Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Создание бифункциональных производных генов G-эндотоксинов Bacilius Thurigiensis и анализ их экспрессии в трансгенных растениях

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Создание бифункциональных производных генов G-эндотоксинов Bacilius Thurigiensis и анализ их экспрессии в трансгенных растениях"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ВШИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ

На правах рукописи

ШАДЕНКОВ Александр Александрович

СОЗДАНИЕ БЕШШЦИОИАЛЬНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ГЕНОВ {»-ЭНДОТОКСИНОВ ВАСНШБ ТЮШаЕНБШ И АНАЛИЗ ИХ ЭКСПРЕССИИ В ТРАНСГЕННЫХ'РАСТЕНИЯХ •

I

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени кандидата Онологических наук

Москва - 1994

Работа выполнена в лаборатории генетической нЕкенерпя растений ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

проф. Шемякин М.Ф. Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Андрианов В.II. доктор биологических наук Морозов С.Ю.

Ведущая организация - Филиал Института сиоорганической химии РАН.

Защита диссертации состоится " "__ 1994 г.

_ час. на заседании специализированного совета Д.020.40.01

при ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН по адресу: 125206, г.Москва, ул. Тимирязевская, д.42.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Автореферат разослан " " ___ 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета, /7

кандидат биологических наук Меликова С.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. До настоящего момента перед человечеством остро стоит- проблема защиты сельскохозяйственных растений от насекомых-вредителей. Широкое применение искусственных инсектицидов в последнее время справедливо подвергается критике. Неблагоприятное влияние шгогах используемых инсектицидов на здоровье человека и глвотных, употребляющих в пищу обрабатываемые растения, способность насекомых быстро приспосабливаться к некоторым ядам, общее загрязнение округапцей среды и нарушение бкологического баланса, связанное с применением тех или иных Химикатов,, их дороговизна - все это заставляет продолкать поиски новых инсектицидов и способов их применения. .

В современном сельском хозяйстве используются биологические инсектицида бациллярного происхождения,- которые представляют собой важную альтернативу химическим агентам. Белки, • образующее кристаллические включения в БааШиа 1Тшг1щ1епа1в (О-впдотрксины) , высоко специфичны в своей активности, • как правило, против насеко?шх, п "соверзенно безвредны для человека и теплокровных яивотшх. Отдельный б-эндотокелн обладает патогенны™ свойствами обычпо . против "представителей только одного отряда насекомых. Однако, коммерческое использование этих токсинов ограничено высокой стоимостью препаратов п, в особенности, пх нестабильностью в полевых условиях.

Таким образом, очевидным становится стремление ученых создать сорта сельскохозяйственных растений, в которых устойчивость к пасокой« была бы генетически обусловлена. Успехи современной генной птсенерзи растений позволяет это осуществить. В серэдяно 80-х годов были получены перше растения, в которых содержались и зксирэссировались гены токсотов В.ИшИ->£1епа18. С тех пор

—А ~ 2 ~ ■

некоторым ведущим фирмам удалось значительно увеличить уровэнь накопления С-андотоксинов в растительных тканях и началась работа, направленная на коммерческое использование трансгенных растений, устойчивых к насекомым. Однако, по-прехнему актуальной остается задача ускорения и упрощения детекции инсектицидных белков в трансгенных растениях и селекция таких растений на начальных стадиях их получения.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось конструирование производных генов О-эндотоксинов, кодирующих бифункциональные белки, которые обладают одновременно инсектицидной и легко тестируемой ферментативной активностями, а также анализ экспрессии таких производных в трансгенных растениях. В связи с этим были поставлены следующие задачи: I) .конструирование генов бифункциональных белков типа "инсектотоксин-маркер" на основе О-эндотоксинов B.thurlnglenala; 2) анализ токсичных и ферментативных свойств продуктов экспрессии гибридных генов в Е.colli 3) получение трансгенных растений табака и картофеля, экспрессирувдих сконструированные гены; 4) анализ маркерных и инсектицидных активностей в тканях полученных трансгенных растений.

• Научная новизна и практическая > ценность работы. Сконструированные в настоящей работе производные генов О-эндотоксинов ВааШиз thurlngtenals кодируют белки, проявляющие как инсектицидные свойства по отношению к чешуекрылым или жесткокрылым, так и маркерные ферментативные активности. Поскольку гибридные гены способны к экспрессии в растениях, то они могут использоваться для создания трансгенных растений ' различных сельскохозяйственных культур, обладающих устойчивостью к определенным видам насекомых. На примере трансгенных растений табака и хозяйственно значимых сортов картофеля (Дезире, Львовянка,

Еуковскзй ранний) продемонстрированы возможности детекции инсектицидных белков в растительных тканях и простого и надежного отбора трансгенных растений с максимальны!.! содерванием таких белков о помощью анализа маркерных ферментативных активностей.

Осуществлена задана С-концевой части гена токсичного по отношению 1 к гесткокрылым белка Grylllk на гомологичную последовательность гена CrylA(a), проявляющего патогенные свойства к чоиуекрылнм, и показано, что генный продукт токсичен для Еасткокрылих. Такие данные позволяют более точно локализовать области в последовательности CryIIIА, ответственные за специфичность эндотоксина.

Апробация работы. Представленные в диссертации результаты долоетны и обсуаденн на Конференции молодых ученых ВНШСБ в 1990 .году (первая премия), на 1-ом Всесоюзном и П-о;л Российском Симпозиумах "Новые методы биотехнологии растений" (Щ дино, 1991; IS93), а такта па российско-германском совещании "»Молекулярная биология и генетика растений" (Москва, 1993).

Публикации. Результаты, исследования опубликованы в 8 печатных работах, список которых приведен в конце автореферата.

Структура и объом работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания условий экспериментов, результатов и их обсуждения, выводов и списка использованной литературы. Работа излогена на Г40 страницах машинописного текста, содержит 27 рисунков и 5 таблиц. Список цитируемой литературы включает 169 наименований.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовались бактериальные raTajMU E.colt TG1, СА161, Agrobacterlum tmefaclena С58С1(pGV3850), GY3101(pMP90RK),

Agrobacieriwi rhtzogeneo A4. Выращивание клеток Б,colt ш агробактернй проводили, соответственно, на средах LB П YEh Растения N toot tana tabacum ст. SR1 поддерживали в стерильшх условиях на среде MS (Lturaa tilge, Skoog, 1962). В работе использовались векторные шшзмиды рКК233-2 (Ашапп, Бгоз1ш, 1935), pGV941 (Deblaere et al., 1985), pPCY002 (Koncz, Schell, 1986). Молекулярное субклонированне в E.coli проводили ш стандартным методикам (Ыаниатис и др., 1984). Шмуноблоттинг осуществляли в соответствш с методом Тоубина (ТстгЫп et al., 1979). Плавыида в агробактерии вводили методом прямой трансформации (£n et al., 1988) п подтвервдали трансформации, выделяя плазкпда катодом щелочного лизиса (BlrnbolJn, Doly, 19Т9). Трансгенные растения табака получалп методом инкубирования листовых дисков с агробактериальной суспензией о последующей регенерацией фертилышх растений (ДрэШгер и др., 1991). Растительную геномную ДНК выделяли согласно руководству (Дрейпвр, Скотт, 1991). Полждзразную цапнув реакции проводили в автоматическом ратаю на вмшвфжаторо "Еиотерм". Определение глгжуронидазной активности осуществляли по методу Дкефферсона (Jeileraon et al., 1987). Глшурошдазную активность In situ в ПААГ анализировали в соответствии с (Kavanagh et al., 1988; Скотт и др., 1991). Метод определения канамицпнфосфотрансферезной активности излозкен в руководстве (Скотт и др., 1991). Для анализа инсектицидных свойств бактериальных клонов и трансгенных растений использовались личинки непарного иелкопряда {fymantrla älapar), хлопковой ' совки (HellothlB vlrescena), лугового мотылька (Loxostegta et let leal1в) и колорадского аука (Lepttnotarsa decemllneata).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУВДЕШЕ

I. Создание бифункциональных производных генов О-андотоксинов crylA(a) и cryIIIA

I.I. Конструирование гена бифункционального белка "инсектотоксин Crylh(a) - глюкуронидаза"

Сконструированные ранее в нашей лаборатории С.В.Узбековой плазмйды pRT103tt и pRT103tn содержат производные гена специфичного к чешуекрылым в-вндотонсина CrylA(a) ß.thuringtenate var. kurataRi HD-I, OPG в плазмиде pRT103tt содержит Ю-72Б-ые кодоны crylA(a), т.е. полную последовательность токсичного фрагмента. Перед 10-ым AK-остатком ОРС кодирует полипептид IÍGELDLVRAXISLHA. В плазмиде pR?103tn кодирующие последовательности crylA(a) и квпаадщинфосфотрансферазн (NPTII) слиты в одной фазе считывания. Меяду 647-ым AK-остатком токсичного домена и третьим остатком HPTII ОРС кодирует трипептид PSb.

С целью" сконструировать ген бежа, обладающего квк инсектицидными свойствами i>j/IA(a), так и легко тестируемой в растительных тканях ферментативной активностью, мы к последовательности токсичного фрагмента из pRT103tt присоединили в одной фазе считывания ОРС ß-глшуронидазы E.coll (GUS), донором которой являлась любезно предоставленная В.Л.Меттом (ИМГ РАН) плазмида p35SGusNoa. Рестрикционный фрагмент ВатН1-Ес113611 из етой плазмйды после обработки синтетическими Kpnl- и BglII-линкерами лигировали с плазмндой pRT103tt, расщепленной Kpnl (725-й триплет кодирующей последовательности инсектстокслна) и BamHI (за пределами ОРС) и получили плазмиду pRT103tg. В результате проведенных манипуляций в потенциальном продукте гибридной ОРС домены т:ксина

(после 725-ого АН-остатка) и р-глжуронздаз1; разделана олигопептидом GSPGGQSL. в N- и С-концевых частях нсполъзуеного фрагмента С-вндотоксша сохранились участки узнавания протеазами пз кишечника наоекомнх. Как и в плазмпдэ pRT103tt, ген снабген растительными элементами регуляции вкспрессии: ЗКЗ-промотором и терминатором гена VI вируса мозаики цветной капусты, а тшдаэ имеет оптимальный для экпрессии в растениях участок инициации трансляции состава CCACCATGG (Kozak, 1983).

Для того, чтобы получить штата E.coli, синтезирумдаЗ белок с той se первичной структурой, какой долган обладать продукт гибридной ОРС "Енсектотоксш-глазкуронидаза" в метке растения, ма клонировали в шазмиде pRI103tg SalGI-NcoI-üparaoHT из плазмида рКК233-2, который содержит'нвдуцибэлышз промотор Ptyo (гибрид 1ас-и trp-прсилоторов). .В результате, структуры белковых продуктоз полученной илаз?.щда pTrctg, а т are» аналогичным образом сконструированных С.В.Узбековой плазмид pTrctt и pírctn, совпадают, соответственно, со структурам продуктов pRT103tg, pKP103tt и pRT103tn и схематически представлены на рис. I. Генные конструкции а соответствуйте белки в дальнейшем сокращенно обозначается "tt (ТТ)", "tn (TN)", "tg (TG)".

1.2. Анализ свойств гибрида "инсактотоксш сгу1А(а) -глюкуронидаза"

На рис. 2 представлены результаты Еммупоблоттинга суммарных белков клонов E.coli, тршсфорщюватшх плазмпдеш pTrctt, pTrctn и pTrctg, который проведен с использованием моноспэщфческшс антител к инсектотоксинам типа kurstakl. Как следует ю иллюстрации, гибридный белок TG, по всей видимости, подверкен в бактериях значительно более иптенспвно?«7 протеолэтическому

29

607

10

—мшшыалышй---

-тасектотоксин—■

CrylA(a)

П( шоразмврный CryIA(я)

725 1

CGELDLVRAKISLHA

I G

GUS

Z3 TG

¡SPGGQSL

644

• 159

Полноразмерный От/ША

—минимальный—

-ИНС9КТОТОКСИН-

607

565ч

725. •

TenG

SPGGQSL

fhc. i. Схематическое изображение аминокислотных последовательностей белковых продуктов сконструированных' производных на основе генов cry ТА (а) и сгуША. Ци<5ры обозначают номера аминокислотных позиций соответствующих природных белкой.

155 кДа

~ 100 кДа

тщщ

-wwaS- __ 80 кДа

а б в г

Рис. 2. Иммуноблоттинг белков клонов E.coll, трансформированных плазмидами рКК233-2 (а), pTrctt (б), pTrctn (в) и pTrctg (г).

рзслзшгешта, ш сровпоплю с ■ белками ТТ и TN, т.к., наряду с полноразмервш 155-кДа продуктом гена tg, в превосходящих количествах продуцируется такзгэ иммунореактивный полипептид кепызого разшра.

Наличие у 155-кДа бежа "CryIA(a)-GUS" глшуронидазной активности подтверждается анализом с использованием флюорогенного субстрата TJUG экстрактов клопа pfFrctg In situ в ПЛАТ после электрофореза в денатурирующих условиях (рис. 3).

Присутствующая в ¡слетках клона E.colt, содержащего pTrctg, инсектицидная активность по отношению к гусеницам L.dispor уступает токсичности бактерий, трансформированных pTrctt и pTrctn, Это моено объяснить как свойства?® растворимости белка TG, который, как следует из анализа глюкуронидвзной активности различных фракций бактериальных экстрактов, присутствует в клетках В.coll в основпои в виде труднорастворшых агрегатов, так и упоминавшимся протеолизом полноразмериого Оелса в бактериях.

1.3. Конструирование генов токсичных для жесткокрылых гибридных белков на основа гена сгуША

Любезно ■ предоставленная Г.Г.Честухинсй плазмида pRK168 Содержит клонированный в векторе pUC19 фрагмент ДНК B.tkurlnglenata subsp. ienebrlofda, включающий последовательность crylllA до 565-ого кодона. Для получения гена функционального белка, который обладал бн свойствами специфичного к аэсткотсрылым О-эядотоксина СгуША, ш предприняли попытку ' достроить указанный фрагмент сгуША, используя гомологичную последовательность из сгу1А(а) (526-Б07-ыв кодоны этого гена). Б качество источников такой-последовательности чспользозелясь плазкидц pRT103tt, -рПТКШп и pRT103tg. Рострикционные ЕсоН1-За1С1-фрап,'.внтц, содержащие

155 кда 115 кДа

а 0 в

Рис. 3. Гликуронидазная активность In situ в гвлэ. Клоны E.coll трансформированы плазмидами p35SGuBNos (a), pTrctg (0), pTrcteng (В).

З'-котцэшэ лослэдоватальпосет гвпов tt, tn и tg, начшюмщээся с трлплота, соотизтствупцэго 527-ому кодону природного сгу1А(а), переносили в рШб8, -проводя полную рестрикцию последней по SalGI и пзггалпуи по EcoHI. Pstl-фрагкапта сконструированных таким образом шгазяпд pUC19tenki pTJCISteim и pUC19teng содерват гибридные ОРС, начиная с БО-ого кодона сгуШЛ.

В • результате клонирования указанных фрагментов в скспрассксшпоя вектора рКК233-2 были получены клоны Б.coll, содерггаЕ^о рзкокбякатныв шгагкада pTrotenk, pTrctenn я pTrcteng, и способные акспрэссирошть геш, схематическое изображение продуктов которых представлено га ряс. I. Как видно из рисунка, б'-концевые часта гибридных ОРС отличаются от начинающейся с 48-ого кодона последовательности интактного crylllA лишь заменой треонпнового кодона природного гена па алшшгошй во втором пологонпп. Известно тазсзэ, что отсутствие перснх 48-и АК-остатпов- не влияет на токсические свойства CrylllA. (Selcar et al., 1987; Carroll et al., 1989).

1.4. АПОЛ23 СПОЙСТЗ гибридных ППЛШВПТЯДГШХ продуктов гоншп производных crj/IIIА

Суммарные белки плеток Б.coll, трансфоретрованных плазмздалз pTrctenfc, pTrotenn и - pTrcteng, анализировали с помощью электрофореза , в деяатурирущпх условиях и имчуноблоттпнга, используя коносгоцифячвскпе антитела к. токсинам типа гenebrtonta. Как видно из рис. 4, в указанных клонах синтезируются ккмунореактивные полипептида, швщго квдущиеся молекулярные массы около 80, 100 и 165 кДа соответственно, которые в общем совпадают о-рассчитанными значениями, а таксе со значениями масс белков, созданных ранее на основе crylA(a) (рис. 2). В экстрактах

- 155 кДа

100 кДа 30 кДа

66 кДа 63 кДа

а б в г д ь ж

Рис. 4. Иммуноблоттинг белков клонов E.coll, трансформированных плазмидами pTrctenk (а,б), pTrctenn (в,г), pTrcteng (д,е) и препарата очищенного О-эндотоксина из B.t.tenebrlonla (к). В случаях (а), (в), (д) экстракцию белков E.coll проводили в буфере для биотестирования (см. разд. 2.1.3), в случаях (б), (г), (е) - в буфере для определения активности ß-глюкуронидазы.

клеток, содераащцх pTrcteng, помимо интактного 155-кДа бежа (TenG), наблздвется тага» пммунореактившй полипептид, который является, вероятно, продуктом протеолитпческого расщепления TenG.

Цредставленные на рис.3 результаты анализа р-глюкуронидвзной активности пршщшшально на различаются для клеток, содерзащах • pTrcteng и pTrctg, п шшзстрпруют синтез этими клетками 155-кДа ' белков, обладающих глюзуронидазной активностью.

В экстрактах. суммарных белков E.coll, несущи! pTrcterm, мы продемонстрировали наличие канамицинфосфотрансферазной активности с помощью анализа In situ в геле. Как видно из рис. 5, наряду с полпоразмэрннм продуктом Tenlí, существенный вклад в КРТ-активность клеток вносит полипептид, мигрирующий аналогично NPTII. Это совпадает с результатами работы (Horte et al., 1988) по анализу НРТ-актишости меток E.coll, экспрессирутацих ген типа "CíryIA(to)-КРПI"*. Такие результаты являются, по всей видимости, следствием протеолитического расщепления бифункциональных белков или инициацией трансляции гибридной OPG в клетках E.coll с внутреннего мэтионшгового ко дона.

Проявление . инсектицвдннх свойств гибрядпкх полшгептидов ' исследовали на личинках колорадского жука. Предварительные результаты биотестирования указали на большую токсичность экстрактов бактерий, несущих • pTrcterm, го сравнению с клетками клопов, содержащих pTrctenk и pTrcteng. Это коррелирует с тем, что наибольиее количество потенциально инсектицидного белка в оптимальной для проведения биотостов растворимой форие присутствует питано в клетках, експрессируэдаэс ТепН (рас. 4). Как видно из табл. I, токсичность экстрактов клона E.coll, несущего pTrctenn, на-уступает токсичности препарата, в котором в суспензию клеток клона -рКК233-2 добавляли раствор очищенных кристаллов B.t.tenebrlonle в

Рис. Б. Канамицивфосфотрансферазная активность In Bltu в геле. Клоны E.colt трансформированы плазмидами pTrctn (8), pTrctenn (0), pT5i9Sneo (в, положительный контроль;, рКК233-2 (г, отрицательный контроль).

.Таблица I.

Анализ инсектицидной активности в отношении личинок колорадского хука хслонов E.coll, несущих указанные плазшда

Бактериальные клоны. Увеличение веса личинок по отношению к первоначальному,% Среднее количество поп 1бших личинок на шестые сутки,5

на третьи сутки на шестые сутки

рКК233-2 164-22. 339^30 , 4*

pTrctenn 104-39 87±41 47

рКК233-2 с добавлением CryUU 3?±51 247-79 20

количестве, приблизительно эквимолярном содержанию

бифункционального белка в клетках рТг^епп, -что оценивали по интенсивности окрашивания соответствующих зон на иммуноблоте. Подученные данные свидетельствуют о том, что произведенная замена элемента последовательности СгуША на фрагмент из Сгу1А(а) не уменьшает токсичность белка по отношению к колорадскому куку и, вероятно, к прочим кесткокрылым. В очередной раз показано также, что слияние с ферментом НРТТ1 не снижает инсектицидную активность эндотоксина. .

2. Получение и анализ трансгенных растений, экспрессирущих •бифункциональные белки "инсектотоксин - маркерный фермент"

2.1. Трансгенные растения табака и картофеля с введенным геном "сгу1А(а)-СЦЗ"

Сконструированный ген кодирующий бифункциональный

полипептид "Сгу1А(а)-оиЗ", клонировали в плазмидных компонентах бинарных векторов рСУ941 и рРС7002, трансформировали рекомбинатнымп плазмидами штаммы АЛите/ас1епз ЬСУ3350 и 073101 (рМР90ЕК), а тага® А.гМгоЁвпеэ А4, которые затем использовались для получения трансгонных растений табака и картофеля.

Регенерирующие посе трансформации методом листовых дисков растения И1соИапа гаЬасит селектировали на среде, содержащей 100 мкг/мл канамицина, и убеждались в наличии КРТ-активкости в экстрактах полученных растений (рис. 6).

Приведенные з табл. 2 результаты количественного определения . глюкуронидазной активности указывают на то, что е тканях значительной части, трансформантов, в которые вводился ген а'паруюгоается р-глпкуронидазная . активность. Широкий диапазон ^ровной глюкуронидазной активности, который долхен коррелировать с

— NPTII

абвгдекз Рис. 6. Канамицинфосфотрансферазная активность In situ в геле..Клон E.coll трансформирован плазмидой pT519Sneo (а, положительный контроль)., не трансформированное растение fllc.tabacim (б),' растения трансформированы геном tt (в) и геном tg (г - з).

',-i'" -4 V -/ite'V

'Ф

■■.л'.

ГК :

t

ft

— 155 кДа

— 115 кДа

аовгдожзи Рис. 7. Глвкуронидазая активность In situ в геле. Клон E.coll, трансформированный плазмидой pTrctg' и продуцирующий двудоменный полигоптид наряду с эндогенной ß-глгкуронидазой (а); клон E.coll, не содержащий плазмид (б), ^трансформированные растения tilc.tabacxm SRI (в,г); растения трансформированы геном gus (д) геном tg (е - и). Растительные экстракты получены из F1-потомства различных линий трансформантов.

Таблица 2,

Распределение индивидуальных растений, трансформированных генои "инсектотоксин-гликуронидаза", относительно глюкуронидазной активности в их тканях

Глхкуронвдазная активность, .пкмоль 4-Ш/(мин » мг белка)

Число растений с указанной активности

<5 (фоновая флюоресценция) 5-20 20-40 40-60 60-100

5

17 7 . I 3

уровнем накопления инсектицидного продукта, подтверждает целесообразность создания системы с использованием трансляционпо слитых целевого и маркерного генов для эффективной селекции индивидуальных линий трапсгенных растений с повышенным синтезом пнсектотоксина.

Как известно, ОРС генов О-эндотоксинов и их бифункциональных производных экспрессируются в растительных тканях с 'низкой эффективностью (Barton et al., 1987; Flschhoff et al., 1987; Vaeck et al., 1987). Это также подтверздается сравнением полученных нами растений с геном tg с растениями, трансформированными геном интактной глюхуронидазы, в которых ферментативная активность оказалась значительно выше. Несмотря па это, экстракты некоторых трансформантов tg и их потомства наш были успешно использованы для определения глюкуронидазной активности In situ в ПААГ после электрофореза в денатурирующих условиях. Как видно из рис. 7, глюкуронидазной активностью в таких растениях обладает интактный бифункциональный белок "CryIA(a)-GUS".

При анализе инсектицидных• свойств полученных трвнсгенных растений с использованием гусениц непарного шелкопряда L.dispar была обнаруггана частичная устойчивость некоторых обладающих сравнительно высокой глюкуронидазной активностью растений к поражению личинками. Однако, мы не добились строгой воспроизводимости результатов и количественной оценки токсичности. Это объясняется тем, что табак не является естественной пища! для гусениц L.dtapar. Првдварителыггй анализ потомства трансформантов на устойчивость по отношению к L.stlcticalla и Н.armígera также указывает на экспрессию в них инсектотоксина. Разницы в токсических свойствах растений с введенным геном "cryIA(a)-gus" и служивших положительным контролем трансформантов геном tt не наблюдается.

Расщепление признака устойчивости к канамицину и сцепленной с ним глюкуронидазной активности в потомстве,* полученном после самоопыления трансгенных растений табака, проходит подобно доминантному признаку по Менделю, что согласуется с выводами работы (Budar, 1986).

Глюкуронидазная активность в растениях картофеля сорта Львовянка, экспрессирующих гибридный ген "crt/IA(a)-gua", находится в пределах 6-15 пкмоль 4-Ш / (мин » мг белка). Достаточно чувствительный д.. л анализа токсичности растений картофеля к чешуекрылым тест-объект нам выбрать не удалось.

2.2. Трансгенные растения табака и картофеля с введенным геном "crylIIA-crylAO )-nptII"

Для получения трансгенных растений, устойчивых к кесткокрылым, ми решили использовать сконструированный ген бифункционального белка "инсектотоксш-КРТП". Любезно предоставленная С.В.Узбековой плазмида pGV941tn содержит ген, который отличается it присутствующего в pRT103tn лишь заменой терминатора гена VI ВМЩ на терминатор гена нопалинсинтазы Собственный ген селективного

маркера NPTII,. происходящий из pGV941, в плазмиде pGV941tn удален. Плазмида pGV941otn также предоставлена С.В.Узбековой и отличается от pGV941tn наличием перед гибридным геном дополнительно последовательности усилителя трансляции ы из вируса табачной мозаики (Gallle et al., 1937).

Ncol-фрагменты плазмид pGV941tn и pGV941iotn, содержащие последовательность 0FC гибридного гена, которая включает кодирующие последовательности инсектотоксяна CrylÁ(a) и частично NPTII (до 173-го кодона), заменялись яа Nool-фрагмент pTrcterm, который, в zvою очередь, содержит последовательность ОРС temí, ограниченную на

З'-конце сайтом рестрикции из nptll с такими ::е координатами. В результате были получены плазмиды pGV941tenn и pGV941orterm, которые отличаются от pGV941tn и pGV941cjtn заменой последовательности ОРС гена tn на ОРС гена tern.

Сконструированными таким образом плазмидами трансформировали штагам A.tmsfaclem LGV3850 и A.rhlzogenes А4 и затем использовали их для получения трансгенных растений табака и картофеля.

Селекция трансгенных растений табака после трансформации с помощью плазмид pGV941tenn и pG7941wtenn проводилась на искусственной питательной среде, содержащей 30-50 мкг/мл Km. Устойчивость к канамицину обеспечивалась исключительно за счет экспрессии бифункционального белка "инсектотоксшИ'1РТ11".

Встройку гетерологичной ДНК в растительной геном подтверждали с помощью полимеразной цепной реакции. Размер синтезируемых в ПЦР фрагментов ДНК соотвествует расчетному.

Экстракты трансгенных растений табака, проявляющих наибольшую устойчивость к канамицину, были использованы для определения NPT-активности In situ в ПААГ. Из рис. 8 видно, что, как и в случае экспрессии гибрида TenN в клетках E.coll, наибольшей ITPT-активностью в экстрактах растений, .несущих ген этого бифункционального белка, обладает полигептид, мигрирующий аналогично NPTJI. Даке после применения специальных методов по устранению фоновых сигналов, вызванных активностью растительных протеинкиназ, NPT-активность интактного 100-кДа белка TenN оставалась слабо заметна. Подобная картина объясняется, по нашему мнению, интенсивным протеолитическим расщеплением бифункционального бежа в растительных тканях In vivo, скорее всего, в месте слияния ЛК-последовательностей токсичного и маркерного доменов.

Расщепление признака устойчивости к канамщину у растет;;»;

а б в г д

Рис. 8. Канамицинфосфотрансферазная активность In situ в гешк Трансгенные растения Slcotlana tabacum трансформированы геном tern, содержащим последовательность усилителя трансляции и (а,б), и не содержащим его (в,г). Клон Е.coll, трансформированный плазмидой pTrctenn (д).

табака, прорезанных из семян после самоопыления трапсформантов tera, но отличалось от рассматривавшегося для потомства растений с геном tg (разд. 2.1). Для тэтах выращенных из семян растений окспрессая бифункционального белка TenN была такова, что достаточно высокое содержание Km в среде (до 150 мкг/мл) совершенно не тормозило развитие растений. В тканях растений, гомозиготна по признаку устойчивости, к канамицшу, наблюдалось усиленно НРТ-сигнала при анализе активности In situ в ПААГ. В настоящее время продолжается наблюдения за потомством трансгешшх растений третьего поколения.

Сконструированный ген бифункционального белка "ннсектотохспн-НРТП" сотрудник нааей лаборатории И.Л.Дрпдзе, сотрудник ИЩ АН Беларуси С.Д.Курочкина и сотрудники' НПО по картофелеводству Г.В.Рассадина и Н.О.Юрьева вводили также ' в растения картофеля сортов Дезаре, Львовянка и Носовский ранний. Трансформанты отбирали на среде, содержащей 25-30 икг/мл Km, что является достаточной селективной концентрацией для такой культуры, как картофель. Встройку геторологичной ДНК в рзстптелышй гепом' подтверждали с помощью ПЦР. Кок правило, экспрессия гена бифункционального белка обеспечивала нормальный рост трансформантов ha среде с указанной концентрацией антибиотика, но зачастую была недостаточна для их стабильного укоренения при вегетативном размногэнпи. В то se время, контрольные нетрансфоргированные растения не развивались в присутствии используемых концентраций селективного антибиотика п погибали через 10-15 дней.

Три индивидуальные линии полученных трапегенных растений картофеля были проанализированы на токсичность по отношении к колорадскому зуку. Лячппст па трансгеннах растениях существенно отставали в росте п развитии от контрольных. В то а врезд.

заметной токсичности во время вксдаршанта с вегететившш потомством полученных линий обнаружить на удалоаь, что отчасти объясняется неравноценностьи епзласпособлоста пспольаувмых личинок жуков, но указывает танш на необходимость увалачашг, вкспрессиа токсичного болка.

Нами не бшю закачано существенного усиления експреосш бифункциональною гибрида при анализе трансгошцх растений табака и картофеля, полученных о потцыэ шюзьшда pGV941o)îerm, по срйвавшт с растениями, hoji¿ ^ешшда с шыощью pGV941 tonn, т.о. в отсутствии усилителя трансляции ш. Это указывав? на необходимость дальнейшего поиска регуляторных вламентоз, которые бы белее бФЗЕйктивно усиливали экспрессию шевктотечошкн) в растениях.

ВЫВОДЫ

1. Сконструирован ген гибридного бежа "минимальный . инсектотоксин Сгу1к(а) - глюкуронидаза" и показано' проявление продуктом такого гена коп токсичности по отношении к чешуекрылым, так и маркерной глюкуронидазной активности.

2. Ограниченная в 3'-концевой части 565-ым кодоном последовательность гена специфичного к кесткокрылым Й-эндотоксина СгуША дополнена гомологичным фрагментом гена сгу1А(а) и сконструированы гены, где такая гибридная 0Р0 слита с кодирующими последовательностями канамищшфосфотрснсфэразы (ЫРТИ) и р-глюхуронидазн.

3. Анализ полипептидных продуктов этих. генов установил проявление бифункциональными белками соответствующих ферментативных активностей и доказал, что использованный фрагмент последовательности СгуША целиком содержит область, ответственную за токсичность по отношению к жесткокрылым.

4. Получены трячегеннне растения табака и картофоля, содержащие и экспрессиругацие гены бифункциональных белков "Сгу1А(в) - глюкуронидаза" ' и "СгуША -- Сгу 1А(а) кшшмицинфосфотрансфераза".

5. Показана эффективность применения системы гибридных генов типа "инсектотокскн-фермект" для чувствительной де жнии инсектицидных бежов по маркерной ферментативной, активности в трансгенных растениях и для первичной селекции трансформантов.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

I. Кузьшн Е.В., Шаденков A.A., Узбекова C.B., Шешткин U.0. Создание бифункциональных производных гена инсектотоксина Bacillus tburlnglensla var.kursta&l для экспрессии в трансгенных растениях // Доклада Академии Наук СССР. 1991. Том 321, JS 2. С.412-415.

- 2. Шаденков A.A., Кузьшн Е.В., Эйспер Г.И., Шешптап У.©. Экспрессия гибридного гена . бифункционального белка "инсектотоксин-глюкуронидаза" в трансгенных растениях табака // I Всесоюзный симпозиум "Новые метода биотехнологии растений". Пущано, 1991. Тез. докл. С. 47.

3. Кузьшш Б.В., Шаденков A.A., Узбекова C.B., Шемякин M.Q. Создание генов, кодирующих бифункциональные инсектицидные белки с маркерной активностью для экспрессии в трансгенных растениях // I Всесоюзный симпозиум "Новые методы биотехнологии растений". Пущино, 1991. Тез. докл. С.22.

4. Иадекков A.A., Узбекова C.B., Кузьшн Е.В., Болотова Т.Б., Эйснер Г.И., Еешгкин У.ф. Экспрессия гибридного гена бифункционального белка "инсектотоксин-глюкуронидаза" в трансгенных растениях табака // доклады /*:адемии Неук. 1992. .Том 325, Й I. С. 183-186.

5. Шаденков A.A., Дридзе И.Л., Гетачау Т.Л., Курочкина С.Д., Узбекова C.B., Майсурян А.Н., Шемякин У.О. Конструирование гена токсичного для кесткокрылых белка "CRYIIIA-CRYIA(a)-NPTII" и введение его в трансгенные растения картофеля // II Российский симпозиум "Новые методы биотехнологии растений". Пущина, 1993. Тез. докл. С.59.

6. Ваденхов A.A., Курочкина С.Д., Узбекова C.B.,Дридзе И.Л., Хадеева Н.В., Забенькова К.И., Шемякин М.ф. Получение трансгенных

растений. картофеля, несущих производные гена инсектогоксина CrylA(a) Bacillus ôturtngienala vor. kurataki // II Российский симпозиум "Новые метода биотехнологии растений". Пущино, 1993. Тез. докл. С.60.

7. Узбзпсза C.B., Шадекксв A.A., Ковалева М.В., Куаьшт 13.В. Бифункциональные белки "ннсектотоксин-ЩТ" в трансгегашх растениях табака // II Российский симпозиум "Новые методы биотехнологии растений". Пущино, 1993. Тез. докл. С.54.

8. Шадевков A.A., Кадаров P.M., Угбековз C.B., Кузьмин Е.В., Осториан А.Л., Чостухппэ Г.Г., Швилшш U.S. Создание гена гибридного белка ка основе О-эндотоксинов Bacillus thvringienala CrylIIA и CrylA(a) и экспрессия его производных в Escherichia coll // Молекулярная биология. 1993. Т.27. С*952-959.