Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Создание и анализ трансгенных растений Nicotiana tabacum L. с различными ориентациями гетерологичного гена 3-окси-3-метилглутарил-КоА редуктазы

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Поройко, Валерий Анатольевич

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Природные изопреноидные соединения.

1.2. Многобразие путей биосинтеза природных изопреноидных соединений.

1.2.1. Мевалонатный путь биосинтеза изопреноидов.

1.2.2. Роль З-окси-З-метилглутарил-КоА редуктазы в биосинтезе мевалоновой кислоты.

1.2.3. Гены, кодирующие З-окси-З-метилглутарил-КоА редуктазу.

1.3. Открытие альтернативного немевалонатного пути биосинтеза изопреноидов у эубактерий и зеленых водорослей.

1.4. Ранние стадии биосинтеза изопреноидов в высших растениях.

1.5. Направленное ингибирование экспрессии эукариотических генов.

1.6. Применение антисмысловых РНК в генетической инженерии растений.

1.6.1. Модельные системы.

1.6.2. Исследования по подавлению экспрессии эндогенных генов растений.

1.7. Механизмы действия асРНК и ас ДНК в клетках эукариот.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды.

2.2. Растения, использованные в работе.

2.3. Среды, использованные в работе.

2.3.1. Микробиологические среды.

2.3.2. Среды для культивирования растений.

2.4. Растворы, использованные в работе.

2.5. Ферменты, использованные в работе.

2.6. Другие реактивы и материалы.

2.7. Условия культивирования бактерий.

2.8. Видоспецифичный тест для Agrobacterium Ште/аЫет и А. гасИоЬас^ег: образование 3-кетолактозы при окислении лактозы.

2.9. Выделение, очистка и манипуляции с плазмидной ДНК.

2.10. Трансформация листовых дисков табака.

2.11. Выделение суммарной растительной ДНК

2.12. Введение метки в ДНК.

2.13. Скрининг рекомбинантных клонов гибридизацией • на фильтрах.

2.14. Перенос растительной ДНК на фильтры по Саузерну.

2.15. Гибридизация на фильтрах по Саузерну.

2.16. Выделение суммарной растительной РНК с использованием горячего фенола.

2.17. РНК-ДНК гибридизация.

2.18. ПЦР-анализ трансгенных растений.

2.19. Анализ стеринов методом газожидкостной хроматографии

ГЖХ).

2.19.1. Подготовка проб для анализа.

2.19.2. Анализ.

2.20. Спектрофотометрическое определение хлорофиллов а и Ь и каротиноидов.

2.21. Статистическая обработка результатов.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Создание трансгенных растений МсоНапа (аЬасит, содержащих ген кт%1 Arabidopsis ЖаИапа в прямой и обратной ориентациях.

3.1.1. Конструирование рекомбинантных плазмид с различными ориентациями гена З-окси-З-метилглутарил-КоА редуктазы

ШаНапа относительно двойного промотора 358.

3.1.2. Перенос рекомбинантных плазмид р88-а81тщ1 и р88-1шщ1 в агробактерии.

3.1.3. Агробактериальная трансформация растений МсоНапа гаЪасит конструкциями, содержащими ген hmgl А. МаНапа в прямой и обратной ориентациях.

3.2. Подтверждение трансгенной природы полученных растений.

3.3. Анализ экспрессии гетерологичного гена hmgl в растениях табака.

3.4. Фенотипическое проявление экспрессии гетерологичного гена Л. ЖаНапа в растениях табака в условиях выращивания в закрытом грунте.

3.5. Анализ основных групп изопреноидных соединений в трансгенных растениях.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Создание и анализ трансгенных растений Nicotiana tabacum L. с различными ориентациями гетерологичного гена 3-окси-3-метилглутарил-КоА редуктазы"

Разработка технологии рекомбинантных ДНК внесла существенный вклад в развитие целого ряда направлений классической генетики, в изменение представлений о структурно-функциональной организации живой материи. Бурному прогрессу ДНК-технологий способствовало то, что сразу была осознана их огромная важность и перспективность в решении самых разнообразных задач биологии и сельского хозяйства. Впервые исследователям стала доступна возможность не только изучать генетические основы жизнедеятельности организмов, но и сознательно планировать изменения в них. Это послужило причиной развития новой области исследований - "обратной" генетики, которая основана на определении функционального значения участков ДНК путем целенаправленного манипулирования ими.

Введение в геном растения генов, кодирующих ключевые ферменты биохимических путей, позволяет получить информацию о механизмах, регулирующих тот или иной метаболический путь. Направленное ингибирование таких генов предоставляет не менее ценную информацию о функции гена и позволяет изучить роль связанной с ним стадии метаболического пути.

Одним из таких генов является ген З-окси-З-метилглутарил КоА редуктазы (ОМГР) - лимитирующий фермент ацетатно-мевалонатного пути биосинтеза изопреноидов. В растениях изопреноидный биосинтез является источником множества уникальных продуктов, необходимых для нормального роста и развития растений, для синтеза важных вторичных метаболитов. На сегодняшний день накоплено достаточно фактов для возникновения противоречивых гипотез о функциональной роли ОМГР. Открытие Ромером с соавторами в 1996 году альтернативного пути биосинтеза изопреноидов, локализованного в хлоропластах, делает вдвойне актуальным исследование роли одного из двух путей синтеза изопреноидов в растениях.

Трансформация растений геном hmgl в прямой ориентации под контролем сильного вирусного промотора, имеющего иную, нежели промотор hmg, систему регуляции, предоставит возможность, с одной стороны, получить растения со сверхэкспрессией ОМГР. С другой стороны, высокая гомология генов семейства hmg позволяет использовать стратегию антисмысловых РНК для успешного ингибирования их экспрессии в растениях и получения растений с пониженным уровнем синтеза ОМГР.

Целью данной работы является получение трансгенных растений с измененным синтезом ОМГР, которые могут послужить хорошим инструментом в изучении функциональной роли ацетатно-мевалонатного пути биосинтеза изопреноидов в растениях.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Конструирование рекомбинантных плазмид для генетической трансформации растений, содержащих ген hmgl Arabidopsis thaliana в прямой и обратной ориентациях по отношению к двойному промотору вируса мозаики цветной капусты.

2. Получение трансгенных растений табака, содержащих указанные конструкции с геном hmgl. 8

3. Исследование влияния конститутивной экспрессии мРНК и асРНК гетерологичного гена hmgl АгаЫс1орз1$ ЖаНапа на рост и развитие растений табака, а также на синтез основных групп изопреноидов.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Поройко, Валерий Анатольевич

ВЫВОДЫ

1. Сконструированы рекомбинантные плазмиды с полноразмерным геном hmgl Arabidopsis thaliana в прямой и обратной ориентации по отношению к двойному 35S промотору вируса мозаики цветной капусты. Получены трансгенные растения Nicotiana tabacum, содержащие эти формы генов в своем геноме.

2. Трансгенные растения со смысловой формой гена hmgl фенотипически не отличались от контрольных, но содержание суммарных стеринов в этих растениях было на 21% выше по сравнению с контролем.

3. Трансгенные растения с антисмысловой формой гена hmgl заметно отставали от контрольных растений в развитии и формировании соцветий. Впервые отмечено изменение формы и окраски венчиков цветков этих растений. Семена "антисмысловых" растений отличались резким снижением всхожести.

4.Влияние экспрессии гетерологичного гена hmgl не обнаружено в растениях, культивируемых in vitro. Все фенотипические и физиологические эффекты экспрессии гена hmgl наблюдали только у растений, культивируемых в грунте. Это можно объяснить наличием альтернативного пути синтеза изопреноидных соединений, более активно функционирующего в растениях in vitro.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Обнаружено, что введение гетеро логичного гена hmgl в антисмысловой ориентации в растения табака вызвает заметные фенотипические эффекты, задержку роста и развития растений, влияет на процесс формирования семян, приводит к снижению их всхожести. В работе впервые было отмечено влияние антисмысловой формы гена hmgl на окраску венчиков цветков. Показано, что указанные эффекты наблюдаются только в растениях, выращиваемых в грунте. Это можно объяснить наличием в растениях альтернативного пути синтеза изопреноидных соединений, более активно функционирующего in vitro. Возможно, наблюдаемые фенотипические изменения связаны с нарушением баланса фитогормонов. играющих важную роль в процессе цветения.

Введение в растения гетерологичного гена hmgl в прямой ориентации привело к увеличению количества суммарных стеринов на 21% пс сравнению с контролем. Этот эффект обнаруживается только у растений культивируемых в грунте.

Полученные результаты указывают на перспективность продолжение исследований по искусственной регуляции синтеза фермента З-окси-З метилглутарил-КоА редуктазы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Поройко, Валерий Анатольевич, Москва

1. Вайнтрауб Г.М. Антисмысловые РНК и ДНК // В мире науки. 1990. №3. С. 22-29.

2. Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений. В 2-х томах. М.: Мир. 1986 Т. 1. С. 226-231.

3. Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений. М.:Мир, 1996. С. 393.

4. Методы общей бактериологии / Под ред. Герхардт Ф. и др. В 3-х томах. М.: Мир. 1984. Т.З. С.29.

5. Дрейпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф., Дьюри Г., Джекоб Л., Уолден Р., Кумар А., Джефферсон Р., Хэмил Дж. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство. М.: Мир. 1991. 408 с.

6. Ермаков А.И., Арасимович В.В., Ярош Н.П. и др. Методы биохимического исследования растений /Л.:Агропромиздат. Ленингр. отд. 1987.430 с.

7. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа. 1990. С. 352.

8. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир. 1984. С. 480.

9. Пасешниченко В.А. Биосинтез и биологическая активность растительных терпеноидов и стероидов // Итоги науки и техники. Биологическая химия. Т. 25. М.: ВИНИТИ. 1987.

10. Пасешниченко В.А. Терпеноиды и стероиды в жизни растений // Успехи биол. химии, 32, С. 197-221. 1991

11. Пасешниченко В.А. Новый альтернативный путь биосинтеза изопреноидов у эубактерий и растений // Биохимия. 1998. Т. 63. Вып. 2. С. 171-172.

12. Albrecht, М., and Sandmann, G. Light stimulated carotenoid biosynthesis during transformation of maize etioplasts is regulated by increased activity of isoprenil pyrophosphate isomerase // Plant Physiol. 1994. V.105. P. 529-534.

13. Amor Y, Babiychuk E, Inze D, Levine A The involvement of poly(ADP-ribose) polymerase in the oxidative stress responses in plants // FEBS Lett. 1998. V. 440. P. 1-7

14. An G., Ebert P.R., Mitra A., Ha S.B. Binary Vectors // Plant Mol. Biol. Manual / Eds Gelvin S.B., Schilperoort R.A., Verma D.P.S. Dordrecht: Kluwer Acad. Publ. 1988. A3. P. 1-19.

15. Bach Т., Lichtenthaler H.K. Inhibition by mevinolin of mevalonate formation and plant root elongation // Naturwissen. 1982. V. 69. C. 242.

16. Bach Т., Lichtenthaler H.K. Inhibition by mevinolin of plant growth, sterol formation and pigment accumulation // Physiol. Plant. 1983. V.59. P. 50-60.

17. Bach T. Hydroxymethylglutaryl-CoA reductase, a key enzyme in phytosterol synthesis // Lipids. 1986. V. 21. №1. P. 82-88.

18. Bach T. Some new aspects of isoprenoid biosynthesis in plants // Lipids. 1995. V. 30. C. 191-202.

19. Bach T., Motel A., Weber T. Some properties of enzymes involved in the biosynthesis and metabolism of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA in plants // Rec. Adv; Phylochemistry. 1990. V. 24. P. 1-82.

20. Bach T., Lichtenthaler H. Mechanisms of inhibition by mevinolin of microsome-bound radish and of partially purified yeast HMG-CoA reductase (EC.l. 1.1.34) //Z. Naturforsch. 1983. V. 38. №3-4. C. 212-219.

21. Bariola P.A., Macintosh G.C., Green P.J. Regulation of S-like ribonuclease levels in Arabidopsis. Antisense inhibition of RNS1 or RNS2 elevates anthocyanin accumulation // Plant Physiol. 1999. V. 119. P. 331-42.

22. Bernaerts M.J., De Ley J. Nature (London). 1963. V. 197. P. 406-407.

23. Bevilacqua A., Erickson R.P., Hieber V. Antisense RNA inhibits endogenous expression in mouse preimplantation embryos: Lack of a double-stranded RNA "melting" activity // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1988. V. 85. P. 831-835.

24. Birnboim H.C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA // NAR. 1979. V.7. P. 1513.

25. Bramley P., Teulieres C., Blain I., Bird C., Schuch W. Biochemical characterization of transgenic tomato plants in which carotenoid synthesis has been inhibited through the expression of antisense RNA to pTOM5 // Plant J. 1992. V. 2. P. 343-349.

26. Caelles C., Ferrer A., Balcells L., Hegardt F.G., Boronat A. Isolation and structural characterisation of cDNA encoding Arabidopsis thaliana 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase // Plant Mol. Biol 1989. V. 13. P. 627-38.

27. Campos N., Boronat A. Targeting and topology in the membrane of plant 3- hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase // Plant Cell. 1995. V. 7. P. 2163-2174.

28. Capecchi M.R. Target gene replacement // Sci. Am. 1994. V. 270. P. 52-59.

29. Cappell J. The biochemistry and molecular biology of isoprenoid methabolism // Plant Physiol. 1995. V.107. P.l-6.

30. Casenave C., Chevrier M.,Thuong N.-T., Helene C. Rate of degradation of a- and (3-oligodeoxynucleotides in Xenopus oocytes / Implications for antimessenger strategies//NAR. 1987. V.15.P. 10507-10521.

31. Cech T.R.,Zaug A .J.,Grabowski P.J. In vitro splicing of the ribosomal RNA precursor of Tetrahymena: Involvement of a guanosine nucleotidein the excision of the intervening sequence // Cell. 1981. V. 27. P. 487-496.

32. Cenedella R.J. Posttranscriptional regulation of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase in lens epithelial cells by mevalonate-derived nonsterols // Exp. Eye Res. 1997. V. 65. P. 63-72.

33. Chan P.P., Glazer P.M. Triplex DNA: fundamentals, advances and potential application for gene therapy // J. Mol. Med. 1997. V. 75. P. 267-282.

34. Choi D., Ward B.L., Bostock R.M. Differential induction and suppression of potato 3- hydroxy-3-methylglutaryl-Co A reductase genes in response to Phytophtora infestans and to its elicitor arachidonic acid // Plant Cell. 1992. V. 4. P. 1333-1344.

35. Chye M.L., Tan C.T., Chua N.H. Three genes encode 3- hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase in Hevea brasiliensis: hmgl and hmg3 are differentially expressed // Plant Mol Biol. 1992. V. 19. P. 473-484.

36. Cornelissen M. Nuclear and cytoplasmic sites for antisense control // Nucl.Acids Res. 1989. V. 17. P. 7203-7209.

37. Cornelissen M., Vandewiele M. Both RNA level and translation efficiency are reduced by anti-sense RNA in transgenic tobacco // Nucl. Acids Res. 1989. V.17. P. 833-843.

38. Crookes P.R., Grierson D. Infrastructure of tomato fruit ripening and the role of polygalacturonase isoenzymes in cell wall degradation // 1983. V. 72. P. 1088-1093.

39. Czernilofsky A.P., Hain R., Herrera-Estrella L., Lorz H., Goyvaerts E., Baker B.J., Schell J. Fate of selectable marker DNA integrated into the genome of Nicotiana tabacum // DNA. 1986. V. 5. P. 101-113.

40. De Block M., Botterman J., Vandewiele M., Dockx J., Thoen C., Gossele V., Mowa N., Thompson C., Van Montagu M., Leemans J. Engineering herbicide resistance in plants by expression of a detoxifying enzyme // EMBO J. 1987. V. 6. P.2513-2518.

41. De Vries S., Höge H., Bisseling T. Isolation of total and polysomal RNA from plant tissues // Plant Mol. Biol. Manual / Eds Gelvin S.B., Schilperoort R.A., Verma D.P.S. Dordrecht: Kluwer Acad. Publ. 1988. B6. P. 1-13.

42. Delauney A.J., Tabaeizadeh Z., Verma D.P.S. A stable Afunctional antisense transcript inhibiting gene expression in transgenic plants // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1988. V. 85. P. 4300-4304.

43. Denbow C.J., Lang C.L.,Cramer C.L. The N-terminal domain of tomato 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductases. Sequence, microsomal targeting, and glucosylation // 1996. J. Biol. Chem. V. 271. P. 9710-9715

44. Ecker J.R., Davis R.W. Inhibition of gene expression in plant cells by expression of antisense RNA // Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 1986. V.83. P. 5372-5376.

45. Edwards K., Johnston C., Thompson C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis // Nucleic Acids Res. 1991. V. 19. N. 6. P. 1349.

46. Fire A. RNA-triggered gene silencing // Trends Genet. 1999. V. 15. P. 358363.

47. Flashmann R. Composition of photosystem II antenna in light-harvesting complex II antisense tobacco plants at varying irradiances // Plant Physiol. 1997. V. 113. P. 787-794.

48. Frank-Kamenetskii M.D., Mirkin S.M. Triplex DNA structures // Annu. Rev. Biochem. 1995. V. 64. P. 65-95.

49. Fulton D., Kroon P., Matern U., Threlfall D., Whiteheed J. Inhibition of phytosterol biosynthesis in elisitor-treated cultures of Ammi-Majus // Phytochemistry. 1993. V. 34. P. 139-145.

50. Gil G., Faust J.R., Chin D J., Goldstein J.L., Brown M.S. Membrane-bound domain of HMG-CoA reductase is required for sterol-enhanced degradation of the enzyme // 1985. Cell. V. 41. №1. P. 249-258.

51. Goodwin T., Mercer E. Regulation of sterol and carotenoid metabolism in germinating seedlings //Biochem. Soc. Symp. 1963. V. 24. P. 37-41.

52. Guerrier T., Altman S. Catalytic activity of an RNA molecule prepared by transcription in vitro // Science. 1984. V. 223. P. 285-286.

53. Harborne J., Thomas-Barberan F. Ecological chemistry and biochemistry of plant terpenoids / Clarendon Press, Oxford, 1991. P. 399-426.

54. Harland R., Weintraub H. Translation of mRNA injected into Xenopus oocytes is specifically inhibited by antisense RNA // Cell Biol. 1985. V. 101. P. 1094-1100.

55. Heintze A., Gurlbach J., Leuschner C., Hoppe P., Hagelstein P., Schulze-SiebertD., Schultz G. //Plant Physiol. 1990. V. 93. P. 1121-1127.

56. Holton T.A., Brugliera F., Tanaka Y. Cloning and expression of flavonol synthase from Petunia hybrida // Plant J. 1993. V. 4. P. 1003-1010.

57. Horsch R.B., Fire J., Hoffmann N., Neidermeyer J., Rogers S.G., Fraley R.T. Leaf disc transformation // Plant Molecular Biology Manual / Ed. GelvinS.B. Schilperoort R.A. Verna D.P.S. Dordrecht Kluwer Acad. Publ. 1988 A5. P. 1-9.

58. Hofgen R., Willmitzer H. Transgenic potato plants depleted for the major tuber protein patatin via expression of antisense RNA // Plant Sci. 1992. V. 87. P. 45-54.

59. Keun K.K., Yamashita H., Sawa Y., Shibata H. A high activity of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-Co A reductase in chloroplasts of Stevia rebaudiana Bertoni // Biosci. Biotech. Biochem. 1996. V. 60. P. 685-686.

60. Kim Y.S, Lee M.H, Min S.R, Yoo O J, Liu J.R. Frequent occurrence of transgene deletion in transgenic plants // Mol. Cell. 1998. V. 31. P. 705-708.

61. Kim S.K., Wold B J. Stable reduction of thymidine kinase activity in cells expression high levels of antisense RNA // Cell. 1985. V. 42. P. 129-138.

62. Kjeuz, K., and Kleinig, H. On the compartmentalisation of diphosphate synthesis and utilisation in plant cells // Planta. 1981. V.153. № 6. P. 578581.

63. Knecht D. Application of antisense RNA to the study of the cytoskeleton back-graund, principles and summary of results obtained with myosin heavy chain // Cell Motility and the Cytoskeleton. 1989. V. 14. P. 92-102.

64. Koolman J. Ecdisteroids // Zool. Sci. 1990. №7. P. 563-580.

65. Koops A., Groenfeld H. Triterpenoid biosynthesis in the etiolatid seedlings of Euphorbia lathyris L. developmenthal changes and regulation of local triterpenoid production//J. Plant Physiol. 1991. V. 138 P. 142-149.

66. Kuhn C., Franceschi V.R., Schulz A., Lemoine R., Frommer W.B., Macromolecular trafficking indicated by localization and turnover of sucrose transporters in enucleate sieve elements // Science. 1997. V. 275. P. 12981300.

67. Kuipers A.G., Soppe W.J., Jacobsen E., Visser R.G. Factors affecting the inhibition by antisense RNA of granule-bound starch synthase gene expression in potato // Mol Gen Genet. 1995. V. 246. P. 745-755.

68. Lange B.M., Severin K., Bechthold A., Heide L. Regulatory role of microsomal 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase for shikonin biosynthesis in Lithospermum erythrorhizon cell suspension cultures // Planta. 1998. V. 316. P. 234-241.

69. Learned R.M. Light suppresses 3-hydroxy-3-methilglutaryl coenzyme A reductase gene expression in arabidopsis thaliana // Plant Physiol. 1996. V. 110. P. 645-655.

70. Learned R.M., Fink G.R. 3- Hydroxy-3-methylglutaryl-Co A reductase from Arabidopsis thaliana is structurally distinct from the yeast and animal enzymes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 2779-2783.

71. Lee H.S., Huang S., Kao T. S-proteins control rejection of incompatible pollen in Petunia inflate // Nature. 1994. V. 367. P. 560-563.

72. Lee N.-G., Stein B., Suzuki H., Verma D.P.S. Expression of antisense nodulin-35 RNA in Vigna aconitifolia transgenic root nodules retards peroxisome development and affects nitrogen availability to the plant // Plant J. 1993. V. 3.P. 599-606.

73. Lee, T., Langston-Unkefer P. Piruvate decarboxylase from Zea mays L. I. Purification and partial characterization from mature kernels and anaerobically treated roots // Plant Physiol. 1985. V. 79. № 1. P. 242-247.

74. Lerned R.M., Connolly E.L. Light modulates the spatial patterns of 3-hydroxy-3-methilglutaryl coenzyme A reductase gene expression in Arabidopsis thaliana // Plant J. 1997. V. 11. P. 499-511.

75. Lichtenthaler H.K. Chlorophyll and carotenoids: pigments of photosynthetic biomembranes //Methods Enzymol. 1987. V. 148. P. 351-382.

76. Lichtenthaler H., Schwender J., Disch A., Rohmer M. Biosynthesis of isoprenoids in higher plants chloroplasts proceeds via a mevalonate independent pathway // FEBS Lett. 1997. V. 400. P. 271-274.

77. Lynen F. Biosynthetic pathways from acetate to natural products // Pure and Appl. Chem. 1967. V. 39. P. 137-167.

78. Maccarrone M., Hilbers M.P., Veldink G.A., Vliegenthart J.F., Finazzi A.A. Inhibition of lipoxygenase in lentil protoplasts by expression of antisense RNA // Biochim. Biophys. Acta. 1995. V. 1259. P. 1-3.

79. Maher L.J., Dolnick B J. Comperative hybrid arrest by tandem antisense oligodeoxyribonucleotides or oligodeoxyribonucleoside methylphosphonates in a cell-free system // Nucl. Acids Res. 1988. V. 15. P. 3341-3358.

80. Molina A., Volrath S., Guyer D., Maleck K., Ryals J., Ward E. Inhibition of protoporphyrinogen oxidase expression in Arabidopsis causes a lesionmimic phenotype that induces systemic acquired resistance // Plant J. 1999. V. 17. P. 667-678

81. McGaskill D., Croteau R. Isoprenoid synthesis in pepermint (Mentax piperita): development of a model system for measuring flux of intermediates through the mevalonic acid pathway in plants // Biochem. Soc. Transactions. 1995. V. 23. P. 290.

82. McHale N., Hanson K., Zelitch I. A nuclear mutation in Nicotiana sylvestris causing a thiamine-reversible defect in sinthesis of chliroplast pigments // Plant. Physiol. 1988. V. 88. P. 930-935.

83. McGurl B., Pearce G., Orozco-Cardenas M., Ryan C.A., Structure , expression, and antisense inhibition of the systemin precursor gene // Science. 1992. V. 255. P. 1570-1573.

84. McGurl B., Pearce G., Orozco-Cardenas M., Ryan C.A. Expression of an antisense prosystemin gene in tomato plants reduces resistance toward Manduca sexta larvae // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P. 82738276.

85. Melton D.A. Injected anti-sense RNAs specifically block messenger RNA translation in vivo // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. V. 82. P. 144-148.

86. Mol J.N.M., Stuitje A.R., van der Krol A. Genetic manipulation of floral pigmentation genes // Plant Mol. Biol. 1989. V. 13. P. 287-294.

87. Munroe S.H. Antisense RNA inhibits splicing of pre-mRNA in vitro // EMBO J. 1988. V. 7. P. 2523-2532.

88. Munroe S.H. Antisense RNA inhibits splicing of pre-mRNA in vitro // EMBO J. 1988. V. 7. P. 2523-2532.

89. Muotri A.R., da Veiga Pereira L., dos Reis Vasques L.,. Menck C. F. M Ribozymes and the anti-gene therapy: how a catalytic RNA can be used to inhibit gene function // Gene. 1999. V. 237. P. 303-310.

90. Murasige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. 1962. V. 15. P. 473-497.

91. Nagy F., Kay S.A., Chua N.-H. Analysis of gene expression in transgenic plants // Plant Mol. Biol. Manual / Eds Gelvin S.B., Schilperoort R.A., Verma D.P.S. Dordrecht: Kluwer Acad. Publ. 1988. B4. P. 1-29.

92. Nelson A., Roth D.A., Johnson J.D. Tobacco mosaic virus infection of transgenic Nicotiana tabacum plants is inhibited by antisense constructs directed at the 5' region of viral RNA // Gene. 1993. V. 127. P. 227-32.

93. Ng D.T., Walter P. Protein translocation across the endoplasmic reticulum // Curr. Opin. Cell Biol. 1994. V. 6. P. 510-516.

94. Oeller P.W., Lu M.W., Taylor L.P., Pike D.A. Theologis A Reversible inhibition of tomato fruit senescence by antisense RNA // Science. 1991. V. 254. P. 437-9.

95. Oliver M.J., Ferguson D.L., Burke J.J., Velten J. Inhibition of tobacco NADH-hydroxypyruvate reductase by expression of a heterologous antisense

96. RNA derived from a cucumber cDNA: implications for the mechanism of action of antisense RNAs // Mol. Gen. Genet. 1993. V. 239. P. 425-434.

97. Pestka S., Daugherty B.L., Jung V., Hotta K., Pestka R.K. Anti-mRNA: specific inhibition of translation of singl mRNA molecules // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1984. V. 81. P. 7525-7528.

98. Prehn S., Wiedmann M., Rappoport T.A., Zwieb C. Protein translocation across wheat germ microsomal membranes requires an SRP-like component // EMBO J. 1987. V. 6. P. 2093-2097.

99. Radhakrishnan I., Patel D., DNA triplex: Solution Structures, Hydration Sites, Energies, Interaction and Functions // Biochemistry 1994. V. 33. P. 11405-11416.

100. Rapoport T.A. Transport of proteins across the endoplasmic reticulum membrane // Sciense. 1992. V. 258. P. 931-936.

101. Re E.B., Jones D., Learned R.M. Co-expression of native and introduced genes reveals cryptic regulation of HMG CoA reductase expression in Arabidopsis thaliana // Plant J. 1995. V. 7. P. 771-784.

102. Richard J. Kinetic parameters for the elimination reaction catalyzed by triosephospate isomerase and aestimation of reactions physiological significance // Biochemistry. 1991. V.30. P. 4581-4585.

103. Riessmeier J.W., Willmitzer L. and Frommer W.B. Evidance for an essential role of the sucrose transporter in phloem loading and assimilate partitioning // EMBO J. 1994. V. 13. P. 1-7.

104. Rodermel S.R., Abbott M.S., Bogorad. L. Nuclear organelle interactions: nuclear antisense gene inhibits ribulose bisphosphate carboxylase enzyme levels in transformed tobacco plants // Cell. 1988. V. 55. P. 673-681.

105. Roger S., Shah P. Compartmentation of terpenoid biosynthesis in green plants a proposed route of acetyl-coenzyme A synthesis in maize chloroplasts // Biochem. J. 1969. V. 114. № 2. P. 395-405.

106. Rohmer M., Khani M., S imonin P., Sutter B., S ahm H. Isoprenoid biosynthesis in bacteria a novel pathway for the early steps leading to isopenthenyl diphosphate // Biochem. J. 1993. V. 295. P. 517-524.

107. Rosenberg U.B., Preiss A., Seifert E., Jackie H., Knipple D.C. Production of phenocopies by Kruppel antisense RNA injection into Drosophila embryos // Nature. 1985. V.3. P. 703-706.

108. Rothstein S.J., Dimaio J., Strand. M., Rice D. Stable and, heritable inhibition of the expression of nopaline synthase in tobacco expressing antisense RNA // Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 1987. V.84. P. 8439-8443.

109. Salehuzzaman SN, Jacobsen E, Visser RG., Isolation and characterization of a cDNA encoding granule-bound starch synthase in cassava (Manihot esculenta Crantz) and its antisense expression in potato // Plant Mol Biol. 1993. V. 23. P. 947-962.

110. Sandler S.J., Stayton M., Townsend J.A., Ralston M.L., Bedbrook J.R., Dansmuir P. Inhibition of gene expres- sion in tranbformed plant by antisense RNA//Plant Mol.Biol. 1988. V. 11. P.301-310.

111. Sekar V. A rapid screening procedure for the identification of recombinant bacterial clones // BioTechniques. 1987. V.5. P. 11-13.

112. Sheehy R.E., Kramer M., Hiatt W.R. Reduction of polygalacturonase activity in tomato fruit by antisense RNA // Proc. Natl. Acad.Sci.USA. 1988. V.85.P. 8805-8809.

113. Sherf B.A., Bajar A.M., Kolattudy P.E., Abolition of an inducible highly anionic peroxdase activity in transgenic tomato // Plant Physiol. 1993. V. 101. P. 201-208.

114. Smith C J.S., Watson C.F., Ray J., Bird C.R., Mor ris P.C., Schuch W, Grierson D. Antisense RNA inhibition of polygalacturonase gene expression in transgenic tomatoes // Nature. 1988. V.334. P. 724-726.

115. Smith CJ, Watson CF, Bird CR, Ray J, Schuch W, Grierson D., Expression of a truncated tomato polygalacturonase gene inhibits expression of the endogenous gene in transgenic plants // Mol Gen Genet. 1990. V.224. P. 477-481

116. Sonnewald U, Basner A, Greve B, Steup M. A second L-type isozyme of potato glucan phosphorylase: cloning, antisense inhibition and expression analysis // Plant Mol Biol. 1995. V. 27. P. 567-576

117. Spurgeon, S., and Porter, J. / In: Biosynthesis of isoprenoid Compounds. John Wiley and Sons, New York, 1981. P. 1-46

118. Stivers, J., and Washabaugh, M. // Biochemistry. 1993 V. 32. P. 1347213482.

119. Stoeckle M.Y., Guan L. Improved resolution and sensivity of Northern blots using polyacrylamide-urea gels // Biotechniques. 1993. V. 15. P. 227231.

120. Stricland S., Huarte J., Belin D., Vassalli A., Rickles R.J., Vassalli J.-D. Antisense RNA directed against the 3' noncoding region prevents dormant mRNA activation in Mouse Oocites // Science. 1988. V.241. P. 680-684.

121. Swiezewska, E., Dallner, G., Andersson, B., and Ernster, L. Biosynthesis of ubiquinone and plastoquinone in endoplasmic reticulum-Golgi membranes of spinach leaves // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 1494-1499.

122. Takatsuji, H., Nishino, T., Miki, 1., and Katsuki, H. Studies on isoprenoid biosynthesis with bacterial intact cell // Biochem. and Biophys. Res. Comm. 1983. V.110. P. 187-193.

123. Topfer R., Matzeit V., Gronenborn B., Shell J., Steinbiss H. A set of plant expression vectors for transcriptional and translational fusions // NAR. 1987. V. 15. P. 5890.

124. Tujisaki, T., Nishino, H., and Katsuki, H. // J. Biochem.1986. V. 99. P. 1227-1237.

125. Van der Krol A.R., Lenting P.E., Veenstra J., Van der Meer I.M., Koes R.E., Geräts A.G.M., Mol J.N.M., Stuitje A.R. An anti-sense chalcone synthase gene in transgenic plants inhibits flower pigmentation // Nature. 1988. V.333. P.866-869.

126. Van der Krol AR, Mur LA, de Lange P, Mol JN, Stuitje AR Inhibition of flower pigmentation by antisense CHS genes: promoter and minimal sequence requirements for the antisense effect // Plant Mol Biol. 1990. V.14. P. 457-66.

127. Vaucheret H, Kronenberger J, Lepingle A, Vilaine F, Boutin JP, Caboche M., Inhibition of tobacco nitrite reductase activity by expression of antisense RNA // Plant J. 1992. V. 2. P. 559-69.

128. Velten J., Shell J. Selection-expression plasmid vectors for use in genetic transformation ofhightr plants //NAR 1985. V. 13. P.6981-6998.

129. Visser R.G., Somhorst I., Kuipers G.J., Ruys N.J., Feenstra W.J., Jacobsen E., Inhibition of the expression of the gene for granule-bound starch synthase in potato by antisense constructs // Mol Gen Genet. 1991. V. 225. P. 289-96

130. Voss A., Niersbach M., Hain R. et al. Reduced virus infectivity in N. tabacum secreting a TMV-specific full-size antibody // Molecular Breeding. 1995. V. 1. P. 39-50.

131. Walkerpeach C.R., Velten J. Agrobacterium-mediated gene transfer to plant cells cointegrate and binary vector systems / Plant Mol. Biol. Manual., Kluwer Acad. Publ., Bl: 1-19, 1994

132. Wang Z.Y., Kenigsbuch D., Sun L., Harel E., Ong M.S., Tobin E.M. A Myb-related transcription factor is involved in the phytochrome regulation of Arabidopsis Lhcb gene //Plant Cell. 1997. V. 9. P. 491-507.

133. Watson CF, Zheng L, DellaPenna D Reduction of tomato polygalacturonase |3 subunit expression affects pectin solubilization and degradation during fruit ripening // Plant Cell. 1994. V.6. P. 1623-34

134. Wen F, Zhu Y, Hawes MC, Effect of pectin methylesterase gene expression on pea root development//Plant Cell. 1999. V.ll. P. 1129-1140

135. Wirtz U., Schell J., Czernilofsky A.P. Recombination of selectable marker DNA in Nicotiana tabacum // DNA. 1987. Vol 6. P. 245-253.

136. Wolin S.L, From the elefant to E.coli: SRP-department protein targeting //Cell. 1994. V. 77. P. 787-790.

137. Yamamoto YY, Matsui M, Ang LH, Deng XW, Role of a COP 1 interactive protein in mediating light-regulated gene expression in arabidopsis //Plant Cell 1998. V. 10. P. 1083-94.

138. Zhang H., Goodman H.M., Jansson S., Antisense inhibition of the photosystem I antenna protein Lhca4 in Arabidopsis thaliana // Plant Physiol. 1997. V. 115. P. 1525-1531.

139. Zhou, D., and White, R. Early steps of isoprenoid biosynthesis in Escherichia coli // Biochem. J. 1991. V. 273. P. 627-634.

140. Zhu B, Chen TH, Li PH Analysis of late-blight disease resistance and freezing tolerance in transgenic potato plants expressing sense and antisense genes for an osmotin-like protein // Planta. 1996 V. 198. P. 70-77.

141. Zrenner R, Salanoubat M, Willmitzer L, Sonnewald U., Evidence of the crucial role of sucrose synthase for sink strength using transgenic potato plants (Solanum tuberosum L.) // Plant J. 1995. V. 7. P. 97-107.

142. Zrenner R, Schuler K, Sonnewald U. Soluble acid invertase determines the hexose-to-sucrose ratio in cold-stored potato tubers // Planta. 1996. V. 198. P. 246-252.

143. Zrenner R, Willmitzer L, Sonnewald U. Analysis of the expression of potato uridinediphosphate-glucose pyrophosphorylase and its inhibition by antisense RNA //Planta. 1993. V. 190. P. 247-252.1271. БЛАГОДАРНОСТЬ

144. Благодарю Беликова Владимира Александровича за консультации по вопросам биологии агробактерий.

145. Сердечно благодарю Ирину Владимировну Орлову и Екатерину Геннадиевну Семенюк за помощь в культуральной работе.

146. Признателен студентам МГУ, Самарского гос. университета и Ярославского гос. университета, принимавшим участие в данном исследовании на разных его этапах.

147. Выражаю огромную благодарность своей семье за постоянную моральную и материальную помощь, без которой данное исследование не было бы возможным.

148. С искренней признательностью,2711.2000 ПоройкоВ.А.