Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение и изучение гормональных мутантов редиса Raphanus Sativus L.

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Выделение и изучение гормональных мутантов редиса Raphanus Sativus L."

0РГ6 од

| / САШТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ

•Ч П 'ПР ГОСУЛЛРСТПЕИКЫЙ УНИВЕРСИТгТ

ч ......

На правах рукописи УДК: 575.1:581.143.6

ВУЗОШШ Ирина Сергеевна

ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ ГОРШ ИЛЬНЫХ МЛЛНТОВ РЕДИСЛ ИАРНАШЗ ЗЛТГУиЗ Ь.

03.00.15 - генетика

Автореферат

.стсоортчции на соискание ученой степени кандилатп биологичнгких няук

Санкт-Петербург - 1993

Работа выполнена на кафедре генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного университета

Научный руководитель: кандидат биологических наук Л.А.Лутова

инициальные оппоненты: доктор биологических наук С.А.Гостимский, кандидат биологических наук 0.П.Митрофанова

Ведущее учреждение: ВНИИ сельхоз. микробиологии РАОХН

Защита диссертации состоится 1993 г. в^часов

на заседании специализированного Совета Д.063.57.21 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу 199034 г.Санкт-Петербург, Университетская наб. д.7/9, СПбГУ, биолого-пэчвенгай ф-т; кафедра генетики и селекции, аудитория I.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной научной библиотеке СШГУ.

Автореферат разослан « Х993 г.

Ученый секретарь специализированного Совета

Л.А.Мамон

. Актуальность проблемы. Гормональные мутанты растений играют важнейшую роль в изучения механизма действия и метаболизма фитогормо-нов. В настоящее время выделяют две группы мутантов:- с нарушениями, в синтезе гормонов и с нарушениями в чувствительности к ним. Для выделения фитогормональных-мутантов используют следующие подходы: первый - изучение фенотипов с нарушенным типом роста, второй -внделение мутантов по изменению чувствительности к высоким концентрациям гормона. С помощью гормональных мутантов достигнут успех в изучении действия, синтеза и метаболизма гиббереллина и абсцизовой кислоты. В менызей степени разработаны генетические модели по клю-чрвнм гормонам - ауксину и цитокинину. Трудности в выделении мутантов по этим гсрюнвм связаны с участием ayscciraa и вдтокинина во всех основных процессах жизнедеятельности. Очевидно, что выделеняв новых мутантов по цитокинину и ауксину является актуальным для изучения синтеза, метаболизма и действия этих фитогормонов.

Для выявлэния гормональных мутантов необходимы модели, позволяющих тестировать мутантный фенотип и включать отобранные формы в генетический анализ. Перспективной моделью является генетическая коллекция инбредных линий редиса, часть которых характеризуется наруаенным типом роста - образованием опухолей. Для выявления и анализа мутантного фенотипа инбредннп линии тестировали in vitro по устойчивости и чувствительности к экзогенным фитогормонам. 3 роботе также проведено изучение .фермента пвроксидазы, про?тгализи-рована связь между изсхфрмяктнши спектрами пероксидаз и реакцией на экзогешшо фитогормоны у инбредмх линия редиса in vitro. Цель и задачи исследования. Полью работы является выявление и изучение гормональных мутантов для идентификации генов, контролирующих процессы дифференцировки и морфогенеза высших растений на примере редиса. В задачи работы входило:

1. Анализ инбредных линий редиса по устойчивости эксплантов (семядолей) к экзогенным фитогормонам (ауксинам и цитокинину).

2. Выявление гормональных мутантов по чувствительности к цитокинину и их генетический анализ.

3. Моделирование процесса опухолеобразовакия ia vitro у линий и гибридов редиса.

4. Получение цитокишш-, ауксин-, и гормоннезависимнх клеточных

штаммов редиса.

5. Характеристика ланий, гибридов и клеточных штаммов редиса по изоферментнш спектрам пероксвдаз на фоне экзогенных фитогормонов. Научная новизна и значимость работы. Впервые среда инбредных линий генетической коллекции редиса выделены цитокишшовые мутвнты, характеризующиеся специфической реакцией на экзогенный цитокинин БАЛ. Признак наследуется как доминантный и моногенный. Выявленный ген, обозначенный сут, обусловливает образование корнеплодоподоб-ных структур у основания асептических растений на среде с БАЛ.

Впервые у опухолеоОразущих линий редиса смоделировано опу-холеобразование in vitro. Полученные результаты доказывают генетическую природу опухолеобраэования у инсредных линий редиса.

Получены цитокинин-, ауксин-, гормоннезависимые клеточные . штаммы. Установлено, что гормоннезависимость характерна только для опухолеооразущих Форм редиса.

Показано, что линии редиса различаются но экспрессии гена Рх!,, контролирующего зону пероксидаз средней подвижности. Выявлена специфическая экспрессия гена Рх! в тканях различных генотипов в зависимости от экзогенных фитогормонов. Ген Рх2, контролирующий наличие зоны быстромигрирущих пероксидаз, использован как маркерный, результаты позволяют предполагать, что он наследуется независимо с геном СУТ и со способностью к опухолеобразованию in vitro. Практическая ценность работы. Выделенные гормональные мутанты, а так» цитокинин-, ауксин-, и гормоннезависимые клеточные штаммы могут Сыть использованы для изучения механизма действия фитогормонов и процессов дифферендаровки и морфогенеза высших растений. Разработанная модель по индукции опухолеобраэования m vitro может бить использована в изучении патологических новообразований у высших растений. Покааана возможность использования провокационных Фонов (культивирование in vitro и экзогенные фитогчэрмоны) для изучения экспрессии генов РхТ и Рх2 в онтогенезе высших растений. Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на Всесоюзных конференцях по генетике соматических клеток в культуре (Звенигород, 1986, 1989); на v съезде ВСГиС (Москва 1987); на Республиканской конференции "Гаметная и зигоная селекция растений" (Кишинев, 1В«7); на Российско-Гермзнском совещании по молекулярной биологии растений (Москва 19У2).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ.

-Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на IGQ страницах машинописного текста," состоит-из введения, обзора литература, описания материала и методов, пяти глав результатов и обсуэде----- -

ний, заключения и выводов, содержит 23 таблицы, 15 рисунков. Список литературы включает 150 наименований.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В работе использованы линии 20-25-го поколений инбридинга из генетической коляекцйи редиса Raphanue sativas L. Биологического НШ Петербургского университета, различающиеся по способности формировать Ео время цветения опухоль на корнеплода m vivo, а также i.iOpiUü! Fj и f . Для аалучргая рксплантов у асептических 10-ти дневных проростков изолировали семядоли и точку роста и лог.'т.!;ч.ггт на срэду Мурасига и Скуга (МС) с добавками различных, ©логортгнов. Контролем служила среда МС без фитогормонов.

Для анализа устойчивости экспланты (семядоли) культивировали нв четырех вариантах сред: I) с цитокинином БАП 2 мг/л; 2) ауксином 2,4Д I—10 мг/л; 3) ауксином НУК 2-10 мг/л; 4) ауксином ИУК 1-5 мг/л. Учет проводили на 10 и 30-35 день культивирования. Устойчивость оценивали по жизнеспособности эксплантов. К устойчивым относили линия, у эксплантов которых отсутствовали некротические процесс«. К неустойчивым - линии, у которых эксплапт боляя 40!« на 50? пнкротизировпн и к моменту учета погибает.

Для изучения чувствительности к цитокинину верхушки "септических растения помещали на среду МС с цитоюнганом БАП (2 мг/л к Чувствительность оценивали по способности формировать у основания бескорневого растения стуктуру, подобную корнеплоду интяктногс растения - корнеплодоподобную структуру (КС).

Для индукции опухолевых структур (ОС) in vitro полученные корнеилодоподобшю структуры (КС) инкубировали на средо МС с 2 мг/л БАП в течение 1-4 пассазкей автономно и/или вместе с проростком. Опухолевую природу полученных новообразований (ОС) проверяли по способности к гормоннезависимому росту в течение 3-8 пасспжай.

Клеточные штагя.щ ЦН (цитокининнозявисимне), АН (яуксиннеяэви-симые), ГН (гормоннезависимые) получали при культивировании перви Ч1мх эксплантов, корнеплодоподобных и опухолевых структур на средо только г. ЗИЛ, В All и без фитогормонов соответственно.

Для анализа изоферментннх спектров шрокеидяз проводили

диск-электрофорез в полиакриламидаом геле по стандартной методике с последующим инкубированием в среде о З-амино-9-этилкэрбазолом в течение 40 мин (Маурер 1971, shaw. Prasad 1970). Опыты проведены в 2-3 повторностях.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Выделение неустойчивых к экзогенным фитогормонам линий редиса с использованием эксплзнтированных сэмядолей. В контрольном варианте на среде без гормонов экспланты всех линий к 30-ому даю культивирования оставались жизнеспособными. Использование ауксинов (ИУК, КУК, 2,4Д) выявило устойчивые и неустойчивые лиши, контрастные различия по устойчивости получены на среде с ауксином 2,4Д. Цитокшшн БАЛ также дифференцирует линии на устойчивые и неустойчивые с выявлением контрастных различий. Сопоставление признала "устойчивость к экзогенным фитогормонам" со способностью к опухо-леобразованшо выявило следующие закономерности: все неопухолевые линии попали в группу устойчивых; все опухолевые линии (за исключением линии 269) характеризовались или цитокшшн- или ауксиннеус-тойчивостью. Две опухолеобразувдие линии (337/76, 342) характеризовались неустойчивостью к обоим фитогормонам (табл.1). Таким образом, неустойчивость к экзогенным фитогормонам у редиса является свойством опухолевого генотипа, что свидетельствует об изменении баланса фитогормонов у форм с нарушениями в морфогенезе.

Выделение гормональных мутантов редиса по чувствительности асептических растений к экзогенному цитокинину vitro. Асептические растения инбредных линий различались по реакции на цитоки-нин БАП. Выделено две группы линий по чувствительности к цитокини-ну. Первая группа - чувствительные cyt+ линии (269, 342, 337/24, 337/2Ь): характерно формирование на базальной части крупных плотных корнеплодоподобных структур, окраска которых совпадает с окраской корнеплода интактных растений. Другая группа - нечувствительные cyt~ линии, не способные формировать КС (255, 43/51, 337/76). Безусловно, различная реакция линий на экзогенный гормон отражает гормональный баланс растения. Добавление цитокинина создает провокационный фон для выявления межлинейных различий. Мы ожидали, что опухолевые линии будут отличаться от безопухолевых по реакции на цитокинин. Однако результаты свидетельствуют, что чувствительность к цитокинину не связана прямо с опухолеобразованием, т.к. в обеих

Таблица I.

Характеристика инбредных ланий редиса ко шрфофюиологическим признакам.

I N

VI V о

i n

у!тдо

Линия

•лтутле-ооразо-ванив

Рх2

Устойчивость семядолей к экзогенным

фитогормонгм ауксин цитокинин

Чувствительность асепт. растений к цитокинину

Образование

опухолевых

структур

Тип клеточных зтаммов**

I

да ан гн

ЛЬ-255

ЛВ-269

ЛВ-342

ЛС-43/51

ЛС-337/24

ЛС-337/25

ЛС-337/7В

-+

+

+

+

+

+

+

Прим.: * * *

V

- По данным Нарбут 1966, Нарбут и др.1985.

-ЦП - цитокинин-; АН - ауксин-; ГН - гормоннезависимый рост.

- не изучено.

группах присутствуют как опухолевые, так и безопухолевые линии (табл.1.). Выделение контрастных форм по чувствительности к цитокинину позволило провести генетический анализ (табл.2.).

Таблица 2.

Чувствительность к цитокинину in vitro У гибридов редиса .

Формы

*1

Частота

проявл. п призн.

Соотношение

экспер. cyt+: Суt'

теорет. cyt*:cyt

Но

Соотв.

таор.

ожид

а)суг"х cyt" 43/51x337/7в 337/76x43/51 255x337/76 337/76x255

б)CYT*x CYT+ 337/25x337/24 337/24x337/25 b)CYT+x CYT" 337/25X43/5I 43/51x337/25 337/72x337/25 337/76x337/24 43/51x337/24

19 0,00 8 0,00 33 0.00

15 0,80

10 0,80 24 0,80

11 0,73 10 0.73

12 0,67

60 40 ПО 87

225 ИЗ

141 190 147 192 261

0 : 60 О : 40 О :И0 О .: 87

181 : 44 90 : 23

105 : 36 126 : 64 89 : 58 119 : 73 147 :114

О : 60

О : 40

О : 110

О : 87

174 : 51 87 : 26

90 : 51 121 : 69 94 : 53 101 : 81 131 :Х24

3:1 3:1 3:1 3:1

3:1

>0,05 >0,05 >0,С5 >0,05.

>0,05 >0,05

<0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05

Прим.: * - теоретически ожидаемое соотношение рассчитывалось с учетом такетранттасти признака (0,8). Частота проявления признака у ЛИНИЙ: 255, 43/51, 337/76 - 0,0; 337/24 - 0,7; 337/25 - 0,8.

Признак у Fj проявляется как доминантный. У гибридов г2 обнаружено расщепление, не противоречащее гипотезе о моногенном наследовании. На основании этого мы вводим ген СУТ и предполагаем наличие как минимум двух аллелей: cyt* - определяет чувствительность к цитокинину, что морфологически проявляется как формирование КС; cyt~~ нечувствительность к цитокинину, КС не формируются. Различная пенетрантность признака у линий и гибридов может быть связана с влиянием генетического фона на экспрессию выявленного гена.

Модалитювакие опухолеобразования у редиса in vitro. У редиса спонтанные опухоли in vivo образуются на корнеплоде, поэтому

для индукции опухолей in vitro использованы полученные ранее кор-неплодоподобше структуры КС. При культивировании КС на среде с БАЛ на их поверхности образовывались наросты белого цвета,, . морфологически напоминащие опухоли in vivo. Такие опухолевые структуры (ОС) формировались только у опухолевых линий. ОС при пассировании на минимальной среде активно растут, увеличиваются в размере, т.е. являются гормоннезависимыми. Таким образом, нам удалось смоделировать процесс опухолеобразования на корнеплоде у части опухолевых лтп1й. Однако, для проявления признака in vitro необходимо обязательное образование КС. Следовательно, линии, которые несут рецессивную аллель гена СУТ, т.е. пв образуют КС, не могут быть проана-.ггирированн 1грямо по этому пргзняку. Поэтому для таких линий (43/51, 337/76 и 255) прсвепян анялиз признака "ОС" по птбрилям, полученным от скрещивания с cyt+ линиями (табл.3).

Таблица 3.

Образовывать опухолевых стуктур (ОС) у гибридов и f2 in vitro

Форш п F! наличие ОС п Г2 наличие ОС частота ОС

a)cyt+0C~xcyt40C+

337/25 Х337/24* 4 + 99 + 0,38

337/24*х337/25 90 + 0,49

6)Cyt+0C~xCyt"0C?

337/25x43/51 ТО - 105 0,00

43/51x337/25 14 - 126 - 0,00

255x337/7,5 не иссл. 30 - 0,00

B)cyt+0C~xcyt~0C?

337/25x337/76* 10 + 15 + 0,40

337/76_*х337/25 4 + 91 + 0,21

r)Cyt"OCVXCyt+OC+

337/76*х337/24* 4 + 49 + Q.43

Прим.: * - опухолевые in vivo линии;

В качестве линии-анализатора использовали линию 337/25 (Cyt+OC~). Показано, что неопухолеобразующие in vivo линии 255 и 43/51 не способны формировать ОС in vitro (табл.36). Тогдэ как опухолевая линия 337/76 формировала бы ОС in vitro при наличии КО,

т.к. у гибридов f2 этот признак проявляется с высокой частотой (табл.Зв). Таким образом, ген, контролирующий способность к опухо-леобразованию у растений в период цветения in vivo, в экстремальных условиях может ёкспрессироваться на более ранних стадиях онтогенеза у растения in vitro. Это подтверждается сопоставлением проявления признака опухолеобразования у линий и гибридов Fj. f2 in vitro с результатами анализа опухолеобразования in vivo. Все не образукщие опухоли in vivo линии (337/25, 255, 43/51) не обладают признаком "образование опухолевых структур" in vitro. Все образующие опухоль in vivo линии (269 , 342 , 337/24,, 337/76) обладают признаком "образование опухолевых структур" in vitro (табл.1). У гибридов FjH f2 между неопухолевыми in vivo линиями (табл.3,6) опухоли in vitro не формируются. Если в скрещивание была вовлечона хотя бы одна линия, образующая опухоль у интактного растения, то у гибридов fx и f2. in vitro удается получить опухолевые структуры (табл.За,в,г).

Итак, мы смоделировали процесс опухолеобразования у инбредных линий и гибридов редиса в асептических условиях, что подтверждает предположение о генетической природе опухолеобразования. Изучение этого признака в контролируемых условиях открывает новые возможности для познания генетического контроля и физиологических механизмов опухолеобразования у растений.

Гормоннезависимый рост клеточных штаммов. Получены ауксиние-зависимые (АН) и цитокининнезависимые (ЦН) клеточные штаммы. Способность клеточных штаммов к росту на среде без ауксина или цито-кинина зависела от направления отбора. Так, если первичный каллус получали на среде с 2.4Д, то при дальнейшем пассировании такие штаммы росли на среде только с ауксином, т.е. являлись АН. Такой же принцип заложен и при получении ЦН клеточных штаммов. Это связано с тем, что при индукции каллусогенеза на средах только с ауксином (или цитокшишом) в высоких концентрациях в силу гетерогенности первичного зкспланта отбирается устойчивые и компетентные к этому фитогормону клетки, которые в дальнейшем способны к активной пролиферации. В пользу этого говорит невозможность индуцировать рост у КС при эксплантации их на среду с ауксином (каллусообразо-ваиие не наблюдается, эксплант гибнет) и, наоборот, Ш штамп®, растущие на среде с 2,4Д, не способны к росту на безауксиновой

средо с высокой концентрацией ВАЛ.

--------Одним иа главных критериев опухолевого роста явля/зтся автономность по ауксинам и цитокшшнам при культивировании тканой in vitro. Нами установлено, что все опухолевые структуры линий и гибридов редиса способны к гормоннезависимому (ГН) росту, что подтверждает опухолевую природу полученных структур. К росту на среди без фитогормонов способны не только ОС, но и другие ткани опухоле-образующих растений. Так птакм! (КС) опухолевой линии337/24 проявили высокую жизнеспособность на всех этапах пассирования. Таким образом, отсутствие в среде фитогормонов у опухолевой линии не подавляет пролиферацию и регенерацконше процессы. Линию 337/76 яользл прямо прэвшдагавровв» ня обрчновр.нив ос и их ГН рост из-ай неспособности ее форлировать КС, однако тератомы згой jejuni способны к росту на минимальной среде. Т.е. все опухолевые линии в отличие от безопухолевих обладают ГН фенотипом (табл.1).

Изучение экспрессии генов пероксидазы у ипбредных линий и гибридов редиса. Ранее изучен генетический контроль изоферментных. (ИФ)спектров пероксидаз у интвктннх растений линий редиса. Показано, что зона пероксидаз средней подвижности контролируется геном Рх-I. Независимо от гена Рх-I наследуется ген Рх-2, контролирующий появление Снстромягрярукцих пероксидаз (Войлоков 1977). Пероксвда-за относится к числу "аварийных" ферментов, т.е. изменяет свой спектр на любые воздействия, в том числе на ранении и экзогенные фнтогормоны. >'и проанализировали наличие причинно-следственных связей мезду изменениями спектра пероксидаз и устойчивостью, чувствительность» и способностью к опухолеобразопатг» у инбредннх линия редиса, о также сопоставили характер роста клеточных, штаммов с закономерностями появления изозимов пероксидаз.

Показано влияние зкзоггипш: гормонов на изменение НО) спектров эксгглантировшвшх семядолей. Наиболее сильно влияют на изменение спектра ауксины. Характер изменений связан не с определенным изо-зимом, ь затрагивает весь спектр к различен у линий редиса (табл. •1). Одной из причин низкой устойчивости к ауксинам может быть ги-перауксиноз, связанный с нарушениями в инактивации ауксина нерек-сидазой. Однако, анализ спектра пероксидаз и поведения линий in vitro не выявил связей между спектрами пероксидаз и отсутствием устойчивости лйв.Л к экзогенным гормонам. Исключение состояли1!'

Таблица 4.

Характеристика линий редиса по изоферментным спектрам анионных пероксидаз.

Линии

30-

на

Эксплантированные семядоли

на среде МС

на среде МС+БАП

на среда МС+2.4Д

Цитокининнезависише первичн. [длительные

Клеточные штаммы

Ауксиннезависимые первичные длительные

Гипотетический спектр

337/2! 43/51 337/24 337/76 342

1,2.4,6*

1,2,3,4,!

1,2.4,6 1,2,3,4

2,4,6 1,2,3

1.2.4,6 2,3

1,2,3,4,5

1,2,3,4,6 2,3_

1.2.3.4.6 2.3,4

С(1,2,3,4,5,6) ¿(1,2,3,4,?_

I,2,4,5,£

1,2,4.5,С

2.4,6

2,3,4,5,6

1,2,3,4,5,6

не изучено

0(1,2,3.4.5,6)

1.2.4

1.2.4

2,4

2,3,4,5,6

не изучено

1,2,3,4,5,6

1.2,3.4.6

0(1,2,3,4,5,6)

д-_

1.4

1,4

2.4

1,2.3.4,5

1,2.3.4.5.6

на изучено

0(1,2,3,4,5,6) Д -_

1,2,4,5,6 1,2,3,4,5

1,2,4.5,6 1.2,3,4

3.4,5,6 1.2.3

2.4.5.

2.3

1,2,3,4,5,6

1.2,4,5 2.3

1,2.4.5.6

2.3

0(1,2,3,4,5,6) Д(1.2,3,4,5)

Прим,: * С - зона средней подвижности, контролируется геном Рх1;

Д - зона быстромигрирующих пероксидаз, контролируется геном Рх2; »» - номера изозимов внутри зон;

линия 337/76, у которой отсутствует устойчивость и одновременно с этим она имеет бедный спектр пероксидаз во всех вариантах опыта. Вероятно, разный баланс фитогормоноз у изучаемых линий проявляется в различающихся морфологических реакциях на экзогенные гормоны in vitro, одновременно с этим мн наблюдаем и специфичные для каждой линии типы 1№ спектров на фоне экзогенных гормонов.

Клеточные штаммы редиса, отличающиеся по потребностям в гормонах, отличаются и по морфологическим признакам - по типу и степени дедифференцировки и по потребностям в гормонах, что должно было отразиться и в ИФ спектрах пероксидаз. ЦН клеточные штаммы характеризуются высокой степенью дедифференцировки: рыхлой структурой, беговато-яэтлтой окраской. В процессе пассирования их спектры менялись (табл.4): обогащалась средняя зона, а зона быстромир-рирувдих пероксидаз обеднялась. При длительном культивировании спектры всех линий по зоне, контролируемой геном Pxl, выравнивались, прекращалась экспрессия гена Рх2. Вероятно, это связано с дедифференцировкой тканей, т.к. экспрессия гена Рх2 органо- и ста-диоспецифична. Т.е. процессы дедифференцировки приводят к нивелированию межлинейных различий по генам, контролирующим пероксидазы.

АН клеточные штаммы обладают плотной структурой, наличием "антоцианоБ в поверяюстпом слоо, т.е. характеризуются сохранением дифференцировки. При пассировании их спектры изменялись, но незначительно. Изменения касались интенсивности и регулярности появления некоторых изозимов. Меяишнейные различия сохранялись как у первичных, так и у длятельнопассируемых АН клеточных штаммов.

Итак потребность в фитогормонах и уровень дифференцировки влияют на экспрессию генов Pxl и Рх2, процессы дедифференцировки приводят к нивелированию межлинейных различий.

Для характеристики мы составили для каждой линии гипотетический спектр с учетом анализа отдельных органов, культивируемых in vitro. Гипотетические спектры всех линий одинаковы и содержат в средней зоне максимальное число изозимов, при этом каждый из изозимов проявляется у всех линий редиса, но время и место его прояЕ1-ления генотипоспецифичны. Ш предполагаем, что на определенных этапах дифференцировки линии различаются по модификации первичного продукта гена Pxl, что и приводит к межлинейным различиям, которые выявляются у инт ктшх растений, у культивируемых органов на раз-

ных провокационных фонах in vitro. Возможность индуцировать любой из изозимов гипотетического спектра по средней зоне у всех изученных линий указывает на отличие их не по аллелям структурного гена РхХ, а по регуляторными механизмам. Вероятно, инбридинг сортов выявил измененные по регуляторным генам варианты, закрепив их в инбредшх линиях. Иная картина наблюдается при анализе экспрессии гена Рх2: различия между линиями в гипотетических спектрах по признаку наличие - отсутствие быстромигрирувдих пероксидаэ сохраняются, что свидетельствует в пользу отличий инбредных линий по аллелям структурного гена Рх2.

Анализ пероксидаэ, контролируемых геном Рх2, у гибридов f2 in vitro выявил расщешшше, которое соответствует моногенному характеру наследования (X2 для всех комбинаций от 0,03 до 0,88). Наши результаты согласуются с ранее полученными на интактных растениях (Войлоков 1977). моногеншй характер наследования позволяет использовать ген Рх2 в качестве маркерного при анализе совместного наследования с другими изучаемыми признаками (табл. 5,6). Анализ совместного наследования признаков "чувствительность к цитокинину" и "наличие зоны быстромигрирувдих пероксидаэ" (табл.5) у гибридов

Таблица 5.

Совместное наследование признаков "наличие зоны быстромигрирущих

пероксидаэ" (Рх2) и "чувствительность к цитокинину" (Cyt).

Расщепление Гипо- рн

Гибрида п наблюдаемое ожидаемое теза 0

F2 Щ Р*2 ч ^2 9:3:3:1

cyt Cyt Cyt Cyt" <?yt+ Cyt Cyt Cyt"

43/51 74 34 17 • 16 7 34 22 II 7 9:6:3:2* >0,05

Х337/25 41 14 14 5 19:3:3:1) >0,05

337/76 147 71 44 18 14 66 44 22 15 9:6:3:2* >0,05

Х337/25 81 28 28 9 [9:3:3:1) <0,05

337/25 85 43 14 22 6 38 26 13 8 9:6:3:2* <0,05

X43/5I*' 46 17 17 5 9:3:3:1 >0,05

Прим.:* - теоретически ожидаемое соотношение рассчитывалось с учетом пенетрантности признака (0,8); ** - в данной комбинации расщепление по гену СУт соответствует моногенному без учета пенетрантности признака, поэтому при расчете теоретически ожидаемых частот мн ожидаем классическое соотношение 9:3:3:1.

г1 выявил единообразно и доминирование обоих признаков, а в \ 2 обнаружено расцепление, соответствующее гипотезе об их независимом наследовании.

У опухолевых лилий 337/24, 337/76 не выявлена зона Оыотротг-рирующих пероксидаз (0С+Рх2~), в отличив от родственной им безопухолевой линии 337/25 (0С"Рх2ч). Возможно, высокая частота ООО*; опухолеобразования связана с отсутствием экспрессии гена Рх2, что приводит к нарушению инактивации ауксина. Анализ совместного наследования признаков ОС и Рх2 ослоетен нестабильностью проявления и отсутствием четких схем расцепления по признаку "ОС". Поэтому косвенным ответом на вопрос о взаимосвязи этих признаков явилось бы наличие (отсутствие) ьо втором поколении иародательаслх ишсш (0С+Рх2\ ОСТйГ).

Таблица 6.

Анализ совместного наследования признаков "наличие зоны бистро-мигрируицих пероксидаз" (Рх2) и опухолеобразования in vitro (ОС).

Формы ФбНОТИПЫ расщепление в Г2

F1 п ОС Рх2 ОС Рх2~ 0С~Рх2 0С~Рх2~

¿¡ЬЪхУ37/2Ь : ' Ш Pxi! уи и и зи и

255x337/24 0С+Рх2+ 10 X 2 6 I

337/25x337/76* 0С+Рх2+ 15 5 I 7 2

337/76**337/25 ОС+Рх2+ 89 15 «1 57 13

337/25x337/24* 0С+Рх2+ 72 29 4 28 II

337/24*х337/25 0С+Рх2+ 73 32 8 26 7

337/76*х337/24* 0С+Рх2~ 38 0 21 0 17

Прим.: « - опухолеобразующие линии.

Нами показано (табл.6), что если в скрещивание вовлечены линии, различающиеся по обоим признакам (0С~Рх+, ОС^Рх"), то наблюдается расщепление и выявляются как родительские (ОС+Рх~, ОС~Рх+). так и рекомбинантные классы (0С+Рх+, ОС~Рх~). Эти результаты указывают на отсутствие причинно-следственных связей между признаками "наличие зоны быстромигрируивдх пероксидаз" и опухолеобразованием in vitro. Мы также проверили гипотезу о влиянии экспрессии гена Рх2 на частоту опухолеобразования. Полученные результаты позволяют говорить об отсутствии влияния наличия зоны быстромигриругацих пероксидаз на проявление опухолеобразования in vitro у линий редиса 337/24 и .37/76.

Итак, в результате проведенных экспериментов выделен новый "ип гормональных мутантов у редиса с измененной чувствительностью к цитокшишу, которая проявляется в формировании корнеплодоподоб-ных структур в ответ на экзогенный цитокинин. Признак наследуется как доминантный и моногенный, а выявленный ген обозначен err- Использование экзогенных фмогормонов позволило индуцировать у опухолевых линий редиса опухолеобразование в асептических условиях. Формирующиеся in vitro опухоли способны к росту на среде без фито-гормонов. У опухолвобрэзующх линий изменена также реакция на экзогенные гормоны, в результате чего они погибают, т.е. являются неустойчивыми к экзогенным фитогормонам. Таким образом, опухоле-образующие линии редиса (337/24, 337/76, 269, 342) являются гормональными мутантами с нарушениями гормональной ситетемы.

ВЫВОДЫ

1. Среди инбредных линий редиса выявлены контрастные различия по устойчивости эксплантированних семядолей к высоким концентрациям экзогенных фигсгормонов (ауксинам и цигокининзм). Установлено, что только у опухолевых линий отсутствует устойчивость к фитогормонам, что указывает на нарушения в гормональной системе у этих форм.

2. Среди инбредных линий редиса обнаружена изменчивость по чувствительности асептических растений к экзогенному цитокинину, которая проявляется как способность образовывать корнеплодоподобные структуры. Признак наследуется как доминантный и моногенный. Выявленный ген, контролирующий признак "чувствительность к экзогенному цитокинину" у редиса, обозначен СУТ.

3. Смоделирован процесс опухолеобразоввния у асептических проростков ЛИНИЙ, гибридов Fj И Fj in vitro с помощью экзогенного питокинина. Полученные опухоли характеризуются гормошезависимом ростом in vitro. Способностью к опухолеобразованию in vitro и гор-моннезависимым ростом обладают только опухолевые in vivo линии.

4. Получены ауксин- и цитокининнезависимые клеточные штаммы редиса. Способ получшшя ауксин- и цитокининнезависимых клеточных штаммов определяется условиями индукции пролиферации у первичных эксплантов.

Ь. Показано, что экзогенные фитогормонн изменяют изоферментнип спектр пероксидаз у первичных эксплантов линий редиса в завнси мости от-их генотипа. При-длительном культивировмнии штиммов редиса ауксин нивелирует различия между линиями по зоне ипроксвдч,! средней подвижности и подавляет экспрессию гена Рх2.

6. Ген Рх2, контролирукидай наличие зоны быстромигрирумцих поро ксидаз. использован как маркерный при анализе совместного наелидо вания с морфологическими признаками. Полученные данные не противоречат гипотезе о независимом наследовании признаков "чувствитмль ность к цитокинину" и "наличие зош бистромигрируюцих преоксидаз", а также гипотезе об отсутствии причинно-следственных связей в проявлении признаков "наличие зоны бчетромигрирутгаих пероксимз" и "одутлиооразование m vitro''.

СЛИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

I. Лутова Л.А., Бузовкина И.С. Восприимчивость к заражению A.turoefaciens инбредных линий редиса, различающихся по способности к опухолеобразованию //2-е Всес. сов. по генетике соматических клеток в культуре, Звенигород, 1983 г. : Тез.докл. - M., 1983, С.73.

2 .Лутова Л.А., Шишкова С.О., Бузовкина И.С. Зависимость роста клеточных штаммов редиса от гормонального статуса исходных генотипов // Всес. конф. по генетике соматических клеток в культуре, Звм нигород, 1936.: Тез. докл. - М., 1986, С.28-29.

3. Бузовкина И.С., Лутова Л.А. Экспрессия генов пероксидазы Рх1, Рх2 и изозимов с ИУК-оксидазной активностью у линий редиса и норме и при дедиф^еренциации //Всес. конф. по генетике соматически* клеток в культуре, Звенигород, 1986: Тез. докл. - (Д., 1986, С.13.

'1. Лутова Л.А., Верзина И.П., Бузовкина U.C., Шишкова С.о. Рм'внерация почек из тканей иноредних линий редиса //Респ. конф. "Гаметпая и зиготная селекция растений" : Тез. докл. - Кишинев : Штшшца, 1987, С.167-168.

5. Бузовкина И.С., Лутова Л.А. Выявление изменчивости по спек трем RV'K-оксидаз при регенерации m vitro у инородных линий редвся //Рьсп. конф. "Гаметная и зиготная селекция растений" : Тез. докл. - Кишинев : Штиинца, 1987, С.130.

6. Бузовкина И.С. Изучение спектров пероксидаз и ОИУК у инородных линий редиса в процессе онтогенеза проростков и при эксплантации //Тез. докл.У съезда ВОГиС - М.,1987г., т.1, С.36.

7. Lutova L.A.. Buzovkina I.S.. Shiehkova 3.0. The relation-ehio between tumor foraotion and in vitro differentiation type of radish inbred lines // EUCARPIA Cruciferae Newsletters. -19S8. - N 13. - P.97.

8. Лутова Л.А., Бузовкина И.О., Арсютина М.С. Инбредные линии редиса как модель для изучения признака гормоннезависимости in vitro // Всес. конф. по генетике соматических клеток в культуре, Звенигород, 1989 г. : Тез. докл. - М., 1989, С.91.

9. Арсютина М.С., Бузовкина И.О. Экспрессия генов пероксидазы у инбредных линий, гибридов fxh f2 редиса на провокационном фоне //Бюллетень ВИР, 1990, Вып.204, С. 61-65.

10. Бузовкина И.С., Лутова Л.А. Генетические, биохимические и физиологические аспекты опухолеобразования у инбредных линий редиса

■ тетк ЛГУ. - 1991. - Вып.2. N 10. - 102-107.