Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и анализ трансгенных растений, вырабатывающих инсектицидные белки

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Получение и анализ трансгенных растений, вырабатывающих инсектицидные белки"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ВШИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ

на правах рукописи

УЗБШСОВА Светлана Викторовне

ПОЛУЧЕНИЕ И АНАЛИЗ ТРАНСГЕНИЫХ,РАСТЕНИЙ, ВЫРАБАТЫВАЮЩИХ ИНСЕКТИЦИДНЫЕ БЕЖИ

(Специальность 03.00.03 - молекулярная биология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 193 4

Работа выполнено ь лаборатории генетической шяданер:п1 растений ВШИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН

Научный руководители: доктор биологических наук,

профессор Шемякин М.Ф.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Бурьянов Я.И. доктор биологических-наук, Завриев С.К.

Ведущая организация - Институт молекулярной генетики

РАН

Защита диссертации состоитой " "_ 1994 г.

п __ чао. на заседании специализированного оовета Д.020.40.01

при ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН по адресу: г.Москва, ул. Тимирязевская д.42.

Автореферат разослан " "_ 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат'биологический наук

. Меликова С.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблем«. Создание трансгенных растений, гстойчивых к фитопатогенам, является в последние года основной хЗластью приложения сил генной инженерии культурных растений. )сновным направлением в этой области в настоящий момент является ®0деше в них производных чужеродных гвное, которые обеспечивают ;интез защитных белков в тканях растений и тем самым предохраняют ix от губительного воздействия патогенных факторов. Очень юрспективными для использования в целях защиты растений от юразитических . насекомых признаны гены параспоральных сристаллических белков почвенной бактерии ВасШиз thurlngtenata (О-эндотоксиков), обладающих высокоспецифичными инсектицидными свойствами и являющихся безвредными для теплокровных нивотных.

Создание трансгенных растений, экспрессирующих бациллярные 'вны ó-эндотоксинов, выявило практические трудности в детекции шсектотоксинов, синтезирующихся в трансгенных тканях в ^значительных количествах. Невысокий уровень экспрессии генов 5-эндотоксинов обусловлен их нехарактерным для растительных генов годонным составом и другими • особенностями нуклеотидной юслэдовательностп, что приводит к низкой эффективности процессов гранскрипции и трансляции. Тем не менее, в некоторых случаях экспрессия токсиновых генов под контролем сильных растительных-эегуляторных элементов обеспечивает достаточное количество белка цля придания траисгенным растениям устойчивости к поеданию дичинками чувствительных к данному токсину вредных насекомых. Настоящая работа посвящена созданию производных гена О-эндотоксина Bacillus ttvurtnglenata типа kuratakt HD-1 (токсичен для ?ешуекрылых), способных эффективно экспрессироваться в растениях, а гакжэ обеспечивающих маркерную активность токсичного продукта, что позволяет проводить отбор растений с наибольшим количеством ансектотоксина. .

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было, конструирование рекомбинвнтных кодирующих последовательностей на основе гена О-эндотоксина Bacillus xhuaringienala crylA(a) и маркерного гена nptll, обуславл ващего устойчивость ' к вминогликозидиым антибиотикам, а такке анализ экспрессии полученных гибридных генов в трансгенных растениях табака. Исходя из этого, выли определены следующие задачи:

1. Конструирование рекомбинантних генов, снабжэншг растительными регуляторными элементами, и кодирующих: а) токсичны! домен б-ендотоксина CRYIA(a); б) бифункциональный бело: "TOKcnH-NPriI".

2. Анализ функциональных активностей продуктов втих генов з E.coll.

3. Анализ экспрессии гена бифункционального белка "токсин-НЕТ в трансгенных растениях табака.

4. Отбор растений с наибольшим уровнем синтев! бифункционального белка и проверка их инсектицидной активности.

Научная новизна и практическая ценность работы. В ходе настоящей работы получены грансгенные растения табака, конститутивно синтезирующие гибридный двудшэнннй белоз "токсин-NPT", проявляющий инсектицидные свойства З-андотокспш Bacillua thurlngtenala kuratpkl HD-1 и обеспечивающий способном] трансформантов расти в присутствии селективной концентрацш канамицина. Векторные конструкции с рекомбинантными генами тиш "инсектотоксин-nptll" могут быть использованы для созданш трансгенных растений различных сельскохозяйственных культур. Лепк тестируемая маркерная активность гибридного бифункционального белю позволяет отбирать трансгенные растения, эффективно вкспрессирулцш целевой ген, уже на стадии первичной регенерации. Возможное^ прямой канамициновой селекции на наличие токсичного белка позволяет контролировать сохранение внедренного гена в потомстве.

Апробация работы. Представленные в диссертации материалы бит доложены й обсуадены на 1-ом Всесоюзном и 11-ом Российски Симпозиумах "Ноше метода биотехнологии растений" (Пущино, 1991; 1993), а также на российско-германском совещании "Ыолекулярнаг биология и генетика растений" (Москва, 1993).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Структура я объем работы. Диссертация состоит из введения, оозора литературы, описания материалов и методов исследования, чэтырех глав с описанием результатов и их обсуждения, выводов I списка цитируемой литературы из 218 наименований. Работа изяогеш нь 136 страницах машинописного текста и проиллюстрирована И {исунками и 3 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовались следующие птамш E.coli: TG-1, СА161 йаЗЗ (dam~); и штамм Agrobacteriim twmfociena С58С1 (pGV3850) IZamtayskl et al, 19831, в дальнейшем обозначаемый LGV3850.

Молекулярное субклоннрование в E.eolt проводили по стандарта™ мтодикач (Маниатао а др. ,19841. Компьютерный анализ нуклеотидных и шпкокислотеых последовательностей проводили с использованием 1рограш GEKBPR0 и OLIGO. Трансформацию агробвктерий проводили на эспове метода An Q. 119883. Выделение высокомолекулярной плазмидной ЩК из агробактерий проводили на основе метода щелочного лизиса [Blrnboim et а!,1ЭТ93. Наличие и ¡функциональную активность эекомсинантшх белков в E.coli исследовали с помощью лслуноОдоттинга, инкубируя реплику о 8ф£инн0 очпценннмя галтслональнши антителами кролика, специфичными к О-эндотоксину В.t.тиса lasrataki.

Лгробактериальнув тртсфршщю растений та Ста fficottcma tdbacrn SRI провели на основе метода ластовых дисков tHorsch et el, 19851. Отбор трансформантов к' дальнейшее их подцеркание проводили на среде MS с добавлением 50-100 шсглдл каншшвшсульфата. Наличке пнтегрированннх в растительный геном рэхомбинантннх генов проверяли катодом блот-гпбридкзации ДНК по,' Сауаерну и методом полшеряаной цепной реакция [Salkl,19901. Выделение тотальной растительной ДНК проводила на основе методик, ошсананх в руководстве Дройпера и Скотта [19913. Тестирование болковнх экстрактов из бактерий и растений на активность NPTII осуществляла in situ в ПААГ после элоктрофэреза в неденатурлрувдих условиях в соответствия с методиками, изложэнннш в CRelaa et al, 1984-; Скотт а др.,19911.'

йнсектицвднув активность рекомбинвнтныг белнов в экстрактах E.coli тестировала на лнгшшшх второго возраста непарного шэлкопрдяа (Lymntria dispar). Анализ растений табака на токсичность по отношения: к личинкам чешуекрылых проводил с использованием гусениц непарного шелкопряда, лугового мотылька {Loxastega stlcttoalla) и хлопковой совки (Hellothta armígera).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. МОДИФИКАЦИЯ ГЕНА С-ЭВДОТОКСИНА США(а) ВасШш гЬхсг1п%1епа1а ТИПА кигвгак1 НП-1.

1.1. Конструирование укороченного гена С-эндотоксина под контролем растительных регуляторных элементов.

В качестве донора гена б-эндотоксина В.г.ЬигзгаМ НВ-1, сгу1А(а), нами была использована плазмида рОС2 (любезнс предоставлена Г.Г.Честухиной, ВНИИ генетики и сэлекции промышленных микроорганизмов), содержащая участок мегаплазмиды Вас Шив хЬиг1щ1епз1з. ШгвгаЫ Н1)-1 размером около 10 т.п.н. с полной последовательностью этого гена. Модификацию гена проводили исходя из того факта, что собственно токсичной является только ^концевая часть инсектотоксина ВЛ. типа ЪигаХаМ, содержащая около 600 из 1176 аминокислот полноразмврного белка СБсйперГ, ?Ш11е1еу,1985]. Делеции до 25-ой АК О-вндотоксина также не влияют на его токсичные свойства. В результате серил • субклонирований фрагмент КП гена сгу1А(а), с 10-го по 725-й АК-остаток, и десять триплетов из 5'-концевой области гена VI ЮЩК перед ним были перенесены в вектор рНТ103 [ТорГег е1; а1,19871, содержащий регуляторные элементы генов Еируса мозаики цветной капусты (ВМЦЮ и участок инициации трансляции состава ССАССАТОС (т,н. "контекст Козак"), [Когак,1983]. Таким образом, КП укороченного инсектотоксина (в дальнейшем просто токсина) оказалась под контролем 355 промотора ВМЦК и поли (А) -сигнала гена VI ВМЦК. За 725-ым триплетом КП сгу1А(а) путем достройки сайта ВатН1 был образован терминирующий кодон (рис.1). Сконструированный таким образом ген, кодирующий указанный полипептид, мы обозначили как и, и, соответственно, продукт этого гена - белок ТТ.

Для удобства дальнейшего клонирования в вектора для трансформации растений последовательность гена и была перенесена в плазмиду рШМП (рис.2). .

'et1 Noo1 10

JbsootI ИатТВАКШЛ^^^ЩСЯГГ^Га;!

725B

Pet1

-gcaggatgg'gc-

Kpn1

_4X

r g s il4*

pRT103tt

Noo1

s i

ccggggatcgatcctctaga-Sma1-

BamH1

iXbal

teo.Z. Схема рвкомбинэлтной кодирующей последовательности гена tt - ЗбЗ-промотор ВМЦК; ===== - терминатор гена 71 ВМЦК; слева зкобкой выделена последовательность "контекст Козак"

¡00 Вап Sal Pet

pUC4K

4,1 тпн

i-Patl-фрагмент pRT103tt гидролиз PetI 2,8 тпн

353 токсин '647

ter

N00

HBamH1-Sma13-фрагмент рйл21, '; содержащий ген nptri

Bol Sma

*Pst

pUC4tt

б,Б тпн

гидролиз Boll , Snuvt

токсин

•647 nptI1 ter аяада j — pUC4tn

» 6,5 тпн

Sma

Pam/Bol

-gatccgagcttggat-

647

P S L

NPTII О третьего КРДОН8

Ргс.2. Схема конструирования рекомбинантшх плазмид pUC4tt и püC4tn. Условные обозначения: gsgggj; - КП гена р-галвктозидазы, ВВЖ1 - КП инсектотоксина, ЕИва - NPTII, | - полилинкаринй участок.

1.2. Конструирование гибридного гена итоксин-прШ".

Из литературных данных известно, что в пищеварительном тракт насекомых протеолиз ö-эндотоксинов класса сгуХА с образование: токсичных фрагментов происходит в районе 607-609 аминокислотнн остатков. Поэтому продление открытой рамки считывания (ОРС инсектотоксина ниже 609-го триплета кодирующей последовательность) NPTII должно приводить к образованию нормально процессируемог< "протоксинового" белка, обладающего такие NPT-активностью.

Донором КП канамицинфосфотрансферазы (ген nptll транспозон! Тп5) служила плазмида рйп21 SBecK, et al,19823. Встройка фрагмент! этой плазмида, несущего ген nptll, в КП усеченного токсина i плазмвде pUC4tt проводилась по сайтам Bell (647 триплет КП токсина! и. Smal (за пределами КП) (рис.2). В сконструированной такта образом плазмиде, названной pUC4tn, КП токсичного домена и НИ оказались слиты, образовав новую КП белка "токсин-NPT" (ген tn, белок TN).

Согласно компьютерному анализу нуклеотиднш

последовательностей рекомбинангяых генов tt и tn и аминокислотного состава их продуктов, максимальная длина кодируемого геном tt полипептида - 735 аминокислотных остатков, его расчетная молекулярная масса - 82456 Да. Для продукта гена tn эти значения соответственно составляют 916 AK-остатков и I0I959 Да.

2. ИЗУЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ РЕКОМБИНАНТШХ ГЕНОВ В Е.СОЫ

Экспрессию рекомбинантных генов tt . и tn анализировали в специально созданных штаммах E.coll, эффективно синтезирующих указанные белки в условиях индукции. Плазмида pUCMtt и pUC4tn были дополнены фрагментом (450 пн) экспрессионного вектора рКК233-2, несущим бактериальный промотор Ptrc и SD-последовательность, который был .встроен между 35Б-промотором и ATG-Кодоном кодирующих последовательностей предполагаемых токсичных белков TT и TN. Штамма с такими плазмидами получили названия pTrctt и pTrctn.

Для того, чтобы убедиться, что в сконструированных йаш штаммах E.coli действительно синтезируются токешпвые белея, ш проанализировали суммарные белки в бактериальных экстрактах с податью иммуноблоттинга. Нами выяснено, что продукт усеченного гона

гу1А(а) практически нерастворим в условиях нейтрального рН. :артина, представленная на ряс.Э, была получена при анализе елковых экстрактов, приготовленных о использованием щелочного «страгирулцего буфера Как видно,' в штаммах pTrctt и pTrctn интезируатся шмунорзактивннв полшэтггада с молекулярными массами 1Коло 80 и 100 кДа соответственно, что соответствует рассчитанным ааченияы • дня белков ïî a ÎK. Наблюдаемые псшшептиды меньших юзнэров, вероятно, представляют собой продукты протеолитического юсщешгения токсичных белков в метках E.coli.

A G В Г

Рно.З. йагунобж>ттивг белков штаммов E.coli рЫЧ (а), рКК233-2 0), pTrctt {6)t pïrctn (е).

Анализ NPT-активности продуктов гибридного гена tn показал, что полноразмерный гибридный белок, определенный наш как ТВ, обладает фосфотрансферазной активностью и имеет существен® меньшую электрофоретическую подвижность, чем 28кДа белок NPTII, продукт гена nptll из Тп5 (рас.4). В экстракте исследуемого штаммг pTrctn доминирует белок, мигрирующий на уровне интактно? канамицинфосфотрансферазы, что свидетельствует о распад? полноразмерного "слитого" белка, вероятно, вблизи места слиянш доменов. Видимо, он представляет собой С-концевой НРТ-активнШ домен белка ТЫ, отщепившийся от токсиновой N-концевой части. Эк свидетельствует о нестабильности гибридного белка тиш "инсектотоксин-МРТ" в.клетках E.coll.

-NPTII

А Б В

Рис.4. Анализ канамицинфосфотрансферазной активности Oezrcoi итаммов E.coli tn attu в геле: А - pT5-19Sneo (полояительк-л контроль), Б - рКХ233-2, В - pTrctn. Количество белка в и (В! ^сличено в ТО раз по сравнению с (А).

Для анализа инсектицидной активности белковых продуктов рекомбияантных генов tt и tn в качестве тест-обьекта были кяюльзованы гусеницы второго возраста непарного шелкопряда ifymcmtrta diapar). Эти представители чешуекрылых сравнительно данее чувствительны к б-эндотоксину типа uuratakt, чем, например,-¡fanduca sexta (табачный бракник), являющийся стандартным гест-обьектом для этого типа токсинов, но не введенный в культуру в вашей стране. Энтомологическая часть биотестирования была проведена А.Барановым (МП "Биотест").

Разведенные лизаты бактериальных культур исследуемых штаммов добавляли в чашки с питательной средой и подсаживали по 10 гусениц. Подсчет погибших гусениц проводили на 3-й сутки. В качестве положительного контроля использовали клетки E.coll, трансформированные плазмидой рЬТ4, несущей полный ген О-эндотоксина типа kuratakl под контролем собственного промотора. Количества инсектицидных белков в бактериальных лизатах нормировали иммунохимически. В качестве отрицательного контроля был взят штамм E.colt рКК233-2, несущий ген прШ. Результаты биотестов представлены в таблице I;

Таблица I

Количество погибших гусениц fymantrta diapar из десяти,

посаженных на чашку

лизаты Разведение I 4 Разведение I :16

Клоны E.colt к О В т о р н о с т и

.1 и III I II III

рКК233-2 2 i 2 2 1 4

pLT4 . 9 - 8 2 3 2 6 .

ptrctt 9 6 7 6 2 4

ptrctn а 10 7 7 7 5

Как видно из результатов биотеста, инсектицидная активность рекомбинантных белков - усеченного инсектотоксина ТТ и "слитого". белка ТИ - соизмерима с биологической активностью интактного природного белка СННА(а). Следовательно, имеющее место протеолитическое расщепление токсиновнх белков в клетке не влияет значительным образом на их токсичные свойства.

Ваш Sph

ori TO jpnos nptll | Тпов TL

—•-jr j-'-^-j--pCV941 '

Ap j^r Sp/Str? lima

A. pGV94ï / BamHl.фосфатаза + BamHl-фрагмент pUC4tt (2.8 тш)

Ваш ^

■ - Bern Sph

TR Leo токсин_ [Pnos_rxptll 1 ТПОВ TL •:

—• • ■ ■ ■ - —

1 ,"5тйн ' " * _

pSVSSItt

В. pGV941 / BamHl, Sph1 + [BamHl -БрЫ ]~4рагкэнт püC4tn (3.1 тш)

I

Ват

TR j 35S Т ° К ° И я ~ П Р * 11 Гтпов TL .

Xho Noo pcmitn

+fXhoI-KcoI]- гидролиз фрагмент из Xhol, Nool pTZ18ux (89ПН)

5301 OnV

ТВ I ? TL

Ur4 .___I Tnoa

-навмшждмши——i—

Xho N00 * о к о и и - n p t II pGV941utn

Рсс.б. Схеиа клонирования рекокОштавтвнх генов токсичпнх белков в бинарном вектора pGV941. Условные обозначения: ÏR, ÏL -области правой и левой границ Т-ДНК; ori - точка начала решшк^щш PVS1, Тпов - тершнаторная область гена поз; стрелкага обозначены каста отаига праймеров для ПЦР.

3. КОНСТРУИРОВАНИЕ БИНАРНЫХ ВЕКТОРОВ С ПРОИЗВОДНЫМИ ГЕНА ЛИТА (а)

Среди имеющихся в нашем распоряжении агробактериальных зекторов, предназначенных для трансформации растений, нами был аыбран вектор pGV941, относящийся к бинарному типу [Deblaere,1987]. Зхема клошфовэкия рёкомбинантных генов из плаэмид pUC4tt и pUC4tn з векторе pGV941 приведена на рис.5. В результате мы получили векторные плазмидо: pGV94ttt, несущую независимые сцепленные гены tt и nptll, и pGV941tn, не им&щую в своем составе независимого гена устойчивости к канамицину, но несущую ген бифункционального Зелка TN.

Ми также провели модификацию рэкомбинаягного гена tn в составе бинарного вектора pGV941tn с целью увеличения экспрессии этого гена в растительной клетке. Как известно, некоторые 5'-нетранслируемые лидерные последовательности генов растительных вирусов могут выполнять роль энхансеров и увеличивать уровень экспрессии-чужеродных генов в растениях iGallle et ai,198T;1990). В наше распоряжение С.Ю.Морозовым была любезно предоставлена плазмида pTZieu, несущая в своем составе 5*~нетранслируемую лидерную последовательность ВТМ, т.н. и. Мы субклонировали 89-членную лидерную последовательность и в pGV941tn по Xho1 и Nco1 сайтам-кэзкду ЗбЗ-промотором и ATG-кодоном КП "токсин-KPT". Полученная векторная конструкция бала названа pGV941wtn (рис.5).

Uu перенесли векторные конструкции с. ракомбинантными гопа?,ш в штаммы Agrobaoterim tumefaciena методом прямой трансформации бактериальных культур. Для доказательства трансформации был проведен сравнительный рестрикционный анализ оазмвдной ДНК, выделенной из полученных клонов A.t., которые получили названия IßV3850«, LGV3850tn, LGV3850utn, и из соответствующих штаммов E.coll.

4. ИЗУЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ПРОИЗВОДНЫХ ГЕНА О-ЭВДОТОКСИШ. СНГСА(а В ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЯХ

Как и ожидалось, уровень канамицин-устойчивости, проявляющий в скорости роста первичных регенерантов на селективной среде < канамицином после трансформации листовых дисков табака полученным! штаммами АЛ., оказался значительно ниже у растений трансформированных геном "токсин-nptll", чем у трансфомированнн: вектором с независимыми генами токсина и nptll. Из литературные данных известно, что уровень экспрессии генов б-эндотоксинов cryL в трансгенных растениях на порядок ниже, чем у маркерного ген! nptll, что вызвано, вероятно, нестабильностью токсиновой мРНК вследствие неэффективности посттрансжрипционных событий. Независим экспрессирующийся под контролем поэ-промотора ген nptll в клетка: растений, трансформированных LGV3850tt, обеспечивает больше( количество канамицинфосфотрансферазного продукта, чем "слитый" reí tn в растительных клетках, трансформированных bGV3850tn i LGV3850utn.

В результате трансформации нами было получено около 50-tí растений табака, предположительно несущих усеченный ген crylA(a), (растения типа tt), 35 растений с рекомбинантным геном tn (растенш типа tn), и 18 - с геном utn (растения типа wtn). Все они имел! нормальный фенотип и укоренялись в присутствии 100 mt/mj канамицина. Часть растений было высажено в землю, и в условию гарантированного самоопыления (с помощью изоляторов) от них Оиж получены семена. Дальнейший анализ проводился как на поддеркивамыз вегетативно in vitro линиях исходно полученных растений (F1), так i на их потомках, выращенных из семян (Fg).

4.1. Анализ растений-трансформантов типа tt

Для доказательства того, что полученные растения-трансформанть действительно являются трансгенными, мы провели тестирование их не активность NPTII, не без основания полагая, что. в большинстве случаев оба гена из векторной плазмида pGV941tt (nptll и tt) перенеслись совместно. МРТ-активность In situ в ПААГ был£ продемонстрирована в экстрактах большинства тестируемых растенкР фис.6). Как видно из представленного радиоавтографа, ген npill пол

контролен coccrвенного промотора в ¿.colt и 35S-irpo;*oгора в растениях экслроссирует сходный по размеру фермент.

В

Рас.6. Анализ канамищшфэсфогрансфзразной активности Овшотх экстрактов трансгенных растений табака типа tt (п attu в геле. I -NP7II в S.coIi (pT5-19Sneo); 2,3,5,6 - трансгенные растения: Л ~ не трансформированное контрольное растение.

Прямое доказательство присутствия гена гг в трансгенных растениях табака мы получили при проведении блот-гибридизвцан тотальной ДНК нескольких МРТ-голожительных растений с фрагментом 8того гена б качестве пробы. Впоследствии ш проанализировали ДНК канамицин-устойчивых растений из числа потомков исходных, трансформантов методом полимеразной цепной реакции <ПЦР). фрагмент ожидаемого размере (1,6 тпн) мы наблюдали не" во всех растениях (рас.7, А). Это мовот свидетельствовать о том, что в условиях отсутствия прямой селекции на наличие токсинового гена возмоаш рекомбинационные события, приводящие я изменению или делевдга гена П как в процессе трансформации, так и при наследовании гена в следующем поколении.

В ИМВД АН Беларуси была проведена трансформация созданным нами штаммоа А.г. ЬСТ3850гг растений картофеля сорта "Львовлнка". После проверки их на КРТ-вктиеность, ДНК растений такке исследовали. Методом гибридизации было показано, что рекшбиншшшй ген гг интегрировался в геном трансформантов.

4.2. Анализ растений типа гп и (Лп

При создании гена бифункционального белка "токсин-КРТП" ш предполагали, что в случае встраивания таких конструкшй в функциональный район растительного генома, будет возмогло прямо селектировать трансформаши, сшггезирущза шсектотоксия. Мы провали анализ ДНК канамицин-устойчивых пота,асов трансформированных растений методом ПЦР. Амплифицированный фрагмент присутствовал в ДНК всех проанализирована«, растений и его размер соответствовал расчиташому (рао,7. б). Таким образом, все канашщш-устойчише растения имеют в своем геноме Ентактньй вкспрассирухдийся ген гп. Возмокность с помощью прямой кзаашцкновоа селекции отбирать проростки с фунвдионируидаш; генаш токсичного белка является преимуществом данной конструкции "слитого" гена и позволяет контролировать сохранение этих генов в потомства.

Наличие 61 -нетранслируемой лидерной последовательности и в КП бифункционального белка, по вашш данным, не оказывает значительного влияния на уровень экспрессии гена мгп в трансгекныг растениях в сравнении с геном гп.

1.БТ.О Н. -

Л к I 2 з Ч 5" б 7 Д

ТЕЗ ГН

Сг

С.;

с:

¿V; > ¿г, =: л-:,, 5,': .;

Л К < 2 3 4 5" б 7 3 9 го гиг

Рис.7. Продукты ПЦР с ДНК трансгегомх растений таоака типа « (А) и т£1па гп (В). К - контрольные нетрансфор?.ярованше растения; д. - ДКК фага Д., рэстряшфованная РвИ. Цифрами обозначены трансгешт растения пшэ гг и, 1-7); и гп [Б, 1-13).

Чтобы подтвердить наличие функционального гибридного белка в полученных растениях, наш было проведено тестирование их белковых экстрактов на активность канамицинфосфотрансферазы. Принимая во внимание известные данные о низкой эффективности посттранскрипцчонных событий при экспрессии гетерологичных генов бациллярных С-эндотоксинов, можно предположить наличие в таких растениях очень незначительного количества гибридного белка, активности которого, тем не менее, хватает для нормального роста .растения в присутствии селективной концентрации Кт. В экстрактах наиболее канамицин-устойчивых трансформантов и их потомков оказалось возможным визуально обнаруживать сигналы НРТ-актившх полипептидов. Как видно из представленного радиоавтографа (ряс.8), КРТ-активныб голипептидц в трансгешшх растениях типа гп и оЛп по электрофоре тической подвижности совпадают с интактным белком МРТИ, синтезирующемся в растении типа гг. Интенсивность сигнала в анализируемых растениях с геном бифункционального белка во много раз ниже, а на уровне полноразмерного продукта мигрируют маскирующие искомый сигнал растительные протеинкиназы. Даже при их удалении полноразмерный продукт .при имеющемся уровне чувствительности зафиксировать трудно. Это может быть связано, наряду с низким уровнем экспрессии соответствующих генов,' также и о неполной его экстракцией в условиях функциональной активности ЮТ, а также с протволитическим расщеплением ОТ в растительных клетках. Исходя из известных фактов о протеолитической стабильности токсичного домена С-эндотоксинов (НоЯ;е, WM.teI.ey, 1989], и полученных наш данных об инсектицидной активности слитого бедка ТН, можно предположить, что подобный гидролиз не влияет на токсичные свойства продуктов рекомбинантных генов и . шгп в трансгенных растениях. Возможность появления низкомолекулярных ЮТ-активных продуктов соответствующих размеров за счет внутренней инициации трансляции с других имевдяхся АТС-кодонов в рассматриваемой ОРС маловероятна.

Таким образом, обнаружение в экстрактах трансгенных растений, несущих гены бифункциональных белков 1п и иЛп, ЮТ-активных полипептидов позволяет полагать наличие в данных растениях и инсектицидных продуктов. В условиях одинаковой экстракции обнаруживаются специфические сигналы разной активности, которая, вероятно, коррелирует с накоплением в данном растении большего количества и токсичных продуктов.

^ bmj :

ш

sfe^l. -..ii

РАСТИТЕЛТз-

НЫЕ ПРОТЕИН-КИНАЗЬЗ

NPT-

А В

О Ж

Рис.8. Анализ НРГ-активности экстрактов трансгенных растешгй тесака типа tn и wtn In situ в геле. А - растение таоака с геном nptll; Б,В,Г - растения типа tn; Д - штамм E.coll pTrctii; Б -¡«трансформированное контрольное рвстшше; Ж - растение тина wtn.

4.3. Анализ инсектицидных свойств полученных трансгенных растений

Биотестирование полученных нами трансгенных растений проводилось во ВНИИ химических средств защиты растений (Москва) на личинках непарного шелкопряда Lymanzria dispar и в института:-, генетики АН Молдовы (г. Кишинев) с использованием относительно капо чувствительных к эндотоксину ORYIA(a) представителей чешуекрылых. -лугового мотылька Laxoatege stlcticalls и хлопковой совки Heliothtsr armígera. Для анализа ш отбирали те растения типов tn и uto, в экстрактах которых воспроизводимо найлздались НРТ-актившо полипептида, а из трансформантов типа tt были взяты три линии о наибольшей копийностью интегрированных генов.

среди проанализированных растений некоторые проявляли явао выраженные инсектицидные свойства. Они выражались в лшаь частичном повреждении гусеницами листовых пластинок и достаточно высокой ; гибели личинок на з-4-е сутки го сравнению с контролем. По отношению к Iymantrla diapar токсичными оказались 5 лишай из 12-ти, среда них 4 экспрессировали гены бифункционального белка TN." Токсичные свойства по отношению к луговому мотыльку проявили растения трех линий из пята исследованных, по одной из каздого типа. Уровень токсичности растений разных типов бил сходен, что свидетельствует о наличии активных токсиновых фрагментов в трансгенных растениях со веема видаш рекомбинантных генов на основе сху1А(а)-гена б-эндотоксина Baclllua tfturlngtenaiа.

При биотестировании потомков трансгенных растений баз предварительной селекции сэмян на устойчивость- к кавамицину, среди них, как и «кидалось, выявились формы с различной степенью устойчивости к поеданию личинками бабочек. Это обусловлено генетическим расщеплением потомства по данному признаку. На рис.3 показаны два растения-потомка от трансформанта типа wtn (W9) на третьи сутки после подсадки к ним по пяти гусениц лугового мотылька. На фотографии представлены крайние по степени повреждения варианты, сыпани поедания остальных исследованных растений этой ' линии - промежуточного характера. Вероятно, что практически неповрежденное растение является гомози:->тнш по доминантеоиу признаку наличия инсекготоксина, а поврежденное аналогично не трансформированным контрольным растениям,- возшано, на содержит соответствующего гена. Конкретно для поколения Р2 трансгенного

растения 579, по признаку канак.^ги-устсйчлшости показало расщепление в соотношении 15:1. Такое расщепление свидетельствует о наличии двух экспрессирукщихся несцепленных генов гп, обуславливающих доминантный признак устойчивости к канамицину, и, следовательно, признак токсичности для чешуекрылых. В таком случае, 1/16 часть потомков являются гомозиготными по доминантным аллелям обоих интегрированных генов, что приводит к повышенному уровню канамицин-устойчивости и токсичности таких растений. Промежуточш. по степени повревдения гусеницами формы растений несут в со Со различные комбинации аллелей встроенных токсиновых генов.

Рис.9. Расщепление по признаку токсичности для чешуекрылых в потомстве трансгенного растения с геном бифункционального белка "токсин-НРТИ". Представлены крайние по степени повревдения личинками лугового мотылька сегреганта аз Р2 одного из растений типа

Проведенный нами генетический анализ - потомства по признаку устойчивости к канамицину (таОл.2), показал присутствие в полученных трансформантах разного количества функционирующих наследуемых генов, что приводит к различной степени защиты от этого антибиотика. Применительно' к растениям с генами бифункционального белка "токсин-ЮТИ" такой анализ полностью распространяется и на признак токсичности для чешуекрылых насекомых.

Таблица 2.

Анализ потомства трансгеняых растений табака по признаку устойчивости к канамшдау

Группа Число растений Р, Количество растений в F0 <*) 2 Соотношение юЛкш? Минимальное число копий гена

I 12 22,27i 4,47 3 : I I

II II 7,0Э± 2,52 15 : I 2

III 3 0 nd 3

Условные обозначения: Km1* - канамицин-устойчивые растения, Кп3 - канамицин-чувствительние, nd - не поддается определению.

Таким образом, получение растений, трансформированных гибридными генами бифункционального белка "тсксин-НРТП", отбор среди трансформаятов наиболее устойчивых к канаыицану, н последующее ■ выделение чистых гомозиготных по данному гену линий позволит получить формы растений, - устойчивых к поедании паразитирующими насекомыми. Быстрый. отбор травсформантов с наибольшим количеством KPT-активных продуктов можно проводить, используя высокочувствительный метод определения НРТ-ахтивности в растительных экстрактах In vitro, позволяющий скринировагь одновременно большое количество мякрообразцов из проростков на стадии первичной регенерации tRamesh.Osbom, 19911. При наличии каких-либо других защитных генов возможно создание новых генов бифункциональных белков на основе сделанных нами конструкций.

вывода

1. Сконструированы рекомбинантные гены, содержащие КП токсичного домена б-эндотоксина Вас111из 1Гшг(п#£епз(з подвида kurэtakl иод контролем "сильного ЗбБ-промотора ВМЦК: ген гг, кодирующий усеченный инсектотоксин СИПА(а), и ген гп слитого белка "токсин-ИРТИ".

2. Анализ экспрессии рекомбинантных генов гг и гп в Е.соИ показал наличие инсектицидной активности их продуктов, сравнимой с токсичностью природного белка СНПА(а), а такке 1ЧРТ-активности бифункционального белка "токсин-?ПТП".

3. Ферментативная активность продукта гена гп в растительных тканях обеспечивает возможность отбора трансгешшх растений, вырабатывающих инсектицидные белки, в присутствии канвмищша в селективной концентрации на стадии первичных трансформантов.

4. Прямая канамициновая селекция позволяет контролировать сохранение работающих генов бифункционального белка в потомстве трансгешшх растений.

5. Трансгенные растения с наибольшим уровнем синтеза ИРТ-активных продуктов гена гп проявляют наиболее выраженные токсичные свойства в отношении личинок некоторых чешуекрылы? насекомых.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТШ ДЙССЕРТАЦШ

1. Кузьмин Б.В., Шаденков A.A., Узбекова C.B., Шешвшв U.S. Создание бифункциональных производных гена инсектотоксинв Bacillus tfturlnglenala v&r.kurstakl для экспрессии в трансгенных растениях // Доклада Академии Наук СССР. 1991. Том 321, й 2. С.412-415.

2. Шаденков A.A., Узбекова C.B., Кузьшн Е.В., Болотова Т.Е., Эйскер Г.И., Шеиякш U.®. Экспрессия гибридного гена бифункционального белка п1Шсектотоксин-глюкуронидазап в трансгеншх растениях табака // Доклады Академии Наук. 1992. Том 325, £ I. С. 183-186.

3. Кузьшш Е.В., Шаденков A.A., Узбекова C.B., Шеиякш! M.Ö. Создание генов, кодирующих бифункциональные инсектицидные белки с маркерной активностью для экспрессии б трансгенных растениях // I Всесоюзный Симпозиум "Новые метода биотехнологии растений". Пущино, 1991. Тез.докл. С.22.

4. Узбекова C.B., Шаденков A.A., Ковалева U.B., Кузьмин Е.В. Бифункциональные белки "инсектотоксин-ШТ" в трансгенных растениях табака // II Российский Симпозиум "Ноше метода биотехнологии растений". Пущино, 1993. Тез.докл. С.54.

5. Шаденков A.A., Дрэдзе И.Л., Гетачоу Т.А., Курочканэ С.Д., Узбекова C.B., Майсуряв Д.Н., Шешпшн tö.S. Конструирована гена токсичного для жесткокрылых белка "GKYTITA-CRYIA(a)-NPTIIn и введение его в трансгешша ' растения картофеля // II Российский Симпозиум "Новые методы биотехнологии растений". Пущино, 1993. Тез.докл. С.59.

6. Шаденков A.A., Курочетгаа С.Д., Узбекова С.В.,Дридзз К.Л., Хадеева Н.В., Забег^-кова К.И., Шемякин Ь'.О. Получение трансгенных растёний картофеля, несущих производные гена инеектотоксияа CrylA(a) Bacillus ttvurlngienats var. kvratciki // II Российский Симпозиум "Новые метода биотехнологии растений". Пущино, 1993. Тез.докл. С.60.

7. Шэдечков A.A., Кадаров P.M., Узбекова C.B., Кузьшш В.В., Остермэн А.Л., Честухика Г.Г., Шеиякш II.®. Создание гена гибридного белка на основе С-эндотоксинов Bacillus thurlngtcnela CrylIIA и СгуЩа) и экспрессия его производных в Escherichta colt // Молекулярная биология. 1993. Т.27. С.952-959.