transgenic tobacco expressing Zumomonas mobilis pyruvate decarboxylase // Enbo J. 1998. V. 14. P. 327-335.

73. Bultynck L., Geuns J.M., Van Ginkel G., Caubergs R.J. Properties of plasma membranes of Phsp 70-ipt transformed tobacco (Nicotiana tabacum). //Phytochemistry. 1997. V. 45. P. 1337-1341.

74. Burnap R.L., Sherman L.A. Detection mutagenesis in Synechocyctis sp.

75. РСС6803 indicates that the Mn-stabilizing protein of photosystem II is not essential for 02 evolution. // Biochemistiy. 1991. Jan. 15. V. 30. P. 440446.

76. Burrows W.J., Carr D.T. Effects of flooding the root system of sunflower plants on cytokinin in the xylem sap // Physiologia Plantarum. 1969. V. 22. P. 1105-1112.'

77. Cai S.B., Cao Y., Yan J.M., Fang X.W. and Zhu. W. Genotypes in response to hypoxia and subsequent resumption of aeration. // Crop Science. 1994. V. 34. P. 1538-1544.

78. Cannell R.Q., Calusk, Shaydon R.A., Suhatt R.A. Effects of short term waterlogging on the growth and yield of peas (Pisum sativum L.) // Ann. Appl. Biol. 1979. V. 93. № 3. P. 327-335

79. Caiy A.J., Liu W., Howell S.H. Cytokinin action is coupled to ethylene in its effects on the inhibition of root and hypocotyl elongation in Arabidopsis thaliana seedlings.//Plant Physiol. 1995. V. 107. P. 1075-1082.

80. Chatfield J.M., Armstrong D.J. Regulation of Cytokinin Oxidase Activity in Callus Tissues of Phaseolus vulgaris L. cv Great Northern. // Plant Physiol. 1986. V. 80. P. 493-499.

81. Chen C.M. Biosynthesis and enzymic regulation of the interconversion of cytokinin. Metabolism and molecular activities of cytokinins. // Eds Guern J., Peaud-Lenoel C. Heidelberg: Springer-Verlag. 1981. P. 34-43.

82. Chen D.F. and Dale P.J. A comparison of methods for delivering DNA to wheat: the application of wheat dwarf virus DNA to seeds with exposed apical meristems. // Transgenic Research. 1992. V. 1. P. 93-100.

83. Chen C.M. Cytokinin biosynthesis and interconversion // Physiologia

84. Plantarum. 1997. V. 101. P. 665-673.

85. Cheng M., Fry J.E., Pang S., Zhou H., Hironaka C.M., Duncan D.R., Conner T.W., Wan Yu. Genetic Transformation of Wheat Mediated by Agrobacterium tumefaciens. II Plant Physiol. 1997. V. 115. P. 971-980.

86. Chibbar R.N., Kartha K.K., Leung N., Qureshi J. and Caswell K. Transient expression of marker genes in immature zygotic embryos of spring wheat (Triticum aestivum L.) through microprojectile bombardment. // Genome. 1991. V. 34. P. 453-460.

87. Coenen C., Lomax T.L. Auxin-cytokinin interactions in higher plants: old problems and new tools. // Trends Plant Sci. 1997. V. 2. P. 351-356.

88. Davies M.S., Hillman G.C. Effects of soil flooding on growth and grain yield of population of tetraploid and hexaploid species of wheat // Annals of Botany. 1988. V. 62. № 6. P. 597-604.

89. De Block M., Debrouwer D. and Moens T. The development of a nuclear male sterility system in wheat. Expression of the barnase gene under the control of tapetum specific promoters. // Theoretical and Applied Genetics. 1997. V. 95. P. 125-131.

90. Dekeyser R.A., Claes В., De Rycke R.M.U. Transient gene expression in intact and organized rice tissues. // Plant and Cell. 1990. V. 2. iss. 7. P. 591-602.

91. Dellaporta S.L., Wood J., Hicks J.B. A plant DNA miniprepration: version II. //Plant. Mol. Biol. 1983. Rep. 1. P. 19-21.

92. Dobrzanska M, Krysiak C, Kraszewska E Transient and stable transformation of wheat with preparations delivered by a biolistic method // Acta Physiol Plant. 1997. V. 19. P. 277-284.

93. Dong J.G. and Yu S.W. Effect of cytokinin on senescence and ethylene production in waterlogged wheat plants. // Aeta Phytophysiologia Sinica. 1984. V. 10. P. 55-62.

94. Dong J.G., Yu Z.W. and Yu S.W. Effect of increased ethylene production during different periods on the resistance of wheat plants to waterlogging. // Acta Phytophysiologia Sinica. 1983. V. 9. P. 383-389.

95. Doree M., Guern J. Short-term metabolism of some exogenous cytokinins in Acer Pseudoplatanus cells // Biochim. Biophys. Acta. 1993. V. 304. P. 611-622.

96. Drew M.C., Sisworo E.S. The development of waterlogging damage in young barley plants in relation to plant nutrient status and changes in soil properties //New Phytologist. 1979. V. 82. P. 302-314.

97. Durand J.M., Bjork G.R., Kuwae A., Yoshikawa M., Sasakawa C. The modified nucleoside 2-methylthio-N6-isopentenyladenosine in tRNA of Shigella flexneri is required for expression of virulence genes. // J. Bacteriol. 1997. V. 179. № 18. 5777-5782.

98. Eklof S., Astot C., Blackwell J., Moritz Т., Olsson O., Sandberg G. Auxin-cytokinin interaction in wild-tipe and transgenic tobacco // Plant Cell. Physiol. 1997. V. 38. P. 225-235.

99. Emery R.J., Ma Q., Atkins C.A. The forms and sources of cytokinins in developing white lupine seeds and fruits. // Plant Physiol. 2000. V. 123. P. 1593-1604.

100. Fromm M.E., Taylor L.P., Walbot V. Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1985. V. 82. P. 5824-5825.

101. Gan S., Amasino R.M. Cytokinins in plant senescence: from spray and pray to clone and play // BioEssays. 1996. V. 18. P. 557-565.

102. Gan S., Amasino R.M. Inhibition of leaf senescence by autoregulated production of cytokinin. // Science. 1995. V. 270. P. 1986-1988.

103. Gaudin V., Vrain Т., Jouanin L. Bacterial genes modifying hormonal balances in plants // Plant Physiol. Biochem. 1994. V. 32. P. 11-29.

104. Giannopolitis C.N. and Ries S.K. Superoxide Dismutases I. Occurrence in higher plants. // Plant Physiol. 1977. V. 59. P. 309-314.

105. Goicoechea N., Dolezal K., Antolin MC., Strnad M., Sanchez-Diaz M. Influence of mycorrhizae and Rhizobium on cytokinin content in drought-stress alfalfa. // J. of Exp. Bot. 1995. V. 46. P. 1543-1549.

106. Grichko V.P., Glick B.R. Ethylene and flooding stress in plants. // Plant Physiol. Biochem. 2001a. V. 39. P. 1-9.

107. Grichko V.P., Glick B.R. Flooding tolerance of transgenic tomato plants expressing the bacterial enzyme ACC diaminase controlled by the 35S, rolD or PRB-1 b promoter. // Plant Physiol. Biochem. 20016. V. 39. P. 1925.

108. Guang-Min X.I.A. and Zhong-Ti L.I. (1999). Transgenic plant regeneration from wheat (Triticum aestivum L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens. Acta Phytophysicologica Sinica. 1999. V. 25. P. 22- 28.

109. He D.G., Mouradev A., Yang Y.M., Mouradeva E. and Scott K.J. Transformation of wheat (Triticum aestivum L.) through electroporation of protoplasts. // Plant Cell Reports. 1994. V. 14. P. 192-196.

110. He G.Y. and Lazzeri P.A. Analysis and optimization of DNA delivery into wheat scutellum and tritordeum inflorescence explants by tissue elctroporation. // Plant Cell Reports. 1998. V. 18. P. 64-70.

111. Heidekamp F., Dirkse W.G., Hille J., Ormondt H. Nucleotide sequence of the Agrobacterium tumefaciens octapine Ti plasmid-encoded tmr gene. // Nucl. Acids Res. 1983. V. 11. P. 6211-6233.

112. Hess D., Dressier K., Nimmrichter R. Transformation experiments by pipetting Agrobacterium into the spikelets of wheat (Triticum aestivum L.) И Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1991. V. 25. P. 233-244.

113. Hole D.J., Cobb B.G., Hole P., Drew М.С.» Enhancement of anaerobic respiration in root tips of Zea mays following low oxygen (hypoxic) acclimation // Plant Physiol. 1992. V. 99. P. 213-218.

114. Holland M.A. Are cytokinins produced by Plants? // Plan. Physiol. 1997. V. 115. P. 865-868.

115. Horgan R., Cytokinins. In "Advance Plant Physiology" // Wilkins M.B., Ed., Pitman, London. 1984. P. 53-75.

116. Houba-Herin N., Pethe C., dAlayer J., Laloue M. ytokinin oxidase from Zea mays', purification, cDNA cloning and expression in moss protoplasts. //Plant J. 1999. V. 17. P. 615-26.http://wheat.pw.usda.gOv/ggpages/awn/45/Textfiles/USKS.html#anchor36 7934

117. Huang B.R. and Johnson J.W. Root respiration and carbohydrate status of two wheat genotypes in responses to hypoxia. // Annals of Botany. 1995. V. 75. P. 427-432.

118. Ismond K.P., Dolferus R., Pauw M., Dennis E.S., Good A.G. Enhanced low oxygen survival in Arabidopsis through increased metabolic flux in the fermentative pathway. // Plant Physiology. July 2003. V. 132. P. 12921302.

119. Jackson M.B. Plant and crop response to waterlogging of the soil //Aspects of Appl. Biol. 1983. V. 4. P. 99-116.

120. Jackson M.B., Armstrong W. Formation of aerenchyma and the processesof plant vertilation in relation to soil flooding and submergence // Plant Biol. 1999. V. 1. P. 274-287.

121. Jackson M.B., Kowalewska A.K.B. Positive and negative messages from roots induce foliar desiccation and stomatal closure in flooded pea plants // J. Exp. Bot. 1983. V. 34. P. 493-506.

122. Jackson M.B., Long-distance signaling from roots to shoots assessed: the flooding story. // J. Exp. Bot. 2002. V. 53. P. 391-398.

123. James E.K., Crawford R.M.M. Effect of oxygen availability on nitrogen fixation by two Lotus species under flooded conditions // J. Exp. Bot. 1998. V. 49. № 320. P.599-609.

124. Johnson J.R., Cobb B.G., Drew M.C. Hypoxic induction of anoxia tolerance in root tips of Zea mays. // Plant Physiol. 1989. V. 91. P. 837841. ■ i

125. Jones R.J., Schreiber B.M.N. Role of cytokinin oxidase in plants // Plant

126. Growth Regul. 1997. V. 23. P. 123-136.

127. Kakimoto T. Biosynthesis of cytokinins. // J. Plant Res. 2003. V. 116. P. 233-139.

128. Kakimoto T. Plant cytokinin biosynthetic enzymes as dimethylallyl diphosphate: ATP/ADP isopentenyl-transferases. // Plant Cell Physiol. 2001. V. 42. P. 677-685.

129. Kaminek M., Armstrong D.J. Genotypic Variation in cytokinin oxidase from phaseolus callus cultures. // Plant Physiol. 1990. V. 93. P. 1530-1538.

130. Karp A. Somaclonal variation as a tool for crop improvement. // Euphytica. 1995. V. 85. P. 295 302.

131. Kasahara H., Takei K., Ueda N., Hishiyama S., Yamaya Т., Kamiya Y., Yamaguchi S., Sakakibara H. Distinct isoprenoid origins of cis- and trans-zeatin biosyntheses in Arabidopsis. // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 14049-14054.

132. Kawase M. Role of cellulase in aerenchyma development in sunflower // Am. J. Hot. 1979. V. 66. P. 183-190.

133. Kende H., van der Knaap E., Cho H.T. Deepwater rice: a model plant to study stem elongation // Plant Physiol. 1998. V. 118. P. 1105-1110.

134. Khanna H.K. and Daggard G.E. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of wheat using a superbinaiy vector and a polyamine-supplemented regeneration medium. // Plant Cell Rep. 2002. V. 21. P. 429-436.

135. Klee H., Romano C. The roles of phytohormones in development as studied in transgenic plants. // Critical Rev. in Plant Sciences. 1994. V. 13. P. 311-324.

136. Klein Т. M., Wolf E.D., Wu R. and Sanford J.C. High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. // Nature. 1987. V. 327. P. 70-73.

137. Klein T.M. and Jones T.J. Methods of genetic transformation: The gene gun. In: Vasil, I.K. ed. Molecular Improvement of Cereal Crops. // Kluwer

138. Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands. 1999. P. 21-42.

139. Kloti A., Iglesias V.A., Wijnn J., Burkhardt P.K., Datta S.K. and Potrykus I. Gene transfer by electroporation into intact scutellum cells of wheat embryos. //Plant Cell Reports. 1993. V. 12. P. 671-675.

140. Krapp A, Hofmann B, Schafer C, Stitt M. Regulation of the expression of rbcS and other photosynthetic genes by carbohydrates: a mechanism for the "sink regulation" of photosynthesis. // The Plant Journal 1993.V. 3. P. 817-828.

141. Kulaeva O.N., Karavaiko N.N., Selivankina S.Yu., Zemlyachenko Ya.V., Shipilova S.V. Recepter of trans-zeatin involved in transcription activation by cytokinin. // FEBS Lett. 1995. V. 366. P. 26-28.

142. Kunkel Т., Niu Q.W., Chan Y.S., Chua N.H. Inducible isop>entenyl transferase as a high-efficiency marker for plant transformation. // Nat. Biotechnol. 1999. V. 17. P. 916-919.

143. Kuroha Т., Kato H., Asami Т., Yoshida S., Kamada H., Satoh S. A trans-zeatin riboside in root xylem sap negatively regulates adventitious root formation on cucumber hypocotyls. // Journal of Experimental Botany. 2002. V. 53. №. 378. P. 2193-2200

144. Laloue M., Fox J.E. Cytokinin Oxidase from Wheat: Partial Purification and General Properties. // Plant Physiol. 1989. V. 90. P. 899-906.

145. Lander H.M. An essential role for free radicals and derived species in signal transduction. // FASEB J. 1997. V. 11. P. 118-124.

146. Leckband G. and Lorz H. Transformation and expression of a stilbene synthase gene of Vitis vinifera L. in barley and wheat for increased fungal resistance. I I Theoretical and Applied Genetics. 1998. V. 96. P. 1004-1012.

147. Lee В., Murdoch K., Topping J., Kreis M. and Jones M.G.K. Transient gene expression in aleurone protoplasts isolated from developing caryopses of barley and wheat. // Plant Molecular Biology. 1989. V. 13. P. 21-29.

148. Letham D.S. Zeatin, a factor inducing cell division isolated from Zea mays.1.fe Sci. 1963. V. 8. P. 569-573.

149. Li Y., Hagen G., Guilfoyle T.J. Altered morphology in transgenic tobacco plants that overproduce cytokinins in specific tissues and organs. // Dev Biol. 1992. V. 153. P. 386-395.

150. Loreti E., Yamaguchi J., Alpi A., Perata P. Sugar modulation of a-amilase genes under anoxia. //Ann. Bot. 2003. V. 91. Spec. Iss. P. 143-148.

151. Lorz H., Baker B. and Schell J. Gene transfer to cereal cells mediated by protoplast transformation. // Molecular and General Genetics. 1985. V. 199. P. 178-192.

152. Mahalakshmi A. and Khurana P. Agrobacterium-mediated gene delivery in various tissues and genotypes of wheat (Triticum aestivum L.). // Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology. 1995 V. 4. P. 55-59.

153. Mahalakshmi A., Maheshwari S.C. and Khurana P. High frequency divisions in leaf base protoplasts of wheat (Triticum aestivum L.). // Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology. 1993. V. 2. P. 61-65.

154. Mallick N., Mohn F.H. Reactive oxygen species: response of algal cells. // J. Plant Physiol. 2000. V. 157. P. 183-193.

155. Maniatis Т., Fritch F., Sambrook J. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. // New York: Cold Spring Harbor Lab. 1989.

156. Marks M.S., Kemp J.M., Woolston C.J. and Dale P.J. Agroinfection of wheat: A comparision of Agrobacterium strains. I I Plant Science. 1989. V. 63. P. 247-256.

157. Martin R.C., Мок M.C., Мок D.W. Isolation of a cytokinin gene, ZOG1, encoding zeatin O-glucosyltransferase from Phaseolus lunatus. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. № 1. P. 284-289.

158. McGaw B.A., Heald J.K., Horgan R. Dihydrozeatin metabolism in radishseedlings //Phytochemistry. 1984. V. 23. P. 1373-1377.

159. McGaw B.A., Horgan R. Cytokinin catabolism and cytokinin oxidase. // Phytochemistry. 1983. V. 22. P. 1103-1105

160. McManmon M., Crawford R.M.M. A metabolic theory of flooding tolerance: the significance of enzyme distribution and behaviour // New Phytologist. 1971. V. 70. № 2. P. 299-306.

161. Medford J.I., Hordan R., El-Sawi Z., Klee H.J. Alterations of endogenous cytokinins in transgenic plants using a chimeric isopentenyl transferase gene//Plant Cell. 1989. V. l.P. 403-413.

162. Merritt F., Kemper A., Tallman G. Inhibitors bf ethylene synthesis inhibit auxin-indused stomatal opening in epidermis detached from leaves of Vicia faba // Plant and Cell Physiol. 2001. V. 42. P. 223-230.

163. Mi Q.L., Velazhahan R., Muthukrishnan S., Liang G.H. Wheat transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens. Annual Wheat Newsletter. V. 45 online. 2000.1. Available from:http://wheat.pw.usda.goV/ggpages/awn/45/Textfiles/USKS.html#anchor36 7934

164. Miller C., Skoog F., Okumura F., von Saltza M., Strong F. Isolation structure and synthesis of kinetin, a substance promoting cell division. // J. Am. Chem. Soc. 1956. V. 78. P. 1375-1384.

165. Miyawaki K., Matsumoto-Kitano M., Kakimoto T. Expression of cytokinin biosynthetic isopentenyltransferase genes in Arabidopsis: tissue specificity and regulation by auxin, cytokinin, and nitrate. // Plant J. 2004. V. 37. 128138.

166. Moller E.M., Bahnweg G., Sandermann H., Geiger H.H. A simple and efficient protocol for isolation of high molecular weight DNA from filamentous fungi, fruit bodies, and infected plant tissues. // Nucleic. Acids Res. 1992. V. 20. № 22. P. 6115-6116.

167. Monk L.S., Fagerstedt K.V., Crawford M.M. Superoxide Dismutase as an

168. Anaerobic Polypeptide. // Plant Physiol. 1987. V. 85. P. 1016-1020.

169. Mooney P.A., Goodwin P.B., Dennis E.S., Llewelleyn D.J. Agrobacterium tumefaciens-gene transfer into wheat tissues // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1991. V. 25. P. 209-218.

170. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. // Physiol. Plant. 1962. V. 15. P. 473-497.

171. Musgrave M.E. Waterlogging effects on yield and photosynthesis in eight winter wheat cultivars. // Crop Sci. 1994. V. 34. P. 1314-1318.

172. Nandi S.K., Palni L.M., Parker C.W. Dynamics of Endogenous Cytokinins during the Growth Cycle of a Hormone-Autotrophic Genetic Tumor Line of Tobacco. // Plant Physiol. 1990. V. 94. P. 1084-1089.

173. Noctor G., Foyer C.H. Ascorbate and glutathione: Keeping Active Oxygen Under Control. // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1998. V. 49. P. 249-279.

174. Palni L.M., Summons R.E., Letham D.S. Mass Spectrometric Analysis of Cytokinins in Plant Tissues : V. Identification of the Cytokinin Complex of

175. Datura Innoxia Crown Gall Tissue. // Plant Physiol. 1983. V. 72. P. 858863.

176. Qi-xian Lai, Zhi-yi Bao, Zhu-jun Zhu, Qiong-qiu Qian, Bi-zeng Mao. Effects of osmotic stress on antioxidant enzymes activities in leaf discs of PSAG12-ZPJ modified gerbera // Journal of Zhejiang University Science B. 2007. V. 8. P. 458-464.

177. Quirino В., Noh Y-S., Himelblau E., Amasino R.M. Molecular aspects of leaf senescence // Trends in Plant Science. 2000. V. 5. P. 278-282.

178. Rahman M., Glover A., Peacock W.J., Dennis E.S., Ellis M.H. Effects of manipulation of pyruvate decarboxylase and alcohol dehydrogenase levels on the submergence tolerance of rice. // Australian J. Plant Physiology. 2001. V. 28. P. 1231-1241.

179. Rasco-Gaunt S., Riley A., Barcelo P. and Lazzeri P.A. Analysis of particle bombardment parameters to optimise DNA delivery into wheat tissues. //

180. Plant Cell Reports. 1999. V. 19. P. 118-127.

181. Ricard В., van Toai Т., Chourey P., Saglio P.H. Evidence for the critical role of sucrose synthase for anoxic tolerance of maize roots using a double mutant//Plant Physiol. 1998. V. 116. P. 1323-1331.

182. Rinaldi A.C., Comandini O. Cytokinin oxidase strikes again. // Trends Plant Sci. 1999. V. 4. № 8. P. 300.

183. Ryu SB., Wang X. Expression of phospholipase D during castor bean leaf senescence. //Plant Physiol. 1995. V. 108. P. 713-719.

184. Sa G., Mi M., He-chun Y., Ben-ye L., Guo-feng L., Kang C. Effects of ipt gene expression on the physiological and chemical characteristics of Artemisia annua L. // Plant Sci. 2001. V. 160. P. 691-698.

185. Saab I.N., Sachs M.M., Flooding-induced xyloglucan endo-transglucosylase homolog in maize in responsive to ethylene and associated with aerenchyma // Plant Physiol. 1996. V. 112. P. 385-391.

186. Sachs Т., Thimann K.V. The role of auxins and cytokinins in the release of buds from dominance // American J. Bot. 1967. V. 54. P. 136.

187. Sato Т., Harada Т., Ischizawa K. Stimulation of glycolysis in anaerobicelongation of pondweed (Potamogeton distinctus) turions // J. Exp. Bot. 2002. V. 53. P. 1847-1856.

188. Schmulling Т., Beinsberger S., De Greef J., Schell J., Van Onckelen H., Spena A. Construction of a heat-inducible chimeric gene to increase the cytokinin content in transgenic plant tissue. // FEBS Lett. 1989. V. 249. P. 401-406

189. Schwartz D. An example of gene fixation resulting from selective advantage in suboptimal conditions // Am. Natural. 1969. P. 479-481.

190. Scott H.D., DeAngulo J., Daniels M.B., Wood L.S. Flood duration effects on soybean growth and yield // Agron. J. 1989. V. 81. P. 631-636.

191. Sharma D.P. and Swarup A. Effect of nutrient composition of wheat in alkaline soils. // Journal of Agricultural Science (UK). 1989. V. 112. P. 191-197.

192. Smart C., Scofield S., Bevan M., Dyer T. Delayed leaf senescence in tobacco plants transformed with tmr, a gene for cytokinin production in Agrobacterium // Plant Cell. 1991. V. 3. P. 647-656.

193. Smigocki A. Cytokinin content and tissue distribution in plants transformed by a reconstructed isopentenyl transferase gene. // Plant Mol. Biol. 1991 V. 16. P. 105-115.

194. Smigocki A., Neal J.W. Jr., McCanna I., Douglass L. Cytokinin-mediated insect resistance in Nicotiana plants transformed with the ipt gene. // Plant Mol. Biol. 1993. V. 23. P. 325-335.

195. Soejima H., Sugiyama Т., Ishihara К. Changes in chlorophyll contents of leaves and levels of cytokinins in root exudates during ripening of rice cultivars Nipponbare and Akenohoshi. // Plant Cell Physiol. 1995. V. 36. P. 1105-1114.

196. Sorokin A.P., Ke X.Y., Chen D.F. and Elliott M.C. Production of fertile transgenic wheat plants via tissue electroporation. // Plant Science. 2000. V. 156. P. 227-233.

197. Sparrow L.A. and Uren N.C. The role of manganese toxicity in crop yellowing on seasonally waterlogged and strongly acidic soils in northeastern Victoria. // Australian Journal of Experimental Agriculture. 1987. V. 27. P. 303-307.

198. Strnad M., Peters W., Beck E., Kaminek M. Immunodetection and Identification of N-(o-Hydroxybenzylamino)Purine as a Naturally Occurring Cytokinin in Populus x canadensis Moench cv Robusta Leaves. // Plant Physiol. 1992. V. 99. P. 74-80.

199. Summers Y.E., Ratcliffe R.G., Jackson M.B., Anoxia tolerance in the aquatic monocot Potamogeton pectinatus: absence of oxygen stimulates elongation in association with unusually Pasteur effect // J. Exp. Bot. 2000. V. 51. P. 1413-1422.

200. Tadege M., Brandle R., Kuhlemeier C. Anoxia tolerance in tobacco roots: effect of overexpression of pyruvate decarboxylase. // The Plant Journal.1998. V. 14. P. 327-335.

201. Takei К., Sakakibara H., Sugiyama T. Identification of genes encoding adenylate isopentenyltransferase, a cytokinin biosynthesis enzyme, in Arabidopsis thaliana. I/ J. Biol. Chem. 2001. V. 256. P. 26405-26410.

202. Takumi S, Shimada T Variation in transformation efficiencies among six common wheat cultivars through particle bombardment of scutella tissues // Genes Genet Syst. 1997. V. 72. P. 63-69.

203. Takumi S., Murai K., Mori N. and Nakamura C. Trans-activation of a maize Ds transposable element in transgenic wheat plants expressing the Ac transposase gene. // Theoretical and Applied Genetics. 1999. V. 98. P. 947-953.

204. Tang K., Wu A., Yao J., Qi H., Lu X. Development mediated transformation and genetic analysis based selektion. // Acta Biotech. 2000. V. 20. iss. 2. P. 175-183.

205. Trought M.C.T., Drew M.C. Effects of waterlogging on young wheat plants (Triticum aestivum L.) and on soil solutes at different soil temperatures // Plant and Soil. 1982. V. 69. P. 311-326.

206. Van Toai T.T., Bom G., Zhang J. Flooding tolerance of crops // Encyclopedia of Soil Science. 2002. P. 1-3.

207. Vartapetian B.B. Introduction: Life without Oxygen / Plant Life in Anaerobic Environments // Eds Hook D.D., Crawford R.M.M. Ann. Arbor, Michigan: Ann. Arbor Sci. 1978. P. 1-12.

208. Vartapetian B.B., Andreeva I.N., Generozova I.P., Polyakova L.I., Maslova I.P., Dolgikh Y.I.,Stepanova A.Yu. Functional electron microscopy in studies of plant response and adaptation to anaerobic stress. // Ann. Bot. 2003. V. 91. P. 155-172.

209. Vartapetian B.B., Andreeva I.N., Kozlova G.I. The resistance to anoxia and the mitochondria fine structure of rice seedlings. // Protoplasma. 1976. V. 88. P. 215-224.

210. Vartapetian B.B., Andreeva I.N., Kozlova G.I., Agapova L.P. Mitochondrial ultrastructure in roots of mesophyte and hydrophyte at anoxia and after glucose feeding. // Protoplasma. 1977. V. 91. P. 243-256.

211. Vartapetian B.B., Jackson M.B. Plant adaptations to anaerobic stress. // Ann. Bot. 1977. V. 79. suppl. A. P. 3-30.

212. Vasil V., Brown S.M., Re D., Fromm M.E. and Vasil I.K. Stably transformed callus lines from microprojectile bombardment of cell suspension cultures of wheat. // Biotechnology. 1991. V. 9. P. 743-747.

213. Vasil V., Castillo A.M., Fromm M.E. and Vasil I.K. Herbicide resistant fertile transgenic wheat plants obtained by microprojectile bombardment of regenerable embryogenic callus. // Biotechnology. 1992. V. 10. P. 667674.

214. Vasil V., Srivastava V., Castillo A.M., Fromm M.E. and Vasil I.K. Rapid production of transgenic wheat plants by direct bombardment of cultured immature embryos.//Biotechnology. 1993. V. 11. P. 1553-1558.

215. Voesenek L.A.C.J., Peeters A.J.M. Submergence-induced shoot elongation: plant hormones and microarrays // Abst. 8th Congr. Int. Soc. Plant Anaerobiosis (Perth. West Australia). 2004. P. 44.

216. Vriezen W.H., Zhou Z., van der Straeten D. Regulation of submergenceinduced enhanced shoot elongation in Oryza sativa L. // Ann. Bot. 2003. V. 91. Spec. Iss. P. 263-270.

217. Wadman-van-Schravendijk H., van Andel O.M. Interdependence of growth, water relations and abscisic acid level in Phaseolus vulgaris during waterlogging // Physiologia plantarum. 1985. V. 63. P. 215-220.

218. Wang Y.C., Klein T.M., Fromm M., Cao J., Sanford J.C.and Wu R. Transient expression of foreign genes in rice, wheat and soybean cells following particle bambardment. // Plant Molecular Biology. 1988. V. 11, P. 433-439.

219. Warner G.J., Rusconi C.P., White I.E., Faust J.R. Identification and sequencing of two isopentenyladenosine-modified transfer RNAs from Chinese hamster ovary cells. // Nucleic. Acids Res. 1998. V. 26. № 23. P. 5533-5535.

220. Waters I., Armstrong W., Thompson C.J, Setter T.L., Adkins S. Diurnal changes in radial oxygen loss and ethanol metabolism in roots of submerged and non-submerged rice seedlings // New Phytologist. 1989. V. 113. P. 439-451.

221. Waters I., Kuiper P.J.C., Watkin E., Greenway H., Colmer T.D. Effects of anoxia eat seedlings: I. Interaction between anoxia and other environment factors. //J. Exp. Bot. 1991a. V. 42. P. 1427-1435.

222. Waters I., Morel S., Greenway H., Colmer T.D. Effects of anoxia on wheat seedlings: II. Influence of O2 supply prior to anoxia on tolerance to anoxia. Alcoholic fermentation and sugar levels // J. Exp. Bot. 19916. V. 42, P.1437-1447.

223. Weeks J.T., Anderson O.D. and Blechl A.E. Rapid production of multiple independent lines of fertile transgenic wheat (Triticum aestivum). // Plant Physiology. 1993. V. 102. P. 1077-1084.

224. Werner Т., Hanus J., Holub J., Schmulling Т.,-Van Onckelen H., Strnad M. New cytokinin metabolites in IPT transgenic Arabidopsis thaliana plants. // Physiol Plant. 2003. V. 118. P. 127-137.

225. Werner Т., Motyka V., Strand M., Schmulling Th. Regulation of plant growth by cytokinin. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98. P. 1048710492.

226. Werr W. and Lorz H. Transient gene expression in a Gramineae cell line. // Molecular and General Genetics. 1986. V. 202. P. 471-475.

227. Woolston C.J., Barker R., Gunn H., Boulton M.I. and Mullineaux P.M. Agroinfection and nucleotide sequence of cloned wheat dwarf virus DNA. // Plant Molecular Biology. 1988. V. 11. P. 35-43.

228. Wu H., Sparks C., Amoah B. and Jones H.D. Factors influencing successful Agrobacterium-med\atQd genetic transformation of wheat. // Plant Cell Rep. 2003. V. 21. P. 659-668.

229. Wu J.G., Liu S.F., Li F.R. and Zhou J.R. Study on the effect of wet injury on growth and physiology winter wheat. // Acta Agriculture Universitatis Henanensis. 1992. V. 26. P. 31-37.

230. Xia J.H., Saglio P.H. H4" efflux and hexose transport under imposed energy status in maize root tip. //Plant Physiol. 1990.V. 93. P. 453-459.

231. Xia J.H., Saglio P.H., Roberts J.K.M. Nucleotide levels do not critically-determine survival of maize root tips acclimated to a low oxygen environment. //Plant Physiol. 1995. V. 108. P. 589-595.

232. Yagisawa F., Mori Т., Higashiyama Т., Kuroiwa H., Kuroiwa T. Regulation of Brassica rapa chloroplast proliferation in vivo and in cultured leaf disks. //Protoplasma. 2003. V. 222. P. 139-148.

233. Yusibov V.M., II P.C., Andrianov V.M., Piruzian E.S. Phenotypically normal transgenic T-cyt tobacco plants as a model for the investigation of plant gene expression in response to phytohormonal stress. // Plant Mol. Biol. 1991. V. 17. P. 825-836.

234. Zaghmout O.M.F. Transformation of protoplasts and intact cells from slowly growing embryogenic callus of wheat (Triticum aestivum L.). // Theoretical and Applied Genetics. 1994. V. 89. P. 577-582.

235. Zambryski P., Joos H., Genetello C., Leemans J., Van Montagu M. and

236. Schell J. Ti plasmid vector for the introduction of DNA into plant cells without alteration of their normal regeneration capacity. // EMBO Journal. 1983. V. 2. № 12. P. 2143-2150.

237. Zhang J., van Toai Т., Huynh L., Preiszner J. Development of flooding-tolerant Arabidopsis thaliana by autoregulated cytokinin production. // Molecular Breeding. 2000a. V. 6. P. 135-144.

238. Zhang L., Rybczynski J.J., Langenberg W.G., Mitra A. and French R. An efficient wheat transformation procedure: transformed calli with long-term morphogenic potential for plant regeneration. // Plant Cell Reports. 20006. V. 19. P. 241-250.

239. Zhou H., Stiff C.M. and Konzak C.F. Stably transformed callus of wheat by electroporation-induceddirect gene transfer. // Plant Cell Reports. 1993. V. 12. P 612-616.

Информация о работе

Терешонок, Дмитрий Викторович
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.23

Диссертация

Получение и анализ трансгенных растений пшеницы (Triticum aestivum L.) с агробактериальным геном изопентенилтрансферазы (ipt) - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Получение и анализ трансгенных растений пшеницы (Triticum aestivum L.) с агробактериальным геном изопентенилтрансферазы (ipt) - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы