Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Создание трансгенных растений картофеля, экспрессирующих модифицированный ген дельта-эндотоксина из Bacillus thurinciensis var. tenebrionis

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Создание трансгенных растений картофеля, экспрессирующих модифицированный ген дельта-эндотоксина из Bacillus thurinciensis var. tenebrionis"

ПБ ОА

Л П 1 СИ " ^ Л '

российская академия наук

ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им.В.А.ЭНШЬГАРДГА

На правах рукописи УДК 577.21

Гулина Ирина Вячеславовна г

СОЗДАНИЕ ТРАНПШШЫХ РАСТЕНИИ КАРТОФЕЛЯ, ЭКСПРЕССИРУВДИХ МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ГЕН «-ЭНДОТОКСИНА ИЗ васш.из тнш1нс1ем513 чат. 1впеъг1оп1з

03.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1994

Работа выполнена в лаборатории генетической инженерии Центра "Биошкенерая" РАН

НАУЧНЫЕ РУКОВОЖРЕШ: доктор биологических наук, профессор, член-корр. РАСХН К.Г.Скрябин, кандидат химических наук О.А.Шульга

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук В.Ц.Андрианов

кандидат биологических наук Л.Б.Дорохов

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Институт общей генетики. РАН

Защита состоится " " г. в ^/часов на

заселении специализированного совета Д.0С2.79.01 при Институте .молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН по адресу: 117984 Москва, ул.Вавилова, д.32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН

Автореферат разослан "

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат химических наук А.М.Крицын

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы: •Среди задач, которые приходится решать при создгнии ценных сельскохозяйственннх культур, наиболее важной является получение растений, устойчивых к. насекомым-вредителям. Особенно это актуально в отношении колорадского картофельного жука, потенциальные потери урожая от которого .в отдельна регионах, могут достигать от 6.8 до 36.55 в зависимости от сорта и фазы развития растений в момент появления вредоносной стали вредителя. Традиционные методы селекции устойчивых сортов трудоемки и дое" :_илменны, а применение инсектицидов зачастую создает неблагоприятную экологическую обстановку не только в пределах агрофи-тоценозов, но и в отдаленных природных биоценозах.

Развитие и широкое применение методов генетическхй инженерит* и методов трансформации растительных клетс:; позвался получать трансгенные растения, экспрессирушие гетерологичнзе гены. ? литературе имеются многочисленные примеры создания трансгенни~ рг с-тений, устойчивость которых к различЕж: пасекомЕс-вро.дитолям обусловлена экспрессией в них генов ^-эндотоксинов (cry-генов) из

Bacillus thuringiensis раЗЛИЧНЫХ ПОДВИДОВ (Dellanrjay at al.,J989; Perlak et al.,1990; Itoh et al. ,1933):" КНСеКТЕИИДЗОе ДвЙСТВИв

белков, кодируемых этими генами, известно давно. Однако, попытки экспрсссировать cry-гены в трансгенных растениях осуществлены относительно недавно. Но они показали, что природные последовательности этих гонов имеют низкий уровень экспрессии в метках трансгенных растений. Поскольку гены инсектицпдных белзов имеют бактериальное происхождение, по-видимому, низкий уровень их экспрессии в травсгэнных растениях связан с различаем кодонового состава про- и зузариот. Поэтому возникла идея о получении н экспрессии

синтетическк аналогов этш генов с кодоновым составом, оптимизированным дм трансляционной системы растений.

. . Настоягая работа посвящена изучению экспрессии в трансгенных растениях картофеля частично модифицированного гена з-эндотоксина

ИЗ Bacillus thuringiensis var. tenebrionis И■ ИССЛедОВаНИЮ ИНСвК-тицидного деаствия его продукта.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в получении растений картофеля сортов Теш, Desiree, Resy, гранат экспрессирулшх частично модифицированный ген s-эндотоксина из

Bacillus thuringiensis var. tenebrionis И ИЗуЧвНИЙ ВЛИЯНИЯ еГО

экспрессии на устойчивость трансгенных растений к повреждению колорадским хуком. В задачи исследования входило:

1. Замена исходных кодонов на оптимизированные для трансляции в растительных клетках.

2. Создание конструкций для экспрессии в растениях частично модифицированного гена s-эндотоксина, содержащих регуляторные элементы, обеспечиващие эффективную экспрессию этого гена в растениях.

3. Получение на основе реципиентных итаммов LBA44Q4, А281, СВЕ21 штаммов агробахтерай, несущих созданные кассеты экспрессии, для трансформации -растений.

4. Трансформация растений картофеля (Solanum tuberosum L.) и

изучение экспрессии модифицированной последовательности в трансгенных растениях.

5. Исследование устойчивости трансгенных растений к повреждению колорадским жуком, получение клубней трансгенного картофеля, пригодных для дальнейших манипуляций.

Научная новизна и практическая ценность работы. С ПОМОЩЬЮ метода голимзразвой цепной реакции проведена частичная модифика-

ция природной последовательности гена s-гндотоксина кз Bacillus

thurincriensis vaг. tenebrionis. Сконструирована КЭССбТа ЭКЙфОС-

сии этого г-ана под коЕтролам регуляторннх глементов 35S-PHK вируса мозаики цветной капусты. Полученная конструкция перенесена В штаммн Aerobacterlum tumefaciens LBA4ÍА281, СБЕ21, используемые для трансформации растений. Получены трансгённые растения s.tuberosum сортов Темп, Desiree, Resy, Гранат экспрессируюзе частично модифицированный rea ¿-эндотоксина. Показано, что эти растения оказквда угнетающее воздействие на лабораторную популяцию колорадского зхука.

Известно, что многие сорта, облздсл целим спектром полезных и ценных качеств, в значительной степени поражаются колорадским куком. Поэтому тем более важной является задача придания таким сортам устойчивости к этому вредитега. Полученные клубки трансгенных растений могут сыть использованы как для дальнейших биологических испытаний, так и для вовлечения в селекцконнае работы.

Апробация работы. Представленные в диссертации результаты были дологени я обсушены на II Мездународном симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" (Пдано, 1993), на конференции "Генетическая инженерия и биотехнология" (Мине::, 1S9-1), на.заседаниях коллоквиума лаборатории генетической инженерии и Ученого Совета Центра "Биокнженерия" РАН.

Структура и объем диссертации. Диссертация ссстсзт из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов, изложение и сбсуздчнке эксперимвн-тальлых результатов, выводов и cimera литературы. Работа содержит 102 страницы машинописного текста, зкдочает 11 ркс^шяв и бсйлзографаческЕй список из 138 названий.

Использованные сокращения. Bt, ВИЗ, 5177 - гены

s-эндотоксина: природная последовательность, природная последовательность, клонированная в бактериофаг М13 шр ю, частично модифицированная, соответственно; cry- гены - гены кристаллических инсектицидных белков ИЗ Bacillus thuringiens is.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Клонирование кодируюдея последователь ности гена Bt. Исходя из опубликованной последовательности гена протоксина s-эндотоксина (Sekar et al.,1987) была синтезирована пара праймеров БТ1 (5'-ggg атс cat gac тсс aga taa taa tac gca-3 ) и БТ2 (5'-ggg agc tct taa ttc act gga ata AAT тел att ttg tc-3 •), ограничивавших кодирующую область. активного токсина. С помощью полимеразнсй цепной реакции, проведенной на суммарной ДНК, выделенной из штамма Bacillus

•thuringiensis var. tenebrionis, бЫЛ ПОЛуЧвН фрагмент ДНК, ДЛИНОЙ

1812 нуклеотвдных пар. Этот фрагмент был встроен в сайт Вааш фага М13 юр 10 (рис.1). Определение нуклеотидной последовательности 200 н.п. с 5* и 200 н.п. с 3'-конца клонированного фрагмента методом Сэнгера <Senger,i98i) показало ее идентичность с опубликованной ранее. Далее одноцепочечная ДНК фага М13 шр ю с клонированной последовательность» была использована для частичной модификации гена bt.

Модификация концевых последовательностей гена Bt. Для изменения первичной последовательности гена вт модифицирующий олигонук-леотид Bt77 15' -GGGATCCACC ATG GCA GCA GAC AAC AAC ACT GAA GCA CTC GAT TCT ACT ACC AAG GAC GTC АТС CAG aaa GGC ATT TCC-3" > 0ТЖИ-гался на матрице и достраивался с помощью Taq-полимеразы (Биопол) при 72°С в течение 3 минут. Затем полученный продукт использовали

ВззяШ

!ато ато . 7SS б - ЭНДОТОКСИН 1

1 вут>нт

ВшШ

Btl3

Ка>1

1. Кгонкроюнне в МП

2. СекагняроЕаиие

Btl3

i«—yj»ki

пцр

Сегвенироваяне Null ЕссЭ

Bt77

Клонирование J Neoi>Ee>Rl

вхаесету экспрессии

I

Ncol БхИ

i 1

а

»«««¿вБв Bt77 ЫrNOs

Рис. 1. CXIMA МОДИФИКАЦИИ ГЕНА 5 -ЭНДОТОКСИНА из Bacillus thwingietisis vor. tenebrianis я получения кассеты дяя экспрессии ' модифицированного гена в растениях

-6в качестве матрицы лая ПЦР с праймерама 5'-ашр (S'-gggatccacc atg ее? GCA еле Аде ААС-з'i, который был комплементарен модифицированной последовательности б'-коица гена Bt, и 2* -amp о'-ттс атт аат тса ctg gaa taa атт caa тот tgt с-з ' i, который был комлементарен последовательности 3*-конца гена Bt и одновременно являлся модифицирующим. Смесь инкубировали 2 минутк прз 94°С и затем проводили 20 циклов: 1 кинута щш 94°С, 2.5 мЕкутшзри 7Z°C. Образовавшиеся продукты клонировали и секвенировали. В результате в нук-леотадной последовательности гена Bt были получены точечные замены, показанные на рис.2. Клон, содержащий ген, в котором первые 67 и последние 23 н.е. заменены синтезированной последователь-' костью, был использован для дальнейших, манипуляций. Частично модифицированный ген s-звдотоксина был соединен с промтором 35S (Odeil,1985) и сайтом полиаденилирования гена нопалинсинтетазы (Sanders st al. ,19871, а Затем ЛИШрОВаН С плазмвдой рМОН505,

исходная S'-ATG ACT GCA GAT AAT AAT ACG GAA GCA СТА GAT AGÇ TCT М0ДИф1Щ. 5 ' -ATG GCT GCA GAÇ A AC AAÇ ACT GAA GCA CTC GAT TCT TCÇ

АСА AAA GAT CTC ATT CAA AAA АСА ...........................

ACÇ AAS CAÇ CTC АТС CAG AAG ACT...........................

;.................................AAT GAA TTT CCA GTG AAT -3 *

:................................ .AAG AAT TTT CCI GTT AAT -3'

Рис.2. Модифицированные последовательности гена а-эндотокеша.

расщепленной рестриктазой N0«. Таким образом был -получен бннар-еый вектор р!юм505^77. Его структура показана на рис.з.

Рис.З.Структура бинарного трансфорлирущзго вектора p.v0N505:Bt77. вк2 - фрагмент плазмвды а широким кругом хозяев RK2, содержащий сайты инициа^чи ретаикацпи и переноса; ori322 -фрагмент, содержащий сайт инициации репликации pBR322-, йв - правая пограничная последовательность Т-ДНК рптзт; nos - p7iT37 -ген нопалинсинтетазы рТ1~37; Tn7 Spo/Stгй - фрагмент из Тп7, со-дешадий ген устойчивости к спектшомицину/стрептомишзу; npt -химерный ген неомглинфосфотрансферазы и с промотором и терминатором гена нопалинсинтетазы Т-ДНК, ооеспечиваншй з трансформированных клетках растения устойчивость к канамицкау; Bt77 - частично модифицированный ген 5-ЭНДОТОКСИНа из Bacillus thuringiensis var tenebrionis. Стрелкам показано направление транскшшии. ■

Получение агробактерии.. несущих бинарный вектор pMQH505r4t77 1. Шазмвду pMOf!5C5:Bt77, содержащуюся В штамме HB] 03 E.coll, с покошью плазкиди-пшовника рПК2013 (Figurski et ai.,i973i, содержащейся в штамме hbioi к.coli, переносили в A.tumefaciens штампа LBA4404 трехродительской конъюгацией штаммов (Gbeesen et ai. .198? i. После двух пассаяэй на минимальной АЗ-сред2. содержащей 100 мкг/мл канамицина, 25мкг/мл рифашкцива и 5Ф.кг/ьш спек-тиномицина, из полученных клонов агрсЗактерай выделяли суммар-

яую ДНК (Draper et ai.,i986!, обрабатывали эшюнуклзазой рестрикции BaxcHi и проводили анализ по методу Саузерна ¡Маниатис и соавт.,1984). Результаты этого анализа представлены на рис.4.

1 2 3 4 5 6

Рис.4. Анализ геномной ДНК, выделещой из агробактерий штамма LBA4404, путем рестрикции и гибридизации по Саузерну. 1 - ДНК рМОМ505; 2 - ВашНХ фраГМОНТ ПЛаЗМЩШ p«OK505:Et7T;3-6 - суммарная ДНК агробактерий, обработанная BacHi

2. Агробактерии штаммов А281 и СВЕ21, несущие бинарный вектор PU0K505:Btrr были получены трансформацией компетентных клеток ре-ципиентных атаммов агробактерий (Hofgen et ai.,i98ei. Из полученных клонов агробактерий выделяли суммарную ДНК и проводили анализ ПО методу ШР, описанному в руководстве Currant Protocol in

Molecular Biology, V.2, Supl.12.

Полученные таким образом штаммы агробактерий использовали ДЛЯ трансформации растений картофеля сортов Desiree, Easy, Теш, Гранат.

Ранее Глагоцкой и соавт. (1990) было показано, что растения сорта Темп хоропо трансформируются при использовании штамма LBA4404. Для выбора системы трансформации других сортов картофеля было решено провести предварительный эксперимент с использованием всех трех штаммов агробактерий, содераашх разные плазмшщ-помоиники, на модельном сорте Desiree. с помощью ППР показано.

что при трансформации, опосредованной. СБЕ21, 1CCS регенерантов содержат ген Bt77, тогда как при трансформации, опосредованной А281 и LBA4404 - 46 и 165, соответственно. Основываясь на ьтпх даншгх, трансформацию сортов Hesy и Гранат проводили с помощь» штамма СВЕ21.

Трансформация стеблевых сегментов каитсаеля. Стеблевые сегменты картофеля получали из растений, выращенных асептически б течение четырех недель на среде si iEe Bioc;k,i98s> и переносим их в жидкую среду hs íHurashice.sioog,1952¡. Ночную культуру агробактерий добавляли к стеблевым сегментам, находящимся в чаше Петря в 10 мл кидкой среды ms тагам, образом, чтобы соотношение агробакте-ркальной культуры и среды иисубации составляло i:20. Кокультиви-рование агробактерий и стеблевых сегментов растений картофеля проводили в течение 16-ie часов при 2^С в темноте. По окончании инкубации сегменты переносили на среду из, содержащую агар в концентрации 0.7%. Через троз суток сегменты переносила на среду wsv с фжгогормснаыи (Глагоцкая Т.Д., личное сообщение) состава: 0.2 да/л 1-Еафталуксусной кислоты, 1 мг/л зеатина, 0.02 мг/л ги-Оерелловой кислоты, 1 мг/л 6-бензилачинонурина, соли ks, 0,7 s агар, 100 мкг/мл цефотаксима, 200 мкг/мл карбенилзллияа, 50 мкг/мл канакицина. Регенеранты переносили на среду si, содержащую в качестве селективного агента канамицин, а также цефотаксим в концентрации 500 мкг/мл, чтобы искгопггь агробактериаяьное заражение растений. В среднем процесс регенерации и укоренения полученных регенерантов занял 5-8 месяцев. Укоренивсиеся регенеранты анализировали на присутствие гена Btrr в геноме при пошци ПЦР.

Проведение полимеразной цепной реакции ца геномной ДНК растенйй-регенералтов ■ Геномную ДНК из растений-регенерантов выделяли методом, описанным ранее (Падегаиас и соавт.,1993). Для проведения ЩР использовали праймеры, специфичные к последовательности 35s-npom0t0pa (5■-tgacgcacaatcccactatccttcgc-з1 ) и гена

Bt77 ( 5 '-AGCCAGGGACGTATTCGCGAGC-3" >. ГОТОВИЛИ реаКШЮННУЭ СМвСЬ состава: 2 шел буфера для Taq-полимеразы (Amershaa) состава: 100 мМ Tris-Hci рк 8.3, 500 iüä KCl, 15 мм UgCij, o.oiss iw/v) хелати-на, 200 Midi смеси четырех ¿ntp, 20 нмоль каждого праймера, 100200 нг геномной ДНК (5 моя полученного препарата) и 0.5 ед Taq-полимеразы. Общий об)ем смеси составлял 20 мкл. ЩР проводили в течение 35 циклов (денатурация в течение 1 минуты при 9$ с отжиг в течение 1 минуты при бсЯс, синтез в течение 1 минуты при 72°С) в термоцаклере Techno MV-1. Половину реакционной смеси фракционировали в is агарозном геле в трис-ацетатном буфере и окрашивали бромистым этидием. Результаты одного из таких анализов представлены на рис.5.

Изучение экспрессии интегрированных генов. Методом бдот-иммуногибридизации белков (LaemmH,1970; Towbin et al., 1979) определяли уровень синтеза s-эндотоксина в трансгвнных растениях картофеля. Бедки выделяли в видоизмененном буфере Лэмли состава: 'ЗСК глицерол, 5* р-меркаптоэтанол, 5* sus, 125 мМ Trts-HCi pH 6.а из предварительно гомогенизированных в жидком азоте листовых тканей асептически вырааенных растений. Для этого гомогенат листовых тканей заливали эквивалентным (V:Vi количеством буфера Лэмли, суспендировали при помощи аппарата "Миксер-ВЛ" в течение пяти секунд и выдергивали при sic в течение пяти минут в термостате фирмы "Eppendorf". После чего центрифугировали в те-

Рис.5. ЩР-анализ геномной ДНК, выделенной из растеянй-регенерантов сортов Теш (дорожки 3-5, номера растенай ТЗ, 14, Т5, соответственно) и Desiree (дорожки 6-9, номера растений D2, ВЗ, В22, D23, соответственно); дорояки 1 и 11 - ДНК плазмины puci9, разрезанной рестриктазой Mspi¡ дорожка 2 - продукты ПЦР, прозе ленной на плазмидной ДНК бинарного вектора p«ON505:Bt77-, дорожка 10 - продукты ПЦР, проведенной на ДНК нетрансформированного растения.

чение семи минут на центрифуге 5414 фирмы "Eppendorf". Суперна-тант переносили в новые пробирки. Концентрацию белка определяли по методу Брэдфорда (Bradford. 1976). 25 мкг суммарного белка фракционировали з 7% полиакриламидном геле в присутствии додешш-сульфата натри* и переносили на • нитроцеллЕлозннй фильтр

ScMeicher&Schuell В ТрИС-ГЛШШНОВОМ буфере (Ш 8.3) С ЭТЭНОЛОМ при 300 тА в течение 2 часов. Фильтр инскуоировали в блокирующем буфере (50мМ Tris-HCl pH 7.5, ¡50 Ы< NaCl, 5 шЕ EDTA, 0.25% кеЛЗ-ТЕн, 0.05% NP-40, 0.1 х Tween-201 при комнатной температуре в течение 12 часов. Затем добавляли разведенные в блокирующем буфере

(1:1000) осшклоналыше антитела к кристаллическому белку из

Bacillus ttea-ingiensis var tenebrionis, предоставленные СОТруДниками ВНИИ генетики и селекции промышленных, микрорганизмов РАК. йиьтр кассировали в течение часа и промывали 2-3 раза блокирующим буфере». Затем добавляли пероксидазу, конъвгированнув с иммуноглобулинами козла, шбридизунимися с полжкональными эктк-телами кролика, и инкубировали в течение часа. После отмывки не-связавшихся антител фильтр окрашивали 0.04% раствором 3,3'-диаминобензнина в присутствии 0.035s хлорида кобальта в буфере рвз. б качестве положительного контроля был использован очищенный

5-ЭНД0Т0ХСЯЗ.

Частичная- замена природных кодонов Bt на характерные для эукариот, а также использование промотора 35S-PHK вируса мозаики цветной капусты, определили детектируемое накопление 5-зндотоксаЕа в клетках полученных растений. Анализ трансгенных растений методом блот-иммуногибридизации (рис.6) показал, что накопление &-зндотоксина составляет 0.005-0.022 от количества сум;,¡арного белка.

Биологическое тестирование трзнсгенных растений проводили в лабо раторных усетвиях, видоизменив метод, описанный ранее (Методические рекомендации по оценке устойчивости картофеля к колорадскому жуку, 1987). Для этого листья 3-4 яруса трансгенных и нетрансфор-мированных растений, выращиваемых в вегетационном домике, помещали в чашки Дгари на увлажненную фильтровальную бумагу. На приготовленные таким образом чашки Петри подсаживали по 10 личинок первого раннего возраста, средний вес которых составлял 0.7+0.1 мг. Чашки с личинками помещали в комнату искусственного климата с равнорменш освещением (длина светового дня -

1 2 3 4 5 6 7 8 91011

Рис.6. .Результаты анализа трансгенных растений картофеля методом блот-шмуногибридизации. Дорожка 1 - 20 нг «-эндотоксина, дорожки 6 и 11 - 25 мкг суммарного белка из нетрансформированных растений картофеля соответствующих сортов.

Сорт Теш: дорожки 7-10, номера растений ТЗ,Т4,Т5,Т15, соответственно.

Сорт Эезхгее: ДОрОЖКИ 2-5, Номера раСТеНИЙ П2,23,В22,Б23, соответственно.

12 часов) при температуре 25-ЗсРс. Ежедневно меняли фильтровальную бумагу с листьями для кормления. Определение веса и количества выживши личинок проводили на шестые и двадцать певвые сутки с момента начала корлпения. Количество выживших личинок определяли также в момент появления первых куколок.

На рисунке 7 представлена диаграмма, на которой показано процентное отношение среднего веса личинок первого возраста, питающихся трансгенными растениями, к среднему весу личинок, питающихся листьями ^трансформированного растения. Для сорта Темп наибольшее отставание в весе наблвдалось у личинок, питающихся

1

п

W — — tt

аш м> «м «ш

Рис.7. Вес личинок (в процентах от контроля через шесть суток после начала питания листьями трансгенных растений сорта Теш (А), 1)еа1гее (Б), Кегу (В).

листьями растений ТЗ, Т4, 15, и Т18: на 55.6 , 61.0 , 70.4 и 56.45 соответственно, для сesiree - у личинок, питашихся листьями растений D2, из, ы, D5 - на 54.0, 45.0 , 48.0 и 43.0, соответственно, ДЛЯ сорта Resy - у личинок, питающихся листьями растения Rsi5 - на 76.93

В этот же период проводили визуальную оцежу повреждаемости поверхности листовой пластинки (рис.£.), которая показалф, что наименьшей поврекдаэмостью характеризуются растения ТЗ и Т5 copra

Темп. Адаяг и соавт.(1990) показали, что уровень синтеза 5-эвдотоксина коррелирует со степенью угнетения жизнедеятельности колорадского жука.. В нашем же случае уровень экспрессии белка в растениях ТЗ и Т5 не отличался от такового в других растениях этого сорта.

Рис.8. Повреждаемость поверхности листовой пластинки трансгенных растений сорта Темп. К - нетрансфоршрованяое растение данного сорта, 1 - растение ТЗ, 2 - растение Т5.

Perlak et al., 1990 ПОЛУЧИЛИ ТраЯСГвЕНЫе раСТвНИЯ ХЛОПЧаТ ника, экспрессирупще синтетический аналог cry ia гена. Ими показано, что уровень экспрессии этого гена в 100 раз выше уровня синтеза бактериального и составляет от 0.05 до O.is от суммарно экстрагируемого белка. Процент повреждения листовой поверхности гусеницами Manduca sexta при таком уровне синтеза инсектицидного белка составлял от 30 до 132. в нашем случав уровень экспрессии частично модифицированного гена s-эндотоксина был в 5 раз ниже по сравнению с представленными данными. Причем оптимизированные .нами последовательности составляют лишь 55 от полного гена. В таблице 1 приведены данные по оценке повреждаемости поверхности листовой пластинки трансгенных растений, из -которой видно, что устойчивость полученных нами растений по этому показателю достаточно высока. Так, для растения ТЗ повреждается лишь 20г

листовой поверзности.

Известна, что личинка колорадского жука з процессе развития претерпевают три линьки. После второй линьки наступает третий

Таблица 1.Поврездаемость поверхности листовой .пластинки трансгенных растений сортоз Теш, Desires, Resy.

Теш' Desiree Ез sy

n растения «г н растения % н растения %

3 20 2 60 12 40

4 55 3 45 14 50

5 40 4 30 15 40

10 40 5 30 контроль 100

18 50 6 60

контроль 100 9 55

контроль 100

возраст личиночной стадии. В этот период личинки наиболее устойчивы к различным воздействиям (Ferro et al.,1991.УшаТИНСКЭЯ И соавт.,1981). Чтобы определить степень угнетающего воздействия обобщенной популяции трансгенного картофеля на лабораторную популяции вредителя, был проведен статистический анализ распределения веса подопытных личинок третьего возраста (21-е сутки питания трансгенными растениями). Данные представлены на рис.9

Как видно из- рисунка, вес большинства личинок колеблется около отметки 50 мг, тогда как максимальный вес личинок в контроле составлял 116.8 мг. Аналогичный аксперимэнт был проведен

Адангсм и соавт.(1990) для каждой отдельной лишш трансгенных растений. Вес Личинок третьего возраста в этом случае колеблется

Рис.9. Свободное распределение в популяции трансгенного картофеля сорта Темп, оказывавшего угнетающее воздействие на популяцию вредителя. Максимальный вес личинок третьего возраста в контроле составлял 116.8 мг.

около отметки 35 мг, тогда как вес личинок в контроле составлял 113 мг. Эти же авторы. показали достаточно строгую зависимость мевду уровнем синтеза 5-эвдотоксина и инсектишщностью трансгенных растений картофеля. Так как определяемый уровень синтеза инсектицидного белка в нашем случае составлял 0.005-0.02% от суммарно экстрагируемого белка, а в работе Аданга и соавт. -0.0252, разница в результатах угнетающего воздействия популяции трансгенного картофеля на популяцию вредителя, вероятио, объясняется тем, что Адангом и соавт. была использована лабораторно

ю л «9 50 «о 70 кс за юо

вес личинок

лоддерашваемая популяция личинок колорадского жука, тогда как мы использовали личинки из кладок, собранных на полях.

. На диаграмме (рис.ю) представлены результаты определения смертности личинок. Как видьс из диаграммы, выживаемость личинок, питающихся трансгенными растениями, стабильно ниже контрольных. Для растений сорта Теш (рисЛОа) на шестые сутки число погибших личиеок составило: ТЗ — две, Т4 — три, Т5 — более шести, Т10 более трех, Т18 — не отличалось от контроля — одна. На 21 сутки питания листьями трансгеншх растений сорта Темп на чашках оставалось: четыре для ТЗ, менее двух для Т4, одна 'для Т5, две для TIO и две для Т18. В чашке с листьями ^трансформированного растения в среднем выживало" более четырех личинок. Однако, необходимо отметить, что наблюдалась значительная вариабельность степени угаетения жизнедеятельности личинок колорадского жука при рассмотрении каждого отдельного растения. Так, смертность лгчинок на растении ТЗ была выше смертности личинок в контроле незначительно " (рисЛОа): на шестые сутки семь из деспот дичинок выживало, на 21-е — 4, на период появления первых куколок — 2, тогда как в коятроле эти цифры составляли 8, 4, 2, соответственно. Хотя, как показано на рис.8, листовая пластинка растения ТЗ личинками первого возраста повреждалась незначительно.

Для растений сортов Eesiree, Resy (рйС.Юб.В) и Гранат (данные не представлены) наблюдалась та же тенденция, что и для растений сорта Теш: более высокая смертность личинок всех возрастов в обобщенной популяции трансгенного картофеля по сравнений с контрольными растениями. Так, для растений D2, вз, ' D4, D5, D6 и D9 число погибших личиеок на шестые сутки питания трансгенными растениями составило две, несть, две, четыре, три к

А

Б

(мл алц«

□мм С3ы4 еяш

Рис.10. Смертность личинок в условиях питания листьями растений трансгенного картофеля сортов. Темп (А), г>е®1гее

ч СБ). Незу (В!

три, соответственно, тогда как в контроле выживали девять личинок из десяти. Смертность личинок при питании растениями тех же номеров через 21 сутки составила 5, 9, 7, 6, 7, 5 из 10 изначально помещенных на чаши личинок. В контрольных опытах погибало от 4 до 5 личинок. И, наконец, к моменту появления первых куколок (на диаграмме 10 данные не приведены) на чашках с

листьями нетразсформированннх растений выживало от четырех до пяти личинок, а для трансгенных растений выживаемость была ниве: дня D2 — три, для ОД- одна, для D4 - в среднем менее ►даой, для D5 - три, для DS - две, для D9 - три.

Приведенные данные свидетельствуют об угнетениии популяции вредителя, развивавдейся в условиях питания растениями трансгенной популяции картофеля.

Таким образом, получены трансгенные растения картофеля сортов Темп, Desiree, Resy, Гранат, экспрзссирунние частично моди-фшшрованннй ген £■-ЭНДТСКОИаа . ИЗ Bacillus thur Indiensis var. tsnebrionis, и обладающие различной степенью .угнетающего воздействия на лабораторную шпуляцшо вредителя. Дальнейшее изучение экспрессии этого гена позволит определить степень устойчивости трансгенных растений в условиях воздействия природной популяции колорадского лука, а также использовать полученные растения в селекционной работе.

ВЫВОДЫ

1. Получен частично модифицированный геп 5-эндотоксина: с учетом универсальной таблицы кодонов было проведено изменение первых 23 "и последних 9 кодонов последовательности cry-niA гена на оптимизированные для растений.

2. Создан вектор, содержащий кассету экспрессии в растениях частично модифицированного гена Б-эндтотоксиза под контролем 353-промотора и Nos-тершнатора. Полученные конструкции клонированы в бинарный вектор puon5os и перенесены в агробактериальные штаммы LBA4404, А281, CBE2i.

3. С использованием агробактерий (п.З) получены трансгекные растения картофеля сортов Desiree, йэзу, Темп, Гранат. Показано,

что для модельного сорта Désirее наибольшая эффективность трансформации получается при использовании штамма СБЕ21.

4. Показано, что полученные трансгенные растения экспрессируют' 5-эадотоксин в количестве 0.02% от суммарного экстрагируемого белка и обладают относительной устойчивостью к поеданию личинками колорадского жука.

5. Получены клубни трансгенного картофеля, которые могут быть использованы для дальнейших полевых испытаний и селекции.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1.Гулина И.В., Шульга O.A., Краев A.C., Скрябин К.Г. - "Получение трансгенных растений картофеля, несущих модифицированный ген

5-ЭНДТОКСИНа ИЗ Bacillus thuringiensis var tenebrionls" - -

(

Тез.докл. ix Российского симпозиума "Новые "методы биотехнологии растений", Пущино, 1993, с.14

2. Гулина И.В., Шульга O.A., Скрябин К.Г. - "Создание растений картофеля с геном бациллярного токсина" - Тез.докл.конференции "Перспективы развития научных исследований по картофелеводству", Минск, 1993, С.90

3. Гулина И.В., Шульга O.A., Скрябин К.Г. - "Трансгенные растения картофеля, несуще ген инсектицидного белка - исходные формы для получения устойчивых к колорадскому жуку" - Тез.докл.конференции "Биология культивируемых клеток растений и биотехнология", Алма-Ата, 1993, с.96

4. Яковлева Г.А., Гулина И.В., Дубинич В.Л., Семанюк Т.Б., Шульга O.A. - "Генетическая ишенерия картофеля" - Тез.докл.конференции "Биология культивируемых клеток растений и биотехнология", Алма-Ата, 1993, с.135. • "

-225. Гулина И.В., Шульга О.А., Миронов В.Н., Ревенкова Е.В., Краез А.С., Позмогова Г.Е., Яковлева Г.А., Скрябин. К.Г. "Экспрессия частично модифицированного гена 6-эндотоксша из Вас ш из thuringiensis vaг tenebrionls в ТраНСГЙННЫХ раСТвНИЯХ КартОфеЛЯ". Молекулярная биология, 1994 (в печати)

6-Skryabin К.G., Bagyan I.L., Gulina Ï.V., Kraev A.S., Padegimas L., Pooggin M.M., Pozmogova G.E., Eevenkova E.V. ,Schonni!:ova A.V., Shulga O.A., Sokolova M.A. - Production of transgenic plants resistant to viruses, insects arid herbicides: optimisation of heterologous gene expression - 10th Anniversary -Otto Warburg Symposiua, "Molecular Biology and Plant Breeding: Theoretical, Practical and Legal Aspects", March 21-22, 1994, conference .paper.

7. Гулина И.В., Шульга O.A., Миронов В.Н., Ревенкова Е.В., Краев А.С., Позмогова Г.Е., Яковлева Г.А., Скрябин К.Г. "Экспрессия частично модифицированного гена s-гндтокоша в траясгеннкх растениях картофеля" - Тез. докл.конференции "Генетическая инженерия и биотехнология", Минск, 1994, с.19

8. Яковлева Г.А., Гулина И.В., Дубинич B.JÎ., Подобед Н.И., Семанюк Т.В. "Получение новых форм картофеля с помощью биотехнологии". - Тез.докл.конференции "Генетическая инженерия и биотехнология", Минск, 1994 с.74.

9. Яковлева Г.А., Гулина И.Б., Дубинич B.JI., Подобед Н.И., Семанюк Т.В., Бусько И.И. - "Возможные пути повышения устойчивости картофеля к патогенам и вредителям с помощью биотехнологии" Тез докл.конференции "Стратегии и новые методы в селекции и семеноводстве сельскохозяйственных культур" Жодино, 1994, с.153.

Подписано к печати 0 " ^ У 1S94 г.

Отпечатано на ротапринте в Формат бумаги 30x42/4

Производственном комбинате Обьем^^п.л.

Литературного фонда России Ззку^ Тир. 100