Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Создание бифункциональных производных генов О-эндитоксинов BACIUJIS THURINGIENSIS и анализ их экспрессии в трансгенных растениях

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Создание бифункциональных производных генов О-эндитоксинов BACIUJIS THURINGIENSIS и анализ их экспрессии в трансгенных растениях"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ВНИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ

На правах рукописи

шденков Александр Александрович юздание бифункциональных производных гиюв о-эндотоксинов ВАСШИЭ

ттттшБК и анализ их экспрессия в трансгенных растениях 03.00.03 - молекулярная биология

автореферат на соискание ученой степени кандидата апологических наук

Москва - 1994

работе выполнена в лаборатории генетической шэюдаргта растения ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

Ведущая организация - вилиал РАН.

доктор биологических наук, проф. Шемякин М.Ф. доктор биологических наук Андрианов В.М. доктор биологических наук Порозов С.Ю.

Института Оиооргвнической химии

Защита диссертации состоится " " ' 1994 г. _ час. на заседании специализированного совета Д.020.40.01

при ВШИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН по адресу: 125206, г.Москва, ул. Тимирязевская, д.42.

С диссертацией могио ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАОХН.

Автореферат разослан " " —_ 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета, /)

кандидат отологических наук fy/b-^i Ыеликова O.A.

в

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. До настоящего момента перед человечеством остро стоит, проблема защита сельскохозяйственных растений от насекомых-вредителей. Широкое применение искусственных инсектицидов в последнее время справедливо подвергается критике. Неблагоприятное влияние многих используемых инсектицидов на здоровье человека и животных, употребляющих в пищу обрабатываемые растения, способность насекомых быстро приспосабливаться к некоторым ядам, общее загрязнение окружающей среды я нарушение биологического баланса, связанное с применением тех или иных химикатов, их дороговизна - все это заставляет продолжать поиски новых инсектицидов и способов их применения.

В современном сельском хозяйстве используются биологические . инсектициды бациллярного происхождения,- которые представляют собой важную альтернативу химическим агентам. Белки, - образующие кристаллические вкличекия в БасШиа {Ьиг1п&{епэ1в (й-эндотоксины), высоко специфичны в своей активности, ■ как правило, против насекомых, и совершенно безвредны для человека и теплокровных животных. Отдельный б-эндотоксин обладает патогенными свойствами обычно против •представителей только одного отряда насекомых. Однако, коммерческое использование этих токсинов ограничено высокой стоимость» препаратов в, в особенности, их нестабильностью в полевых условиях.

Таким образом, очевидным становятся стремление ученых создать сорта сельскохозяйственных растений, в которых устойчивость к насекомшд была бы генетически обусловлена. Успехи современной генной инженерии растений позволяют это осуществить. В серадкнэ 80-х годов были получены перше растения, в которых содержались в экспрессировались гены токсинов В.гЬиг1~1^1впв1а. С тех пор

некоторым ведущим фирмам удалось значительно увеличить уровень накопления в-ендотоксинов в растительных тканях и началась работа, направленная на коммерческое использование трансгенных растений, устойчивых к насекомым. Однако, по-прежнему актуальной остается задача ускорения и упрощения детекции инсектицидных белков в трансгенных растениях и селекция таких растений на начальных стадиях их получения.

Цель и задачи исследования. Целью настоящее работы являлось конструирование производных генов О-андотоксинов, кодяруадях бифункциональные белки, которые обладают одновременно инсектицидной и легко тестируемой ферментативйой активностями, а также анализ экспрессии таких производных в трансгенных растениях. В сеязи с этим были поставлены следующие задачи: I) .конструирование генов бифункциональных белков типа "инсектотоксин-маркер" на основе О-андотоксинов B.tjxurlngleiiala; 2) анализ токсичных и ферментативных свойств продуктов экспрессии гибридных генов в Б.coll; 3) получение трансгенных растений твбака и картофеля, вкспрессирукщих сконструированные гены; 4) анализ маркерных и инсектицидных активностей в тканях полученных трансгенных растений.

• Научная новизна и практическая >ценность работы. Сконструированные в настоящей работе производные генов О-эндотоксинов Bacillus thurlnglenale кодируют белки, проявляющие как инсектицидные свойства по отношению к чешуекрылым или жесткокрылым, так и маркерные ферментативные активности. Поскольку гибридные гены способны к экспрессии в растениях, то они могут использоваться для создания трансгенных раетений ' различных сельскохозяйственных культур, обладающих устойчивостью к определенным видам насекомых. На примере трансгенных растений табака н хозяйственно значимых сортов картофеля (Дезире, Львовянка,

Еуковсквй ранний) продемонстрированы возможности детекции инсектицидных белков в растительных тканях п простого и надакаого отбора трансгенных растений с максимальным содержанием таких оолков о помощью анализа маркерных ферментативных активностей.

Осуществлена замена С-концевой части гена токсичного по отношению к гесткокрылым белка CrylllA на гомологичную последовательность гена СгуШа), проявляющего патогенные свойства к чешуекрылым, и показано, что генный продукт токсичен для зяэоткокрнлых. Такие данные позволяют более точно локализовать области в последовательности CryllIA, ответственные за специфичность эндотоксина.

Апробация работы. Представленные в диссертации результаты долоетш и обсувденн на Конференции молодых ученых ВНМИСБ в 1990 .году (первая премия), на 1-ом Всесоюзном и 11-ом Российском Сшпозиумах "Новнз метода биотехнологии растений" (Щдино, 1991; IS93), а также на российско-германском совещании "Молекулярная биология и генетика.растений" (Москва, 1993).

Публикации. Результаты, исследования опубликованы в 8 печатных работах, список которых приведен в конце автореферата.

Структура а объем работы. Диссертация •состоит из введения, обзора литературы, описания условий экспериментов, результатов и ах обсуждения, выводов и описка использованной литературы. Работа изложена на 140 страницах машинописного текста, содераит 27 рисунков и 6 таблиц. Список цитируемой литературы включает 169 наименований.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовались бактериальные штаммы E.colt TG1, СА161, Agrabacterlum twefactena С58С1(pGV3850), GV3101(pMP90RK),

Agrobacterlm rhlzogenee A4. Выроднвщшэ клзго» Я,colt и агрооактерий проводили, соответственно, на средах LB й Y1S. Растения Nlcotiana tabactm ст. SR1 поддергивали в сторзлъшх условиях на среде MS (Murasiilge, Skoog, 1962). в работе использовались векторные плвзшда рКК233-2 (Апаш, Brosiua, 1985), pGV941 (Deblaere et al., 1986), pPCY002 (KoncZ, Schsll, 1986). Молекулярное суСнлоннрованш в E.coli проводили со стандартным методикам (Маниатис и др., 1984). Шмуноблоттинг осуществляли в соответствии с методом Тоуоина (Towbin et al., 1979). Плаашды в згробактерии вводили методой прямой трансформации (to et al., 1988) н подтверздаж трансформацию, выделяя шшзииды катодом щелочного лизиса (Bimboljn, Doly, 19Т9). Трансгенные растения тебака получала методом инкубирования листовых дисков с агробактернальной суспензией о последующей регенерацией форташшх растений (Драйпэр и др., 1991). Растительную гэномяуи ДНК выделяли согласно руководству (Дрейпвр, Скотт, 1991). Полймэрвзную цепную реакцию проводили в автоматическом рэазмо на шшпфкаторэ "Биотергд". Определение глисуронидозной активности осуществляла по методу Дгюфферсона (Jefferson et al., 1987). Гликуронидазную активность in situ в ПАAT анализировали в соответствии с (Karanagh et al., 1983; сиотт и др., 1991). Метод определения квнашщинфосфотршсфэрозпой активности изложен в руководстве (Скотт п др., 1991). Для анализа инсектицидных свойств бактериальных клонов и трансгенкых растений использовались личинки непарного иелкопряда (Lymntrta dtapar), хлопковой ' совки {Hellotitis vlгевсепв), лугового мотылька (Loxoategia atlctlcalio) и колорадского иука (Lepttrwtarsa decemllneata). '

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУВДШЕ

I. Создашо бифункциональных производных генов О-андотоксинов crylA(a) и сгуША

I.I. Конструирование гена бифункционального белка "шсектотоксин СгуШа) - гликуронидаза"

Сконструированные ранее в нашей лаборатории С.В.Уэбековой плазмиды pHTIOStt и pHT103tn содержат производные гена специфичного к чешуекрылым в-вндотоксзгаа CryIA(a) fl.tfturlngleriats var. tsuratakl ЩЫ. 0Р0 в плазмиде pRT103tt содерют IQ-725-ые кодоны сгу1А(а), т.е. полную последовательность токсичного фрагмента. Перед 10-шд АК-оствтком ОРС кодирует полипетггад MGELDLVRAXISLSA. В плазмиде pRT?03tn кодирующие последовательности сгуГА(а) и кенамицинфосфогренсферазы (RPTII) слиты в одной фазе считывания. Мэяду 64?-ын АК-оствтком токсичного домене и третьим остатком NPTII ОРС ко/ирует трипептид PSL.

О целью" сконструировать ген белка, обладащего как шсектщидвдаи свойствам CrylA(a), так и легко тестируемой в растительных тканях ферментативной активностью, мы к последовательности токсичного фрагмента из pRT103tt присоединили в одной фазе считывания ОРС р-глюкуронидазы E.coll (GOS), донором которой являлась любезно предоставленная В.Л.Меттом (1ШГ РАН) плазмпда p35SGusNos. Рестрикционный фрагмент BattHl-ЕсИЗбИ из этой плазмиды после обработки синтетическими Kpnl- и Bglll-линкерами дотировали с плазмндой рШМОЗ«, расщепленной Kpnl (725-й триплет кодирующей последовательности инсектстоксина) и ВатНГ (за пределами ОРС) и получили ютзмиду pRT103tg, В результате проведенных манипуляций в потенциальном продукте гибридной ОРС домены токсина

(после 725-ого АК-остатка) и р-глшуронцдаз;; раздэлош олигопептидоы ОЗРйСС&Ь. В К- п С-концевых частях используемого фрагмента б-вндотоксдаа сохранилась участки узнавания протеазача из кишечника насекомых. Как и в шшзмэдв рКИОЗгг, ген снаоген растительными элементами регуляции експрессии: ЗбЗ-прог.итором к терминатором гена VI вируса мозаики цветной капусты, а таете вдэет оптимальный для акпрессии в растениях участок инициации трансляции состава ССАССАТСС (Ковак, 1983).

Для того, чтобы получить штага! Е.соИ, синтезирующий белок с той же первичной структурой, какой долган обладать продукт гибридной ОРС "инсектотаксин-глЕКуронидаза" в клетке растения, ш клонировали в шшзмпдз рШСШй 8а1С1-Нсо1~фрагаэнг из шхаздцца рКК233-2, который содержит нндуцибалыша промотор (гибрад 1ас-и ггр-прдаогоров). В результате, структуры белковых продуктов полученной ллазшда рТгс^, а таксе шззлогичнеи образоа сконструированных С.В.Узбвковой плазмад рФгси и р№сгп, совпадают, соответственно, со структурами продуктов рК11СШ£, рКПОЗП п рКГ1СШп и схематически представлены на рис. I. Гейша конструкции и соответствующие белка в дальнейшем сокращенно обозначается (ТТ)", "Хп (ИО", "«8 (ТС)".

1.2. Анализ свойств гнбрвда "ннсектотоксш сгуШа) -глзжуронидаза"

На рас. 2 представлены результаты шялупоблоттшга сукмарша белков клонов Е. со И, трвнсфорвфованшх шшзшдаш рТгс«, рТгсгп и рТгсгн," который проведен с использованием ■ моностшщфзчвских антител к шсектотоксанш тша Аитяга^. Как следует ез иллюстрацди, гибрвдшй белок 1X5, по всей ездикости, подвергай в бактериях гначлзэльно более интенсивному про те олитн че схему

-инсектотокспн—

10

èïzzzzzzzz

EGEmVBAKISm • 159

IR зноразмерный Cryl&(a)

TG

6U

—минимальный-

-инсектотоксин---

Полноразмерный Crylïlk

607

565* *Лб 725.

I "1

RGSIL

647

50 • 565ч *52б[

СгуША I Î II mu

СгуЩаГ

ТепК

ТепИ

565ч #526

725 1

G0S

ш&шшт

ISPGGQSb

TenG

Рис. I. Схематическое изображение аминокислотных •последовательностей белковых продуктов сконструированных производим не основе генов сгуГА(а) и сгуША. Цифры обозначают номера аминокислотных позиций соответствующих природных белкой.

Ш» — 155 кДа

- 100 кДа w. — 80 кДа

а б в г

Рис. 2. Иммуноблоттинг белков клонов E.coll, трансформированных плазмидами рКК233-2 (a), pTrctt (б), pTrctn (в) и pTrctg (г).

расщеплению, ш сравнению с белками ТТ и TN, т.к., наряду с полноразмершм 155-кДа продуктом гена tg, в превосходящих количествах продуцируется тага» иммунореактивный полипептид меньшего размера.

Наличие у 155-кДа белка nOrylX{a)-GVS" гликуронидазной активности подтверждается анализом с использованием флюорогенного субстрата 5IUG экстрактов клона pTrctg In situ в ПААГ после штактрофореза в депатурирупцпх условиях (рис. 3).

Присутствующая в клетках клона Е.ооН, содержащего pTrctg, инсектицидная активность по отношению к гусеницам L.dlspccr уступает токсичности бактерий, трансформированных pTrctt и pTrctn, Это можно объяснить как свойствами растворимости белка TG, который, как следует из анализа глнкуронидазной активности различных фракций бактериальных экстрактов, присутствует в клетках Б. со It в основпом в вида труднорастворшых агрегатов, так и удамшвватмся протеолизом полноразмерного белка в бактериях.

1.3. Конструирование генов токсичных для кесткокрылых гибридных белков на основе гена erj/IIIA .

Любезно • предоставленная Г.Г.Честухяной плазмида рКК168 содорют клонированный в векторе pUC19 фрагмент ДНК B.thvringtenals subsp. tenebrlorda, вюгочагаций последовательность crylllA. до 565-ого кодона. Для получения гена функционального белка, который обладал бн свойствами специфичного к ©эсткокрылым О-андотоксша Grylllk, мы предприняли попытку ' достроить указанный фрагмент crj/IIIA, используя гомологичную последовательность из crylA(s) (526-607-ые кодоны этого гена). Б качестве источников такой-последовательности использовались плазмида pRT103tt, -pRT1Q3tn и pRT1C3tg. Рострикционныв . EcoKI-SalGI-фрагменты, содержащие

Ряс. 3. Глхкуронпдазная активность 1л situ в геле. Клоны E.coli трансформированы плазмидами p35SGufiNos (в), pTrctg (0), pTrcteng (В).

З'-концошэ лослэдоЕатэлызоста гэгов И;, 1л и начикащився с трашгота, ооотеотствущого 527-ому кодону природного СГу1А(Й), щрзвосш в рЖ168, проводя полную рестрикцию после дней по БаШ и неполную го ЕсаНГ. РвИ^-фражотти сконструированных таким образом шгазшсд рЦ019Гепй, р0019гепп и рЦС19гепв содержат гибридные ОРС, начиная о 50-ого кодона сгуШК.

В ■ результата клонирования указанных фрзгкэнтов в вкспрассшявш вектора р!Ж233-2 были получены клони Б.соИ, содержащая рокшбннвтннв плазипда рТг^епК:, рТгеПепп и рТгсгепд, п способные акспрзссировать геш, схематическое изображение продуктов которых представлено па рис. I. Как видно из рисунка, 5'-концевые часта гибридных ОРС отличаются от начинающейся с 48-ого кодона последовательности интавтшго сгуШД лить заменой трэслшнового кодона природного гена на вшшвтй во второй полошташ. Известно такав,, что отсутствии первых 48-и АК-остатков не влияет на токсические свеййтпа СгрША (БеКаг а1., 1987; СаггоП е* а1., 1989).

1.4. Анализ свойств гибридных пшшпвптвдашх продуктов генных производных сгуША

Суказршв белки клэтспс Е.оо11, трансформированных плазмгдгг.а рТгс^епк, рфгсшт и * р(ГгсХепд, анализировали с помощью электрофореза. в денатурирующие условиях и имчуноолоттпнга, используя шноспецпфаческие антитела, К: токсинам типа гвпвЪПопЬв. Как видно из рас. 4, в указанных клонах синтезируются го£мунор9активные гголапептпдн, шеитеа кенущиеся молекулярные массы около 80, 100 и 1ББ кДа соответственно, которые в общей соипадаят о-рассчитанными' значениями, а также оо значения® масс белков, созданных ранее на основе Сгу1А(а) (рис. 2). В вкстпактах

- 155 кДа

100 кЛа 80 кДа

66 кДа 63 кДа

а 0 в г дея

Рис. 4. Иммуноблоттинг белков клонов Е.соИ, трансформированных плазмидами pTrctenk (8,6), pTrctenn (в,г), pTrcteng (д,е) и препарата очищенного С-вндотоксина из B.t.tenebrlonta (к). В случаях (а), (в), (д) экстракцию белков E.colt проводили в буфере для биотестирования (см. разд. 2.1.3), в случаях (б), (г), (е) - в буфере для определения активности р-глшуронидазы.

клеток, содержащих pTrcteng, помимо интактяого 155-кДа белка (ТепО), наблвдаэтся такяэ шмунорэактивный полипептид, который ' является, вероятно, продуктом протеолитического расщепления TenG.

Представленные на рис.3 результаты анализа ß-глшурошдазной активности принципиально не различаются для клеток, содержащих : pTrcteng п pTrctg, и иллюстрируют синтез этими клетками 155-кДа ' белков, обладапда глюкуронидазиой активностью.

В зкстрактах. суммарных белков Б.colt, несущит pTrctenn, мы продемонстрировали наличие кана?гицинфосфотрансферазной активности с помощью анализа In situ в геле. Как видно из рис. б, наряду с полноразмэрнш продукте»« ïenH, существенный вклад в КРТ-активность клеток вносит полипептид, мигрирущий аналогично NPTII. Это совпадает с результатами работы (Horte et al., 198В) по анализу НРТ-актданости . клеток Е.colt, акспрессирунцих ген типа ,*OгyIA(to)-NШI^,. Такт результаты являются, по всей видимости, следствием протеолптзческого расщепления бифункциональных белков шга инициацией - трансляции гибридной OPG в клетках E.coît с внутреннего метиовинового кодона.

Проявление . инсектицидных свойств гибридных полягте тгтидов • исследовали на личинках колорадского яука. Предварительные результат« биотестирования указали на большую токсичность экстрактов бактерий, несущих ■ pTrctenn, по сравнению с клетками клонов, содергащих pïrctenk и plrcteng. Это коррелирует с тем, что наибольшее количество потенциально инсектицидного белка в оптимальной для проведения сиотестов растворимой форме присутствует именно в клетках, експрессируодих ТепН (рос. 4). Как видно из табл. i, токсичность экстрактов клона в.colt, несущего pfôrctenn, в» уступает токсичности препарата, в котором в суспензию плеток клона -рНХ?.33-2 добавляли раствор очнщэнпнх кристаллов B.t .tenebrtonta в

а б в г

Рас. Б. Канашщавфосфотрансферазная активность In situ в геле. Клоны E.colt трансформированы плвзмидаыи pTrctn (a), pTrctenn (б), pT519Srieo (в, положительный контроль), рКК233-2 (г, отрицательный контроль).

.Таблица I.

Анализ инсектицидной активности в отношении личинок колорадского вука клонов Е.соИ, несущих указанные плазмида

Бактериальные клоны. Увеличение веса личинок по отношению к первоначальному,Ж Среднее количество погибших личинок на шестые сутки,Я

на третьи сутки на шестые сутки

рКК233-2 164-22, 339±30 . 4'

pTгctenn 104-39 87±41 ' 47

рКК233-2 с добавлением СП/1 ПА 37±51 247±79 20

количестве, приблизительно эквимолярном содержанию

бифункционального белка в клетках рТгс1;ет, -что оценивали по интенсивности окрашивания соответствующих зон на иммуноблоте. Полученные данные свидетельствуют о том, что произведенная замена элемента последовательности CryT.Uk на фрагмент из Оу1А(а) не уменьшает токсичность белка по отношению к колорадскому куку и, вероятно, к прочим жесткокрылым. В очередной рвз показано также, что слияние с ферментом НРТП не снижает инсектицидную активность эндотоксина. .

2. Получение и анализ трансгенных растений, экспрессирувдих •бифункциональные белки "инсектотоксин - маркерный фермент''

2.1. Трансгенные растения табака и картофеля с введенным геном "сгуШ а)-си3"

Сконструированный ген кодирующий бифункциональный

полипептид "Сгу1А(а)-СПЗ", клонировали в шюзмидных компонентах бинарных векторов рйУ94.1 и рРСТ002, трансформировали рекомбинатшма плазмидами штаммы АЛите?ас1еп8 1Д73850 и С73101 (рЫР90ЕК), а такие А.гЫгодэпеа А4, которые затем использовались для получения трансгенных растений табака и картофеля.

Регенерирующие поспе трансформации методом листовых дисков растения ¡ПсоНапа ХаЬасит селектировали на среде, содержащей 100 мкг/мл канамицина, и убавдались в наличии Ырт-активиости в экстрактах полученных растений (рис. 6).

Приведенные з табл. 2 результаты количественного определения глкжуронидазной активности указывают на то,, что в тканях значительной части трансформантов, в которые вводился ген <?'наруыгоается р-глюкуронидазная . активность. Широкий диапазон ¿ровней глюкуронидазной активности, который долхон коррелировать с

— NPTII

абвгденз Рис. 6. Канамицинфосфотрансферазная активность 1п аии в геле. .Клон Е.соП трансформирован плазмидой рТ5195пео (а, положительный контроль)., ^трансформированное растение ШсЛаЬасгт (б),' растения трансформированы геном tt (в) и геном tg (г - з).

f- V'

— 155 кДа ~ 115 кДа

аовгдежзи Рис. 7. Глюкуронвдазая активность In situ в геле. Клон Е.соП, трансформированный плазмидой pTrctg' и продуцирующий двудомеший полипвптид наряду с эндогенной р-глисуронидвзой (а); клон Е.соП, не содержащий плазмид (б), ^трансформированные растения Nlc.tabacm SRI (в,г); растения трансформированы геном gus (д) и геном tg (е - и). Растительные экстракты получены из PI-потомства различных линий трансформантов.

Таблице 2,

Рвспределение индивидуальньа растений, трансформированных гвнед "инсектотоксин-глвкуронидаза", относительно глшуронидазнсй активности в их тканях -

Глшуронидазная активность, .пкколь 4-Ю/(мин * мг белка)

Число растений с указанной активности

<5 (фоновая флюоресценция) 5-20 20-40 40-60 60-100

5

17. 7 I 3

уровнем накопления инсектицидного продукта, подтверждает целесообразность создания системы с использованием трансляционно слитых целевого и маркерного генов для эффективной селекция индивидуальных линий трансгенних растений с повышенным синтезом инсектотоксина.

Как известно, ОРС генов б-эндотоксинов и их бифункциональных производных экспрессируются в растительных тканях с 'низкой эфХактивностью (Barton et al., 1987; Flachhoff et al., 1987; Vaeck et al., 1987). Это таете подтверждается сравнением полученных нами растений с геном tg с растениями, трансформированными геном интактной глюкурояидазы, в которых ферментативная активность оказалась значительно выше. Несмотря на это, экстракты некоторых трансформантов tg и их потомства нами были успешно использованы для определения глюкуронидазной активности In situ в ПААГ после электрофореза в денатурирувдих условиях. Как видно из рис. 7, глюкуронидазной активностью в таких растениях обладает интактный бифункциональный белок "CryIA(a)-GUS".

• При анализе инсектицидных- свойств полученных трансгенных растений с использованием гусениц непарного шелкопряда L.dispar была обнаружена частичная устойчивость некоторых обладающих сравнительно высокой глюкуронидазной активностью растений к поранению личинками. Однако, мы не добились строгой воспроизводимости результатов и количественной оценки токсичности. Это объясняется тем, что табак на является естественной rrrenerf для гусениц I.dispar. Предварительна анализ потомства трансформантов на устойчивость по отношению к L.at let leal ta и R.armlgera также указывает на экспрессию в них инсектотоксина. Разницы в токсических свойствах растений с введенным геном wcryIA(a)-gus" и служивших пологштельным контролем трансформантов геном tt не наблюдается.

Расщепление признака устойчивости к канамицину и сцепленной с ним гликуронидазной активности в потомстве,* полученном после самоопыления трансгенных растений табака, проходит подобно доминантному признаку по Мендели, что согласуется с выводами работы (Вийаг, 1986).

Глвжуронидазная активность в растениях картофеля сорта Львовянка, экспрессируюдих гибридный ген "сгуН(а)-^изи, находится в пределах 6-15 пкмоль 4-Ш / (мин * мг белка). Достаточно чувствительный д^н анализа токсичности растений картофеля к чешуекрылым тест-объект вам выбрать не удалось.

2.?.. Трансгеннне растения табака и картофеля с введенным геном ясггД11А-сгу1А(8)-прШ"

Для получения трансгенных растений, устойчивых к жесткокрылым, мы решили использовать сконструированный ген бифункционального белка "шсектотоксин-КРИI". Любезно предоставленная С.В.Узбековой плазщда рСУ94Пп содержит ген, который отличается ->т присутствующего в рППОЗгп лишь заменой терминатора гена 71 ЕМЦК на терминатор гена нопалинсинтазы Т1ГО3. Собственный ген селективного маркера НРТП,. происходящий из рСУ941, в плазшде рСУ941удален. Плазмида рС7941иЛп также предоставлена С.В.Узбековой и отличается от рСУ94Пп наличием перед гибридным геном дополнительно послодовагольностх! усилителя трансляции и из вируса табачной мозаики (Са111е ег а!.. 193Т).

Нсо1-фрагменты плазмид рС7941и рС7941югп, содержащие последовательность ОБО гибридного гена, которая включает кодируйте последовательности иксектотоксина Сп/1А(а) и частично НРТП (до :78-го кодона), заменялись яа N001-фрагмент рТгсгеш, который, в спою очередь, содержит последовательность ОРС гепп, ограниченную на

З'-коицв сайтом рестрикции из nptll с тагао.м гв координатами. В результате были получены плазмиды pG7941term и pGV941utenn, которые отличаются от pGV941tn и pGV941cotn заменой последовательности ОРС гена tn на ОРС гена tenn.

Сконструированными таким образом плазмидами трансформировали пижмы A.tumefactens LGV3850 и A.rhtzogenes А4 и затем использовали их для получения трансгенних растений табака и картофеля.

Селекция трансганных растений табака после трансформации с помощью плазмид pG7941teim и pGV941utenn проводилась на искусственной питательной среде, содержащей 30-50 мкг/мл Km. Устойчивость к канамицину обеспечивалась исключительно за счет экспрессии бифункционального белка "инсектотоксин-НРТП".

Встройку гетерологичной ДНК в растительный геном подтверждали с помощью голимеразной цепной реакции. Размер синтезируемых в ПЦР фрагментов ДНК соотвествует расчетному.

Экстракта трансгенных растений табака, проявляющих наиоольшуго устойчивость к канамицину, были использованы для определения N?T-активности In aitu в ПААГ. Из рис. 8 видно, что, как и в случае экспрессии гибрида TenN в клетках Е.соИ, наибольшей NPT-активностью в экстрактах растений, .несущих ген этого бифункционального белка, обладает полгатаптид, мигрирующий аналогично NPTJI. Лаже после применения специальных методов по устранении фоновых сигналов, вызванных активностью растительных протеинкиназ, NPT-активность интактного 100-кДа белка TenN оставалась слабо заметна. Подобная картина объясняется, по нашему мнению, интенсивным протеолитическим расщеплением бифункционального белка в растительных тканях In vivo, скорее всего, в месте слиянии ЛК-последовательностей токсичного и маркерного доменов.

Расщепление признака устойчивости к канамицину у ррстеьиг;

а о в г д

Рис. 8. Канамицивфосфотраноферазная активность In situ в геле* Трансгенные растения fflcat tana tabacm трансформированы геном tern, еодэрзацим последовательность усилителя трансляции и (а,б), и не содаркащим его (в,г). Клон E.coll, трав сформированный шшзмидой pTrctem (д).

табака, прорсцзнных из сешш после самсошлонпя трансформантов tem, не отличалось от рассматривавшегося для потомство растений с геном tg (разд. 2.1). Для многих выращенных из семян растений экспрессия (Здункционадьяого белка TenN была такова, что достаточно ' высокое содеряште Кт в среде (до 150 мкг/мл) совершенно но тормозило развитие растений. Б тканях растений, гомозиготное по признаку устойчивости, к канакицину, наблюдалось усиление ОТТ-сигнала пра анализе активности In situ в ПААГ. В настоящее вреия продолжаются наблюдения за потомством трансгенпых растений третьего поколения.

Сконструированный ген бифункционального белка "шсектотоксия-ItPTII" сотрудник нашей лаборатории И.Л.Дридае, сотрудншс ИГЦ АН Беларуси С.Д.Курочкива и сотрудники' НПО по картофелеводству Г.В.Рассадина п И.О.Юрьева вводили такие ' в растения картофеля сортов Дезирэ, Львовянка и Жуковский ранний. Траясформанты отбирали на ерэде, содержащей 25-30 ккг/ил Km, что является достаточной селективной концентрацией для такой культуры, как картофель. Встройку гетеролопгпюа ДНК в растительный геном' подтверждали с помощью ПНР. Кек правило, экспрессия гена бифункционального белка обеспечивала нормальный рост трансформантов &а среде с указанной концентрацией антибиотика, но зачасгуа была недостаточна для пх стабильного укоренения при вегетативном размножении. В то кэ время, контрольные нэтршефоргяированше растения не развивались п присутствии использув1йых концентраций селективного антибиотика и погибала через 10-15 дней.

Три индивидуальные лянш полученных трэнсгэнных растений картофеля были проанализированы на токсичность по стяслетт к колорадскому йуку. Личинка на трансгеншгх растениях сущэствеяш отставали в росте а развитии от контрольных. В то га врем д.

заметной токсичности во время вкспэршанта с взгвтативтаз потомством полученных линий обваррнтъ т удалось, что отчасти объясняется иорашоцзшостьи &авнаспособности используемых лкчшкя: пуков, но уквзываэт таша на необходимость увеличения вкспрваснш токсичного белка.

Нами па было ввкзчоно существенного усиления вкспраосш бифункционального гибрида нря • анализе траноганвдх растений табака и картофеля, полученных с по&ощыэ шшзывду рОУ941ш1апп, по срагшешо с растениями, жвдавшшш с помощь» ра?94Пеш, т.е. в отсутствия усилителя трансляции ш. Это указывает на наобходадаоть дальнейзаго поиска рвгуляторшх вламзнтов, которые бы белей еффзктнвяо усиливали экспрессию Енсектотогошов в растениях.

вывода

1. Сконструирован ген гибридного белка "минимальный. гаюэктотоксин Сгу1к(ъ) - глтасуронидаэа" и показано' проявление продуктом такого гена как токсичности по отношению к чешуекрылым, так п маркерной глюкуронидавной активности.

2. Ограниченная в 3'-концевой части 565-ым кодовом последовательность гена специфичного к яэсткокрылым в-андотоксина СгуНХА дополнена гомологичным фрагментом гена сгу1А(а) и сконструированы гены, где такая гибридная ОРС слита с кодирущими последовательностями калашцннфосфотрансфервзы .(КРТИ) и ¡З-глюкуронидазы.

3.. Анализ полипептидных продуктов &тик генов установил проявление бифункциональными белками соответствующих. ферментативных активностей и доказал, что использованный • фрагмент последовательности СГуША целиком содержит область, ответственную за токсичность по отношению к гдасткокрылни.

4. Получали трдчсгвннш растения табака и картофеля, содержащие и экспрессирущие гены бифункциональных белков "Сгу1А(в) - глшуронидаза" ' и "СгуША - Сгу1А(а) канамицшфосфотрансфераза ".

5. Показана эффективность применения системы гибридных генов типа "инсектотоксин-фермект" для чувствительной де жции инсектицидных белков по маркерной ферментативной, активности п трансгенных растениях и для первичной селекции трансформпнтов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

I. Кузькин Б.В., Шаденков A.A.. Узбекова C.B., Еешшга M.G. Создание бифункциональных производных гена инсектотоксина Bacillus thurlnßlenala var.kuratakl для экспрессии в трансгенннх растениях // Доклада Академии Наук СССР. 1991. Том 321, Л 2. С.412-415.

- 2. Шаденков A.A., Кузьмин Е.В., Эйснар Г.И., Шаыякин 14.0. Экспрессия гибридного гена бифункционального белке "инсектотоксин-глижуронидаза" в трансгенных растениях табака // I Всесоюзный симпозиум "Новые методы биотехнологии растений". Пущино, 1991. Тез. докл. С. 47.

3. Кузьшв Е.В., Шаденков A.A., Узбекова C.B., Шешовш И.О. Создание генов, кодирующих бифункциональные инсектицидные белки < маркерной активностью для экспрессии в трансгенных растениях' // ] Всесоюзный симпозиум "Новые методы биотехнологии растений". Пущино, 1991. Тез. докл. С.22.

4. Шаденков A.A., Узбекова C.B., Кувышн Е.В., Золотовэ Т.Б., Эйснер Г.И., Шемякин Н.Ф. Экспрессия гибридного reHi бифункционального белка "инсектотоксин-глккуронидаза" в трансгенны: растениях табака // Доклада /-садемии Наук. 1992. .Том 325, * I. С 183-186.

5. Йаденков A.A., Дрздзэ И.Л., Гетачеу Т.&., Курочкииа С.Д. Узбекова C.B., Ыайсурян А.Н., Шемякин М.®. Конструирование ген токсичного для жесткокрылых белка "CHHIIA-CRYIA(a)-NPTII" введение его в трансгенные растения картофеля // II Российски симпозиум "Новые методы биотехнологии растений". Пущино, 1993. Тез докл. С.59.

6. Шаденков A.A., Курочкина С.Д., Узбекова С.В.,Дридзе И.Л. Хадеева Н.В., Забеньковя К.И., Шемякин М.Ф. Получение трансгенны

растений картофеля, несущих произведшие гена ннсектотоксина Сгу1Л(а) Baoillua ifturingtensla чат. kurataül // II Российский сшпознум "Новые метода биотехнологии растений". Пущино, 19ЭЗ. Тез. докл. С.60.

7. Узбексаа C.B.", Шэдепков A.A., Ковалева И.В., Куэыст В.В. Бифункциональные белки "инсактотоксин-NPT" в трансгенных растениях табака // II Российский симпозиум "Новые методы биотехнологии растений". Пущино, I99G. Тез. докл. С.54.

8. Шадэпхов A.A., Кадыров P.M., Уебекова C.B., Кузьмин В.В., Остершп А.Л., Чэстухинз Г.Г., Шемякин Н.Э. Создание гена гибридного белка на основе О-эндотоксинов Baal1T.ua thurlnglewts СгуША н СгуШа) и вкспрессия его производных в Escherichia coll // Молекулярная биология. 1993. Т.27. С..952-959.