Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Создание бифункциональных производных генов ...-эндотоксинов Bacillus thuringiensis и анализ их экспрессии в трансгенных растениях

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Создание бифункциональных производных генов ...-эндотоксинов Bacillus thuringiensis и анализ их экспрессии в трансгенных растениях"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ВНИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ

На правах рукописи

ШДВНКОВ Александр Александрович

ОЗДДНИЕ БИФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ГЕНОВ С-ЭНДОТОКСИНОВ ВАСШиЭ ТНиШвШБЮ И АНАЛИЗ ИХ ЭКСПРЕССИИ В ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЯХ

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1994

Работа выполнена в лаборатории генетической инженерна растения ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

проф. Шемякин М.Ф. Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Андрианов В.М. доктор биологических наук Морозов С.Б.

Ведущая организация - Филиал Института биоорганической химии РАН. . .

Защита диссертации состоится " " _____ 1994 г.

в _ час. на заседании специализированного совета Д.020.40.01

при ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН по адресу: 125206, г.Москва, ул. Тимирязевская, д.42.

С диссертацией мокно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Автореферат разослан " "...... 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

Меликова С.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. До настоящего момента перед человечеством остро стоит проблема защиты сельскохозяйственных растений от насекомых-вредителей. Широкое применение искусственных инсектицидов в последнее время справедливо подвергается критике. Неблагоприятное влияние многих используемых инсектицидов на здоровье человека и животных, употребляющих в пищу обрабатываемые растения, способность насекомых быстро приспосабливаться к некоторым ядам, общее загрязнение окружающей среды и нарушение Экологического баланса, связанное с применением тех или иных химикатов, их дороговизна - все это заставляет продолжать поиски повых инсектицидов и способов их применения.

В современном сельском хозяйстве используются биологические инсектициды бациллярного происхождения ,• которые представляют собой важную альтернативу химическим агентам. Белки, • образующие кристаллические включения в БасШиа 1Ъиг1тщ1епа1в (О-эндотоксины), высоко специфичны в своей активности, квк правило, против насекомых, и совершенно безвредны для человека и теплокровных животных. Отдельный б-эвдотоксин обладает патогенными свойствами обычно против "представителей только одного отряда насекомых. Однако, коммерческое использование этих токсинов ограничено высокой стоимостью препаратов и, в особенности, их нестабильностью в полевых условиях.

Таким образом, очевидным становится стремление ученых создать сорта сельскохозяйственных растений, в которых устойчивость к насекомым была бы генетически обусловлена. Успехи современной генной инженерии растений позволяют это осуществить. В серадана 80-х годов были получены первые растения, в которых содержались и экспрвссировались гены токсинов ВЛТихг1->&1вп81а. С те* пор

. - 2 - -некоторым ведущим фирмам удалось значительно увеличить уровэнь накопления б-ендотоксинов в растительных тканях и началась работа, направленная на коммерческое использование трансгенных растений, устойчивых к насекомым. Однако, по-прежнему актуальной остается задача ускорения и упрощения детекции инсектицидных белков в трансгенных растениях и селекция таких растений на начальных стадиях их получения.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось конструирование производных генов О-эндотоксинов, кодирующих бифункциональные белки, которые обладают одновременно инсектицидной и легко тестируемой ферментативной активностями, а также анализ экспрессии таких производных в трансгенных растениях. В связи с атим были поставлены следующие задачи: I) .конструирование генов бифункциональных белков типа "инсектотоксин-маркер" на основе О-эндотоксинов B.tbxxrlnglenalB; 2) анализ токсичных и ферментативных свойств продуктов экспрессии гибридных генов в Е.coll; 3) получение трансгенных растений табака и картофеля, экспрессирующих сконструированные гены; 4) анализ маркерных и инсектицидных активностей в тканях полученных трансгенных растений.

■ Научная новизна и практическая > ценность работы. Сконструированные в настоящей работе производные генов О-эндотоксинов ВасШив thuringlenaia кодируют белки, проявляющие как инсектицидные свойства по отношению к чешуекрылым или жесткокрылым, так и маркерные ферментативные активности. Поскольку гибридные гены способны к экспрессии в растениях, то они могут использоваться для создания трансгенных растений ' различных сельскохозяйственных культур, обладающих. устойчивостью к определенным видам насекомых. На примере трансгенных растений табака и хозяйственно значимых сортов картофеля (Дезире, Львовянка,

- з -

куковский ранний) продемонстрированы возможности детекции инсектицидных оелков в растительных тканях и простого и надежного отбора трансгенных растений с максимальным содержанием таких белков о помощью анализа маркерных ферментативных активностей.

Осуществлена замена С-концевой части гена токсичного по отношению к жесткокрылым белка Crj/IIIA на гомологичную последовательность гена CrylA(a), проявляющего патогенные свойства к чешуекрылым, и показано» что генный продукт токсичен для Еэоткокршшх. Такие данные позволяют более точно локализовать области в последовательности CryIIIA, ответственные за специфичность эндотоксина.

Апробация работы. Представленные в диссертации результаты доложены и обсувдены на Конференции молодых ученых ВНМИСБ в 1990 .году (первая премия), на 1-ом Всесоюзном и 11-ом Российском Симпозиумах "Новые метода биотехнологии растений" (Щдино, 1991; 1993), а также на российско-германском совещании "Молекулярная биология и генетика растений" (Москва, 1993).

Публикации. Результаты, исследования опубликованы в 8 печатных работах, список которых приведен в конце автореферата.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания условий экспериментов, результатов и их обсуждения, выводов и списка использованной литературы. Работа излоаена на 140 страницах машинописного текста, содержит 27 рисунков и 5 таблиц. Список цитируемой литературы включает 169 наименований.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовались бактериальные штаммы E.colt TG1, СА161, Agrobacterlum tmefaclena С58С1(pGV3850), GV3101(pMP90RK),

Agrobacterim rhizogenea A4. Выращивание клато»; E.coli ы агрооактерий проводили, соответственно, на средах LB И УЕВ. Растения Nlcotlana tabaavm ст. SRI поддергивали п стерпльши. условиях на среде US (Huraahlge, Skoog, 1962). В работе использовались векторные плазмиды рКК233-2 (Ашапп, Broalus, 1985), pGV941 (Deblaere et al., 1985), pPCY0Q2 (Koncz, Schall, 1986). Молекулярное субклонирование в E.coli проводили по стандартным методикам (Маниатис и др., IS84). ИЬзлуноблоттшзт осуществляла в соответствии с методом Тоубина (ТотЫп et al., 1979). Плазмида в агробактерии вводили методом пряхой трансформации (An et al., 1988) и подтверждали трансформации, выделяя шшз^'зда катодом щелочного лпзпса (Blrnbolffl, Doly, 1979). Трансгенные растения табака получала методом инкубирования листовых дисков с агроОактерпалыюй суспенБией о последующей регенерацией фортилышх растений (Дрейпер п др., 1991). Растительную геномную ДНК выделяли согласно руководству (Дрейпвр, Скотт, 1991). Полнмэразную цепную реакцию проводили в автоматическом разимо на шлшпфжаторо "Бнотерм". Определение глккуронидазной активности осуществляла по методу Дкефферсопа (Jefferson et al., 1987). Глюкуронидазную активность In situ в ПАAT анализировали в соответствии с (Kavarmgh et al., 1988; Скотт и др., 1991). Метод определения канампцивфосфотрансферезноЯ активности изложен в руководстве (Скотт и др., 1991). Для анализа инсектицидных свойств бактериальных клонов и трансгенных растений использовались личинки непарного шелкопряда {Lyxmtrla at арат), хлопковой ' совки (Hellothle vlreacena), лугового мотылька (Loxostegia BttotlcaHo) и колорадского жука (Lept trxotarm decent Ineata).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУВДЕНКЕ

I. Создание бифункциональных производных генов О-эндотоксинов crylA(a) и crj/IIIA

I.I. Конструирование гена бифункционального белка "инсектотоксин CrylA(a) - глюкуронидаза*

Сконструированные ранее в нашей лаборатории С.В.Узбековой плазмиды pRTIOStt и pRT103tn содержат производные гена специфичного к чешуекрцлшд О-вндотоксина GrylA(a) 3.thxxrtngienala таг. kurataki HD-I. ОРС в плазмиде pRT103tt содержит Ю-72Б-ыв кодоны сгу1А(а), т.е. полную последовательность токсичного фрагмента. Перед 10-ым АК-оствтком ОРС колирует полипептид HGELDLVRAKISLHA. В плазмиде pRTtoatn кодирующие последовательности crylA(a) и Канамицинфосфотрансфаразы (RPTII) слиты в одной фазе считывания. Мэвду 647-ым АК-остатком токсичного домена и третьим остатком NPTII ОРС кодирует трипептид PSL.

С целью" сконструировать ген белка, обладающего как инсектицидными свойствами Сгу1А(а), так и легко тестируемой в растительных тканях ферментативной активностью, ш к последовательности токсичного фрагмента из pRT103tt присоединили в одной фазе считывания ОТО p-глюкуронидаяы E.coll (GOS), донором которой являлась любезно предоставленная В.Л.Меттом (ММГ РАН) плазмпда p35SGusNoa. Рестрикционный фрагмент BamHI-Ecl13611 из этой плазмиды после обработки синтетическими Kpnl- и BglII-линкврами лигировали с плазмидой pRT103tt, расщепленной Kpnl (725-й триплет кодирующей последовательности инсектстоксина) и BamHI (за пределами ОРС) и получили плазмиду pRT103tg. В результате проведенных манипуляций в потенциальном продукте гибридной ОРС домены токсина

(посла 725-ого AK-остатка) и р-глзасуронадвзи разделаны олигопептидоы GSPGGQSL. В N- и С-концевых частях используемого фрагмента О-вндотоксина сохранились участки узнавания протеазаыи из кишечника наоекомнх. Как и в плазмвдэ pHTlCßtt, ген снабззн растительными элементами регуляции экспрессии: ЭбЭ-прокотором и терминатором гена VI вируса мозаики цветной капусты, а также смэот оптимальный для экцрессии в растениях участок инициации трансляции состава CCACCATGG (Kosak, 1983).

Для того, чтобы получить штата E.coli, синтезпрувдпй белок с той же первичной структурой, какой должен обладать продукт гибридной ОРС "инсектотоксин-глюКуронидаза" в шютке растения, мы клонировали в плазмзде pRTICßtg SalGI-NcoI-фрагмант из плазшды рКК233-2, который содержит 'индуцибэлышй прогаэтор Ptro (гибрид 1ас-и trp-проглоторов). .В результате, структуры белковых продуктов полученной плазшда pTrctg, а таксе аналогичным образом сконструированных С.В.Уабековой плазмид plrctt и pTrctn, совпадают, соответственно, со структурами продуктов pRTl03tg, pRTl03tt и pKIM03tn и схематически представлены на рис. I. Генные конструкции и соответствуйте белки в дальнейшем сокращенно обозначаются "tt (TT)", "tn (TN)", "tg (TG)".

1.2. Анализ свойств гибрида "инсектотоксин crylA(a) -гликуронидаза"

На рис. 2 представлены результаты имыупоблоттинга сушараых белков клонов E.coli, трансформированных тгазиидаыи pffrctt, pTrctn и pTrctg, который проведен с использованием моноспвцЕфзческих антител к инсектотоксшам типа kurstakl. Как следует кз иллюстрации, гибридный белок TG, по всей видимости, подваргэн в бактериях значительно более интенсивному протеолитическому

Рис. I. Схематическое изображение аминокислотных последовательностей белковых продуктов сконструированных производных не основе генов сгу1А(а) и сгуША. Цифры обозначают номера аминокислотных позиций соответствующие природных белков.

C2SO

156 кДа

— 100 кДа

— 80 кДа

а б в г

Рис. 2. Иммуноблоттинг белков клонов E.coll, трансформированных плазмидами рКК233-2 (а), pTrctt (б), pTrctn (в) и pTrctg (г).

расщеплению, то сравнении с белками TT и TN, т.к., наряду с шлноразмерннм 155-кДа продуктом гена tg, в превосходящих количествах продуцируется таю» тсмупоре активный полипептид меньшого размера.

Наличие у 15Б-кДа белка "CryIA(a)-GUS" глюкуронидазной активности подтверздается анализом с использованием флюорогенного субстрата BUG экстрактов клона pTrctg 1л situ в ПЛАТ после электрофореза в д&натурирувдях условиях (рис. 3).

Присутствующая в клетках клона E.coli, содержащего pTrctg, инсектицидная активность по отношению к гусеницам L.dispar уступает токсичности бактерий, трансформированных pTrctt и pTrctn. Это можно объяснить как свойствами растворимости бежа TG, который, как следует из анализа глшуронвд&зной активности различных фракций бактериальных экстрактов, присутствует в клетках E.coli в основпом в виде трудпорастворшых агрегатов, так я упоминавшимся протеолизом полпоразмерного белка в бактериях.

1.3. Конструирование гонов токсичных для жесткокрылых гибридных белков на основе гена orylllk .

Любезно -предоставленная Г.Г.Честухиной плазмида pRK168 йодорюгг клонированный в векторе pUC19 фрагмент ДНК B.ttwrlnglenala subsp. tenébrlorila, включающий последовательность crylllk до 565-ого кодона. Для получения гона функционального белка, который обладал бн свойствами специфичного к заэстшсрнлым О-эндотокслна Crylllk, мы предприняли попытку ' достроить указанный фрагмент crylllk, используя гомологичную последовательность из crylA(a) (525-607-ке кодоны этого гена). Б качестве источников такой последовательности использовались плазмида pRT103tt, 'pRT103tn и pRT103tg. Рострккционные EcoRI-SalGI-фрагменты. содержащие

Рис. 3. Глгкуронидазная активность in situ в геле. Клоны E.coli трансформированы плазмидами p35SGusNos (a), pTrctg (О), pTrcteng (в).

3*-концепае лослэяователыюсто генов tt, tn и tg, начинающиеся с триплета, ооогветствуищого 627-ому кодону природного crylA(a), дарзгосшш в рНК168, проводя полную рестрикцию последней по SalGI и неполную по EcoHI. Pstl-фрагконты сконструированных таким образом шгазнид pUC19ten&i pUC1Stenn и pOCl 9teng содержат гпбридпые ОРС, начиная о БО-ого кодона сгуША.

В ревультато клонирования указанных фрагментов в вкопресскошюм векторе рКК233-2 были получены клоны E.coll, содержащие раксдабпнатные плазкады pTrctenk, pTrctenn п pTrcteng, и способные экспрессировать генн, схематическое изображение продуктов которых представлено па рис. I. Как видно ив рисунка, 6'-концевые части гибридных ОРС отличаются от начинающейся с 48-ого кодона последовательности штатного сгуША лишь заменой трэонинового кодона природного гена на влнниеобый во втором положении. Известно также,, что отсутствие первых 48-и AK-остатков- не влияет на токсические свойства СгуША (Sekar et al., 1987; Carroll et al., 1989).

1.4. Анализ свойств гибридных пшшгоптндаах продуктов гнпищ-производных crylllk

Суммарные белка клеток E.coll, трансформированных плазмидамя pTrctenk, pTrctenn и * pTrcteng, анализировали с помощью электрофореза. в деяатурирущпх условиях и иммуноблоттинга, используя юноспецпфяческиэ антитала- к токсинам тяпа tcnebrlcnis. Как видно из рис. 4, в указанных клонах синтезируются иммуноре активные полипептида, имеющие кажущиеся молекулярные масса около 80, 100 и 155 кДа соответственно, которые в общей совпадают о-рассчитанными значениями, а также оо значениях^ масс белков, созданных ранее на основе Cry1А(8) (рис. 2). В вкстпактах

- 155 кДа

- 100 кДа

- 80 кДа

- 66 кДа

- 63 кДа

б в

ь я

Рис. 4. Иммуноблоттинг белков клонов E.coll, трансформированных плазмидами pTrctenk (а,б), pTrctenn (в,г), pTrcteng (д,е) и препарата очищенного О-вндотоксина из B.t.tenebrlonla (s). В случаях (а), (в), (д) экстракцию белков E.coll проводили в буфере для биотестирования (см. разд. 2.1.3), в случаях (б), (г), (е) - в буфере для определения активности р-глюкуронидвзы.

клзток, содержащих pTrcteng, помимо интактного 155-кДа белка (TenG), наблздается также иммунорвактивный полипептид, который ! является, вероятно, продуктом протеолитического расщепления TenG.

Црэдставлвнные на рис.3 результаты анализа р-глвкуронидазной активности принципиально не различаются для клеток, содержащих •

/

pTrcteng и pTrctg, и иллюстрируют синтез этими клетками 155-кДа ' белков, обладающих гликуронидазной активностью.

В экстрактах. суммарных белков Б.coll, несущит pTrctenn, мы продемонстрировали наличие кнначпцинфосфотрансферазной активности с помощью анализа In situ в геле. Как видно из рис. 5, наряду с полноразмэрннм продуктом TenN. существенный вклад в КРТ-активность клеток вносит полипептид, мигрирующий аналогично ЮТИ. Это совпадает с результатами работы (Horte et al., 1988) по анализу НРТ-активности клеток E.coll, вкспрессируюсщх ген типа "Сгу1А(Ь)-КРП1". Такие результаты являются, по всей видимости, следствием протеолитического расщепления бифункциональных белков или инициацией трансляции гибридной ОРС в клетках E.coll с внутреннего мэтионинового кодона.

Проявление инсектицидных свойств гибридпкх полипептидов •

исследовали на личинках колорадского жука. Предварительные

«

результаты биотестирования указали на большую токсичность экстрактов бактерий, несущих pTrctenn, го сравнению с клетками клонов, содержащих pTretenk и pTrcteng. Это коррелирует с тем, что наибольшее количество потенциально инсектицидного белка в оптимальной для проведения биотестов растворимой форме присутствует именно в клетках, экспрессируадих ТепН (рис. 4). Как видно из табл. I, токсичность экстрактов клона Я.coll, несущего pTrctenn, ш уступает токсичности препарата, в котором в суспензию клеток клона -рКК?.33-2 добавляли раствор очищенных кристаллов B.t.tenebrtonla в

TN

— TenN

a 0 в г

Рис. 5. Канамнцинфосфотрапсферазная активность In situ в геле.

Клоны E.coll трансформированы плазмидами pTrctn (a), pTrctenn (0),

pT519Sneo (в, положительный контроль), рКК233-2 (г, отрицательный контроль).

.Таблица I.

Анализ инсектицидной активности в отношении личинок колорадского йука клонов E.coll, несущих указанные плазмида

Бактериальные клоны. Увеличение веса личинок по отношению к первоначальному,% Среднее количество погибших личинок на шестые сутки,Ж

на третьи сутки на шестые сутки

рКК233-2 164-22. 339±30 . 4

pTrctenn 104-39 87¿4I ' 47

рКК233-2 с добавлением СгуША 37-51 247-79 20

количестве, приблизительно эквимолярном содержанию

бифункционального белка в клетках pTrctenn, -что оценивали по интенсивности окрашивания соответствующих зон на иммуноблоте. Полученные данные свидетельствуют о том, что произведенная замена элемента последовательности CrylIIA на фрагмент из CrylA(a) не уменьшает токсичность белка по отношению к колорадскому куку и, вероятно, к прочим жесткокрылым. В очередной раз показано также, что слияние с ферментом HPTII не снижает инсектицидную активность эндотоксина. .

2. Получение и анализ трансгенных растений, экспрессирующих • бифункциональные белки "инсектотоксин - маркерный фермент"

2.1. Трансгенные растения табака и картофеля с введенным геном •\;ryIA(a)-GUS"

Сконструированный ген tg, кодирующий бифункциональный полипептид "CryIA(ñ)-GUS", клонировали в плазмидных компонентах, бинарных векторов pGV941 и pFCV002, трансформировали рекомбинатными плазмидами штаммы A.tvmefactena LGV3350 и GV3101 (рНР90ЕК), а также A.rhlzogenes А4, которые затем использовались для получения трансгенных растений табака и картофеля.

Регенерирующие noce трансформации методом листовых дисков растения Nlcotlana tabacum селектировали на среде, содержащей 100 мкг/мл канамицина, и убевдались в наличии NPT-активкости в экстрактах полученных растений (рис. 6).

Приведенные з табл. 2 результаты количественного определения глюхуронидазной активности указывают на то,, что е тканях рачительной части, трансформантов, в которые вводился ген tg, о'наруигоается р-глюкуронидазная . активность. ПЬ-.рокий диапазон равной глюкуронидазной активности, который долган коррелировать с

О

— NPTII

абвгдежз Рис. 6. Канамицинфосфотрансферазная активность In Bltu в геле. .Клон E.coll трансформирован плазмидой pT519Sneo (а, положительный контроль)., не трансформированное растение Ntc.tabacvm (0),' растештя трансформированы геном tt (в) и геном tg (г - з).

EEFSfiF^il

— 155 кДа

— 115 кДа

Рис. 7. Глтуронидазая активность In situ в геле. Клон E.coll, трансформированный плазмидой pTrctg и продуцирующий двудомегап;! полипвптид наряду с эндогенной р--глюкуронидазой (а); клон E.coll, не содержащий плазмид (б), нетрансформированные растении Nlc.tdbaam SR1 (в,г); растения трансформированы геном gas (д) и геном tg (е - и). Растительные экстракты получены из Fl-потомства различных линий трансформантов.

Таблица 2,

Распределение индивидуальных растений, трансформированных геном "инсектотоксин-глюкуронидаза", относительно глюкуронидазноЗ активности в их тканях -

Глюкуронндазная активность, ,пкмоль 4-Ми/(мин » иг белка)

Число растений с указанной активностью

<5 (фоновая флюоресценция) Б - 20 20-40 40-60 60-100

5

17 7 I 3

уровнем ншсопления инсектицидного продукта, подтзэрвдает целесообразность создания системы с использованием трансляционно слитых целевого и маркерного генов для эффективной селекции индивидуальных линий трансгенных растений с повышенным синтезом • инсектотоксина.

Как известно, ОРС генов в-эндотоксинов и их бифункциональных производных экспрессируются в растительных тканях с 'низкой эффективностью (Barton et al., 1987; Flschhoff et al., 1987; Vaeck et al., 1987). Это также подтверждается сравнением полученных нами растений с геном tg с растениями, трансформированными геном пнтактной глюкуронидазы, в которых ферментативная активность оказалась значительно выше. Несмотря на это, экстракты некоторых трансформантов tg и их потомства нами были успешно использованы для определения глюкуронидазной активности in situ в ПААГ после электрофореза в денатурирующих условиях. Как видно из рис. 7, глюкуронидазной активностью в таких растениях обладает интактный бифункциональный белок "Crj/IA(a)-GUS".

При анализе инсектицидных- свойств полученных трансгенных растений с использованием гусениц непарного шелкопряда L.dispar была обнаружена частичная устойчивость некоторых обладающих сравнительно высокой глюкуронидазной активностью растений к поражению личинками. Однако, мы не добились строгой воспроизводимости результатов и количественной оценки токсичности. Это объясняется тем, что табак не является естественной nmjctí для гусениц L.dlspar. Предварительной анализ потомства трансформантов на устойчивость по отношению к L.atlctlcalta и И.armígera также указывает на экспрессию в них инсектотоксина. Разницы в токсических свойствах растений с введенным геном "cryIA(a)-gus'' и служивших положительным контролем трансформантов геном tt не наблюдается.

Расщепление признака устойчивости к канамицину и сцепленной с ним глюкуронидазной активности в потомстве,* полученном после самоопыления трансгенных растений табака, проходит подобно доминантному признаку по Менделю, что согласуется с выводами работы (Budar, 1986).

Глюкуронидазная активность в растениях картофеля сорта Льврвянка, экспрессирующих гибридный ген "crj/IA(a)-gus", находится в пределах 6-15 пкмоль 4-Ш / (мин * мг белка). Достаточно чувствительный д._л анализа токсичности растений картофеля к чешуекрылым тест-объект нам выбрать не удалось.

2.2. Трансгенные растения табака и картофеля с введенным геном "сгуША-сгу1А(а )-nptII"

Для получения трансгенных растений, устойчивых к жесткокрылым, мы решили использовать сконструированный ген бифункционального бежа "инсектотоксин-КРТП". Любезно предоставленная С.В.Узбековой плазмида pGV941tn содержит ген, который отличается ">т присутствующего в pRT103tn лишь заменой терминатора гена VI ЕМЦК на терминатор гена нопалинсинтазы Тко&. Собственный ген селективного маркера HPTII,. происходящий из pGV941, в плазмиде pGV941tn удален. Плазмида pGV941utn также предоставлена С.В.Узбековой и отличается от pGV941tn наличием перед гибридным геном дополнительно последовательности усилителя трансляции ш из вируса табачной мозаики (Caille et al., 193Т).

Ncol-фрагыенты плазмид pGV941tn и pGV941cotn, содержащие последовательность OFC гибридного гена, которая включает кодирующие последовательности инеектотоксина CrylÀ(a) и частично NPTII (до 170-го кодона), заменялись яа Ncol-фрагмент pTrctenn, который, в "пою очередь, содержит последовательность ОРС terni, ограниченную на

З'-конце сайтом рестрикции из nptll с такими ко координатами. В результате были получены плазмиды pG7941tem и pGV941(jtenn, которые отличаются от pGV941tn и pGV941cotn заменой последовательности ОРС гена tn на ОРС гена tenn.

Сконструированными таким образом плазмидами трансформировали штаммы A.tmefaclens LGV3850 и A.rhizogenes А4 и затем использовали их для получения трансгенных растений табака и картофеля.

Селекция трансгенных растений табака после трансформации с помощью плазмид pGV941tenn и pG?941utenn проводилась на искусственной питательной среде, содержащей 30-50 мкг/мл Km. Устойчивость к канамицину обеспечивалась исключительно за счет экспрессии бифункционального белка "инсектотокси^-ЯРТП".

Встройку гетерологичной ДНК в растительный геном подтверждали с помощью полимеразной цепной реакции. Размер синтезируемых в ПЦР фрагментов ДНК соотвествует расчетному.

Экстракты трансгенных растений табака, проявляющих наибольшую устойчивость к канамицину, были использованы для определения NPT-активности In situ в ПААГ. Из рис. 8 видно, что, как и в случае экспрессии гибрида TenN в клетках E.coll, наибольшой NPT-активностью в экстрактах растений, .несущих ген этого бифункционального белка, обладает полипептид, мигрирующий аналогично NPTTI. Даже после применения специальных методов по устранению фоновых сигналов, вызванных активностью растительных протеинкиназ, NPT-активность интактного 100-кДа белка TenN оставалась слабо заметна. Подобная картина объясняется, по нашему мнению, интенсивным протеолитическим расщеплением бифункционального бежа в растительных тканях In vivo, скорее всего, в месте слияния ЛК-последовательностей токсичного и маркерного доменов.

Расщепление признака устойчивости к канаглщпну у ррстеъис

а о в г д

Рис. 8. Канамицинфосфотрансферазная активность In situ в геле-. Трансгенныв растения Я loot tana tabacwn трансформированы геном teim, содержащим последовательность усилителя трансляции u (a,ö), и не содержащим его (в,г). Клон E.coll, трансформированный плазмидой pTrctenn (д).

табака, прорсцонннх из семян после самоопыления трапсфорлантов tern, не отличалось от рассматривавшегося для потомства растений с геном tg (разд. 2.1). Для многих выращенных из семян растений экспрессия бифункционального белка ТепН была такова, что достаточно высокое содержание Km в среде (до 150 мкг/мл) совершенно но тормозило развитие растений. В тканях растений, гомозигстньс по признаку устойчивости, к канамицину, наблюдалось усиление НРТ-сигнала при анализе активности In situ в ПААГ. В настоящее врегля продолжаются наблюдения за потомством трансгешшх растений третьего поколения.

Сконструированный ген бифункционального белка "инсектотокспн-KFTII" сотрудник нашей лаборатории И.Л.Дридзе, сотрудник ИГЦ АН Беларуси С.Д.Курочкина и сотрудники НПО то картофелеводству Г.В.Рассадина и Н.О.Ерьева вводили также в растения картофеля сортов Дезнре, Львовянка п Жуковский ранний. Трансформантн отбирали на среде, содержащей 25-30 мкг/мл Km, что является достаточной селективной концентрацией для такой культуры, как картофель. Встройку гетерологичкой ДНК в растительный геном' подтверждали с помощью ПЦР. Как правило, экспрессия гена бифункционального белка обоспечпвала норлальшй рост трансформантов &а среде с указанной концентрацией антибиотика, но зачастую была недостаточна для их стабильного укоренения при вегетативном размножения. В то se время, контрольные нетрансфоргированные растения не развивались в присутствии используемых концентраций селективного антибиотика и погибали через 10-15 дней.

Три индивидуальные линии полученных трэнсгенпых растений картофеля были проанализированы на токсичность по отношению и колорадскому куку. Личинки на трансгешшх растениях существенно отставали в росте и развитии от контрольных. В то га время.

заметной токсичности ео время вксдаршанта с вэгетатевшш потомством полученных линий обнаружат, ш удалось, что отчасти объясняется неравноценность!) ливне способности используешх личинок пуков, во указывает тшшэ на необходимость увеличения вкспроссии токсичного белка.

Нами на было зыачано существенного усиления експреосш бифункционального гибрида при-анализе трвноганнцх растений табака и картофеля, полученных а пошщьо шшвыидц р(ЗУ941шгеш, по срашюияю с растениями, пол! ,вннша с помощь» р0?94иега1, т.о. в отсутствия усшштоля трансляции ы. Это указывает на необходимость дальнейшего поиска рэгуляторных олемэнтов, которые бы белее вффэктнвно усиливали экспрессию Енсектоттоошюв в растениях.

вывода

1. Сконструирован геп гибридного белка "минимальный. иисектотоксин Сгу1А(а) - глюкуронидаза" и показано' проявление продуктом такого гена как токсичности по отношении к чешуекрылым, так и маркерной глюкуронидавной активности.

2. Ограниченная в 3*-концевой части 565-ым кодоном последовательность гена специфичного к жесткокрылым Э-эндотоксина СгуТП А дополнепа гомологачннм фрагментом гена сгу1А(а) и сконструированы гены, где такая гибридная ОРС слита с кодирующими последователыгостями канамицинфосфотрансферазн (ЮТИ) и р-глтасуронидазы.

3. Анализ полипептидных продуктов этих. генов установил проявление бифункциональными белка;,га соответствующих ферментативных активностей и доказал, что использованный фрагмент последовательности СгуША целиком содерготт область, ответственную за токсичность по отношению к жесткокрылым.

4. Получены трачсгенные растения табака и картофеля, содержащие и экспрессирущие гены бифункциональных белков "Сгу 1А(а) - глюкуронидаза" ' и "СгуША - Сгу1А(а) канамицинфосфотрансфераза".

5. Показана эффективность применения системы гибридных генов типа "инсектотоксин-фермент" для чувствительной де жики инсектицидных белков по маркерной ферментативной, активности п трансгенных расте}шях и для первичной селекции трансформг.нтов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

I. Кузьиик Е.В., Шаденков A.A., Узбекова C.B., Еешжнш М.0.

Создание бифункциональных производных гена инсектотоксина Bacillus thuringtenata var.feuratafet для экспрессии в трансгенных растениях // Доклада Академии Наук СССР. 1991. Том 321, й 2. С.412-415.

- 2. Шаденков A.A., Кузьмин Е.В., Эйснер Г.П., Шемякин U.S. Экспрессия гибридного гена бифункционального белке "инсоктотоксин-глюкуронидаза" в трансгенных растениях табака // I Всесоюзный симпозиум "Новые метода биотехнологии растений". Пущзно, 1991. Тез. докл. С. 47.

3. Кузькин Е.В., Шаденков A.A., Узбекова C.B., Шошгаш И.О. Создание генов, кодирующих бифункциональные инсектицидные белки < маркерной ыстивностью для экспрессии в трансгенных растениях' // ] Всесоюзный симпозиум "Новые метода биотехнологии растений". Пущино, 1991. Тез. докл. С.22.

4. Шаденков A.A., Узбекова C.B., Кузыдш Е.В., Золотова Т.Б., Эйснер Г.И., Шемякин Ы.Ф. Экспрессия гибридного ген! бифункционального белка "инсектотоксин-глюкуронидаза" в трансгенны; растениях табака // Доклада /-:адемии Наук. 1992. .Том 325, $ I. С 183-186.

5. Шаденков A.A., Дридзе И.Л., Гетачзу Т.А., Курочкина С.Д. Узбекова C.B., Майсурян А.Н., Шемякин Ы.О. Конструирование ген токсичного для жесткокрылых белка "CRYIIIA-CRYIA(a)-NPTII" введение его в трансгенные растения картофеля // II Российски симпозиум "Новые метода биотехнологии растений". Пущино, 1993. Тез докл. С.59.

6. Шаденков A.A., Курочкина С.Д., Узбекова C.B..Дридзе И.Л. Хвдоева Н.В., Забенькова К.И., Шемякин М.Ф. Получение трансгешш

растений. картофеля, несущих производив гена инсектотоксина OrylA(a) Bacillus fhurlnglenalB таг. kuretdkt // II Российский сишюзиум "Новые метода биотехнологии растений". Пущино, 1993. Тез. докл. С.60.

7. Узбеком C.B.', Падепков A.A., Ковалева М.В., Куэьмяп В.В. Бифункциональные белки "инсектотоксин-NPT" в трансгенных растениях табака // II Российский симпозиум "Новые метода биотехнологии растений". Пущино, 1990. Тез. докл. С.54.

8. Шадвпков A.A., Кадыров P.M., Угбекова C.B., Кузьмин Е.В., Остершп А.Л., Честухика Г.Г., Шемякин U.0. Создание гена гибридного белка ка основе 0-эндотоксинов ВасШиз thiiringlenalD СгуША и Сгу1А(а) и экспрессия его производных в Escherichia coll // Молекулярная биология. 1993. Т.27. С»952-959.