Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Создание и изучение биологических свойств кандидатных ДНК-вакцин против ВИЧ
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Создание и изучение биологических свойств кандидатных ДНК-вакцин против ВИЧ"
САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
На правах рукописи
Мурашев Борис Владимирович
СОЗДАНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ КАНДИДАТНЫХ ДНК-ВАКЦИН ПРОТИВ ВИЧ
03 00 04 - Биохимия
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Санкт-Петербург 2007
003163096
Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии ННИУ "Биомедицинский центр" и лаборатории молекулярной вирусологии ФГУП "Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов ФМБА России"
Научный руководитель
доктор биологических наук профессор
Козлов Андрей Петрович
Официальные оппоненты
доктор биологических наук, профессор
Кокряков Владимир Николаевич
доктор биологических наук Евтушенко Владимир Иванович
Ведущее учреждение Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук
Защита состоится " "_ 2007 г в часов на заседании
Диссертационного совета Д 212 232 09 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб 7/9, СПбГУ
С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке Санкт-Петербургского государственного университета
Автореферат разослан " "_2007 г
Ученый секретарь Диссертационного совета
доктор биологических наук, профессор 3 И Крутецкая
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. В России и других странах бывшего СССР в настоящее время эпидемия ВИЧ-инфекции находится в стадии перехода от концентрированной в среде инъекционных наркопотребителей к генерализованной, т е распространяющейся среди людей, не принадлежащих к обособленным группам риска Таким образом, актуальным является создание свойств специфической профилактики ВИЧ-инфекции
Как было показано в нашей и других лабораториях, уровень генетического разнообразия ВИЧ-1 а странах СНГ и темпы его роста являются самыми низкими в мире [Lazouskaya et al, 2005, Masharsky et al, 2003] Полученная в лаборатории Биомедицинского центра полная нуклеотидная последовательность генома ВИЧ-1 субтипа А, доминирующего на территории России и стран СНГ (00UA0116), является основой для создания отечественной вакцины против ВИЧ-инфекции
ДНК-вакцины являются новым методом вакцинации, основанным на введении ДНК, кодирующей антигены патогена, и обеспечивающей их экспрессию в клетках иммунизированного организма Имитируя вирусную инфекцию и не являясь таковой в действительности, ДНК-вакцин инициирует развитие полноценного, преимущественно опосредованного Т-клетками иммунного ответа [Estcourt et al, 2004] Применение гетерологичной системы праймирования и бустирования с использованием различных векторов доставки одного и того же иммуногена стимулирует как Т-клеточное, так и гуморальное звено иммунного ответа При этом многими авторами показано, что использование ДНК-вакцин при праймировании является перспективным и целесообразным [Ramshaw et al, 2000]
Существует общепризнанное мнение, что профилактическая вакцина против ВИЧ-инфекции должна индуцировать специфический Т-клеточный и, возможно, гуморальный иммунный ответ При этом в связи с высоким генетическим разнообразием ВИЧ-1 в мире считается, что создание кандидатных вакцин против ВИЧ/СПИД целесообразно проводить на основе субтипов ВИЧ-1, доминирующих в регионе, для которого эти вакцины предназначены JHanke et al, 2000]
Цели и задачи исследования Целью данного исследования является создание кандидатных ДНК-вакцин против ВИЧ и изучение их биологических свойств
Задачи исследования
1 Осуществление молекулярного дизайна плазмидного вектора и разработка серии плазмидных кандидатных ДНК-вакцин против ВИЧ-инфекции
2 Изучение экспрессионных и адъювантных возможностей кандидатных ДНК-вакцин в системе in vitro
3 Определение способности ДНК-вакцин вызывать различные формы иммунного ответа у мышей
Научная новизна работы Впервые был получен отечественный препарат кандидатной ДНК-вакцины против ВИЧ-инфекции, несущий фрагменты генов российского штамма ВИЧ-1 субтипа А, и всесторонне изучены его биологические свойства Разработанная оригинальная векторная система обеспечизает эффективную экспрессию антигенов и адъювантность кандидатных ДНК-вакцин в системе m vitro Модификация последовательности гена nef ВИЧ-1 доминирующего в России субтипа А увеличивает уровень его экспрессии по отношению к природному Показана активация ВИЧ-специфического иммунного ответа при внутримышечной вакцинации мышей кандидатными ДНК-вакцинами, а также образование клеток иммунологической памяти
Научно-практическое значение работы. Данные проведенного исследования представляют собой часть работы по созданию профилактической вакцины против ВИЧ-инфекции, проводимой в ННИУ «Биомедицинский центр», ФГУП "ГосНИИ особо чистых биопрепаратов ФМБА России" и Санкт-Петербургского Государственного Университета В ходе работы созданы генно-инженерные конструкции и кандидатные вакцины против ВИЧ/СПИД Включение в конструкции последовательностей фрагментов генов штамма ВИЧ-1 субтипа А, доминирующего на территории России и стран СНГ, делает перспективным дальнейшие испытания и применение полученных кандидатных вакцин в данном регионе Разработаны методы очистки плазмидной ДНК, которые при соответствующем масштабировании могут быть внедрены в промышленность Проведено всестороннее изучение биохимических, биологических и иммунологических свойств данного препарата Доклинические испытания, осуществленные в лабораториях ННИУ "Биомедицинский центр" и ФГУП "ГосНИИ особо чистых биопрепаратов ФМБА России" и Института токсикологии, показали, что новая вакцина не токсична, не вызывает аллергических реакций, безопасна, апирогенна и не обладает раздражающим действием Эффективная активация ВИЧ-специфического Т-клеточного иммунного ответа и образование клеток иммунологической памяти при вакцинации мышей, выявленные в работе, являются потенциальной предпосылкой иммуногенности данных препаратов у людей и протективности вызываемых реакций против инфицирования ВИЧ Таким образом, данная работа не только углубляет фундаментальные знания в области биохимии нуклеиновых кислот, молекулярной иммунологии и вакцинологии, но и вносит непосредственный практический вклад в борьбу с эпидемией ВИЧ/СПИД
Форма выполнения диссертационной работы Работа выполнялась в рамках финансирования ННИУ "Биомедицинский центр" и ФГУП "ГосНИИ особо чистых биопрепаратов" ФМБА России по Межведомственной научно-технической программе "Вакцины нового поколения и медицинские диагностические системы будущего", Федеральной целевой научно-технической программе "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники", а также по грантам Международного центра Фэгарти (FIC, AITRP, 5-D43-TW01028-04) и МНТЦ №2344
Апробация работы Материалы диссертации были представлены на 7-й -12-й и 14-й - 16-й Международных конференциях "СПИД, рак и родственные проблемы", Санкт-Петербург, Россия, 1999-2004 и 2005-2007, международных конференциях "Вакцина против СПИДа" Филадельфия, США, 2001, Нью-Йорк, США, 2003 и Амстердам, Голландия, 2006, 10-й конференции по ретровирусам и оппортунистическим инфекциям, Бостон, США, 2003 По теме диссертации опубликовано 11 статей, 29 тезисов докладов и получено 6 патентов Российской Федерации
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы Работа изложена на 196 страницах машинописного текста, иллюстрирована 28 рисунками, 17 таблицами и 9 приложениями Список литературы содержит 260 литературных источников
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для получения плазмидного вектора рВМС, а также серии плазмидных ДНК, содержащих фрагменты генов ВИЧ-1 штамма LAI субтипа В и штамма, доминирующего на территории стран СНГ субтипа А, использовали стандартные методы генно-инженерного клонирования В качестве источника генетического материала использовали плазмиды pcDNA3 1(+) (Invitrogen, США), pNL4-3 (GenBank М19921), pGenvM3 [Masharsky et al, 2003], pBlueScnpt KS ll(+)snef (Евроген, Москва)
Для изучения свойств кандидатных ДНК-вакцин in vitro плазмидные ДНК выделяли методом, основанным на щелочном лизисе клеток Ecoli с последующей очисткой центрифугированием в градиенте ппотности хлористого цезия с бромистым этидием Для проведения доклинических испытаний кандидатных ДНК-вакцин против ВИЧ-инфекции препараты плазмидных ДНК были очищены хроматографически по методу Нот [Нот et al, 1995], с некоторыми модификациями Полученные препараты ДНК-вакцин были охарактеризованы в соответствии с рекомендациями FDA (США) (www fda gov/cder/) Критерии оценки качества препаратов плазмидных ДНК, используемых в иммунотерапии, а также методы их анализа представлены в табл 2
Для анализа экспрессии антигенов in vitro использовали методы трансформации клеток линии мыши NIH/3T3 (ITCC #CRL-1658) и человека 293Т (ITCC #CRL-1573), Northem-гибридизацию, иммуноблот и проточную цитофлуориметрию Для исследования адъювантных свойств ДНК-вакцин in vitro проводили анализ экспрессии цитокинов ИФН-у, ИЛ-4, а также фактора ранней активации лимфоцитов CD69, в смеси лимфоцитов селезенки, или отдельно в популяциях CD4 или CD8 спленоцитов, при неспецифической стимуляции препаратами плазмидных ДНК
Иммунизацию мышей линии Balb/C ДНК-вакцинами проводили внутримышечно (в четырехглавую мышцу бедра левой лапы) в физиологическом растворе Через две недели после последней вакцинации
животных бустировали ДНК-вакциной Для исследования Т-клеточного иммунного ответа анализировали цитотоксичноскую активность с помощью набора CytoTox96 (Promega, США) или проточной цитофлуориметрией, изучали количество специфичных к антигену Т-лимфоцитое с помощью регистрации внутриклеточных циттжинов (CD8+ - ИФН-у, CD4+ - ИФН-у или ИЛ-4) Уровень гуморального ответа определяли с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) При использовании набора CytoTox96, в качестве клеток-мишеней брали клетки линии F160, конститутивно экспрессирующие ген env ВИЧ-1 При использовании метода, основанного на измерении активности ЦТЛ с помощью проточной цитофлуориметрии, брали клетки линии Р815 (ITCC #TIB-64), предварительно инкубированные с пептидами (ер Nef (В) - ewrfdsrlafhhvarel, ер р24(В) - amqmlketi), или пулом пептидов (Nef-1 - girfpltfgwcyklvp, Nef-2 - mwkfdsrlalihrarel, Gag-1 - amqmlkdti, Gag-2 - epfrdyvdrf, Gp120 - MYAPPIEGNI (подчеркнуты аминокислоты не совпадающие в данной позиции с последовательностью известного ЦТЛ-эпитопа ВИЧ-1 В субтипа (www hiv-web lanl gov/immunology))), окрашенные 5(6)-carboxyfluorescein N-succinimidyl ester (CFSE) Клетки, подверженные атаке ЦТЛ, выявлялись по связыванию иодида пропидия (PI). При проведении ЦТЛ-теста в качестве эффекгорных клеток использовали нестимулированные m vitro спленоциты или мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), очищенные в градиенте плотности Ficoll-Paque Стимуляцию С08*-лимфоцитов к экспрессии цитокинов проводили пептидами или пулом пептидов, С04+-лимфоцитов - рекомбинантным белком Nef В качестве антигенов в ИФА использовали рекомбинантные белки др120 (AIDS Research and reference reagent program, США), или Nef и р24, полученными в нашей лаборатории
Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей проводили с помощью компьютерных программ BioEdit 7 0 5 2 и Pnmer Primier 5, получение компьютерных фотографий и их обработку - Gel Imager 1 0, Gel Analysis 1 0 и Adobe Photoshop 7 0 В работе использовали проточный цитофлуориметр EPICS XL (Beckman Coulter, США) Сбор и анализ данных производили с использованием программ System II Software (Beckman Coulter, США) и WinList 32 (Verity Software House Inc , США), Flow Explorer 3 5 Статистический анализ полученных данных проводили с помощью стандартного пакета программ Microsoft Excel
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Создание плазмидного экспрессионного вектора рВМС и серии плазмидных ДНК
Важным компонентом ДНК-вакцин является плазмидный вектор Полученная плазмида рВМС (рис 1) содержит необходимые элементы для обеспечения эффективности ДНК-вакцины Так, для обеспечения транскрипции генов белков ВИЧ-1 в плазмиде рВМС используется промотор предранних белков
цитомегаловируса (pCMV), который содержит Bgiii
область связывания РНК полимеразы II •^^^pCMV
(САААТ и TATA), расположенную между +1 и jr
-65 нуклеотидами, а также область Ашр r f ,,
энхансера, расположенную между -66 и -524 нуклеотидами [Lubon et al, 1989] При этом области негативной регуляции промотора (положения -600 и -720, а так же -750 и -1145) в плазмиду рВМС не включены В качестве сайта терминации транскрипции и полиаденилирования мРНК в рВМС представлена З'-нетранслируемая область бычьего гормона роста (BGH рА) Полилинкер рВМС (MCS) содержит уникальные сайты рестрикции, использованные в работе для клонирования фрагментов генов ВИЧ-1 В векторе рВМС для селекции и репликации в клетках Е coli используется фрагмент ДНК из плазмиды pUC18/19, содержащий ген устойчивости к ампициллину (Amp R), и участок Orí, включающий точку начала репликации и последовательность гена rep рМВ1, который обеспечивает высокую копийность данной плазмиды
С целью получения ДНК-вакцин гены, перечисленные в табл 1, были вставлены в рВМС, под сигналы, обеспечивающие их экспрессию в клетках млекопитающих Гены включали последовательность Козак [Kozak 1999], инициирующий (ATG) и терминирующие кодоны Плазмидные конструкции, содержащие гены ВИЧ-1 субтипа В, использовались в работе для определения основных свойств ДНК-вакцин Плазмиды, содержащие модифицированные гены ВИЧ-1 субтипа А, входили в состав кандидатной ДНК-вакцины против ВИЧ
Таблица 1
Гены и фрагменты генов ВИЧ-1, использованные для создания коллекции плазмидных ДНК на основе вектора рВМС
рг I I Ш
рВМС Ji 3265 пн f V вен
BGH pÄ
pUC Orí
PvuII
Рис 1 Кольцевая схема плазмидного вектора рВМС
Гены и фрагменты генов ВИЧ-1 Субтип В (pNL4-3, #AF324493) Субтип А (98UA0116, #AF413987) Модификация и гуманизация последовательностей для субтипа А
gag p 17-24 +
gag + +
pol RT + +
env env +
gpi60 +
gpi20 +
Asp gp120 +
gp140 + +
rief + + +
" - В работе с данными генами принимали участие другие сотрудники лаборатории
Ген env ВИЧ-1 субтипа В был получен последовательной ферментативной обработкой плазмиды pNL4-3 эндонуклеазой Bpil, Т4 ДНК полимеразой, эндонуклеазой Xhol и клонирован в вектор рВМС, последовательно обработанный эндонуклеазой Xbal, Т4 ДНК полимеразой и эндонуклеазой Xhol Фрагменты генов др160, др120, Asp др120, р17-24, nef ВИЧ-1 субтипа В были амплифицированы методом ПЦР на матрице плазмидной ДНК pNL4-3, ген nef ВИЧ-1 субтипа А - на матрице pGenvM3, фрагмент ДНК, несущий последовательность модифицированного гена nef ВИЧ-1 субтипа А (snef), получен рестрикцией плазмиды pBlueScnpt KS ll(+)snef по сайтам Nhel и Xhol Все фрагменты генов были клонированы в плазмидный вектор рВМС по сайтам рестрикции Xhol и EcoRI (др160, др120. Asp др120, р17-24), или Nhel и Xhol {nef) В результате были получены плазмидные ДНК pBMCgpl 60(B), pBMCgpl20(B), pBMCAspgp120(B), рВМСр17-24(В), pBMCnef(B), pBMCnef(A), pBMCsnef(A)
Все модифицированные гены gag, RT, gp140, nef ВИЧ-1 субтипа A были получены методом гуманизации кодонов консенсусной последовательности, построенной по генам ВИЧ-1 доминирующего субтипа А, циркулирующего на территории России и стран СНГ (посчитанной 2003 и 2007 гг) При этом аминокислотная последовательность белка Gag после модификации соответствовала консенсусной Последовательность белка RT после модификации также соответствовала конценсусной, за исключением того, что был добавлен метионин (кодируемый инициирующим ATG-кодоном), а также заменены остатки аспарагиновой кислоты в положениях 110, 185 и 186 на гистидин для инактивации ферментативного центра обратной транскриптазы [Gutierrez-Rivas et al, 2001] Белок gp140 содержал консенсусную последовательность белка др160 с удаленным трансмембранным и цитоплаоматическим доменом (676-860 а к ), сайтом разрезания и доменом слияния (500-534 а к), а также областью гептадных повторов (589-618 а к) [Chakrabarti et al, 2002] Кроме того, в белке др140 природный сигнальный пептид был заменен на аналогичную область из белка тканевого активатора плазминогена человека [Chapman et al, 1991] Белок Nef соответствовал консенсусной последовательностьи, из которой были удалены два остатка глицина, расположенные на N-конце Таким образам был инактивирован сайт присоединения меристиновой кислоты [Welker et al, 1998] Плазмидные ДНК pBMCsgag(A), pBMCsRT(A), pBMCsgp140(A), pBMCsnef(A) вошли в состав кандидат ной ДНК-вакцины против ВИЧ
Очистка плазмидных ДНК-вакцин
При использовании лабораторного культивирования и очистки плазмидных ДНК центрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия, продуктивность штаммов в среднем составляла 4-6 мг/л, что соответствует ранее опубликованным данным [Prazeres et al, 1999] При этом наблюдалась небольшая разница в выходе плазмидной ДНК в зависимости от фрагмента
гена ВИЧ-1, клонированного в плазмидный вектор (данные не представлены) Для проведения доклинических испытаний кандидатной ДНК вакцины плазмидные ДНК pBMCsgag(A), pBMCsRT(A), pBMCsgp140(A), pBMCsnef(A) были очищены хроматографически, с использованием гель-фильтрации на Sephacryl S-1000 Результат представлен на рис 2 Первую стадию хроматографической очистки (рис 2А) проводили в условиях протока элюирующего буфера 0,75 мл/мин на колонке SR 25/100 Видно, что происходит отделение плазмиды (пик II) от примеси геномной ДНК Е coli (пик I) и РНК (пик III) Вторую стадию (рис 2В) проводили при той же скорости протока, но на колонке SR 50/100, имеющей в 4 раза большую площадь поперечного сечения При этом происходило разделение различных форм плазмидных ДНК (суперскрученной - ССФ и релаксированной - РФ) Результат подтвержден электрофорезом (данные не представлены) Продуктивность метода составляла более 4 мг/л культуры (ОП6оо = Ю-20 ОЕ) В результате с 40 литров суммарной культуры Ecoli было получено 168 мл готового препарата кандидатной ДНК-вакцины для инъекционного введения, представляющего собой эквимолярный раствор смеси четырех плазмидных ДНК pBMCsgag(A), pBMCsRT(A), pBMCsgp 140(A), pBMCsnef(A) (1мг суммарной плазмидной ДНК на миллилитр физиологического раствора)
рнк
А - хроматограмма первой стадии очистки плазмидной ДНК В - хроматограмма второй стадии очистки плазмидной ДНК
Показатели контроля качества плазмидных ДНК, такие как содержание суперскрученной формы плазмиды и примесь РНК, определяли при каждом раунде очистки плазмид (44 образца) Содержание примеси геномной ДНК Eco//, белка, эндотоксинов (13 образцов), идентификация плазмидной ДНК (6 образцов) и стерильность проб (9 образцов) определяли для плазмид, используемых в опытах in vivo Для кандидатных ДНК-вакцин, участвующих в доклинических испытаниях, контроль качества проводили как на стадии конечных, так и промежуточных препаратов (табл 2) Следует отметить, что в отношении эндотоксинов примененный нами метод очистки заметно превосходит результат, полученный в исходной работе (100 EU/мг [Horn et al, 1995])
Таблица 2
Результаты контроля качества препаратов плазмидных ДНК, очищенных хроматографическим методом
Параметр Метод анализа Препарат, очищенный на Sephacryl S1000' Рекомендации fda"
ССФ- форма плазмидной ДНК Электрофорез в агарозном геле > 90% > 90%
Содержание РНК Электрофорез в агарозном геле - -
Содержание хромосомной ДНК ПЦР + авторадиография <10 нг/мг (5,7±3,6 нг/мг) <10 нг/мг
Чистота СФ соотношения А260/А280 А260/А230 >1,8 (2,0±0,1) >1,9 (2,4±0,3) >1,75 >1,9
Содержание белка микро-ВСА < 10 нг/мг (6+4 нг/мг) <10 нг/мг
Содержание эндотоксинов ЦМ-тест <0,1 EU/мг (0,04±0,0311Е/мг) < 0,1 EU/мг
Идентификация Рестрикционный анализ, ПЦР и сиквенс + +
Стерильность Культивирование в 1В-среде + +
- приведены средние значения и среднеквадратичные отклонения по параметрам содержание хромосомной ДНК, чистота, содержание белка, содержание эндотоксинов - www fda gov/cder/
Свойства кандидатных ДНК-вакцин in vitro
Важным параметром, характеризующим ДНК-вакцины, является экспрессии антигенов /л
—35ооа vitro На рис 3 представлен —2800 н результат анализа методом Northern-гибридизации экспрес-~моо Н сии мРНК генов др160 (2830н), •'~900н др120 (1790н), р17-24 (1415н ),
6000 н 4000 н-3000 н-2000 н-
1500 н 1000 н 500 н-200 н-
» _ ¿А,
Рис 3 Результаты Мог1Ьет-гибридиэации, РНК из клеток Ы1Н/ЗТЗ, трансформированных плазмидными ДНК
1 РНК из клеток 60,
2 РНК из клеток Ы1Н/ЗТЗ/рВМСдр160(В),
3 РНК из клеток М1Н/ЗТЗ/рВМСдр120(В),
4 РНК из клеток ШИ/ЭТЗ/рВМСр17-24(В),
5 РНК из клеток МН/ЗТЗ/рВМСпе^В),
6 РНК из клеток МН/ЗТЗ/ рВМС
пеГ (931 н) клетками МН/ЗТЗ, трансформмированными плаз-мидами рВМСдр160(В), рВМС др120(В), рВМСр17-24(В) и рВМС пе^В) Как видно из рис 3, подвижность выявляемых полос соответствует расчетной (дор 2,
3, 4, 5 соответственно) При этом размер мРНКгена env, экспрессируемой клетками F160, и содержащей IRES и
Neor элементы, приблизительно равен 3500н (рис. 3, дор. 1).
Эффективность экспрессии белков ВИЧ-1 gp41, gp120Asp, р17-24, Nef клетками линии NIH/3T3, трансформмированными плаз-мидными ДНК рВМСдр160(В), рВМСдр120Двр(В), рВМСр17-24(В) и pBMCnef(B), оценивали методом иммуноблота (рис. 4). В качестве источника специфических антител использовали сыворотку крови ВИЧ-инфицированного индивидуума. Как видно из рис. 4, в лизатах клеток выявляются специфические полосы, соответствующие белкам'. др41 (дор. 3), негликозилированной форме др120 (белок с удаленным сигнальным пеп-
U6kDa 97,4kDa
66kDa
48,5kDa
29kDa
gpl20Asp
pt7-24
34kDa 25kDa
Рис. 4. Результат анализа иммуноблотом белков клеток NIH/3T3, трансформированными пгазмидами
1. маркер Silver Stain MW Standard Mixture;
2. лизат клеток NIH/3T3 (15 мкл);
3. лизат клеток NIH/3T3/pBMCgp160(B);
4. лизат клеток NIH/3T3/pBMCgp120Asp(B); - 5. лизат клеток NIH/3T3/pBMCp17-24(B);
ТИДОМ) (дор. 4), слитому белку 6. лизат клеток NIH/3T3/pBMCnef(B); р 17-24 (дор. 5) и Nef (дор. 6). В 7 лизат клеток nih/ЗТЗ; 8. вирусный лизат.
вирусном лизате наблюдаются все полосы, соответствующие белкам - продуктам генов env и gag. Важно отметить, что регуляторные элементы вектора рВМС обеспечивают независимую от белка Rev экспрессию фрагментов гена env (рис. 3,4),
Для изучения изменения эффективности экспрессии модифицированного гена nef (плаз-мида pBMCsnef(A)) по отношению к природному (pBMCnef(A)), использовали методы иммуноблота (рис. 5) и анализа с помощью проточного цитофлуориметра (рис. 6). Как 1 2 3 4 5 6 7
33kDa» _ .....
"" fP1®"
24kDa->#
видно из рис. 5, уровень экспрессии природного белка Nef (дор. 3) примерно в пять раз меньше, чем модифицированного (дор. 5).
Из рис. 6 видно, что клетки, экспрессирующие
Рис. 5. Результат иммуноблота белков клеток 293Т, трансформированных плазмидами pBMCnef(A) и pBMCsnef(A) 1. маркер Page RulerTM Prestained Protein l.adder;
ПРИРОДНЫЙ 2. лизат клеток 293T; r 3. лизат клеток 293T/pBMCnef(A);
оелок Nef, на диаграмме 4 лизат клеток 293T/pBMCsnef(A), разведение 1/25; образуют область событий, четко 5. лизат клеток 293T/pBMCsnef(A), разведение 1/5; отделимую ОТ точек, соответ- 6. лизат клеток 293T/pBMCsnef(A), разведение 1/1;
, ' 7. рекомбинантный белок NEF.
ствующих нетрансформирован-
ным клеткам. Среднее значение и среднеквадратичное отклонение флуоресценции FITC для данной группы точек составляет 115±68 ед (обл. 1).
Клетки, экспрессирующие модифицированный белок Nef, образуют две области событий, разделимые как в отношении нетрансформированных клеток, так и между собой по уровню флюоресценции FITC. Средние значения для этих областей равны 96±55 ед. (обл. 2) и 2390±850 ед. (обл. 3). Так как меченых антител было взято с избытком и интенсивность флуоресценции пропорциональна количеству белка, получаем, что эффективность суммарной экспрессии возросла в 4,2 раз, что соответствует результатам, полученным иммуноблотом (рис. 5).
pBMCnef(A)
J 0%
1 (ЗУ.
0
ю я О M M II
pBMCsnef(A)
1,59%
8,61%
Рис. 6. Анализ эффективности экспрессии белка Nef клетками линии 293Т, трансформированными плазмидными ДНК, методом проточной цитофлуриометрии
Одним из важных свойств ДНК-вакцин, выделенных из бактерий, является активация клеток иммунной системы организма за счет наличия в составе плазмид неметиллированных CpG динуклеотидов. В опытах in vitro определяли эффективность стимуляции спленоцитов мыши плазмидой pBMCgpl 60(B) в концентрации 100мкг/мл в течение 11 часов или препаратом плазмидной ДНК, предварительно обработанной ДНКазой I (Юмкг на 1 мг ДНК в течение часа) (рис. 7). Из рисунка видно, что имеет место стимуляция
спленоцитов к экспрессии как ИФН-у, так и CD69. При обработке плазмиды ДНКазой I наблюдается достоверное снижение числа ИФН-у+ клеток (р<0,05). Снижение числа CD69+ клеток было не достоверно (р=0,06), что, возможно, связано с небольшим объемом выборки.
Из анализа популяции CD8+ и С04+спленоцитов при стимуляции плазмидой рВМСдр160(В) следует, что большинство ИФН-у+ клеток экспрессирует и маркер CD69. Так, в наших опытах выявляется 0,87% событий положительных по ИФН-у и CD69 относительно пула CD8+ лимфоцитов и 1,07% относительно
V X
е
S о,1%
S р<0,05
О
о
р=0,06
" и t
■ - без стимуляции о - стимуляция pBMCgpl60(B) А - стимуляция pBMCgp!60(B)/flHKa3a — - среднее значение по выборке
Рис. 7. Оценка относительного количества спленоцитов мыши, отвечающих экспрессией ИФН-у или CD69 на стимуляцию in vitro плазмидой рВМСдр160(В)
пула СР4+лимфоцитов Количество ИЛ-4+ CD4+ Т-лимфоцитов составляет 0,01%, и соответствует уровню отрицательного контроля (данные не представлены) Эти данные свидетельствуют о неспецифической дифференцировке хелперных лимфоцитов по Th1-зависимому пути
Изучение иммунологических свойств кандидатных ДНК-вакцин на
мышах
Было проведено сравнение иммуногенности плазмиды pBMCenv(B) с плазмидами pCMVENV (Перевозчиков А П (ИЭМ, Санкт-Петербург)), pENV1 и pENV2 (Щелкунов С Н (НПО "Вектор", Новосибирск, Россия)) Данные плазмиды были предоставлены соисполнителями Биомедицинского центра, в рамках межведомственной программы "Вакцины нового поколения и медицинские диагностические системы будущего" Иммунизацию мышей проводили в количестве 50 мкг ДНК в 100 мкл Анализировали специфическую цитотоксичность лимфоцитов в суспензии нестимулированных 'in vitro спленоцитов используя набор Су1оТох96 Было показано, что при вакцинации плазмидой pBMCenv(B) лизис достигал более высокого уровня Эффект наблюдался до 21 дня, с максимумом на 14 день после вакцинации (данные не представлены) Кроме того, в лаборатории иммунофармакологии под руководством Симбирцева А С (ГосНИИ ОЧБ) проводился анализ пролиферативной активности спленоцитов и ИФА Было показано, что уровень иммунологических показателей для ДНК-вакцины pBMCenv(B) был либо соизмерим, либо выше аналогичных параметров для pCMVENV, pENV1 и pENV2 Результаты данной работы представлены в совместной публикации [Климов и др , 1999]
Зависимость цитотоксичности от времени после разовой вакцинации плазмидной ДНК pBMCgpl60(B) представлена на рис. 8 (иммунизация 50 мкг ДНК в 100 мкл) и рис 9 (иммунизация 25 мкг ДНК в 100 мкл, с бустировнием на 50 день внутрибрюшинно по 105 клеток линии F160 в 200 мкл ФСБ) Из рис 8 видно, что происходит выход в кровь активных ЦТЛ из органов вторичной лимфатической системы Причем число эффекторных клеток в периферической крови выше, чем в селезенке (примерно одинаковый результат наблюдается для спленоцитов при Е/Т=25/1 и для РВМС при Е/Т=3/1) На 14 день после иммунизации также наблюдается цитотоксичность специфических ЦТЛ в суспензии лимфоцитов, выделенных из лимфоидных органов, ассоциированных с ЖКГ (данные не представлены) Все эти результаты говорят о системном характере иммунного ответа при ДНК-иммунизации Наблюдаемый уровень индукции специфических антител был незначителен (данные не представлены) Для оценки эффективности образования клеток иммунологической памяти использовался подход, основанный на введении иммунизированным животным сингенных клеток линии F160, конститутивно экспрессирующих др160 ВИЧ-1 (рис 9) Данный метод имитирует наличие инфицированных вирусом клеток в организме
мыши Как видно из рисунка, амплитуда и скорость нарастания вторичного ответа выше, чем первичного при вакцинации плазмидной ДНК рВМСдр 160(В), а также возникающего в группе контрольных животных Эти данные свидетельствуют об образовании клеток иммунологической памяти, быстро реагирующих активацией и трансформацией в эффекторные клетки, специфичные по отношению к антигену, введенному в организм отличным от первичной ДНК-вакцинации способом
Спленоциты _ 80, РВМС
5 7 9 рВМСдр160(В) 75/1 •—рВМСдр160(В) 50/1 *-рВМСдр160(В) 25/1 »— контроль 75/1 з— контроль 50/1 &—контроль 25/1
14 25 время (дни)
-рВМСдр160(В) 10/1 -рВМСдр160(В)6/1 -р8МСдр160(В) 3/1 -контроль 10/1 -контроль 6/1 -контроль 3/1
14 25 время (дни)
Рис
Анализ специфической цитотоксичности в зависимости от времени после разовой иммунизации мышей плазмидной ДНК рВМСдр160(В)
- Е Т=75 1
- Е Т=50 1
-ЕТ=251
« контроль Е Т=75 1
60
50
40
в- зо
0 10 20 30 40 50 60 70 80
| время (дни)
бустирование Р160
Рис 9 Анализ специфической цитотоксичности в суспензии спленоцитов в зависимости от времени после иммунизации мышей плазмидной ДНК рВМСдр160(В) с последующим бустированием клетками Р160 Для анализа специфической цитотоксичности у мышей, вакцинированных плазмидами рВМСр17-24(В) и рВМСпе^В) (иммунизация 50 мкг ДНК в 100 мкл), использовали метод, основанный на измерении числа клеток, подвергшихся цитолизу, с помощью проточного цитофлуориметра (рис 10) Важно, что уровень наблюдаемого лизиса характеризует активность нести-мулиров энных спленоцитов Измеряемая в данном случае величина отражает
-рВМСр17-24(В) -контроль ер р24(В)
-pBMCnef(B) - контроль ер Nef(B)
О 2
•г £-х
-е-
10/1
20/1
соотношение Е Т
Рис 10 Анализ специфической цитотоксичности в суспензии спленоцитов на 14 день после иммунизации мышей плаэмидами рВМСр17-24(В) или рВМСпеКВ)
процент клеток, подвергшихся воздействию ЦТЛ и не изменивших параметры клеточной структуры в течение времени инкубации
Анализ популяции СйЗ* и С04+ спленоцитов мышей, вакцинированных плазмидой рВМС пе^В) (данные не представлены), показал, что относительное количество С08+-лимфоцитов, отвечающих экспрессией ИФН-у на стимуляцию пептидом ер Ые^В), составляет около 3,33% от ' общего количества анализированных
спленоцитов (уровень изотипического контроля - 0,02%, уровень юнтроля неспецифической стимуляции - 0,08%, уровень контроля неспецифического синтеза ИФН-у - 0,15%) При этом число CD8+ клеток в суспензии быпо 24%, что означает, что около 13% данной популяции специфично по отношению к эпитопу ер Nef(B) Для С04+-лимфоцитов, стимулированных белком Nef, экспрессией ИФН-у отвечает 4,06%, а ИЛ-4 - 0,17% клеток, от общего количества анализированных спленоцитов Число CD4+ клеток в суспензии составляло 32%, что означает, что около 12% данной популяции отвечает экспрессией ИФН-у Наблюдаемая нами преимущественная стимуляция CD4+ лимфоцитов к экспрессии именно ИФН-у, а не ИЛ-4, говорит о преобладании Th1 типа хелперного ответа
На рис 11 представлены результаты анализа Т-клеточного иммунитета, возникающего у мышей линии Balb/C, иммунизированных три раза кандидатной ДНК-вакциной в дозе 100 мкл Из рис 11 следует, что эффект двойного бустирования выражается в усилении и пролонгировании аю ивности цитотоксических лимфоцитов Максимальные значения наблюдаются на второй и пятой неделе Уровень ЦТЛ возрастает после второго бустирования и достоверно наблюдается до 10-й недели после иммунизации включительно Относительно С08+-лимфоцитов наблюдается увеличение количества специфических к пулу пептидов С08+ИФН-у+ клеток на первой (6,64%) и третьей (3,36%) неделях (уровень отрицательного контроля составлял 1,15%) Таким образом, в результате бустирования общее количество специфических к анализируемому антигену CD8+ лимфоцитов падает, но возрастает их способность к цитолизу Для СЭ4+-лимфоцитов доля клеток, экспрессирующих ИФН-у в ответ на стимуляцию белком Nef, составляет 6,97% на первой неделе и 4 56% на четвертой неделе после иммунизации (при отрицательном контроле 0,99%) При анализе С04+ИЛ-4+ лимфоцитов значимых отклонений от контрольных значений не выявляется, что свидетельствует о преобладании Th1 типа хелперного иммунного ответа Уровень
специфических антител был незначителен (данные не представлены). Анализ ЦТЛ
специфический лизис минус контроль (%)
Анализ С08-лимфоцитов колличество CD8+ ИФН/ (%) 6
Анализ СТ>4-лимфоцитов 0 колличество CD4" 8 ИФНу7ИЛ-4*"(%)6
время (недели)
время (недели)
il ВИФН^
— H аип-4
.1» I LJs h_jfaJ^B-,
5 6 7 время (недели)
ДНК-бустирование
Рис. 11. Результаты анализа Т-кпеточного иммунитета, возникающего у мышей, иммунизированных три раза кандидатной ДНК-вакциной к"-среднее значение соответствующего контроля по всем значениям опыта.
ВЫВОДЫ
1. Создана идеологическая, методическая и реагентная база для разработки вакцин нового поколения - ДНК-вакцин.
2. Получен плазмидный вектор рВМС, на основе которого создана коллекция плазмидных ДНК, являющихся кандидатными ДНК-вакцинами против ВИЧ-инфекции.
3. Осуществлена модификация последовательности гена nef ВИЧ-1, которая значительно увеличивает его уровень экспрессии, но не во всех клетках одинаково.
4. Установлено, что кандидатные ДНК-вакцины in vitro обладают адъювантным эффектом по отношению к Т-лимфоцитам, выраженным в неспецифической дифференцировке хелперных лимфоцитов по Till-зависимому пути.
5. Показано, что при вакцинации мышей кандидатными ДНК-вакцинами возникает системный ВИЧ-специфический Th1-зависимый Т-клеточный иммунный ответ, и образуются клетки иммунологической памяти. При этом уровень индукции ВИЧ-специфических антител незначителен.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
(важнейшие)
1. Козлов A.n., Климов H.A., Машарский А.Э., Полякова М.С., Романович А.Э., Мурашеа Б.В.. Мурашева И.В. Рекомбинантная плаэмидная ДНК pBMC-nef(A)m-1, экпрессирующая белок nef вируса иммунодефицита человека типа 1 в эукариотических клетках. // Патент на изобретение № 2229518.-2003.
2 Козлов А П , Климов НА, Машарский А Э , Полякова М С , Романович А Э , Галачьянц (О П , Мурашев Б В Рекомбинантная плазмидная ДНК pBMC-gp120(A)m-1 для иммунизации против вируса иммунодефицита человека Патентна изобретение № 2227161 -2003
3 Козлов А П , Климов НА, Машарский А Э , Полякова М С , Романович А Э , Дорофеева Е С , Мурашев Б В Рекомбинантная плазмидная ДНК pBMC-RT(A)m-1, используемая для экспрессии обратной транскриптазы (RT) вируса иммунодефицита человека в клетках высших эукариот Патент на изобретение № 2238977 - 2003
4 Козлов А П , Климов НА, Машарский А Э , Полякова М С , Романович А Э , Духовлинов И В , Мурашев Б В Рекомбинантная плазмидная ДНК pBMC-gag(A)mod для экспрессии белка gag вируса иммунодефицита человека в эукариотических клетках Патент на изобретение № 2241752 -2003
5 Климов Н А , Ерошкин А М , Поздняков С Г, Веревочкин С В , Мурашев Б В , Котов А Ю , Пигарева Н В , Симбирцев А С , Романович А Э , Бажан С И , Щелкунов С Н , Козлов А П Сравнительные испытания новых иммуногенов и способов их доставки на мелких лабораторных животных //Аллергия, астма и клиническая иммунология - 1999 -T9 -С110-3
6 Мурашев Б В . Мурашева И В , Романович А Э , Машарский А Э , Климов НА, Козлов А П Создание и изучение иммунологических свойств ДНК-вакцины на основе гена env ВИЧ-1 // Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы - 2000 - Т 4 -№2 - С 29-37
7 Мурашев Б В . Мурашева И В , Духовлинов И В , Духовлинова Е Н , Машарский А Э ,'Галачьянц Ю П , Дорофеева Е С , Климов НА, Козлов А П Разработка ДНК-вакцин против ВИЧ/СПИД на основе генов, кодирующих иммуногенные эпитопы вариантов ВИЧ // Аллергия, астма и клиническая иммунология -2003 -Т7 -№9 - С 126-33
8 Karpenko L I, Nekrasova N А , Ignat'ev G М , Agafonov АР , Proniaeva Т Р , Murashev В V. Romanovich А Е, Klimov N А, Kozlov АР, ll'ichev АА Immune response In oral and rectal immunization by the attenuated strain of salmonella canying the HIV DNA-vaccine // Vopr Virusol -2003 -V48 -P 16-20
9 Мурашева И В, Мурашев Б В, Астанина М С , Козлов А П Экспрессия клетках £ coll, хроматографическая очистка и иммунологические свойства рекомбинантного белка Nef ВИЧ-1 // Физиология и патология иммунной системы - 2005 -Т9 -№7 -С 96-106
10 Murashev В У, Kazennova Е V, Kozlov A A, Murasheva IV, Dukhovlinova Е N , Galachyants Y Р, Dorofeeva Е С, Dukhovlinov IV , Smirnova G V, Mashareky A E , Kiimov N A, Kozlov A P , Immunogenicity of candidate DNA vaccine based on subtype A human Immunodeficiency virus type 1 predominant in Russia //Biotechnol J -2007 -V2 -P 871-8
11 Murashev В V. Murasheva IV, Kreslavskiy T Yu, Romanovich A E , Klimov N A, and Kozlov A P Immunological properties of HIV-1 env gene based DNA vaccines II Abstract Conference AIDS Vaccine 2001 Conference, Philadelphia PA USA - 2001 - P 84
12 Murashev В V . Masharsky A E , Murasheva I V, Romanovich A E , Dukhovlinov I V, Pavlova M S , Dukhovlinova Y N , Dorofeyeva Y S , Galatchiants Y P , Klimov N A, Kozlov A P Design, punficatlon, and immunological testing of DNA vaccines against HIV-1 // Abstract 10th Conferentce on Retroviruses and Opportunistic Infections Boston Massachusetts USA -2003 -P216
13 Dukhovlinov IV, Murashev BV. Murasheva I V, Vorojtsova E V, Masharsky AE , Klimov N A, Kozlov A P Design and Development of Candidate DNA Vaccines Based on HIV-1 Subtype A gag and nef Gene //Abstract AIDS Vaccine 2003 Conference New York. USA -2003 -P140
14 Dukhovlinova E N , Murashev В V . Galatchiants Yu P Dukhovlinov IV Murasheva I V, Kozlov AA, Kzenova E V, Pavlova M S , Masharsky AE , Kiimov NA., Kozlov AP Immunological properties of oral Salmonella typhimunum-based, and injectional forms of DNA-vaccine administered in vanous prime-boost combinations in mice // Abstract AIDS Vaccine 2006 Conference Amsterdam Netherlands -2006 -P 161
Подписано в печать 27 09 07 Формат 60x841/16
Бумага офсетная Печать офсетная Уел печ листов 0,93 Тираж 70 экз Заказ №63
ЦОП типографии Издательства СПбГУ 199061, С-Пегербург, Средний пр, д 41
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мурашев, Борис Владимирович
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ.
ВВЕДЕНИЕ.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Особенности развития ВИЧ-инфекции и возможность создания вакцины против ВИЧ-1.
1.1.1. Развитие ВИЧ-инфекции и уход вируса из под иммунной атаки.
1.1.2. Перспективность вакцинирования против ВИЧ-инфекции.
1.1.3. Значимость ЦТЛ-ответа при вакцинации против ВИЧ-инфекции.
1.1.4. Значимость IgG-ответа при вакцинации против ВИЧ-инфекции.
1.1.5. Значимость хелперного ответа, опосредованного CD4+ Т-лимфоцитами, при вакцинации против ВИЧ-инфекции.
1.2. ДНК-вакцины.
1.2.1. Структура и отдельные элементы ДНК-вакцины.
1.2.2. Потенциальные преимущества ДНК-вакцин перед традиционными подходами.
1.2.3. Экспрессия и презентация антигена, специфика иммунного ответа.
1.2.4. Эффективность трансформации и возможность интеграции в геном.
1.2.5. Самоадъювация ДНК-вакцин за счет CpG последовательностей.
1.2.6. Иммунологическое усиление ДНК-вакцин.
1.3. ДНК-вакцины против ВИЧ-1.
1.3.1. Возможность создания субтипической и субтип-независимой вакцины.
1.3.2. ДНК-вакцина как прайм при иммунизации.
1.3.3. Доклинические и клинические испытания ДНК-вакцин против ВИЧ-инфекции, проводящиеся в мире.
1.4. Методы очистки ДНК-вакцин и стандарты их качества.
1.4.1. Различные методы очистки ДНК-вакцин.
1.4.2. Контроль качества препаратов ДНК-вакцин.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Методы генно-инженерных манипуляций с ДНК.
2.1.1. Плазмидные ДНК, использованные в работе.
2.1.2. Реакции ферментативной модификации ДНК.
2.1.2.1. Полимеразная цепная реакция.
2.1.2.2. Реакция рестрикции плазмидной ДНК.
2.1.2.3. Реакция обработки ДНК-полимеразой фага Т4 (Т4 ДНКпол).
2.1.2.4. Реакция обработки ДНК щелочной фосфотазой из кишечника теленка (CIAP).
2.1.2.5. Реакция лигирования фрагментов ДНК.
2.1.2.6. Реакция ферментативного секвенирования ДНК.
2.1.3. Электрофорез нуклеиновых кислот.
2.1.3.1. Аналитический электрофорез ДНК в агарозном геле.
2.1.3.2. Препаративный электрофорез ДНК и выделение ДНК из агарозного геля.
2.1.3.3. Электрофорез РНК в денатурирующих условиях.
2.1.4. Микробиологические методы.
2.1.4.1. Приготовление компетентных клеток E.coli для трансформации.
2.1.4.2. Трансформация клеток Е. coli.
2.1.4.3. Скрининг рекомбинантных клонов на наличие искомой плазмидной ДНК.
2.1.4.4. Масштабное культивирования клеток E.coli - продуцентов плазмидных ДНК-вакцин.
2.2. Очистка нуклеиновых кислот.
2.2.1. Выделение плазмидной ДНК из клеток E.coli.
2.2.2. Очистка ДНК между ферментативными реакциями.
2.2.3. Концентрирование нуклеиновых кислот.
2.2.4. Очистка плазмидной ДНК в градиенте плотности хлористого цезия с бромистым этидием.
2.2.5. Хроматографическая очистка плазмидной ДНК.
2.2.6. Выделение тотальной РНК из трансформированных культур клеточных линий.
2.3. Контроля качества препаратов плазмидных ДНК.
2.3.1. Определение содержания суперскрученной формы плазмид.
2.3.2. Определение содержания РНК в препаратах плазмидных ДНК.
2.3.3. Определение содержания хромосомной ДНК E.coli в препаратах плазмидных ДНК.
2.3.3.1. Подготовка проб к анализу.
2.3.3.2. Перенос и иммобилизация ДНК на фильтрах.
2.3.3.3. Получение специфического меченого зонда.
2.3.3.4. Проведение гибридизации ДНК.
2.3.4. Определение спектрофотометрических показателей препаратов плазмидных ДНК и РНК.
2.3.5. Определение содержания белка в препаратах плазмид.
2.3.6. Определение содержания эндотоксинов в препаратах плазмид.
2.3.7. Методы идентификации плазмид.
2.3.8. Определение стерильности препаратов плазмид.
2.4. Анализ экспрессии генов ВИЧ-1 in vitro.
2.4.1. Культуральные методы.
2.4.1.1. Линии клеток, среды и условия культивирования.
2.4.1.2. Трансформация клеток млекопитающих.
2.4.1.3. Определение эффективности трансформации с помощью проточного цитофлуориметра.
2.4.2. Northern-гибридизация.
2.4.2.1. Перенос и иммобилизация препаратов РНК на фильтрах.
2.4.2.2. Получение специфических меченых зондов.
2.4.2.3. Проведение гибридизации РНК.
2.4.3. Иммуноблотинг.
2.4.3.1. Получение образцов.
2.4.3.2. Электрофорез белков в ПААГ.
2.4.3.3. Перенос препаратов белков на фильтр.
2.4.3.4. Проведение иммунологического окрашивания белков.
2.4.4. Анализ экспрессии гена nef с помощью проточного цитофлуориметра.
2.5. Иммунологические методы исследования.
2.5.1. Иммунизация мышей и забор иммунологических проб.
2.5.2. Анализ специфической активности ЦТЛ.
2.5.2.1. Выделение эффекторных лимфоцитов.
2.5.2.2. Цитотоксический анализ с использованием набора CytoTox 96.
2.5.2.3. Цитотоксический анализ с использованием проточного цитофлуориметра.
2.5.3. Анализ CD8+- спленоцитов иммунизированных мышей.
2.5.4. Анализ CD4+- спленоцитов иммунизированных мышей.
2.5.5. Иммуноферментный анализ (ИФА).
2.5.6. Анализ неспецифической стимуляции лимфоцитов мыши плазмидной ДНК in vitro.
2.6. Обработка результатов и статистический анализ данных.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ.
3.1. Создание плазмидного экспрессионного вектора рВМС.
3.2. Создание плазмид на основе вектора рВМС.
3.3. Очистка плазмидных ДНК.
3.3.1. Хроматографическая очистка плазмидных ДНК.
3.3.2. Контроль качества плазмидных ДНК.
3.4. Изучение свойств полученных плазмид in vitro.
3.4.1. Анализ экспрессии генов ВИЧ-1 in vitro.
3.4.2. Неспецифическая стимуляция лимфоцитов мыши плазмидами in vitro.
3.5. Результаты лабораторных иммунологических испытаний препаратов кандидатных ДНК-вакцин.
3.5.1. Результаты сравнительнх испытаний ДНК вакцин на основе вектора рВМС и других векторов, полученных соисполнителями Биомедицинского центра по данной тематике.
3.5.2. Результаты иммунологических испытании ДНК-вакцин несущих гены ВИЧ-1 субтипа В.
3.5.3. Некоторые результаты доклинических испытаний кандидатных ДНК-вакцин несущих гены ВИЧ-1 субтипа А.
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
4.1. Создание плазмидного экспрессионного вектора рВМС и серии плазмидных ДНК-вакцин.
4.2. Оптимизация штамма-продуцента.
4.2. Очистка плазмидных ДНК-вакцин.
4.3. Свойства кандидатных ДНК-вакцин в системе in vitro.
4.4. Изучение иммунологических свойств кандидатных ДНК-вакцин на мышах.
ВЫВОДЫ.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Создание и изучение биологических свойств кандидатных ДНК-вакцин против ВИЧ"
Актуальность проблемы.
В России и других странах бывшего СССР в настоящее время эпидемия ВИЧ-инфекции находится в стадии перехода от концентрированной, в среде инъекционных наркопотребителей, к генерализованной, т.е. распространяющейся среди людей, не принадлежащих к обособленным группам риска. Как было показано в нашей и других лабораториях, уровень генетического разнообразия ВИЧ-1 в странах СНГ и темпы его роста являются самыми низкими в мире [138, 156]. Таким образом, полученная в лаборатории биомедицинского центра полная нуклеотидная последовательность генома ВИЧ-1 доминирующего на территории России и стран СНГ субтипа A (00UA0116) является основой для создания отечественной вакцины против ВИЧ-инфекции.
ДНК-вакцины являются новым методом вакцинации, основанным на введении ДНК, кодирующей антигены патогена и обеспечивающей их экспрессию в клетках иммунизированного организма. Имитируя вирусную инфекцию и не являясь таковой в действительности, данный подход инициирует развитие полноценного, преимущественно опосредованного Т-клетками иммунного ответа [75]. Применение гетерологичной системы праймирования и бустирования с использованием различных векторов доставки одного и того же иммуногена стимулирует как Т-клеточное, так и гуморальное звено иммунного ответа. При этом многими авторами показано, что использование ДНК-вакцин при праймировании является перспективным и целесообразным [188].
Существует общепризнанное мнение, что профилактическая вакцина против ВИЧ-инфекции должна индуцировать специфический Т-клеточный и, возможно, гуморальный иммунный ответ. При этом в связи с высоким генетическим разнообразием ВИЧ-1 в мире считается, что создание кандидатных вакцин против ВИЧ/СПИД целесообразно проводить на основе субтипов ВИЧ-1, доминирующих в регионе, для которого эти вакцины предназначены [103].
Цели и задачи исследования.
Целью данного исследования является создание кандидатных ДНК-вакцин против ВИЧ и изучение их биологических свойств.
Задачи исследования:
1. Осуществление молекулярного дизайна плазмидного вектора и разработка серии плазмидных кандидатных ДНК-вакцин против ВИЧ-инфекции.
2. Изучение экспрессионных и адъювантных возможностей кандидатных ДНК-вакцин в системе in vitro.
3. Определение способности ДНК-вакцин вызывать различные формы иммунного ответа у мышей.
Научная новизна работы.
Впервые был получен отечественный препарат кандидатной ДНК-вакцины против ВИЧ-инфекции, несущий фрагменты генов российского штамма ВИЧ-1 субтипа А, и всесторонне изучены его биологические свойства. Разработанная оригинальная векторная система обеспечивает эффективную экспрессию антигенов и адъювантность кандидатных ДНК-вакцин в системе in vitro. Модификация последовательности гена nef штамма ВИЧ-1 доминирующего субтипа А российского изолята увеличивает уровень его экспрессии по отношению к природному. Показана активация ВИЧ-специфического иммунного ответа при внутримышечной вакцинации мышей кандидатными ДНК-вакцинами, а также образование клеток иммунологической памяти.
Научно-практическое значение работы.
Данные проведенного исследования представляют собой часть работы по созданию профилактической вакцины против ВИЧ-инфекции, проводимой в ННИУ «Биомедицинский центр», ФГУП "ГосНИИ особо чистых биопрепаратов ФМБА России" и СПбГУ. В ходе работы созданы генно-инженерные конструкции и кандидатные вакцины против ВИЧ/СПИД. Включение в конструкции последовательностей фрагментов генов штамма ВИЧ-1 субтипа А, доминирующего на территории России и стран СНГ, делает перспективным дальнейшие испытания и применение полученных кандидатных вакцин в данном регионе. Проведено всестороннее изучение биохимических, биологических и иммунологических свойств данного препарата. Доклинические испытания, осуществленные в лабораториях ННИУ "Биомедицинский центр" и ФГУП "ГосНИИ особо чистых биопрепаратов ФМБА России", показали, что новая вакцина не токсична, не вызывает аллергических реакций, безопасна, апирогенна и не обладает раздражающим действием. Эффективная активация ВИЧ-специфического Т-клеточного иммунного ответа и образование клеток иммунологической памяти при вакцинации мышей, выявленные в работе, являются потенциальной предпосылкой иммуногенности данных препаратов у людей и протективности вызываемых реакций против инфицирования ВИЧ. Таким образом, данная работа не только углубляет фундаментальные знания и теоретические основы вакцинологии, но и вносит непосредственный практический вклад в борьбу с эпидемией ВИЧ/СПИД.
Форма выполнения диссертационной работы.
Работа выполнялась в рамках финансирования ННИУ "Биомедицинский центр" и ФГУП "ГосНИИ особо чистых биопрепаратов" ФМБА России по Межведомственной научно-технической программе "Вакцины нового поколения и медицинские диагностические системы будущего", Федеральной целевой научно-технической программе "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники", а также по грантам Международного центра Фогарти (FIC, AITRP, 5-D43-TWO1028-04) и МНТЦ №2344.
Апробация работы.
Материалы диссертации были представлены на 7-й - 12-й и 14-й - 16-й Международных конференциях "СПИД, рак и родственные проблемы", Санкт-Петербург, Россия, 1999-2004 и 2005-2007; международных конференциях "Вакцина против СПИДа" Филадельфия, США, 2001; Нью-Йорк, США, 2003 и Амстердам, Голландия, 2006; 10-й конференции по ретровирусам и оппортунистическим инфекциям, Бостон, США, 2003. По теме диссертации опубликовано 11 статей, 29 тезисов докладов и получено 6 патентов Российской Федерации.
Объем и структура диссертации.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 196 страницах машинописного текста, иллюстрирована 28 рисунками, 17 таблицами и 9 приложениями. Список литературы содержит 260 литературных источников.
Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Мурашев, Борис Владимирович
ВЫВОДЫ
1. Создана идеологическая, методическая и реагентная база для разработки вакцин нового поколения - ДНК-вакцин.
2. Получен плазмидный вектор рВМС, на основе которого создана коллекция плазмидных ДНК, являющихся кандидатными ДНК-вакцинами против ВИЧ-инфекции.
3. Осуществлена модификация последовательности гена nef ВИЧ-1, которая значительно увеличивает его уровень экспрессии, но не во всех клетках одинаково.
4. Установлено, что кандидатные ДНК-вакцины in vitro обладают адъювантным эффектом по отношению к Т-лимфоцитам, выраженным в неспецифической дифференцировке хелперных лимфоцитов по Независимому пути.
5. Показано, что при вакцинации мышей кандидатными ДНК-вакцинами возникает системный ВИЧ-специфический Thl-зависимый Т-клеточный иммунный ответ, и образуются клетки иммунологической памяти. При этом уровень индукции ВИЧ-специфических антител незначителен.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мурашев, Борис Владимирович, Санкт-Петербург
1. Духовлинов И.В. Изучение свойств ДНК-иммуногенов на основе гена gag ВИЧ-1 субтипа А. / И.В. Духовлинов, Е.В. Ворожцова, Е. В. Казеннова, Б.В. Мурашев и др. // Русский журнал СПИД, рак и общественное здоровье. -2006. Т.10. -№1. - С.35-42.
2. Климов Н.А. Сравнительные испытания новых иммуногенов и способов их доставки на мелких лабораторных животных./ Н.А. Климов, A.M. Ерошкин, С.Г. Поздняков и др. // Аллергия, астма и клиническая иммунология. 1999. -Т.9.-С.110-113.
3. Козлов А.П. Рекомбинантная плазмидная ДНК pBMC-gpl20(A)m-l для иммунизации против вируса иммунодефицита человека. / Козлов А.П., Климов Н.А., Машарский А.Э. и др. // Патент на изобретение Российской Федерации. -№ 2227161. 2003.
4. Мурашев Б.В. Разработка ДНК-вакцин против ВИЧ/СПИД на основе генов, кодирующих иммуногенные эпитопы вариантов ВИЧ. / Б.В. Мурашев, И.В. Мурашева, И.В. Духовлинов и др. // Аллергия, астма и клиническая иммунология. 2003. - Т.7. - №9. - С.126-133.
5. Мурашев Б.В. Создание и изучение иммунологических свойств ДНК-вакцины на основе гена env ВИЧ-1. / Б.В. Мурашев, И.В. Мурашева, А.Э. Романович и др. // Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы. -2000. Т.4. - №2. - С.29-36.
6. Мурашев Б.В. Экспрессия рекомбинантных белков Nef и р24 ВИЧ-1 в клетках E.coli и их очистка. / Б.В. Мурашев, И.В. Мурашева, А.С.Рождественская и др. // Русский журнал «СПИД, рак и общественное здоровье». 2006. - Т. 10. - №1. - С.28-34.
7. Хаитов P.M. СПИД / P.M. Хаитов, Г.А. Игнатьева // Москва: Народная академия культуры и общечеловеческих ценностей. - 1992.
8. Ada G.L. The immune response to influenza infection. / G.L. Ada, P.D. Jones // Curr Top Microbiol Immunol. 1986. - V. 128. - P. 1-54.
9. Albini A. HIV-1 Tat protein mimicry of chemokines. / A. Albini, S. Ferrini, R. Benelli et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA- 1998. V.95. - P. 13153-8.
10. Alexander-Miller M.A. Role of antigen, CD8, and cytotoxic T lymphocyte (CTL) avidity in high dose antigen induction of apoptosis of effector CTL. / M.A. Alexander-Miller, G.R. Leggatt, A. Sarin, J.A. Berzofsky // J. Exp. Med. 1996. -V. 184.-P.485-92.
11. Alizon M. Genetic variability of the AIDS virus: nucleotide sequence analysis of two isolates from African patients / M. Alizon, S. Wain-Hobson, L. Montagnier et al. // Cell. 1986. - V.46. - P.63-74.
12. Allen P.M. Promethean viruses? / P.M. Allen, R.M. Zinkernagel // Nature. 1994. - V.369. -P.355-6.
13. Alving C.R. Novel vaccines and adjuvants: mechanisms of action. / C.R. Alving, N.M. Wassef// AIDS Res. Hum. Retrovir. 1994.- V.l0.-P.91^L
14. Amano H. Morphological estimation of total number of influenza A type virion spikes. / H. Amano, Y. Hosaka // J. Electron. Microsc. 1992. - V.41. - P. 104-6
15. Andre S. Increased immune response elicited by DNA vaccination with a synthetic gpl20 sequence with optimized codon usage. / S. Andre, B. Seed, J. Eberle et al. // J. Virol. 1998. - V.72. - P.1497-503.
16. Annunziata P. HIV-1 gpl20 increases the permeability of rat brain endothelium cultures by a mechanism involving substance P./ P.Annunziata, C.Cioni, S. Toneatto, E. Paccagnini // AIDS. 1998. - V.12. - P.2377-85.
17. Appay V.Characterization of CD4(+) CTLs ex vivo. / V.Appay, J.J. Zaunders, L. Papagno et al. // J. Immunol. 2002. - V.l68. - P.5954-8.
18. Ara Y. Zymosan enhances the immune response to DNA vaccine for human immunodeficiency virus type-1 through activation of complement system. / Y. Ara, T. Saito, T. Takaqi et al. // Immunol. 2001. - V.103. - P.98-105.
19. Badovinac V.P.Programmed contraction of CD8(+) T cells after infection. / V.P.Badovinac, B.B. Porter, J.T. Harty // Nat. Immunol. 2002. - V.3. - P.619-26.
20. Barnett S.W. Vaccination with HIV-1 gpl20 DNA induces immune responses that are boosted by a recombinant gpl20 protein subunit. / S.W. Barnett, S. Rajasekar, H. Legg // Vaccine. 1997. - V.15. - P.869-73.
21. Barouch D.H. Control of viremia and prevention of clinical AIDS in rhesus monkeys by cytokine-augmented DNA vaccination. / D.H. Barouch, S. Santra, J.E. Schmitz et al. // Science. 2000. - V.290. - P.486-92.
22. Barouch D.H. DNA vaccination for HIV-1 and SIV./ D.H. Barouch, N.L. Letvin // Intervirology. 2000. - V.43. - P.282-7.
23. Belz G.T. Compromised influenza virus-specific CD8(+)-T-cell memory in CD4(+)-T-cell-deficient mice. / G.T. Belz, D. Wodarz, G. Diaz // J. Virol. -2002. V.76. - P.12388-93.
24. Benimetskaya L. Mac-1 (CDllb/CD18) is an oligodeoxynucleotide-binding protein. / L. Benimetskaya, J.D. Loike, Z. Khaled, et al. // Nat. Med. 1997. -V.3.-P.414-20.
25. Bertoletti A. Natural variants of cytotoxic epitopes are T-cell receptor antagonists for antiviral cytotoxic T cells. / A. Bertoletti, A. Sette, F.V.Chisari et al. // Nature. 1994. - V.369. - P.407-10.
26. Binley J.M. Analysis of the interaction of antibodies with a conserved enzymatically deglycosylated core of the HIV type 1 envelope glycoprotein 120. / J.M. Binley, R. Wyatt, E. Desjardins et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. -1998. V.14. -P.191-8.
27. Birnboim H.C. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. / H.C.Birnboim, J. Doly // Nucleic. Acids. Res. 1979. - V.7. -P.l 513—1523.
28. Borrow P. Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection. / P.Borrow, H. Lewicki, B.H. Hahn et al. // J. Virol. 1994. - V.68. - P.6103-10.
29. Bourinbaiar A.S. The ratio of defective HIV-1 particles to replication-competent infection virions. / A.S. Bourinbaiar//Acta. Virol. 1994. - V.38. -P.59-61.
30. Branovic K. Application of short monolithic columns for fast purification of plasmid DNA. / K. Branovic, D. Forcic, J. Ivancic et al. // J. Chromatogr. В Analyt. Technol. Biomed. Life. Sci. 2004. - V.801. - P.331-7.
31. Buchbinder S. HIV-infected long-term nonprogressors: epidemiology, mechanisms of delayed progression, and clinical ahd research implications. / S. Buchbinder, E. Vittinghoff// Microbes ahd Infection. 1999. - P.l 113-20.
32. Budker V. Hypothesis: naked plasmid DNA is taken up by cells in vivo by a receptor-mediated process. / V.Budker, T. Budker, G. Zhang et al. // J. Gene. Med.-2000.-V.2.-P.76-88.
33. Burrows S.R. The specificity of recognition of a cytotoxic T lymphocyte epitope. / S.R. Burrows, S.J. Rodda, A. Suhrbier et al. // Eur. J. Immunol. 1992. - V.22. -P.191-5.
34. Burton D.R. A sound rationale needed for phase III HIV-1 vaccine trials. / D.R. Burton, R.C.Desrosiers, R.W. Doms et al. // Science. -2004. -V.303. -P.316.
35. Cao H. Cytotoxic T-lymphocyte cross-reactivity among different human immunodeficiency virus type 1 clades: implications for vaccine development. / H. Cao, P.Kanki, J.L. Sankale et al. // J. Virol. 1997. - V.71. -P.8615-23.
36. Caplen N.J. Gene therapy for cystic fibrosis in humans by liposome-mediated DNA transfer: the production of resources and the regulatory process. / NJ. Caplen, X. Gao, P.Hayes et al. // Gene Ther. 1994. - V.l. - P.139^47
37. Chakrabarti B.K. Modifications of the human immunodeficiency virus envelope glycoprotein enhance immunogenicity for genetic immunization. / B.K. Chakrabarti, W.P.Kong, B.Y. Wu et al. // J. Virol. 2002. - V.76. - P.5357-68.
38. Chandra G. Large-scale purification of plasmid DNA by fast protein liquid chromatography using Hi-Load Q Sepharose column. / G. Chandra, P.Patel, T.A. Kost, J.G. Gray // Anal. Biochem. 1992. - V.203. - P. 169-72.
39. Chang K.M. Differential CD4(+) and CD8(+) T-cell responsiveness in hepatitis С virus infection. / K.M. Chang, R. Thimme, J.J. Melpolder et al. // Hepatology. -2001. V.33. -P.267-76.
40. Chapman B.S. Effect of intron A from human cytomegalovirus (Towne) immediate-early gene on heterologous expression in mammalian cells. / B.S. Chapman, R.M. Thayer, K.A. Vincent et al. // Nucleic Acids Res. 1991. - V.19. -P.3979-86.
41. Choi M.J. Topical vaccination of DNA antigens: topical delivery of DNA antigens. / M.J. Choi, H.I. Maibach // Skin Pharmacol. Appl. Skin Physiol. 2003. - V.16. -P.271-82.
42. Cichutek K. Nucleic acid immunization: a prophylactic gene therapy? / Cichutek K. // Vaccine. 1994. - V. 12. - P. 1520-5.
43. Cocchi F. Identification of RANTES, MIP-1 alpha, and MIP-1 beta as the major HIV-suppressive factors produced by CD8+ T cells. / F. Cocchi, A.L. DeVico, A. Garzino-Demo et al. // Science. 1995. - V.270. - P.1811-5.
44. Coffin J.M. Genetic variation in AIDS viruses. / J.M. Coffin // Cell. 1986. -V.46. -P.l-4.
45. Coffin J.M. HIV population dynamics in vivo: implications for genetic variation, pathogenesis, and therapy. / J.M. Coffin 11 Science. 1995. - V.267. - P.483-9.
46. Conant K. Induction of monocyte chemoattractant protein-1 in HIV-1 Tat-stimulated astrocytes and elevation in AIDS dementia. / K. Conant, A. Garzino-Demo, A. Nath, et al. // Proc Natl Acad Sci U S A. 1998. - V.95. - P.3117-21.
47. Constant S.L. Induction of Thl and Th2 CD4+ T cell responses: the alternative approaches. / S.L. Constant, K. Bottomly // Annu. Rev. Immunol. 1997. - V.15. - P.297-322.
48. Currier J.R. A panel of MHC class I restricted viral peptides for use as a quality control for vaccine trial ELISPOT assays. / J.R. Currier, E.G. Kuta, E. Turk et al. // J. Immunol. Methods. 2002. - V.260. - P. 157-72.
49. Davenport M.P. Clonal selection, clonal senescence, and clonal succession: the evolution of the T cell response to infection with a persistent virus. / M.P.Davenport, C.Fazou, A.J. McMichael, M.F. Callan // J. Immunol. 2002. -V.168. -P.3309-17.
50. Davis H.L. Comparison of plasmid DNA preparation methods for direct gene transfer and genetic immunization. / H.L. Davis, M. Schleef, P.Moritz et al. // Biotechniques. 1996. - V.21. - P.92-9.
51. Demkowicz W.E. Vaccinia virus-specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes in humans. / W.E. Demkowicz, F.A. Ennis // J. Virol. 1993. - V.67. - P. 1538-44.
52. Diogo M.M. Purification of a cystic fibrosis plasmid vector for gene therapy using hydrophobic interaction chromatography. / M.M. Diogo, J.A. Queiroz, G.A. Monteiro, et al. // Biotechnol. Bioeng. 2000. - V.68. - P.576-83.
53. Donnelly J.J. DNA vaccines. / J.J. Donnelly, J.B. Ulmer, J.W. Shiver, M.A. Liu // Annu. Rev. Immunol. 1997. - V.15. - P.617-48.
54. Dukhovlinov I.V. Design and development of candidate DNA vaccines based on subtype A HIV-1 gag and nef gene. / I.V.Dukhovlinov, B.V.Murashev, I.V.Murashevaetal. //AIDS Vaccine 2003 Conference. -2003. P. 140.
55. Dupuis M. Distribution of DNA vaccines determines their immunogenicity after intramuscular injection in mice. / M. Dupuis, K. Denis-Mize, C.Woo et al. // J. Immunol. 2000. - V.165. - P.2850-8.
56. Earl P.L. Immunogenicity and protective efficacy of oligomeric human immunodeficiency virus type 1 gpl40. / P.L. Earl, W. Sugiura, D.C.Montefiori et al. // J. Virol. 2001. - V.75. - P.645-53.
57. Eigen M. On the nature of virus quasispecies / M. Eigen // Trends. Microbiol. -1996. V.4. -P.216-8.
58. Esser M.T. Memory T cells and vaccines. / M.T. Esser, R.D. Marchese, L.S. Kierstead et al. // Vaccine. 2003. - V.21. - P.419-30.
59. Estcourt M.J. DNA vaccines against human immunodeficiency virus type 1. / M.J. Estcourt, A.J. McMichael, T. Hanke // Immunol. Rev. 2004. - V.199. - P.144-55.
60. Estcourt M.J. Prime-boost immunization generates a high frequency, high-avidity CD8(+) cytotoxic T lymphocyte population. / M.J. Estcourt, A.J. Ramsay, A. Brooks et al. // Int. Immunol. 2002. - V.14. - P.31-7.
61. Fackler O.T. Live and let die: Nef functions beyond HIV replication. / O.T. Fackler, A.S. Baur // Immunity. -2002. V.l6. - P.493-7.
62. Ferrantelli F. Neutralizing antibodies against HIV back in the major leagues? / F. Ferrantelli, R.M. Ruprecht // Curr. Opin. Immunol. - 2002. - V.l4. - P.495-502.
63. Ferreira G.N.M. Studies on the batch adsorbtion of plasmid DNA onto anion-exchange chromatographic supports. / G.N.M. Ferreira, J.M.S. Cabral, D.M.F. Prazeres // Biotechnol. Prog. 2000. - V.l6. - P.416-24.
64. Foecking M.K. Powerful and versatile enhancer-promoter unit for mammalian expression vectors. / M.K. Foecking, H. Hofstetter // Gene. 1986. - V.45. -P.101-5.
65. Fouts T.R. Expression and characterization of a single-chain polypeptide analogue of the human immunodeficiency virus type 1 gpl20-CD4 receptor complex. / T.R. Fouts, R. Tuskan, K. Godfrey et al. // J. Virol. 2000. - V.l A. - P. 11427-36.
66. Fujii Y. Evidence for the role of human immunodeficiency virus type 1 Nef protein as a growth inhibitor to CD4+T lymphocytes and for the bloking of the nef function by anti-Nef antibodies. / Y. Fujii, M. Ito, K. Ikuta // Vaccine. 1993. -V.l 1-P.837-47.
67. Fujita K. Rapid degradation of CD4 in cells expressing human immunodeficiency virus type 1 Env and Vpu is blocked by proteasome inhibitors / K. Fujita, S. Omura, J. Silver//J. Gen. Virol. 1997.-V.78. -P.619-25.
68. Gallimore A. Protective immunity does not correlate with the hierarchy of virus-specific cytotoxic T cell responses to naturally processed peptides. / A. Gallimore, T. Dumrese, H. Hengartner, et al. // J. Exp. Med. 1998. - V.l87. - P. 1647-57.
69. Gallo R.C. Tat as one key to HIV-induced immune pathogenesis and Tat (correction of Pat) toxoid as an important component of a vaccine. / R.C.Gallo // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1999. - V. 96. - P.8324-6.
70. Geleziunas R. HIV-1 Nef inhibits ASKl-dependent death signaling providing a potential mechanism for protecting the infected host cell. / R. Geleziunas, W. Xu, K. Takeda et al. //Nature. -2001. V.410. -P.834-8.
71. Glansbeek H.L. Adverse effects of feline IL-12 during DNA vaccination against feline infectious peritonitis virus. / H.L. Glansbeek, B.L. Haagmans, E.G. Lintelo et al. // J. Gen. Virol.- 2002. V.83. - P. 1-10.
72. Goodenow M. HIV-1 isolates are rapidly evolving quasispecies: evidence for viral mixtures and preferred nucleotide substitutions / M. Goodenow, T. Huet, W. Saurin et al. // J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. 1989. - V.2. - P.344-52.
73. Gould SJ. The trojan exosome hypothesis. / SJ. Gould, A.M. Booth, J.E. Hildreth // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2003. V.100. - P. 10592-7.
74. Graf M. Codon-optimized genes that enable increased heterologous expression in mammalian cells and elicit efficient immune responses in mice after vaccination of naked DNA. / M. Graf, L. Demi, R. Wagner // Methods. Mol. Med. 2004. -V.94.-P.197-210.
75. Greenberg M.E. The SH3 domain-binding surface and an acidic motif in HIV-1 Nef regulate trafficking of class IMHC complexes. / M.E. Greenberg, A.J. Iafrate, J. Skowronski // EMBO J. 1998.- V.7. - P.2777-289.
76. Greenway A. Human immunodeficiency virus type 1 Nef protein inhibits activation pathways in peripheral blood mononuclear cells and T-cell lines / A. Greenway, A. Azad, D. McPhee // J. Virol. 1995. - V.69. - P.l842-50.
77. Grundner G. Factors limiting the immunogenicity of HIV-1 gpl20 envelope glycoproteins. / G. Grundner, M. Pancera, J.M. Kang et al. // Virology. 2004. -V.330. -P.233^18.
78. Gursel M. Differential and competitive activation of human immune cells by distinct classes of CpG oligodeoxynucleotide. / M. Gursel, D. Verthelyi, I. Gursel, et al. // J. Leukoc. Biol. 2002. - V.71. - P.813-20.
79. Gurunathan S. DNA vaccines: a key for inducing long-term cellular immunity. / S. Gurunathan, C.Y. Wu, B.L. Freidag, R.A. Seder // Curr. Opin. Immunol. -2000. V.12. - P.442-7.
80. Gurunathan S. DNA vaccines: immunology, application, and optimization. / S. Gurunathan, D.M. Klinman, R.A. Seder // Annu. Rev. Immunol. 2000. - V.18. -P.927-74.
81. Gutierrez-Rivas M. A mutation in the primer grip region of HIV-1 reverse transcriptase that confers reduced fidelity of DNA synthesis. / M. Gutierrez-Rivas, L. Menendez-Arias // Nucleic. Acids. Res. 2001. - V.29. - P.4963-72.
82. Hahn B.H. Genetic variation in HTLV-III/LAV over time in patients with AIDS or at risk for AIDS / B.H. Hahn, G.M. Shaw, M.E. Taylor et al. // Science. 1986. -V.232.-P.1548-53.
83. Haigwood N.L. Native but not denatured recombinant human immunodeficiency virus type 1 gpl20 generates broad-spectrum neutralizing antibodies in baboons. / N.L. Haigwood, P.L. Nara, E. Brooks et al. // J. Virol. 1992. - V.66. - P. 172-82.
84. Halstead S.B. Global epidemiology of dengue hemorrhagic fever. Southeast Asian. / S.B. Halstead // J. Trop. Med. Public. Health. 1990. - V.21. - P.636^1.
85. ЮЗ.Напке Т. Design and construction of an experimental HIV-1 vaccine for a year-2000 clinical trial in Kenya. / T. Hanke, A.J. McMichael // Nat. Med. 2000. -V.6. -P.951-5.
86. Hanke T. Enhancement of MHC class I-restricted peptide-specific T cell induction by a DNA prime/MVA boost vaccination regime. / T. Hanke, T.J. Blanchard, J. Schneider et al. // Vaccine. 1998. - V.16. - P.439^5.
87. Hassett D.E. Direct ex vivo kinetic and phenotypic analyses of CD8(+) T-cell responses induced by DNA immunization / D.E. Hassett, M.K. Slifka, J. Zhang, J.L. Whitton // J. Virol. 2000. - V.74. - P.8286-91.
88. Haynes J.R. Particle-mediated nucleic acid immunization. / J.R. Haynes, D.E. McCabe, W.F. Swain et al. // J. Biotechnol. 1996. - V.44. - P.37^2.
89. Hines R.N. Large-scale purification of plasmid DNA by anion-exchange high-performance liquid chromatography. / R.N. Hines, K.C. O'Connor, G. Vella, W. Warren // Bio.Techniques. 1992. - V. 12. - P.430^
90. Ho D.D. Rapid turnover of plasma virions and CD4 lymphocytes in HIV-1 infection / D.D. Ho, A.U. Neumann, A.S. Perelson et al. // Nature. 1995. -V.373.-P.123-6.
91. Horn N.A. Cancer gene therapy using plasmid DNA:Purification of DNA for human clinical trials. / N.A. Horn, J.A. Meek, G. Budahazi, M. Marquet // Hum. Gene. Ther. 1995. - V.6. - P.565-73.
92. Hou S. Virus-specific CD8+ T-cell memory determined by clonal burst size. / S. Hou, L. Hyland, K.W. Ryan et al. // Nature. 1994. - V. 369. - P.652^1.
93. Hu W.S. Retroviral recombination and reverse transcription / W.S. Ни, H.M. Temin // Science. -1990. V.250. - P. 1227-33.
94. Hua J. Human immunodeficiency virus types 1 and 2 and simian immunodeficiency virus Nef use distinct but overlapping target sites for downregulation of cell surface CD4 / J. Hua, B.R. Cullen // J. Virol. 1997. -V.71. -P.6742-8.
95. Irvine K.R. Enhancing efficacy of recombinant anticancer vaccines with prime/boost regimens that use two different vectors. / K.R. Irvine, R.S. Chamberlain, E.P. Shulman et al. // J. Natl. Cancer. Inst. 1997. - V.89. -P. 1595-601.
96. Janssen E.M. CD4+ T cells are required for secondary expansion and memory in CD8+ T lymphocytes. / E.M. Janssen, E.E. Lemmens, T. Wolfe et al. // Nature. -2003. V.421. - P.852-6.
97. Jeffs S.A. Antigenicity of truncated forms of the human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein. / S.A. Jeffs, J. McKeating, S. Lewis et al. // J. Gen. Virol. 1996. - V.77. - P.1403-10.
98. Jones T.R. Synthetic oligodeoxynucleotides containing CpG motifs enhance immunogenicity of a peptide malaria vaccine in Aotus monkeys / T.R. Jones, N. Obaldia, R.A. Gramzinski et al. // Vaccine. 1999. - V.l7. - P.3065-71.
99. Kang C.Y. Development of HIV/AIDS vaccine using chimeric gag-env virus-like particles. / C.Y. Kang, L. Luo, M.A. Wainberg, Y. Li // Biol. Chem. 1999. -V.380. -P.353-64.
100. Kaul R. New insights into HIV-1 specific cytotoxic T-lymphocyte responses in exposed, persistently seronegative Kenyan sex workers. / R. Kaul, S.L. Rowland-Jones, J. Kimani et al. // Immunol. Lett. 2001. - V.79. - P.3-13.
101. Khanolkar A. Preferential utilization of the perforin/granzyme pathway for lysis of Epstein-Barr virus-transformed lymphoblastoid cells by virus-specific CD4+ T cells. / A. Khanolkar, H. Yagita, M.J. Cannon // Virology. 2001. - V.287. -P.79-88.
102. Klenerman P. Cytotoxic T-cell activity antagonized by naturally occurring HIV-1 Gag variants. / P. Klenerman, S. Rowland-Jones, S. McAdam et al. // Nature. -1994. V.369. - P.403-7.
103. Klinman D.M. CpG motifs as immune adjuvants / D.M. Klinman, K.M. Barnhart, J. Conover // Vaccine. 1999. - V.17. - P. 19-25.
104. Klotman M.E. Kinetics of expression of multiply spliced RNA in early human immunodeficiency virus type 1 infection of lymphocytes and monocytes. / M. E. Klotman, S. Kim, A. Buchbinder et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. -V.88. -P.5011-5.
105. Kolchinsky P. Adaptation of a CCR5-using, primaiy human immunodeficiency virus type 1 isolate for CD4-independent replication. / P. Kolchinsky, T. Mirzabekov, M. Farzan et al. // J. Virol. 1999. - V.73. - P.8120-6.
106. Koup R.A. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. / R.A. Koup, J.T. Safrit, Y. Cao et al. // J. Virol. 1994. - V.68. - P.4650-5.
107. Kozak M. Initiation of translation in prokaryotes and eukaryotes. / M. Kozak // Gene. 1999. - V.234. - P.l 87-208.
108. Krieg A.M. The role of CpG motifs in innate immunity. / A.M. Krieg // Curr. Opin. Immunol. 2000. - V.12. - P.35^13.
109. LaBranche C.C. Determinants of CD4 independence for a human immunodeficiency virus type 1 variant map outside regions required for coreceptor specificity. / C.C. LaBranche, T.L. Hoffman, J. Romano et al. // J. Virol. 1999. - V.73. - P.l0310-9.
110. LaCasse R.A. Fusion-competent vaccines: broad neutralization of primary isolates of HIV. / R.A. LaCasse, K.E. Follis, M. Trahey et al. // Science. 1999. - V.283. -P.357-62.
111. Lamb R.A. Do Vpu and Vpr of human immunodeficiency virus type 1 and NB of influenza В virus have ion channel activities in the viral life cycles? / R.A. Lamb, L.H. Pinto // Virology. 1997. - V.229. - P. 1-11.
112. LaRosa G.J. Conserved sequence and structural elements in the HIV-1 principal neutralizing determinant. / G.J. LaRosa, J.P. Davide, K. Weinhold et al. // Science. 1990. - V.249. - P.932-5.
113. Lazouskaya N.V. The HIV type 1 epidemic in Belarus: predominance of Eastern European subtype A strains and circulation of subtype В viruses. / N.V. Lazouskaya, V.F. Eremin, K.W. Adema et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. -2005. V.21. - P.830-3.
114. Le T.P. Safety, tolerability and humoral immune responses after intramuscular administration of a malaria DNA vaccine to healthy adult volunteers. / T.P. Le, K.M. Coonan, R.C. Hedstrom et al. // Vaccine. 2000. - V.l8. - P. 1893-901.
115. HO.Ledwith B.J. Plasmid DNA vaccines: investigation of integration into host cellular DNA following intramuscular injection in mice. / B.J. Ledwith, S. Manam, P.J. Troilo et al. // Intervirology. 2000. - V.43. - P.258-72.
116. Lee A.L. A method for ladge scale plasmid purification. / A.L. Lee, S. Sagar // World Intellectual Propery Organization pub. 1996. - V.02658.
117. Leifer C.A. Heterogeneity in the human response to immunostimulatory CpG oligodeoxynucleotides. / C.A. Leifer, D. Verthelyi, D.M. Klinman // J. Immunother. 2003. - V.26. - P.313-9.
118. Leifert J.A. Targeting plasmid-encoded proteins to the antigen presentation pathways. / J.A. Leifert, M.P. Rodriguez-Carreno, F. Rodriguez, J.L. Whitton // Immunol. Rev. 2004. - V.l99. - P.40-53.
119. Lemmens R. Supercoiled plasmid DNA: selective purification by thiophilic/aromatic adsorption. / R. Lemmens, U. Olsson, T. Nyhammar, J. Stadler // J. Chromatogr. В Analyt. Technol. Biomed. Life. Sci. 2003. - V.784. - P.291-300.
120. Leong K.H. Generation of enchanced immune responses by consecutive immunization with DNA and recombinant fowl poxvirus. / K.H. Leong, A.J. Ramsay, I.A. Ramshaw et al. // Vaccines Cold Spring Harbor Laboratory Press. -1995. -P.327-331.
121. Letvin N.L. Potent, protective anti-HIV immune responses generated by bimodal HIV envelope DNA plus protein vaccination. / N.L. Letvin, D.C. Montefiori, Y. Yasutomi et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1997. V.94. - P.9378-83.
122. Levy J.A. Pathogenesis of human immunodeficiency virus infection. / J.A. Levy // Microbiol. Rev. -1993. V.57. - P. 183-289.
123. Li C.J. Induction of apoptosis in uninfected lymphocytes by HIV-1 Tat protein. / C.J. Li, D.J. Friedman, C. Wang et al. // Science. 1995. - V.268. - P.429-31.
124. Loke S.L. Characterization of oligonucleotide transport into living cells. / S.L. Loke, C.A. Stein, X.H. Zhang et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1989. -V.86. P.3474-8.
125. Lole K.S. Full-length human immunodeficiency virus type 1 genomes from subtype C-infected seroconverters in India, with evidence of intersubtype recombination / K.S. Lole, R.C.Bollinger, R.S. Paranjape et al. // J. Virol. 1999. - V.73. -P.152-60.
126. Lubon H. Cell-specific activity of the modulator region in the human cytomegalovirus major immediate-early gene. / H. Lubon, P. Ghazal, L. Hennighausen et al. //Mol. Cell. Biol. 1989. - V.9. - P. 1342-5.
127. Malm M. GTU-MultiHIV DNA vaccine results in protection in a novel P815 tumor challenge model. / M. Malm, R. Sikut, K. Krohn, V. Blazevic // Vaccine. -2007. V.25. -P.3293-301.
128. Mansky L.M. Lower in vivo mutation rate of human immunodeficiency virus type 1 than that predicted from the fidelity of purified reverse transcriptase / L.M. Mansky, H.M. Temin // J. Virol. 1995. - V.69. - P.5087-94.
129. Martin T. Plasmid DNA malaria vaccine: the potential for genomic integration after intramuscular injection. / T. Martin, S.E. Parker, R. Hedstrom et al. // Hum. Gene. Ther. 1999. - V.10. - P.759-68.
130. Marzio R. CD69 and regulation of the immune function. / R. Marzio, J. Mauel, S. Betz-Corradin // Immunopharmacol Immunotoxicol. 1999. -V.21. - P.565-82.
131. Masharsky A.E. Molecular cloning and analysis offull-length genome of HIV type 1 strains prevalent in countries of theformer Soviet Union. / A.E. Masharsky, N.A. Klimov, A.P. Kozlov // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2003. - V.19. -P.933-9.
132. Melief C.J. Regulation of cytotoxic T lymphocyte responses by dendritic cells: peaceful coexistence of cross-priming and direct priming? / C.J. Melief // Eur. J. Immunol. 2003. - V.33. - P.2645-54.
133. Meyerhans A. In vivo persistence of a HIV-l-encoded HLA-B27-restricted cytotoxic T lymphocyte epitope despite specific in vitro reactivity. / A. Meyerhans, G Dadag.io, J.P. Vartanian et al. // Eur. J. Immunol. 1991. - V.21. -P.2637-40.
134. Miller M.D. The human immunodeficiency virus-l nef gene product: a positive factor for viral infection and replication in primary lymphocytes and macrophages
135. M.D. Miller, M.T. Warmerdam, I. Gaston et al. // J. Exp. Med. 1994. - V.179. -P.101-13.
136. Montgomery D.L. Heterologous and homologous protection against influenza A by DNA vaccination: optimization of DNA vectors. / D.L. Montgomery, J.W. Shiver, K.R. Leander et al. // DNA.Cell Biol. 1993. - V.12. - P.777-83.
137. Moore J.P. Genetic subtypes, humoral immunity, and human immunodeficiency virus type 1 vaccine development. / J.P. Moore, P.W. Parren, D.R. Burton // J. Virol. 2001. - V.75. - P.5721-9.
138. Moore J.P. Sattentau. Dissociation of gpl20 from HIV-1 virions induced by soluble CD4. / J.P. Moore, J.A. McKeating, R.A. Weiss, Q.J. Sattentau. // Science.- 1990.-V.250.-P.1139-42.
139. Moskophidis D. Virus persistence in acutely infected immunocompetent mice by exhaustion of antiviral cytotoxic effector T cells. / D. Moskophidis, F. Lechner, H. Pircher, R.M. Zinkernagel //Nature. 1993. - V.362. -P.758-61.
140. Mountain A. Recombinant proteins, monoclonal antibodies and therapeutic genes. / A. Mountain, U. Ney, D. Schomburg // Biotechnology, Weinheim, Wiley-VCH.- 1999. V. 5a. - Ch.20.
141. Mourich D.V. Spermine compaction is an efficient and economical methodof producing vaccination-grade DNA. / D.V. Mourich, M.W. Munks, J.C. Murphy et al. // J. Immunol. Methods. 2003. - V.274. - P.257-64.
142. Mueller Y.M. Increased CD85/Fas-induced apoptosis of HlV-Specific CD8+ T cells. / Mueller Y.M. //Immunity. -2001. V. 15. - P.871-82.
143. Muller D. LCMV-specific, class II-restricted cytotoxic T cells in beta 2-microglobulin-deficient mice. / D. Muller, B.H. Koller, J.L. Whitton et al. // Science. 1992. - V.255. - P. 1576-8.
144. Murashev B.V. Immunogenicity of candidate DNA vaccine based on subtype A human immunodeficiency virus type 1 predominant in Russia. / B.V. Murashev, E.V. Kazennova, A.A. Kozlov et al. // Biotechnol. J. 2007. - V.2. - P.871-8.
145. Murashev B.V. Immunological properties of HIV-1 env gene based DNA vaccines. / B.V. Murashev, I.V. Murasheva, T.Yu. Kreslavskiy et al. // Abstract Conferentce AIDS VACCINE 2001, Philadelphia, PA USA. 2001. - P. 84.
146. Murphy J.C. Purification of plasmid DNA using selective precipitation by compaction agents. / J.C. Murphy, J.A. Wibbenmeyer, G.E. Fox, R.C. Wilson // Nature Biotechnol. 1999. - V.17. - P.822-3.
147. Mwau M. Design and validation of an enzyme-linked immunospot assay for use in clinical trials of candidate HIV vaccines. / M. Mwau, A.J. McMichael, T. Hanke // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2002. - V.l 8. - P.611-8.
148. Myers G. Human Retroviruses and AIDS. / G. Myers // Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM. 1987.
149. Nehete P.N. Studies on V3-specific cross-reactive T-cell responses in chimpanzees chronically infected with HIV-1IIIB. / P.N. Nehete, K.K. Murthy, W.C. Satterfield et al. //AIDS. 1995.- V.9.-P.567-72.
150. Pang S. Human immunodeficiency virus Env-independent infection of human CD4(-) cells. / S. Pang, D. Yu, D.S. An et al. // J. Virol. 2000. - V.74. -P.l 0994—1000.
151. Patterson S. CD4 expression on dendritic cells and their infection by human immunodeficiency virus. / S. Patterson, J. Gross, N. English et al. // J. Gen. Virol. 1995.-V.76.-P.l 155-63.
152. Paul N.L. Expression of HIV-1 envelope glycoproteins by Semliki Forest virus vectors. / N.L. Paul, M. Marsh, J.A. McKeating et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1993. - V.9. - P.963-70.
153. Pinto B.L.A. Alloantigen-stimulated anti-HIV activity. / B.L.A. Pinto // Blood. -1998. V.92. - P.3346-54
154. Pinto L.A. ENV-specific cytotoxic T lymphocyte responses in HIV seronegative health care workers occupationally exposed to HIV-contaminated body fluids. / L.A. Pinto, J. Sullivan, J.A. Berzofsky et al. // J. Clin. Invest. 1995. -V.96. -P.867-76.
155. Pircher H. Viral escape by selection of cytotoxic T cell-resistant virus variants in vivo. / H. Pircher, D. Moskophidis, U. Rohrer et al. // Nature. 1990. - V.346. -P.629-33.
156. Prazeres D.M. Large-scale production of pharmaceutical-grade plasmid DNA for gene therapy: problems and bottlenecks. / D.M. Prazeres, G.N. Ferreira, G.A. Monteiro et al. //Trends. Biotechnol. 1999. - V.17. - P. 169-74.
157. Prazeres D.M.F. Preparative purification of supercoiled plasmid DNA using anion-exchange chromatography. / D.M.F. Prazeres, T. Schluep, C. Cooney // J. Chrom. A. 1998. - V.806. -P.31^15.
158. Price D.A. Antigen-specific release of beta-chemokines by anti-HIV-1 cytotoxic T lymphocytes. / D.A. Price, A.K. Sewell, T. Dong et al. // Curr. Biol. 1998. -V.8. -P.355-8.
159. Quinn D.G. Transfer of lymphocytic choriomeningitis disease in beta 2-microglobulin-deficient mice by CD4+ T cells. / D.G. Quinn, A.J. Zajac, J.A. Frelinger, D. Muller//Int. Immunol. 1993. - V.5.- P. 1193-8.
160. Ramshaw I.A. The prime-boost strategy: exciting prospects for improved vaccination. / I.A. Ramshaw, A.J. Ramsay // Immunol. Today. 2000. - V.21. -P.163-5.
161. Raposo G. Human macrophages accumulate HIV-1 particles in МНС II compartments. / G. Raposo, M. Moore, D. Innes et al. // Traffic. 2002. - V.3. -P.718-29.
162. Raul R. Late seroconversion in HIV-resistant Nairobi prostitutes despite preexisting HIV-specific CD8+ responses. / R. Raul // The Journal of clinical investigation. -2001. V.l 07. -P.341-9.
163. Reitter J.N. A role for carbohydrates in immune evasion in AIDS. / J.N. Reitter, R.E. Means, R.C. Desrosiers //Nat. Med. 1998. - V.4. -P.679-84.
164. Ribergo R.M. In vivo dynamics of T cell activation, proliferation, and death in HIV-1 infection: Why are CD4+ but not CD8+ T cells depleted? / R.M. Ribergo, H. Monhri, D.D. Ho, A.S. Perelson // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2002. -V.99.-P.l 5572-7.
165. Rickinson A.B. Long-term T-cell-mediated immunity to Epstein-Barr virus. / A.B. Rickinson, D.J. Moss, L.E. Wallace et al. // Cancer Res. 1981. - V.41. -P.4216-21.
166. Roberts J.D. The accuracy of reverse transcriptase from HIV-l / J.D. Roberts, K. Bebenek, T.A. Kunkel // Science. 1988. - V.242. - P.l 171-3.
167. Robertson J.S. Assuring the quality, safety, and efficacy of DNA vaccines. / J.S. obertson, E. riffiths // Mol. Biotechnol. 2001. - V. 17. - P. 143-9.
168. Robinson H.L. New hope for an AIDS vaccine. / H.L. Robinson // Nat. Rev. Immunol. 2002. - V.2. - P.239-50.
169. Robinson H.L. Prime boost vaccines power up in people. / H.L. Robinson // Nat. Med.-2003.-V.9.-P.642-3.
170. Robinson H.L. T cell vaccines for microbial infections. / H.L. Robinson, R.R. Amara // Nat. Med. 2005. - V. 11. - P.25-32.
171. Robinson W.E. Antibodies to the primaiy immunodominant domain of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) glycoprotein gp41 enhance HIV-1 infection in vitro. / W.E. Robinson, T. Kawamura, D. Lake et al. // J. Virol. -1990. V.64. -P.5301-5.
172. Rockville M.D. Characterization of plasmid DNA vectors for use in Human gene therapy. / M.D. Rockville, M. Marquet, N.A. Horn, J.A.Meek // Biopharm. -1997. V.5. - P.42-50.
173. Rodriguez F. Immunodominance in virus-induced CD8+ T-cell responses is dramatically modified by DNA immunization and is regulated by gamma interferon. / F. Rodriguez, S. Harkins, M.K. Slifka, J.L. Whitton // J. Virol. -2002.-V.76.-P.4251-9.
174. Rowland-Jones S.J. HIV-specific cytotoxic T-cells in HIV-exposed but uninfected Gambian women. / S.J. Rowland-Jones, K. Sutton, T. Ariyoshi, et al. // Nat. Med. 1995. - V.l. -P.59-64
175. Rowland-Jones S.L. HIV-specific cytotoxic T-cell activity in an HIV-exposed but uninfected infant. / S.L. Rowland-Jones, D.F. Nixon, M.C. Aldhous et al. // Lancet. 1993.-V.3.-P. 860-1
176. Medzhitov R. Innate immune recognition: mechanisms and pathways./ R. Medzhitov, C.Jr.Janeway // Immunol Rev. 2000. - V.173. - P.89-97.
177. Rugeles M.T. Alloantigen recognition in utero: dual advantage for the fetus? / M.T. Rugeles // Trends in immunology. 2004. - V.25. - P.348-52.
178. Sanger F. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors / F. Sanger, S. Nicklen, A.R. Coulson//Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1977. - V.74.-P.5463-7.
179. Sato Y. Immunostimulatory DNA sequences necessaiy for effective intradermal gene immunization. / Y. Sato, R. Mark, H. Tighe et al. // Science. 1996. - V.273. -P.352-354.
180. Schmitz J.E. Control of viremia in simian immunodeficiency virus infection by CD8+ lymphocytes. / J.E. Schmitz, M.J. Kuroda, S. Santra et al. // Science. -1999. V.283. - P.857-60.
181. Seaman M.S. Subsets of memory cytotoxic T lymphocytes elicited by vaccination influence the efficiency of secondary expansion in vivo. / M.S. Seaman, F.W. Peyerl, S.S. Jackson et al. // J. Virol. 2004. - V.78. - P.206-15.
182. Secchiero P. Extracellular HIV-1 tat protein up-regulates the expression of surface CXC-chemokine receptor 4 in resting CD4+ T cells. / P. Secchiero, D. Zella, S. Capitani et al. Hi. Immunol. 1999. - V. 162. -P.2427-31.
183. Sedegah M. Protection against malaria by immunization with plasmid DNA encoding circumsporozoite protein. / M. Sedegah, R. Hedstrom, P. Hobart, S.L. Hoffman // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1994. V.91. - P.9866-70.
184. Sedlik C. In vivo induction of a high-avidity, high-frequency cytotoxic T-lymphocyte response is associated with antiviral protective immunity. / C. Sedlik, G. Dadaglio, M.F. Saron et al. // J. Virol. 2000. - V.74. - P.5769-75.
185. Shata M.T. Recent advances with recombinant bacterial vaccine vectors. / M.T. Shata, L. Stevceva, S. Agwale, et al. // Mol. Med. Today. 2000. - V.6. - P.66-71.
186. Shiver J.W. Cytotoxic T lymphocyte and helper T cell responses following HIV polynucleotide vaccination. / J.W. Shiver, H.C. Perry, M.E. Davies et al. // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1995. - V.772. - P. 198-208.
187. Simmonds P. Analysis of sequence diversity in hypervariable regions of the external glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1 / P. Simmonds, P. Balfe, C.A. Ludlam et al. //J. Virol. 1990. - V.64. -P.5840-50.
188. Slifka M.K. Functional avidity maturation of CD8(+) T cells without selection of higher affinity TCR. / M.K. Slifka, J.L. Whitton // Nat. Immunol. 2001. - V.2. -P.711-7.
189. Sofer G. Handbook of process chromatography: a guide to optimization. Scale-up, and validation. / G. Sofer, L. Hagel // Academic Press, San Diego. 1997.
190. Sol-Foulon N. HIV-1 Nef-induced upregulation of DC-SIGN in dendritic cells promotos lymphocyte clustering and viral spread. / N. Sol-Foulon, A. Moris, C. Nobile et al. // Immunity. 2002. - V.16. - P. 145-55.
191. Sparwasser T. Bacterial CpG-DNA activates dendritic cells in vivo: T helper cell-independent cytotoxic T cell responses to soluble proteins. / T. Sparwasser, R.M. Vabulas, B. Villmow et al. // Eur. J. Immunol. 2000. - V.30. - P.3591-7.
192. Srivastava P. Interaction of heat shock proteins with peptides and antigen presenting cells: chaperoning of the innate and adaptive immune responses. / P. Srivastava // Annu. Rev. Immunol. 2002. - V.20. - P.395-425.
193. Stadler J. Plasmid DNA purification. / J. Stadler, R. Lemmens, T. Nyhammar // J. Gene. Med. 2004. - V.6. - P.54-66.
194. Stein B.S. pH-independent HIV entry into CD4-positive T cells via virus envelope fusion to the plasma membrane. / B.S. Stein, S.D. Gowda, J.D. Lifson et al. // Cell. 1987. - V.49. - P.659-68.
195. Steven G.W. Repressor titration: a novel system for selection and stable maintenance of recombinant plasmids. / G.W. Steven, R.M. Cranenburgh, A.M.E. Weiss et al. // Nucleic Acids Research. 1998. - V.26. -P.2120-4.
196. Stranford S.A. Lack of infection in HIV-exposed individuals is associated with a strong CD8(+) cell noncytotoxic anti-HIV response. / S.A. Stranford, J. Skurnick, D. Louria et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1999. V.96. - P. 1030-5.
197. Strick T.R. Behavior of supercoiled DNA. / T.R. Strick, J.F. Allemand, D. Bensimon, V. Croquette // Biophys. J. 1998. - V.74. - P.2016-28.
198. Su L. Characterization of a virtually full-length human immunodeficiency virus type 1 genome of a prevalent intersubtype (C/B') recombinant strain in China / L. Su, M. Graf, Y. Zhang et al. // J. Virol. 2000. - V.74. - P. 11367-76.
199. Sumida S.M. Neutralizing antibodies and CD8+ T lymphocytes both contribute to immunity to adenovirus serotype 5 vaccine vectors. / S.M. Sumida, D.M. Truitt, M.G. Kishko et al. // J. Virol. 2004. - V.78. - P.2666-73.
200. Sun S. Type I interferon-mediated stimulation of T cells by CpG DNA. / S. Sun, X. Zhang, D.F. Tough, J. Sprent // J. Exp. Med. 1998. - V.188. - P. 2335^12.
201. Suni M.A. Detection of antigen-specific T cell cytokine expression in whole blood by flow cytometry. / M.A. Suni, L.J. Picker, V.C. Maino // J. Immunol. Methods. 1998. - V.212. - P.89-98.
202. Turner B.G. Structural biology of HIV. / B.G. Turner, M.F. Summers // J. Mol. Biol. 1999.-V.285.-P. 1-32.
203. Ulmer J.B. Heterologous protection against influenza by injection of DNA encoding a viral protein. / J.B. Ulmer, J.J. Donnelly, S.E. Parker et al. // Science. -1993. V.259. - P.1745-9.
204. Van Parijs L. The Fas/Fas ligand pathway and Bcl-2 regulate T cell responses to model self and foreign antigens. / L. Van Parijs, D.A. Peterson, A.K. Abbas // Immunity. 1998. - V.8. - P.265-74.
205. Wabl M. Hypermutation at the immunoglobulin heavy chain locus in a pre-B-cell line / M. Wabl, P.D. Burrows, A. von Gabain et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. -1985. V.82. -P.479-82.
206. Walker B.D. Immune control of HIV: the obstacles of HLA and viral diversity. / B.D. Walker, B.T. Korber // Nat. Immunol. 2001. - V.2. - P.473-5.
207. Whitmire J.K. Costimulation in antiviral immunity: differential requirements for CD4(+) and CD8(+) T cell responses. / J.K.Whitmire, R. Ahmed // Curr. Opin. Immunol. 2000. - V.12. - P.448-55.
208. Whitton J.L. The regulation and maturation of antiviral immune responses. / J.L. Whitton, M.K. Slifka, F. Liu et al. // Advances in virus research. 2004. - V.63. -P.181-238.
209. Wicks I.P. Bacterial lipopolysaccharide copurifies with plasmid DNA: implications of animal models and human gene therapy. / I.P. Wicks, M.L. Howell, T. Hancock et al. // Hum. Gene. Ther. 1995. - V.6. - P.317-23.
210. Widera G. Increased DNA vaccine delivery and immunogenicity by electroporation in vivo. / G. Widera, M. Austin, D. Rabussay et al. // J. Immunol. 2000. - V. 164. - P.4635-40.
211. Wilson C.C. Development of a DNA vaccine designed to induce cytotoxic T lymphocyte responses to multiple conserved epitopes in HIV-1. / C.C. Wilson, D. McKinney, M. Anders et al. // J. Immunol. 2003. - V.l71. - P.5611-23.
212. Wu Y. Selective transcription and modulation of resting T cell activity by preintegrated HIV DNA. / Y. Wu, J.W. Marsh // Science. 2001. - V.293. -P. 1503-6.
213. Wyatt R. Functional and immunologic characterization of human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoproteins containing deletions of the major variable regions. / R. Wyatt, N. Sullivan, M. Thali et al. // J. Virol. 1993. -V.67. -P.4557-65.
214. Xin K.Q. Immunization of RANTES expression plasmid with a DNA vaccine enhances HIV-1-specific immunity. / K.Q. Xin, Y. Lu, K. Hamajima et al. // Clin. Immunol. 1999. - V.92. - P.90-6.
215. Yang X. Modifications that stabilize human immunodeficiency virus envelope glycoprotein trimers in solution. / X. Yang, L. Florin, M. Farzan et al. // J. Virol. -2000. V.74. - P.4746-54.
216. Yang X. Stiochiometry of envelope glycoprotein trimers in the entry of human immunodeficiency virus type 1. / X. Yang, S. Kurteva, X. Ren et al. // J.Virol. -2005. V.79. - P.12132^47.
217. Zagury D. Interferon alpha and Tat involvement in the immunosuppression of uninfected T cells and C-C chemokine decline in AIDS. / D. Zagury, A. Lachgar, V. Chams et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1998. V.95. - P.3851-6.
218. Zeh H.J. High avidity CTLs for two self-antigens demonstrate superior in vitro and in vivo antitumor efficacy. / H.J. Zeh, D. Perry-Lalley, M.E. Dudley et al. // J. Immunol. 1999.- V.162.-P.989-94.
219. Zinkernagel R.M. Antiviral protection by virus-immune cytotoxic T cells: infected target cells are lysed before infectious virus progeny is assembled. / R.M. Zinkemagel, A. Althage // J. Exp. Med. 1977. - V. 145. - P.644-51.
220. Zinkernagel R.M. On Immunity Against Infections and Vaccines: Credo 2004. / R.M. Zinkemagel // Scand. J. Immunol. 2004. - V.60. - P.9-13.
221. Zocchi M.R. HIV-1 Tat inhibits human natural killer cell function by blocking L-type calcium channels. / M.R. Zocchi, A. Rubartelli, P. Morgavi, A. Poggi // J. Immunol. 1998. - V.161. -P.2938^13.
222. Полная нуклеотидная последовательность плазмидного вектора рВМС
-
Мурашев, Борис Владимирович
-
кандидата биологических наук
-
Санкт-Петербург, 2007
-
ВАК 03.00.04
- Получение компонентов полиэпитопной вакцины против ВИЧ/СПИД
- Исследование иммуногенности полиэпитопных ВИЧ-1 антигенов с использованием разных систем доставки
- Характеристика рекомбинантного штамма Salmonella enteritidis E23/pcDNA-TCI, несущего ДНК-вакцину против ВИЧ-1, и исследование его иммуногенных свойств в составе суппозиториев
- Особенности иммунного ответа, индуцированного комбинированной ДНК-белковой вакциной КомбиВИЧвак
- Полиэпитопные рекомбинантные вакцины против вируса гепатита B и ВИЧ-1
