Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Совместное культивирование видов рода Pleurotus (Fr.) P. Kumm. с дрожжами

ВАК РФ 03.02.12, Микология

Автореферат диссертации по теме "Совместное культивирование видов рода Pleurotus (Fr.) P. Kumm. с дрожжами"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

НОВОСЁЛОВА Дарья Николаевна

СОВМЕСТНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ВИДОВ РОДА РЬЕШОТУЗ (Ш.) Р. КЦММ.

С ДРОЖЖАМИ

Специальность 03.02.12 - микология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва-2011

2 1 АПР 2077

4844237

Работа выполнена на кафедре микологии и альгологии Биологического факультета Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Ольга Владимировна Камзолкина Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, отдел микологии, Институт ботаники имени Н.Г. Холодного

HAH Украины Нина Анатольевна Бисько член-корреспондент, доктор биологических наук, профессор, Факультет почвоведения

МГУ имени М.В. Ломоносова Иван Юрьевич Чернов

Ведущая организация: Пензенская государственная сельскохозяйственная академия (Пензенская ГСХА), г. Пенза

Защита состоится 13 мая 2011 г. в 15 час. 30 мин. на заседании Диссертационного совета Д 501.001.46 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук при Московском Государственном Университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991 Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, МГУ имени М.В. Ломоносова, Биологический факультет, аудитория М-1, тел./факс (495) 939-39-70.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Отзывы (в двух экземплярах) просим направлять по адресу: 119991 Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, МГУ, Биологический факультет, Кафедра физиологии растений, ученому секретарю Диссертационного совета Д 501.001.46. Факс (495) 939-39-70.

Автореферат разослан_2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук М.А. Гусаковская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Грибы рода Pleurotos широко распространены по всему земному шару и занимают второе место в мире по объему культивирования в промышленности. В искусственных условиях вешенка неприхотлива, обладает ценными вкусовыми качествами, выраженным «грибным» ароматом и широко культивируется в пищевых целях, а также является ценным объектом медицинской и фармацевтической промышленности, поскольку экстракты из мицелия и плодовых тел вешенки содержат различные биологически активные вещества, обладающие гиполипидемическим, противоаллергическим, гипотоническим, фунгицидным действиями (Макеева и др., 1998; Wang et al., 2005; Hu et al., 2006).

В природе вешенка обитает на различных породах живых и мертвых деревьев. Древесина состоит преимущественно из углеводов; она богата органическим углеродом, но бедна азотом, а значит, вешенка, как и все ксилотрофные грибы, развивается на древесине в условиях недостатка азота. В лабораторных условиях показана способность вешенки использовать клетки дрожжей, водорослей и бактерий, встречающихся на поверхности коры, в качестве дополнительного источника питания, а также активно захватывать нематод с помощью «ловчих» петель (Blanchette, Shaw, 1978; Hutchison, Barron, 1997; Barron, 2003). Большинство работ по исследованию механизмов взаимодействия вешенки с другими организмами проведены на Pleuroíus ostreatus и описывают совместные культуры гриба, в основном, с бактериями, а также с некоторыми видами дрожжей и водорослей на агаризованных средах (Barron, 1988; Cho et al., 2003).

Данные о практическом использовании совместных культур вешенки с бактериями, например, для повышения урожайности культивируемых грибов, малочисленны, имеют коммерчески-прикладной характер (Никитина, 2003). Комплексные исследования взаимодействия различных видов рода Pleuroíus с дрожжами на агаризованных средах и в процессе плодообразования ранее не проводились.

Цель работы: провести морфофизиологическое исследование совместных культур пяти видов рода Pleuroíus и эпифитных дрожжей аскомицетного и базидиомицетного аффинитета и изучить влияние дрожжей на процесс плодоношения вешенки. Для выполнения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Описать макро- и микроморфологические признаки мицелия вешенки в совместных культурах с дрожжами на различных агаризованных средах.

2. Определить из круга дрожжей пищевые предпочтения для каждого из пяти видов вешенки на агаризованных средах.

3. Изучить влияние дрожжей, определенных как пищевые предпочтения, на процесс плодоношения пяти видов вешенки.

4. Определить оптимальное сочетание объема и концентрации суспензии клеток дрожжей, вносимых в субстрат, для получения максимальной биомассы плодовых тел вешенки.

5. Провести биохимический анализ плодовых тел вешенки при совместном культивировании с дрожжами (анализ аминокислотного состава плодовых тел и спектра летучих органических веществ, определяющих запах плодовых тел).

Научная новизна. В представленной работе впервые проведен комплексный анализ взаимодействия пяти видов рода Р1ешоЬш с дрожжами, принадлежащими к разным систематическим группам. Изучены особенности макро- и микроморфологии мицелия в совместных культурах на агаризованных средах, выявлены специализированные структуры для контакта с дрожжевыми клетками (сосочковидные выросты, коралловидные гифы). Сосочковидные выросты образуются в присутствии как живых, так и мертвых клеток дрожжей, однако, формирование коралловидных гиф и образование контактов между гифами гриба и дрожжевыми клетками происходит только в присутствии живых клеток дрожжей. При росте на питательных средах, содержащих органические и неорганические источники азота и углерод, в присутствии клеток дрожжей мицелий вешенки использует доступные компоненты субстрата, то есть существует как сапротроф, и только в условиях острого недостатка азота и углерода (на голодном агаре) проявляет свойства паразита.

Полученные данные значительно расширяют и дополняют известную информацию о взаимодействии высших базидиальных грибов (на примере видов рода Р1еиго1ш) и дрожжей в совместной культуре. Для Р. сШторИеМш, Р. (¡¡атог и Р. eryngii данные о взаимодействии с дрожжами в совместной культуре получены впервые.

Практическая значимость работы. Предложен метод повышения урожая плодовых тел нескольких видов рода Р1еиго1ш с использованием дрожжей. Определены параметры совместного культивирования видов рода РкшоЬш с дрожжами, позволяющие ускорить рост мицелия гриба на субстрате и получить максимальный выход биомассы плодовых тел, а именно: сроки внесения суспензии живых клеток дрожжей, объем и концентрация суспензии дрожжей. Определены виды дрожжей, являющиеся пищевыми предпочтениями для каждого вида вешенки. Результаты проведенного исследования заложили основу для понимания морфофизиологических аспектов взаимодействия между различными видами грибов и дрожжей в искусственных условиях с целью последующего

использования совместных культур в процессе выращивания вешенки и других съедобных ксилотрофных грибов в условиях грибоводческого предприятия.

Апробация работы. Основные положения работы обсуждались на Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2006», «Ломоносов-2007» (Москва, 2006,2007), I (III) Всероссийской молодежной научно-практической конференции «Перспективы развития и проблемы современной ботаники» (Новосибирск, 2007), 2-ом Съезде микологов России (Москва, 2008), II Научно-практической конференции в рамках Третьего Фестиваля науки в городе Москве и Биотехнологической выставки-ярмарки «РосБиоТех-2008» (Москва, 2008).

Публикация. По теме диссертации опубликовано 9 работ; 1 статья сдана в печать; подана заявка на патент.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения и пяти глав, посвященных обзору литературы, материалам и методам исследований и трех глав с описанием результатов, иллюстраций и заключений к каждой главе, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на 136 страницах, содержит 27 таблиц и 34 рисунка. Список литературы включает 134 источника, из них 80 - зарубежные, в том числе 11 Интернет-источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. Обзор литературы.

В обзоре литературы приведены сведения по систематике, биологии и экологии, а также о практическом значении исследуемых видов рода Pleuroíus и дрожжей, собраны данные об истории изучения взаимодействия грибов с различными микроорганизмами на искусственных питательных средах (включая описание макро- и микроморфологических особенностей мицелия грибов, в том числе, вешенки в совместных культурах) и о практическом применении совместных культур грибов с микроорганизмами в пищевой промышленности, биотехнологии и грибоводстве.

Глава 2. Материалы и методы исследований.

Объекты исследования. Объектами исследования служили 5 наиболее распространенных в грибоводстве видов рода Pleurotus: Р. citrinopileatus Singer, сортовой штамм Santana 304Р; Р. djamor (Rumph. ex Fr.) Boedijn, сортовой штамм Santana RP; P. eryngii (DC.) Gillet, сортовой штамм Santana CP; P. ostreatus (Jacq.) P. Kumm., сортовой штамм HK-35; P. pulmonarius (Fr.) Quel., штамм БФ-32, природный изолят. Для создания совместных культур использовали 8 видов (10 штаммов) дрожжей: 5 видов дрожжей аскомицетного аффинитета (Debaryomyces hansenii (Zopf) Lodder & Kreger-van Rij, штамм

LAF3; Hanseniaspora warum (Niehaus) Shehata, Mrak & Phaff; Kluyveromyces marxianus (E.C. Hansen) Van der Walt, штамм LAF4; Metschnikowia pulcherrima Pitt & M.W. Mill.; Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E.C. Hansen, штаммы 3785, 3809, Moment) и 3 вида дрожжей базидиомицетного аффинитета {Cryptococcus albidus (Saito) C.E. Skinner; Cystofilobasidium capitatum (Fell, I.L. Hunter & Tallman) Oberw. & Bandoni; Rhodotorula minuta (Saito) F.C. Harrison).

Культивирование проводили на следующих агаризованных средах: голодный агар (ГА); среда Чапека (Семенов, 1990), модифицированная; среда для грибов, разрушающих древесину (Семенов, 1990), модифицированная; сусло-агар (CA). Мицелий вешенки инокулировали в центр чашки Петри с агаризованной средой блоком агара с мицелием (1 х 1 см) и инкубировали в термостатируемых условиях при 24 ± 1°С. Через 7-10 суток роста мицелия в монокультуре вносили водную суспензию дрожжей в виде 3 капель (150 мкл на поверхность среды) на расстоянии 1,5-2 см от края колонии гриба. Суспензию живых клеток дрожжей готовили разведением в стерильной воде. Суспензию мертвых клеток готовили кипячением клеток на водяной бане (30 мин.). Подсчет концентрации клеток дрожжей в суспензии проводили в камере Горяева.

Получение плодовых тел. Посевной мицелий грибов выращивали на пшеничном зерне (Lemke, 1972). В качестве субстратов для культивирования использовали подсолнечную лузгу, пшеничную солому и комбинированный субстрат (смесь подсолнечной лузги и соломы зонтичных растений), разработанный для P. eryngii с учетом особенностей биологии данного вида. Субстраты культивирования готовили по модифицированной методике Бухало с сотр. (Бухало и др., 2004). Влажность (влагосодержание) субстрата измеряли по общепринятой в грибоводстве методике (Интернет-сайт ООО «Экоцентр» www.ecocentr.ru). Банки с субстратом для плодоношения (объем 450 мл) инокулировали мицелием вешенки и инкубировали (24 ± 1°С) в течение 14—35 суток (в зависимости от вида вешенки) до полного зарастания субстрата мицелием. В опытные образцы вносили водную суспензию дрожжевых клеток сразу после инокуляции субстрата мицелием. В качестве контроля использовали субстрат без каких-либо добавок. Выгонку плодовых тел проводили в климатической камере при температуре 17-19 °С (15 °С для P. eryngii) и относительной влажности воздуха 85-99%.

Плодовые тела P. djamor получали также на грибоводческой ферме Ковалевых КФХ «Агродар» (Саратовская область). В полипропиленовые пакеты расфасовывали смесь подсолнечной лузги и зернового мицелия по 6 кг. При перемешивании лузги и зернового мицелия добавляли стерильно приготовленную суспензию дрожжей S. cerevisiae 3809 (3% по массе блока). Блоки инкубировали при 17 ± 1 °С и относительной

влажности 60-65%. Выгонку плодовых тел производили в климатической камере при 15 ± 1 "С и относительной влажности воздуха 87-92%.

В процессе культивирования на субстратах использовали суспензию живых клеток дрожжей и супернатант суспензии дрожжей S. cerevisiae Moment, полученный двумя способами: 1) суспензию клеток центрифугировали дважды сразу после разведения дрожжевых клеток в стерильной воде в режиме 5000об/15мин (далее обозначен как «Супернатант № 1»); 2) суспензию клеток центрифугировали дважды в том же режиме через 2 часа после разведения дрожжевых клеток в стерильной воде (далее обозначен как «Супернатант № 2»).

Анализ аминокислотного состава плодовых тел. Состав аминокислот определяли в плодовых телах P. citrinopileatus, выращенных на подсолнечной лузге совместно с дрожжами S. cerevisiae 3809 и раздельно. Подготовку образцов плодовых тел проводили методом кислотного гидролиза белка (Tsugita, Scheffler, 2004). Анализ проводили на базе отдела хроматографии НИИФХБ имени А.Н. Белозерского на жидкостном хроматографе Hitachi L-8800 (Япония).

Авали! спектра летучих соединений, определяющих запах плодовых тел. Хроматомасс-спектрометрический анализ был проведен на плодовых телах Р. citrinopileatus, выращенных на подсолнечной лузге совместно с дрожжами S. cerevisiae 3809 и раздельно. Экстракцию летучих соединений из плодовых тел проводили с использованием хлористого метилена (Wood et al., 2004). Анализ был проведен на базе лаборатории органического анализа химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова на хроматомасс-спектрометре Pegasus 4D фирмы LECO. Идентификацию соединений проводили с использованием библиотек масс-спектров NIST.

Методы микроскопирования. В работе использовали световой микроскоп Axioskop 40 FL Zeiss (увеличения *10, *20, х40 и х100), оснащенный цифровой камерой AxioCam MRc. Жизнеспособность дрожжевых клеток в монокультуре и при совместном культивировании с мицелием вешенки определяли путем окрашивания родамином 6Ж по методике Людовико (Ludovico et al., 2001) и последующего просмотра препаратов с использованием светофильтра № 15 (Zeiss). Электронные микрофотографии были получены с помощью сканирующего электронного микроскопа (СЭМ) Jeol JSM-6380LA. Подготовку материала проводили по методике Лобаковой с сотр. (Лобакова и др., 1995); перед просмотром препаратов на СЭМ на них был нанесен слой микрочастиц смеси золото-палладий в вакуумном напылителе «Giko» IB-3 Ion Coater.

Все эксперименты проводили в трех повторностях. Расчеты и статистическую обработку данных проводили по формулам (Дворецкий, 1971) и с помощью компьютерных программ «Microsoft Office Excel 2003» и «Statistika 6».

Результаты и обсуждение.

Глава 3. Изучение совместных культур вешенки и дрожжей па агаризованпых

питательных средах.

Описание микроморфологических признаков мицелия 5 видов вешенки в совместной культуре с дрожжами на голодном агаре. Исследованы совместные культуры (СК) 5 видов рода Pleurotus и 8 видов (10 штаммов) дрожжей; всего 50 комбинаций совместных культур. Мицелий 5 видов вешенки полностью зарастал микроколонии дрожжей на голодном агаре. Скорость роста мицелия в сторону микроколоний дрожжей не увеличивалась и не замедлялась. Дрожжевые клетки во всех совместных культурах в зоне контакта с мицелием были мертвые, что свидетельствовало о негативном влиянии мицелия вешенки на дрожжи.

Для большинства совместных культур вешенки и дрожжей было отмечено учащение ветвления гиф мицелия по сравнению с монокультурами в 2-8 раз в зависимости от вида вешенки. Частоту ветвления оценивали по расстоянию между соседними боковыми веточками одной гифы: в монокультурах это расстояние было 20100 мкм и более (рис. 1 а), в совместных культурах, как правило, 5-10 мкм (рис. 1 б). Увеличение числа боковых веточек, по-видимому, связано с увеличением поверхности мицелия для образования наибольшего числа контактов с дрожжевыми клетками.

В совместных культурах P. citrinopileatus и Cr. albidus, M. pulcherrima, S. cerevisiae (табл. 1), P. djamor и Cr. albidus, С. capitatum, К. marxianus, M. pulcherrima, R. minuta, S. cerevisiae, P. eryngii и S. cerevisiae, P. ostreatus и H. uvarum, R. minuta, S. cerevisiae, P. pulmonarius и H. uvarum, S. cerevisiae были обнаружены коралловидные гифы (рис. 1 в). Они представляют собой обильно ветвящиеся в апикальной части гифы (с расстоянием между боковыми веточками менее 5 мкм). Данные структуры необходимы для проникновения мицелия в микроколонии дрожжей и абсорбции питательных веществ (Hutchison, Barron, 1996).

Для контакта с дрожжевыми клетками на мицелии образовывались сосочковидные выросты. Это специализированные короткие выросты гиф, с помощью которых происходит передача питательных веществ из дрожжевой клетки в мицелий. Они образовывались на гифе группами (рис. 2 а, г) или одиночно (рис. 2 б, д); с одной дрожжевой клеткой контактировал один или два выроста (рис. 2 в).

Рис. I. Характер ветвления мицелия P. djamor: а - монокультура; б - СК с M. pulcherrima; в - коралловидная гифа в СК с R. minuta.

Рис. 2. Морфология контактов мицелия вешенки и клеток дрожжей: а - СК P. djamor и Cr. albidus; б - СК P. eryngii и H. uvarum; в - СК P. citrinopileatus и Cr. albidus; г - СК Л djamor и Д. minuta; д - СК P. pulmonarius и S. cerevisiae 3785 (а—г - световая микроскопия, д - СЭМ).

Контакты сосочковидных выростов мицелия с дрожжевыми клетками были обнаружены не во всех совместных культурах вешенки с дрожжами. Например, контакты гиф мицелия P. citrinopileatus с дрожжевыми клетками наблюдали только в совместных культурах с видами О. albidus, M. pulcherrima и S. cerevisiae (табл. 1).

Таблица 1. Микроморфология мицелия P. citrinopileatus в CK с 8 видами дрожжей на ГА.

Комбинации * Частота ветвления (мкм) Толщина гиф (мкм) СВ КГ Контакты

Основные Связывающие Эксплуатирующие

Монокультура 20 ±6 3,3 ± 0,3 2,5 ± 0,3 1,6 ±0,5 + - -

CK с Cr. albidus 5 ± 1 4,8 ± 0,6 2,8 ± 0,5 1,8 ±0,5 +++ + +++

CK с С. capitatum 5 ± 1 4,3 ± 0,3 2,5 ± 0,4 1,5 ±0,2 +++ _ +

CK с D. hansenii 20 ±5 3,3 ± 0,1 2,5 ± 0,3 1,7 ±0,2 + петли -

CK с H. uvarum 10±3 3,8 ± 0,4 2,5 ± 0,3 1,8 ±0,2 ++ - +

CK с К. marxianus 20 ±6 3,7 ±0,1 2,6 ± 0,6 1,6 ±0,3 +++ петли +

CK с M. pulcherrima 5 ± 2 4,8 ± 0,2 2,9 ±0,4 1,8 ±0,3 +++ + петли ++

CK с R. minuta 15 ± 4 5,0 ± 0,3 2,8 ± 0,5 1,8 ±0,3 ++ - +

CK с S. cerevisiae 3785 5± 1 4,8 ± 0,4 3,0 ±0,6 1,7 ± 0,3 ++ - +

CK с S. cerevisiae 3809 5 ± 1 4,9 ± 0,4 3,0 ±0,7 1,7 ±0,3 +++ + ++

CK с S. cerevisiae Moment 5± 1 4,8 ± 0,4 3,0 ± 0,7 1,7 ±0,3 ++ - ++

* Условные обозначения здесь и далее: СВ - сосочковидные выросты, КГ - коралловидные гифы. Количество выростов на гифах или контактов с дрожжевыми клетками: «+» - единичные (не более 1 в поле зрения), «++» - мало (от 1 до 3 в поле зрения), «+++» - много (более 3 в поле зрения).

Наличие контактов мицелия с дрожжевыми клетками бьио определяющим критерием при определении пищевых предпочтений для каждого вида вешенки. При выделении видов дрожжей в качестве пищевых предпочтений также учитывали следующие признаки: частота ветвления, количество сосочковидных выростов, наличие коралловидных гиф при культивировании вешенки совместно с дрожжами на голодном агаре. Для P. citrinopileatus в качестве пищевого преферендума выделены 3 вида дрожжей из 8 исследованных (Cr. albidus, M. pulcherrima, S. cerevisiae), для P. djamor показан наиболее широкий спектр пищевых предпочтений - 6 видов дрожжей (Cr. albidus, С. capitatum, К. marxianus, M. pulcherrima, R. minuta, S. cerevisiae), для P. eryngii продемонстрирован наиболее узкий спектр пищевых предпочтений — 1 вид S. cerevisiae, для P. ostreatus выделены 3 вида (Я. uvarum, R. minuta, S. cerevisiae) в качестве пищевого преферендума, для P. pulmonarius - 2 вида (Я. uvarum, S. cerevisiae).

Сравнение макро-, микроморфологии и скорости роста мицелии P. eryngii и Р. pulmonarius в совместных культурах с дрожжами на различных агаризованных средах. На всех исследованных средах мицелий двух видов вешенки полностью зарастал

микроколонии дрожжей S1. cerevisiae 3809 на поверхности среды. Максимальную скорость роста мицелия наблюдали на сусло-агаре: мицелий полностью зарастал поверхность среды СА на 12-14 сутки, тогда как другие среды - на 18-20 сутки. При культивировании вешенки в моно- и в совместных культурах с дрожжами на различных средах было показано, что контакты мицелия с дрожжевыми клетками образовывались только на голодном агаре (табл. 2).

Таблица 2. Микроморфология мицелия Р. eryngii в моно- (К) и совместной культурах (СК) с S. cerevisiae 3809 на разных средах.

Параметры ГА Среда Чапека, модифицированная С : N = 20: 1 Среда для грибов, разрушающих древесину, модиф. С : N = 7 : 1 СА С : N = 3 : 1

К СК К СК К СК К СК

Частота ветвления (мкм) 20 ±5 10±3 15 ± 5 5 ± 1 20 ±5 10±3 40 ±7 20 ±5

св - + - + - + - -

кг - + - - - - - -

Контакты - + - - - - - -

На среде Чапека с добавлением целлюлозы и среде для грибов, разрушающих древесину, на мицелии Р. eryngii образовывались сосочковидные выросты, но не было коралловидных гиф и контактов с дрожжевыми клетками, на сусло-агаре не наблюдали ни сосочковидных выростов, ни контактов мицелия с дрожжевыми клетками. По-видимому, мицелий вешенки использует в первую очередь доступные ресурсы среды и только при отсутствии источников питания в среде (на голодном агаре) переходит к паразитизму на дрожжевых клетках.

Сравнение микроморфологии мицелия вешенки в совместных культурах с живыми и мертвыми клетками дрожжей. При внесении в культуру вешенки Р. егу^и суспензии живых или мертвых клеток дрожжей наблюдали учащение ветвления гиф мицелия (табл. 3). Контакты сосочковидных выростов с дрожжевыми клетками (на ГА) наблюдали только при внесении в культуру вешенки суспензии живых клеток дрожжей. При внесении суспензии клеток, убитых кипячением, сосочковидных выростов образовывалось меньше (для Р. сИгтор^каШ, Р. сЦатог, Р. ри!топапш) или не образовывалось вовсе (для Р. егущИ, Р. (¡¡1гесйж), а коралловидных гиф и контактов мицелия с дрожжевыми клетками не наблюдали.

Таблица 3. Микроморфология мицелия P. eryngii в моно- и совместной культурах с S. cerevisiae Moment на ГА.

Параметры Контроль CK с S. cerevisiae Moment (живые) CK с S. cerevisiae Moment (мертвые)

Частота ветвления (мкм) 20 ± 7 10±3 5 ± 2

Сосочковидные выросты - ++ -

Коралловидные гифы - + -

Контакты - ++ -

В результате экспериментов на агаризованных средах было установлено, что мицелий пяти видов рода Pleurotus (P. citrinopileatus, P. djamor, P. eryngii, P. ostreatus, Р. pulmonarius) образует специализированные структуры для контакта с дрожжевыми клетками (сосочковидные выросты) в присутствии как живых, так и мертвых клеток дрожжей, однако формирование коралловидных гиф, а также образование контактов между гифами гриба и дрожжевыми клетками происходит только в присутствии живых клеток дрожжей. По-видимому, для образования данных структур необходимо комплексное воздействие дрожжей на мицелий как путем непосредственного контакта с гифами гриба, так и с помощью каких-либо дрожжевых внеклеточных метаболитов. Таким образом, полученные результаты согласуются с литературными данными о том, что вешенка проявляет свойства факультативного паразита при отсутствии доступных источников питания и является некротрофным паразитом по отношению к дрожжам (Barron, 2003; Hutchison, Barron, 1996).

Глава 4. Использование дрожжей в процессе культивирования вешенки на различных субстратах.

Сравнение параметров выгонки плодовых тел вешенки на подсолнечной лузге при добавлении суспензии дрожжей в разном объеме и концентрации. В задачи работы входило определение диапазона объемов и концентраций вносимой в субстрат суспензии дрожжей, при которых достигается максимальная биомасса плодовых тел. Диапазон объемов определяли так, чтобы влажность (влагосодержание) субстрата при внесении суспензии дрожжей не выходила за пределы, обеспечивающие нормальное развитие вешенки, т.е. 55-70% (Заикина и др., 2007). Влажность контрольного субстрата составляла 61,2 ± 2,0 %. Было установлено, что при внесении суспензии дрожжей в объеме 5, 10, 15,20 мл влажность субстрата колеблется в пределах 60-70%. При внесении 25 мл суспензии и более влажность субстрата была выше 70%.

Зарастание субстрата мицелием Р. фатог во всех образцах, в которые добавляли суспензию клеток дрожжей 5. сегеушае в различных объемах и концентрациях, произошло одновременно на 18 сутки после инокуляции субстрата мицелием, тогда как в контроле и при добавлении стерильной воды в различных объемах - на 20-21 сутки.

На гистограмме (рис. 3) представлены значения биомассы плодовых тел Р. ф'атог в контрольных образцах (т.е. без каких-либо добавок), при добавлении стерильной воды в объеме 5, 10, 15, 20 мл и при добавлении суспензии дрожжей в объеме 5, 10, 15, 20 мл и концентрации 102, 104, 106, 108 клеток/мл.

Рис. 3. Гистограмма распределения биомассы плодовых тел P. djamor при выгонке на подсолнечной лузге в зависимости от объема и концентрации суспензии S. cerevisiae Moment; К -контроль без каких-либо добавок.

Достоверное увеличение биомассы плодовых тел Р. сЦатог по сравнению с контролем было отмечено при добавлении суспензии дрожжей в концентрации 10б в объемах 5, 10 и 15 мл и в объеме 10 мл в концентрации 108 клеток/мл.

Для Р. оз1геаШ было показано, что зарастание субстрата мицелием вешенки во всех образцах, в которые добавляли суспензию клеток дрожжей Н. тагит в различных объемах и концентрациях, произошло одновременно на 14 сутки, в контроле и при

добавлении стерильной воды в различных объемах - на 18 сутки. На графике поверхности (рис. 5) оптимальное сочетание параметров объема и концентрации клеток в суспензии для получения максимального выхода биомассы плодовых тел обозначено темно-красной областью: это объем 5-10 мл в концентрации 106-108 клеток/мл. При прочих комбинациях параметров объема и концентрации клеток в суспензии биомасса плодовых тел Р. ояЬгеаЬш была ниже.

Рис. 4. График поверхности, изображающий зависимость биомассы плодовых тел Р. ostreatus от объема и концентрации вносимой суспензии Н. uvarum.

По результатам экспериментов, проведенных для двух видов вешенки Р. djamor и Р. ostreatus, можно сделать следующее заключение: скорость роста мицелия в образцах с добавлением суспензии клеток дрожжей была выше по сравнению с контролем, опытные образцы мицелия Р. djamor зарастали субстрат на 3 суток быстрее, Р. ostreatus - на 2 суток быстрее, чем контрольные, при этом скорость роста мицелия была практически одинаковой во всех опытных образцах мицелия независимо от объема и концентрации вносимой суспензии. Максимальный выход биомассы плодовых тел двух видов вешенки Р. djamor и Р. ostreatus был получен при внесении суспензии в объеме 10 мл и в концентрации 106 клеток/мл - 130,7% для Р. djamor и 160% для Р. ostreatus по сравнению с контролем.

Таким образом, для получения наибольшей прибавки биомассы плодовых тел двух видов вешенки был выделен диапазон объемов и концентраций клеток дрожжей в суспензии: объем 5-10 мл, концентрация 106-108 клеток/мл.

Сравнение параметров выгонки плодовых тел P. citrinopileatus на подсолнечной лузге при добавлении суспензии дрожжей и суперпатанта, полученного путем центрифугирования суспензии дрожжей. В эксперименте использовали дрожжи S. cerevisiae Moment (супензию дрожжей вносили в объеме 10 мл в концентрации 106 клеток/мл). Наибольшую скорость роста мицелия P. citrinopileatus на субстрате наблюдали при добавлении суспензии клеток дрожжей. Мицелий вешенки полностью зарастал субстрат в присутствии суспензии дрожжей на 14 сутки, в присутствии супернатанта № 1-2 - на 16 сутки, в контроле (т.е. без каких-либо добавок) и при добавлении стерильной воды - на 18 сутки (рис. 5).

сутки роста

Рис. 5. Скорость роста мицелия Р. сИппорПетиз при выгонке на подсолнечной лузге с добавлением суспензии дрожжей и супернатантов (с/н) № 1-2; К № 1 - контроль без каких-либо добавок; К № 2 - субстрат с добавлением стерильной воды.

При добавлении суспензии дрожжей биомасса плодовых тел Р. сИгторИеа составила 11,1 ± 2,0 г, при добавлении супернатанта № 1 - 8,5 ± 1,1 г, супернатанта № 2 -8,0 ± 1,0 г, в контроле № 1 - 7,2 ± 1,0 г, в контроле № 2 - 7,6 ± 0,5 г. Таким образом, добавление супернатанта суспензии дрожжей приводило к ускорению роста мицелия на субстрате, но не оказывало влияния на биомассу плодовых тел. Супернатант № 1, по-видимому, представлял собой раствор веществ, перешедших в воду с поверхности клеток

дрожжей; супернатант № 2, возможно, также содержал какие-либо метаболиты, выделенные дрожжами в процессе жизнедеятельности. Наиболее вероятно, что ускорение роста мицелия на субстрате обусловлено тем, что в виде супернатанта в субстрат вносили легкодоступный дополнительный источник питания, а именно вещества полисахаридной природы - водорастворимые глюканы клеточной стенки дрожжей.

Биомасса плодовых тел вешенки увеличивалась только в образцах, в которые добавляли суспензию клеток дрожжей. Жизнеспособные дрожжевые клетки были единично обнаружены в субстрате в течение всего времени роста гриба и его плодоношения. По-видимому, вешенка использовала в качестве дополнительного источника питания как метаболиты дрожжей, так и сами дрожжевые клетки. Таким образом, для достижения максимальной скорости роста гриба на субстрате и получения максимального урожая плодовых тел необходимы живые клетки дрожжей, которые являются дополнительным источником питания для мицелия в течение всего цикла роста и плодоношения на субстрате.

Сравнение параметров выгонкн плодовых тел Р. (Цатог на подсолнечной лузге и пшеничной соломе с добавлением суспензии дрожжей. В эксперименте сравнивали два наиболее распространенных в отечественном грибоводстве субстрата для культивирования вешенки: подсолнечную лузгу и пшеничную солому. Зарастание двух субстратов мицелием Р. сЦатог при добавлении суспензии дрожжей 5. сегеушае наблюдали на 2 суток раньше, чем в контроле (табл. 4).

Таблица 4. Параметры плодоношения Р. фатог при выгонке плодовых тел на подсолнечной лузге и пшеничной соломе.

Варианты Субстраты Время освоения субстрата (сутки) Время формирования плодовых тел (сутки) Масса плодовых тел с 1 банки (г)

Контроль Лузга 14 7 14,6 ± 2,0

Солома 15 6-10 2,3 ± 0,5

+ сегехшае Лузга 12 7 18,2 ±2,1

Солома 13 6-10 3,4 ±0,5

Повышение урожайности Р. фатог было зафиксировано как на подсолнечной лузге, так и на соломе: биомасса плодовых тел была выше на 47,8% на соломе и на 24,6% на подсолнечной лузге по сравнению с контролем. Таким образом, на двух субстратах в присутствии дрожжей скорость зарастания субстрата мицелием и биомасса плодовых тел

были выше, чем в контроле, т.е. положительный эффект от внесения суспензии дрожжей в субстрат был достигнут как на подсолнечной лузге, так и на соломе.

Выгонка плодовых тел 5 видов вешенки на подсолнечной лузге с добавлением суспензии дрожжей из круга пищевых предпочтений. На основании результатов эксперимента по определению круга пищевых предпочтений для каждого из 5 видов вешенки в процессе выгонки плодовых тел использовали виды/штаммы дрожжей, отобранные в качестве пищевых предпочтений для каждого вида вешенки. Супензию дрожжей вносили в субстрат в объеме 10 мл в концентрации 106 клеток/мл

1. Выгонка плодовых тел P. citrinopileatus. Культивирование вешенки проводили с использованием дрожжей Cr. albidus, М. pulcherrima, S. cerevisiae 3809, Moment Зарастание субстрата при добавлении дрожжей О. albidus и S. cerevisiae 3809, Moment наблюдали на 4 суток раньше, чем в контроле, при добавлении М. pulcherrima - на 2 суток раньше, чем в контроле (рис. 6).

Рис. 6. Скорость роста мицелия Р. сИппорНеаш при выгонке на подсолнечной лузге; К - контроль

без каких-либо добавок.

В 1-ой волне урожайность грибов повышалась на 43,6% в присутствии Cr. albidus и на 39,2-44,9% в присутствии S. cerevisiae 3809, Moment (табл. 5).

Таблица 5. Параметры плодоношения Р. сИгторНеаШ при выгонке на подсолнечной

лузге.

Варианты Время Время Максимальная Масса

освоения формирования высота плодовых тел

субстрата плодовых тел плодовых тел с 1 банки (г)

(сутки) (сутки) (мм) ± 5 мм

Контроль 1 волна 18 6-12 75 8,7 ± 1,0

2 волна - 8-12 50 4,2 ± 1,2

+ Cr. albidus 1 волна 16 6-8 80 12,5 ± 2,0

2 волна - 3-5 50 5,5 ±1,5

+ M. pulcherrima 1 волна 14 16 65 10,0 ±0,5

2 волна - 7 60 3,1 ±0,2

+ S. cerevisiae 3809 1 волна 16 6-8 90 15,5 ± 2,0

2 волна - 3-8 45 4,2 ±0,1

+ S. cerevisiae Moment 1 волна 16 6 85 14,9 ± 2,5

2 волна - 3-5 55 5,6 ±1,5

2. Выгонка плодовых тел P. djamor. В эксперименте были использованы дрожжи Cr. albidus, С. capitatum, К. marxianus, M. pulcherrima, Я minuta, S. cerevisiae Moment. Зарастание субстрата мицелием вешенки при добавлении дрожжей M. pulcherrima произошло на 14 сутки, при добавлении Cr. albidus, К. marxianus, R. minuta, S. cerevisiae Moment - на 16 сутки, при добавлении С. capitatum и в контроле - на 18 сутки. Биомасса плодовых тел P. djamor увеличивалась по сравнению с контролем в образцах, в которые добавляли дрожжи Cr. albidus (на 24,6%), С. capitatum (на 22,8%), S. cerevisiae Moment (на 49,1%) в 1 волне.

Прибавка урожайности плодовых тел Р. djamor была получена при использовании дрожжей как в условиях климатической камеры, так и в условиях грибоводческого предприятия. Внесение в субстрат суспензии дрожжей S. cerevisiae 3809 не повлияло на скорость зарастания блоков (табл. 6).

Биомасса урожая плодовых тел вешенки при добавлении суспензии дрожжей увеличивалась в 1 волне - на 52,8%, во 2 волне - на 18% в условиях грибоводческого предприятия.

Таблица 6. Параметры плодоношения Р. фатог Загнала ЯР при выгонке на подсолнечной

лузге в блоках по б кг.

Параметры 1-я волна 2-я волна

Контроль + S. cerevisiae Контроль + 5". cerevisiae

Время зарастания блоков (сутки) 11 11

Время формирования плодовых тел (сутки) 4-5 4-5 16-18 15-18

Масса плодовых тел с 1 блока (г) 690 ± 10 1055±145 360 425±105

3. Выгонка плодовых тел P. eiyngiL В эксперименте использовали дрожжи S. cerevisiae 3809. Субстрат полностью зарастал мицелием вешенки в присутствии суспензии дрожжей на 12 сутки, в контроле - на 14 сутки. Биомасса плодовых тел вешенки в контрольных образцах составляла 4,7 ± 2,5 г, в присутствии суспензии дрожжей - 9,8 ± 2,5 г, т.е. урожайность вешенки увеличивалась при добавлении суспензии дрожжей в 2,08 раза.

4. Выгонка плодовых тел P. ostreatus. В эксперименте использованы дрожжи Я. uvarum, R. minuta, S. cerevisiae 3809. Во всех образцах с добавлением дрожжей полное зарастание субстрата мицелием наблюдали на 14 сутки, в контроле - на 18 сутки. Биомасса плодовых тел P. ostreatus была выше, чем в контроле, в 1-ой волне в присутствии Н. uvarum - на 75,7%, в присутствии S. cerevisiae - на 52,8%.

5. Выгонка плодовых тел P. pulmonarius. В эксперименте использованы дрожжи Н. uvarum, S. cerevisiae Moment. Во всех образцах с добавлением дрожжей полное зарастание субстрата мицелием вешенки наблюдали на 15 сутки, в контроле - на 18 сутки. Биомасса плодовых тел P. pulmonarius была выше, чем в контроле, в 1-ой волне только в присутствии S. cerevisiae - на 43,8%.

В ходе проведенных экспериментов было установлено, что при соблюдении технологических параметров выгонки плодовые тела, выращенные с применением дрожжей, не отличались по внешнему виду от плодовых тел, выращенных по традиционным методикам. Добавление суспензии дрожжей проводили одновременно с посевом мицелия на субстрат; при этом стерильность банки/блока не нарушалась в процессе зарастания субстрата, что является важным условием выгонки грибов на грибоводческом предприятии.

При добавлении дрожжей из круга пищевых предпочтений в процессе культивирования прибавка урожайности изученных видов вешенки составила от 22,8 до 108%. В условиях грибоводческого предприятия получен урожай плодовых тел P. djamor на 52,8% больший при добавлении пекарских дрожжей по сравнению с монокультурой.

Глава 5. Биохимический анализ плодовых тел грибов, выращенных при совместном культивировании с дрожжами

Анализ аминокислотного состава плодовых тел P. citrinopileatus. Плодовые тела вешенки лимонношляпковой, выращенные с добавлением клеток S. cerevisiae Moment, отличались от контрольных только содержанием орнитина: в опытных образцах его содержание составляло 2,45 ± 0,43 мг/г сухого веса, в контрольных - 0,98 ± 0,07 мг/г. Орнитин представляет собой продукт распада аргинина, содержание которого было одинаково в опытных и контрольных образцах. Таким образом, различий в содержании аминокислот в плодовых телах, выращенных совместно с дрожжами и раздельно, не было выявлено. Пищевая ценность плодовых тел, выращенных с дрожжами, сохранялась: содержание общего белка в контрольных образцах составляло 21,5 ± 0,5 %, в присутствии дрожжей - 21,0 ± 1,0 %.

Анализ спектра летучих органических веществ, определяющих запах плодовых тел P. citrinopileatus. Предварительно был проведен органолептический анализ плодовых тел P. citrinopileatus. По результатам опроса 30 человек было показано, «гго запах плодовых тел вешенки, выращенных с добавлением суспензии S. cerevisiae Moment, отличался от запаха контрольных плодовых тел. В присутствии дрожжей наблюдали следующие изменения: 1) резкость и интенсивность запаха были выше, 2) был отмечен сладковатый «цветочный» оттенок запаха, 3) часть опрошенных отмечала также некоторый «рыбный» (селедочный) оттенок запаха.

В ходе хроматомасс-спектрометрического анализа были обнаружены различия как в составе спектра веществ, так и в количественном содержании веществ в плодовых телах, выращенных без дрожжей и с добавлением дрожжей S. cerevisiae Moment.

В таблице 7 представлен спектр органических соединений, обнаруженных в плодовых телах P. citrinopileatus, выращенных совместно с дрожжами S. cerevisiae Moment и без них.

Таблица 7. Спектр летучих органических веществ в плодовых телах Р. сИппорИеШия, выращенных на подсолнечной лузге.

Параметры Контроль + S. cerevisiae Moment

Ы-этилметилбензенсульфонамид + +

п-гексадекановая кислота + +

2-метиленциклогексанэтанол + +

2-метил-3-метокси-(4Н)-пиран-4-он + +

2-ноненаль - +

2-оксогексадекановая кислота, метиловый эфир + +

2-пентилфуран + +

3-октанол + +

3-октанон + +

3,4-диметоксибензенметанол + +

5-метил-2-(4-пиридил)-индол - +

9,12-октадекадиеновая кислота + +

Алкиламид - +

Бензенацетальдегид + +

Бензилбензоат + +

Гексаналь + +

Децен - +

Диметилсульфон + +

Додекановая кислота + +

Индол + +

Индол-З-ацетальдегид + +

Нонановая кислота + +

Ноненаль + +

Октановая кислота - +

Пентадекановая кислота + +

Тетрадекановая кислота + +

Трибутилацетилцитрат - +

В таблице 8 представлены химическая природа, химические свойства и характеристика запаха органических соединений, обнаруженных только в плодовых телах, выращенных с дрожжами (Химия, 1998; Lizarraga-Guerra et al., 1997; Wood et al., 2004; Интернет-сайт Химической Энциклопедии www.xumuk.ru).

Таблица 8. Характеристика летучих органических веществ, обнаруженных только в плодовых телах P. citrinopileatus, выращенных на подсолнечной лузге совместно с дрожжами S. cerevisiae Moment.

Параметры Химическая природа Нахождение в природе, использование Оттенок запаха

2-ноненаль альдегид масличные растения маслянистый

5-метил-2-(4-пиридил)-индол азотсодержащее гетероциклическое соединение эфирные масла жасмина, цитрусовых растений цветочный бальзамический

Алкиламид производные высших жирных кислот и аминоспиртов эмульгаторы, стабилизаторы, консерванты рыбный

Децен алкен ароматизатор, используется для производства масел, в фармакологии неизвестно

Октановая кислота жирная кислота кокосовое масло, сахаробразующие растения сладкий

Трибутилацетилцитрат производное лимонной кислоты ароматизатор, усилитель запаха растительный

Методом хроматомасс-спектрометрии были выявлены различия в содержании некоторых веществ в плодовых телах вешенки, выращенных совместно с дрожжами и без них. Содержание 2-пентилфурана в контрольных образцах составляло 0,1-0,13 мкг/г сухого веса, в опытных образцах - 0,15-0,45 мкг/г; содержание индола в контрольных образцах составляло 0,03-0,13 мкг/г, в опытных образцах - 0,35-0,55 мкг/г; содержание индол-3-ацетальдегида в контрольных образцах составляло 0,32-0,49 мкг/г, в опытных образцах- 0,57-1,14 мкг/г.

Аромат грибов зависит от состава среды/субстрата культивирования и от условий развития гриба (Jong, Birmingham, 1993). Отмеченное в эксперименте изменение запаха плодовых тел P. citrinopileatus, вероятно, обусловлено влиянием внесенных дрожжевых клеток в субстрат. 2-пентилфуран и трибутилацетилцитрат обладают свойствами усиления запаха, повышенная концентрация 2-пентилфурана и содержание трибутилацетилцитрата в плодовых телах, выращенных с дрожжами, может объяснять усиление резкости и стойкости запаха вешенки. Октановая кислота и производные индола обладают сладковатым бальзамическим фруктово-цветочным запахом, с наличием октановой

кислоты и повышенной концентрацией (по сравнению с контролем) индольных соединений может быть связан «цветочный» оттенок запаха вешенки, выращенной с дрожжами. Алкиламид, как и все азотсодержащие соединения, обладает рыбным запахом. Вероятно, его присутствие объясняет «селедочный» оттенок запаха плодовых тел вешенки, выращенной с дрожжами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучение совместных культур базидиальных грибов и микроорганизмов проводятся с середины ХХ-го века, однако большинство из них имеют экологическое значение и теоретическую направленность. Сведения о практическом использовании совместных культур с целью повышения урожайности культивируемых грибов малочисленны, имеют коммерчески-прикладной характер и не описывают механизмов взаимодействия грибов с микроорганизмами.

Проведенное нами комплексное исследование микроморфологии мицелия 5 видов рода Р1еиго1ш выявило специализированные структуры для контакта с дрожжевыми клетками: сосочковидные выросты, образующиеся в присутствии живых и мертвых клеток дрожжей, и коралловидные гифы с многочисленными контактами с дрожжевыми клетками, формирующиеся только в присутствии живых клеток дрожжей. Продемонстрировано потребление мицелием вешенки в первую очередь доступных источников углерода и азота в субстрате (сапротрофный способ питания) и использование живых клеток дрожжей в условиях острого недостатка азота и углерода (некротрофный паразитизм). В ходе проведенного анализа совместных культур 5 видов рода Р1гиго1ш и 8 видов дрожжей для всех изученных видов вешенки был определен круг дрожжей, являющихся пищевыми предпочтениями для данного вида. Каждый вид вешенки имел определенный набор (широкий/узкий) видов дрожжей с общим для всех видом ЕассЬаготусех сеге\ч$1ае. Полученные данные позволили значительно расширить и дополнить известную информацию о взаимодействии высших базидиальных грибов (на примере вешенки) и дрожжей в совместной культуре.

Добавление дрожжей в субстрат культивирования не снижает качества плодовых тел и не требует существенных методических изменений процесса культивирования при значительном повышении урожайности грибов. Максимальный выход биомассы плодовых тел получен при внесении в субстрат суспензии живых клеток дрожжей. Клетки дрожжей сохраняют жизнеспособность в течение всего цикла выгонки плодовых тел. Плодовые тела, выращенные совместно с дрожжами 5. сегеушае, обладают высокой пищевой ценностью и широкой гаммой оттенков запаха.

Выводы

1. Впервые проведено морфофнзиологическое исследование совместных культур пяти видов рода Р1еигоШ с клетками дрожжей аско- и базидиомицетного аффинитета в процессе вегетативного роста и плодообразования.

2. Выявлены отличные от монокультур признаки микроморфологии мицелия в совместных культурах видов рода Р1еиго(«5 с живыми клетками дрожжей на голодном агаре: специализированные структуры, обеспечивающие контакты с дрожжевыми клетками (сосочковидные выросты и коралловидные гифы) и увеличение частоты ветвления гиф мицелия в 2-8 раз.

3. Для каждого вида рода Р1еиго1ия определены пищевые предпочтения из круга используемых видов дрожжей. Наиболее широкий спектр пищевых предпочтений характерен для вида Р. сЦатог, наиболее узкий спектр - для вида Р. егуп&1

4. Показано, что максимальная биомасса плодовых тел Р1еиго1ш фатог и Р. о$1геа1т достигается при внесении суспензии клеток дрожжей в объеме 1,5-3 % от объема субстрата в концентрации 10е—108 клеток/мл.

5. Совместное культивирование видов рода РкиШю с дрожжами из круга пищевых предпочтений позволило увеличить выход биомассы плодовых тел вешенки в условиях климатической камеры в зависимости от вида на 22,8-108 %; в условиях грибоводческого предприятия - на 52,8% (для Р. сЦатог).

6. Продемонстрировано сходство в содержании общего белка и в составе аминокислот в плодовых телах Р1еигоШ сИг^порНеаШ при совместном культивировании с клетками БассЫготусев сеге^хае и без них.

7. Выявлены качественные и количественные отличия в спектре летучих органических соединений, определяющих запах плодовых тел Р1еиго1и$ сИппорйеМт, культивируемых совместно с Басскаготусе^ сегеушяе и без дрожжей. Только в плодовых телах, выращенных с применением дрожжей, были обнаружены 2-ноненаль, 5-метил-2-(4-пиридил)-индол, алкиламид, децен, октановая кислота, трибутилацетилцитрат. При выращивании плодовых тел совместно с дрожжами отмечено повышенное содержание 2-пентилфурана и производных индола по сравнению с контролем.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи, опубликованные в журналах, рекомендованных ВАК для публикации основных положений по теме диссертации.

1. Савельева Д.Н.*, Камзолкина О.В. Совместное культивирование некоторых видов рода Pleurotas с эпифитными дрожжами // Микологии в фитопатология. - 2009. - Т. 43. - Вып. 1. - С. 45-52.

2. Новосёлова Д.Н., Камзолкина О.В. Культивирование Pleurotus osireatus (Jacq.) Р. Komm, совместно с дрожжами // Вестник Московского Университета. Серия биологическая (принята к печати).

Прочие статьи.

3. СавельеваД.Н.*, Камзолкина О.В. Культивирование съедобных грибов совместно с дрожжами // Школа грибоводства. - 2008. - № б (54). - С. 48-50.

Тезисы, материалы конференций.

1. Савельева Д.И.* Об изучении чистых культур базидиомицетов // Ломоносов-2006: Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых, секция «Биология»; 12-15 апреля 2006 г., Москва, МГУ, Биологический факультет: Тезисы докладов. - М.: МАКС Пресс, 2006. - С. 195.

2. Савельева Д.Н.* Взаимодействие высших съедобных базидиомицетов и дрожжей в чистой культуре // Ломоносов-2007: Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых, секция «Биология»; 11-14 апреля 2007 г., Москва, МГУ имени М.В. Ломоносова, биологический факультет: Тезисы докладов. - М.: МАКС Пресс, 2006. - С. 101-102.

3. Savelieva D.N.* Interactions between Kuehneromyces mutabilis and Saccharomyces cerevisiae in mixed culture // XV Congress of European Mycologists. Abstracts. - St Petersburg: TREEART LLC. 2007. - P. 203-204.

4. Савельева Д.Н.*, Камзолкина О.В. Совместное культивирование ксилотрофного базидиомицета Flammutina velutipes (Curt.: Fr.) Sing, и дрожжей // Перспективы развития и проблемы современной ботаники: Материалы I (III) Всероссийской молодежной научно-практической конференции ботаников в Новосибирске. - Новосибирск: Изд-во СО РАН, 2007.-С. 189-192.

5. Савельева Д.Н.*, Камзолкина О.В. Взаимодействие съедобного ксилотрофного базидиомицета Pleurotus eryngii (DC.) Gillet и эпифитных дрожжей в культуре // Современная микология в России. Том 2. Материалы 2-го Съезда микологов России. М.: Национальная академия микологии, 2008. - С. 42-43.

6. Савельева ДМ.*, Смирнов И. А. Культивирование съедобных грибов Pleurotus spp. совместно с дрожжами и цианобактериями // Перспективы развития инноваций в биологии: Материалы II Научно-практической конференции в рамках Третьего Фестиваля науки в городе Москве и Биотехнологической выставки-ярмарки «РосБиоТех-2008» (5-7 ноября 2008 года, г. Москва) / МГУ имени М.В. Ломоносова, Биологический факультет. -М.: Инноватика, 2008. - С. 80-83.

7. Савельева Д.Н.* Культивирование ксилотрофного базидиомицета Pleurotus pulmonarius (Fr.) Quel, совместно с дрожжами и цианобактериями // Изучение грибов в биогеоценозах: сборник материалов V Международной конференции. - Пермь, 2009. - С. 221-225.

8. Новосёлова Д.Н., Камзодкина О.В., Дьяков М.Ю., Кудрявцева O.A. Способ культивирования съедобных ксилотрофных базидиомицетов. Заявка на патент № 2009127497/10(038227).

* поменяла фамилию на Новосёлова в 2009 г.

Благодарности. Выражаю искреннюю благодарность научному руководителю Ольге Владимировне Камзолкиной и коллективу кафедры микологии и альгологии Биологического факультета МГУ за помощь и всестороннюю поддержку при выполнении работы, а также всему коллективу ООО ПКП «Сантана» (г. Саратов) за предоставление штаммов грибов и помощь в проведении некоторых экспериментов.

Подписано в печать 28.03.2011 Формат 60x88 1/16. Объем 1.0 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 1097 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Новосёлова, Дарья Николаевна

Список сокращений

Введение

Цель и задачи.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Систематика, биология и экология видов рода Pleurotus (Fr.) P. Kumm.

1.1.1. Систематика видов рода Pleurotus (Fr.) P. Kumm.

1.1.2. Биология и экология видов рода Pleurotus (Fr.) P. Kumm.

1.2. Практическое значение видов рода Pleurotus (Fr.) P. Kumm.

1.2.1. Культивирование видов рода Pleurotus (Fr.) P. Kumm.

1.2.2. Применение грибов рода Pleurotus для утилизации отходов различных 22 отраслей промышленности.

1.2.3. Медицинские свойства грибов рода Pleurotus.

1.2.4. Летучие органические вещества, определяющие запах плодовых тел 25 грибов рода Pleurotus.

1.3. Систематика, биология и экология видов дрожжей, исследованных в работе.

1.3.1. Систематика видов дрожжей, исследованных в работе.

1.3.2. Биология и экология видов дрожжей, исследованных в работе.

1.4. Практическое значение видов дрожжей, исследованных в работе.

1.5. Совместные культуры грибов и микроорганизмов.

1.5.1. Совместные культуры грибов и микроорганизмов на различных 38 питательных средах.

1.5.2. Совместные культуры грибов и микроорганизмов, используемые в 43 промышленности.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Культивирование на агаризованных средах.

2.3. Получение плодовых тел.

2.4. Анализ аминокислотного состава плодовых тел.

2.5. Анализ летучих соединений, составляющих запах плодовых тел.

2.6. Методы микроскопирования.

2.7. Построение графиков.

2.8. Расчеты и статистическая обработка данных.

Глава 3. Изучение совместных культур вешенки и дрожжей на 59 агаризованных питательных средах.

3.1. Описание микроморфологических признаков мицелия 5 видов вешенки в 59 совместной культуре с дрожжами на голодном агаре.

3.2. Изучение взаимодействия вешенки и дрожжей при различных условиях 68 совместного культивирования на агаризованных средах.

3.2.1. Влияние концентрации суспензии дрожжей на скорость роста Р. о$1геШш 68 в совместной культуре на голодном агаре.

3.2.2. Сравнение макро-, микроморфологии и скорости роста мицелия Р. егущи 70 и Р. риЬпопапия в совместных культурах с дрожжами на различных агаризованных средах.

3.2.3. Сравнение микроморфологии мицелия вешенки в совместных культурах с 74 живыми и мертвыми клетками дрожжей.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Совместное культивирование видов рода Pleurotus (Fr.) P. Kumm. с дрожжами"

Грибы рода Pleurotus широко распространены по всему Земному шару и занимают второе место в мире по объему культивирования в- промышленности. Исследованию1 биологии и условий культивирования видов вешенки посвящены обзоры и статьи-отечественных и зарубежных авторов (Бисько и др., 1983; Бисько, Дудка, 1987; Stamets, 2000). Вешенка богата белком, витаминами, микроэлементами, биологически активными, веществами, которые могут использоваться в пищевой и фармацевтической! промышленности, медицине и парфюмерии. Вешенка, как и другие ксилотрофные грибы, обладает высокой скоростью роста, обильно плодоносит, большинство видов неприхотливы к условиям культивирования и могут развиваться на широком спектре субстратов растительного происхождения. Грибы выращивают на соломе, растительных остатках, опилках, обрезках древесины, следовательно, производство грибов тесно связано с биологической конверсией отходов сельскохозяйственной и деревообрабатывающей промышленности (Philippoussis et al., 2000), что особенно важно для поддержания чистоты окружающей среды.

В природе вешенка обитает на различных породах живых и мертвых деревьев. Древесина состоит преимущественно из углеводов; она богата органическим углеродом, но бедна азотом, а значит, вешенка, как и все ксилотрофные грибы, развивается на древесине в условиях недостатка азота. В лабораторных условиях показана способность вешенки использовать клетки дрожжей, водорослей и бактерий, встречающихся на поверхности коры, в качестве дополнительного источника питания, а также активно захватывать нематод с помощью «ловчих» петель (Blanchette, Shaw, 1978; Hutchison, Barron, 1997; Barron, 2003). Механизмы таких взаимодействий описаны в серии работ Бэррона с соавторами. Однако большинство работ проведены на P. ostreatus и описывают совместные культуры вешенки, в основном, с бактериями на различных агаризованных средах. Крайне мало работ касается описания совместных культур вешенки с дрожжами, которые являются распространенным компонентом филлопланы и поверхности' древесины. Комплексные исследования взаимодействия различных видов Pleurotus с дрожжами на агаризованных средах и в процессе плодообразования гриба ранее не проводились.

Совместные культуры высших грибов, в том числе вешенки, и микроорганизмов используются для повышения выхода продукции биологически активных веществ мицелия (Паносян, Авакян, 1974; Экологическая роль., 1986), а также для увеличения выхода съедобной биомассы мицелия (Никитина, 2003). Свойство грибов использовать микроорганизмы в качестве источника питания представляет научный интерес для понимания взаимоотношений между различными организмами в природных условиях, а также открывает перспективу использования совместных культур съедобных мицелиальных грибов и нетоксичных для человека и животных штаммов дрожжей или бактерий в биотехнологии и грибоводстве.

Цель работы: провести морфофизиологическое исследование совместных культур пяти видов рода РкиШш и эпифитных дрожжей аскомицетного и базидиомицетного аффинитета и изучить влияние дрожжей на процесс плодоношения вешенки.

Для выполнения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Описать макро- и микроморфологические признаки мицелия вешенки в совместных культурах с дрожжами на различных агаризованных средах.

2. Определить из круга дрожжей пищевые предпочтения для каждого из пяти видов вешенки на агаризованных средах.

3. Изучить влияние дрожжей, определенных как пищевые предпочтения, на процесс плодоношения пяти видов вешенки.

4. Определить оптимальное сочетание объема и концентрации суспензии клеток дрожжей, вносимых в субстрат, для получения максимальной биомассы плодовых тел вешенки.

5. Провести биохимический анализ плодовых тел вешенки при совместном культивировании с дрожжами (анализ аминокислотного состава плодовых тел и спектра летучих органических веществ, определяющих запах плодовых тел).

Заключение Диссертация по теме "Микология", Новосёлова, Дарья Николаевна

Выводы

1. Впервые проведено морфофизнологическое исследование совместных культур пяти видов рода Р1еиго1ш с клетками дрожжей аско- и базидиомицетного аффинитета в процессе вегетативного роста и плодообразования.

2. Выявлены отличные от монокультур признаки микроморфологии мицелия в совместных культурах видов рода Р1еиго1т с живыми клетками дрожжей на голодном агаре: специализированные структуры, обеспечивающие контакты с дрожжевыми клетками (сосочковидные выросты и коралловидные гифы) и увеличение частоты ветвления гиф мицелия в 2-8 раз.

3. Для каждого вида рода Р1еиШш определены пищевые предпочтения из круга используемых видов дрожжей. Наиболее широкий спектр пищевых предпочтений характерен для вида Р. ф'атог, наиболее узкий спектр - для вида Р. егущп.

4. Показано, что максимальная биомасса плодовых тел Р1еигоШ ф'атог и Р. оя^есЛт достигается при внесении суспензии клеток дрожжей в объеме 1,5-3% от объема субстрата в концентрации 106-108 клеток/мл.

5. Совместное культивирование видов рода РЫигоШз с дрожжами из круга пищевых предпочтений позволило увеличить выход биомассы плодовых тел вешенки в условиях климатической камеры в зависимости от вида на 22,8-108%, в условиях грибоводческого предприятия - на 52,8% (для Р ф'атог).

6. Продемонстрировано сходство в содержании общего белка и в составе аминокислот в плодовых телах Р1еиго1ив сИггпорИеаШв при совместном культивировании с клетками ЗассНаготусея сегеугягае и без них.

7. Выявлены качественные и количественные отличия в спектре летучих органических соединений, определяющих запах плодовых тел Р1еигоШз сИгторИеаШ, культивируемых совместно с БасскаготусеБ сегеугягае и без дрожжей. Только в плодовых телах, выращенных с применением дрожжей, были обнаружены 2-ноненаль, 5-метил-2-(4-пиридил)-индол, алкиламид, децен, октановая кислота, трибутилацетилцитрат. При выращивании плодовых тел совместно с дрожжами отмечено повышенное содержание 2-пентилфурана и производных индола по сравнению с контролем.

Заключение.

Биохимический анализ плодовых тел Р. сНгторИеаШ показал, что пищевая ценность плодовых тел, выращенных совместно с дрожжами & се/еушае и раздельно, была одинаковой: общее содержание белковой продукции составляло около 21%. Различий в содержании аминокислот в плодовых телах, выращенных без и с применением дрожжей, не было.

Результаты хромато-масс-спектрометрического анализа плодовых тел косвенно подтвердили данные органолептического анализа, полученные при социологическом опросе людей относительно изменения запаха грибов при выращивании их совместно с дрожжами. Наличие сладковатых «цветочных» тонов в запахе плодовых тел Р. сНгторИеШт, выращенных совместно с дрожжами, может быть обусловлено наличием октановой кислоты и повышенным содержанием производных индола, «рыбный» запах -наличием алкиламидов; усиление запаха может быть связано с содержанием трибутилацетилцитрата и повышенной концентрацией 2-пентилфурана.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Новосёлова, Дарья Николаевна, Москва

1. Бабицкая В.Г., Стахеев И.В., Костина A.M., Вадецкий Б.Ю. Образование белка смешанными культурами гриба Pénicillium digitatum 24П и дрожжей // Микробиологическая промышленность. - 1977. -№ 11. - С. 32-34.

2. Бабьева И.П. Что такое дрожжи? // Современные проблемы микологии, альгологии и фитопатологии (сборник статей). М.: МГУ - ИД «Муравей», 1998. - С. 142-144.

3. Бабьева И.П., Чернов И.Ю. Биология дрожжей. М.: Товарищество научных изданий КМК, 2004. - 221 с.

4. Барсукова Т.Н., Гарибова JI.B., Иванов А.И. Эколого-биологическая характеристика Pleurotus pulmonarius (Fr.) Quel. Il Микология и фитопатология, 1989.-Т. 23.-Вып. 1.-С. 14-19.

5. Биосинтез микроорганизмами нуклеаз и протеаз. М.: «Наука», 1979. - 294 с.

6. Бисько H.A., Бухало А.С, Вассер С.П. Высшие съедобные базидиомицеты в поверхностной и глубинной культуре. Киев: Наукова думка, 1983. - 312.

7. Бисько И.А., Дудка И.А. Биология и культивирование съедобных грибов рода вешенка. Киев: Наукова думка, 1987. - 145 с.

8. Богданов В.М. Микробиология молока и молочных продуктов. М.: Изд-во «Пищевая промышленность», 1969. 368 с.

9. Бухало A.C., Бисько H.A., Соломко Э.Ф., Билай В.Т., Митропольская Н.Ю., Поединок H.JL, Гродзинская A.A., Михайлова О.Б. Культивирование съедобных и лекарственных грибов / Под общей ред. Бухало A.C. / Киев: «Чернобыльинтеринформ», 2004. 128 с.

10. Виноградова С.П., Кушнир С.Н. Биосинтез гидролитических ферментов при совместном культивировании макро- и микромицетов // Прикладная биохимия и микробиология. 2003. - Т. 39. - № 6. - С. 573-575.

11. Гарибова Л.В., Сидорова И.И. Грибы. Энциклопедия природы России. М.: 1999. -352 с.

12. Герасименя В.П., Ефременкова О.В., Камзолкина О.В., Богуш Т.А., Соболев Л.А., Орлов А.Е., Конопля Е.Ф., Путырский Л.А., Милевич Т.И., Анисимов Д.Г.,

13. Капранов Г.Е. Препарат, влияющий на тканевой обмен, и применение штамма Pleurotus ostreatus 1137 для его получения. Патент РФ 2192873, 20.11.2002.

14. Денисова Н.П. Лечебные свойства грибов. Этномикологический очерк. СПб: Изд-во СПбГМУ, 1998. - 59 с.

15. Дворецкий M.J1. Пособие по вариационной статистике. Изд. 3-е, перераб. и доп. -М.: «Лесная промышленность», 1971. 104 с.

16. Блинов Н.П. Основы биотехнологии. СПб: Изд. фирма «Наука», 1995. - 600 с.

17. Егоров Н.С., Ландау Н.С. Биосинтез биологически активных соединений смешанными культурами микроорганизмов // Прикладная биохимия и микробиология. 1982. - Т. 18. - Вып. 6. - С. 835-849.

18. Зашеина H.A., Коваленко А.Е., Галынкин В.А., Дьяков Ю.Т., Тишенков А.Д. Основы биотехнологии высших грибов. СПб: «Проспект Науки», 2007. - 336 с.

19. Камзолкина О.В. Микроморфология и ультраструктура агарикоидных грибов на разных стадиях жизненных циклов. Мат. дис. на соискание ученой степени д.б.н. 2005. 225 с.

20. Краснопольская Л.М., Белитский И.В., Федорова Г.Б., Катруха Г.С. Pleurotus djamor. методы культивирования и1 антимикробные свойства // Микология и фитопатология. 2001. - Т. 35. - Вып. 1. - С. 56-62.

21. Лессо Т. Грибы. Определитель. М.: ООО «Издательство Астрель», 2003. - 304 с.

22. Лодыгин А.Д., Серов A.B., Рябцева А.Б. Теоретические предпосылки и технология получения производных лактозы галактоолигосахаридов // Вестник СевКавГТУ. - 2006. - № 3 (7). (Из science.ncstu.ru).

23. Мамеева О.Г., Нагорная С.С., Остапчук A.M., Подгорский B.C. Внеклеточные полисахариды дрожжей Cryptococcus albidus (Saito) Skinner // Микробиология и биотехнология. 2008. - № 1 (2). - С. 29-35.

24. Мир растений. В 7 томах. Т. 2. / Под ред. Горленко М.В. 2-е изд., перераб. - М.: Просвещение, 1991.-475 с.

25. Мишарина Т.А., Мухутдинова С.М., Жарикова Г.Г., Теренина М.Б., Крикунова Н.И. Влияние термической обработки на состав летучих компонентов белых грибов (Boletus edulis) II Химия растительного сырья. 2008. - № 3. - С. 97-101.

26. Паносян А.К. Авакян С.А. О синтезе ряда аминокислот при совместном развитии1 азотобактера и дрожжей из рода Candida и Torulopsis // Микробиология. 1974. -Т. 43. - Вып. 2. - С. 242-244.

27. Промышленная микробиология: Учебное пособие для ВУЗов / Под ред. Н.С. Егорова. М.: Высшая школа, 1989. - 688 с.

28. Решетникова И.А. Деструкция лигнина ксилотрофными макромицетами. Накопление селена и фракционирование его изотопов микроорганизмами. М., 1997.- 197 с.

29. Ризванов К. Исследование взаимоотношений Lactobacterium bulgaricum и Saccharomyces lactis II Микробиология. 1960. - Т. 29. - Вып. 4. - С. 536-543.

30. Семенов С.М. Лабораторные среды для актиномицетов и грибов. М.: Агропромиздат, 1990. - 240 с.

31. Сергеева М.Н. Грибы. М.: Изд-во «Культура и традиции», 2003. - 264 с.

32. Химия. Большой энциклопедический словарь / Гл. ред. И.Л. Клунянц. Большая Российская энциклопедия, 1998. - 792 с.

33. Храбрых O.JI., Барайщук Г.В., Kollar A., Jelkmann W. Дрожжи в борьбе с возбудителем заболевания серая гниль Botrytis cinerea II Аграрный вестник Урала, 2007,-№4.-С. 30-33.

34. Широков А.В., Актуганов Г.Э. Изучение взаимодействия бактерий-антагонистов Bacillus spp. с фитопатогенными грибами // «Биология наука XXI века»: Тезисы 7-й Пущинской школы-конференции молодых ученых. - Пущино, 14-18 апр. 2003. - С. 297-298.

35. Экологическая роль микробных метаболитов / Под ред. Д.Г. Звягинцева. М.: Изд-воМГУ, 1986.-240 с.

36. Яковлева Е.П. Совместное культивирование продуцентов биологически активных веществ с другими микроорганизмами // Прикладная биохимия и микробиология. -1983. Т. XIX. - Вып. 3. - С. 330- 346.

37. Alberts В., Johnson A., Lewis J., Raff М., Roberts К., Walter P. Molecular Biology of the Cell. 4th edition. New York: Garland Science, 2002. P. 879-964.

38. Barron G.L. Microcolonies of bacteria as a nutrient source for lignicolous and other fungi // Canadian Journal of Botany. 1988. - Vol. 66. - P. 2505-2510.

39. Barron G.L. Predatory fungi, wood decay, and the carbon cycle // Biodiversity. — 2003. — Vol. 4. P. 3-9.

40. Barron G.L., Dierkes Y. Nematophagous fungi: Hohenbuehelia, the perfect state of Nematoctonus II Canadian Journal of Botany. 1977. 55: 3054-3062.

41. Belern M.A.F., Lee B.H. Production of bioingredients from Kluyveromyces marxianus grown on whey: an alternative // Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 1998. -38 (7): 565-598.

42. Belinky P.A., Masaphy S., Levanon D., Hadar Y., Dosoretz C.G. Effect of medium composition on l-octen-3-ol formation in submerged cultures of Pleurotus pulmonarius II Applied Microbiology and Biotechnology. 1994. - 40: P. 629-633.

43. Beltran-Garcia M.J., Estarron-Espinosa M., Ogura T. Volatile compounds secreted by the Oyster Mushroom (.Pleurotus ostreatus) and their antibacterial activities // J. Agric. Food Chem., 1997. 45 (10). P. 4049-4052.

44. Blanchette R.A., Shaw C.G. Associations among bacteria, yeasts, and Basidiomycetes during wood decay // Phytopathology. 1978. - Vol. 68. - P. 631-637.

45. Breheret S., Talou T., Rapior S., Bessiere J.-M. Monoterpenes in the Aromas of Fresh' Wild Mushrooms (Basidiomycetes) II Journal of agricultural and food chemistry. 1997. -45 (3): P: 831-836.

46. Buck J.W. In vitro antagonism of Botrytis cinerea by phylloplane yeasts // Canadian Journal of Botany. 2002. - Vol. 80. - P. 885-891.

47. Caballero R., Olguin P., Cruz-Querrero A., Gallardo F., Garcia-Garibay M., Gomez-Ruiz L. Evaluation of Kluyveromyces marxianus as baker's yeast // Food Research International, 1995. 28 (1): 37-41.

48. Carlos R., Gabor P. Biodiversity and ecophysiology of yeasts. Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 2006. - 579 p.

49. Cheirsilp B., Shoji H., Shimizu Ii., Shioya S. Interactions between Lactobacillus kefiranofaciens and Saccharomyces cerevisiae in mixed culture for kefiran production.// Journal of Bioscience and Bioengineering. 2003. - Vol'. 96. - № 3. - P. 279-284.

50. Chen G. Studies on Extracellular Polysaccharide-Degrading Enzymes Secreted by Pleurotus Ostreatus Grown on Lupin Hull // Thesis Master Degree. Centre for bioprocessing and food technology, 1996. 228 p.

51. Cho Y.-S., Kim J.-S., Crowley D.E., Cho B.-G. Growth promotion of the edible fungus Pleurotus ostreatus by fluorescent pseudomonads // FEMS Microbiology Letters. 2003. -218: 271-276.

52. Clemen9on H. Cytology and Plectology of the Hymenomycetes // Bibliotheca Mycologica. 2004. - Vol. 199. - 488 p.

53. Combet E., Burton K.S., Eastwood D.C., Griffits G., Henderson J. Mushroom flavor biogenesis in A. bisporus II Science and cultivation of edible and medicinal fungi. Romine, Keil, Rinker and Royse (eds.) Penn State, 2004.

54. Dijkstra F.J. Submerged cultures of mushroom mycelium as sources of protein and flavour compounds. Dissertation. Delft, 1976.

55. Dijkstra F.J., Scheffers W.A., Wiken T.O. Submerged growth of the cultivated mushroom, Agaricus bisporus // Antonie van Leeuwenhoek. 1972. 38: 329-340:

56. Druvefors U.A., Passoth V., Schnurer J. Nutrient effects on biocontrol of Penicillium roqueforti by Pichia anomala J121 during airtight storage of wheat // Applied and Environmental Microbiology. 2005. - Vol. 71. - № 4. - P. 1865-1869.

57. Echavarri-Erasun C., Johnson E.A. Stimulation of astaxanthin formation in the yeast Xanthophyllomyces dendrorhous by the fungus Epicoccum nigrum II FEMS Yeast Research. 2004. - Vol. 4 (4-5). - P. 511- 519.

58. Faraco V., Palmieri G., Festa G., Monti M., Sannia G., Giardina P. A new subfamily of fungal subtilases: structural and functional analysis of a Pleurotus ostreatus member // Microbiology. 2005. - 151: P. 457-466.

59. Fredlund E., Blank L.M., Schnurer J., Sauer U., Passoth V. Oxygen- and glucose-dependent regulation of central carbon metabolism in Pichia anomala II Applied and Environmental Microbiology, 2004. 70 (10): 5905-5911.

60. Fries N., Swedjemark G. Sporophagy in hymenomycetes // Experimental mycology, 1985.-Vol. 9.-P. 74-79.

61. Grba S., Stehlik-Tomas V., Stanzer D., Vahcic N., Skrlin A. Selection of yeast strain Kluyveromyces marxianus for alcohol and biomass production on whey // Chemical and Biochemical Engineering Quarterly, 2002. 16 (1): 13-16.

62. Jong S.C., Birmingham J.M. Mushrooms as a source of natural flavor and aroma compounds // Mushroom Biology and Mushroom Products. Chinese University Press: Hong Kong, 1993. P. 345-366.

63. Hanson J.R. The chemistry of fungi. UK, Cambridge, Royal Society of Chemistry, 2008.-221 p.

64. Hu S.H., Liang Z.C., Chia Y.C., Lien J.L., Chen K.S., Lee M.Y., Wang J.C. Antihyperlipidemic and antioxidant effects of extracts from Pleurotus citrjnopileatus II Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2006a. Vol. 54. P. 2103-2110.

65. Hu S.H., Wang J.C., Lien J.L., Liaw E.T., Lee M.Y. Antihyperglycemic effect of polysacchsaride from fermented broth of Pleurotus citrinopileatus I I Applied Microbial and Cell Physiology. 20066. Vol. 70. P. 107-113.

66. Hutchison L.J., Barron G.L. Parasitism of algae by lignicolous Basidiomycota and other fungi // Canadian Journal of Botany. 1997. - Vol. 75. - P. 1006-1 111.

67. Hutchison L.J., Barron G.L. Parasitism of yeasts by lignicolous Basidiomycota and other fungi // Canadian Journal of Botany. 1996. - Vol. 74. - P. 735-742.

68. Kirk P.M., Cannon P.F., David J.C., Stalpers J.A. Ainsworth & Bisby's Dictionary of the Fungi. 9th ed. Wallingford: CAB International, 2001. 655p.

69. Klis F.M., Boorsma A., De Groot P.W.J. Cell wall construction in Saccharomyces cerevisiae II Yeast. 2006. - 23: P. 185-202.

70. Kues U., Liu Y. Fruiting body production in basidiomycetes // Applied Microbiology and Biotechnology. 2000. 54: 141-152.

71. Kuske M., Romain A.-C., Nicolas J. Microbial volatile organic compounds as indicators of fungi. Can an electronic nose detect fungi in indoor environments? // Building and Environment. 2005.-40: 824-831.

72. Lemke G. Myzelwachstumsteste mit vier champignonstammen // Champignon, 1972. -№ 128: P. 1-5.

73. Ludovico P., Sansonetty F., Corte-Real M. Assessment of mitochondrial membrane potential in yeast cell populations by flow cytometry // Microbiology. 2001. 147. - P. 3335-3343.

74. Luo H., Mo M., Huang X., Li X., Zhang K. Coprinus comatus: A basidiomycete fungus forms novel spiny structures and infects nematode II Mycologia. 2004. - Vol. 96. - № 6.-P. 1218-1224.

75. Margaritis A., Bajpai P. Direct fermentation of D-xylose to ethanol by Kluyveromyces marxianus strains // Applied and Environmental microbiology, 1982. P. 1039—1041.

76. Nakagawa T., Nagaoka T., Miyaji T., Tomizuka N. Cold-active polygalacturonase from psychrophilic-basidiomycetous yeast Cystofilobasidium capitatum strain PPY-1 // Bioscience, biotechnology and biochemistry. 2005. - 69 (2): 419-421.

77. Nyegue M., Zollo P.H.A., Bessiere J.M., Rapior S. Volatile components of fresh Pleurotus ostreatus and Termitomyces shimperi from Cameroon 11 Journal of Essential Oil-Bearing Plants, 2003 (6). P. 153-160.

78. Okamura T., Ogata T., Minamimoto N., Takeno T., Noda H., Fukuda S., Ohsugi M. Characteristics of wine produced by mushroom fermentation // Bioscience. Biotechnology. Biochemistry. -2001.-65 (7). P. 1596-1600.

79. Pessoa JR A., Vitolo M. Inulinase from Kluyveromyces marxianus: culture medium composition and enzyme extraction // Brazilian Journal of Chemical Engineering, 1999. -16 (3): 237-245.

80. Petersson S., Schnurer J. Biocontrol of mold in high-moistuie wheat stored under airtight conditions by Pichia anomala, Pichia guilliermondii and Saccharomyces cerevisiae II Applied and Environmental Miciobiology. 1995. - Vol. 61. - P. 1027-1032.

81. Poppe J. Use of agricultuial waste materials in the cultivation of mushrooms // Science and cultivation of edible fungi. Van Griensven (ed.) Balkema, Rotterdam, 2000. P. 323.

82. Prasad K.K., Mohan S.V., Pati B.R., Sanna P.N. Immobilization of Pleurotus ostreatus 1804 on PUF cubes: Influence of mycelial growth pattern on laccase yield // Indian Jouranal of Biotechnology. 2006. - Vol. 5. - P. 84-88.

83. Rainey P.B. Effect of Pseudomonas putida on hyphal growth of Agaricus bisporus II Mycological Research. 1991. - Vol. 95. - P. 699-704.

84. Rangel-Castro J.I., Levenfors J.J., Danell E. Physiological and genetic characterization of fluorescent Pseudomonas associated with Cantharellus cibarius II Canadian Journal of Microbiology. 2002. - Vol. 48. - P. 739-748.

85. Rawlings N.D., Barrett A.J. Evolutionary families of peptidases // Biochemical Journal. -1993.-290: P. 205-218.

86. Ritschkoff A.-C. Decay mechanisms of brown-rot fungi. Technical Research Centre of Finland. Espoo, 1996. 67 p.

87. Ritschkoff A.-C., Ratto M., Buchert J., Viikari L. Effect of carbon source on the production of oxalic acid and hydrogen peroxide by brown-rot fungus Poria placenta I I Journal of Biotechnology. 1995.-40: 179-186.

88. Rodriguez Estrada A.E., Royse D.J. Pleurotus eryngii and P. nebrodensis: from the wild to commercial production // Mushroom News. Feb. 2008.

89. Ruhl M., Fischer C., Kues U. Ligninolytic enzyme activities alternate with mushroom production during industrial cultivation of Pleurotus ostreatus on wheatstraw-based substrate // Current Trends in Biotechnology and Pharmacy. 2008. 2 (4): 478-492.

90. Scbotic J., Trcek T., Popovic T., Brzin J. Basidiomycetes harbour a hidden treasure of proteolytic activity // Journal of Biotechnology. 2007. - 128: P. 297-307.

91. Silva S.O., Gomes da Costa S.M., Clemente E. Chemical composition of Pleurotus pulmonarius (Fr.) Quel, substrates and residue after cultivation // Brasilian Ai chives of Biology and Technology. -2002. Vol. 45 (4): 531-535.

92. Stamets P. Growing Gourmet and Medicinal Mushrooms. Third Edition. Ten Speed Press, Berceley. Toronto. 2000. - 574 p.

93. Tsugita A., Scheffler J.-J. A rapid method for acid hydrolysis of protein with a mixture of trifluoioacetic acid and hydrochloric acid // European Journal of Biochemistry, 2004. 124 (3): 585-588.

94. Urbonas V., Kalamees K., Lukin V. Conspectus florum agaricalium fungorum (Agaricales s.l.) Lithuaniae, Latviae et Estoniae. Vilnius: Mokslas, 1986. 138 p.

95. Velankar H., Heble M. Biotransformation of L-citronellal to L-citronellol by free and immobilized Rhodotorula minuta II Electronic Journal of Biotechnology. 2003. - Vol. 6 (2).-P. 90-103.

96. Venkateshwarlu G., Chandravadana M.V., Pandey M., Tewari R.P., Selvaraj Y. Volatile flavour compounds from oyster mushroom {Pleurotus floridd) in submerged culture // Flavour and Fragrance Journal. 2000. - 15: 320-322.

97. Wang J.C., Hu S.H., Liang Z.C., Yeh C.J. Optimization for the production of water-soluble polysaccharide from Pleurotus citrinopileatus in submerged culture and its antitumor effect // Applied Microbiology and Biotechnology. 2005a. Vol. 67. P. 759766.

98. Wang J.C., Hu S.H., Liang Z.C., Yeh C.J. Antigenotoxicity of extracts from Pleurotus citrinopileatus II Journal of the Science of Food and Agriculture. 20056. Vol. 85. P. 770-778.

99. Wasser S.P., Nevo E., Sokolov D., Timor-Tismenetsky M., reshetnikov S.V. The regulation of dietary supplements from medicinal mushrooms // International Journal of Medicinal Mushrooms. 2000 (2): 1-19.

100. Wasser S.P., Weis A.L. Medicinal properties of substances occurring in higher Basidiomycetes mushrooms: current perspectives // International Journal of Medicinal Mushrooms. 1999 (1): 31-62.

101. Wesenberg D., Kyriakides I., Agathos S.N. White-rot fungi and their enzymes for the treatment of industrial dye effluents // Biotechnology Advances. 2003. - 22: P. 161187.

102. Witzany G. Biocommunication of Fungal Organizms. Nature Precedings. 2008. (Из preceedings.nature.com)

103. Whitney K.D., Arnott H.J. Calcium oxalate crystal morphology and development in Agaricus bisporus И Mycologia. 1987. - 79(2): P. 180-187.

104. Wood W.F., Largent D.L., Henkel T.W. Headspace analysis identifies indole and 1-octen-3-ol as the "coal tar" odor of Tricholoma inamoenum II Mycological Progress. 2004.-3 (4): 325-328.

105. Wood W.F., Lefevre C. Changing volatile compounds from mycelium and sporocarp of American matsutake mushroom, Tricholoma magnivelarc II Biochemical Systematics and Ecology, 2007. Vol. 35. - P. 634-636.

106. Yamamoto Y., Osanai S., Fujiuchi S., Yamazaki K., Nakano H., Ohsaki Y., Kikuchi K. Extrinsic allergic alveolitis induced by the yeast Debaryomyces hansenii 11 European Respiratory Journal, 2002. 20. P. 1351-1353.

107. Zadrazil F., Compare G., Maziero R. Biology, cultivation and utilization of Pleurotus species // Science and cultivation of edible and medicinal fungi. Romine, Keil, Rinker and Royse (eds.) Penn State, 2004. P. 383-391.

108. Интернет-сайт ООО Кировская пищевая лаборатория http://foodstandart.ru/.

109. Интернет-сайт Министерства здравоохранения республики Беларусь http://www.minzdrav.by/med/docs/tnpa/Gigiena 231-2 2002 Sanpin Pril7.doc.

110. Интернет-сайт ООО «Экоцентр» http://ecocentr.ru/index.php?option=com content &view=article&id=6:2008-03-24-10-10-48&catid=3 :technologies&Itemid=4.

111. Интернет-сайт химической энциклопедии www.xumuk.ru.

112. Интернет-сайт Большой Советской Энциклопедии http://bse.sci-lib.com/article 084835.html.

113. Интернет-сайт энциклопедии овощеводства http://www.ovoschevodstvo.ru/.

114. Интернет-сайт энциклопедии научного бодибилдинга http://sportswiki.ru

115. Интернет-сайт American Biological Safety Association http://www.absa.org/ riskeroups/.

116. Интернет-сайт CABI (Commonwealth Agricultural Bureau International) Bioscience Databases of Fungal Names http : //www, indexfungorum. or g/.

117. Интернет-сайт http://chestofbooks.com/.

118. Интернет-сайт European Bioinformatics Institute http://www.ebi.ac.uk/.