Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ, ПЕРЕСАДКИ И КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ, ПЕРЕСАДКИ И КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА"

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-НССЛЕДОВЛТЕЛЬСКНЯ ИНСТИТУТ ЖИВОТНОВОДСТВА

СЕРГЕЕВ Николай Иванович

УДК 612.646.02

МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ, ПЕРЕСАДКИ И КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

Специальность 03.00.13 — «Физиология человека и жнвотных» (Физиология сельскохозяйственных животных)

На правах рукописи

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

п. Дуйровицы, Московской обл., 1984 г.

У

Работа выполнена во Всесоюзном ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском институте животноводства с 1976 по 1984 гг.

доктор биологических наук, профессор А. Ш, М. Амарбаев;

доктор биологических наук, профессор А. К. Голубев;

доктор биологических наук Е. М. Платов.

Ведущее учреждение: Эстонский научно-исследовательский институт животноводства и ветеринарии.

Специализированного 1 . , ите диссер-

таций на соискание ученой степени доктора наук при Всесоюзном ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском институте животноводства.

Адрес института: 1420)2, Московская область, Подольский р-н, пос, Дубровицы.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан « & » 1934

Официальные оппоненты

Защита состоится

заседании

у

Ученый секретарь Специализированного Совета, кандидат биологических наук

И. И. Шмыгни

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Основным» направлениями экономического н социального развития СССР на 1981 —1985 гг. н на период до 1990 г., утвержденными XXVI съездом КПСС, определена неотложная необходимость повышения уровня селекционной работы по совершенствованию племенных и продуктивных качеств животных, создания новых высокопродуктивных пород, линий и гибридов скота. Среди поставленных задач наиболее важной и актуальной является ускорение темпов воспроизводства животных желательного типа, полученных от высокопродуктивных коров, осемененных спермой выдающихся быков, проверенных по качеству потомства.

В решении этой задачи большое значение имеет широкое использование генофонда коров-рекордисток, Между тем, традиционные методы воспроизводства выдающихся по продуктивности животных не обеспечивают желаемого влияния их на большие популяции племенного и пользовательного скот?. Трансплантации зародышей в этой проблеме отведена роль метода, который позволяет получать большое число однотипных потомков от высокопродуктивных животных.

Большую актуальность и практическую значимость имеют вопросы оценки жизнеспособности эмбрионов, так как от их качества в основном зависит успех трансплантации. Разработка объективных критериев оценки жизнеспособности эмбрионов дает возможность значительно повысить эффективность метода трансплантации.

Одним из главных путей перевода метода трансплантации на практическую основу является разработка способов глубокого консервирован-ия'зародышей, которые упростят подбор по половому циклу реципиентов и доноров, позволят осуществлять транспортировку на дальние расстояния.

Эффективное использование трансплантации в программе селекции животных должно привести к оптимальному уровню репродуктивных качеств с учетом многократного вызывания лолиовуляцци. Поэтому повторные гормональные обработки коров-доноров являются неотъемлемой частью этого метода. Принято считать, что возрастание числа потомков от небольшого числа коров-доноров приведет к снижению гене-

тнчсской базы вариабельности, а использование пересадок эмбрионов в селекционной программе приведет ограничение инбридинга до минимума.

Цель н задачи исследований. Цель исследований заключалась в разработке эффективных методов получения, пересадки н криокоисервлровання эмбрионов крупного рогатого скота отечественных пород. В связи с этим для решения были поставлены следующие основные задачи:

— усовершенствовать существующие и разработать новые методы гормонального вызывания полиовуляции у крупного рогатого скота. Изучить факторы, влияющие на уровень супе ровуляцнн, оплодотворяемость яйцеклеток и жизнеспособность эмбрионов;

— разработать методы хирургического н исхнрургпческого извлечения и пересадки эмбрионов;

— изучить эффективность билатеральной пересадки эмбрионов реципиентам с целью увеличения воспроизводства телят;"

— разработать объективные тесты морфологической оценки жизнеспособности эмбрионов, обеспечивающие максимальный процент стельности после пересадки;

— разработать технологию глубокого замораживания, длительного хранения эмбрионов и изучить возможность дальней транспортировки и пересадки их в условиях ферм;

—- ла основе результатов исследований разработать биотехнологию трансплантации эмбрионов у крупного рогатого скота, применительно к конкретным условиям, для повышения эффективности и ускорения темпов воспроизводства высокопродуктивного скота; усовершенствовать некоторые методические положения по гормональному вызыванию полиовуляции, отбору доноров и рештнентов, оценке качества эмбрионов и их криоконсервированию.

Научная новизна работы. Состоит в том, что впервые в нашей стране разработана технология вызывания суперову-ляцин путем комплексного применения гонадотропина (СЖК), рнлнзинг-гормона, витаминов А и Е и йодистых препаратов, что позволило повысить уровень овуляции, оплодотворяемость яйцеклеток и увеличить выход полноценных эмбрионов на одного обработанного донора.

Изучены факторы, влияющие на уровень суперовуляции, оплодотворяемость яйцеклеток и качество эибрионов. Усовершенствована методика составления и приготовления сред для получения н кратковременного хранения эмбрионов. Разработаны тесты морфологической оценки жизнеспособности эмбрионов и технология их кратковременного хранения перед Пересадкой п криоконсервированием. Усовершенствована 2

техника I! методы хирургического и нехирургичсского извлечения н пересадки эмбрионов. Сконструированы приборы и приспособления для этих целей. Значительно улучшена технология криоконсервировапня, хранения и оттаивания эмбрионов.

Впервые в нашей стране получено потомство от пересадки замороженно-оттаянных эмбрионов, осуществлена дальняя транспортировка и пересадка криоконсервированных эмбрионов в условиях ферм. Сконструированы полуавтоматический программный з а мор а жива тел ь, устройства и приспособления для хранения эмбрионов, что дало возможность упростить процесс замораживания и повысить жизнеспособность и прнжнвляемость эмбрионов после оттаивания и пересадки. Новизна 'исследований подтверждена 5 авторскими свидетельствами.

Пракическое значение раб°ты. На основе выполненных исследований усовершенствована телнология трансплантации эмбрионов, которая может быть использована в практике животноводства для получения достаточного числа однотипных потомков от высокопродуктивных коров. Разработаны методы повышения эффективности гормонального вызывания суперовуляции у коров-доноров эмбрионов для центров и пунктов, занимающихся трансплантацией, которые обеспечивает индуцирование суперовуляцпн у 83,9% коров, получение эмбрионов у 89,5% животных при числе овуляции от 7,7 дб 13,9 и выходе в среднем 3,9 нормального эмбриона на донора. Большую практическую значимость имеет методика, разработанная для оценки качества и кратковременного хранения эмбрионов, так как от качества и условий их хранения перед пересадкой в основной зависит успех трансплантации. Разработанные методические и технологические условия перс-садки двух зародышей или пересадка одного зародыша осе-меиетюму реципиенту позволяют получать высоки» процент стельности и отел двойнями до 50%.

Криоконсервирование зародышей в жидком азоте позволяет применять трансплантацию наиболее эффективно и с минимальными затратами. Так отпадает необходимость в содержании стада реципиентов, появляется возможность для создания национального генофонда зародышей от высокопродуктивных, редких и исчезающих пород животных и переводить зародыши па любые расстояния.

Возможность с большей эффективностью использовать повышенные репродуктивные свойства ко ров-доноров, благодаря гормональному вызыванию суперовуляции и контролю некоторых факторов во всей технологии трансплантации эмб-

рионов, является значительным потенциалом о проведении научных исследований.

Апробация полученных результатов. Основные положения диссертации доложены на ежегодных Ученых Советах ВИЖа в отчетах о научно-исследовательских работах (1977— 1983 гг.), на международных симпозиумах по трансплантации эмбрионов в ГДР октябрь 1976 г., сентябрь 1977 г., ноябрь 1978 г., октябрь 1931 г., сентябрь 1982 г., НРБ — октябрь 1979 г., ВНР — октябрь 1980 г., Дубровины, ВИЖ — 1978. 1982, 1983 гг., ФР.Г — октябрь 1983 г., на годичном собрании отделения животноводства ВАСХНИЛ — апрель 1983 г. (Москва), апрель 1984 г. (Дубровицы), на заседании Совета по селекции и гибридизации жнвотных при Президиуме ВАСХНИЛ (апрель 1983 г,, г. Москва), на координационном совешанин по заданию О. СХ. 77.08.04. (апрель 1983 г., Пушкин-Ленинград), на 2-м рабочем совещании по консервации генетических ресурсов (апрель 1984 г., Пущино), на республиканской конференции «Фундаментальные аспекты и практическое применение в медицине и сельском хозяйстве достижений биотехнологии» (4—8 июня 1984 г., Тарту).

Внедрение. Основные положения диссертации использованы в «Инструкции по трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота» МСХ СССР, М., 1984 и в шести методических рекомендациях: по гормональному вызыванию полиовуляцни; составлению сред для вымывания, хранения и кульгнвнрова-нин эмбрионов; хирургическому и нехирургнческому извлечению и пересадке; оценке качества и криоконсервированию эмбрионов сельскохозяйственных животных.

Объем работы. Работа изложена на . страницах

машинописного текста и иллюстрирована 69 таблицами и 37 рисунками. Библиографический список литературы содержит 400 источников, в том числе 327 иностранных.

Объект исследования. Исследования проводили на молочных фермах опытного хозяйства «Щапово», в ВИЖе в лаборатории трансплантации эмбрионов. Эксперименты по оценке эффективности гормонального вызывания суперовуляцни проведены в нескольких повторностях на 970 телках' и коровах. Технология хирургического и нехирургического получения и пересадки отработана на 1291 животном. Влияние факторов на уровень полиовуляции, оплодотворяемость яйцеклеток и качество эмбрионов изучено на 566 донорах. Испытания про-стагландина с целью синхронизации охоты проведены на 701 жнвотном-доиоре к реципиенте, морфологическая оценка жизнеспособности — на 2082 зародышах, крноконсервирова-ние и оттаивание — на 712 эмбрионах. 4

Методика исследований. Испытания различных вариантов гормонального вызывания суперовуляцин проводили на коровах и телках черно-пестрой породы с нормальный проявлением половых циклов. Для оценки стимулирующего действия гонадотропина определяли число овуляций н неовулкровав-ших фолликулов на 7—8-й день после осеменения. Извлекали зародыши у телок хирургическим методом, у коров — иехн-рургнческим. При разработке новых способов индуцирования суперовуляцин животным-донорам в начале проявления охоты внутримышечно вводили витамины «А» п «Е», а с кормом давали раз в сутки в течение 18—25 дней йодистый калий, а при введении гонадотропииа коровам инъецировали витамины в половинной дозе от первоначальной, вводимой в период проявления охоты. Для вызывания суперовуляцин применяли натнвный препарат СЖК в дозе 3600 и. е. одной серии (с активностью 200 и. е. в 1 мл).

Для снижения числа неовулировавших фолликулов использовали эту же схему гормональной обработки с той лишь разницей, что при втором осеменении вводили внутримышечно гонадотропин рнлизинг-гормон {1 мг телкам и 2 мг коровам). Для синхронизации охоты у доноров и реципиентов, те-лок-рештнентов обрабатывали проста гланд ниом на 12 тгеоз раньше, чем доноров.

Для определения влияния повторных гормональных обработок на чувствительность яичников к гонадотропнну и устойчивость органов воспроизведения к многократному нехирургическому извлечению животных обрабатывали СЖК на 10— 12-й день цикла в дозе 3600 и. е. В день извлечения эмбрионов коровам инъецировали простагландин. Вторую гормональную обработку проводили через б недель после первой.

Для извлечения эмбрионов использовали три основных оперативных метода: через разрез верхнего свода влагалища с использованием эффеминатора и без него; лапзратомию по белой линии живота с применением наркоза, через разрез в области голодной ямки под местной анестезией.

В экспериментах по нехирургическому извлечению зародышей применяли 4 вида катетеров: двухканальные катетеры' Фоллея, и три — нашей конструкции. По продолжительности введения в рог матки, объему введенной и удаленной жидкости, удобству в работе, числу извлеченных зародышей дана оценка конструкции катетеров.

Эмбрионы перед пересадкой или криоконсервированием оценивали под световым инвертированным микроскопом МБИ-13 по морфологическим признакам и жизнеспособности. Пересаживали эмбрионы хирургическим методом через боко-

вой разрез (г нехирургнческнм способом с использованием .катетера «Нонштадт» (ФРГ) л прибора нашей конструкции. Трансплантировали эмбрионы на 7—8-й день эстрального цикла при наличии у реципиентов хорошего активного желтого тела в одном из яичников. Эксперименты по пересадке двух эмбрионов хирургическим методом через боковой разрез проводили на телках.

Замораживали эмбрионы на программном замораживате-ле ЗГТ.00.00.00 харьковского опытного производства и полуавтоматической установке нашей конструкции. Крнозащитные вещества — ДМСО в 1,5 М и глицерин в 1,0 М концентрации в фосфатно-солевом буфере. Охлаждение с ДМСО — медленное и такое же оттаивание, с глицерином — ускоренное, двухступенчатое и быстрое оттаивание. Эквнлибрания в кр¡топротекторе — ступенчатая с нарастанием концентрации, удаление его — в обратной последовательности.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

I, Влияние дозы гонадотропина на уровень суперовуляции и качество эмбрионов

Гонадотропин (СЖК) в дозе 2,5—3,0 тыс. и., е. вызывал множественный рост фолликулов у 54,8% животных, в дозе 5,0—5,5 — у 58,8%. Увеличение дозы СЖК до 6—7 тыс, и. е. снижало число коров, реагирующих на гонадотропин, до 36,2% и повышало количество неовулировавших фолликулов с 1,5 и 2,7 до 5,3 на донора. У большинства животных 3-й группы (6—7 тыс. и. е.) не удалось получить даже яйцеклеток. Несколько лучшие результаты по извлечению (60,9—65,0%) и количеству нормальных эмбрионов на донора (1,7—1,9) были в 1-й, 2-й группах. Отмечена высокая вариабельность реакции яичников на гонадотропин. Суммарное число овуляций на оба яичника колебалось от 0 до 30. Испытанные дозы СЖК в среднем обеспечивали рост и развитие оптимального числа фолликулов. Наряду с этим были выявлены нежелательные последствия на гормональную обработку, такие как, полное отсутствие овуляции фолликулов, либо частичная овуляция их, а остальные превращались в кисты. Оплодотворяемость яйцеклеток у большинства обработанных животных была низкой и составила 30,4; 34,5 и 18,9%. В последующих исследованиях доза СЖК была сокращена до 2300—3000 и. е. В среднем уровень полиовуляции, индуцированный введением 2,3—2,5 тыс. и. е. СЖК. составил 8,0, а увеличение дозы препарата до 2,6—3,0 тыс. и. е. повышало число овуляций до 10 (Р<0,1). Число неовулировавших фолликулов почти было одинаковым (табл. I). 6

Доза СЖК (тыс, и, е.)

Показатели 2. 3—2. 5 . 2, 6—3, 0

(п=68)':. (п=г54>

Реагировало полноеуляцией (п — %) Среднее число овуляций на донора Чисдо неоаул крова вших фолликулов Оперировано животных (коровы—телки) Процент от числа обработанных животных -

Положительных доноров по извлечению зародыщеП

Пр(женг от числа оперированных

Вариабельность (%)

Среднее число зародышей на донора

Б том числе: нормальных

деге нер нр о в а н ных

неопл од отворенных яйцеклеток

51—75,0 8,0±0,70 2,4 а: 0,33 25—22

67,6—70,9

19—20 76—90,9 57,1—57,1

2.3±0,34— —5,3±0,63

1,5±0,31— —1,7±0,41 0,6±0,20— —1,4 ±0,42

0,2±0>,13— —2,2 ±0,65

43—79,6 10 ±0,89

2.1 ±0,75 34—13

87,2—86,6

31 — 10 ■ 91.2—76,9 93,1—76,5

4,3 ±0,63— —9,4 ±0,93

2.2 ±0,50— —3,4 ±0,81

1,8±0,49— —1,2±0,44.

0,3 ±0,21 — —4,8 ±1,54

Дозы СЖК в 2,6—3,0 тыс. и. е. практически почти у всех ■животных индуцировали дополнительный рост фолликулов. Однако различия в числе овуляций были весьма значительными (табл. 2).

Таблица 2

Реакция яичников н ее изменчивость у животных-доноров

Показатели

Корова

Телкн

п 1 % « 1 *

76 — 46 ___

4 5.3 ' 2 4,3

12 15,8 2 4,4

1 (.3 1 2.2

59 77,6 41 89,1

16 27,1 11 26,8

30 50,8 14 34,1

11 18,7 10 24,4

1 1.7 4 9.3

1 1,7 2 4,9

Обработано животных

Из них: не пришли в охоту

отсутствовала полиовуляция

отсутствовала овуляция фолликулов

Реагировало множественной овуляцией Число овуляций: от 2'до 5 6—10 И—16

' 17—22

23—30

В зависимости от дозы СЖК 65,2 и 51,2% зародышей у животных были нормальными, 26,9 и 41,8% — дегенер проз энными, а 8,6 и 7,6% яйцеклеток — исоплодотворспными. Число дегеперированных яйцеклеток по отношению к оплодотворенным достоверно выше при введении 2,6—3,0 тыс. и. е. СЖК (41,8 против 26,9%), Можно предположить, что у суперовули-ровавшнх животных создаются неблагоприятные условия в маточной среде, оказывающие влияние на качество зародышей при выходе их из яйцеводов в матку. Извлечение зародышей по отношению к числу овуляции было несколько выше, когда уровень овуляции был ниже.

Выяснено, что у л актирующих коров овуляторная реакция ниже,, чем у телок. Среднее число овуляций у л актирующих коров при введении й,3 'и 3,6 тыс. и. е. СЖК составило 8,5, . у телок — 10,4. Нормальных эмбрионов также было больше у телок, чем у коров (3,2 и 1,8 на донора). Лучшие результаты дало извлечение зародышей главным образом у коров с небольшими рогами матки. У большинства коров в нашем опыте было по крайней мере по 4 отела н требовался большой объем жидкости для наполнения рогов их матки. Это обстоятельство, вероятно, способствовало снижению результатов извлечения эмбрионов и составило 38,8% от числа овуляций. У телок этот показатель был выше почти в два раза (61,5%). При этом 50 и 54% эмбрионов были нормальные, 14 я 24% — дегенерированные, 36 и 21% — неоплодотворенные яйцеклетки, Не было существенных различий и в оплодотворяемости яйцеклеток (64,0 и 78,8%). Дегенерированных эмбрионов у .тактирующих коров было на 10% больше, чем у телок.

Влияние серии гонадотропина на уровень суперовуляции

' и качество зародышей

Для вызывания суперовуляции использовали 5 серий гонадотропина СЖК. Активность первых 4 серий установлена но тесту Стильман и Паули в сравнении с ннтергонаном. Серии 1 и 2, кроме того, тестированы по тесту снижения аскорбиновой кислоты в яичниках крыс. Серия 1 отличалась от серии 2 относительно высокой лютеонизирующен активностью. После применения серии 1, 2 и 5 в охоту пришло 81—89% животных, серии 4 — 100%. У животных каждой серии было от 6,2 до 9,4 овуляции. Отмечено достоверное различие по числу неовулироваиных фолликулов между О и 4 (Р<0,01), 2 и 4 (Р<0,02) сериями. У животных 4-й серии были выше оплодотворяемость яйцеклеток и выход нормальных эмбрионов по сравнению с другими сериями (табл. 3). 8

Реакция суперовуляции, о плодите ор я ем ость яйцеклеток и качество зародышей у животных-доноров в зависимости от серии гонадотропина

Показатели

Серии гонадотропина С Ж К*

I 2 I а

Обработано животных 26 12 32 20 9

Реагировало полновуля- . >

шгей 16 6 27 20 8

Среднее число на донора:

ор\ляццГ[ 6,5 ±0,9 6,2±1,7 9,0±1,0 8,1 ±0,Т 9.4 ±1.3

зародышей 3,2±0,7 2.0±0.7 3,7+(&9 4,5 + 0:9 &,в±1,4

ь том числе нормальных 1,1 ±0,2 0,5 ±0.4 1,2 + 0.3 3.1+0.6 1,1 ±0,4 О лл одот воряемость я й- А иеклеток (%) 72,0 68,0 44,0 97,0 63.0

Животные серии 3, 4 и 5 реагировали полновуляцней на 84—100%, а серии 1 и 2 только 50—61%. Почти все доноры (94—100%) имели оплодотворенные яйцеклетки за исключением животных 3 серии, среди которых только у 71% были оплодотворенные зародыши. Это свидетельствует, что частота полиовуляции и оплоотворяемость яйцеклеток связаны с серией гонадотропина. Причины этой связи неясны. Серии препаратов СЖК 1 и 2 различались между собой соотношением в них ФСГ и ЛГ активности. Однако в оплодотворяемо-стн яйцеклеток *и качестве эмбрионов не было существенных различий. Следовательно, эти показатели не связаны с соотношением ФСГ к ЛГ в исследованных препаратах гонадотропина.

Уровень суперовуляции и качество зародышей в зависимости от дня обработки гонадотропином

При индуцировании полиовуляции очень важен день введения СЖК. Установлено, что оптимальная реакция яичников на гонадотропин при обработке животных СЖК наблюдается па )0—12-и день эстрального цикла (табл. 4), Овуляторная реакция яичников при введении СЖК на 9 и 12-й день была почти одинаковой, но снижалось число овуляций и повышалась вариабельность (68%). Введение гонадотропина на 14-й день дало низкие результаты. У животных-доноров, обрабо--тэниых на 13 и 14-й день выделено только 1,3 и 1,8 оплодотворенных яйцеклеток. По числу иеовулировавшнх фолликулов в я-ячниках между группами не имело достоверных различий. Обработка животных на 9—П-й день дала лучшие результаты по числу и качеству эмбрионов,

Число овуляций н зародышей у коров и телок-доноров в зависимости от дня обработки СЖК

Дни обработки

Показатели 9-й 10-Й 11-й ' 12-й 13-й 14-й

■ (п = 17) (п=44) (п = 50) (п = 20) (п = 22) (л = 14)

14 41 47 18 19 14

82,3 93.1 94,0 90,0 во,6 100,0

7,6±1,398,8±0,84 8,0±0,77 8,8±1,34 7,7±1,70 5,5±0,76

8 31 33 14 10 10

57,1 75.6 70,2 77,7 52,6 71,4

3,7 ±1,4 3,2 ±0,54 2,7±0,7 2,3±0,88 2,3±0,89 2,3±0,57 1,6±0,65 1,6±0,ЗЭ 1,9 ±0,42 1,1 ±0,30 0,8 ±0,29 1,3±0,45

Влияние сезона года на уровень суперовуляции и качество зародышей

Показано, что процент реагирующих животных на гоиа-дотропнн летом к осенью выше, чем зимой и весной (табл. 5).

(При гормональной обработке животных весной н зимой отмечено достоверное увеличение числа неовулировавших фолликулов (Р<0,1), по сравнению с летом и осенью. По числу реагирующих животных и неовулировавших фолликулов различий между коровами и телками не было. Сезоны года не имели существенной связи с числом извлеченных зародышей. Однако нормальных эмбрионов было получено достоверно (Р<0,01) больше осенью, чем в другие сезоны года. Среднее число извлеченных зародышей, а также нормальных эмбрионов на донора во все сезоны года было больше у телок, чем у коров (6,7; 6,5; 6,6 и 5,7 против 3,2; 3,4; 3,9 и 3,2).

Из приведенных данных следует, что изменения, происходящие в организме коров и телок-доноров при гормональной обработке, в определенной мере связаны с сезоном годз. Осенью наблюдается более активная реакция животных на СЖК; чем в другое время года. Снизить вариабельность н повысить эффективность гормональной обработки жнвотных-

10

Реагировало пол нов уд я цн ей Процент от числа обработанных Среднее число овуляцш! на донора

Положительных доноров по извлечению эмбрионов

Процент от числа оперированных

Среднее число зародышей на донора

С том числе нормальных

Влияние сезона года на уровень супер овуляции и качество зародышей у коров н телок-доноров

Показатели* Весна (март—май) Лето Осень Зима

(июнь- (сентябрь— (декабрь-

август) ноябрь) февраль)

Обработано животных 65 84 84 98

Реагировало полловуля- 84 48 41 61

30 78 76 78

цией 69 31 ■ 41 53

Процент от числа обра- 76,9 92,8 90,4 79,5

ботанных 80,8 93,7 100,0 86,8

Среднее число овуляций 6,2 ±0,44 7,4 ±0,52 7,3 ±0,52 6.1 ±0,50

на донора 6,0 ±0.85 9,7±0,46 11,4 + 0,74 7,8 ±0,95

Среднее число зародышей

на донора (коровы 4-тел-

ки) 5,1 ±0,43 о,0±0,47 4,9 ±0,54 4,3 ±0,40

В том числе: нормаль-

ных 2,3 ±0,32 1,9±0,22 3,1 ±0,37 ) ,7 ±0,20

д сгенерированных 0^0,18 1,4 ±0,24 0,9 ±0,20 0,9 ±0.17

неоплодотворенных яй -

це клеток 2,0±0,40 1,7 ±0,32 0,8 ±0,30 1,6±0,33

* Верхнее число — коровы, нижнее — телкн.

доноров в разные сезоны года можно путем полноценного кормления, при полном обеспечении витаминами и микроэлементами и хорошего содержания.

Влияние витаминов «А» и «Е». йодистого калия на эффек-тнвнОсть гормонального вызывания суперовуляшпг у коров и тел Окг-,ДО н о ров.

Для выяснения возможности использования биологически активных веществ при гормональной обработке коров и телок-доноров были проведены исследования с введением в общую схему вызывания суперовуляции витаминов «А» и «Е», а также йодистого калия. Животным-донорам в день проявления охоты внутримышечно вводили витамины и одновременно с кормом в течение 18—25 дней давали йодистый калий, а при введении гонадотропина инъецировали витамины (в половинной дозе от первоначальной). Были испытаны различные дозы витаминов и йодистого калия.

Эксперименты показали, что двухкратное введение витамина в дозе 135 и. е. (первая инъекция) и 70 и. е. (вторая) н витамина «Е» соответственно 90 и 45 мг при ежедневном скармливании с кормом в течение до 25-тн дней 100 мг йодистого калия способствовало повышению уровня овуляции на

41,7%, числа извлеченных зародышей на 52,0%, нормальных эмбрионов — в 2,2 раза и снижению числа дегенерированных и неоплодотворенных зародышей по сравнению с контролем (табл. 6)*.

Таблица 6

Результаты суперовуляции и число зародышей у коров-доноров при введении витаминов и йодистого калия

Опытные группы

Показатели Контроль« ная группа А—135—70 тыс. И. Е. Е —90—45 мг,' йодистый калий (мг) НЮ toü —75 тыс. И. Е., 100—50 мг, йодистый ка-лий^мг)

Число животных 29 30 30

В среднем на донора:

овуляций 6,4 ±0,4 11,9 + 0,6 9,4 ±0.8

зародышей 4,8±0,6 7,3 ±0,8 5,4 ±0,8

В том числе:

нормальных 2.$±0,5 6,2 ±0.4 4,3 + 0,8

дегенерированных 0,8 ±0,3 0,6±0,4 0,6 ±0,3

неоп лодот во рен ны х 0.6±0,4 0,5 ±0,6

яйцеклеток 1.2±1.1

Аналогичные результаты были получены и в научно-производственных опытах (табл.7).

Таблица 7

Уровень полиовуляции и число »а роды шей у коров п телок-доноров при введении витаминов и йодистого калия

Показатели

Коровы <п=.Ц2)

Телки

(п=68)

Реагировало полновуляцней (п — Среднее число овуляций на донора Процент от числа фоллнкулоо Положительных доноров по извлечению эмбрионов (ц — %) Среднее число зародышей: из донора В том числе: нормальных

дегенерированных неоплодотворенных яйцеклеток

91—81,2 60—88,2

7.7±0,52 13,9± 1,21

82,4 86,1

75—86.2 53—94,6

3,4 ±0,30 8,3 ±0.96

1,8±0,20 3,9 ±0,53

0,8±0,15 . 1,5 ±0,23

0,8±0,15 3,8 ±1,02

Характерной особенностью этой схемы обработки является четкая синхронизация охоты у коров. Все животные проявили признаки охоты через 48 часов после введения проста* гландина. В научно-производственном опыте пз 112 коров проявили признаки охоты 107 (95,5%), несколько меньше этотпо-казатель был у телок (88,2%),

Критериями эффективности гормональной обработки доноров следует считать число животных, от которых получены эмбрионы. В данном опыте этот показатель был высоким и составил 86,2% у коров и 94,6% у телок. Важным показателем является также уровень овуляции созревших фолликулов. Использованная схема гормональной обрабткн обеспечивает высокий уровень овуляций (в пределах 82—86%),

Относительно сильную реакцию яичннков, особенно в группе телок, можно, вероятно, объяснить повышенной реактивностью животных на гонадотропин под влиянием биологически активных веществ.

Влияние гонадотропина рилизинг-гормона на уровень суперовуляции и качество эмбрионов

Реакция яичников коров и телок при комплексном применении СЖК в сочетании с прост атландинамн VI биологически активными веществами в значительной степени зависит от дозы гонадотропина. Наиболее эффективной дозой по ФСГ следует считать 2500—3000 и, е,, которая обеспечивает значительный рост фолликулов в яичниках (от 4 до 26 на каждого обработанного донора). При этом из-за недостатка лютеопи-зирующего гормона не все индуцированные к росту фолликулы овулируют,

В связи с этим были проведены исследования, направленные на снижение числа неовулировавших фолликулов путем включения в обшую схему гормональной обработки гонадотропина рилизинг-гормона, который вводили внутримышечно при втором осеменении (1 мг телкам н 2 мг коровам).

Рилизинг-гормон обеспечивал увеличение уровня овуляции на достоверную величину (Р<0,001). У коров уровень овуляции был выше на 1(3,1% (Р<0,001), у телок — на 30,8% (Р<0,05) при коэффициенте изменчивости соответственно 50,0 и 45,6%; 64,0 и 47,6%. С повышением числа овуляций

13

увеличивался выход нормальных эмбрионов. Этот показатель был достоверно выше у опытных животных (табл. 8). Превышение составило 30,3% (Р<0,01).

Таблица 8

Влияние рнлнзинг-гормона на уровень су пер овуляции н качество эмбрионов у коров и телок-доноров

Группы

Показатели контрольная опытная

(п=52) (п=53>

Реагировало полиовуляцией (п—%) 46—88,5 51—96,2

Среднее число овуляций: на донора 8,5±0,82 11,4 ±0.68

У коров 6,0 ±0,60 6,9±0,67

У тело« 11,0±1,40 15,9 ±1,43

Неовутшро в а вш н х фолликулов 1,3 ±0,20 1,1 ±0,30

Положительных доноров по извлечению

эмбрионов (п— %) 37—90.2 44—91,6

Среднее число зародышей: на донора 5,3 ±0,68 7,6 ±0,83

В том числе: нормальных 2,4 ±0,40 3,4 ±0,46

дегенерированных 0,9±0,18 1,2 ±0,33

неоплодотворенных яйцеклеток 2,0±0.47 3,0 ±0,67

Под влиянием рилнзипг-гормна несколько уменьшалось число неоплодотворенных яйцеклеток. Однако у телок оно сопровождалось увеличением числа дегенерированных эмбрионов. У коров этот показатель не имел различий. Полученные данные свидетельствуют о том, что рилизинг-гормои способствовал регуляции физиологических процессов в яичниках и матке, что сопровождалось повышением уровня овуляции, оп-лодотворяемости яйцеклеток и выходом нормальных эмбрионов.

Синхронизация охоты у коров-доноров и тело к-реципиентов

В настоящее время для синхронизации охоты у доноров и реципиентов используют в основном иростагландин или его аналоги, как наиболее результативные и несложные в практической работе. Синхронизация охоты должна быть такой, чтобы обеспечить максимум животных в охоте в течение 24 часов, при двухкратной выборке с промежутком 12 часов и

постоянном интервале между окончанием обработки и началом охоты. Телок-реципиентов следует обрабатывать на 12 часов раньше доноров и только тех животных, у которых перед обработкой за 10—12 дней был установлен половой цикл, а в день введения препарата — хорошо выраженное желтое тело. Нами установлено, что простагландниы, введенные через 48 часов после СЖК, обеспечивают проявление астрального цикла у 95,3% животных (табл. 9).

Таблица 9

Синхронизация охоты у коров и телок-доноров (п — %)

П ро ста гл а ндин ы

Показатели люта лиз j эстрофан

энза прост

Обработано животных 305 309 87

Проявил к признаки охоты 279—91,5 307—99,3 82—94,2

В том числе: через 48 часов ■ 258—84,6 292—94,5 80—91,9

72 часа 21—6,8 15—4,8 2—2,3 •

Не пришли в охоту 26—8,6 2—0,7 5—5,8

Лишь незначительное число животных пришло в охоту черйз 72 часа и 4,7% их не реагировали на простагландин. Существенных различий в результатах синхронизации между коровами и телками-донорами не выявлено. По эффективности действия лучшими препаратами оказались «Л ют а л из» и «Эстрофан».

Результаты синхронизации охоты у телок-реципиентов без СЖК были несколько ниже. Так, за 96 часов после введения простагландина проявили признаки охоты 86,6% животных (182 из 210), в том числе через 48 часов — 74,7%; 72 — 7,1%; 96 — 4,7%. После однократного введения простагландина не Есе животные реагировали на препарат (табл. 10). Причи-

Таблица 10 Синхронизация охоты у телок-реципиентов (п — %)

Показатели Группы

[ (энза-прост) 1 И (люта л из) III (эсгро. фан)

Обработано животных 52 108 50

Проявили признаки охоты 44—84,6 93—86,1 46—92,0

Б. той числе через: 48 часов 32—61,5 87—80,6 38—76,0

72 часа 6—11,5 ¡£-1,8 7—14.0

96 часов 5—8,6 4—3,7 1—2.0

. ]08 часов 1—1,8 — —

Не пришли в охоту 8-15,4 15—13,9 4—8,0

15

на этого, вероятно, возможные ошибки определения возраста и качества желтого тела перед инъекцией простагландина. Более высокие результаты синхронизации охоты были получены при обработке телок простагландином с 10 по 13-й день астрального цикла (89,3—90,5%), по сравнению с обработкой на 8-й (69,6%) и 14-й день (64,7%). Введение простагландина на 9—10 н 13-й день повышало результаты синхронизации охоты у телок (80,0; 89,3; 90,5%), по они были ниже; чем при обработке на 11 и 12-й день (95,1 и 96,4%). При применении простагландина раньше 9-го и позднее 13-го дня во всех случаях результаты прихода телок в охоту были хуже.

Повторное гормональное вызывание полиовуляции у коров-доноров

Применение биотехнического метода трансплантации эмбрионов удлиняет промежуток времени получения телят от коров-доноров после гормональной обработки. Организму нуж* но определенное время для восстановления нормального цикла после суперовуляцин. Кроме того, фактором, ограничивающим получение эмбрионов, будут накапливающиеся нарушения в половом тракте коров при увеличении числа нехи'рур-гических извлечений зародышей. Установлено, что средний уровень полиовуляции, индуцированный СЖК в дозе 3600 и. е„ число реагирующих животных и количество зародышей после двух обработок почти не изменяется (табл. 11).

Таблица И

Суперовуляция н число зародышей у коров-доноров после двух гормональных обработок

Показатели Обработки Бесплодные

первая 1 вторая коровы

Обработано коров 40 36 23

Реагировало полиовуляци-

ей (л— %> 38—95,0 35—97.2 20—"35.9

Среднее число овуляций на

донора 10,4± 1,7 10,2± 1,5 8,9 ±0.83

Положительных доноров по

извлечению эмбрионов (п — %) 33—86,6 28—80,0 14—70,0

Среднее число зародышей на 6,8 ±0,9 4,6 ±0,8

донора 7,0 ±1,4

Процент от числа овуляций 67,3 66,6 48,3

В том числе: нормальных 5,3±0,9 3,2 ±0,6 1,8 ±0,4

дегеиерирован- 0,8 ±0.3 1,9 ±0,7 0,9±0,8

ных -

неоплодотво-

рениыч яйце- *

клеток 0,9 ±0,8 1,7 ±0,7 1,9±0,3

Несколько ниже были результаты при гормональной обработке часто перегуливающих коров. Выявлено, что при второй обработке у некоторых животных появляются кисты в яичниках (2,8%), а у бесплодных коров даже после первой обработки (13,0%). Наибольшие различия были выявлены в качестве эмбрионов н оплодотворяемости яйцеклеток после второй обработки в 3 группе животных. Нормальных эмбрионов было достоверно меньше после второй гормональной обработки (Р<0,01). Оплодотворяемость яйцеклеток после второй обработки составила 87%, второй — 75% и у проблемных животных — 58,6%,

Подлинная причина снижения оплодотворяемости яйцеклеток после второй гормональной обработки и у многократно перегуливающих коров пока неизвестна, но определенные морфологические дефекты, возникающие в процессе роста ооцитов, могут быть одной из причин, а если они и оплодотворяются, то ухудшается качество эмбрионов. Полученные результаты показывают, что животные с нормальной оплодот-воряемостью более подходящи и для использования их в качестве доноров, чем часто перегуливающие.

Использование высокопродуктивных коров в качестве доноров эмбрионов

В последние годы обсуждается вопрос, остаются ли пригодными для последующего воспроизводства коровы-доноры после гормонального вызывания множественной овуляции и нехирургического извлечения эмбрионов. В исследованиях выявлено, что при первой гормональной обработке можно получить в среднем 10,8 овуляции. |После второй — реакция яичников на гонадотропнн снижается почти в два раза (6,2 овуляции). Кроме того, число коров, реагирующих полиовуляцией, снижается до 55,5%.

Нехирургическим методом после первой обработки были извлечены зародыши у 77,8% животных (7 из 9), после второй у 75% (3 из 4). В среднем за две обработки получено по 8,3 зародыша, из них 4,3 нормальных, 2,8 дегенернрованных и 1,2 неоплодотворениой яйцеклетки. При пересадке 26 эмрио-нов хирургическим методом телкам-реципиентам получено 17 стёльностей (65,4%). Число стельностей колебалось от 1 до 4, пересаженных эмбрионов — в среднем 6,7 л телят —: 2,7 на донора.

Длительность суперовуляторного цикла у коров была в среднем 23,2 дня (от 8 до 36 дней). Оплодотворяемость коров-доноров посла первого осеменення составила 42,8% (3 из 7), после второго — 57,2%.

2—5694 17

Эксперименты показали, что нативный препарат СЖК в отдельных случаях вызывает нарушение астрального цикла после двух обработок, что приводит к повторным осеменениям и удлинению межотельного периода. Нехирургическое извлечение представляет меньший риск для последующей плодовитости высокопродуктивных животных.

Методы извлечения эмбрионов у коров и телок-доноров

Получение зародышей у животных-доноров является одной из важнейших составных частей общей технологии трансплантации эмбрионов и требует тщательного и безошибочного осуществления. Техника извлечения эмбрионов у одних видов животных заметно отличается от техники получения их от других видов. Главная цель этой операции — получение максимального числа зародышей и сохранение их жизнеспособности до пересадки.

Хирургические методы. В опытах были использованы три основных оперативных метода, обеспечивающих доступ к внутренним половым органам: через разрез верхнего свода влагалища с использованием специального прибора (эффе-мниатор) и без него; лапаротомия по вентральной линии живота с использованием наркоза; лапаротомия в области голодной ямки под местной анестезией (табл. 12).

Таблица 12

Результаты хирургического извлечения эмбрионов у коров и телок-доноров

Методы извлечения

Показатели частичная гистерэктомия вентральный разрез боковой разрез

телки коровы

Оперировано животных 50

Число овуляций: всего 374

на одного донора 8,9±0,94

Извлечено зародышей 282,

Процент от числа овуляций 75,4 Среднее число нормальных эмбрионов я а донора

43 427 9,9 ±0,78 228 53,4

38 302 7,9±0,43 98 32.9

5,3±0.97 2,6±0,73

3,4± 1,12

Методом частичной гистерэктомии от 50 оперированных телок было получено 282 зародыша. Из них 143 (50,7%) — нормальных, 55 (19,5%) дегенерированных и 84 (29,8%) не-оплодотвореннех яйцеклеток. Этот метод можно применять при одноразовом использовании животных в качестве доноров эмбрионов. 18

Операции по белой линии более эффективны, так как в отдельных случаях позволяют извлекать 100% эмбрионов. В опытах часть животных использовали дважды с удовлетворительными результатами.

При извлечении эмбрионов у коров через боковой разрез в сбласти голодной ямки хорошие показатели в основном получены при промывании рога матки со стороны разреза. Промывание противоположных рогов матки дает низкий эффект и возникают трудности в подтягивании их через просвет раны и фиксировании. На телках этот метод применять не следует из-за небольших размеров маточных рогов. Несмотря на относительную простоту хирургической техники извлечения эмбрионов, требуется высокая квалификация хирурга, а операции следует проводить в операционном зале с применением современного оборудования и средств асептики.

Нехирургические методы. Преодоление некоторых технических и физиологических ограничений, связанных с хирургической техникой, способствовало широкому развитию пехирур-гического метода извлечения эмбрионов. Биотехнический метод ^бескровного получения эмбрионов должен быть простым и надежным, позволяющим получать их с высокой результативностью в условиях ферм. Для этих целей были сконструированы и изготовлены три вида катетеров н приспособлений к ним.

Техника вымывания зародышей, при использовании безбаллонных катетеров значительно усложняется при недостаточном проявлении сокральной анестезин. В этих случаях применение катетеров с надувным баллоном более надежно. Техника введения наконечника катетера до верхушки рога магки оказывает решающее влияние на результаты извлечения зародышей. При извлечении эмбрионов у коров-доноров (п= 119) двухканальным-и одноканальным катетерами в первом случае не получено эмбрионов у 20%, во втором — у 28% животных. Среднее число эмбрионов на донора было соответственно 3,3 'и 4,2, а эффективность извлечения от числа овуляций — 53,5%. Не выявлено разницы в количестве извлеченных эмбрионов при использовании одноходового катетера, когда верхушка его была размещена на расстоянии не более 5 см от маточнотрубного соединения и когда баллон двухходового катетера располагался в середине рога матки (54,6 против 51,3%).

Сравнительные 'испытания модифицированных катетеров, изготовленных из латекса и обычной резины, показали, что при хорошем навыке работы все три катетера могут быть использованы для извлечения эмбрионов (табл. 13). Имеющиеся различия между группами, вероятно, больше обусловлены

вариациями в числе овуляций, чем различиями в конструкции катетеров. Кроме того, не всегда имеется возможность получения зародышей от любого донора. Отсутствие их в среднем у 30% животных может быть объяснено задержкой яйцеклеток в яйцеводе, их дегенерацией и рассасыванием, отсутствием овуляций, неудачным промыванием и другие.

Результаты извлечения эмбрионов, выполненных на 7—8-й день после осеменения, были лучше (70—76%), чем при вымывании их на 5—0-й день (54%). Среднее число нормальных эмбрионов в разные периоды исследований различалось, что свидетельствует об индивидуальной суперовуляторной реакции коров-доноров на гонадотропин и их особенностях воспроизводства жизнеспособных эмбрионов.

Установлено, что нехирургическое извлечение эмбрионов с помощью устройств из резины не оказывает заметного влияния на последующую плодовитость коров-доноров. После усовершенствования и некоторой модернизации существующих и создания принципиально новых катетеров, а также улучшения техники промывания рогов матки результаты заметно улучшились. Эффективность извлечения эмбрионов у коров-доноров с множественной овуляцией в основном зависит не от конструкции приборов и полноты извлечения промывной жидкости, а от типа гормональных препаратов, используемых для вызывания суперовуляции.

Таблица 13

Результаты извлечения эмбрионов у коров-доноров разными катетерами

Катетеры

Показатели фол лея в металлической трубке без баллонный 0дноканалькый со съемным наконечником двухкакадь* нын резиновый с баллоном

Оперировано животных 42 41 41

Положительных доноров по извлечению эмбрионов (п — %) 26—61,9 31—75,6 35—85,4

Среднее число овуляций па оперированного донора »,7 ±0,43 9,1 ±0,28 8.4 ±0.23

Среднее число зародышей на донора 5,3 ±0,63 5,8 ±0,47 6.9±0,72

Процент от числа овуляций 37,8 48.2 70,0

В1 том числе: нормальных 2,1 2,8 3.7

дегенернрованных 1,7 1,4 1.4

неоплод отворенных, яйцеклеток 1,5 1,6 1.8

20 ^ 9

Оценка качества зародышей при трансплантации

Основным методом оценки является морфологическое состояние зародышей. Ее целью является отбор неоплодотво-реш-шх яйцеклеток, определение стадии их развития, выявление повреждений отдельных бластомеров или всего эмбриона. Нормальное развитие, заканчивающееся рождением нового организма, является окончательным свидетельством полноценности испытуемого зародыша. Однако при проведении пересадок эмбрионов требуется немедленно определить их жизнеспособность исключительно по морфологическим признакам. При этом учитывают целостность и равномерность развития бластомеров, прозрачность перивителлннового пространства, целостность зоны пеллюцида, соответствие стадий развития возрасту зародышей. Показатели морфологической оценки исключительно важны, поскольку видимая морфологическая разнокачественность является выражением внутренней скрытой физической, биологической и физиологической неравноценности зародышей.

Полноценными считаются такие эмбрионы, которые имеют правильную шарообразную форму, гомогенную светлую про-топлззму, целостную прозрачную зону, одинакового размера бластомерьс с определенным характером их расположения {плотность межклеточных контактов). Они должны по уровню дробления соответствовать возрасту от оплодотворения до извлечения.

Неполноценными считаются зародыши с неравномерными по величине бластомерамн, лизисом протоплазмы, отсутствием прозрачной оболочки, отстаиванием в дроблении. Определение уровня дробления очень важно потому, что отставание в темпе дробления в 90% случаев свидетельствует о начальных этапах дегенерации эмбриона.

По степени развития различают ранние и поздние морулы, ранние бластоцисты с растянутой полостью и без прозрачной зоны. Наблюдаются большие вариации в состоянии бласто-цнет не только у разных доноров, но даже у одного итого же. На 7-й день после осеменения преобладают поздние морулы (37%) и ранние бластоцисты (60%), на 8-й день — ранние бластоцисты (32%) и бластоцисты с полостью (52%). Выявлено, что из общего числа (п = 1512) исследованных зародышей 38,2% были нормальными, 24,1% —дегенерироваиными и 37,7% — неоплодотворенные яйцеклетки. У телок-доноров по сравнению с коровами получено меньше нормальных эмбрионов (3(3,6 против 46,8%) и больше неоплодотворенных яйцеклеток (42,8 против 28,4%). Оплодотворяемость яйцеклетоку коров была выше на 14,4%, При разной степени суперову-

ляцни наблюдается различная жизнеспособность и физиологическая активность зародышей. С увеличением числа овуляций число нормальных эмбрнонов снижается с 54 до 22%.

Установлено, что одинаково могут приживляться ранние зародыши (4—6 дней), морулы и бластоцисты. От пересадки ранних зародышей (до 16 бластомеров) стельность составила 50% (7 из 14), морул — 38,3% (18 из47), бластоцист — 38,7% (12 из 31). Важнейшим условием успешного развития зародышей после пересадки помимо их полноценности является физиологическое состояние реципиента и в частности функциональное состояние эндометрия, обеспечивающего условия нормального эмбриогенеза. Определяющим фактором в этой связн будет синхронность развития зародыша у донора и дифференциация эндометрия у реципиента. При регулировании полового цикла у доноров и реципиентов важна их одинаковая реакция на обработки, хотя на практике встречаются значительные индивидуальные вариации и их необходимо учитывать при пересадке зародышей.

Методы и результаты пересадки эмбрионов

Техника пересадки эмбрнонов приемлема для многих видов животных, но имеются отдельные детали в операциях, которые применимы только для крупного рогатого скота, в особенности это касается пересадок,осуществляемыхнепосред-ственно на фермах. Очень большое влияние на результативность эмбриопересадок оказывает степень синхронности эст-ралных циклов. Имеется еще ряд технических трудностей в осуществлении пересадок, включая реактивность животных при стимуляции полиовуляции, качество зародышей, технику пересадки, постоперационные спайки и др. При пересадке, кроме альтернативного отбора по качеству, придается большое значение возрасту зародышей и его соответствию с темп сроками, какие отделяют извлечение от осеменения.

Пересадка хирургическим методом. Для этой цели использовали метод лапаротомпп по белой линии живота с использованием наркоза и более простой и менее трудоемкий — через боковой разрез в области голодной ямки справа или слева на стороне желтого тела в яичнике. Стельность наблюдается как при односторонней, так и двустороннем хирургической лересадке (соответственно 38,7 и 42,8%). Уровень стельности повышается при пересадке двух зародышей. Приживляем ость зависит от возраста эмбрнонов. От пересадки 6 дневных зародышей стельность была зарегистрирована у 46,4%, 7-дневных — у 54,1% и 8—9-дневных — у 50% животных. В целом из 183 телок-реципиентов стали стельными 92 (50,3%). На 22

результаты пересадки оказывают влияние скрытые неизвестные факторы, как и при естественной оплодотворяем ости в стаде. Кроме того, от одного или двух доноров зародыши имеют различную приживляемость, что оказывает существенное влияние па результаты пересадки.

Пересадка нехирургическим методом. Оптимальное местонахождение эмбриона в ходе пересадки обуславливается местом, на котором бы он находился при естественном зачатии. Для выполнения этих условий была разработана конструкция прибора, позволяющая апплицировать зародыш как можно краннально в рог матки с желтым телом в яичнике. Наряду с оптимальным положением эмбриона в полости рога очень важно соблюдение асептики при пересадке, что обеспечивалось применением специальной защитной оболочки из парафинированной стерильной бумаги. Результаты нехирургической пересадки по годам исследований приведены в таблице 14.

Таблица 14

Результаты пересадки эмбрионов не хирургическим методом

Годы Пересажено эмбрионов Число реципиентов Стельных реципиентов Процент стельности

1980 21 21 10 45,0

1981 47 44 23 52,3

1982 36 36 23 63,8

1983 119 119 61 51,3

Всего 223 220 117 53,2

Установлено, что результаты приживляем ости эмбрионов во многом зависят от качества пересаживаемых зародышей и стадии их развития. Наиболее подходящей стадией для нехирургической пересадки является поздняя морула, ранние и поздние бластоцисты. Приживляемость от пересадки ранних и поздних бластоцист с морфологической оценкой «отличные» и «хорошие» составила 60,8 и 64,7%.

Результаты эмбриопересадок нехирургическим методом показали, что место расположения эмбрионов в просвете рога матки связано с их приживллемостью. Зародыши, пересаженные у основания рога матки, дали стельность у 16,6% животных, а в верхушку рога — 55,4%, что, вероятно, связано с неадекватным эмбриональным и маточным взаимодействием до и в имплантаиионный период.

Пересадка эмбрионов предварительно осемененным телкам не оказывает влияния на приживляемость собственного эмбриона, и она меньше при конгрлатеральной (36%), чем при ипенлатеральной пересадки (57,1%).

Применение метода пересадок эмбрионов с целью получения двоен

Пересадка двух эмбрионов является перспективным методом увеличения выхода телят при соответствующем подборе реципиентов и отборе эмбрионов. Пересаживали эмбрионы хирургическим методом через боковой разрез. Ограничение подвижности животного во время пересадки достигалось внутримышечной инъекцией 0,8 мл комбилена. Эмбрион вводили сначала в противоположный от разреза рог, а затем во второй рог маткн.

При подтягивании рогов матки необходимо их выводить в разрез за маточную связку в момент полного расслабления маточных мышц, при этом нельзя касаться стенок рогов матки. Несоблюдение этих правил вызывает микротравмы эндометрия, вследствие чего значительно снижается прнживляе-мость эмбрионов после пересадки. Эмбрионы апплицнровали в верхушку рога матки приблизительно в 50 мм от маточно-трубного соединения. Из 52 пересаженных эмбрионов стельность составила 61,5%, а рождение двоен от числа стельных — 50%. Не былоотклоненийотнормыутелок, отелившихся двойнями. Средняя продолжительность стельности при двойнях была меньше, чем одинцами (258,0±3,4 против 272,1 ±3,2 дней). Двойни, в основном телочки, имели массу тела при рождении ниже (26,0±0,50 кг), чем одинцы (38,2±0,94 кг), хотя общая масса двух телят была выше (50,8±2,53 кг).

Криоконсервиро&ание эмбрионов

Эмбрион, который на 20%. состоит из твердых составных частей и на 80% из воды, подвержен двум негативным влияниям — образованию интрацеллюлярных кристаллов и воздействию высоких концентраций солей, С повышением концентрации солн в частично замерзшей среде из эмбриона выделяется вода, повышается количество интрацеллюлярнок жидкости, а точка замерзания понижается. При медленном обезвоживании эмбриона затрудняется образование льда. Предпосылкой этому является медленное охлаждение, при котором достаточно времени для выделения воды. Подходящая скорость охлаждения, обеспечивающая медленную отдачу воды — 0,3е С/мин.

При быстром изменении температуры в период заморозки переохлажденной среды в ампуле с эмбрионами эта скорость значительно бы увеличивалась. Поэтому нужна принудительная кристаллизация для того, чтобы избежать ннтра-целлюлярного образования льда. При оттаивании обезвожи-24

ванис клеток эмбриона переходит в свою противоположность. Из-за отсутствия процессов переохлаждения в клетках эмбриона, скорость оттаивания может быть больше — примерно 10°С в минуту,

В итоге многолетних исследование! наметилось два направления в разработке методов криоконсервирования эмбрионов: а) медленное охлаждение биообъекта при минусовой температуре, когда замораживание сопровождается дегидратацией клеток с последующим переходом в твердое состояние и мед-,ленное оттаивание, при котором регидратация клеток протекает постепенно; б) эмбрионы при переходе на минусовые температуры медленно охлаждают, приблизительно до минус 38—40°С, а затем резко замораживают. Прн этом полной дегидратации клеток не происходит, поэтому оттаивание производят с быстрой скоростью,

Криотехника для глубокого замораживания эмбрионов,

В настоящее время не вызывает сомнения положение, что замораживание биологическнх/объектов требустрого определенных режимов охлаждения. Нарушение их или применение неправильно подобранных режимов, как правило, повреждает эмбрионы, что приводит к снижению или полной потери их прнживляемости после пересадки.

В исследованиях установлено, что если строго соблюдать правила подготовки и режим замораживания эмбрионов высокого качества, то они удовлетворительно переносят крио-консервацию и в 80% случаев сохраняют жизнеспособность при длительном хранении.

Для выполнения необходимого режима замораживания использовали полуавтоматическую установку с высокой точностью режима работы с отклонением до ±0,5"С от заданной программы. Наряду с этим применяли программный замора* живатель ЗПБ.00.00.00. с некоторыми нашими техническими •решениями по усовершенствованию работы с эмбрионами в процессе подготовки и замораживания. Для контейнеров с эмбрионами сконструировали и изготовили специальные держатели из нержавеющей стали. Металлическую крышку камеры заменили на пластмассовую с 4 отверстиями и с пробками на держателях, что создало необходимое удобство в осуществлении процесса кристаллизации.

Для хранения эмбрионов в жидком азоте было разработано унифицированное устройство, обеспечивающее постоянство температуры эмбрионов во время их извлечения из сосуда и переноса.

Режим замораживания и огтаивання эмбрионов. Положительные результаты были получены при медленном охлаждении эмбрионов (0;3°С/мнн), начиная с момента кристаллизации до минус 50°С, затем их погружали в жидкий азот. Из 77 замороженных и оттаянных эмбрионов 26 имели признаки дегенерации (33,8%), 51 (66,2%) были нормальными, а некоторые из них с незначительными отклонениями от нормы. Проведенные эксперименты показали, что достаточная степень эмбриональной приживляемости может быть получена при сравнительно простых процедурах замораживания и оттаивания. Стадия развития эмбрионов играет существенную роль в сохранении их жизнеспособности после замораживания и оттаивания. Предшествующие стадии бластоцисте проявляют высокую чувствительность к охлаждению и их жизнеспособность заметно снижается. В исследованиях выяснено, что наиболее приемлемым возрастом эмбрионов для замораживания являются ранние и экспандированные бластоцнсты (табл. 15).

Таблица 15

Результаты замораживания, оттаивания и трансплантации амбрионов

Показатели Стадии развития эмбрионов

ранние экспандированные без зоны пеллюцида

Заморожено и оттаяно 20 36 21

Дегенернроаанные (п — %) 5—25,0 10—27,8 11—52,3

Переса жеко 15 26 10

Число реципиентов 8 13 6

Стельных реципиентов (п— %) 4—50,0 6—46,1 1—16,7

Получено телят 4 8 1

Приживляем ость эмбрио-

нов <%) 26,7 30,7 10,0

Значительных различий в стельности реципиентов и приживляемости 7- или 8-дневных бластоцист, заключениях в зону пеллюцида, не выявлено. Отмечено снижение результатов стельности и приживляемости бластоцист, покинувших зону пеллюцида. Приведенные результаты свидетелствуют о возможности использования метода медленного (0,3"С/мин) замораживания и медленного оттаивания (4°С/мин) до минус 10°С и быстрого доведения до комнатной температуры.

Манипуляции с эмбрионами занимают, как правило, 2,0— 2,5 часа от момента их получения до пересадки или замораживания. При этом очень важно создать такие условия, которые обеспечивали бы сохранение жизнеспособности эмбрио-26

иов. С этой целью разработана методика кратковременного хранения эмбрионов»

В сравнительных опытах по оценке выживаемости 7 и 8-дневных эмбрионов с использованием двух режимов замораживания — медленное охлаждение и оттаивание с криопро-тектором ДМСО в 1,5 молярной концентрации, сокращенное охлаждение и быстрое оттаивание с криопротектором глицерином в 1,0 молярной концентрации — показан высокий уровень их выживаемости после оттаивания (79,3 и 84,6%). Не было существенных различий в приживляемостн эмбрионов после нехирургической их пересадки (табл. 16).

Таблица 16

Влияние режима охлаждения и кркопротектора на жизнеспособность эмбрионов

Показатели

Режим и криопротектор

медленный (ДМСО)

ускоренней (глицерин)

Заморожено и оттаяно эмбрионов 52 53

Пригодных к пересадке (п — %) 44—84.6 42—79,2

Пересажено эмбрионов 44 42

Стельных реципиентов (п — %) 23—52,3 28—66,6

Продолжительность хранения эмбрионов в жидком азоте не оказывает существенного влияния на приживляемость их после пересадки. Так, стельность после пересадки эмбрионов, хранившихся в азоте до 1 месяца, составила 36,4% (п=40), от I До 13—52,9% (п = 24), от 3 до 6 — 42,8% (п = 21), от 6 до 12 — 72,7% (п=14), более 12 месяцев — 52,9% (п=23). Этот показатель зависит от качества эмбрионов перед замораживанием. Эмбрионы, оцененные как посредственные, нецелесообразно криоконсервировать, так как после оттаивания около 40% из них сановятся непригодными к пересадке. Их необходимо трансплантировать сразу же после извлечения.

ВЫВОДЫ

[. Разработанный новый способ гормонального вызывания суперовуляции обеспечивает приход в охоту 95% коров, индуцирование полиовуляции у 83,9%, извлечение зародышей у 89,5% животных при среднем числе овуляций от 7,7 до 13,9, нормальных эмбрионов до 3,9 на донора. Включение в общую схему гормональной обработки гонадотропин рилизинг-гормо-на при втором осеменении снижает число неовулировавшнх фолликулов на 25,4% и в два раза увеличивает выход нормальных эмбрионов.

2. Комплексная обработка СЖК, простаглаидииом к биологически активными веществами коров и телок-доноров и телок-реципиентов с активным желтым телом в яичнике с 10 по 12-й день астрального цикла четко синхронизирует охоту у 90—95% животных в течение 48 часов. У реципиентов результаты синхронизации охоты снижаются на 20,4 и 31,3% при обработке их лростагландином на 8 и 14-й день цикла. Для точной синхронизации охоты у реципиентов их необходимо обрабатывать на 12 часов раньше, чем животных-доноров.

3. При повторном гормональном вызывании суперовуляцин у коров-доноров уровень овуляции почти не изменяется, достоверно уменьшается оплодотворяемость яйцеклеток и число нормальных эмбрионов. Гонадотропнн ((СЖК) вызывает су-перовуляцню у 86,9% часто перегуливающих коров при среднем уровне овуляций 8,9 на реагирующего донора.

4. Установлена высокая эффективность использования в качестве доноров эмбрионов нормально циклируюших высокопродуктивных коров, от большинства которых получено в среднем по 4.3 нормальных эмбриона, от 40 до 83% стельности после хирургической пересадки и 2,7 теленка на донора.

5. Опыты по хирургическому извлечению эмбрионов у коров и телок-даноров показали, что лучшие результаты при вымывании зародышей получаются через разрез по белой линии живота. При разовом использовании доноров целесообразно применять метод удаления рогов маткн, яйцеводов н яичников через разрез верхнего свода влагалища,

6. В исследованиях установлено, что нехирургическая-технология с применением новых устройств обеспечивает вымывание эмбрионов у 88,6% животных и получение 70% зародышей от общего числа овуляций. Эффективность нехирургического извлечения эмбрионов в большей степени зависит не от конструкции устройств к полноты удаления промывной жидкости, а от типа гормональных препаратов, используемых для вызывания суперовуляции. Соотношение нормальных н деге-нерированных эмбрионов находится в прямой зависимости от дозы и серии гопадотропина, дня обработки и извлечения эмбрион Об, сезон а года, функционального состояния яичников и степени суперовуляцни.

7. Усовершенствованный хирургический способ пересадки эмбрионов телкам-реципиентам, основой которого является метод боковой лапаротомии с использованием специальных приспособлений, дает возможность получать до 54,6% стельности, Наиболее подходящими для нехирургической пересадки являются поздние морулы 7-го дня, ранние н поздние бластоцисты 7—8-го дня. Лучшая приживляем ость (60,8—64,7%) наблюдается при пересадке ранних и поздних бластоцист от-28

личного н хорошего качества, несколько меньшая (54,8%) — поздних морул.

Место аппликации эмбриона в просвете рога матки оказывает существенное влияние на его приживление. Контрлатеральная пересадка эмбрионов предварительно осемененным реципиентом не снижает прижнвляемость собственного эмбриона, Пересадка двух эмбрионов — по одному в каждый рог матки — при соответствующем подборе реципиентов л отборе зародышей обеспечивает высокий уровень обшей стельности (61,5%) и двойневостн — (до 50%).

8. Разработанное унифицированное устройство для загрузки, хранения в жидком азоте и транспортировки эмбрионов на дальние расстояния позволяет маркировать и составлять индивидуальную картотеку учета эмбрионов, является простым в изготовлении, надежным в эксплуатации, может быть использовано во всех сосудах Дьюара. Программная установка для замораживания дает возможность без особых затруднений и с высокой точностью производить охлаждение и оттаивание эмбрионов, значительно сокращает расход азота (до 7 л) на цикл замораживания 4 контейнеров с эмбрионами. Упрощенная конструкция установки позволяет использовать ее непосредственно на фермах.

9, Замораживание и оттаивание в медленном режиме с использованием криопротектора ДМСО в 1,5 молярной концентрации н программных замораживателей сохраняет жизнеспособность 84,6% эмбрионов и обеспечивает стельность после нехирургнческой пересадки у 52,3% телок-реципиентов. Замораживание по ускоренному режиму и быстром оттаивании с криопротектором глицерин в 1,0 молярной концентрации — 79^3 и 66,6% соответственно. Продолжительность пребывания эмбрионов в низкотемпературной среде не оказывает существенного влияния на последующую их жизнеспособность после оттаивания и трансплантации. Этот показатель в значительной мере зависит от качества н стадии развития эмбрионов перед замораживанием.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1, В целях повышения эффективности гормонального вызывания полиовуляции у животных-доноров эмбрионов предлагается способ получения зародышей у крупного рогатого скота для трансплантации путем включения в общую схему гормональной обработки биологически активных веществ (витамины А и Е, йодистый калий), обеспечивающих повышение оплодотворяемости яйцеклеток и числа нормальных эмбрионов.

2. Для ускорения овуляции у животных-доноров, повышения выхода нормальных зародышей, снижения числа иеову-лировавших фолликулов следует применять гонадотропии рилнзинг-гормон при втором осеменении.

3. Для нехирургнческого вымывания эмбрионов предлагается универсальное устройство из пищевой резины, обеспечивающее максимальное извлечение зародышей и исключающее травмирование тканей эндометрия рогов матки.

4. Для криоконсервировання эмбрионов крупного рогатого скота рекомендуется использовать установку программного замораживания, контейнеры для хранения и транспортировки эмбрионов, два режима охлаждения — медленное замораживание и медленное оттаивание с использованием ДЛ1СО; ускоренное замораживание и быстрое оттаивание с глицерином и сахарозой.

По теме диссертации опубликовано 52 работы, основное содержание изложено в следующих статьях:

1. «Нехнрургнческое извлечение эмбрионов у крупного рогатого скота». Доклады ВАСХНИЛ, 1979, № 10, 37—38 <з соавторстве).

2. «Об осеменении ко ров-доноров с множественной овуляцией», Молочное и мясное скотоводство, 1979, ЛЬ 12, 38—39 (в соавторстве).

3. «Пересадка эмбрионов у крупного рогатого скота». Животноводство, 1979, Ка 12, 48—51 (в соавторстве). -

4. «Успешные опыты трансплантации за морожен но-отта-янных эмбрионов крупного рогатого скота». Вестник с.-х. науки, 1980, №7, 105—109 (в соавторстве).

5. «Рождение двоеп при трансплантации двух эмбрионов». Доклады ВАСХНИЛ, 1980, № 12, 24—26 (в соавторстве).

6. «Воспроизводительная способность коров-доноров зигот», Животноводство, 1981, № 6, 57—59 (в соавторстве). .

7. «Дальняя транспортировка эмбрионов». Животноводство, 1982, № 1,46—47 (в соавторстве).

8. «Оценка качества яиц крупного рогатого скота при трансплантации». Архив экспер, вет. мед., Лейпциг, 1982, №36, 89—93 (в соавторстве).

9. Хирургическая техника получения и пересадки эмбрионов у крупного рогатого скота. Архив экспер. вет. мед., Лейпциг, 1982, Ха 36, 71—75.

10. «Суперовуляция и оплодотворяем ость яйцеклеток у крупного рогатого скота в зависимости от серии гонадотропн-на (СЖК)». Архив экспер, вет. мед., Лейпциг, 1982,.Мв36,61 — 64 (в соавторстве),

11. «Влияние суперовуляцни и нехирургического извлечения эмбрионов на воспроизводительную способность коров 30

черно-пестрой породы», Доклады ВАСХНЛЛ, 1982, № 5, 38— 40.

12. «Глубокое замораживание эмбрионов сельскохозяйственных животных», Сельскохозяйственная биология, 1982, т. XVII, №3, 420—426 (в соавторстве).

13. «Полиовуляция у коров и телок-доноров эмбрионов», Ветеринария, 1982, № 7, 47-—49 (в соавторстве).

14. «Суперовуляция, получение, криоконсервированпе и пересадка эмбрионов крупного рогатого скота», Животноводство, 19813, Лв 10, 20—22 (в соавторстве).

15. «Влияние некоторых факторов на жизнеспособность зародышей крупного рогатого скота прн трансплантацнн», Доклады ВАСХНИЛ, 1983, № 7, 29—30 (в соавторстве).

16. Установка для замораживания эмбрионов животных. Автор, св-во № 989272, Бюллетень «Открытия, Изобретения», .\в 2, 15.01.1983 (в соавторстве).

17. Устройство для сохранения и транспортировки биологических объектов в замороженном состоянии. Авт. св-во ЛЪ 986412, Бюллетень «Открытия, Изобретения», № 1, 7.01.1983 (в соавторстве).

18. Способ получения эмбрионов у крупного рогатого скота для трансплантации. Авт. св-во № 1009366, Бюллетень «Открытия, Изобретения», № 13, 7.04.1983 (в соавторстве).

19. Способ получения зародышей у самок-доноров крупного рогатого скота. Авт. св-во № 1029960, Бюллетень «Открытия, Изобретения», № 27, 23.07.1983 (в соавторстве).

20. Устройство для извлечения эмбрионов у животных. Авт. св-во Лг 1034735, Бюллетень «Открытия, Изобретения», Ка 30, 15.08.1983 (в соавторстве).

21. Эффективность гормонального вызывания овуляции у коров и телок-доноров в зависимости от сезона года, Животноводство, 1983, № 12, 53—55 (в соавторстве).

22. Результаты применения простагландпна для синхронизации охоты у коров-доноров и телок-реиигшентов. Молочное и мясное скотоводство, 1984, № в, 29—32 (в соавторстве).

23. Получение, оценка н пересадка зародышей крупного рогатого скота. В сб. XIV съезд Всесоюзного физиологического общества имени И. П. .Павлова (Баку, 1983), Л., Из-во «Наука», 1983, 447.

Заказ 5694 Л-69691 Тираж 100 экз.

Малоярославец^ я городская типография управления издательств, полиграфии и крнжной торговли Калужского облисполкома