Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение молекулярно-генетических аспектов опухолеобразования у редиса Raphanus sativus

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение молекулярно-генетических аспектов опухолеобразования у редиса Raphanus sativus"

Р Г Б ОД

САНКТ-ПЕ'ГЕРЬУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕГСЙ/ГцМаЙ 23Ш

На правах рукописи УДК 575.1:581.143.6

МАТВЕЕВА Татьяна Валерьевна

(ПУЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ АСПЕКТОВ ОПУХ О Л Е О Б Р А ЗО И А И ИЯ У РЕДИСА КЛРНЛЫиЬ БАТ1\'№

специальность 03. 00. 15 - Генетика

АВ'1 ОРЕФЕРАТ жссешапии па соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ-2000

Работа выполнена на кафедре генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного университета

Научный руководитель:

профессор,

доктор биологических наук Л.А. Лутова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук С.А. Гостимский кандидат биологических наук H.A. Проворов

Ведущее учреждение: Всероссийский Институт Растениеводства им. Вавилова

Защита диссертации состоится " " Лу^ЛЛ 2000 года в " часов на заседании Диссертационного совета Д 063.^7.21 по тащите диссертаций на соискание ученой степепи доктора биологических наук в Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, СПбГУ. биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке Санкт-Петербургского университета.

Автореферат разослан " у*"'' iM&jiHik. 2000 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат биологических наук Л.А. Мамон

ПЪЭ/.Цо

£ /гь г # о

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Контролируемая генетически способность к опухолеобразованию является одной из распространенных аномалий морфогенеза растений. Генетические опухоли описаны у целого ряда видов и межвидовых гибридов. Известны по крайней мере две причины генетического опухолеобразования: это мутации растительных генов, или наличие в геноме растения последовательностей онкогенов агробактерии как результат горизонтального переноса генов в процессе эволюции. Наиболее подробно генетические опухоли изучены у межвидовых гибридов в пределах рода Ыюопапа. Однако, проведение генетического анализа у этих форм затруднительно, поскольку межвидовые гибриды стерильны, а полученные на их основе амфидиплоиды - полиплоидны.

Работа проведена с использованием уникальной генетической коллекции высокоинбредных линий редиса НарЬапиэ за^уиэ, созданная в лаборатории генетики растений БиНИИ СпбГУ С.И. Нарбут. В ней представлены линии, способные образовывать опухоли, по многим характеристикам напоминающие опухоли табака, а также линии, неспособные к опухолеобразованию. Редис, как диплоидный вид, может быть^легко подвергнут генетическому анализу, что делает его особенно ценным в экспериментах по изучению генетического контроля процесса опухолеобразования у растений. Исследование механизмов опухолеобразования у растений будет способствовать более глубокому пониманию контроля деления клеток и их дифференцировки.

Настоящая работа является частью комплексного исследования опухолеобразования у редиса, которое включает в себя изучение генетического контроля морфологических и физиологических признаков, связанных с опухолеобразованием, изучение молекулярных основ опухолеобразования: поиск в геноме редиса, последовательностей ДНК, гомологичных агробактериальным онкогенам, ЯАРО-картирование, анализ

экспрессии генов клеточного цикла, характеристику эндогенного гормонального статуса.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы является изучение молекулярных основ опухолеобразования у редиса.

В задачи работы входило:

- поиск в геноме редиса последовательностей, гомологичных онкогенам Agrobacterium tumefaciens и A. rhizogenes;

- изучение влияния деметилирующего агента — 5-азацитидина на проявление признаков, сопутствующих опухолеобразованию у редиса in vitro;

- поиск RAPD (random amplified polymorphic DNA) маркера, совместно проявляющегося с признаком "способность к опухолеобразованию" у редиса и изучение совместного наследования данных признаков.

Научная новизна работы. С . использованием молекулярно-генетических подходов, впервые удалось продемонстрировать наличие в геноме опухолеобразуюших и безопухолевых линий редиса последовательностей, гомологичных цитокининовым онкогенам А. tumefaciens. Этот результат свидетельствует о возможности в процессе эволюции горизонтального переноса генов между про- и эукариотами. Влияния деметилирующего агента - азацитидина на процесс опухолеобразования у редиса обнаружено не было, что свидетельствует об отсутствии роли эпигенетических изменений в индукции данного процесса у исследованных линий редиса. Методом RAPD-анализа удалось вскрыть полиморфизм линий редиса по данным молекулярным маркерам, а также обнаружить маркеры, характерные для опухолевых линий.

Научно-практическая ценность работы. Получение в диссертационной работе данные, свидетельствующие о наличии в геноме редиса последовательностей, гомологичных фрагменту Т-ДНК А. tumefaciens, могут быть использованы для построения моделей

горизонтального переноса генов в эволюции и выяснении роли фитогормонов в дифференцировке растительных клеток.

Обнаруженный полиморфизм RAPD маркеров послужит основой для дальнейших работ по созданию генетических карт у редиса, на которых будут присутствовать как молекулярно-генетические маркеры, так и морфологические и физиологические маркеры, определяющие развитие хозяйственно-ценных признаков этой культуры.

' Апробация работы. Результаты работы были представлены на II съезде Всероссийского общества физиологов растении (Москва. 1999). II съезде Вавилопского общества генетиков и селекционеров (Санкт-Петербург, 2000), конференциях «99th General Meeting of the American Society for Microbiology» (Chicago. USA, 1999), «9th Molecular Plant-Microbe Interactions Congress» (Amsterdam. 1999), на семинарах лаборатории генетики растений БиНИИ СПбГУ.

Объем___и стр\кт\рп диссертации. Диссертация изложена на 112

страницах, содержит II рисунком. 26 фотографин и 9 таблиц. Работа состоит из введения, глав "Обзор литературы". "Материалы и методы". "Результаты". "Обсуждение", выводов, списка литературы и приложения.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Растительный материал. В работе использованы линии редиса Raphanus sativos, созданные в лаборатории генетики растений ВиНИИ СПбГ'У. контрастно рамичатошиеся по способности к оп\хо.теобразованию на корнеплоде: nus\о.теобраз\кннис - 10.12.16.19.21 и беюп\холеные - 6. 18. 30.

Кроме того, использованы растения табака (Nicotiana glauca), а также трансгенная суспензионная культура клеточной линии Н1-11 тополя (содержащего Т-ДНК A. tumefaciens дикого типа). Данные формы были необходимы как источник ДНК, применяемой в качестве контролей в экспериментах по Саузерн-гибридизации.

Бактериальные штаммы и плазмиды. В работе использовали штаммы дикого типа Agrobacterium tumefaciens - A281(Hood et al., 1986) и Agrobacterium rhizogeiies - 8196 (Koplow cl al., 1984). Штаммы любезно предоставлены профессором Онджсем (Institut of Molecular Biology. Czech Republic).

Для получения зондов в экспериментах по блот-гибридизации по Саузерну использованы следующие плазмиды Е. coli: 1)вектор pRK.290 (Dita et al., 1981) со вставкой фрагмента EcoRI-7 Т-ДНК A. tumefaciens, содержащего гены tmr, 6b и часть локуса tms; 2)всктор pRK.290 со вставкой фрагмента BamHI-8 Т-ДНК A. tumefacicns. содержащего гены tms (Garfinkel et al.. 1981); 3) вектор pVK 102 со неганкой фрагментов II-II - 11-18 из pR¡A4b A. rhizogeiies (While el al.. 1985) Плазмиды любезно предоставлены профессором Пестером (Unversity of Washington. Seattle. USA)

Культивирование растений in vivo и in vitro, генетические и молекулярно-биологические манипуляции проводили согласно стандартным методикам (Нарбут и др, 1985; Маниатис и др., 1984; Дрейпер, Скотт, 1991; Murashige. Scoog. 1962, Birnboim, Doly, 1979). Оригинальные методы подробно описаны в диссертационной работе.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Поиск последовательностей ДНК. гомологичных онкогенам Agrobacterium tumefaciens и Agrobacterium rhizoeenes мы проводили с использованием комплекса молекулярно-генетичсских методов ( П1ДР с вырожденными и невырожденными праймерами к данным онкогенам и блот гибридизация по Саузерну). Наиболее адекватным из них оказался метод блот-гибридизации. На первом папе работы был осуществлен поиск в геноме редиса последовательное гей. i омологичпых опколгнам Agrobacterium tumefaciens и Agrobacterium rhizogeiies. методом Са\зерп -гибридизации стремя зондами последовательно.

При использовании в качестве зонда Eco RI-7 фрагмента Т-ДНК Agrobacterium tumefaciens, мы получили позитивный результат в случае всех исслсдова........ линий рсдиса (6, 10, 18,. 19). Данный зонд содержит

гены tmr, 6b, и часть локуса tins. В позитивном контроле (тополь, трансформированный A. tumefaciens дикого типа) размер гибридизовавшихся фрагментов соответствовал ожидаемому. В негативном контроле (табак) гибридизационного сигнала не наблюдали.

В результате гибридизации с использованием в качестве зонда Bam HI - 8 фрагмента Т-ДНК Agrobacterium tumefaciens (включающего гены 5, tmsl, tms2) в позитивном контроле получены фрагменты ожидаемого размера. С негативным контролем и ДНК линий редиса гибридизации не наблюдали. Сходную картину наблюдали при гибридизации ДНК редиса с последовательностью ТЛ-ДНК Agrobacterium rhizogenes.

Блот-гибридизация по Саузерну ДНК двух линий редиса (6 -безопухолевая, 10 - опухолеобразующая) с использованием в качестве зондов фрагментов генов tmr и 6Ь по отдельности показала, что оба этих гена присутствуют в геноме редиса (фото 1, 2).

Итак, в геномах всех изученных линий обнаружены только последовательности, гомологичные генам tmr и 6b (tml), которые как известно, относятся к "цитокининовым" генам. Для нас неожиданным явился факт их обнаружения в линиях обоих типов: как в опухолеобразующих, так и в неспособных образовывать опухоли. Мы предположили, что в безопухолевых линиях они ннактинированы. Поскольку инактивацию генов связывают с метилированием ДНК, в следующем эксперименте мы проанализировали влияние демегилирующего агента - азацитидина на проявление признаков, сопутствующих опу.холеобразованию, у редиса.

Влияние азацитидина па проявление признаков, сопутствующих опу.холеобразованию. у редиса (Raphanus sativus) in vitro. В наших ранних экспериментах было показано, что опухолевые линии редиса, по сравнению с безопухолевыми, обладают повышенной чувствительностью к высоким концентрациям фитогормонов. Кроме того, только опухолевые линии способны образовывать вторичные опухоли in vitro. Вторичные опухоли

s

формируются на корнеплодоподобных структурах, индуцированных цитокинином (Бузовкина и др, 1993). В своей работе мы проанализировали влияние АгаС на проявление каждого из этих признаков.

Зонд; Лиг

Зонд: gene 6b

Фото 1. Результат гибридизации по Фото 2. Результат гибридизации Саузерну ДНК двух линий редиса с по Саузерну ДНК двух линий геном Цпг редиса с геном 6Ь

В каждом из экспериментов мы использовали те линии, для которых характерно наиболее контрастное проявление исследуемых признаков. Вспомогательным этапом работы был подбор условий, при которых линии 19 и 30 редиса имели наиболее контрастные различия по признаку чувствительность к цитокинину - кинетину.

Для изучения чувствительности к кинетину сем.ядолл л листья проростков 19 и 30 линии культивировали на двух вариантах сред: с концентрацией кинетина 5 мг/л и 10 мг/л. Контрольным вариантом служила

среда МС без фитогормонов. Культивируемые на среде МС семядоли и листья обеих линий к моменту учёта оставались зелёными.

На средах с кинетином реакция эксплантов на фитогормон носила ярко выраженный качественный характер. Мы наблюдали 3 типа морфогенетических реакций: формирование каллусов, корней и некрозов. В качестве определяющего был выбран признак некрозообразование. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Наиболее контрастные различия были получены на среде с концентрацией кинетина 10 мг/л при использовании семядолей в качестве эксплантов. Их мы и использовали в последующих экспериментах.

Таблица 1.

Характеристика линий редиса 19 и 30 по чувствительности к

кинетину

Генотип Концентр. Эксплант Кол-во % чувствитель-

кинетина в эксплант ных эксплантов

среде, мг/л ов (доверительный интервал, р=0.95)

Линия 19 5 семядоли 65 32,3 (21,4 -44,3)

5 листья 38 63,2 ( 47,0 -78,0)

10 семядоли 35 80,0 (64,7-91,7)

10 листья 23 34.8 ( 16.3-56.0)

Линия 30 5 семядоли 44 22.7 ( 11.4 -36.5)

5 листья 34 29,4 (15,1 -46,2)

10 семядоли 40 32,5 ( 18,7-48,0)

10 листья 28 35,7 ( 18,7-54.8)

Мы изучили влияние азацитидина на чувствительность редиса к

цитокинину.

На рисунке 1 представлены характеристики реакции эксплантов семядолей линий 19 и 30 на цитокинин - кинетин. Безопухолевая линия 30 -не чувствительна к кинетину, характеризуется низкими баллами некротической реакции как в контрольном варианте, так и при обработке азацитидином (средний балл 1,5 и 0,9 соответственно). У чувствительной опухолевой линии 19 средний балл составляет 4,9 в контроле, 4,2 - после воздействия AzaC.

В наших ранних экспериментах было показано, что опухолевые линии обладают повышенной чувствительностью к ауксину (Бузовкина, 1993). Мы изучили влияние азацитидина на чувствительность редиса к ауксину. Характеристики реакции эксплантов семядолей линий 19, 21, 30 на ауксин 2,4-Д в концентрации 10 мг/л представлены на рисунке 2. Показано, что безопухолевая линия 30 характеризуется отсутствием некротической реакции как в контрольном варианте, так и при обработке азацитидином (средний балл 0 и 0,2 соответственно). У опухолевых линий 19 и 21 этот показатель как в опыте, так и в контроле колебался от 2,4 до 4,0 баллов.

Таким образом, влияния AzaC на чувствительность исследованных эксплантов к 2,4-Д и кинетину не обнаружено.

В эксперименте по изучению влияния AzaC на способность линий редиса к вторичному опухолеобразованию мы использовали только те линии, которые образуют in vitro корнеплодоподобные структуры (КС), индуцируемые БАП, а именно Л18 и Л21. Это связано с тем, что вторичные опухоли образуются только на КС опухолеобразующих линий (линия 21). Влияния AzaC на формирование КС и опухолеобразование нами обнаружено не было (рис. 3). Одинаковой способностью к формированию вторичных опухолей на КС в контроле и при обработке AzaC характеризовалась только опухолеобразующая линия 21.

Рестрикция ДНК из тканей опытных и контрольных эксплантов изошизомерами Mspl и Hpall показала, что в условиях нашего эксперимента азацитидин проявил себя как деметилирующий агент. Следовательно,

метилирование ДНК не является причиной различной способности линий редиса к опухолеобразованию.

Влияние АгаС на средний балл некротической реакции семядолей линий редиса на среде с 10 мг/л кинетина

вяч и

— _

--

19 к 19 АгаС 30 к ЗОАгаС

варианты опыта

Рис. 1

Влияние АгаС на средний балл некротической реакции семядолей линий редиса на среде с 10 мг/л 2,4-Д

Рис. 2

Влияние АгаС на формирование КС и вторичных опухолей у редиса

18к 18 21 к 21 АгаС АгаС

Варианты опыта

Рис. 3.

Другим объяснением того, что часть линий образуют опухоли, а часть - не образуют, может быть то, что найденые последовательности в опухолевых линиях могут отличаться от безопухолевых, так как после их встройки в геном редиса в процессе эволюции в данных генах могли возникнуть мутации. Для проверки этого предположения необходимы эксперименты по клонированию и секвенированию найденных последовательностей. Такие эксперименты проводятся в настоящее время.

Кроме того, найденные последовательности могут быть "молчащими", и следовательно, не иметь отношения к индукции опухолеобразования. В этом случае опухолеобразование контролируется целиком генами растительного происхождения. Возможно также взаимодействие «бактериальных» цитокининовых генов с какими-либо генами растительного происхождения, в результате чего часть линий становится способной образовывать опухоли. На следующем этапе работы мы предприняли попытки поиска таких генов.

Поиск ЯАРР-маркера. проявляющегося' совместно с признаком "способность к опухолеобразованию". Мы провели анализ наследования признака "способность к опухолеобразованию" у редиса в гибридных

комбинациях в пределах сорта Сакса 18x19, 19x18, 18x21, 21x18, 19x21. При скрещивании опухолевых линий с безопухолевыми в первом поколении наблюдали единообразие - все растения были безопухолевыми. Суммарные данные расщепления среди гибридов второго поколения сведены в таблице 2.

Расщепление среди гибридов 1;2 между линиями с контраетнм проявлением признака статистически не отличается от 3:1. При скрещивании двух опухолевых линий между собой наблюдали единообразие в первом и втором поколениях - все растения образовывали опухоли. Таким образом, признак контролируется как минимум одним геном и способность образовывать опухоли рецессивна по отношению к неспособности.

Таблица 2.

Наследование признака "способность к опухолеобразованию" у редиса

Гибрид Оп+ Оп- Х2(3:1)

F218x19 47 125 0,50

F218x21 11 60 3,41

F219x21 (1999 год) 11 0

После подтверждения моногенных различий по признаку "способность к опухолеобразованию" линий редиса в пределах сорта Сакса мы приступили к поиску RAPD - маркеров, проявляющихся совместно с данным признаком.

На первом этапе мы провели ПЦР, в которых матрицей служили смеси ДНК всех безопухолевых линий (смесь 1) и всех опухолевых линий (смесь 2). Были получены продукты при использовании 72 из 82 имевшихся в нашем распоряжении десятичленных праймеров. При использовании праймеров Е13, G9, J7. М9. М 15, ТЗ, Т14, Т17 (Operon) были обнаружены различия среди продуктов реакции. Данные результаты были подтверждены в двух повторностях.

На следующем этапе мы провели полинейный ПЦР анализ с использованием данных праймеров с целью поиска таких ЯАРЭ- маркеров, которые бы встречались во всех опухолевых линиях и отсутствовали во всех безрпухолевых, или наоборот встречались во всех безопухолевых линиях ц отсутствовали во всех опухолевых. Такие маркеры были обнаружены при использовании праймеров Л, М9, Т17 (фото 2>). Их мы использорали при анализе ДНК гибридов с целью поиска маркера, наследуемого сцепленно с признаком "способность к опухолеобразованию у редиса.

Фото 2. Результаты ПЦР с праймерами, с которыми были получены различия между опухолевыми и безопухолевыми линиями. (Размер фрагментов маркера молекулярного веса указан в кЬ, праймеры и номера линий редиса подписаны на рисунке. Различающиеся полосы указаны стрелкам^).

Анализ срвместного наследования способности к опухолеобразованию и молекулярных маркеров, полученных в ПЦР с праймерами .17, Т17, М9, проводил^ в гибридной комбинации 18x19, 19x18.

Результаты анализа совместного наследования опухолеобразования с каждым цз молекулярных маркеров представлены в таблице 3. Во всех вариантах нами получены данные не противоречащие гипотезе о независимом наследовании данных признаков. Таким образом, нам не

удалось обнаружить сцепления признака "способность к опухолеобразованию у редиса" ни с одним из молекулярных маркеров.

Однако, в своей работе мы показа™ наличие полиморфизма ЯАРЭ-маркеров у линий редиса. Не смотря на то. что работа была методологически нацелена на поиск маркера, сцепленного с признаком "способность к опухолеобразованию", нами были обнаружены и межсортовые различия среди 11АРО- продуктов (линии 6, 12 полученные на основе сорта Вировский белый отличались от остальных линий, полученных на основе сорта Сакса).

Таблица 3.

Анализ совместного наследования молекулярных маркеров со способностью к опухолеобразованию у редиса.

ЯАРР-маркер с праймером Оп.У КАРВ- маркер* Оп."/ НАРО- маркер' Оп.*/ ЯАРЭ- маркер* Оп.7 ЯЛРО- маркер' X" (9:3:3:1)

П 46 13 23 6 3,44

Т17 38 16 23 5 5,53

М9 23 6 8 7 7,3!

Полиморфизм ЯАРО-маркеров. обнаруженный не смотря на близкое родство линий, позволяет надеяться на \спех при вовлечении в работу новых праймеров. Среди продуктов ПЦР. которые можно получить с их использованием, необходимо проводить дальнейший поиск маркера, сцепленного с признаком "способность к опухолеобразованию". Кроме того, вскрытый полиморфизм ЯАРЭ- маркеров может быть в дальнейшем использован при маркировании генов, определяющих другие признаки у редиса.

Таким образом. в своей работе мы показали наличие последовательностей, гомологичных Г-ДНК А. ШтеГааепБ в геноме нетрансформированного редиса, что является интересным фактом, поскольку свидетельствует о возможной роли горизонтального переноса генов между про- и эукариотами в эволюции растений. К

сожалению, па .'шипом лапе рабшы нам ие удалось выяснить причину того, что часть линий рсдиса образуют опухоли, а часть линий не способна к этому. Однако, вскрытый полиморфизм RAPD- маркеров позволяет надеяться на успех при вовлечении в работу новых праймеров.

ВЫВОДЫ.

1. Изучено наследование признака "способность к опухолеобразонапию" у редиса в гибридных комбинациях 18x19. 18x21. 19x21 в пределах сорта Сакса. В данных комбинациях признак наследуется по моногенной схеме. Опухолеобразование рецессивно по отношению к неспособности образовывать опухоли.

2. Выявлена чувствительность опухолевой линии 19 редиса к цитокинину -кинетину. Показано, что наиболее контрастно различия между опухолеобразуюшей и безопухолевои линиями проявляются на среде с 10 мг/л гормона при использовании семядолей н качестве эксилан юн.

3. Методом блот-гибридизаиии по Саузерну н геномах опу.холеобразу ющих и безопухолевых линий редиса обнаружены последовательности, гомологичные генам tmr и 6b Agrobacterium tumefaciens.

4. Не обнаружено влияния деметилируюшего агента 5-азацитидина на признаки. сопутствующие опухо.теобразонанию in vitro: чувствигельнооь к ауксинам и шпокинипам. а также способность (|)ормироват I. корнсплодоподобные ст р> кт > pu и и тричные опухоли.

5. Обнаружено 3 KAI'D- маркера, проявляющихся совместно со спрособностью к опухолеобразованию. Сцепления данных признаков не

обнаружено. »

»

6. Поиск в больших растительных геномах последовательностей, гомологичных уже известным, но с неизвестным уровнем сходства по отношению к ним. предпочтительнее проводит!, методом блот-шбридизации по Сау зерну, нежели ПЦР.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Матвеева, Татьяна Валерьевна

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1 .Опухолеобразование у растений.

1.1.1 .Причины опухолеобразования у растений.

1.1.2. Опухолеобразование, вызванное агробактериями.

1.1.3. Привыкание культур растительных тканей к отсутствию фитогормонов в питательной среде in vitro.

1.1.4. Опухолеобразование у межвидовых гибридов.

1.1.5. Опухолеобразование в пределах отдельных видов растений.

1.1.6. Факторы, влияющие на процесс генетического опухолеобразования.

1.2. Инактивация генов.

1.2.1. Основные положения.

1.2.2. Транскрипционная инактивация (ТИ).

1.2.3. Посттранскрипционная инактивация (ПТИ).

1.3. Контроль клеточного цикла и опухолеобразование.

1.3.1. Опухоли арабидопсиса и клеточный цикл.

1.3.2. Отличительные особенности растительных клеток.

1.3.3. Регуляция клеточного цикла у грибов и животных.

1.3.4. Контроль клеточного цикла у растений.

1.3.5. Взаимодействие фитогормонов с основными регуляторами клеточного цикла.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Материалы.

2.2. Методы.

2.2.1. Поддержание коллекции.

2.2.2. Получение асептических растений.

2.2.3. Изучение чувствительности эксплантов к кинетину.

2.2.4. Выделение растительной ДНК.

2.2.5. Выделение ДНК агробактерий и Е. coli.

2.2.6. Поиск последовательностей ДНК, гомологичных агробактериальным онкогенам, в геноме редиса.

2.2.6.1.ПЦР с невырожденными праймерами

2.2.6.2. ПЦР с вырожденными праймерами.

2.2.6.3. Рестрикция геномной ДНК растений

2.2.6.4. Приготовление ДНК-зондов для блот-гибридизации по Саузерну.

2.2.6.5.Блот-гибридизация по Саузерну.

2.2.7. Изучение влияния азацитидина на проявление признаков, сопутствующих опухолеобразованию, у редиса in vitro.

2.2.7.1. Методы культуры in vitro.

2.2.7.2.Анализ метилирования ДНК.

2.2.8.noHCKRAPD-MapKepa, проявляющегося совместно с признаком "способность к опухолеобразованию".

6.2.9. Статистическая обработка.

Глава 3. Результаты.

3.1. Поиск последовательностей ДНК, гомологичных онкогенам Agrobacterimn tumefaciens и Agrobacterium rhizogenes.

3.1.1. Поиск последовательностей методом ПЦР с невырожденными праймерами.

3.1.2. Поиск последовательностей методом ПЦР с вырожденными праймерами.

3.1.3. Поиск последовательностей методом блот-гибридизации по Саузерну геномной ДНК редиса.

3.2.Влияние азацитидина на проявление признаков, сопутствующих опухолеобразованию, у редиса (Raphanus sativus) in vitro.

3.2.1. Изучение чувствительности к кинетину in vitro у инбредных линий редиса.

3.2.2. Влияние азацитидина на чувствительность редиса к ауксину и цитокинину.

3.2.3. Влияние азацитидина на формирование вторичных опухолей.

3.2.4.Влияние AzaC на метилирование ДНК.

3.3. Анализ наследования признака "способность к опухолеобразованию" у редиса.

3.4. Поиск RAPD-маркера, проявляющегося совместно с признаком "способность к опухолеобразованию".

Глава 4. Обсуждение.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение молекулярно-генетических аспектов опухолеобразования у редиса Raphanus sativus"

Контролируемая генетически способность к опухолеобразованию является одной из распространенных аномалий морфогенеза растений. Генетические опухоли описаны у целого ряда видов и межвидовых гибри-\ дов. Известны по крайней мере две причины генетического опухолеобра-зования: это мутации растительных генов, или наличие в геноме растения последовательностей онкогенов агробактерии как результат горизонтального переноса генов в процессе эволюции. Наиболее подробно генетические опухоли изучены у межвидовых гибридов в пределах рода №сойапа. Однако, проведение генетического анализа у этих форм затруднительно, поскольку межвидовые гибриды стерильны, а полученные на их основе амфидиплоиды - полиплоидны.

В нашем распоряжении имеется уникальная генетическая коллекция высокоинбредных линий редиса КарИапиБ зайуиз, созданная в лаборатории генетики растений БиНИИ СПбГУ. В ней представлены линии, способные образовывать опухоли, по многим характеристикам напоминающие опухоли табака, а также линии, неспособные к опухолеобразованию. Редис, как диплоидный вид, может быть легко подвергнут генетическому анализу, что делает его особенно ценным в экспериментах по изучению генетического контроля процесса опухолеобразования у растений.

Исследование механизмов опухолеобразования у растений будет способствовать более глубокому пониманию контроля деления клеток и их дифференцировки.

Наша работа является частью комплексного исследования опухолеобразования у редиса, которое включает в себя анализ экспрессии генов клеточного цикла, характеристику эндогенного гормонального статуса. 6

Целью данной работы является изучение молекулярных основ опухо-леобразования у редиса.

В задачи работы входило:

- поиск в геноме редиса последовательностей, гомологичных онкогенам Agrobacterium tumefaciens и A. rhizogenes;

- изучение влияния деметилирующего агента ~ 5-азацитидина на проявление признаков, сопутствующих опухолеобразованию у редиса in vitro;

- поиск RAPD (random amplified polymorphic DNA) маркера, совместно проявляющегося с признаком "способность к опухолеобразованию" у редиса и изучение совместного наследования данных признаков.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Матвеева, Татьяна Валерьевна

Выводы

1. Изучено наследование признака "способность к опухолеобразованию" у редиса в гибридных комбинациях 18x19, 18x21, 19x21 в пределах сорта Сакса. В данных комбинациях признак наследуется по моногенной схеме. Опухолеобразование рецессивно по отношению к неспособности образовывать опухоли.

2. Выявлена чувствительность опухолевой линии 19 редиса к цитокинину - кинетину. Показано, что наиболее контрастно различия между опу-холеобразующей и безопухолевой линиями проявляются на среде с

10 мг/л гормона при использовании семядолей в качестве эксплантов.

3. Методом блот-гибридизации по Саузерну в геномах опухолеобразую-щих и безопухолевых линий редиса обнаружены последовательности, гомологичные генам tmr и 6b Agrobacterium tumefaciens

4. Не обнаружено влияния деметилирующего агента 5-азацитидина на признаки, сопутствующие опухолеобразованию in vitro: чувствительность к ауксинам и цитокининам, а также способность формировать корнеплодоподобные структуры и вторичные опухоли. .

5. Обнаружено 3 RAPD- маркера, проявляющихся совместно со спрособ-ностью к опухолеобразованию. Сцепления данных признаков не обнаружено.

6. Поиск в больших растительных геномах последовательностей, гомологичных уже известным, но с неизвестным уровнем сходства по отношению к ним, предпочтительнее проводить методом блот-гибридизации по Саузерну, нежели ПЦР.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Матвеева, Татьяна Валерьевна, Санкт-Петербург

1. Байдербек Р. Опухоли растений // М.: Колос,1981. 303с.

2. Бузовкина И.С, Кнешке И, Лутова Л.А. Моделирование опухолеоб-разования in vitro у линий и гибридов редиса. // Генетика. Т29, N6, -1993а. С1002-1008.

3. Бузовкина И.С., Кнешке И, Лутова Л.А. Генетический анализ признакачувствительность к цитокинину in vitro". // Генетика. 19936. Т29, N6. С. 995-1001.

4. Бузовкина И.С., Лутова Л.А. Генетические, биохимические и физиологические аспекты опухолеобразования у инбредных линий редиса// Вестн. ЛГУ. -- 1991. -- Вып.2, № 10. -- С. 102-107.

5. Изучение роли фитогормонов в опухолеобразовании у редиса/ Т В. Матвеева, И.Е. Додуева, Д. Вуд и др. // Генетика 2000. Т. 36, N1. - Р. 1-6

6. Лакин Г.Ф. Биометрия,- М: Высшая школа, 1990.-352 с.

7. Нарбут С.И. Генетическая опухоль у редиса, полученная при инбридинге// Вестн. Ленингр. ун-та. 1967, №15. - С. 144-149.

8. Нарбут С.И., Войлоков A.B., Кириллова Г.А. Генетическая характеристика линий редиса Raphanus sativus var. Radicola pers.// Вестник ЛГУ. 1985. -- №24. - С.75-78.

9. Нарбут С.И., Михалевская О.Б., Войлоков A.B. Исследование опухолеобразующей способности у инбредных линий редиса// Биологические науки. 1983. № 7. - С. 87-91

10. Скотт Р., Дрейпер Дж. Выделение нуклеиновых кислот из клеток растений//Генная инженерия растений. Лабораторное руководство: Пер. с англ. М: Мир. - 1991. - С. 236-254.

11. Терентьев П. В., Ростова Н.С. Практикум по биометрии. Л.: Из-во ЛГУ, 1979.-С. 151.

12. Чернин JI.С., Авдиенко И.Д. Плазмидные гены фитогормонов и их роль в онкогенезе// Мол. Биология. 1985. - Т. 19, №4. - С. 869-889.

13. Чернин Л.С., Слуцкий A.M., Овадис М.И. Структурно-функциональная организация Т-ДНК Ti и Ri плазмид агробактерий// Молекулярные и генетические механизмы взаимодействия микроорганизмов с растениями. Сб. науч. Трудов. Пущино, 1989. - С. 6678.

14. Шишкова С О. Изучение спонтанного и индуцированного опухоле-образования у табака Nicotiana tabacum L. и редиса Raphanus sativus L. //Дисс. на соискан. уч. степ. канд. биол. наук. Санкт-Петербург. - 1991.- 150с.

15. A new open reading frame, encoding a putative regulatory protein, in Ag-robacterium rhizogenes Т-DNA/ G. Hansen., D. Vaubert, D. Clerot et al.// С R Acad Sci III 1994. - V. 317, N1. - P. 49-53.

16. A plant oncogene as a phosphatase/ F. Filippini, V. Rossi, O. Marin et al.// Nature. 1996. - V.379 - P. 499-500.

17. Ahuja M R. A cytogenetic study of heritable tumors in Nicotiana spe-cieds hybrids // Genetics. 1962. Vol. 47. - P. 865-880

18. Ahuja M.R. An hypothesis and evidence concerning the genetic components controlling tumor formation in Nicotiana// MGG. 1968. Vol. 103, №2 - P. 176-184.

19. Alteratious of endogenous cytokinins in transgenic plants using a chimeric isopentenyl transferase gene / J.I. Medford et al., // Plant Cell. Vol.1. 1989. - P403-413.

20. Ames I.H., Rice T.B., Smith H.H. Inhibition of tumor induction by auxin in totally debudded Nicotiana glauca x N. langsdorffii// Plant Physiol. — 1969 . -V. 44, N2. -P. 305-307

21. Ames I.H., Smith H.H. Effect of mercaptoethanol on tumor induction in a Nicotiana amphidiploid// Canad J.Bot. 1969. - Vol. 47. - P. 921-924.

22. An Agrobacterium transformation in the evolution of the genus Nicotiana / I.J. Furner, G.A. Huffman, R.M. Amasino et al.// Nature. 1986. Vol 319. - P. 422-427

23. Andersen RA, Linney TL Oxygen-dependent chemical tumorigenesis in a Nicotiana hybrid: inhibition by ascorbic acid and dinitrophenol //Chem. Biol. Interact. 1977 . -V.19, N3. - P. 317-325.

24. Aoki S., Syono K. Horizontal gene transfer and mutation Ndrol genes in the genome of Nicotiana glauca// PNAS. 1999. - V.96, N23. - P. 1322913234.

25. Bayer M. Genetic tumors: Physiological aspects of tumor formation in interspecies hybrids// Molecular biology of plant tumors. — 1982. P. 3367

26. Bertolla F., Simonet P. Horizontal gene transfers in the enviroment: natural transformation as a putative process for gene transfers between transgenic plants and microorganisms// Res. Microbiol. 1999. - V. 150, N6. - P. 375-384.

27. Birnboim H.C., Doly J. A. Rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA//NAR. -1919. V.7, N6. - P.1513-1523.

28. Buiatti M. The induction of tumors in the hybrid Nicotiana glauca x N. langsdorffii plants by 6-azauracil and its reversal by uracil and actinomycin D// Cancer Res . -1968. V, 28, N2.-P. 166-169.

29. Burgess J, Fleming E.N. The structure and development of a genetic tumour of the pea//Protoplasma. -- 1973. -V.76, N3. P. 315-25

30. Caetano-Anolles G., Bassam B.J. Gresshoff P.M. Primer-termplate interactions during DNA amplification fingerprinting with single arbitrary oligonucleotides// MGG. 1992. - V. 235, N2/3. - P. 157-165.

31. Campell B.R., Town C.D. Characterization of overexpressed cDNAs isolated from a hormone-autonomous, radiation-induced tumor tissue line of Arabidopsis thaliana // Plant Physiol. 1992 .Vol. 100. - P. 2018-2023

32. Cell cycle regulation by plant growth regulators: involvement of auxin and cytokinin in the re-entry of Petunia protoplasts into the cell cycle/ C. Trehin, S. Plaichais, N. Clab et al. // Planta. 1998. - V.206. - P.215-224

33. Chasan R. STARTing the plant cell cycle// Plant cell. 1995, - V.7, N. 1. -P. 1-3.

34. Chou A.Y., Archdeacon J., Kado K. Agrobacterium transcriptional regulator Ros is a procaryotic zink finger protein that regulates the plant oncogene ipt// PNAS. 1998. - V. 95. - P. 5293-5298

35. Christou P. Habituation in in vitro soybean cultures/ZPlant Physiol. 1988. - V. 88.-P. 809-812.

36. Cloning of cDNAs for genes that are specifically or preferentially expressed during the development of tobacco genetic tumors // T. Fujita, H. Kouchi, T. Ichikawa & K. Syono// Plant J. 1994. Vol. 5, №5. - P. 645-654

37. Cogoni C., Macino G. Homology-dependent gene silencing in plants and fungi: a number of variations on the same theme //Current Opinion in Microbiology. ~ 1999 . V. 2. -- P. 657-662.

38. Cyc Ms3, a novel alfalfa cyclin gene, is induced in the GO-to-Gl transition of the plant cell/1. Meskiene, L. Boegre, M. Dahl et al.// Plant Cell. -1995. V.7.— P.759-771.

39. D'Agostino I B., Kieber J.J. Molecular mechanism of cytokinin action// Curr. Opin. Plant Biol. -1999. Vol. 2. - P. 359-364.

40. De Torok. The cytologic and growth characteristics of tumor and normal clones of Picea glauca.//Cancer Res. 1968/ ~ V. 28, N 3. - P. 608-614.

41. Delayed Leaf Senescence in Tobaceo Plant Transformed with trm, a Gene to Cytokinin Production in Agrobacterium / CM Smart, et al., // the Plant Cell. Vol 3, 1991. - P647-656.

42. Distinct classes of cdc2-related genes are differentially expressed during the cell division cycle in plants/ P R. Fobert, V. Gaudin, P. Lunness// Plant Cell . 1996. - vol.8, N. 9 - P. 1465-76

43. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers// J.G.K. Whilliams, A.R. Kubelik, K.J. Livak et al.// NAR. 1990. -V. 18.-P. 6531-6535.

44. Doonan J., Fobert P. Conserved and novel regulators of the plant cell cycle// Current Opin. Cell Biol. 1997. - V. 9, N6. - P824-830.

45. Emsweller S.L., Asen S., Uhring J. Tumor formation in interspecific hybrids of Lilium// Science. 1962. - V.136. - P. 266.

46. Feng X.H., Dube S.K., Bottino P.J., Kung S.D. Restoration of shooty morphology of a nontumorous mutant of Nicotiana glauca x N. langsdorffii by cytokinin and the isopentenyltransferase gene // Plant. Mol. Biol. 1990. Vol 15,№ 3. - P. 407-420.

47. Feng X-H. Kung S-D. Identification of differentially expressedmembers of tobacco homeobox families by differential PCR// Biochemical and Biophysical Research Communications. 1994. Vol. 198, № 3. - P. 1012 -1019

48. Ferriera P., Hemerly A., Van Montagu M., Inze D. Control of cell proliferation during plant development// PMB 1994. - V. 26. - P. 1289-1303

49. Finnegan E.J., Genger R.K., Peackock W.J., Dennis E.S. DNA methyla-tion in plants// Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1998, V. 49. -P. 223-247

50. Fisher R.P. CDKs and cyclins in transition(s)// Current Opin. Genetics and Development. 1997. - V.7, N 1. - P. 32-38

51. Frundt C., Meyer A.D., Ichikawa T., Meins F.J. A tobacco homologue of the Ri-plasmid ORF13 gene causes cell proliferation in carrot root discs//MGG. 1998. - V.259, N6. - P. 559-568.

52. Fujita T., Ichikawa T., Syono K. Changes in morphology, levels of endogenous IAA and protein composition in relation to the development of tobacco genetic tumor induced in the dark// Plant Cell Physiol. 1991. Vol. 32, № 2. - P. 169-177

53. Furnerl.J., Sheikh M.A., Collet C.E. Gene silencing and homology-dependent gene silencing in Arabidopsis: genetic modifiers and DNA meth-ylation// Genetics. 1998. Vol. 149, N2. - P. 651-662.

54. Gene silencing results in instability of antibody production in transgenic plants/ M. De Neve, S. De Buck, C. De Wilde et al.// MGG. 1998. Vol. 260, N6.-P. 582-592

55. Genetic analysis of crown gall: fine structure map of the T-DNA by site directed mutagenesis/ D.J. Garfincel, R.B. Simpson, L.W. Ream et al.// Cell. 1981. - V.27. - P. 143-153

56. Genetic analysisi of the individual T-DNA genes of Agrobacterium tu-mefaciens: futher evidence that two genes are involved in indole -3-acetic acid synthesis/ D. Inze, A. Follin, M. Van Lijsebettens et al.// MGG. -1984,-V.194.-P. 265-274.

57. Genomic survey sequencing of Landsberg erecta ecotype of Arabidopsis thaliana and identification of sequence-based polymorphisms / C.R. Buell, X. Lin, G. Pai. //Unpublished (2000)

58. Gutierez C. The retinoblastoma pathway in plant cell cycle and development// Curr. Opin. Plant Biol. 1998. - V. 1. - P.492-497.

59. Hansen C.E., Meins F. J., Evidence for a cellular gene with potential oncogenic activity in plants // PNAS. 1986, № 8. - P. 2492-2495

60. Hansen C.E., Meins F., Aebi Jr.R. Hormonal regulation of zeatin-riboside accumulation by cultured tobacco cells // Planta. — 1987. Vol. 172, № 4. — P. 520-526.

61. Heidekamp F., Dirkse W.G., Hille J. et al. Nucleotide sequence of the Agrobacterium tumefaciens octopine Ti plasmid-encoded tmr gene // J Nucleic Acids Res. 1983. - V.ll, №18, - p.6211-6223.

62. Heinemann J.A., Sprague G.F. Bacterial conjugative plasmids mobilize DNA transfer between bacteria and yests// Nature. 1989. - V. 340. -P.205-209.

63. Hobbie L., Timpte C., Estelle M. Molecular genetics of auxin and cytokinin // Plant Molecular Biology. 1994. Vol 26. P. 1499-1519.

64. Hormonal Content and Sensitivity of Transgenic Tobacco and Potato Plants Expressing Single Rol Genes of Agrobacterium rhizogenes T DNA / T. Schmuelling et al // The Plant Journal Vol 3, N3. -1993. - P.371-382.

65. Hu J., van Eysden J., Quiros C.F. Generation of DNA-based markers in specific genome regions by two-primer RAPD reactions // PCR Methods Appl. 1995. - V. 4. - P. 346-351.

66. Ichikawa T., Ozeki Y., Syono K. Evidence for the expression of the rol genes of Nicotiana glauca in genetic tumors of N. glauca x N.langsdorffii // MGG. 1990. Vol. 220, №2. - P. 177-180.

67. Ichikawa T., Syono K. Tobacco genetic tumors// Plant Cell Physiol. -1991. Vol. 32, №8.-P1123 -1128

68. Induction and growth properties of carrot roots with different complements of Agrobacterium rhizogenes T-DNA/ I.Capone, L. Spano, M. Card-arelli et al.// Plant. Mol. Biol. 1989. V. 13, N1. - P.43-52.

69. Inze D. Trends in plant cell cycle research// Plant Cell. 1999. - Vol. 11, N1.-P. 1-4.

70. Inze D., Ferreira P., Hemerly A., Van Montagy M. Control of cell division in plants// Biochemical Society Transactions. 1992. - V. 20. - P. 8084.

71. Isolation and characterization of a cDNA that encodes a novel proteinase inhibitor I from a tobacco genetic tumor /T. Fujita, H. Kouchi, T. Ichikawa & K. Syono // Plant Cell Physiol . 1993. Vol. 34. - P. 137-142

72. Jeddeloh J.A., Bender J., Richards E.J. The DNA methylation locus DDM1 is required for maintainance of gene silencing in Arabidopsis// Genes Dev. 1998. - Vol. 12, N 11. - P. 1714-1725

73. Kehr A.E., Smith H.H. Genetic tumors in Nicotiana hybrids// Brookhaven Symp. Biol. 1954. - V.6. - P.55-76.

74. Klee H.S., Romano C.P. The Roles of Phyto hormones in Development as Studied in Transgenic Ploents // Critical Reviews in Plant Sciences Vol 13, N4. - 1994. - P311-324.

75. Kooter J.M., Matzke M.A., Meyer P. Listening to the silent genes: transgene silencing, gene regulation and pathogen control//Trends in Plant Science. 1999. - Vol.4, N9. - P.340-347

76. Lania L., Majello B., Napolitano G. Transkriptional control by cell-cycle regulators// J. Of Cellular Physiology. 1999. - Vol. 179. - P.143-141

77. Lees E. Cyclin dependent kinase regulation// Current Opinion in Cell Biology. 1995. - V. 7. - P. 773-780

78. Lemcke K., Schmulling T. A putative rolB gene homologue of Agrobac-terium rhizogenes TR-DNA has different morphogenetic activity in tobacco than rolB// Plant Mol. Biol. 1998. - V.36,N5. - P.803-808.

79. Lemcke K., Schmulling T. Gain of function assay identify non-rol genes from Agrobacterium rhizogenes TL-DNA that alter plant morphogenesis or hormone sensitivity// Plant J. 1998. - V. 15, N3. - P. 423-433.

80. Lew D.J., Kornbluth S. Regulatory roles of cyclin dependent kinase phosphorylation in cell cycle control// Curr. Opin. Cell Biol. 1996. V.8. -P. 795-804.

81. Littau V.C., Black L.M. Spontaneous tumors in sweet clover//Amer. Journal of Botany. 1952. - V.39. - P. 191-194.

82. Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook J. Molecular cloning lab. Manual. -1981. -P.383

83. Martin F. W. Frosty spot. A developmental disturbance on the tomato leaf// Ann Bot. 1966. - V. 30. - P. 701-709

84. Martin G.B., Williams J.G., Tanksley S.D. Rapid identification of markers linked to Pseudomonas resistance gene in tomato by using random primers and near-isogenic lines// PNAS. 1991. - V. 88, N 6. - P. 2336-2340.

85. Martin P.G.Variation in the amounts of nucleic acids in the cells of different species of higher plants// Exp Cell Res . 1966. ~ V.44, N.l. - P. 84-94

86. Matzke A.J., Matzke M.A. Position effects and epigenetic silencing of plant transgenes// Curr Opin Plant Biol. 1998 / -- V.l, N2. - P. 142-148

87. Mazodier P., Petter P., Thompson C. Integric conjugation between Escherichia coli and Streptomyces species// J. Bacteriology. 1989. - V. 171. - P. 35833585.

88. Meins F., Foster R. A cytokinin mutant derived from cultured tobacco cells // Developmental genetics. — 1985. Vol. 7, № 3. — P.159-165.

89. Meins F., Foster R., Lutz J.D. Evidence for a mendelian factor controlling the cytokinin requirement of cultured tobacco cells // Developmental genetics. — 1983. Vol. 4, № 2. — Planta. 129-141.

90. Meins F.J. Habituation of cultured plant cells// Molecular biology of plant tumors/ Ed. By Kahl G., Schell J. Academic Press, NY&L., — 1982. -P. 3-31.

91. Meyer A.D., Aebi R., Meins F.J. Tobacco plants carrying a tms locus of Ti plasmid origin and the Hl-1 allele are tumor prone// Differentiation. -1997. Vol 61, №4.-P. 213-221

92. Meyer A.D., Ichikawa T., Meins F. Horizontal gene transfer: regulated expression of a tobacco homologue of the Agrobacterium rhizogenes rolC gene// MGG. 1995. Vol. 249. - P. 265-273

93. Morla A.O., Draetta G., Beach D., Wang J.Y. Reversible tyrosine phosphorylation of cdc2: dephosphorylation accompanies activation during entry into mitosis //Cell 1989. - Vol.58, N. 1. - P. 193-203

94. Morris R.O. Genes specifying auxin and cytokinin biosinthesis in phytopato-gens// Ann. Rev. Plant Physiol. 1986. - V. 37. ~ P. 509-538.

95. Morrow R.C., Tibbitts T.W. Evidence for involvement of phytochrome in tumor development on plants // Plant Physiol. 1988 .Vol. 88. - P. 11101114

96. Murashige T., Scoog F. A revised medium for rapid growth and bioas-says for tobacco tissue culture// Physiol. Plant. 1962. - V. 115. - P. 473479.

97. Mutations in RNA polymerase II and elongation factor SII severely reduce mRNA levels in Saccharomyces cerevisiae/ J.C. 3rd Lennon, M. Wind, L. Saunders et al.//Mol .Cell Biol. 1998 . - V.18, N10. - P. 5771-5779

98. Nandi S.K., Palni L.M.S, Parker C.W. Dynamics of endogenous cytokines during the growth cycle of hormone-autotrophic genetic- tumor line of tobacco// Plant Physiol. 1990. Vol. 94. - P. 1084-1089

99. Nester E.W., Gordon M P., Amasino R.M., Yanofsky M.F. Crown gall: molecular and physiological analysis// Ann. Rev. Plant Physiol. ~ 1984. ~ V. 35. -P. 387-413.

100. Nielsen K.M., Bones A.M., Smalla K., van Elsas J.D. Horizontal gene transfer from transgenic plants to terrestrial bacteria a rare event?// FEMS Microbiol. Rev. - 1998. - V. 22, N 2 - P. 79-103

101. Nigg E.A., Gallant P., Krek W. Regulation of p34cdc2 protein kinase activity by phosphorylation and cyclin binding//Ciba Found Symp 1992. Vol. 170 -P. 72-84.

102. Nuttal V.W., Lyall L.H. Inheritance of neoplastic pods in pea// Journal of Heredity. 1964. - V.55. - P.184-186

103. Ohyama K. Chloroplast and mitochondrial genomes from liverwort, Marchantia polymorpha gene organization and molecular evolution// Biosci. Biotechnol. Biochem. - 1996. - V. 60, N1. - P. 16-24.

104. Ooms G, Hooykaas P.J., Moolenaar G., Schilperoort R.A. Grown gall plant tumors of abnormal morphology, induced by Agrobacterium tumefaciens carrying mutated octopine Ti plasmids; analysis of T-DNA functions// Gene. ~ 1981. v. 14, N1-2,- P. 33-50.

105. Physical map of the Agrobacterium rhizogenes strain 8196 virulence plasmid/ J .Koplow, M.C. Byrne, G. Jen et al.// Plasmid. 1984. - V.ll, N1. - P. 17-27 .

106. Porat R., Lu P., O'Neill S.D. Arabidopsis SKP1, a homologue of a cell cycle regulator gene, is predominantly expressed in meristematic cells// Planta -1998. Vol. 204 N.3 - P. 345-51

107. Rapid identification of Japanese potato cultivars by RAPDs/ M.Mori, K. Hosaka, Y. Umemura et al.// Jpn. J. Genet. 1993. - V. 68. - P. 167-174.

108. Rappaport J.J. Satina S., Blakeslee A.F. Extracts of ovular tumors and inhibition of embryo growth in Datura// Amer J. Bot. 1950. - V. 37. - P. 586-595

109. Riou Khamlichi C., Huntley R., Jacqmard A., Murray J.A.H. Cytokinin aktivation of Arabidopsis cell division through a D-type cyclin// Science. -1999. V. 283. - P. 1541-1544.

110. Sasaki,T., Matsumoto,T. and Yamamoto,K. Oryza sativa nipponbare(GA3) genomic DNA, chromosome 3, PAC clone:P0043E01 // Published Only in DataBase (1999) In press

111. Schaeffer G.N., Burk L.G., Tso T.S. Tumors of interspecific Nicotiana hybrids. I. Effect of temperature and photoperiod upon flowering and tumor formation// Amer J. Bot. 1966. -V. 53. - P. 928-932.

112. Schlueter K., Fuetterer J., Potrykus I. Horizontal gene transfer from a transgenic potato line to a bacterial pathogen (Erwinia chrysanthemi) occurs if it all - at an extremely low frequency// Biotechnology. - 1995. - V.13, N 10. - P. 1094—1098

113. Sequence homologous to to Agrobacterium rhizogenes T-DNA in the genomes of uninfected plants /F.F.White, D.J. Garfinkel, G.A. Huffman et al. // Nature. 1983. Vol 301, №5898. - P. 348-350

114. Shimizu S., Mori H. Analysis of cycles of dormancy and growth in pea axillary buds based on mRNA accumulation patterns of cell cycle-related genes// Plant Cell Physiol . 1998. - Vol.39, N3. -P. 255-62

115. Silencing of beta-l,3-glucanase genes in tobacco correlates with an increased abundance of RNA degradation intermediates/ G.J. van Eldik, K . Litiere, J.J. Jacobs et al.//NAR. 1998. -V. 26, N22. - P. 5176-5181.

116. Smigocki A.C. Cytokinin content and tissue distribution in plants transformed by a reconstructed isopentenyltrans ferase gene // Plant Molecular Biology Vol 16.

117. Smigocki F.C., Owens L.D. Cytokinin gene fused with a strong promotor enhances shoot organogenesis and zeatin level in transformed plant cells // Proc. Natl. Acad. Sci. Vol. 85. -1988. P. 5131-5135.

118. Smith H. The inheritance of genetic tumors in Nicotiana hybrids // J. of Heredity. 1988. Vol. 79. - P. 277-283

119. Smith H.H. Plant genetic tumors// Prog Exp Tumor Res. -- 1972. ~ V.15. -- P. 138-64

120. Spanier K., Schell J., Schreirer P.H. A functional analysis of T-DNA gene 6b: the fine tuning of cytokinin effects on shoot development// MGG. 1989. - V. 219, N 1-2. - P. 209-216

121. Sprague G.F. Genetic exchange between kingdoms// Curr. Opin. Genet. Dev. 1991. - V.l, N4. - 530-533

122. Stam M., Mol J.N.M., Kooter J.M. The silence of genes in transgenic plants// Annals of Botany. 1997. - Vol. 79. - P. 3-12.

123. T-DNA gene 5 of Agrobacterium modulates auxin response by autoregulated synthesis of a growth hormone antagonist in plants/ H. Korber, N. Strizhov, D. Staiger et al. // EMBO J. 1991. - V. 10, N13. - P. 39833991.

124. The D-type alfalfa cyclin gene cycMs4 complements G1 deficient yeast and is induced in the G1 phase of the cell cycle/ M. Dahl, I Meskiene, L. Boegre et al.//Plant Cell 1995. - V.7. - P.1847-1857

125. Thomashow L.S., Reeves S., Thomashow M.F. Crown gall oncogenesis: evidence that a T-DNA gene from the Agrobacterium Ti plasmid pTiA6 encodes an enzyme that catalyses synthesis of indole-acetic acid// PNAS. -1984. -V. 81. P. 5071-5075

126. Three discrete classes of Arabidopsis cyclins are expressed during different intervals of the cell cycle/ P. Ferreira, A. Hemerly, J. de Almeida Engler et al.// Proc. Natl. Acad. Sci . -- 1994. -- V. 91, N24. -- P. 1131311317

127. Tinland B., Fournier P., Heckel T., Otten L. Expression of a chimaeric heat -shock-inducible Agrobacterium 6b oncogene in Nicotiana rustica// Plant Mol. Biol. 1992. - V. 18,N 5 - P. 921-930.

128. Voinnet O., Baulcombe D.C. Systemic signalling in gene silencing// Nature. 1997. Vol. 389. -P.553.

129. Wabico H., Minemura M. Exogenous phytohormone-independent growth and regeneration of tobacco plants transgenic for the 6b gene of Agrobacterium tume-faciens AKE10// Plant physiol. 1996. V. 112, N3. - P. 939-951.

130. Welsh J., McClelland. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers//NAR. 1990. - V. 18, N24. - P. 7213-7218.

131. Welsh J., McClelland. Genomic fingerprinting genomes using arbitrary primed PCR and matrix of pairwise combinations of primers // NAR. -1991. V. 19, N 19. - P. 5275-5279.109

132. Xiong L.Z., Xu C.G., Saghai Maroof M.A., Zhang Q. Patterns of cyto-sine methylation in an elite rice hybrid and its parental lines, detected by methylation sensitive amplification polymorphism technique// MGG. -1999. V. 261.-P. 439-446.

133. Zhang K., Letham D.S., John P.C. Cytokinin controls the cell cycle at mitosis by stimulating the tyrosine dephosphorylation and activation of p34cdc2-like HI histone kinase// Planta 1996. - Vol. 200, N. 1 - P. 2-12