Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Совершенствование методов микроклонального размножения лилий

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование методов микроклонального размножения лилий"

3Г6 од

2 з к;,:! '

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

БЕЛОРУССКАЯ ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ

УДК 635.9:582.572.226:573.6

Французёнок Василий Владимирович

СЮВЕР1ШНСТЮШАНЖ ЙЕПЩОЗ ШШЮКЕОНАШЮГО РАЗШОШШЯ МММ

специальность 06.01.05 - селекция и семеноводство

АВТОРШ-РАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

ГОРКИ, 1997

Работа выполнена в Белорусской ордена Октябрьской Революции и ордена Трудового Красного Знамени сельскохозяйственной академии в 1992 - 1995 ГГ.

Научный руководитель - член - корреспондент ААН РБ,

доктор биологических наук, профессор Л. В. Кил&чевсюзй. Официальные оппоненты: доктор биологических наук

И.А. Гордзй,

кандидат биологических наук Е.А. Попович

Оппонирующая организация - Белорусский научно-исследовательский институт плодоводства.

п с С

Защита состоится " 3Р" ■ V 1997 г. ъ1Р на заседа-

нии совета по защите диссертаций Д05.30.01 в Белорусской ордена Октябрьской Революции и ордена Трудового Красного Знамени сельскохозяйственной академии по адресу:

Республика Беларусь, 213410, г.Горки Могилевской области,

ул. Мичурина, 5.

С диссертацией, можно ознакомиться в библиотеке Белорусской сельскохозяйственной академии.

Автореферат разослан " 39" СУ. 1997 р.

Ученый секретарь совета

по защите диссертаций Д. И. ЬС&яьнкчу»

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАШШ

Актуальность темы. Для условий Беларуси лтаии представляют несомненный интерес как важная декоративная культура. Почвенногклиматические условия республики в делом благоприятны для возделывания многих форм лилий, в особенности сортов раздела Азиатские Гибриды. Главным фактором, сдерживающим распространение лилий в Беларуси, является отсутствие посадочного материала современных сортов. Традиционные методы размножения не позволяют получить достаточное количество качественного посадочного материала. Кроме того, в этом случае существует опасность распространения с посадочным материалом бактериальных, грибных и вирусных заболеваний, представляющих большую опасность для культуры. Поэтому как дополнение к традиционным методам размножения во многих странах рассматривают метод in vitro. Этот метод позволяет более эффективно и быстро размножать растения вне зависимости от погодных условий и сезона, обходиться без маточных насаждений, а также препятствовать распространению заболеваний с посадочным материалом.

В научной литературе, как правило, обсуддаются отдельные вопросы микроклонального размножения лилий, касающиеся только первого этапа - введения в культуру in vitro (Иванова, ■1989; Leshem et al., 1982; Niimi, 1984 и др.). Исследования различных авторов по ряду вопросов микроклонального размножения лилий носят довольно противоречивый характер. Большинство работ посвящено изучению размножения ценных в декоративном и коммерческом отношениях сортов из разделов Длинноцветковые и Восточные, которые в условиях Беларуси являются недостаточно зимостойкими. Основные элементы технологии микроклонального размножения Азиатских Гибридов, представляющих наибольший интерес для республики, изучены недостаточно.

Связь работы с крупными научными программами, темами. Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований Белорусской сельскохозяйственной академии.

Цель и задачи исследований. Целью данной работы являлась разработка основных элементов технологии производства посадочного материала Азиатских Гибридов лилий методом культуры тканей.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Отработать эффективную методику получения стерильной культуры лилий.

2. Оптимизировать условия культивирования эксплантов лилий на этапах введения в культуру и собственно микроразмножения (подбор экзогенных гормонов, состава питательной среды, условий культиви-

рования маточных растений, изучение происхождения и оптимальных сроков изолирования эксплантов, условий освещенности, способов расположения экспланта на питательной среде и др.).

3. Исследовать процесс адаптации и доращивания пробирочных растений в условиях in vivo.

Научная новизна. Проведено систематическое изучение процесса микроклонального размножения Азиатских Гибридов лилий и впервые в республике разработаны основные элементы технологии производства посадочного материала лилий методом in vitro. Ряд вопросов, связанных с условиями культивирования маточных растений, происхождением и сроками изолирования эксплантов, подбором вида и концентрации фитогормонов, состава питательной среды, условиями адаптации и доращивания регенерантов in vivo изучены впервые. В работе впервые исследовано влияние эпибрассинолида на процесс пролиферации лилий в культуре in vitro. Изучены различные субстраты для адаптации растений после культуры in vitro и доращивания микрорастений. Установлена неравнозначность аммонийного и нитратного азота для доращиваемых растений.

Показано, что при размножении различных форм лилий in vitre предпочтительной является питательная среда Мурасиге - Скуга- с повышенным содержанием сахарозы (60 г/л). Выявлен наиболее эффективный регулятор роста - сс-нафтилуксусная кислота (НУК) в концентрации 0,1 - 1.0 мг/л. Оптимальная концентрация фнтогормона зависич прежде всего от сортовых особенностей, а также происхождения i срока изолирования эксплантов. 6 - бензиламинопурин не оказываем положительного действия на экспланты лилий. Эпибрассинолид ускоряет регенерацию и повышает коэффициент размножения, хотя и в мета-шей степени, чем НУК, однако стимулирует интенсивный каллусогенез что при размножении дшшй по предлагаемой схеме является нежелательным. Экспланты внутренних чешуи луковицы по способности регенерировать луковички не уступают, а в ряде случаев и превосходя1 экспланты внешних чешуй. Доказана необходимость создавать услови для регенерации крупных луковичек при микроразмножении лилий. Ус тановлено, что оптимальный уровень освещенности для культивирова ния эксплантов лилий составляет 1000 люкс. Отработана методик адаптации микрорастений лилий в условиях in vivo и доращивания и в различных субстратах в пленочных теплицах. Обращается вниыани на необходимость использования для подкормок микрорастений лили

аммонийного азота. Ионы хлора не оказывают заметного ингибирующего (ействия на доращиваемые после культуры in vitro растения лилий.

Практическая значимость полученных результатов. Разработаны >сновные элементы технологии массового размножения лилий методом in vitro от получения стерильной культуры до доращивания растений i условиях in vivo. Предлагаемая методика позволяет размножать лиши с высоким коэффициентом - до миллиона штук в год и более от эдной маточной луковицы при последующем двухлетнем доращивании до товарной луковицы. Технология отличается относительной простотой и южет быть использована в биотехнологических лабораториях для массового производства оздоровленного посадочного материала хозяйственно ценных сортов, а также в селекции лилий для сохранения и размножения особо ценных генотипов.

Экономическая значимость полученных результатов; Эффективность тредлагаемой методики микроразмножения лилий заключается в следующем: 1) высокий коэффициент размножения; 2) сокращение сроков поступления товарных луковиц новых сортов в производство; 3) отсутствие потребности в дорогостоящих маточных насаждениях;- 4) высокое качество посадочного материала, свободного от инфекции. Анализ экономической эффективности микроразмножения лилий показал, что предлагаемая технология является высокорентабельной (на один рубль затрат приходится 5.52 рубля чистого дохода при объеме производства один миллион луковиц).

Основные положения диссертации, выносимые на защиту. На защиту выносятся следующие положения: основные элементы технологии производства посадочного материала лилий на основе метода in vitro.

1. Оптимизация этапа введения в стерильную культуру эксплантов лилий (использование гипохлорита кальция как наиболее эффективного антисептика; перспективность применения провокационных питательных сред Зао и Мурасиге - Скуга с молочным альбумином для быстрого и полного выявления инфекции на начальных этапах культивирования; возможность и целесообразность использования в качестве источника эксплантов как внешних, так и внутренних чешуй луковицы).

2. Совершенствование этапа размножения лилий in vitro ( преимущества использования для размножения крупных луковичек; необходимость увеличения концентрации сахарозы как на первом, так и на втором этапах до 60 г/л; приемлемость различных вариантов ориентации эксплантов на поверхности питательной среды; использование НУК

Е концентрации 0.1-1 мг/л как наиболее эффективного фитогормона для регенерации луковичек на первом и втором этапач культивирования; оптимизация условий освещенности на первом и втором этапах на уровне 1000 люкс).

3. Разработка методики переноса и доращивания микрорастений в условиях in vivo (пригодность верхового торфа или его смесей с песком и перлитом в качестве субстрата для адаптации лилий ; успешное культивирование доращиваемых микрорастений лилий в различных субстратах на основе верхового торфа либо почвы; предпочтительное использование аммонийного азота для подкормки доращиваемых регенерантов лилий).

Личный вклад соискателя. Соискатель участвовал в разработке программы и методики исследований, подготовке к публикации статей и тезисов докладов, самостоятельно выполнил все экспериментальные исследования, провел статистическую обработку данных и анализ полученных результатов.

Апробация результатов диссертации. Материалы исследований были представлены и доложены : на научной конференции к 155 - летию Белорусской сельхозакадемии (Горки, 1395), республиканской конференции "Современные проблемы генетики и селекциш" (Минск, 1995), IV конференции "Брассиностероиды - биорациональные экологически безопасные регуляторы роста и продуктивности растений" (Минск, 1995), международной конференции, посвященной 150 - летию со дня рождения М.В. Рытова "М.В. Рытов - выдающийся агробиолог, философ и педагог" (Горки, 1996), Second International Symposium "Breeding, propagation in vitro and disease resistance of horticultural plants" (Salaspils, Latvia, 1996).

Опубликованность результатов. Основные положения диссертации опубликованы в 7 печатных работах, в том числе 2 - в сборниках научных статей, 2 - в материалах конференций,3 - в тезисах докладов.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, общей характеристики работы, шести глав, выводов, приложения и списка использованных источников. Общий объем диссертации составляет 133 страницы, включает 27 таблиц и 9 рисунков. Перечень использованных литературных источников включает в себя 234 источника, в том числе 131 на иностранных языках.

МАТЕРИАЛ И ШВДЙКА ИССЛЕДОВАНИИ В диссертационной работе рассматриваются результаты экспери-

ментов по размножению in vitro Азиатских Гибридов лилий, которые представляют наибольший практический интерес для условий Беларуси. Основные эксперименты " по разработке технологии микроклонального размножения выполнены на сортах Медуница и Эстафета, луковицы которых получены во ВНШС им. И.В. Мичурина. В отдельных экспериментах использовались сорта Болгария, Виринея, Волхова, Мичуринская Ода, Пелеринка и Эмилия (луковицы приобретены там же), а также Арктика, Sun Ray и Trojan (луковицы получены в ЦБС АН Беларуси).

В качестве экеплантов на первом этапе микроразмножения использовались луковичные чешуи, подготовленные по следующей методике. Здоровые, без явных механических повреждений чешуи отделялись от донца луковицы, тщательно промывались водой и не менее 0,5 часа обрабатывались в 0,01 % растворе детергента Tween-20. После этого чешуи погружались на несколько секунд в 70 % этиловый спирт, а затем стерилизовались в 3-5 %-ном растворе гипохлорита кальция в течение 20 минут. После стерилизации они в условиях ламинара ополаскивались 4 раза автоклавированной дистиллированной водой. Апикальная часть чешуй в связи с низкой способностью к регенерации луковичек для размножения не использовалась. Остальная часть чешуи делилась на экспланты размером около 1,5 см2 и высаживалась в пробирки на стандартную питательную среду Мурзеиге-Скуга (MC) или её модификацию, дополненные сахарозой и фитогормонами в зависимости от эксперимента,pH 5,7-5,8, концентрация агара 5,5-6,0 г/л. Для быстрого выявления инфекции экспланты высаживались на питательную среду Зао и среду MC, дополненную молочным альбумином. Экспланты культивировались по одному в пробирках при температуре 22-24°С, длине дня 16 часов и освещенности 1000 люкс. Через 3 недели после начала культивирования инфицированные экспланты выбраковывались. Через 8 недель от момента посадки проводился учет следующих параметров: процент регенерировавших экеплантов, количество регенерировавших луковичек на каждом экспланте, их масса, количество и длина корней, количество и длина листьев. Все эксперименты в культуре in vitro проводились в трехкратней повторное™ по 10 экеплантов на повторность, а в опытах по подбору антисептиков и провокационных питательных сред - по 100 экеплантов на повторность.

Культивирование на втором этапе микроразмножения осуществлялось в банках объемом 250 мл с винтовыми крышками по 10 экеплантов в каждой. В качестве питательной среды использовалась MC, допол-

ненная сахарозой и гормонами в зависимости от эксперимента. Условия культивирования аналогичны первому этапу. Пассаж длился восемь недель. Учитывались те же показатели, что и на первом этапе.

Для прохождения этапа адаптации и доращивания в •нестерильных условиях регенеранты высаживались в различные субстраты на основе торфа "Двина" (торф, торф + песок 1:1, торф + перлит 1:1). Опыт проводился с сортами Медуница и Эстафета в трехкратной повторности по 50 растений на одну повторность . Использовались деревянные ящики, которые на 2/3 заполнялись субстратом. После высадки реге-нерантов ящики накрывались полиэтиленовой пленкой и устанавливались в культуральной комнате. В течение 40 дней проводился постоянный уход, состоящий из регулярного увлажнения опрыскивателем, полива и проветривания во избежание развития инфекции. Температура составляла 22-24°С, освещенность 2000-3000 люкс. Последние 10 дней растения постепенно адаптировались к естественной влажности воздуха и более высокой освещенности. По истечении 40 дней учитывался процент сохранившихся растений и общий прирост сырой массы в процентах. '

После адаптации in vivo растения высаживались для доращивания на гряды длиной 70 и шириной 60 см по схеме 5 х 10 см. Опыт проводился в трехкратной повторности, на одну повторность бралось 10 растений.' Культивирование осуществлялось в пленочной теплице с 20.06 по 1.10.1995 года. Изучены различные субстраты на основе верхового торфа и почвы (торф, торф + почва 1:1, торф + песок 1:1, почва, почва + песок 1:1) на пригодность использования их для доращивания .микрорастений лилий. Использовались торф "Двина" и легкосуглинистая дерново - карбонатная почва, содержащая 3.15 % гумуса, 12.3 мг азота, 14.7 мг калия и 43.6 мг фосфора в расчете на 100 г почвы, pH 6.6. Эксперимент проводился с сортами Медуница и Эстафета. Также изучено влияние различных форм минеральных удобрений на рост и развитие доращиваемых микрорастений лилий. Опыт проводился с сортами Пелеринка и Эмилия. Схема посадки, число повтор-ностей и растений на делянке аналогичны первому эксперименту. Субстрат - смесь почвы с песком (1:1). Проведено четыре подкормки с интервалом 15 дней раствором минеральных удобрений, исходя из гектарной дозы М120Р140К150 (Ботяновский и др., 1984). В проведенном нами эксперименте варианты опыта не отличались по суммарной дозе NPK, но вносимые удобрения имели разные формы катионов и ани-

онов (вариант 1 - азот в аммонийной форме, вариант 2 - азот в нитратной ферме, вариант 3 - удобрения содержащие хлор , вариант 4 .удобрения не содержащие хлора). В период культивирования проводился постоянный уход: прополки, рыхление, полив водой по мере необходимости. По окончании указанного периода учитывалась средняя масса луковиц.

Результаты экспериментов обрабатывались методом дисперсионного анализа.

СОДЕРЖАНИЕ работы ЭТАП ВВЕДЕШШ ЛИЛИЙ В СТЕРИШШО КУЛЬТУРУ

Задачей исследований было подобрать эффективные, малотоксичные, дешевые и доступные антисептики для стерилизации первичных эксплантов. Проведенные опыты показали, что данным требованиям в первую очередь отвечает гипохлорит кальция, 3 % - ный раствор которого позволяет стерилизовать экспланты с высокой эффективностью и не оказывает на них негативного влияния. Два других антисептика (хлорамин и этанол) не позволяли добиться высокой стерильности, а при повышении их концентрации и экспозиции (этанол) оказывали ин-гибирующее действие на экспланты.

Важной проблемой первого этапа микроразмножения является скрытая инфекция эксплантов, которая может проявиться при последующем культивировании in vitro. Поэтому для выявления такой инфекции нами были изучены среда Зао, а также среда МС, дополненная 250 мг/л молочного альбумина. Эксперимент проводился с сортом Медуница. Экспланты для данного эксперимента специально не подвергались предподготовке, а стерилизация проводилась в течение 10 минут пониженной концентрацией антисептика (1 X). Данные опыта показали (табл. 1), что на изучаемых питательных средах инфекция выявляется гораздо быстрее. Уже на третий день культивирования на питательной среде МС с молочным альбумином и среде Зао было выявлено не менее половины нестерильных эксплантов, в то время как на среде МС -только 7 %. Обращает на себя внимание и конечная степень инфициро-ванности эксплантов. Через три недели культивирования на среде Зао их выявлено 81 "I, на среде МС с молочным альбумином - 74,7 7., а на среде МС - 63,3 Более низкую долю инфицированных эксплантов на среде МС можно объяснить тем, что инфекция выявлена не полностью.

Важным вопросом микроразмножения является подбор состава пи-

Таблица 1

Динамика выявления инфекции на различных питательных средах при введении лилий в культуру in vitro.

Дни Инфицировано эксплантов, %

культиви-

рования среда MC среда MC + молоч- среда Зао

ный альбумин 250 мг/л

3 ' 7,0 41,3 41,7

7 45,7 63,7 70,3

14 56,3 71,7 77,0

21 63,3 74,7 81,0

НСРо.05 = 11,9

тательной среды для пролиферации луковичек. Основываясь на литературных данных, нами были изучены две питательные среды среда Му-расиге-Скуга (MC) и ее модификация (MC*) с изменениями J.A.Sim-monds и B.G.Cumming (1976), а также В.А.Румынина и А.Г.Слюсаренко (1989). Объектом анализа служили сорта Sun Ray, Trojan, Медуница, Эстафета, Болгария, Виринея, Пелеринка и Эмилия. На основании результатов эксперимента можно сделать вывод, что несмотря на сортовую реакцию, лучшей является питательная среда Мурасиге-Скуга.

Успех размножения растений in vitro во многом определяется правильным подбором вида и концентрации экзогенных фитогормонов. Наиболее эффективной при микроразмножении лилий оказалась нафти-луксусная кислота (НУК). Наличие в питательной среде НУК способствовало. формированию крупных хорошо сформированных луковичек с корнями и листьями. Коэффициент размножения в этих вариантах колебался от 3.9 штук/эксплант (у сорта Медуница) до 11.8 (у сорта Эмилия). Оптимальная концентрация НУК зависит от сортовых особенностей. 6 - Бензиламинопурин (БАЛ) способствовал заметному росту коэффициента размножения только в сочетании с НУК. При концентрации БАЛ ОД мг/л положительного влияния на регенерацию луковичек практически не наблюдалось, а при 0,5 и 1 мг/л БАП заметно повышал коэффициент размножения, однако отрицательно влиял на регенеранты - подавлял образование корней, часто приводил к аберрантному раз-

итшз, луковички формировались очень мелкие.

Известно, что практически любой орган растения может служить сточником эксплантов. Большинство исследователей микроразмножения :илий используют для этих целей как правило луковичные чешуи. Од-ако некоторыми авторами (Niimi 1984; Novak, Petru 1981) показана сзможность применения в качестве источника эксплантов вегетатив-:ых и генеративных органов. Наш исследования показали, что экс-ланты из листьев и стебля сорта Арктика, изолированные в два сро-а (за 10 - 12 дней до начала цветения и в момент массового цвете-:ия), не обладали способностью к регенерации. Через некоторое вре-[я после посадки на питательную среду экспланты полностью некроти-;ировались. Способностью к пролиферации луковичек обладали только :егменты цветоноса. Образовывали луковички лишь сегменты первых ■рех зон, близких к бутону. Наиболее активно этот процесс протекал :ри изолировании эксплантов в первый срок. Экспланты луковичных :ешуй в обоих случаях имели самый высокий коэффициент размножения, i процент регенерации составил 100 %.

По данным Н.В.Ивановой (1989), экспланты чешуй внутренней зо-м луковицы не способны к регенерации луковичек. Наши результаты ¡видетельствуют об обратном. Исследования показали, что экспланты ¡нутренних чешуй луковицы сортов Медуница, Эстафета и Эмилия при [золировании в январе незначительно уступают по способности реге-[ерировать луковички эксплантам внешних чешуй. При изолировании в ¡ругие сроки (май и сентябрь) они имеют такой же или дата более щсокий коэффициент размножения.

Существенно влияет на регенерацию эксплантов освещенность. Из (зученных пяти вариантов оптимальной является освещенность 1000 аокс (табл. 2). Коэффициент размножения в этом случае у обоих сор-гав был максимальным (4,9 у сорта Медуница и 8,4 у сорта Эстафета) . При изменении интенсивности света в ту или иную сторону этот юказатель заметно уменьшался. Аналогично выглядит картина и по какому важному показателю, как процент регенерации. В полной тем-юте формировались крупные луковички с немногочисленными вытянуты-га листьями. При освещенности 1000 люкс луковички были несколько гельче, но имели хорошо развитые корни и листья. Освещенность 3000 i 4000 люкс оказывает явное ингибирующее действие на регенерацию ¡уковичек. При этом снижается процент регенерации, формируются ^многочисленные и довольно мелкие луковички, корни укорачиваются,

Таблица 2

Влияние интенсивности света на пролиферацию лилий in vitro

. Сорт Показатели Интенсивность света, лк НСРо. 05

0 1000 2000 3000 4000 А В

Медуница 7, регенерации коэффициент размножения, шт/эксплант средняя масса луковички, мг 75,0 3,4 101,3 88,9 4,9 79,6 80,7 3,5 105,1 71,1 2,8 85,6 56,4 2,6 85,6 2,7 0,1 2,4 4,3 0,2 3,8

Эстафета % регенерации коэффициент размножения, шт/эксплант средняя масса луковички, мг 85,0 6,3 53,0 91,3 8,4 56,3 76,9 7,8 44,2 67,6 7,8 41,1 60,0 6,6 40,3 2,7 0,1 2,4 4,3 0,2 3,8

Примечание: фактор А - сорт; фактор В - интенсивность света.

зато листовой аппарат развит сильнее. Таким образом, эти данные показывают, что не только компоненты питательной среды, но и физические факторы, в частности свет, могут существенно влиять на пролиферацию лилий in vitro.

ЭТАП РАЗЛОЖЕНИЯ ЛИШИ

Главная задача второго этапа - добиться максимально быстрого увеличения количества адвентивных побегов (луковичек). Решение этой задачи в значительной степени зависит от правильного подбора вида и концентрации экзогенных гормонов. Наши исследования на сортах Медуница и Эстафета показали (табл. 3), что ВАЛ не оказывает положительного влияния на регенерацию луковичек, а в вариантах без НУК и при концентрации 0,5 мг/л и выше дает отрицательный эффект. В этих случаях регенерации луковичек не отмечено. Наиболее эффективной оказалась НУК в концентрации 0,5 мг/л. Все изучаемые показатели достигли в этом варианте максимального значения.

Наш в опыте с сортом Медуница выявлено, что размер луковички существенно влияет на коэффициент размножения на втором этапе. Чешуйки адвентивных луковичек мелкой фракции (45 мг) формировали в среднем по 1,8 луковички, средней (100 мг) - 2,4, а крупной (200 мг) - 2,5. Такой фактор, как величина адвентивной луковички, а соответственно и экспланта, способствовал достоверному увеличению

Таблица 3

Влияние НУК и БАЛ на пролиферацию лилий на этапе размножения in vitro

Гормоны, мг/л Сорт

Эстафета Медуница

НУК БАЛ % регенерации коэффициент размножения, шт/эксплант средняя масса луковички, мг % регенерации коэффициент размножения, шт/эксплант средняя масса луковички, мг

0 0 89,0 1,3 15,7 83,3 1,6 22,1

0,1 0 93,7 2,6 25,8 85,7 2 Д 35,8

0,5 0 100,0 2,9 37,3 98,0 2,5 49,6

1 0 100,0 2,7 S3,9 98,0 2,2 39,3

0 0,1 Луковичек нет, растения образуют только листья

0,1 0,1 93,7 2,3 22,1 95,1 2,4 30,1

0,5 од 100,0 2,4 24,2 85,3 2,5 25,4

1 од 100,0 2,2 19,5 85,1 2,4 22,9

от 0 ДО 1 0,5 До 5 Регенерации луковичек не отмечено. Образовывались только листья, каллус.

НСР05ГА) НСРобШ) 2,1 2,1 0,2 0,2 2,3 2,3 2,1 2,1 0,2 0,2 2,3 2,3

Примечание: фактор А - сорт; фактор В - гормоны, -коэффициента размножения на 0,7. В зависимости от величины адвентивной луковички - источника эксплантов - сильно варьировала и

масса луковичек. Экспланты луковичек мелкой фракции регенерировали луковички массой 73,1 мг, средней - 84,9 мг и крупной - 126,5 мг. Необходимо также отметить, что луковичка массой 30 мг может дать 2-3 экспланта (чешуи), а массой 100 мг - 5-6. Таким образом, результаты этого эксперимента позволяют сделать вывод о том, сколь важно на первом и втором этапах получить наряду с хорошим коэффициентом размножения и максимально крупные луковички.

Чешуи адвентивных луковичек очень мелкие и вопрос о том, как правильно сориентировать их на поверхности питательной среды, имеет большую технологическую значимость. Данные наших опытов показывают, что приемлемыми могут быть различные варианты ориентации эксплантов на поверхности питательной среды - горизонтальное, наклонное базалышм концом на среду либо вверх при обязательном условии: внутренняя поверхность чешуйки должна быть ориентирована вверх.

Предыдущие эксперименты показали, что на втором этапе микроразмножения формируются недостаточно крупные луковички, особенно у сорта Эстафета (табл. 3). Поэтому стояла задача добиться регенерации максимально крупных луковичек. Для ее решения был поставлен опыт, результаты которого представлены в таблице 4. Они свидетельствуют о том,- что концентрация сахарозы в питательной среде оказывает большое влияние на все показатели микроразмножения. Оптимальной для обоих сортов является концентрация сахарозы 40-60 г/л. В этом случае у сорта Эстафета коэффициент размножения увеличивается с 1,6 (при 20 г/л) до 4,8 при 60 г/л, а процент регенерации - с 65,0 до 91,3 %. У сорта Медуница коэффициент размножения возрос по вариантам соответственно с 2,5 до 3,6, а процент регенерации с

63.2 до 88,9. Увеличение концентрации сахарозы с 20 до 60 г/л способствовало у сорта Эстафета повышению средней массы луковичек с

12.3 до 76,3 мг, а у сорта Медуница - с 22,3 до 79,6 мг. При повышении концентрации сахарозы до 80 г/л масса луковичек увеличивалась, а два других показателя существенно уменьшались. Гидролизах казеина оказывал некоторое положительное влияние на коэффициент размножения и массу луковичек, однако оно было не столь существенным, как влияние сахарозы.

АДАПТАЦИЯ И ДОРАЩШШШЕ ШКРОРАСТЕНИЙ ЖШЙ В УСЛОВИЯХ Ш VIVO.

Несмотря на всю значимость и важность рассматриваемого этапа,

Таблица 4

Влияние концентрации сахарозы и гидролизата казеина на пролиферацию лилий in vitro

Вариант Показатели Сорт НСРо, 05

Эста- Меду- А В

фета ница

20 г/л % регенерации 65,0 63,2 8,1 9,9

сахарозы коэффициент размножения,

шт/эксплант 1,6 2,5 0,1 0,1

средняя масса луковички, мг 12,3 22,3 3,8 8,4

20 г/л саха- % регенерации 64,4 63,9 8,1 9,9

розы+1000мг/л коэффициент размножения,

гидролизата шт/эксплант 2,2 2,7 0,1 0,1

казеина средняя масса луковички, мг 19,3 28,9 3,8 8,4

40 г/л X регенерации 80,0 81,2 8,1 9,9

сахарозы коэффициент размножения,

шт/зксплант 4,7 3,6 0,1 0,1

средняя масса луковички, мг 76,3 54,4 3,8 8,4

60 г/л 7> регенерации 91,3 88,9 8,1 9,9

сахарозы коэффициент размножения,

шт/эксплант 4,8 3,6 0,1 0,1

средняя масса луковички, мг 76,3 79,6 3,8 8,4

80 г/л % регенерации 77,8 80,1 8,1 9,9

сахарозы коэффициент размножения,

шт/эксплант 4,0 2,6 0,1 0,1

средняя масса луковички, мг 79,8 93,4 3,8 8,4

Примечание: фактор А - сорт; фактор В - концентрация сахарозы, в научной литературе по микроклональному размножению лилий практически не обсуждаются вопросы по адаптации регенерантов и доращива-нию in vivo..

Регенеранты сортов Медуница и Эстафета при культивировании на питательной среде МС, содержащей 0,5 мг/л НУК, имели хорошо развитые корни, луковички и листья и были готовы к пересадке In vivo. Высаженные в торф "Двина" или его смеси с песком (1:1) и перлитом (1:1) растения быстро укоренялись и начинали наращивать листовой аппарат. Это свидетельствует о том, что Азиатские Гибриды в отличие от сортов некоторых других разделов не переходят в состояние покоя после размножения in vitro. Проведенный эксперимент показал возможность использования всех изученных субстратов для адаптации микрорастений лилий.

Для дорашдвакия микрорастений в условиях пленочной теплицы нами изучено пять различных субстратов: торф "Двина", легкосуглинистая дерново - карбонатная почва, торф + почва, торф + песок, почва + песок (соотношение смесей 1:1). Все изученные субстраты способствовали нормальному росту и развитию растений. Самые крупные луковички у обоих сортов (Медуница и Эстафета) выросли в почве. При использовании в качестве субстратов торфа, а также его смесей с песком и почвой результаты были,близки. На субстрате торфн-почва выделялся сорт Медуница - средняя масса луковичек была даже больше, чем в почве. Наиболее мелкие луковички у обоих сортов были при выращивании в субстрате почва+песок, что особенно заметно у сорта Медуница. Такую ситуацию можно объяснить, на наш взгляд, физическими свойствами самих субстратов (меньшая водоудерживающая способность смеси почвы с песком в сравнении с почвой).

Существенное влияние на рост и развитие микрорастений лилий при доращивании в пленочной теплице оказывает состав минеральных подкормок. Установлено, что форма азота Елияет на эффективность доращивания микрорастений лилий (табл. 5). При подкормке растений удобрениями, содержащими азот в нитратной форме (вариант 2) луковички были гораздо мельче, чем при'подкормке аммонийным азотом (вариант 1). В варианте 4 азот вносился в виде аммонийно-нитратной формы (аммиачная селитра) и масса луковиц имела среднее значение между вариантами 1 и 2. Состав минеральных удобрений в варианте 3 отличался от варианта 4 лишь наличием ионов хлора (использовался КС1 вместо K2SO4). Результаты свидетельствуют о том, что наличие ионов хлора не оказывало существенного отрицательного влияния на рост и развитие микрорастений лилий при доращивании in vivo.

Таблица 5

Влияние минеральных подкормок на рост и развитие доращиваемых in vivo луковиц лилий

Сорт Средняя масса луковиц, г

вариант 1 вариант 2 вариант 3 вариант 4

Пелеринка 1,50 1,06 1,12 1,19

Эмилия 1,65 1,29 1,24 1,27

НСР0. 05(A) = 0,08; НСР0,05(В) = 0,11

Примечание: фактор А - сорт; фактор В - вариант минеральной подкормки.

ВЫВОДЫ

1. Наиболее эффективным антисептиком для введения лилий в культуру in vitro является гипохлорит кальция, 3 % - ный раствор которого позволяет добиться высокой стерильности и не оказывает ингибирующего действия на экспланты.

2. Лучшим источником эксплантов лилий на первом этапе 'микроразмножения являются луковичные чешуи. Наш показана возможность использования в качестве таковых как внешних, так и внутренних че-шуй. Эффективность пролиферации зависит от сортовой специфики, физиологического состояния луковицы и концентрации экзогенных фито-гормонов.

3. При введении лилий в культуру in vitro целесообразно использовать провокационные питательные среды Зао и Мурасиге - Скуга с молочным альбумином для- более полного и быстрого выявления инфекции.

4. Для культивирования лилий методом In vitro наиболее пригодна питательная среда Мурасиге-Скута. Установлено, что пролиферация луковичек лилий наиболее активно протекает при наличии в питательной среде нафтилуксусной кислоты (НУК) в концентрации 0.1 - 1.0 мг/л. Оптимальная концентрация ауксина определяется в первую очередь сортовыми особенностям, а также происхождением зксплантов и сроком их изолирования. Цитокинин 6 - БАЛ не является обязательным компонентом питательной среды для размножения лилий in vitro.

5. Увеличение концентрации сахарозы до 60 г/л на первом и втором этапах культивирования лилий in vitro способствует заметному повышению массы адвентивных луковичек, коэффициента размножения и процента регенерации. Образующиеся при этом крупные луковички дают больший выход эксплантов, а последние, в свою очередь, имеют более высокий коэффициент размножения.

6. Эпибрассинолид ускоряет морфогенетическне процессы и способствует увеличению коэффициента размножения, однако в меньшей степени, чем НУК. Образующийся при этом обильный каллус является нежелательным при микроклонадьном размножении лилий.

7. Оптимальная освещенность на первом и втором этапах микроразмножения лилий составляет 1000 люкс.

8. Использование в качестве субстрата верхового торфа либо его смесей с песком и перлитом позволяет создать благоприятные условия для адаптации лилий in vivo в культуральном помещении. Для доращи-вания микрорастений в пленочной теплице применимы субстраты на основе верхового торфа или хорошо окультуренной плодородной почвы. Выявлена неравнозначность аммонийного и нитратного азота.для дора-щивания микрорастений лилий. Предпочтительным является аммонийный азот. Ионы хлора не оказывают заметного ингибирующего действия на растения лилий.

РЕЖЕВДАЩШ ПРОИЗВОДСТВУ

Разработанная технология позволяет размножать лилии с высоким коэффициентом, эффективно осуществлять адаптацию и доращивание микрорастений, приемлема для промышленных биотехнологических лабораторий и тем самым может способствовать быстрому распространению культуры в цветоводческих хозяйствах и на личных приусадебных участках, а также применяться в селекции для сохранения и размножения особо ценных генотипов.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Французёнок В.В. Изучение этапа введения в культуру in vitro лилий // Современные пробл. генетики и селекции: Тез. докл. респ. конф. - Мн. - 1995. - С.7.

2. Французёнок В.В. Микроклональное размножение лилий / Науч. основы зффектав. ведения растениеводства в современных условиях.

.териалы науч. конф. к 155 - летию БСХА. - Горки, 1995. - С. 109.

3. Кильчевский А.В., Французёнок В.В. Влияние эпибрассинолида на генерационную способность лилий в культуре in vitro // Врасси-стероиды - биорациональные экологически безопасные регуляторы ста и продуктивности растений: Тез. дом. IV конф. - Мн. - 1995.

. 10.

4. Кильчевский А.В., Французёнок В.В. Размножение лилий методом льтуры тканей // М.В. Рытов - выдающийся агробиолог, философ и дагог: Тез. докя. и сообщ. междунар. науч. конф. - Горки, 1906. - С.60.

5. Kilchevsky A.V., Frantsuzenok V.V. Optimisation of nutrition dia for the establishment of lily in vitro culture // Breeding, opagation in vitro and disease resistance of horticultural ants. Material II international symposium. - Salaspils, Latvia,

36. - P. 33 - 36.

5. Французёнок В.В. Подбор питательных сред для этапа введения яий в культуру in vitro // С.-х. экология и биотехнология : Сб. 1/4. тр. - Горки, 1997. - С. 26-31.

7. Французёнок В.В. Влияние фитогормонов, сахарозы и гидролизата зеина на эффективность микроразмножения лилий на этапе размноже-а // С.-х. экология и биотехнология : Сб. науч. тр. - Горки,

37. - С. 32 - 37.

РЗЗЮ1Э. Французёнак Вас1ль Уладз1м1рав1ч.

Удасканаленне метадау млкракланальнага размнакэння л!л1й.

Ключавыя словы: лШ1, м1кракланальнае размнажэнне, культура vitro, рзгенерацыя.

Распрацаваны асноуныя элементы тэхналогП м1кракланальнага змнажэння Аз1яцк1х Пбрыдау л!л1й, як1я дазваляюць зфектыуна ат-шваць стэрыльную культуру, размнажаць з bhcokím каэф1цыентам -тыл за м1льён цыбул!нак у год ад адной матачнай цыбул!ны пры зтупным двухгадовым дарошчванн1 да таварнай цыбул1ны, паспяхова щцяуляць адаптацию i дарошчванне м!щ>арасл1н in vivo. Выяулена, > лепшым антысептнкам пры увядзенн1 л!л1й у культуру in vitro 1уляеща г1пахларыт кальцыю у 3 % - най канцзнтрацьи. Найбольшы íkt пры мхкраразмнажэнн! дае выкарыстанне нафтылвоцатнай юслаты 5К) у канцэнтрацьп 0.1 - 1.0 мг/л. Аптымальная канцэнтрацыя гар-

- IS -

мону залежыць ад сартавых асаблавасцей, паходкання i тэрмшау 1за-лявання эксплантау. 6 - Бенз1лам1напурын (ВАЛ) не з'яуляецца аба-вязковым кампанентам патаунага асяродку пры м!краразмнажэкн1 л1-Л1Й. Установлена неабходнасць павышаць канцэнтрацыю цукрозы як на першым, так i на друПм этапах мХкраразмнаюння да 60 г/л, што садзешйчае рзгенерацы! буйных цыбулХнак, большаму выхаду эксплантау, павышэнню каэфхцыента размнажэння. Аптымальная асветленасць пры м1краразмнажэнн1 лШй складае 1000 люкс.

Выкарыстанне у якасщ субстрату верхавога торфу щ яго суме-ся$? з пяском 1 перл1там дазвааяе стварыць" спрыялышя умовы для адаптацы! лШй in vivo у культураяьным памяшканн!. Для дарошчван-ня м!крарасл1н ва умовах плёначнай цяшйвд прыгодныя субстраты на аснове верхавога торфу ц! добра акультураная урадлхвая глеба. Выявлена нерауназначнасць аматйнага i нхтратнага азоту для дарошч-Бання м1крарасл1н лШй. Перавага аддаецца аман!йнаму азоту. 1оны хлору не аказваюць прыкметнага 1нг1б1руючага уздэеяння на расл!ны ЛШЙ.

РЕЗКЖЕ. французёнок Василий Владимирович.

Совершенствование методов микроклонального размножения лилий.

Ключевые слова: лилии, микроклональное размножение, культура in vitro, регенерация.

Разработаны основные элементы технологии микроклонального размножения Азиатских Гибридов лилий, позволяющие эффективно получать стерильную культуру, размножать с высоким коэффициентом - более миллиона луковичек в год от одной маточной луковицы при последующем двухлетнем доращивании до товарной луковицы, успешно осуществлять адаптацию и доращивание микрорастений in vivo. Выявлено, что лучшим антисептиком при введении лилий в культуру in vitro является гипохлорит кальция в 3 - ной концентрации. Наибольший эффект при микроразмножении дает использование нафтилуксусной кислоты (НУК) в концентрации 0.1 - 1.0 мг/л. Оптимальная концентрация гормона зависит от сортовых особенностей, происхождения и сроков изолирования эксплантов. 6 - Бенэиламинопурин (БАЛ) не является обязательным компонентом питательной среды при микроразмножении лилий. Установлена необходимость повышать концентрат® сахарозы как на первом, так и на втором этапах микроразмножения до 60 г/л, что способствует регенерации крупных луковичек, большему выходу

эксплаятов, повышению коэффициента размножения. Оптимальная освещенность для микроразмножения лилий составляет 1000 люкс.

Использование в качестве субстрата верхового торфа либо его смесей с песком и перлитом позволяет создать благоприятные условия для адаптации лилий in vivo в культуральном помещении. Для доращи-вания микрорастений в условиях пленочной теплицы применимы субстраты на основе верхового торфа или хорошо окультуренной плодородной почвы. Выявлена неравнозначность аммонийного и нитратного азота для доращивания микрорастений лилий. Предпочтительным является аммонийный азот. Ионы хлора не оказывают заметного ингибирующего действия на растения лилий.

SffiSÍAKY. Frantsuzionak Vasily Vladimirovich

Perfection of methods of micropropagation of lily.

Key words: lily, micropropagation, in vitro culture , regeneration.

Basic elements of micropropagation of Asiatic Hybrids of were worked out which let effectively get a sterile culture and propagate it very efficiently - more than a million bulbs a year from one parent bulb with the following two-years growing them up to marketing bulbs. It also lets effectively adapt microplant's and finish their growing in vivo. 3 % concentration of calcium hypochlorite was found the best antiseptic at introduction the lily in vitro. Naphthaleneacetic acid (NAA) in 0,1-1,0 mg/1 concentration turned out to be the most effective in this respect. Optimum concentration of a hormone depends on the kind pecularities, origin and terms of explants' isolation. б-Benzylaminopurin is not an obligatory component of culture medium of lily's micropropagation. The necessity to raize the sucrose concentration up to 60 g/1 at the first and second stages of micropropagation is found out, which makes for regeneration of big bulbs, for better output of explants, for raizing the coefficient of propagation. Optimum light intensity for lily's micropropagation is 1000 lux.

Using sphagnum peat or its mixture with sand and perlite as a substrate lets create favourable conditions for adaptation the lily in vivo in cultural room. For growing of microplants in filmy hothouse peat or well-cultivated soil can be used as substrate. Ammonium nitrogen and nitrate nitrogen are found out not to be

equal for growing of microplants of the lily in vivo. Ammonium nitrogen is preferable. Ions of chlorine do not give noticable inhibition effect on lily plants.