Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ СУПЕРОВУЛЯЦИИ И НЕХИРУРГИЧЕСКОГО ВЫМЫВАНИЯ ЭМБРИОНОВ У КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ДЛЯ ЦЕЛЕЙ ТРАНСПЛАНТАЦИИ

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ СУПЕРОВУЛЯЦИИ И НЕХИРУРГИЧЕСКОГО ВЫМЫВАНИЯ ЭМБРИОНОВ У КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ДЛЯ ЦЕЛЕЙ ТРАНСПЛАНТАЦИИ"

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ЦАУЧНО-ИССЛ ЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЖИВОТНОВОДСТВА (ВИЖ)

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ СУПЕРОВУЛЯЦИИ И НЕХИРУРГИЧЕСКОГО ВЫМЫВАНИЯ ЭМБРИОНОВ У КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ДЛЯ ЦЕЛЕЙ ТРАНСПЛАНТАЦИИ

03.00,13 — Физиология человека и животных (физиология сельскохозяйственных животных)

На правах рукописи

НИКОЯН Петрос Еремович

УДК 636.2.082.451 : G12.64G.02.

Автореферат

диссертации иа соискание ученой степени кандидата биологических наук

Дубровины, Московской обл., 1983 г.

¿.І

> + г

Работа выполнена в отделе зоотехнической эндокринологии сельскохозяйственных животных, лаборатории трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота Всесоюзного ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательского -института животноводства.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Ю. Д. Клинский,

кандидат биологических наук Н. И. Сергеев.

Официальные оппопепты:

доктор биологических наук, профессор А. К. Голубев,

кандидат биологических наук В. Я. Черных.

Ведущее учреждение — Эстонский научно-исследовательский институт животноводства и ветеринарии.

Защита диссертации состоится « /г » 1983 г,

в час. на заседании специализированного Совета

Д.020.1В.02 по защите диссертации на соискание ученой степени доктора наук при Всесоюзном ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательского института животноводства.

Адрес института: 142012, Дубровнцы, Подольского района, Московской области.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан « ¡0 » -4" ** л— 1983 г.

Ученый секретарь

специализированного Совета, кандидат биологических наук И. И. Шмыгни.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1, Актуальность темы

Решениями XXVI съезда КПСС и Продовольственной программы СССР предусматривается дальнейший рост производства продуктов животноводства. Эти задачи могут быть решены на основе повышения уровня селекционной работы по совершенствованию племенных и продуктивных качеств животных, созданием новых высокопродуктивных пород, линий и типов скота.

Наличие большого количества зародышевых клеток в я вчинках самок животных и наследуемость генетического потенциала после пересадки эмбриона к реципиенту являются теоретической основой метода трансплантации зародышей, который открывает безграничные возможности целенаправленной селекции.

Широкое внедрение метода искусственного осеменения в животноводстве дало возможность эффективно влиять на улучшение племенных качеств животных через выоокоцен-ных производителей (В. К. Милованов и его школа).

Селекция через высокопродуктивных маток — ограничена. Повторяемость рекордной продуктивности в потомстве рекордисток составляет 8—15% (Л. К. Эрнст, В. Г. Самохин, Н. Т. Семенов).

Метод трансплантации эмбрионов позволяет более эффективно использовать генетический потенциал выдающихся коров путем получения от них нескольких оплодотворенных яйцеклеток в одну индуцированную охоту и пересадки их и из коп роду ктивным животным.

В последние годы в СССР и развитых зарубежных странах мира метод трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных животных, особенно у крупного рогатого скота, .вошел в арсенал средств управления функцией размножения. Однако, несмотря на достигнутые успехи, существуют еще рй'д нерешенных вопросов, сдерживающих ведение широкой запрограммированной работы. Одним из недостатков этого способа считают высокую вариабельность и непредсказуемость

ГБ-. МЧ.-.Л I...*-.:, І і'іЯЯїа С■

результатов супсровуляцнн, которая является первым к важным звеном технологии эмбриопересадок.

Теоретические принципы и практическое применение гормонального вызывания суперовуляшш, с целью повышения многоплодия у малоплодных животных разработаны впервые в Советском Союзе под руководством М. М. Завадов-ского в 30-х годах. Школой Завадовских (А, А. Падучева; Ю. Д. Клпнскнй, М, И. Прокофьев, А. Ш. М, Амарбаев) и многими учеными мира разработаны и предложены разные схемы вызывания полновуляшш. Однако, индуцированная множественная овуляция в аспекте трансплантации эмбрионов приобретает более конкретное значение и вызывает необходимость изыскивать новые способы стимулирования множественного роста фолликулов в яичниках.

Важное значение имеет кратность использования коров и телок-доноров, которая способствует получению большого количества эмбрионов, следовательно и потомков от выдающихся животных. Такая возможность возрастает в связи с разработкой нехирургического (бескровного) метода вымывания эмбрионов, который позволяет получать эмбрионы непосредственно на ферме, а не в специально оборудованных операционных.

Результаты нехирургического метода извлечения зародышей пока весьма нестабильны. Поэтому, разработка более эффективного бескровного способа получения эмбрионов у доноров с применением новых и модифицированных приборов является актуальной задачей,

1.2, Цель и задачи исследований

Основной целью нашего исследования было изучить влияние гонадотропина релизннг-гормона (Гн-РГ) на процесс овуляций, как дополнительного источника выделения гипофи-зарных гонадотропных гормонов, повысить эффективность нехнрургического 'Извлечения эмбрионов. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Изучить эффективность действия гонадотропина рели-зинг-гормона на фоне гонадотропина СЖК, витаминов «А» и «Е» к простагландинов на процесс овуляций у коров и телок-доноров, оплодотворяемость яйцеклеток и качество эмбрионов.

2, Усовершенствовать иехирургический метод извлечения эмбрионов у доноров крупного рогатого скота путем использования новых и модифицированных приборов, позволяющих повысить эффективность вымывания. Сконструировать специальные устройства для этих целей.

*>

1.3. Научная новизна

Разработан новый способ вызывания множественной овуляции у коров н телок-допоров с использованием адекватно-то стимулятора (релизинг-гормона) выделения гипофиза р-пых гоиадотропинов. Новизна подтверждается положительным решением о выдаче авторского свидетельства.

Сконструировано новое устройство для нехирургического извлечения эмбрионов у суперовулнрованных доноров, новизна которого также подтверждается решением о выдаче авторского свидетельства.

1.4. Практическая значимость работы

Разработанный способ вызывания множественной овуляции у доноров эмбрионов крупного рогатого скота обеспечивает высокий уровень индуцирования роста фолликулов, овуляций и выхода нормальны* эмбрионов, пригодных для пересадки.

Предложенное устройство позволяет приблизить по эффективности извлечения эмбрионов нехирургический метод к хирургической технике, легко проводится через шейку матки, не вызывая травматических повреждений в гениталиях доноров.

Метод трансплантации дает неоценимую пользу при использовании в качестве доноров-эмбрион о в выбракованных высокопродуктивных коров, ' .Ї"'"1

1.5. Апробация работы

Материалы диссертации доложены:

— на научных конференциях молодых ученых и аспирантов ВИЖа в 1980, 1981 гг.

— на первой городской (Московской) конференции молодых ученых сельскохозяйственных вузов и институтов (1982 г.);

— на конференции отдела зоотехнической эндокринологии и трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота (1982 г.). ,

1.6. Объем работы- -

Диссертация изложена на 166 страницах машинописного текста, содержит 32 таблицы и 13 рисунков. Состоит из вводной части, обзора литературы, материала и методики иссле-

доваиня, результатов исследования, выводов и предложений. Список литературы включает 244 названий, из них 205 — иностранных.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИП

Работа выполнена в лаборатории трансплантации эмбрионов крупного рогатою скота отдела зоотехнической эндокринологии и трансплантации эмбрионов сел ьскохоз явствен -иыж живопгных и опытном хозяйстве ВИЖа «Щапово» в период с 1980 по 1982 год.

В качестве доноров использовали 49 коров черно-пестрой породы в возрасте 4—5 лет живой массой 500—550 кг tu 56 телок случного возраста (18—20 месяцев) с жнвой массой •320—380 кг.

Животных в группы подбирали с учетом возраста, живой -массы, упитанности и состояния половых органов. Выявление охоты у коров vi телок-доноров проводили дважды в день, (утром и вечером) на прогулке по наличию хорошо выраженного рефлекса неподвижности,- Ректалыю определяли состояние матки и яичников с целью исключения из эксперимента животных с разными отклонениями от нормы. ■<- Коровам и телкам, отобранным в качестве доноров, в день проявления эструса инъецнровали внутримышечно витамин «А» в дозе 150000 ИЕ и витамин «Е» — 100 мг и в день обработки гон адот рогш ном введение витаминов повторяли в дозе соответственно 75000 ИЕ н 50 мг.

На 10—11-й день астрального цикла животным вводилir нативкый препарат «СЖК» одной серии «Нота» (соотношение ФСГ и ЛГ — 2:1) с активностью 200 ИЕ в 1 мл, приготовленной в отделе зоотехнической эндокринологии ВИЖа. Дозы ГСЖК составляли 3600 ИЕ на корову и 2800 ИЕ на телку. В день гормона л нион обработки животных исследовали ректалька на наличие желтого тела в яичнике и его выраженность. Животных с нечетко выраженными желтыми телами в яичниках я при отсутствии их считали не соответствующими требованиям, предъявляемым к донорам, и гормональной обработке не подвергали.;

■ Для рассасывгаиия желтого тела в яичнике, с целью индуцирования охоты, через 48 часов после ннъекцш ГСЖК вводили внутримышечно простаглапдин «Lutalise» в дозе 30 мг коровам и 25 мг телкам.

Животных осеменяли замороженным Семенем ректоцер-викальным методом 3—4-кратно.;;в зависимости -от продолжительности' охоты с интервалом' между осеменениями 10— 12 часов. "-Для опытных »' контрольных животных использо-

вали семя одного быка с содержанием: 50 млн. живчиков в каждой дозе,. Перед вторым осеменением животным опытной группы вводили внутримышечно синтетический гопадотро-гжн релизинг-гормон фирмы «Berlin-Chimie» для стимуляции секреции эндогенного ЛГ гипофизом. Доза Гн-РГ составляла коровам 1 мг в 2 мл физ. раствора и телкам — 0,5 "мг в 1 мл физ. раствора.

Предыдущими экспериментами лаборатории трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота н многими зарубежными исследователями было показано, что вызывание су-перовуляторной реакции одним ГСЖК без применения гормонов лютеинизирующего действия — малоэффективна. Поэтому животным контрольной группы недостаток лютеинизирующего гормона при множественной овуляции компенсировали введением 250 ИЕ (телкам 200 ИЕ) хориогонима (усовершенствованная схема), заранее зная, что без применения хориогонина в контрольной группе были бы получены более низкие результаты.

Число и качество желтых тел (овуляций) и неовулиро-вапшнх фолликулов в яичниках у коров определяли ректальной пальпацией, у телок — визуально при хирургическом извлечении эмбрионов на 8—9-й день после первого осе'ме-; нения.

Вымывание эмбрионов у коров проводили нех.нрургнче-ским методом через цервикалшый канал, у телок — хирургическим методом через разрез по белой линии- живота под общим на-ркозом.

В качестве промывной жидкости использовали среду Дюльбекко. В жидкой среде эмбрионы выявляли и изолировали под стерео микроскопом, переносили на часовые стекла и оценивали качество по морфологическим признакам, под инвертированным микроскопом МБИ-13. Срок кратковременного хранения эмбрионов от момента вымывания до их пересадки или криоконсервнрования составлял 2—2,5 часа. Замороженные эмбрионы пересаживали реципиентам после разных сроков хранения в жидком азоте.

В качестве реципиентов использовали телок и коров черно-пестрой породы с хорошим экстерьером. Отбор реципиентов осуществляли из «стада реципиентов» со спонтанной охотой, которые имели половые циклы синхронные с донорами или в отдельных случаях расходились во времени до ±12 часов.

Пересадку эмбрионов хирургическим методом проводили .через разрез брюшной стенки в области голодной ямш справа или слева под местной анестезией, в положении животного стоя. Для нехнрургическон пересадки использовали прибор

Кассу для искусственного осеменения крупного рогатого скота, а также инструменты конструкции ВИЖа.

При односторонней перссадке эмбрионы помещали в верхушку рога матки, на стороне которого в яичнике имелось функционирующее желтое тело. При двусторонней пересадке эмбрионы аплицировалгг по одному в каждый рог матки. Эмбрионы размещали в участке рога матки соответствующем возрасту его миграции {3—4 см от места соединения яйцеводов). Реципиентов через 60 дней после пересадки эмбрионов обследовали ректально с целью определения стельности. Конечные результаты пересадки эмбрионов определяли по отелу.

Схема опыта

Группы

Сроки обработки (дни цикла) Препараты опытная контрольная опытная контрольная

коровы телки

1-й Витамин «А» (ИЕ) 150000 150000 150000 150000

Витамин «Е» (мг) 100 100 100 100

Витамин «А» 75000 75000 75000 75000

10—11-й Витамин «Е» 50 50 50 50

СЖК (ИЕ) 3600 3600 2800 2800

Хориогонин (ИЕ) — 250 — . 200

12—13-й П роста гла иди н (мг) 30 30 25 ■25

14—15-й Осемененис+Гн—РГ (мг) 1 _ 0,5 —

8—9-й (после индуцн- Извлечение и пересадка эмбрионов рованной охоты)

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ

- 3.1. Вызывание суперовуляции у коров н телок-доноров

С целью проверки теоретических предпосылок влияния гонадотропина релизинг-гормона на гипофиз в момент су-перовуляторной охоты были проведены предварительные исследования на небольшом количестве животных (п=16). Было установлено, что инъекции Гн-РГ при первом осеменении оказались не эффективными. Вероятно, при ускорении овуляции созревших фолликулов образовавшиеся желтые тела блокируют дальнейший процесс овуляции, вследствие чего остается в янчниках большое количество иеовул провавших фолликулов. -,6

Введение Гм-РГ при втором осеменении: обеспечивало лучшие результаты овуляций и оплодотворяем ости яйцекле, ток.

Анализ полученных данных показал (табл. 1}, что вклю-, чение в схему гормональной обработки Гн-РГ при втором-осеменении способствовало повышению числа индуцированных к росту фолликулов на 26,3% (с 9,8 до 13,3), т. е. на достоверную величину (Р<0,05). Гоиадотропин-РГ гипота-лэмической области играет стимулирующую гнпофизарную роль. Гипофиз, являясь регулятором гонадотрошюй функции, может переключаться на преобладающее выделение ФСГ или ЛГ. Благодаря этому, определенное количество фолликулов дозревает до овуляции. Высокий процент реагирующих суперовуляцией животных в опытной группе (92,4 против 78,8) объясняется именно достоверным различием числа индуцированных к росту фолликулов (овуляции + неовулиро-¡вавшие фолликулы).

■ Таблица V

- Уровень лолновуляцин у коров н телок-доноров

Группы

Показатель

контрольная опытная

Обработано животных 52 '','. !, 53

Реагировало иолковуляшгей 41 49

% от числа, обработанных 78,8 ', : ". , 92,4,

Индуцировано к росту фолликулов 512 ' ' "У 703 * J

На одного лонора (М±ш) 9.8¿0,96* 13,3±1,17*

Овулировало фолликулов, всего 440 624 % от числа индуцированных к росту

фолликулов 87,1 ' ' : 88,7 ' :

Число овуляций на одного донора : 1 1

(М±т) - 8,6^0,93*. ■ 11,7^1,07*"

Число неовулировавших фолликулов, • ° '

всего 66 ....

% от числа индуцированных к росту .. ... У ,.. .'.

фолликулов 12,9 ' 11,3 J 1

Число неовулнровавших фолликулов на 1

одного донора (М±ш) 1,3±0,19 1,5±0,28

* _ р<0.05.

Среднее число овуляций на одного донора было больше на 26,5% (11,7. против 8,6) у животных опытной группы (Р<0,05). Отмечено число стимулированных к росту фоллл-

Т

кулов « овуляций у телок было выше, чем у коров, внутри каждой группы.

Индивидуальная овулирующая реакция яичников па введение гонадотропинов обладает большой изменчивостью, которая в первую очередь обусловлена морфофункциональными особенностями обрабатываемого животного и стадий развития прлмордиальиых клеток в момент нх стимулирования гонадотропином. Полученные данные вызывания суперовуля-цнн с применением одинаковых доз ГСЖК подтверждают такое заключение (табл. 2).

Таблица 2

- Реакций ПИ ЧИН К ОБ и ее изменчивость у коров и телок-доноров

Г э у п л ы

Показатель контрольная (п-П) опытная (п—%)

От 3 до 7 овуляций 13—31,7 15—30,6

8—12 16—39,0 17—34.7

13—17 7—17,0 8—16,3

16—22 3—7,3 4—8,2

23—28 1—2,5 4—8,2

29—35 1—2,5 1—2,0

Лимит овуляций у животных составлял от 0 до 35, при атом суперовулмрующимн донорами считали наличие овуляций от 3-х н выше. От 8 до 12 овуляциями (оптимальный уровень оплодотворяемости в наших исследованиях) реагировали самый большой процент животных (до 39%).

Более точную характеристику гормонального вызывания полновулящш дают показатели извлечения эмбрионов {табл. 3). Среднее число извлеченных зародышей -на донора выше у животных опытной группы (0,9 против 4,8), Разница близка к достоверной (Р>0,1).

Оснсгаиьш критерием оценки реакции суперовуляиии является выход нормальных эмбрионов, пригодных для пересадки. У опытных животных их было больше на 0,8 эмбриона или па 27,6% по сравнению с контролем {2,9 против .2,1) при одинаковой оплодотворяемости яйцеклеток.

Установлено, что с повышением числа овулядий увеличивается количество дегенернрованиых эмбрионов и неопло-дотворепных яйцеклеток,

Шг результатам исследований лишь тех животных, у которых успешно провели вызывание суперовуляции н извлечение эмбрионов получены приемлемые результаты. Среднее

Количество и качество эмбрионов у норов и телок-доноров

Груплы

Показатель

контрольная опытная

Опер); рое а но животных

Число положительных доноров ко извлечению эмбрионов

% от числа оперированных Извлечено эмбрионов и яйцеклеток, всего % от числа овуляций

Число эмбрионов и яйцеклеток ва одного донора (М±т)

В том числе: нормальные

.41 -

49

36-... 87,8 197 44,2

45 91,8 337 54,0

дегенер и рова н н ы є неоплодотворекные яйцеклетки

4,8 ±0,73 6,9±0,82

2,1 ±0,42 2,9 ±0,47

0,8 ±0,19 1,2 ±0,32 1,9±0,49 2,8 ±0,67

число овуляций на одного донора-корову составило ' 12,7;'■ до-иора-телку — 16,5; нормальных эмбрионов — 3,2 и 3,8 соответственно.

Протяженность половой охоты при множественной овуляции увеличивается, чем при спонтанной овуляции, что обусловлено числом овуляций и интервалом между «ими. Высокий уровень эстрогенов в крови доноров при множественной овуляция повышает чу встаител да ост ь гипофиза к Гп-РГ, что сопровождается дополнительным выделением ЛГ, который необходим для ускорения момента овуляции. Применение Гн-РГ сокращало интервал между овуляциями и тем самым продолжительность охоты, что сопровождалось меньшим числом осеменений доноров опытной группы (табл. 4). На одно опытное животное затрачено на 0,3 осеменения меньше, чем в контрольной группе (3,2 против 2,9). Разница выоокодостоверна (Р<0,001), Сокращение интервала между овуляциями способствовало однородности условий о плод о-творяемостіі яйцеклеток и выходу нормальных эмбрионов на каждого донора.

Характерной особенностью такой схемы обработки является четкий приход коров н телок-доноров в охоту после введения простагландииа Р^а {в среднем 97,1%), чему способствует повышенный фон гонадотропннов н реактивность организма в связи с витаминизацией.

Уровень овуляций и оплодотворявмост ь яйцеклеток зависит от многих факторов, в том числе и сезона года, В наших

Количество осеменений коров и телок-доноров

Показатель контрольная Группа опытная

Обработано животных 52 53 .

Число доноров пришедших в охоту после инъ- 50 52

екции простагландина

% ot числа обработанных 96,1 98,1

Число осеменений, всего 160 151

Среднее на донора (М±т) 3,2 ±0,02* ■2,9 ±0,05*

* — Р<0,001.

исследованиях сезон года имел определенную роль как в отношении реакции полиовуляции на гонадотропин (СЖК), так и в о пл одот во р я е мост и яйцеклеток. Из данных таблицы 5 видно, что число овуляций на одного донора в декабре, январе, гфеврале и марте достоверно выше (Р<0,02), чем р августе, сентябре, октябре и ноябре, однако оплодотворяе-мость яйцеклеток и выход нормальных, пригодных для пересадки эмбрионов, заметно больше в осенний период, Оплодотворяемость яйцеклеток в осенние месяцы составила 93,9%. Самый низкий уровень оплодотворяемости яйцеклеток и ВЫХОД нормальных эмбрионов наблюдается в зимний период года (42,0 и 30,4% соответственно).

Процент овулировавшнх фолликулов от общего числа индуцированных к росту почти не имел разницы во все сезоны года (88,5%; 87,8%; 87,3%). Соответственно не было разницы между оставшимися неовулировавшими фолликулами (11,5%; 12,2%; 12,7%).

. Наряду с сезоном года большую роль на индекс суперовуляции и оплодотворяемость яйцеклеток оказывают кормление, содержание и реактивность животного, которые не аналогичны в разное время года.

Оплодотворяемость яйцеклеток и выход нормальных эмбрионов, пригодных для пересадки, в значительной мере зависит от уровня полиовуляции (рис. 1). Оптимальный уровень оплодотворяемости яйцеклеток и выход нормальных эмбрионов наблюдается при реакции яичников до 12 овуляций (78,5 и 61,9%). В дальнейшем, с увеличением числа овуляций снижается процент оплодотворяемости яйцеклеток я выход нормальных эмбрионов. Уровень пригодных для пере-10

Уровень овуляции и выход нормальных эмбрионов в зависимости от сезона года

Показатель Сезон года

декабрь —март (п-М) апрель—май (п-38) август—ноябрь (п-16)

Число овуляциіі на донора (М±ш) 13,1 ±1,50* 12,2 ±1,27 8,9 ±0,98*

% от числа индуцированных к росту фол-

ликулов 88,5 87,8 87,3

Число нсовулировавших фолликулов

(М±ш) 1,7+0,31 1,7 ±0,35 1.3=0,31

% от числа индуцнрованшх к росту фол-

ликулов 11,5 12,2 12,7

Число эмбрионов и яйцеклеток на донора

(М±ш) 6,9±1,Ю 6,6 ±0,96 4,9 ±0,89

% от числа овуляций 52,7 54,0 55,0

Из них. нормальные 2,1 ±0,46 (30,4%) 2,7 ±0,52 (40,9%) 3,9 ±0,81 (79,6%)

дегенерированные 0,8 ±0,39 (11,6%) 1,3 ±0,36 (19,7%) 0,7±0,23 (14,3%)

неоплодотворенные яйцеклетки 4,0+0,92 (58,0%) 2,6 ±0,70 (39,4%) 0,3±0,14 (6,1%)

* Р<0,02

ПРОЦЕНТ ОПЛОДОТВОРЯЕМОСТИ ЯЙЦЕКЛЕТОК И НОРМАЛЬНЫХ ЭМБРИОНОВ ПРИ РАЗНЫХ УРОВНЯХ

ПОЛИОВУЛЯЦИИ •

Уровень лоляовуляцки

—-- Оплолотворяемость яйцеклеток.

-..........................- Нормальные эмбрионы.

Рис: (

садки эмбрионов имеет прямую связь с оплодотворяемостыа яйцеклеток,

3.2. Извлечение эмбрионов у коров и телок-доноров

Освоение н усовершенствование нехирургического метода получения эмбрионов у коров-доноров осуществляли с использованием трех видов инструментов: двухканальный ка-12

тетер Фоллея в металлической трубке, одноканальпыи безманжетный катетер со съемным наконечником и катетер собственной конструкции. С учетом недостатков в модификациях катетера Фоллея нами был изготовлен двухканаль-ный катетер из цельной резины с надувным баллончиком. Ставилась задача улучшить фиксирование стилета, не требующей контроля при . введении устройства в шейку матки, уменьшить и даже полностью избежать травмы матки у доноров, а также переход промывной среды из одного рога в другой и вытекание ее через шейку матки, обеспечить максимальное извлечение зародышей с отсасываемой промывной средой.

Результаты промывания рогов .матки у суперовулпрован-, пых коров при использовании разных катетеров приведены в таблице 6.

Таблица в'

Результаты промывания рогов матки при использовании разных катетеров (мл)

Катетеры

Показатель фоллея п металлической трубке беї манжетный одноканальний рези но вы it двухк анальный с манжеткой

Оперировано животных 13 И 14

Из них: с непроходимостью

шейки мзткп і 1 ]

Положительные доноры ПО

промыванию рогов маткн 12 13 13

Использование среды "ДЛЯ

промывания, всего 11285 12519 12570

Среднее л а одного донора 940,4 963.0 967,9

Среднее на однн рог матки 470,2 481,5 483,7

Извлечено среды, всего І0Ш 10564 11713

Среднее яа донора 843.fi -8l2,tt 901.0

Среднее на один , рог матки 42i,8 406,3 450,/)

% извлеченной среды 89.7 84.4 93,1

% потерянной жидкости 10,3 15,6 6,9

В целом но всем группам у трех доноров не удалось пройти шейку матки, что составило в среднем 7,3%. Проблемы, связанные с иепрохождеиием шейки матки, по-видимому;-связаны не столько с конструкцией катетеров, сколько с индивидуальными особенностями животных и навыком оператора.

ІЗ

Основным показателем эффективности промывания рогов матки является объем отсасываемой жидкости, что гарантирует большую вероятность извлечения всех эмбрионов. Процент извлеченной жидкости из рогов матки колебался от 89,7 в первой группе до 84,4 и 93,1 во второй и третьей группах, т. е, был больше у животных той группы, где использовали резиновый двухканальных катетер с надувным баллончиком.

Процент извлеченных эмбрионов и яйцеклеток от числа овуляций выше у животных той группы, где соответственно выше процент извлеченной жид-кости (табл. 7). Число положительных коров-доноров по извлечению эмбрионов было-выше во второй группе, где удалось извлечь эмбрионы или яйцеклетки у 92,3% животных, В целом из трех групп животных только 33 коровы-донора давали эмбрионы или яйцеклетки. У остальных 5 животных не было ни яйцеклеток, ни эмбрионов. К отрицательным донорам относятся и три донора с непроходимостью шейки матки,

■ Т а б л и ц а 7

Результаты извлечения эмбрионов у коров-доноров при использовании разных катетеров

Катетеры

Показатель фол лея в металлической трубке без манжетный однока-нальный резиновый двуяканальный с манжеткой

Оперировано животных 12 13 13 '

Положительные доноры по из-

влечению эмбрионов 10 '12 " м ■

% от числа оперированных ' ■83,3 92,3 84,6

Число овуляций, всего " 95 114 103

Среднее число овуляций на опери-

рованного донора (M±tn) 7,9 ±0,64 8,7 ±0,59 8,0 ±0,81

Число извлеченных эмбрионов и яй-

цеклеток на оперированного доно-

ра (М±ш) ^2,6±0,2J 2,2 ±0,34 3,3 ±0,39

% от числа овуляций 32,9 25,2 41,2

Применение резинового двухкайального катетера обеспечило извлечение зародышей в 41,2% случаев от общего числа овуляций или больше на 8,3% и на 16,0% по сравнению с: другими катетерами. Имеющиеся различия между группами, возможно обусловлены вариациями полтювуляшш, задержанием яйцеклеток в яйцеводах, дегенерацией и рассасыванием их, отсутствием овуляций и др. Значит, при оценке преи-14'

муществ катетеров основным показателем следует считать процент отсасываемой жидкости от объема введенной среды.

Эффективность нехирургического извлечения эмбрионов • значительно уступает результатам, получаемым при хирургическом вымывании (табл. 8), хотя оперативный способ также не обеспечивал 100% вымывания зародышей от общего числа овуляций. Хирургическим методом было извлечено ,в.среднем -57,1% зародышей от общего числа овуляций, прл этом у 3 доноров удалось извлечь 100% эмбрионоа и яйцеклеток.

Таблица«

Результаты извлечения эмбрионов у телок-доноров хирургическим методом (п=49)

Показатель

M ± m

Лимит

Число овуляций на оперированного донора . 15,4±1,32 Число извлеченных яйцеклеток и эмбрионов иа донора . 8,8±1,П % от числа овуляцнй ^ 57,1 В той числе:

нормальные 3,4 + 0,70

дегенерированные 1,6 ±0,48

неоплодотворенные яйцеклетки' ' " 3,8 ± 1,02

3—35

0-27

0—12 0—11 0—18

Результативность бескровного извлечения эмбрионов в наших исследованиях и вообще в большинстве сообщений других авторов хотя, все^.еще..остается относительно низкой в сравнении с хирургическим методом, но весьма приемлема в отношении, времени, места, проведения, практичности и отсутствия хирургического риска..

3.3.-Пересадка-эмбрионов реципиентам

Определение качества пересаживаемых зародышей является составной частью в комплексе эмбриопересадок. Оценку эмбрионов проводили п'о их морфологическому состоянию под инвертированным микроскопом МБИ-13. Ее целью являлся отбор неоплодотворенных яйцеклеток и определение стадии развития эмбрионов, выявление повреждений отдельных бластомеров ил и всего зародыша.

Было-,исследовано ! 534 „зародышевые клетки, оказалось, что 234 ( 43,8%) были нормальные, 93 (17,5%) дегенерированные н 207 (38,7%) — неоплодотворенные яйцеклетки. Он: 15

лодотворяемость яйцеклеток по всем донорам составила 61,3%, а отдельно по группам коров она была выше па 22,4%„ ■ чем у телок,

Стадия развития эмбрионов у доноров опытной группы была более однородной* чем у животных контрольной группы (табл. 9). Увеличение процента отставших в развитии эмбрионов, вымытых у доноров контрольной группы (24,7 против 16,6) явилось, по-видимому, следствием растянутости овуляций при более продолжительной1 охоте.

Т а О г ц а 9*

Стадия развития эмбрионов у доноров

■ГpvIшы ■

Показатель

контрольная | опытная

Извлечено нормальных эмбрионов, всего 89 145

В том числе:

морулы, соответствующие стадии раз-

вития 18 ¡о

морулы, отставшие в развитии У 7

йластоиисты, соответствующие стадии

развития 49 105.

бластоцисты, отставшие в развитии 13 ■ IX

Итого (п/%):

эмбрионы, соответствующие стадии 121/83,4

развития 67/75,3

эмбрионы, отставшие в развитии 22/24,7 24/16,6

После оценки качества эмбрионов 49 были пересажены реципиентам. Из ¡них 25 — нехирургйческим методом 21-му реципиенту (табл. 10)-. Стельность после! бескровной пересадки составила 42,8%, при этом стельность реципиентов с одним пересаженным эмбрионом составила 47,0%. П}ш пересадке двух эмбрионов в оба рога матки процент стельности был значительно ниже (25,0%), чем. при односторонней пересадке, но из-за малого числа животных эти различия .нельзя считать достоверным^: ' (

Хирургическим методом было пересажено 24 зародыша Д7 телкам-реципиентам. При этом эмбрионы аплицирозЗли в „тот маточный рог, на сторонё: которого в яичпике было функционирующее желтое тело. При односторонней пересадке стельными оказались 6 реципиентов (60.%). Двусторонняя пересадка 14 эмбрионов (по одному в каждый рог'матки) 7-мн реципиентам обеспечила стельность у пяти животных (7Г,4%>. 'В целом уровень стельности (но не Выживаемости) 'составил 64,7% (И из 17 реципиентов). 1С

Результаты .пересадки свежих эмбрионов нехнрургическим : и хирургическим методами

Пересажено эмбрионов

Показатель нехнрургическиіі хирургический

по одному по два 1-е его по одному по два всего

Число реципиентов 17 4 21 10 7 17

Число зародышей 17 8 25 10 14 21

Стельных реципиентов 8 I 9 6 5 tl

% стельности 47.0 25,0 42,8 60,0 71,4 64,7

Данные по пересадке эмбрионов хирургическим и нехи-рургкчеоким методами свидетельствуют о том, что при хирургическом способе пересадки зародышей эффективность выше.

Результаты пересадки замороженно-оттаинных эмбрионов хирургическим методом (табл. 11) были хуже, чем при пересадке свежих эмбрионов.

Таблица II

Результаты пересадки замор ожени о-оттаянных эмбрионов хирургическим методом

Показатель

Перес а ж єно эмбрионов

по одному

по два

всего

Число реципиентов М

Число зародышей II

Стельных реципиентов 4

% стельности 36,3

12 24

41,6

23 35 9

39,1

Было пересажено 35 эмбрионов 23 реципиентам. Односторонняя пересадка зародышей обеспечила 36,3% стельности, двусторонняя — 41,6%; В целом стельность установлена у 9 реципиентов (39,1%).

При двусторонней пересадке 24-х эмбрионов 12 реципиентам у 3 установлена Стельность двойнями, что составляет 60% (от числа Стельных). Одинаковый процент двойневой стель--ности бь!л лолучея при пёресадке свежих эмбрионов. 2—2089 17

Причины гибели эмбрионов после пересадки реципиентам еще пе полностью выяснены. Главной причиной, по-видимому, является отклонение в морфофункционалыюй адекватности слизистой матки к восприятию эмбриона. Немаловажными являются некоторые технические моменты, требующие предельной точности и осторожности/ связанные с получением, оценкой и пересадкой зародышей.

4. ВЫВОДЫ ■

1. Вызывание сунеровуляцни путем применения натишю-го препарата СЖК в дозе 3600 ИЕ коровам и 2800 ИЕ телкам в сочетании с витаминами и «Е», проста гл а иди нами и гонадотропин релизинг-гормона, обеспечивает индуцирование множественного роста фолликулов у 92,4% животных-доноров. В среднем по 13,3 фолликула; 11,7 овуляций на одного обработанного донора и 6,9 зародышей на одного оперированного донора. Включение в схему гормональной обработки гонадотропин релизинг-гормона в дозе 1 мг коровам .и 0,5 мг телкам при втором осеменении повышает уровень по-лиавуляции на 26,5% и число нормальных эмбрионов, пригодных для пересадки, на 27,6%.

2. Установлено влияние сезона года на уровень оплодо-творяемости яйцеклеток и число нормальных эмбрионов. Так, в летне-осенний период индекс оплодотворяемости яйцекле-

. ток и выход нормальных эмбрионов был достоверно выше, соответственно на 51,9 и 49,2%, чем зимой и на 33,3 ,н 38,7%, чем весной.

3. Применение простагландина через 48 часов после введения гонадотропнна на фоне витаминов «А» и «Е» обеспечивает проявление признаков охоты у 97,1% животных-доноров. Доза простагландина (30 мг коровам и 25 мг телкам), вводимая внутримышечно, оказалась оптимальной.

4. Индекс оплодотворяем ости яйцеклеток и выход нормальных эмбрионов зависит от числа овуляций. Оптимальным числом овуляций, при котором наблюдается высокий индекс оплодотворяемости яйцеклеток (78,5%) и наибольшее число нормальных эмбрионов (61,9%), является уровень до 12 овуляций на донора. При увеличении числа овуляций (от 22 до 35) наблюдается снижение индекса оплодотворяемости яй-

■ цеклеток до 24,6% и выход нормальных эмбрионов — до 6,1%.

5. Разработано универсальное устройство для*нехирурги4 ческого извлечения эмбрионов у коров и тел о к-до норов, которое обеспечивает выведение промывной жидкости в пределах 90—95% от объема введенной и позволяет по результативности извлечения эмбрионов приблизить нехнрургический 18

метод к хирургическому, легко проводится через канал шейки матки, не вызывает травмы слизистой шейки и эндометрия матки.

6. Пересадка свежих эмбрионов нехмрургическнм и хирургическим методами показала, что результативность первого метода ниже на 21,9%, чем второго (42,8 против 64,7%). Двусторонняя пересадка свежих эмбрионов хирургическим методом (по одному в каждый рог матки) повышала уровень стельности ка 11,4% (71,4 против 00,0%). Результаты пересадки хирургическим методом замороженно-оттаянных эмбрионов ниже на 23,7%, чем пересадки свежил эмбрионов.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Рекомендуется усовершенствованная схема гормональной обработки коров и телок-допорсв, которая включает инъекции витаминов в день охоты и гормональной обработки. На 10—12 день полового цикла вводят ГСЖК в дозе 3600 ИЕ коровам и 2800 ИЕ телкам, через 48 часов — простагландин в дозе 30 и 25 мг. При втором осеменении гонадотропин ре-лизниг-гормон в дозе 1 мг и 0,5 мг (коровы, телки).

2. Для »«хирургического извлечения эмбрионов у коров и телок-доноров рекомендуется новое универсальное устройство, обеспечивающее простоту в работе и надежное извлечение эмбрионов, недорогое в изготовлении.

По теме диссертации опубликованы работы;

1, Хормогоиин, релизипг-гормои и множественная овуляция у коров и телок. Ж. «Ветеринария», 10, 1981, с. 47—48.

2, Множественная овуляция при гормональной обработке. Ж. «Животноводство», 5, 1982, с. 56—57.

При выполнении диссертационной работы Государственным Комитетом Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий выданы автору следующие положительные решения на авторское свидетельство:

1. Способ получения зародышей у самок-доноров крупного рогатого скота Хэ 3280835/30-15 от 27.08.1982 г.

2, Устройство для извлечения эмбрионов у животных № 3420557/30-15 от 28.09.1982 г.

Тираж 100 чкз.

Заказ 2089

Л-89806

М а.тоя рос ла &с цкэ я городская типография управления издательств, полиграфии и книжной торг.щ.'.п Калужского облисполкома