Совершенствование методов диагностики и оценки эффективности вакцинопрофилактики бешенства животных

Истомина, Мария Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Совершенствование методов диагностики и оценки эффективности вакцинопрофилактики бешенства животных
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование методов диагностики и оценки эффективности вакцинопрофилактики бешенства животных"

005004405

ИСТОМИНА Мария Александровна

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ И ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ БЕШЕНСТВА ЖИВОТНЫХ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 1 ДЕК 2011

Щелково - 2011

005004405

Работа выполнена в Государственном научном учреждении «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» Российской академии сельскохозяйственных наук, г. Щелково

Научный руководитель -

доктор биологических наук, профессор Клюкина Валентина Ивановна

Официальные оппоненты -

Ведущая организация -

доктор биологических наук, профессор Кузнецова Светлана Владимировна

доктор биологических наук Балышева Вера Ивановна

ГНУ «Всероссийский научно -исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко»

Защита диссертации состоится 9 декабря 2011 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук Д 006.069.01 при ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» РАСХН по адресу: 141142, Московская область, Щелковский район, п/о Кашинцево, пос. Биокомбината, ВНИТИБП; e-mail: vnitibp@mail.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» Российской академии сельскохозяйственных наук.

Автореферат разослан 8 ноября 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук ____Ю.Д. Фролов

1 Общая характеристика работы

Актуальность темы. Бешенство остается одной из важнейших проблем ветеринарии и здравоохранения во многих странах мира. Несмотря на проводимые противоэпизоотические мероприятия в Российской Федерации, ограничить распространение бешенства не удается (С.В. Грибенча, 1993; H.A. Хисматуллина и др., 2000; В.М. Авилов и др., 2002; В.В. Макаров, A.A. Воробьев, 2004; А.Е. Метлин, 2008; В.А. Ведерников, И.В. Балдина, 2010; А.М. Гулюкин, 2011).

Противоэпизоотические мероприятия при бешенстве включают диагностику болезни и профилактическую иммунизацию домашних, диких плотоядных и сельскохозяйственных животных с последующим контролем эффективности вакцинации.

Методы диагностики бешенства, рекомендуемые Комитетом экспертов ВОЗ, требуют специального оборудования и предназначены, в основном, для постмортальных исследований (Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, 2011).

Показана возможность индикации антигена вируса бешенства в слюне животных методом иммунохроматографии (В.К. Kang, et al., 2007), в эпителиальных клетках роговицы глаза (корнеальный тест) и биоптатах кожи методом иммунофлюоресценции (H.A. Ковалев, 1965; L.G. Schneider, 1969; H.A. Ковалев, A.C. Шашенько, 1970; J. Zimmerman 1971; J. Bingham, P. Mlambo, 1995; Н.П. Мишаева и др., 2008), а также вирусного генома в слюне и спинномозговой жидкости методом ПЦР (Р. Crepin, et al., 1998; Я.С. Цыбанов, 2001).

Достижения биотехнологии на современном этапе позволяют совершенствовать методы иммуноанализа на основе реагентов, визуализирующих результат реакции. В связи с этим, представляет научный и практический интерес разработка тест-систем на основе точечного анализа на нитроцеллюлозной мембране с применением конъюгата специфических антител с пероксидазой (dot-ELISA) или с коллоидным золотом для выявления

антигена вируса бешенства в слюне животных, что необходимо для оценки риска заражения человека или животных.

Объективным методом оценки эффективности вакцинопрофилактики бешенства является определение в сыворотке крови уровня вируснейтрализующих антител (Э.Я. Сазанова и др., 1991; C.B. Кузнецова, 1991; J.S. Smith, 1996; F. Cliquet, et al., 1998; H.A. Хисматуллина и др., 2000; К.Н. Груздев, В.В. Недосеков, 2001).

В 2007 году Комитет экспертов ВОЗ рекомендовал непрямой вариант иммуноферментного анализа (ИФА) для количественного определения поствакцинальных антирабических антител в сыворотке крови собак и кошек (Manual of standards Diagnostic Tests and Vaccines, 2011 ).

В связи с вышеизложенным, исследования в области совершенствования существующих и разработки новых методов диагностики и оценки эффективности вакцинопрофилактики бешенства животных являются актуальными и имеют научное и практическое значение.

Цель и задачи исследований. Основной целью данной работы являлось совершенствование методов диагностики и оценки эффективности вакцинопрофилактики бешенства животных.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:

- получить рибонуклеопротеин вируса бешенства и специфические к нему антитела, синтезировать на их основе конъюгаты с пероксидазой и коллоидным золотом;

- разработать тест-системы на основе dot-ELISA и точечного анализа с применением иммунозолотого маркера для выявления антигена вируса бешенства в слюне животных;

- получить препарат альбумина, меченного родамином, и отработать условия выявления антигена вируса бешенства в отпечатках роговицы глаза, мазках ткани мозга животных и в культуре клеток методом контрастной иммунофлюоресценции;

- усовершенствовать тест-систему на основе непрямого ИФА для определения уровня специфических антител в сыворотке крови вакцинированных против бешенства животных.

Научная новизна исследований. Показана принципиальная возможность выявления антигена вируса бешенства в слюне методами сЫ-ЕЫБА и точечного анализа с применением иммунозолотого маркера и в эпителиальных клетках роговицы глаза животных методом контрастной иммунофлюоресценции.

Разработаны тест-системы на основе (1о1-ЕША и точечного анализа с применением иммунозолотого маркера для индикации антигена вируса бешенства в слюне.

Показано, что применение конъюгата альбумина с родамином повышает эффективность метода иммунофлюоресценции при выявлении антигена вируса бешенства.

Усовершенствована тест-система на основе непрямого ИФА для определения уровня специфических антител в сыворотке крови вакцинированных против бешенства животных.

Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований разработаны и предложены:

- тест-системы на основе <Ы-ЕЫ8А и точечного анализа с применением иммунозолотого маркера для индикации антигена вируса бешенства в слюне;

- набор реагентов для определения уровня специфических антител в сыворотке крови вакцинированных против бешенства животных методом непрямого ИФА;

- метод контрастной иммунофлюоресценции для выявления антигена вируса бешенства в отпечатках роговицы глаза, мазках ткани мозга животных и в культуре клеток.

Результаты исследований представляют практическую ценность для оптимизации противоэпизоотических мероприятий по борьбе с бешенством.

Основные положения, выносимые на защиту

- Индикация антигена вируса бешенства в слюне животных методами dot-ELISA и точечного анализа с применением иммунозолотого маркера.

- Выявление антигена вируса бешенства в отпечатках роговицы глаза, мазках ткани мозга животных и в культуре клеток методом контрастной иммунофлюоресценции.

- Определение уровня специфических антител в сыворотке крови животных, вакцинированных против бешенства, методом непрямого ИФА.

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Отдельные этапы работы проводились совместно с заведующим отделом вирусологии ВНИТИБП, доктором ветеринарных наук B.C. Ивановым (2010), ведущим научным сотрудником ВГНКИ, кандидатом биологических наук A.JI. Елаковым.

Апробация результатов работы. Основные материалы диссертационной работы доложены на заседаниях Ученого совета ВНИИТБП, на Международной научно-практической конференции «Задачи ветеринарной науки в реализации Доктрины продовольственной безопасности Российской Федерации» (Покров, 2011), на Международной научно-практической конференции «Актуальные аспекты разработки, приготовления, контроля качества и использования ветеринарных иммунобиологических препаратов на основе современных биотехнологий» (Алушта, АР Крым, 2011), на научно-практической конференции, посвященной 90-летию ФГУП «Армавирская биофабрика» (Армавир, 2011), Международной научно-практической конференции «Актуальные аспекты интегрированной защиты животных от болезней», посвященной 50-летию ГНУ ВНИИВЭА (Тюмень, 2011), на заседании секции «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (Щелково, 2011) и на межлабораторных совещаниях сотрудников отдела иммунологии, отдела молекулярной биологии и вирусологии ГНУ ВНИТИБП (2010-2011).

Публикация научных исследований. По материалам диссертационной работы опубликовано 5 научных работ, в том числе 2 в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста, иллюстрирована 4 таблицами и 21 рисунком. Список литературы включает 270 источников, из которых 199 иностранных.

2 Собственные исследования

Работа выполнена в 2010-2011 гг. в отделе иммунологии ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» РАСХН в рамках Российской научно-технической программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития АПК РФ, задание 08.06: «Разработать высокоэффективные технологии изготовления новых лекарственных средств для ветеринарии и животноводства на основе современных биотехнологических процессов, базовых конструкций и универсальных технологических линий».

Материалы и методы. Вирус бешенства. В работе использовали фиксированный вирус бешенства, штамм «Овечий», стандартный штамм «CVS», штамм «Щелково-51». Вирус бешенства инактивировали 0,025% раствором В-пропиолактона.

Тест-система на основе dot-ELISA для индикации антигена вируса бешенства в слюне. Для оптимизации условий проведения dot-ELISA использовали пробы слюны от собак, в которые вносили суспензию очищенного мозгового вируса бешенства, штамм «CVS», с инфекционностью 3,8 lg LD5o/0,03 мл.

Дм сорбции на нитроцеллюлозной мембране и приготовления конъюгата с пероксидазой хрена получали антитела к рибонуклеопротеину (РНП) вируса бешенства, штамм «CVS». РНП выделяли из суспензии частично очищенного и концентрированного мозгового вируса, обработанной тритоном Х-100 (А.

Helenius, H. Soderlund, 1973), с последующим центрифугированием в градиенте плотности сахарозы.

Сыворотку к рибонуклеопротеину вируса бешенства получали иммунизацией морских свинок препаратом РНП, активность сыворотки устанавливали в реакциях связывания комплемента по Е. Kuwert (1960) и диффузионной преципитации с использованием «Набора компонентов для диагностики бешенства животных в реакции диффузионной преципитации» (ТУ 9388-006-00497963-99).

IgG из анти-РНП и нормальной сыворотки крови морской свинки выделяли методом аффинной хроматографии на коммерческом сорбенте Protein А - Agarose CL-4B («Fluka»), согласно рекомендациям фирмы-изготовителя, и концентрировали методом диализа против 25% раствора декстрана Т-70 («Sigma»).

Конъюгат анти-РНП IgG с пероксидазой хрена Rz>3,0 (ООО «НИЦ Росбио») получали по В. Wilson, P. Nakane (1978). Молярное соотношение фермент/белок в конъюгате устанавливали методом спектрометрии при 403 и 280 нм. Ферментативную активность конъюгата определяли по Д. Кэтти, Ч. Райкундалиа (1991), специфическую активность - методом прямого ИФА с сорбированным препаратом РНП вируса бешенства в лунках 96-луночного полистиролового планшета («Costar», США).

Dot-ELISA проводили по R. Hawkes, et al. (1982) с использованием нитроцеллюлозной мембраны (Protran ВА 85, 20x20 см, размер пор 0,45 мкм), нарезанной на полоски размером 1x5 см. Для формирования тестируемой полоски сорбировали анти-РНП IgG, контрольной - IgG нормальной сыворотки морской свинки.

Постановка dot-ELISA включала следующие этапы: нанесение проб слюны на тестируемую и контрольную полоски; инкубация полосок в растворе анти-РНП пероксидазного конъюгата; выявление связанного фермента субстратно-индикаторным раствором. О наличии антигена вируса бешенства в

пробе судили по появлению окрашенного пятна на тестируемой полоске при отсутствии окраски на контрольной.

Для определения оптимальных условий выявления антигена вируса бешенства в слюне методом dot-ELISA в экспериментальных условиях изучали влияние различных факторов: сорбционная доза анти-РНП IgG и рабочее разведение специфического пероксидазного конъюгата; температурный режим и время инкубации компонентов; состав промывочного, блокирующего, лизирующего и субстратно-индикаторного растворов.

Тест-система на основе точечного анализа с применением иммунозолотого маркера для индикации антигена вируса бешенства в слюне. Коллоидное золото получали по G. Frens (1973). Конъюгат анти-РНП IgG с частицами коллоидного золота получали по G.T. Hermanson (1996), рабочее разведение устанавливали титрованием в точечном иммуноанализе с постоянной дозой вируса.

Точечный анализ проводили по V.S. Dar, et al. (1994) на ншроцеллюлозных полосках с сорбированными анти-РНП IgG и IgG нормальной сыворотки крови, реакцию проявляли с помощью конъюгата анти-РНП IgG с коллоидным золотом. О наличии антигена вируса бешенства в пробе судили по появлению розовато-красного пятна на тестируемой полоске при отсутствии окраски на контрольной.

Чувствительность разработанных тест-систем устанавливали титрованием в слюне собак суспензии очищенного мозгового вируса бешенства с исходной инфекционностью 3,8 lg LD50/0,03 мл.

Выявление антигена вируса бешенства методом контрастной иммунофлюоресценции. Оптимальные условия приготовления конъюгата альбумина (Albumin from bovine serum, «Fluka») с родамином В (Rhodamine В isothiocyanate, «Fluka») определяли путем подбора соотношения флюорохром/белок, времени конъюгирования и температурного режима. Непрореагировавший краситель удаляли методом гель-хроматографии на колонке 1,5x40, заполненной сефадексом G-50 в ЮмМ фосфатном буфере, pH

7,4-7,6. Соотношение родамин/альбумин в конъюгате устанавливали методом спектрометрии при 573 нм и 280 нм.

Рабочее разведение конъюгата альбумина с родамином устанавливали при одновременной его инкубации с глобулином флюоресцирующим (ТУ 938803-00497963-97) и отпечатками роговицы глаза клинически здоровых мышей и баранов, а также мазками ткани мозга мышей, павших после заражения вирусом бешенства, штамм «CVS», и баранов, павших после заражения вирусом бешенства, штамм «Овечий», при 37°С в течение 30 минут.

Метод контрастной иммунофлюоресценции апробировали при выявлении антигена вируса бешенства в отпечатках роговицы глаза, ткани мозга, в культуре клеток ВНК-21. Реакцию прямой иммунофлюоресценции и биопробу проводили по ГОСТ 26075-84.

Набор реагентов для определения уровня специфических антител в сыворотке крови вакцинированных против бешенства животных методом непрямого ИФА. В качестве антигена для непрямого варианта ИФА использовали гликопротеин вируса бешенства, который выделяли из культуральной суспензии вируса, штамм «Щелково-51», по методу В. Dietzschold, et al. (1978).

В качестве референс-антирабической сыворотки использовали отраслевой стандартный образец антирабической сыворотки крупного рогатого скота (КРС), серия NCA-03, с активностью 20 МЕ/мл (ВНИТИБП), и сыворотку крови собаки, иммунизированной вакциной антирабической инактивированной сухой культуральной из штамма "Щелково-51" (Рабикан). Вируснейтрализуюшую активность сыворотки крови собак определяли в реакции нейтрализации (РН) на мышах согласно «Методам лабораторных исследований по бешенству» (ВОЗ. Женева, 1975) в сравнении с отраслевым стандартным образцом.

В качестве контроля использовали сыворотку крови от клинически здоровых собак и КРС, отрицательно реагирующую в РН in vivo.

Конъюгат протеина A St. aureus («Sigma») с пероксидазой хрена Rz>3,0 (ООО «НЩ Росбио») получали по В. Wilson, P. Nakane (1978). Для исследований сыворотки крови КРС использовали «Иммуноглобулины диагностические против IgG (H+L) быка, меченные пероксидазой» (НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалея).

Рабочее разведение конъюгатов устанавливали методом «шахматного» титрования в прямом варианте ИФА с использованием 96-луночного полистиролового планшета («Costar», США), сенсибилизированного сывороткой крови животных (собака, кошка, лисица, енотовидная собака, песец, КРС).

Методика непрямого ИФА включала следующие этапы: инкубация контрольной отрицательной, референс-антирабической и исследуемых сывороток в разведении 1:100 в лунках полистироловых планшетов (стрипов) с сорбированным гликопротеином вируса бешенства; инкубация пероксидазного конъюгата; выявление связанного фермента субстратно-индикаторным раствором.

Результаты непрямого ИФА учитывали по величине оптической плотности при длине волны 492 нм на спектрофотометре фирмы «Sigma». Уровень специфических антител в исследуемых пробах устанавливали по ОП492 в исследуемых пробах в сравнении с ОП492 референс-антирабической сыворотки.

С использованием предложенного набора реагентов исследовали 250 проб сыворотки крови домашних, диких плотоядных и сельскохозяйственных животных.

Содержание общего белка определяли по О.Н. Lowiy, et al. (1951).

Статистическая обработка результатов. При анализе и статистической обработке результатов использовали программу «Microsoft Excel», входящую в пакет программ «Microsoft Office, 2007». Статистическую обработку полученных данных проводили общепринятыми методами (Г.Ф. Лакин, 1990).

Результаты собственных исследований

Разработка тест-системы на основе dot-ELISA для выявления антигена вируса бешенства в слюне. Длительный и вариабельный по продолжительности инкубационный период бешенства, в течение которого животное может быть вирусоносителем, является одним из основных препятствий при постановке диагноза. Выявление антигена вируса в слюне инфицированных животных до проявления клинических признаков болезни позволяет проводить своевременную диагностику бешенства. Наша задача заключалась в разработке тест-системы на основе dot-ELISA для выявления антигена вируса бешенства в слюне животных.

Исходным материалом при получении рибонуклеопротеина служила суспензия вируса бешенства, штамм «CVS», очищенная от тканевых белков на 96,4% и сконцентрированная по объему в 20 раз. Активность препарата РНП, полученного осаждением при 118000 g из вирусной суспензии, обработанной тритоном Х-100 в конечной концентрации 2%, с последующим центрифугированием в градиенте плотности 10-40% сахарозы, в реакции связывания комплемента с антирабической сывороткой составила 1:320, в реакции диффузионной преципитации -1:512.

Для получения высокоактивной анти-РНП сыворотки препаратом РНП были иммунизированы морские свинки 5-кратно в дозе 80 мкг с интервалом 5 дней. Примененная нами схема иммунизации позволила получить анти-РНП сыворотку с титром преципитирующих 1 антител 1:128-1:512 и комплементсвязывающих антител 1:80-1:160 на 14 сутки после последней иммунизации.

В связи с тем, что аналитические параметры dot-ELISA зависят от качества антител, иммобилизованных на нитроцеллюлозной мембране, и специфического конъюгата, IgG выделяли аффинной хроматографией из анти-РНП сыворотки с титром преципитирующих антител не менее 1:128 и комплементсвязывающих антител не менее 1:80. Методом аффинной хроматографии на Protein А - Agarose CL-4B с последующим

концентрированием получены препараты анти-РНП с содержанием белка 1,5 мг/мл, нормальной сыворотки крови морской свинки -1,2 мг/мл.

В конъюгате анти-РНП ДО с пероксидазой хрена соотношение ОП403/ОП280, пропорциональное количеству фермента, связанного с составило 0,36. Результаты определения ферментативной активности конъюгата показали, что при концентрации белка 1 мкг/мл конъюгат окрашивает субстратно-индикаторный раствор до ОП492 >1,0 за 15 минут, а до ОП492 >1,5 - за 30 минут, что свидетельствует о достаточной ферментативной активности. Активность конъюгата в прямом варианте ИФА составила 1:6400.

Установлена оптимальная сорбционная доза анти-РНП ¡ДО и ДО нормальной сыворотки морской свинки на нитроцеллюлозных полосках - 400 мкг и рабочее разведение анти-РНП пероксидазного конъюгата - 1:1500.

Результаты применения бычьего сывороточного альбумина (БСА) в концентрации 0,5-5% для блокировки мест, свободных после сорбции ДО, и 0,1-1% растворов неионных детергентов №-40, Твин-20 для удаления несвязавшихся компонентов реакции показали, что 3% БСА в сочетании с 0,5% Твин-20 устраняет фоновое окрашивание мембраны без снижения чувствительности скЛ-ЕПЗА.

Анти-РНП ДОг, сорбированные на нитроцеллюлозной мембране, сохраняли активность в течение 12 месяцев при 4°С и 3-х месяцев при 22-25 °С.

Для обеспечения специфического связывания присутствующего в слюне антигена вируса бешенства с иммобилизованными на мембране анти-РНП ДОг оптимизированы состав лизирующего буфера и время инкубации пробы. В качестве детергента выбран тритон Х-100, который способен дезинтегрировать мембрану и удерживать вирусные белки в растворенном состоянии, не нарушая их антигенной структуры и не препятствуя взаимодействию с антителами. Внесение в буфер тритона Х-100 в 0,1% концентрации и инкубация в течение 1 часа обеспечивали специфическое выявление антигена вируса бешенства, что подтверждено интенсивной окраской пятна. При этом повышение

концентрации тритона Х-100 и увеличение времени инкубации не оказывали влияния на результат сЫ-ЕЬКА.

Сравнительная оценка применения 4-хлор-1-нафтола и диаминобензидина в качестве хромогенного субстрата показала преимущество диаминобензидина, преобразующегося в процессе ферментативной реакции в преципитат коричневого цвета в зоне специфического связывания при отсутствии фонового окрашивания.

В результате проведенных исследований определены оптимальные условия выявления антигена вируса бешенства методом (кЛ-ЕЫБА: точечное нанесение на тестируемую и контрольную полоски по 5 мкл слюны в лизирующем буфере (0,05 М трис-НС1, рН 7,5 с 0,1% тритона Х-100) (1:1), инкубация при комнатной температуре в течение 1 часа; инкубация полосок в 5 мл раствора анти-РНП - пероксидазого конъюгата в рабочем разведении 1:1500 на 0,05 М трис-НС1 буфере, рН 7,5 с 1% БСА при комнатной температуре в течение 1 часа; 4-кратная промывка полосок 0,05 М трис-НС1 буфером, рН 7,5 с 0,5% твин-20 после каждого этапа инкубации; проявление реакции с помощью субстратно-индикаторного раствора, содержащего 0,05% диаминобензидина в 0,05 М трис-НС1 буфере, рН 7,5 с 0,01 % Н2О2. Появление выраженного коричневого пятна на тестируемой полоске при отсутствии окрашивания на контрольной полоске через 10 минут свидетельствует о наличии антигена вируса бешенства в пробе.

Чувствительность тест-системы на основе ск^-ЕЫБА составила 2,3 ^ 1Х>5о/0,03 мл.

Разработка тест-системы на основе точечного анализа с применением иммунозолотого маркера для индикации антигена вируса бешенства в слюне. Методы точечного анализа с применением конъюгатов коллоидного золота находят все большее применение благодаря высокой чувствительности и простоте постановки. С целью повышения чувствительности анализа при выявлении вируса бешенства в слюне нами заменена двухкомпонентная система визуализации результатов сЬоЕЫЗА (анти-РНП пероксидазный

конъюгат - субстрах) на иммунозолотой маркер (коньюгат анти-РНП с коллоидным золотом).

Для синтеза конъюгата необходимо было получить коллоидное золото стабильность агрегатов которого зависит от размера частиц. Кипячением в течение 45 минут раствора, содержащего 0,01% золотохлористо-водородной кислоты и 0,015% цитрата натрия, получен устойчивый золь красного цвета с размером частиц 20-40 нм, который сохранял окраску при 4°С в течение месяца.

Конъюгат получен инкубацией в течение 20 минут при комнатной температуре и рН 9,0 частиц коллоидного золота с анти-РНП предварительно диализованными в течение 18 часов при 4°С против 0,01 М карбонатно-бикарбонатного буфера, рН 9,0, с последующим внесением БСА до конечной концентрации 0,3% и отделением от несвязавшегося белка центрифугированием при 6000 g в течение 60 минут. Рабочее разведение конъюгата в точечном анализе составило 1:100.

В результате проведенных исследований определены условия выявления антигена вируса бешенства в слюне: точечное нанесение на тестируемую и контрольную нитроцеллюлозные полоски по 5 мкл слюны в лизирующем буфере (0,05 М трис-НС1, рН 7,5 с 0,1% тритона Х-100) (1:1), инкубация при комнатной температуре в течение 1 часа; инкубация полосок в 5 мл раствора конъюгата анти-РНП ДО с коллоидным золотом в рабочем разведении 1:100 на 0,05 М трис-НС1 буфере, рН 7,5 с 1 % БСА при комнатной температуре в течение 1 часа; 3-кратная промывка полосок 0,05 М трис-НС1 буфером, рН 7,5 с 0,5% твин-20 после каждого этапа инкубации.

Появление розовато-красного окрашивания на тестируемой полоске при отсутствии окрашивания на контрольной полоске свидетельствует о наличии антигена вируса бешенства в испытуемой пробе. Окрашивание появляется в зоне специфического связывания через 5-10 минут после погружения полосок в раствор конъюгата с последующим усилением интенсивности в течение 1 часа.

Чувствительность тест-системы на основе точечного анализа с применением иммунозолотого маркера составила 2,0 ^ 1ЛЭ5о/0,03 мл.

Выявление антигена вируса бешенства методом контрастной иммунофлюоресценции. В препаратах роговицы глаза, ткани мозга, культуры клеток при исследовании под люминесцентным микроскопом нередко наблюдается аутофлюоресценция, что затрудняет учет результатов обнаружения антигена вируса бешенства методом иммунофлюоресценции при диагностике бешенства и определении уровня специфических антител в реакции нейтрализации in vitro.

Одним из методов подавления аутофлюоресценции является контрастирование фона с помощью альбумина, конъюгированного с родамином, что объясняется его способностью вызывать интенсивное неспецифическое окрашивание благодаря высокому отрицательному заряду молекул, а также высокой степенью контрастирования красновато-кирпичного свечения родамина с желто-зеленым свечением флюоресцеинизотиоцианата.

Для определения оптимальных условий приготовления конъюгата альбумина с родамином испытаны концентрации от 5 до 30 мкг красителя/мг белка, время экспозиции - 2, 18 и 24 часа, температура - 20°С и 4°С. В результате проведенных исследований установлено, что соотношение флюорохром/белок 20 мкг/мг является оптимальным при использовании альбумина в концентрации 6 мг/см3, времени конъюгирования 24 часа при рН 9,0 и температуре 4°С.

Гель-хроматография конъюгата на сефадексе G-50 позволила получить свободный от несвязавшегося красителя меченный флюорохромом белок, сходящий с колонки в первом пике. Соотношение родамин/альбумин (ОП373/ОП280) в конъюгате составило 0,5.

Применение конъюгата альбумина с родамином в разведении 1:80 при одновременной инкубации с глобулином антирабическим флюоресцирующим в разведении 1:8 при 37°С в течение 30 минут обеспечивало контрастирование фона в мазках ткани головного мозга животных, павших после заражения вирусом бешенства, без подавления специфической флюоресценции.

Эпителиальные клетки роговицы глаза клинически здоровых животных флюоресцировали красновато-кирпичным цветом.

Метод контрастной иммунофлюоресценции апробирован при исследовании отпечатков роговицы глаза (корнеальная проба) собак и кошек, неспровоцированно покусавших других животных (таблица 1).

Таблица 1

Результаты исследований отпечатков роговицы глаза животных методом контрастной иммунофлюоресценции

Исследования отпечатков роговицы глаза

Вид животных Интравитально Постмортально Рабический статус*

+ - Всего + - Всего

Собаки 2 3 5 4 1 5 Зараженные

0 2 2 не иссл. не иссл. не иссл. Незараженные

Кошки 1 2 3 2 1 3 Зараженные

0 1 1 не иссл. не исся. не иссл. Незараженные

Всего 3 (37,5%) 0 5 (62,5%) 3 (100%) 8 (100%) 3 6 (75%) не иссл. 2 (25%) не иссл. 8 (100%) не иссл. Зараженные Незараженные

Примечание: + положительный результат; - отрицательный результат; не иссл. - не исследовали; * основан на постмортальных исследованиях ткани головного мозга методами флюоресцирующих антител и биопробы.

Согласно данным, представленным в таблице, интравитальные исследования роговицы глаза 11 животных методом контрастной иммунофлюоресценции показали положительный результат у 3 животных, постмортальные исследования показали наличие антигена вируса бешенства в отпечатках роговицы 6 из 8 павших животных. Исследованием ткани мозга павших животных методом иммунофлюоресценции положительный результат был получен у 7, отрицательный результат - у одного животного. Результат биопробы ткани головного мозга этого животного был положительным.

Специфичность метода корнеальной пробы составила 100%, чувствительность при интравитальных исследованиях составила 37,5%, а при постмортальных исследованиях - 75%.

Метод контрастной иммунофлюоресценции апробирован при выявлении антигена вируса бешенства в ткани мозга после хранения в формалине и глицерине и в культуре клеток. Инкубация конъюгата альбумин-родамин с глобулином флюоресцирующим обеспечивала контрастирование фона без подавления специфической флюоресценции, что повышает эффективность метода иммунофлюоресценции при диагностике бешенства и определении уровня специфических антител в тесте ингибиции фокусов флюоресценции (МИТ) и в тесте флюоресценции вируснейтрализующих антител (ТАУЫ).

Препарат конъюгата альбумина с родамином предложен для включения в состав диагностикума «Глобулин флюоресцирующий для диагностики бешенства животных» (ТУ 9388-03-00497963-97).

Набор реагентов для определения уровня специфических антител в сыворотке крови вакцинированных против бешенства животных методом непрямого ИФА. Несмотря на сложную эпизоотическую ситуацию по бешенству и необходимость профилактической иммунизации восприимчивых животных с последующим контролем эффективности вакцинации, в настоящее время отсутствуют коммерческие тест-системы отечественного производства, предназначенные для этой цели.

За основу была взята иммуноферментная тест-система определения уровня специфических антител в сыворотке крови привитых против бешенства кошек и собак (П.В. Рахманин, 2008). Совершенствование данной тест-системы заключалось в расширении видовой специфичности, формировании набора реагентов, оптимизации условий постановки и учета результатов непрямого ИФА, изучении эффективности применения набора для количественного определения антител в сыворотке крови вакцинированных животных.

В результате проведенных исследований предложен набор реагентов в двух вариантах: для исследования сыворотки крови домашних и диких плотоядных; для исследования сыворотки крови КРС (таблица 2).

Таблица 2

Набор реагентов для определения уровня специфических антител в сыворотке крови вакцинированных против бешенства животных методом

непрямого ИФА

Номер компонента Название компонента, описание Количество

К1 Планшет: полистироловые 96-луночные микропланшеты или 16-луночные стрипы в рамке, сенсибилизированные гликопротеином вируса бешенства 2 микропланшета или 12 стрипов

К2 Отрицательный контроль: нормальная сыворотка крови собаки или КРС, не содержащая специфических антител к вирусу бешенства (желто-зеленый раствор) 1 флакон (0,5 см3)

КЗа Референс-препарат (0,5 МЕ/мл): референс-антирабическая сыворотка крови собаки или КРС, содержащая 0,5 МЕ/мл антирабических вируснейтрализующих антител (малиновый раствор) 1 флакон (0,5 см3)

КЗб Реферепс-препарат (5 МЕ/мл): референс-антирабическая сыворотка крови собаки или КРС, содержащая 5 МЕ/мл антирабических вируснейтрализующих антител (малиновый раствор) 1 флакон (0,5 см3)

К4 Конъюгат: раствор протеин А- или анти-^О КРС пероксидазного коньюгата в рабочем разведении (желтый раствор) 2 флакона (i0 см3)

К5 Раствор для разведения проб: 0,05 М трис-НС1 буфер, рН 7,4-7,6 с буфер 0,5% БСА, 0,05% тритона Х-100, 0,05% додецилсульфата натрия (бесцветный раствор) 2 флакона (50 см3)

Кб Промывочный раствор: 10-кратный 0,05 М трис-НС1 буфер, рН 7,4-7,6 с 0,2 М №С1, 0,01% твин-20 (бесцветный раствор) 1 флакон (250 см3)

К7 Субстратный раствор: цитратный буферный раствор, рН 5,0, включающий 0,015% перекиси водорода (бесцветный раствор) 2 флакона (10 см3)

К8 Хромоген: орто-фенилендиамин (ОФД) 5 таблеток (2 мг)

К9 Стоп-реагент: раствор 4И раствор серной кислоты (бесцветный раствор) 1 флакон (10 см3)

Набор рассчитан для исследования 93 проб сыворотки крови при качественном анализе и 88 проб при количественном анализе. Исследование стабильности реагентов набора позволило установить срок их годности 12 месяцев при хранении в защищенном от света месте при 2-8°С.

Обработкой частично очищенного и концентрированного культурального вируса бешенства, штамм «Щелково-51», тритоном Х-100 в конечной концентрации 2% и отделением от рибонуклеопротеина центрифугированием при 118000 § в течение 90 минут получен препарат гликопротеина вируса бешенства, сорбционная доза которого в лунках полистироловых микропланшетов или стрипов составила 4 мкг. Для блокировки сайтов, свободных после сорбции, планшеты обрабатывали 2% БСА в течение 1 часа при 37°С. После промывки сенсибилизированные гликопротеином вируса бешенства планшеты (стрипы) хранили плотно закрытыми при 4°С.

В качестве референс-препарата для исследования сыворотки крови диких и домашних плотоядных была получена сыворотка крови собак с содержанием специфических вируснейтрализующих антител 10 МЕ/мл.

В состав набора включен антикв КРС пероксидазный конъюгат в рабочем разведении 1:3000 или пероксидазный конъюгат протеина А в разведении 1:1500.

Результаты оптимизации состава раствора для разведения исследуемых проб сыворотки показали, что включение в трис- НС1 буфер 0,5% БСА, 0,05% тритона Х-100, 0,05% додецилсульфата натрия позволило снизить чрезмерное фоновое окрашивание, которое часто появляется при исследовании сыворотки крови диких плотоядных, до допустимого уровня (ОП492<0,2) без подавления специфического связывания.

Набор реагентов предназначен для качественного и количественного анализа проб сыворотки в одном разведении 1:100. Для качественного анализа среднее значение ОП492 исследуемой сыворотки сравнивают с ОП492 референс-антирабической сыворотки с активностью 0,5 МЕ/мл и 5,0 МЕ/мл и определяют содержание антирабических антител, выраженное в МЕ/мл. Для

количественного анализа содержание специфических антител в исследуемой сыворотке определяют по калибровочной кривой, отражающей зависимость ОП492 от количества антител (МЕ/мл), установленную титрованием референс-антирабической сыворотки.

С применением набора было исследовано 180 проб сыворотки крови крупного рогатого скота (6 месяцев после вакцинации), 52 пробы сыворотки крови кошек и собак (разные сроки после вакцинации) и 18 проб сыворотки крови лисиц (после проведения кампаний по оральной иммунизации). Результаты определения уровня антирабических антител методом непрямого ИФА представлены на рисунке.

£ а

1 в

Крупный рогатый скот

Домашние плотоядные

й Лисицы

<0,5 0,5-5,0 \ >5,0

Уровень антирабических антител в сыворотке крови, МЕ/мл

Результаты определения уровня антирабических антител методом

непрямого ИФА

Содержание более 0,5 МЕ/мл специфических антител в сыворотке крови 93,3% КРС, 96,15% домашних плотоядных и 33,3 % лисиц свидетельствует о достаточном уровне протективного иммунитета. Высокая сероконверсия установлена у 1,1% КРС и 17,3% домашних плотоядных. 6,7% обследованного

КРС, 3,85% домашних плотоядных и 66,7% лисиц не имели достаточного

уровня специфических антител.

Пробы сыворотки с активностью в непрямом ИФА 0,25-1,25 МЕ/мл были иссдедованы в реакции нейтрализации на мышах. Чувствительность непрямого ИФА при исследовании проб сыворотки плотоядных в этом диапазоне относительно реакции нейтрализации составляет 75%, специфичность - 83,3%, проб сыворотки КРС - 77,8% и 85,7%, соответственно.

Таким образом, в результате проведенных исследований разработаны тест-системы на основе <кй-ЕША и точечного анализа с применением иммунозолотого маркера на нитроцеллюлозной мембране для индикации антигена вируса бешенства в слюне, метод контрастной иммунофлюоресценции для выявления антигена вируса бешенства в отпечатках роговицы глаза, мазках ткани мозга и в культуре клеток, усовершенствована тест-система и предложен набор реагентов для определения уровня специфических антител в сыворотке крови вакцинированных против бешенства животных методом непрямого ИФА.

3 Выводы

1. Разработана технология получения аяти-РНП ДО, включающая очистку рибонуклеопротеина вируса бешенства, получение анти-РНП сыворотки иммунизацией морских свинок и аффинную очистку анти-РНП 1§0. Сорбционная доза анти-РНП Ьв на нитроцеллюлозной мембране составила 400 мкг, рабочее разведете конъюгата анти-РНП ДО с пероксидазой -1:1500, конъюгата анти-гНП ДО с коллоидным золотом -1:100.

2. Разработаны композиты тест-систем на основе {кл-ЕЬКА и точечного анализа с применением иммунозолотого маркера и оптимизированы условия экспресс-индикации штигена вируса бешенства в слюне животных.

3. Разработана технол«гия получения конъюгата альбумина с родамином и усовершенствован нетод иммунофлюоресценции для выявления антигена вируса бешенств: в отпечатках роговицы глаза, мазках ткани мозга животных и в культуре клеток. Применение альбумина, меченного родамином, помшает эффективность метода иммунофлюоресценции при диагностике бе-генства и определении уровня специфических антител в тесте

ингибиции фокусов флюоресценции (RFFIT) и в тесте флюоресценции вируснейтрализующих антител (FAVN).

4. Показана принципиальная возможность обнаружения антигена вируса бешенства в отпечатках роговицы глаза методом контрастной иммунофлюоресценции. Специфичность метода составляет 100%, чувствительность при интравитальных исследованиях - 37,5%, при постмортальных - 75%.

5. Усовершенствована тест-система и предложен набор реагентов для определения уровня специфических антител в сыворотке крови вакцинированных против бешенства животных методом непрямого ИФА, применение которого позволяет осуществлять оценку напряженности поствакцинального антирабического иммунитета. Чувствительность непрямого ИФА при исследовании проб сыворотки плотоядных относительно реакции нейтрализации составила 75%, специфичность -83,3%, проб сыворотки КРС - 77,8% и 85,7%, соответственно.

6. Показана эффективность непрямого ИФА в качестве скринирующего метода при серомониторинге антирабической вакцинации. Результаты исследований сывороток крови свидетельствуют о достаточном уровне протективного иммунитета у 93,3% КРС, 96,15% домашних плотоядных и 33,3% лисиц.

4 Практические предложения

На основании проведенных исследований предлагаются для практики:

- «Методические положения по количественному определению антител к антигену вируса бешенства в сыворотке крови животных в непрямом варианте иммуноферментного анализа», утверждены академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины, академиком Россельхозакадемии А.М. Смирновым 8 августа 2011 г.

- «Методические положения по выявлению антигена вируса бешенства методом контрастной иммунофлюоресценции», утверждены академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины, академиком Россельхозакадемии А.М. Смирновым 8 августа 2011 г.

- Тест-система на основе сЫ-ЕЫБА для индикации антигена вируса бешенства в слюне.

- Тест-система на основе точечного анализа с применением иммунозолотого маркера для индикации антигена вируса бешенства в слюне.

- Набор реагентов для определения уровня специфических антител в сыворотке крови вакцинированных против бешенства животных методом непрямого иммуноферментного анализа.

- НТД на «Набор реагентов для количественного определения антител к антигену вируса бешенства в сыворотке крови животных в непрямом варианте иммуноферментного анализа», утверждена директором ВНИТИБП 5.04.2011.

- Временная инструкция по применению «Набора реагентов для количественного определения антител к антигену вируса бешенства в сыворотке крови животных в непрямом варианте иммуноферментного анализа», утверждена директором ВНИТИБП 5.04.2011.

4 Список работ, опубликованных по теме диссертации

1.Клюкина, В.И. Определение уровня вируснейтрализующих антирабических антител в сыворотке крови вакцинированного против бешенства крупного рогатого скота методом непрямого ТФ-ИФА / В.И. Клюкина, М.А. Истомина, Д.А. Салов // Задачи ветеринарной науки в реализации Доктрины продовольственной безопасности Российской Федерации: материалы Международной научно-практической конференции. - Покров, 2011. - С. 135-138.

2. Истомина, М.А. Прижизненная диагностика бешенства методом контрастной иммунофлюоресценции /М.А. Истомина// Задачи ветеринарной науки в реализации Доктрины продовольственной безопасности Российской Федерации: материалы Международной научно-практической конференции. -Покров, 2011.-С. 131-134.

3. Истомина, М.А. Эффективность метода контрастной иммунофлюоресценции при индикации антигена вируса бешенства в отпечатках роговицы глаза / М.А. Истомина, ВД. Клюкина // Ветеринарна

медицина. М1жвщомчий тематичний науковий зб1рник. - 2011. - Випуск 95. - С. 32-33.

4. Истомина, М.А. Совершенствование методов прижизненной диагностики и оценки эффективности вакцинопрофилактики бешенства / М.А. Истомина // Ветеринарный врач. - 2011. - №4. - С. 17-20.

5. Истомина, М.А. Тест-система на основе ёо1-ЕЫ8А для экспресс-диагностики бешенства / М.А. Истомина, В.И. Клюкина, О.В. Анисина // Ветеринарная медицина. - 2011. - № 3. - С. 7-9.

Заказ № 214. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». г.Москва, ул.Палиха 2а.тел.(499)250-92-06 www.postator.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Истомина, Мария Александровна

Список сокращений.

Введение.б

Актуальность темы.

Цель и задачи исследований.

Научная новизна исследований.

Практическая значимость работы.

Основные положения, выносимые на защиту.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Бешенство. Характеристика болезни.

1.2 Эпизоотическая ситуация по бешенству на территории РФ.

1.3 Характеристика возбудителя бешенства.

1.3.1 Морфология и химический состав.

1.3.2 Иммуногенные свойства.

1.4 Профилактика и меры борьбы.

1.4.1 Специфическая профилактика.

1.5 Лабораторная диагностика.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Совершенствование методов диагностики и оценки эффективности вакцинопрофилактики бешенства животных"

Актуальность темы. Бешенство остается одной из важнейших проблем ветеринарии и здравоохранения во многих странах мира. Несмотря на проводимые противоэпизоотические мероприятия в Российской Федерации, ограничить распространение бешенства не удается (C.B. Грибенча, 1993; H.A. Хисматуллина и др., 2000; В.М. Авилов и др., 2002; В.В. Макаров, A.A. Воробьев, 2004; А.Е. Метлин, 2008; В.А. Ведерников, И.В. Балдина, 2010; A.M. Гулюкин, 2011).

Показана возможность индикации антигена вируса бешенства в слюне животных методом иммунохроматографии (B.K. Kang, et al., 2007), в эпителиальных клетках роговицы глаза (корнеальный тест) и биоптатах кожи методом иммунофлюоресценции (H.A. Ковалев, 1965; L.G. Schneider, 1969; H.A. Ковалев, A.C. Шашенько, 1970; J. Zimmerman 1971; J. Bingham, P. Mlambo, 1995; Н.П. Мишаева и др., 2008), а также вирусного генома в слюне и спинномозговой жидкости методом ПЦР (P. Crepin, et al., 1998; Я.С. Цыбанов, 2001).

Введение выявления антигена вируса бешенства в слюне животных, что необходимо для оценки риска заражения человека или животных.

Основной целью данной работы являлось совершенствование методов диагностики и оценки эффективности вакцинопрофилактики бешенства животных.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:

Научная новизна исследований

Показана принципиальная возможность выявления антигена вируса в слюне методами ёо^ЕЫБА и точечного анализа с применением иммунозолотого маркера и в эпителиальных клетках роговицы глаза животных методом контрастной иммунофлюоресценции.

Разработаны тест-системы на основе скЛ-ЕЫЗА и точечного анализа с применением иммунозолотого маркера для индикации антигена вируса бешенства в слюне.

Показано, что применение альбумин-родаминового конъюгата повышает эффективность метода иммунофлюоресценции при выявлении антигена вируса бешенства.

Практическая значимость работы

На основании проведенных исследований разработаны и предложены:

- тест-системы на основе ёо1-ЕЫ8А и точечного анализа с применением иммунозолотого маркера для индикации антигена вируса бешенства в слюне;

Введение

Основные положения, выносимые на защиту

- Индикация антигена вируса бешенства в слюне животных методами с!о1> ЕЫБА и точечного анализа с применением иммунозолотого маркера.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Истомина, Мария Александровна

4 Выводы непрямого ИФА при исследовании проб сыворотки плотоядных относительно реакции нейтрализации составила 75%, специфичность -83,3%, проб сыворотки КРС - 77,8% и 85,7%, соответственно. 6. Показана эффективность непрямого ИФА в качестве скринирующего метода при серомониторинге антирабической вакцинации. Результаты исследований сывороток крови свидетельствуют о достаточном уровне протективного иммунитета у 93,3% КРС, 96,15% домашних плотоядных и 33,3% лисиц.

5 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основании проведенных исследований предлагаются для практики:

- Тест-система на основе dot-ELISA для индикации антигена вируса бешенства в слюне.

- Тест-система на основе точечного анализа с применением иМмунозолотого маркера для индикации антигена вируса бешенства в слюне.

- НТД на «Набор реагентов для количественного определения антител к антигену вируса бешенства в сыворотке крови животных в непрямом варианте иммуноферментного анализа»- утверждена директором ВНИТИБП 5.04.2011.

Заключение

Анализ литературных данных показал, что на сегодняшний день бешенство и его возбудитель изучены достаточно хорошо. Детально описаны морфология и физико-химические свойства вируса, его геном, иммуногенные свойства, эпизоотология, патогенез, клинические признаки болезни, разработаны средства специфической профилактики, методы диагностики и оценки эффективности вакцинации. Данные по эпизоотической ситуации в РФ показали, что несмотря на проводимые противоэпизоотические мероприятия, ограничить распространение бешенства- до конца не удается, и оно остается одной из важнейших проблем здравоохранения и ветеринарии.

Своевременная диагностика бешенства обеспечивает эффективность проведения лечебно-профилактических мероприятий, однако рекомендуемые Комитетом экспертов ВОЗ методы предназначены, в основном, для постмортальной диагностики бешенства. При этом некоторыми авторами показана эффективность прижизненного обнаружения вирусных агентов в слюне, эпителиальных клетках роговицы глаза, спинномозговой жидкости, биоптатах кожи животных, но в практику методы интравитальной диагностики бешенства не внедрены.

Основным методом профилактики бешенства является вакцинация восприимчивых животных. Показателем успешной вакцинации считается наличие в сыворотке крови достаточного уровня специфических вирунейтрализующих антител (не менее 0,5 МЕ/мл), одним из методов выявления которых является непрямой вариант ИФА с использованием в качестве антигена гликопротеина вируса бешенства. В настоящее время соответствующие тест-системы производятся за рубежом, в РФ коммерческие наборы, предназначенные для оценки эффективности вакцинопрофилактики бешенства, не выпускаются.

Анализ литературных данных определил цель и основные направления наших исследований.

2 Собственные исследования. 2.1 Материалы и методы

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Вирус бешенства. В работе использовали фиксированный вирус бешенства, штамм «Овечий», стандартный штамм «CVS», штамм «Щелково-51». Вирус бешенства инактивировали 0,025% раствором ß-пропиолактона.

Для сорбции на нитроцеллюлозной мембране и приготовления конъюгата с пероксидазой хрена получали антитела к рибонуклеопротеину (РНП) вируса бешенства, штамм «CVS». РНП выделяли из суспензии частично очищенного и концентрированного мозгового вируса, обработанной тритоном Х-100 [151], с последующим центрифугированием в градиенте сахарозы.

Сыворотку к рибонуклеопротеину вируса бешенства получали иммунизацией морских свинок препаратом РНП, активность сыворотки устанавливали в реакциях связывания комплемента по Е. Kuweit (1960) [172] и диффузионной преципитации с использованием «Набора компонентов для диагностики бешенства животных в реакции диффузионной преципитации» (ТУ 9388-006-00497963-99).

IgG из анти-РНП сыворотки и нормальной сыворотки крови морской свинки выделяли методом аффинной хроматографии на коммерческом сорбенте Protein А - Agarose CL-4B («Fluka»), согласно рекомендациям фирмы-изготовителя, и концентрировали методом диализа против 25% раствора декстрана Т-70 («Sigma»).

Конъюгат анти-РНП IgG с пероксидазой хрена Rz>3,0 (ООО «НИЦ Росбио») получали по В. Wilson, P. Nakane (1978) [267]. Молярное соотношение фермент/белок в конъюгате устанавливали методом

2 Собственные исследования. 2.1 Материалы и методы спектрометрии при 403 и 280 нм. Ферментативную активность конъюгата определяли по Д. Кэтти, Ч. Райкундалиа (1991) [39], специфическую i активность - методом прямого ИФА с сорбированным препаратом РНП вируса бешенства в лунках 96-луночного полистиролового планшета («Costar», США).

Dot-ELISA проводили по R. Hawkes, et al. (1982) [150] с использованием нитроцеллюлозной мембраны (Protran ВА 85, 20x20 см, размер пор 0,45 мкм), нарезанной на полоски размером 1x5 см. Для формирования тестируемой полоски сорбировали анти-РНП IgG, контрольной - IgG нормальной, сыворотки морской свинки.

Конъюгат анти-РНП IgG с частицами коллоидного золота получали по G.T. Hermanson (1996) [152], рабочее разведение устанавливали титрованием в точечном иммуноанализе с постоянной дозой вируса.«

2 Собственные исследования. 2.1 Материалы и методы

Точечный анализ проводили по V.S. Dar, et al. (1994) [120] на нитроцеллюлозных полосках с сорбированными анти-РНП IgG и IgG нормальной сыворотки крови, реакцию проявляли с помощью коыъюгата анти-РНП IgG с коллоидным золотом. О наличии антигена вируса бешенства в пробе судили по появлению розовато-красного пятна на тестируемой полоске при отсутствии окраски на контрольной.

Выявление антигена вируса бешенства методом контрастной иммунофлюоресценции. Оптимальные условия приготовления конъюгата альбумина (Albumin from bovine serum, «Fluka») с родамином (Rhodamine В isothiocyanate, «Fluka») определяли путем подбора соотношения флюорохром/белок, времени конъюгирования и температурного режима. Непрореагировавший краситель удаляли методом гель-хроматографии на колонке 1,5x40, заполненной сефадексом G-50 в ЮмМ фосфатном буфере, pH 7,4-7,6. Соотношение родамин/альбумин в конъюгате устанавливали методом спектрометрии при 573 нм и 280 нм.

Рабочее разведение конъюгата альбумина с родамином устанавливали при одновременной его инкубации с глобулином флюоресцирующим (ТУ 9388-03-00497963-97) и отпечатками роговицы глаза клинически здоровых мышей и баранов, а также мазками ткани мозга мышей, павших после заражения вирусом бешенства, штамм «CVS», и баранов, павших после заражения вирусом бешенства, штамм «Овечий», при 37°С в течение 30 минут.

2 Собственные исследования. 2.1 Материалы и методы Набор реагентов для определения уровня специфических антител в сыворотке крови вакцинированных против бешенства животных методом непрямого ИФА. В качестве антигена для непрямого варианта ИФА использовали гликопротеин вируса бешенства, который выделяли из культуральной суспензии вируса, штамм «Щелково-51», по методу В. Dietzschold, et al. (1978) [164].

В качестве референс-антирабической сыворотки использовали отраслевой стандартный образец антирабической сыворотки крупного рогатого скота (КРС), серия NCA-03, с активностью 20 ME/мл (ВНИТИБП), и сыворотку крови собаки, иммунизированной вакциной антирабической инактивированной сухой культуральной из штамма "Щелково-51" (Рабикан). Вируснейтрализующую активность сыворотки собак определяли в реакции нейтрализации (РН) на мышах согласно «Методам лабораторных исследований по бешенству» [45] в сравнении с отраслевым стандартным образцом.

В качестве контроля использовали сыворотку крови от клинически здоровых собак и КРС, отрицательно реагирующую в PH in vivo.

Конъюгат протеина A St. aureus («Sigma») с пероксидазой хрена Rz>3,0 (ООО «НИЦ Росбио») получали по В. Wilson, P. Nakane (1978) [267]. Соотношение фермент/белок в конъюгате устанавливали методом спектрометрии при 403 и 280 нм, ферментативную активность - согласно Д. Кэтти, Ч. Райкундалиа (1991) [39].

Для исследования сыворотки крови КРС использовали «Иммуноглобулины диагностические против IgG (H+L) быка, меченные пероксидазой» (НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалея).

2 Собственные исследования. 2.1 Материалы ъе. метапы

Содержание общего белка определяли О.Н. Lowry, et al. (1951) [210].

2 Собственные исследования. 2.2 Результаты исследований

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Истомина, Мария Александровна, Щелково

1. Аксенова, Т.А. Культивирование вакцинного вируса бешенства в линиях перевивараемых клеток зеленой мартышки / Т.А. Аксенова, Ю.Х. Хапчаев, JI.JL Миронова // Вопросы вирусологии. 1991. - №5. - С. 432438.

2. Анина-Радченко, Н.Д. К вопросу о применении реакции связывания комплемента для диагностики бешенства / Н.Д. Анина-Радченко // Симпозиум по бешенству: тез. докл. ин-та полиомиелита и вирус, энцефалитов АМН СССР. М., 1972. - С. 123-124.

3. Антигенная характеристика полевых штаммов вируса бешенства из различных районов СССР с помощью антинуклеокапсидных моноклональных антител / А.Д. Ботвинкин, М.А. Селимов, Е.В. Клюева и др. // ЖМЭИ. 1990. - № 1. - С. 50-54.

4. Белоусова, Р.В. Ветеринарная вирусология / Р.В. Белоусова, Э.А. Преображенская, И.В. Третьякова. М.: Колос, 2007. - 424 с.

5. Березина, Е.С. Бешенство собак в России во второй половине XX начале XXI века / Е.С. Березина, Г.Н. Сидоров, Е.М. Полещук, Д.Г. Сидорова // Российский ветеринарный журнал. - 2010. - №3. - С. 2-6.

6. Бешенство в Восточной Европе: актуальный вектор развития эпизоотического процесса / В.В. Макаров, О.И. Сухарев, A.M. Гулюкин, Б.В Боев // Вестник РАСХН. 2008. - № 4. - С.58 - 60.

7. Бешенство в России. Оценка риска: информ.-аналит. обзор / Н.С. Бардина, М.А. Титов, А.К. Караулов и др.. Владимир: ФГУ «ВНИИЗЖ», 2008. - 80 с.

8. Бешенство енотовидных собак: статистический анализ заболеваемости / В.В. Макаров, О.И. Сухарев, A.M. Гулюкин, Б.В. Боев // Ветеринария. -2009. №6. - С. 20-24.

9. Бешенство млекопитающих Омской области / Д.Г. Сидорова, Н.М. Колычев, Г.Н. Сидоров, Е.М. Полещук // Терио фауна России и1. Список литературысопредельных территорий. VIII съезд териологического общества. — М., 2007.-С. 453.

10. Ботвинкин, А.Д. Итоги изучения антигенного разнообразия вируса бешенства на территории бывшего СССР / А.Д. Ботвинкин, И.В. Кузьмин, H.A. Хисматуллина // Ветеринарная патология. 2004. - № 3. - С. 117-126.

11. Ботвинкин, А.Д. Природные очаги бешенства в Российской Федерации / А.Д. Ботвинкин, Г.Н. Сидоров // Этиология, эпидемиология и диагностика инфекционных заболеваний в Восточной Сибири. Иркутск, 1992.-С. 182-193.

12. Бучнев, К.Н. Вируснейтрализующая и преципитирующая активность сывороток крови лошадей, привитых рабическими вирус-антигенами / К.Н. Бучнев, И.Л. Квасов, Ш.Ж. Турсункулов // Вестник с/х науки Казахстана. 1985. - № 2.-С.72-75.

13. Бучнев, К.Н. Методы диагностики бешенства. Сравнительная оценка. / К.Н. Бучнев // Докл. сов. ученых. JI., 1971. - С. 3-5.

14. Ведерников, В.А. Краткая характеристика обстановки по бешенству животных, сложившейся в России в сентябре 2010 года / В.А. Ведерников, И'.В. Балдина // Ветеринарная жизнь. 2010. - № 21. - С. 2.

15. Вирусные болезни животных / В.Н. Сюрин, А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьев, Н.В. Фомина. М.: ВНИТИБП, 1998. - 928 с.

16. ГОСТ СССР 26075-84. Животные» сельскохозяйственные. Методы лабораторной диагностики бешенства. — Введ. 9.01.1984. — М.: Государственный комитет СССР по стандартам, 1984. 12 с.

17. Грибенча, C.B. Хроническая рабическая инфекция мышей, зараженных интрацеребрально уличным вирусом / C.B. Грибенча // Вопросы вирусологии. 1977. - №2. - С. 147-151.

18. Груздев, К.Н. Бешенство животных / К.Н. Груздев, В.В. Недосеков. М.: Аквариум, 2001. - 304 с.

19. Гулюкин, А.М. Пути усовершенствования мероприятий по борьбе с бешенством / А.М. Гулюкин // Актуальные вопросы инфектологии.1. Список литературы

20. Матер, юбилейной науч.-практич. конф., посвящ. 85-летию кафедры инфекционных болезней Казанского государственного медицинского университета,- Казань, 2010. С. 66-67.

21. Гулюкин, A.M. Эпизоотологический мониторинг и совершенствование серологического контроля эффективности вакцинопрофилактики бешенства: автореф. дис. . канд. биол. наук / Алексей Михайлович Гулюкин. Казань, 2011. - 21 с.

22. Диагностика и профилактика бешенства животных / A.B. Иванов, H.A. Хисматуллина, Р.Х. Юсупов, А.Н. Чернов. М.: Д 44 ФГНУ "Росинформагротех", 2007. - 60 с.

23. Значение енотовидной собаки в эпидемиологии и эпизоотологии бешенства на Дальнем Востоке / А.Д. Ботвинкин, В.П. Савицкий, Г.Н. Сидоров, В.Г. Юдин // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. -1981. №. 12. - С. 79-81.

24. ИАЦ Россельхознадзора. Эпизоотическая ситуация в РФ (1-е полугодие 2011 года). Режим доступа: http://www.fsvps.ru/fsvps-docs/ru/iac/201 l/files/iac201 lhalf.pdf (проверено 8.11.2011).

25. ИАЦ Россельхознадзора. Эпизоотическая ситуация в РФ (2010 год). -Режим доступа: http ://www.fsvps.ru/fsvps-docs/ru/iac/2011 /files/iac2010 year.pdf. (проверено 8.11.2011).

26. Иванов, B.C. Состояние и перспективы борьбы с бешенством / B.C. Иванов, Е.Э. Школьников // Вестник РАСХН. 2000. - №2. - С. 63-65.

27. Идрисова, Н.Т. Чувствительность некоторых культур клеток к вирусу бешенства / Н.Т. Ирдисова // Бюл. ВИЭВ. 1991. - Вып. 75-76. - С. 119121.

28. Иммуноферментный анализ при индикации вируса бешенства и определении уровня антител / Э.Я. Сазанова, C.B. Кузнецова, Е.В. Маслов и др. // Ветеринария. 1991. - № 8. - С. 62-64.

29. Инфекционные болезни животных / Б.Ф. Бессарабов, A.A. Ватутин, Е.С. Воронин и др.. М.: Колос, 2007. - 671 с.

30. Использование корнеального теста для прижизненной экспресс -диагностики бешенства у человека и животных / Н.П. Мишаева, H.A. Ковалев, С.О. Бельгии, В.В. Щерба. Минск, 2008.

31. Использование полимеразной цепной реакции для выявления полевых изолятов вируса бешенства / М.С. Пантюшенко, М.А. Наумкина, В.В. Недосеков и др. // Современные проблемы рабиологии: тез. докл. науч. конф. М., 1998. - С. 26-27.

32. К вопросу о прогнозировании эпизоотического процесса при бешенстве на территории России / Г.Н. Сидоров, Д.Г. Сидорова, Н.М. Колычев, Е.М. Полещук // Ветеринарная патология. 2007. - № 3. - С. 17-23.

33. Калабеков, М.И. Характеристика эпизоотического процесса бешенства животных / М.И. Калабеков // Ветеринария. 1998. - № 4. - С. 62-64.

34. Ковалев, H.A. Иммунофлуоресцентное исследование отпечатков роговицы при бешенстве / H.A. Ковалев, A.C. Шашенько // Ветеринария. -1970.-№9.-С. 44-46.

35. Ковалев, H.A. О распространении и путях борьбы с бешенством диких животных / H.A. Ковалев, В.А. Седов // Матер. 8-й Всесоюзной конференции по природной очаговости болезней животных и охране их численности. Киров, 1972. - С. 34-35.

36. Ковалев, H.A. Радиоиммунологический метод определения напряженности антирабического иммунитета / H.A. Ковалев // Рекомендации МСХ СССР по внедрению достижений науки и передового опыта в. производстве. М., 1980. - № 1. - С. 73-74.

37. Крупальник, В.П. Бешенство собак в Шри-Ланке и меры борьбы с ним / В.П. Крупальник, С. Нагасинг // Актуальные вопросы инфекционных и1. Список литературыинвазионных болезней животных. Сб. науч. тр. МГАВМиБ. - 1995. - С. 130-131.

38. Кузнецова, C.B. Субъединичная антирабическая вакцина // C.B. Кузнецова, П.П. Кузнецов, B.C. Иванов // Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов-тез. докл. научн. конф. Щелково, 1996. - С. 54.

39. Кэтти, Д. Иммуноферментный анализ / Д. Кэтти, Ч. Райкундалиа // Антитела. Методы. В 2-х кн. Кн. 2: Пер. с англ. М.: Мир, 1991.-384 с.

40. Лакин, Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. М.: Высшая школа, 1990. - 352 с.

41. Лаптева, О.Г. Инфекционная и антигенная активность вируса бешенства, выращенного в суспензии клеток ВНЕС-21 / О.Г. Лаптева, Т.Ф. Горшкова,

42. B.И. Жестерев // Ветеринария. 2003. - №3. - С. 18-19.

43. Макаров, В.В. Актуальные проблемы бешенства: природная очаговость, методология исследования и-контроля в центре России / В.В. Макаров, A.A. Воробьев // Ветеринарная патология. 2004. - № 3. - С. 102-116.

44. Макаров, В.В. Численность лисицы как фактор риска эмеджентности бешенства / В.В; Макаров, С.И. Джупина, В. А. Ведерников // Ветеринарная патология. 2002. - №1. - С. 123-126.

45. Метлин, А.Е. Оральная вакцинация диких плотоядных животных против бешенства / А.Е. Метлин, С.С. Рыбаков, В.В. Михалишин // Ветеринария. -2009.- №8. -С. 18-25.

46. Методы лабораторных исследований по бешенству: пер. с англ., 3 изд. / под ред. М. Kaplan, H. Koprowski. Женева: ВОЗ, 1975. - 358 с.

47. Мицаев, Ш.Ш. Сезонность и цикличность эпизоотий бешенства в Юго-Восточном предкавказье / Ш.Ш! Мицаев // Ветеринария. 2009. - № 8. —1. C. 7-9.

48. Недосеков, В.В. Разработка и совершенствование средств и методов оценки эффективности вакцин против бешенства: автореф. дис. . канд. вет. наук / Виталий Владимирович Недосеков. Покров, 1998. - 24 с.

49. Определение титров антирабических антител у вакцинированных против бешенства людей и животных радиоиммунным методом / В.П. Остапчук, П.А. Ковалев, A.C. Шашенько и др. // Тр. Бел. ПИИЭВ им. П.Вышелесского. М., 1979. - Т. 17. - С. - 74-78.

50. Осидзе, Д.Ф. Репродукция культурального фиксированного вируса бешенства при разных способах культивирования / Д.Ф. Осидзе, Ю.Ф. Борисович // Ветеринария. 1990. - № 11. - С. 57.

51. Основные принципы специфической профилактики бешенства, обеспечивающие эффективность антирабических мероприятий / A.B. Саввин, Ю.В. Пашкина, К.Н. Груздев, В.В. Сочнев // Ветеринарная патология. 2005. - № 4. - С. 102-106.

52. Оценка эффективности вакцинопрофилактики бешенства с помощью иммуноферментной тест-системы / А.М. Гулюкин, H.A. Хисматуллина,

53. A.Н. Чернов и др. // Биотехнология: экология крупных городов: матер. Московской международной научно-практической конференции. — Москва, 2010. С.465-466.

54. Пашкина, Ю.В. Рабическая инфекция: зоны риска и территориальные границы в условиях РФ в целом и в отдельных регионах /Ю.В. Пашкина,

55. B.В. Сочнев // Ветеринарная патология. 2005. - № 4. - С. 68-72.

56. Пилле, Э.Р. Лиссавирусы / Э.Р. Пилле // Вопросы вирусологии. 1996. -№ 1.-С. 2-6.

57. Рахманин, П.В. Иммуноферментная тест-система определения уровня антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак: дис. . канд. биол. наук / Рахманин Петр Владимирович. -Щелково, 2008. 104 с.

58. Селимов, М.А. Бешенство / М.А. Селимов. М.: Медицина, 1978. - 336 с.

59. Селимов, М.А. Применение реакции связывания комплемента (РСК) для индикации вируса бешенства в культуре ткани / М.А. Селимов, Л.И. Калинина, Т.А.Аксенова и др. // Вопросы борьбы с бешенством. — М., 1967. Т. 9. - С.70-79.

60. Селимов, М.А. Современная эпизоотическая ситуация и перспективы элиминации бешенства / М.А. Селимов // Вопросы вирусологии. 1998. -№5.-С. 196-198.

61. Сидоров, Г.Н. Аспекты исторического развития природных очагов бешенства в Европе и Северной Азии / Г.Н. Сидоров. // Ветеринарная патология. 2002. - № 1. - С.21-25.

62. Сидоров, Г.Н. Эпизоотический процесс бешенства: роль диких млекопитающих, периодичность / Г. Н. Сидоров, Д. Г. Сидорова, Н. М. Колычев // Сибирский вестник сельскохозяйственных наук. 2008. - №12. - С.67-73.

63. Система эпизоотологического мониторинга особо опасных, экзотических, малоизученных, в том числе зооантропонозных болезней животных / И.А. Бакулов, A.B. Книзе, В.М. Котляров и др. // Покров, ВНИИВВиМ. -2001.-72 С.1. Список литературы

64. Тенденция распространения бешенства в Восточной Европе / В.В. Макаров, О.И. Сухарев, A.M. Гулюкин и др. // Ветеринария. 2008. -№7.-С. 20-22.

65. Управление Роспотребнадзора по республике Дагестан. Надзор за бешенством. Режим доступа: http//www.dagsen.ru/newsshow.php?nid= 640 (проверено 8.11.2011).

66. Фоменко, М.В. Порядок и оценка результатов лабораторных исследований при диагностике бешенства / М.В. Фоменко, И.К. Тутов // Вестник ветеринарии. 1997. - № 6. - С. 47 - 50.

67. Цыбанов, Я.С. Разработка тест-системы для индикации арктического бешенства на основе методов анализа генома: автореф. дис. . канд. биол. наук / Цыбанов Ярали Содномович Покров, 2001. - 24 с.

68. Черкасский, Б.Л. Эпидемическая ситуация и меры профилактики бешенства / Б.Л. Черкасский, О.С. Хадарцев, A.A. Мовсесянц // Вет. и мед. аспекты зооантропонозов. Покров, 2003. - Ч. 1. - С. 98.

69. Шафаева, P.C. Репродукция вируса бешенства в культуре перевиваемых клеток Vero / P.C. Шафаева, A.B. Фролова // Цитология. 1994. - Т. 36, № 6.-С. 587-588.

70. Эпизоотическая ситуация и меры профилактики бешенства. Режим доступа: http//77.rospotrebnadzor.ru/index.php/press-centr/267-beshenstvo (проверено 8.11.2011).

71. Эпизоотическая ситуация по карантинным и особо опасным болезням животных в Российской федерации за 2009 год / И.К. Рождественский, О.Б. Литвинов, А.Н. Мачнев и др. // ЦЕНОВИК. 2010. - № 5. - С. 6-7.

72. A CD46-binding chimpanzee adenovirus vector as a vaccine carrier / N. Tatsis, A. Blejer, M.O. Lasaro, et al. // Mol. Iber. 2007. - Vol. 15, № 3. - P. 608617.

73. A comparison of two serological methods for detecting the immune response after rabies vaccination in dogs and cats being exported to rabies-free areas /1. Список литературы

74. D.J. Briggs, J.S. Smith, F.L. Mueller, et al. // Biologicals. 1998. - Vol. 26, №4. -P. 347-355.

75. A history estimate and evolutionary analysis of rabies virus variants in China / P. Ming, J. Yan, S. Rayner, et al. // J. Gen. Virol. 2010. - Vol. 91, № 3. - P. 759 - 764.

76. A new quantitative method for rabies virus by detection of nucleoprotein in virion using ELISA / S. Katayama, M. Yamanaka, S. Ota, Y. Shimizu // J. Vet. Med. Sci. 1999. - Vol. 61, № 4. - P. 411-416.

77. A novel double-antigen sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for measurement of antibodies against rabies virus / L.M. Yang, L.Z. Zhao, R.L. Hu, et al. // Clin. Vaccine Immunol. 2006. - Vol. 13, № 8. - P. 966-968.

78. A quantitative indirect ELISA to monitor the effectiveness of rabies vaccination in domestic and wild carnivores / A. Servat, M. Feyssaguet, J.L. Morize, et al. // J. Immunol. Methods. 2007. - Vol. 318, № 1-2. - P. 1-10.

79. A rapid RT-PCR method to differentiate six established genotypes of rabies and rabies-related viruses using TaqMan technology / E.M. Black, J.P. Lowings, J. Smith, et al. // J. Virol. Meth. 2002. -Vol. 105, № 1. - P. 25-35.

80. A recombinant human adenovirus vaccine against rabies / C.L. Preve, J.B. Campbell, B.S. Christie, et al. // J. Infect. Dis. 1990. - Vol. 161, Ж 1. - P. 27-30.

81. A single amino acid change in rabies virus glycoprotein increases virus spread and enhances virus pathogenicity / M. Faber, M.L. Faber, A. Papaneri, et al. // J. Virol. 2005. - Vol. 79, № 22. - P. 14141-14148.

82. Adult dogs receiving a rabies booster dose with a recombinant adenovirus expressing rabies virus glycoprotein develop high titers of neutralizing antibodies / T. Tims, D J. Briggs, R.D. Davis, et al. // Vaccine. 2000^ - Vol. 18, №25. -P. 2804-2807.

83. An evaluation of immunofluorescence and PCR methods for detection of rabies in archival carnoy-fixed, paraffin-embedded brain tissue / K. Kulonen, M. Fekadu, S. Whitfield, C.K. Warner // J. Vet. Med. 1999. - Vol. 46, № 3. - P. 151-155.

84. An update on safety studies of SAD В19 rabies virus vaccine in target and nontarget species / A. Vos, A. Neubert, O. Aylan, et al. // Epidemiol. Infect. — 1999.-Vol. 123, №1.- P. 165-175.

85. Andral, L. Etudes experimentales sur la rage en Ethiopie / L. Andral, C. Serie // Ann. Inst. Past. 1957. - Vol. 93, № 4. - P. 475-478.

86. Ante mortem diagnosis of human rabies using saliva samples: Comparison of real time and conventional RT-PCR techniques / T. Nagaraj, J.P. Vasanth, A. Desai, et al. //J. Clin. Virol. 2006. - Vol. 36, № 1. -P. 17-23.

87. Antigenecity of rabies glycoprotein / A. Benmansour, H. Leblois, P. Coulon, et al. // J. Virol. 1991. - Vol. 65, № 8.-P. 4198-4203.

88. Application d'une méthode immunoenzymatique au titrage des anticorps rabiques neutralisants en culture cellulaire / P. Perrin, M. Lafon, P. Versmisse, P. Sureau // J. Biol. Stand. 1985. - Vol. 13, № 1. - P. 35-42.

89. Arai, Y.T. Epidemiology of rabies virus and other lyssaviruses / Y. T. Arai // Nippon Rinsho. 2005. - Vol. 63, № 12. - P. 2167-2172.

90. Arginine or lysine in position 333 of ERA and CVS glycoprotein is necessary for rabies virulence in adult mice / C. Tuffereau, H. Leblois, J. Benejean, et al. // Virology. 1989. - Vol. 172, № 1. - P. 206-212.

91. Atanasiu, P. Epreuve immunoenzymatique pour la détection rapide des anticorps anti rabiques / P. Atanasiu, V. Savy, P. Perrin // Ann. Microbiol. -1977. Vol. 128, № 4. - P. 489-498.

92. Atanasiu, P. Use of an enzyme immunoassay with protein A for rabies antigen and antibody determination / P. Atanasiu, P. Perrin, J.F. Delagneau // Develop. Biol. Stand. 1980. - Vol. 46. - P. 207-215.

93. Aubert, M.F.A. Practical significance of rabies antibodies in cats and dogs / M.F.A. Aubert // Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epis. 1992. - Vol. 11, № 3. - P. 735-760.

94. Avirulent mutants of rabies virus and their use as live vaccine / A. Flamand, P. Coulon, F. Lafay, C. Tuffereau // Trends. Microbiol. 1993. - Vol. 1, № 8.- P. 317-320.

95. Bankovskiy, D. Immunogenicity of the ERA G 333 rabies virus strain in foxes and raccoon dogs / D. Bankovskiy, G. Safonov, Y. Kurilchuk // Dev. Biol. -2008.-Vol. 131.-P. 461-466.

96. Barnard, B.J.H. A simple technique for the rapid diagnosis of rabies in formalin-preserved brain / В J.H. Barnard, S.F. Voges // Ondersterpoort J. Vet. Res. 1982. - Vol. 49, № 4. - P. 193-194.1. Список литеуатууы

97. Bat lyssaviruses (Aravan and Khujand) from Central Asia: phylogenetic relationships according to N, P and G gene sequences / I.V. Kuzmin, L.A. Orciari, Y.T. Arai, et al. // Virus Res. 2003. - Vol. 97, № 2. - P. 65-79.

98. Bhandari, S. Epidemiology and control of Rabies in Nepal / Shrawan Bhandari. 2005. - Режим доступа: http://homepage.usask.ca/~shb292/rabies innepal.pdf (проверено 8.11.2011)

99. Bingham, J. Ante-mortem, diagnosis of human rabies by the skin biopsy technique: three case reports from Zimbabwe / J. Bingham, P. Mlambo // Cent. Afr. J. Med. 1995 - Vol. 41, № 8. - P. 258-260.

100. Bingham, J. Canine rabies ecology in southern Africa / J. Bingham // Emerg. Infect. Dis. 2005. - Vol. 11, №9. - P. 1337-1342.

101. Biological and immunogenic properties of rabies virus glycoprotein expressed by canine herpesvirus vector / X. Xuan, K. Tuchiya, I. Sato, et al. // Vaccine. 1998. - Vol. 16, № 9. - P. 969-976.

102. Biological characterization of human monoclonal antibodies to rabies virus / B. Dietzschold, M. Gore, P. Casali, et al. // J. Virol. 1990. -Vol. 64, № 6. -P. 3087-3090.

103. Buckley, S.M. Arbovirus infection of vertebrate and insect cell cultures, with special emphasis on Mokola, Obodhiang, and kotonkan viruses of the rabies serogroup / S.M. Buckley // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1975. - Vol. 266. - P. 241-250.

104. Bussereau, F. Reproducible plaquing system for rabies virus in CER cells / F. Bussereau, A. Flamand, D. Pese-Part / J. Virol. Meth. 1982. - Vol. 4, № 4-5.-P. 277-282.

105. Centers for disease control and prevention. Rabies. Режим доступа: http://www.cdc.gov/rabies/transmission/virus.html (проверено 8.11.2011).

106. Characterisation of a novel lyssavirus isolated from Pteroid bats in Australia / A.R. Gould, A.D. Hyatt, R. Lunt, et al. // Virus research. 1998. - Vol. 54, №2.-P. 165-187.1. Список литературы

107. Characterisation of rabies virus nucleocapsids and recombinant nucleocapsid-like structures / F. Iseni, A. Barge, F. Baudin, et al. // J. Gen. Virol. 1998. - Vol. 79, № 12. - P. 2909-2919.

108. Characterization of an antigenic determinant of the glycoprotein that correlates with pathogenicity of rabies virus / B. Dietzschold, W.H. Wunner, TJ. Wiktor, et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983. - Vol. 80, № 1. - P. 70-74.

109. Chronic recrudescent rabies in a cat / D.P. Perl, J.F. Bell, G.F. Moore, et. al. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1977. - Vol. 155, № 4. - P. 540-548.

110. Cliquet, F. Development of a fluorescent antibody virus neutralisation test (FAVN test) for the quantitation of rabies-neutralising antibody / F. Cliquet, M. Aubert, L. Sagne // J. Immunol. Methods. 1998. - Vol. 212, № 1. - P. 79-87.

111. Commercial antirabies vaccine used as antigen in a modified enzyme-linked immunosorbent assay / L. Szkudlarek, W. Gut, M. Jankowski, D. Serokowa // Acta Virol. 1982. - Vol. 26, № 1 -2. - P. 98-101.

112. Coons, A.H. Localization of antigen in tissue cells. II. Improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody / A.H. Coons, M.H. Kaplan // J. Exp. Med. 1950. - Vol. 91, № 1. - p. 1-13.

113. Coslett, D.G. The structural proteins of rabies virus and evidence for their synthesis from separate monocitocistronic RNA species / D.G. Coslett, В.Р. Hollow, J.K. Obijeski // J. Gen. Virol. 1980. - Vol. 49, № 1. - P. 161-180.

114. Cowley, R. Isolation of European bat lyssavirus in the U.K. / R. Cowley, P.R. Heaton // International European Meeting: Abstracts. Paris, 1997. - P. 403.

115. Cytopathic effect induced by rabies virus in McCoy cells / C.A. Consales, R.Z. Mendonca, N.M. Gallina, C.A. Pereira // J. Virol. Methods. 1990. - Vol. 27, №3.-P. 277-285.

116. Dar, V.S. Rapid detection of rotavirus by using colloidal gold particles labeled with monoclonal antibody / V.S. Dar, S. Ghosh, S. Broor // J. Virol. Methods. 1994. - Vol. 47, № 1-2. - P. 51-58.1. Список литературы

117. Detection of rabies virus antigen in dog saliva using a latex agglutination test / S. Kasempimolporn, W. Saengseesom, B. Lumlertdacha, V. Sitprija // J. Clin. Microbiol. 2000. - Vol. 38, № 8. - P. 3098-3099.

118. Determination of efficacy of rabies vaccine in the Saratov region / A.V. Borisov, A.V. Savvin, V.V. Mikhalishin, et al. // Dev. Biol. 2006. - Vol. 125.-P. 217-220.

119. Development of a qualitative indirect ELIS A for the measurement of rabies virus-specific antibodies from vaccinated dogs and cats / F. Cliquet, L.M. McElhinney, A. Servat, et al. // J. Virol. Methods. 2004. - Vol. 117, № 1. -P. 1-8.

120. Development of a real-time, TaqMan reverse transcription-PCR assay for detection and differentiation of Lyssavirus genotypes 1, 5, and 6 / P.R. Wakeley, N. Johnson, L.M. McElhinney, et al. // J. Clin. Microbiol. 2005. -Vol. 43, № 6. - P. 2786-2792.

121. DNA vaccination of mice against rabies virus: effects of the route of vaccination and the adjuvant monophosphoryl lipid A (MPL) / D.L. Lodmell, N.B. Ray, J.T. Ulrich, L.C. Ewalt // Vaccine 2000. Vol. 18, № 11-12. - P. 1059-1066.

122. Efficacy of rabies biologies against new lyssaviruses from Eurasia / C.A. Hanlon, I.V. Kuzmin, J.D. Blanton, et al. // Virus Res. 2005. - Vol. 111, № l.p. 44-54.

123. Elimination of rabies in the Czech Republic / O. Matouch, J Vitasek, Z. Semerad, M. Malena//Dev. Biol. 2006.-Vol. 125.-P. 141-143.

124. ELISA tests for rabies antibody titration in orally vaccinated foxes sampled in the fields / F. Cliquet, L. Sagne, J.L. Schereffer, M.F.A. Aubert // Vaccine. -2000. Vol. 18, № 28. - P. 3272-3279.1. Список литературы

125. Elton, С. Epidemics among sledge dogs in Canadian Arctic and their relation to disease in the arctic fox / C. Elton // Canad. J. Res. 1931. - Vol. 5, № 6. -P. 673-692.

126. Encephalitis caused by a lyssavirus in fruit bats in Australia / G.C. Fraser, P.T. Hooper, A.R. Lunt, et al. // Emerg. Infect. Dis. 1996. - Vol. 2, № 4. -P. 327-331.

127. Ermine, A. Rapid diagnosis of rabies infection by means of a dot hybridization assay / A. Ermine, N. Tordo, H. Tsiang // Molecular and Cellular Probes. 1988. - Vol. 2, № 1. - P. 75-82.

128. Ertl, C.J. T-helper cell epitope of rabies virus nucleoprotein defined by tri and tetrapeptides / C.J. Ertl, B. Dietzschold, L. Otvos // Euro. J. Immunol. -1991.-Vol. 21, № l.-P. 1-10.

129. Evaluation of a rapid immunodiagnostic test kit for rabies virus / B.K. Kang, J.S. Oh, C.S. Lee, et al. // J. Virol. Meth. 2007. - Vol. 145, № 1. - P. 30-36.

130. Evolutionary history and dynamics of dog rabies virus in western and central Africa / C. Talbi, E.C. Holmes, P. de Benedictis, et al. // J. Gen. Virol. 2009 -Vol. 90, №4.-P. 783 -791.

131. Experimental chronic-rabies in the cat / A.F. Murphy, F.J. Bell, S.D. Bauer, et al. // Lab. Invest. 1980. - Vol. 43, № 3. - P. 231-241.

132. Expression of rabies virus glycoprotein from a recombinant vaccinia virus / M.P. Kieny, R. Lathe, R.-Drillien, et al. //Nature. 1984. - Vol. 312, № 5990. -P. 163-166.

133. Expression of the rabies virus glycoprotein in transgenic tomatoes / P.B. McGarvey, J. Hammond, M.M. Dienelt, et al. // Biotechnology. 1995. -Vol. 13, № 13.-P. 1484-1487.1. Список литературы

134. Fekadu, М. Atypical rabies in dogs in Ethiopia. / M. Fekadu // Ethiop. Med. J. 1972. - Vol. 10, № 3. - P. 79-86.

135. First field trial of fox vaccination against rabies with a vaccinia-rabies recombinant virus / P.P. Pastoret, B. Brochier, B. Languet, et al. // Vet. Rec. -1988. Vol. 123, № 19. - P. 481^183.

136. Flamand, A. Use of hybridoma monoclonal antibodies in the detection of antigenic differences between rabies and rabies-related virus proteins / A. Flamand, T.J. Wiktor, H. Koprowski // J. Gen. Virol. 1980. - Vol. 48, № 1. -P. 97-109.

137. Frens, G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in minodisperse gold suspension / G. Frens // Nat. Phys. Sci. 1973.- Vol. 241, № 105.-P. 20-21.

138. Genovese, M.A. Comparaison de deux techniques utilisees pour le diagnostic de la rage: Pimmunofluorescence et rimmunoperoxydase / M.A. Genovese, L. Andral // Rec. Med. Vet. 1978. - Vol. 154, № 7-8. - P. 667671.

139. Goldwasser, R.A. Fluorescent antibody staining of street and fixed rabies virus antigens / R.A. Goldwasser, R.E. Kissling // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. -1958. Vol. 98, Jfe 2. - P. 219-223.

140. Grassi, M. Enzyme-linked immunosorbent assay for determination of antibodies to the envelope glycoprotein of rabies virus / M. Grassi, A.I. Wandeler, E. Peterhans // J. Clin. Microbiol. 1989. - Vol. 27, № 3. - P. 899902.

141. Hanham, C.A. Evidence from the anti-idiotypic network that the acetylcholine receptor is a rabies virus receptor / C. A. Hanham, F. Zhao, G.H. Tignor//J. Virol. 1993. - Vol. 67, № 1. - P. 530-542.

142. Hawkes, R.A. dot-immunobinding assay for monoclonal and other antibodies / R. Hawkes, E. Niday, J. Gordon // Analyt. Biochem. 1982. -Vol. 119, № l.-P. 142-147.

143. Helenius, A. Stepwise dissociation of the Semliki forest virus membrane with Triton X-100 / A. Helenius, H. Soderlund // Biochim. Biophys. Acta. -1973. Vol. 307, № 2. - P. 287-300.

144. Hermanson, G.T. Preparation of colloidal-gold-labelled proteins. / G.T. Hermanson // Bio-conjugate Techniques. NY: Academic Press, 1996. - P. 593-604.

145. Hildegund, C.J. Novel vaccines to human rabies / С J. Hildegund // PLoS Negl. Trop. Dis. 2009. - Vol. 3, № 9. - P. 1-9.

146. Host immunity to repeated rabies virus infection in big brown bats / A.S. Turmelle, F.R. Jackson, D. Green, et. al. // J. Gen. Virol. 2010. - Vol. 91, № 9.-P. 2360-2366.

147. Immunization of dogs and cats with a DNA vaccine against rabies virus / J.E. Osorio, C.C. Tomlinson, R.S. Frank, et al. // Vaccine. 1999. - Vol. 17, №9-10.-P. 1109-1116.

148. Immunization of monkeys with rabies ribonucleoprotein (RNP) confers protective itmnunity against rabies / M. Tollis, B. Dietzschold, C. Buona Volia, H.Koprowski//Vaccine.- 1991.-Vol. 9,№2.-P. 134-136.

149. Immunogenic and antigenic properties of recombinant soluble glycoprotein of rabies virus / P.K. Gupta, S. Sharma, S.S. Walunj, et al. // Vet. Microbiol. -2005.-Vol. 108, №3-4.-P. 207-214.1. Список литературы

150. Immunogenic and protective properties of rabies virus glycoprotein expressed by baculovirus vectors / C. Prehaud, K. Takehara, A. Flamand, D.H. Bishop // Virology. 1989. - Vol. 173, № 2. - P. 390-399.

151. Immunohistochemical test for rabies: identification of a diagnostically superior monoclonal antibody / A.N. Hamir, G. Moser, Z.F. Fu, et. al. // Vet. Ree. 1995. - Vol. 136, № 12. - P. 295-296.

152. Induction of protective immunity against rabies by immunization with rabies virus ribonucleoprotein / B. Dietzschold, H.H. Wang, C.E. Rupprecht, et. al. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA.- 1987. Vol. 84, № 24. - P. 9165-9169.

153. Intravitam diagnosis of human rabies by PCR using saliva and cerebrospinal fluid / P. Crepin, L. Audry, Y. Rotivel, et al. // J. Clin. Microbiol. 1998. -Vol. 36, №4.-P. 1117-1121.

154. Is the acetylcholine receptor a rabies virus receptor? / T.L. Lentz, T.G. Burrage, A.L. Smith, et al. // Science. 1982. - Vol. 215, № 4529. - P. 182184.

155. Isolamento de virus rabico de morcego insetivoro, Lasyurus borealis / L. F. A.Martorelli, E.A.C. Aquiar, M.F. Almeida, et al. // Rev. saude publ. 1996. -Vol. 30, № l.-P. 101-102.

156. Isolation and purification of a polymeric form of the glycoprotein of rabies virus / B. Dietzschold, J.H. Cox, L.G. Schneider, et al. // J. Gen. Virol. -1978.-Vol. 40, № l.-P. 131-139.

157. Jackson, A.C. Detection of rabies virus RNA in the central nervous system of experimentally infected mice using in situ hybridization with RNA probes / A.C. Jackson, D.L. Reimer, W.H. Wunner // J. Virol. Methods. 1989. - Vol. 25,№ l.-P. 1-11.

158. Kaplan, M.M. A field demonstration of rabies control using chicken-embryo vaccine in dogs / M.M. Kaplan, Y. Goor, E.S. Tierkel // Bull. World Health Organ. 1954. - Vol. 10, № 5. - P. 743-752.

159. Kaplan, M.M. Laboratory techniques in rabies. WHO / M.M. Kaplan, H. Koprowski 3rd ed. - Geneva, 1975. - 365 p.1. Список литературы

160. Kissling, R.E. Growth of rabies virus in non-nervous tissue culture / R.E. Kissling // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1958. - Vol. 98, № 2. - P. 223-225.

161. Komarov, A. Studies on the pathogenicity of an avianized street rabies virus / A. Komarov, K. Homstein // Cornell. Vet. 1953. - Vol. 43, № 3. - P. 344361.

162. Koprowski, H. Studies on chick-embryo adapted rabies virus. / H. Koprowski, H.R. Cox // J. Immunol. 1948. - Vol. 60, № 4. - P. 533-554.

163. Koprowski, H. The mouse inoculation test / H. Koprowski // Laboratory techniques in rabies. 4th ed. - Geneva: WHO, 1996. - P. 80-87.

164. Kuwert, E. The complement fixation test / E. Kuwert // Laboratory Techniques in Rabies. WHO. 3rd ed. - Geneva, 1973. - P. 124-134.

165. Lafon, M. Antiviral activity of monoclonal antibodies specific for the internal proteins N and NS of rabies virus. / M. Lafon, M. Lafage // J. Gen. Virol. 1987. - Vol. 68, № 12. - P. 3113-3123.

166. Leist, C.H. Potential and problems of animal cells in suspension culture / C.H. Leist, H.P. Meyer, A. J. Fiechter // Biotechnol. 1990. - Vol. 15, № 1-2. - P. 1-46.

167. Lodmell, D.L. Gene gun particle-mediated vaccination with plasmid DNA confers protective immunity against rabies virus infection / D.L. Lodmell, N.B. Ray, L.C. Ewalt // Vaccine. 1998. - Vol. 16, № 2-3. - P. 115-118.

168. Lodmell, D.L. Rabies virus antinucleoprotein antibody protects against rabies virus challenge in vivo and inhibits rabies vims replication in vitro / D.L Lodmell, J.J. Esposito, L.C. Ewalt // J. Virol. 1993. - Vol. 67, № 10. - P. 6080-6086.

169. Low-affinity nerve-growth factor receptor (P75NTR) can serve as a receptor for rabies virus / C. Tuffereau, J. Benejean, D. Blondel, et al. // EMBO J. -1998. Vol. 17, № 24. - P. 7250-7259.

170. Macfarlan, R.I. Mol. Stimulation of cytotoxic T-lymphocyte responses by rabies virus glycoprotein and identification of an immunodominant domain /1. Список литературы

171. R.I. Macfarlan, В. Dietzschold, H. Koprowski // Mol. Immunol. 1986. - Vol. 23, №7.-P. 733-41.

172. Madhusudana, S.N. Development and evaluation of a latex agglutination test for rabies antibodies / S.N. Madhusudana, S. Saraswati // J. Clin. Virol. 2003. -Vol. 27, №2.-P. 129-35.

173. McElhinney, L.M. Diagnostic tools for the detection of rabies virus L.M. McElhinney, A.R. Fooks, A.D. Radford // EJCAP - 2008. - Vol. 18, № 3. - P. 224-231.

174. Mebatsion, T. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using staphylococcal protein for the measurement of rabies in various species / T. Mebatsion, J.W. Frost, H. Krauss // J. Vet. Med. Ser. B. 1989. - Vol. 36, № 7. -P. 532-536.

175. Meslin, F.X. Laboratory Techniques in Rabies / F.X. Meslin, M.M. Kaplan, H. Koprowski // Laboratory techniques in rabies. WHO. 4-th ed. - Geneva, 1996.-P. 9-27.

176. Metlin, A. Genetic characteristics of field and attenuated rabies viruses and molecular epidemiology of rabies in Finland and Russia: academic dissertation / Artem Metlin. Helsinki, 2008. - 81 p.

177. Mokola virus infection: description of recent south African cases and a review of the virus epidemiology / B.F. Von Teichman, W.C. De Koker, S.J. Bosch, et al. // J. S. Afr. Vet. Assoc. 1998. - Vol. 69, № 4. - P. 169-171.1. Список литературы

178. Molecular methods to distinguish between classical rabies and the rabies-related European bat lyssaviruses / E.M. Black, L.M. McElhinney, J.P. Lowings, et al. // J. Virol. Meth. 2000. -Vol. 87, № 1-2. - P. 123-131.

179. Nadin-Davis, S.A. A molecular epidemiological analysis of the incursion of the raccoom strain of rabies-virus into Canada / S.A. Nadin-Davis, F. Muldoon, A.E. Wandeler // Epidemiol. Infect. 2006 - Vol. 134, № 3. - P. 534-547.

180. Nadin-Davis, S.A. Identification of regional variants of the Canadian province of Ontario / S.A. Nadin-Davis, G.A. Casey, A. Wandeler // J. Gen. Virol. 1993. - Vol. 74, № 5. - P. 829-837.

181. Nandi, S. Global perspective of rabies and rabies related viruses: a comprehensive review / S. Nandi, M. Kumar // Asian J. Anim. Vet. Adv. -2011.-Vol. 6.-P. 101-116.

182. New lyssavirus genotype from the lesser mouse-eared bat (Myotis blythi), Kyrghyzstan / Y.T. Arai, I.V. Kuzmin, Y. Kameoka, A.D. Botvinkin // Emerg. Infect. Dis. 2003. - Vol. 9, № 3. - P. 333-337.

183. Newcastle disease virus-vectored rabies vaccine is safe, highly immunogenic, and provides long-lasting protection in dogs and cats / J. Ge, X. Wang, L. Tao, et al. // J. Virol. 2011. - Vol. 85, № 16. - P. 8241 - 8252.1. Список литературы

184. Nicholson, K.G. Enzyme-linked immunosorbent assay: a rapid reproducible test for the measurement of rabies antibody / K.G. Nicholson, H. Prestage // J. Med. Virol. 1982. - Vol. 9, № 1. - P. 43-^5.

185. Nogueira, Y.L. Morphometric analysis of McCoy cells inoculated with cerebrospinal fluid from patients with rabies / Y.L. Nogueira // Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 1998. - Vol. 93, № 4. - P. 509-514.

186. One-time intradermal DNA vaccination in ear pinnae one year prior to infection protects dogs against rabies virus I D.L. Lodmell, L.C. Ewalt, M.J. Parnell, et al. // Vaccine. 2006. - Vol. 24, № 4. - P. 412-416

187. Pastoret, P.P. Epidemiology and control of fox rabies in Europe / P.P. Pastoret, B. Brochier// Vaccine. 1999. - Vol. 17, № 13. - P. 1750-1754.

188. Pawan, J.L. The transmission of paralytic rabies in Trinidad by the vampire bat / J.L. Pawan // Ann. Trop. Med. Parasitol. 1936. - Vol. 30, № 1. - P. 101128.

189. Perrin, P. A rabies agglutination test (RAT) for rabies antibody detection / P. Perrin, P. Versmisse, P. Sureau // J. Biol. Stand. 1988. - Vol. 16, № 4. - P. 281-284.

190. Perrin, P. A rapid rabies enzyme immune-diagnosis (RREID) useful and simple technique for the routine diagnosis of rabies / P. Perrin, P.E. Rollin, P. Sureau // J. Biol. Stand. 1986. - Vol. 14, № 3. - P. 217-222.

191. Perrin, P. DNA-based immunization against Lyssaviruses / P. Perrin, Y. Jacob, N. Tordo // Intervirology. 2000. - Vol. 43, № 4-6. - P. 302-311.1. Список литературы

192. Phosphorylation of rabies virus nucleoprotein regulates viral by transcription and replication by modulating leader RNA encapsidation / J. Yang, H. Koprowski, B. Dietzschold, et al. // J. Virol. 1999. - Vol. 73, № 2. - P. 1661-1664.

193. Procedures for reproducible detection of rabies virus antigen mRNA and genome in situ in formalin-fixed tissues / C.K. Warner, S.G. Whitfield, M. Fekadu, H. Ho // J. Virol. Methods 1997. - Vol. 67, № 1. - P. 5-12.

194. Protection of mice with vaccinia virus recombinants that express the rabies nucleoprotein / J.W. Sumner, M. Fekadu, J.H. Shaddock, et. al. // Virology. -1991. Vol. 183, № 2. - P. 703-710.

195. Protective efficacy in mice of post-exposure vaccination with vaccinia virus recombinant expressing either rabies virus glycoprotein or nucleoprotein / H. Fujii, Y. Takita-Sonoda, K. Mifune, et. al. // J. Gen. Virol. 1994. - Vol. 75, №6.-P. 1339-1344.

196. Protein measurement with the Folin phenol reagent / O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr, RJ. Randall // J. Biol. Chem. 1951. - Vol. 193, № 1. -P. 265-275.

197. Rabies human diploid cell vaccine elicits cross-neutralising and cross-protecting immune responses against European and Australian bat lyssaviruses / S.M. Brookes, G. Parsons, N. Johnson, et al. // Vaccine. 2005. - Vol. 23, №32. -P. 4101-4109.

198. Rabies specific production of interleukin-2 by peripheral blood lymphocytes from human rabies vaccine / P. Perrin, M.L. Joffret, C. Zenetti, et al. // Vaccine. 1991. - Vol. 9, № 8. - P. 549-558.

199. Rabies virulence: effect of pathogenicity and sequence characterization of rabies virus mutants affecting antigenic site III of the glycoprotein / I.P. Seif, P. Coulon, P.E. Rollin, A. Flamand // J. Virol. 1985. - Vol. 53, № 3. - P. 926934.

200. Rabies virus nucleoprotein expressed in and purified from insect cells is efficacious as a vaccine / Z.F. Fu, B. Dietzschold, C.L. Schumacher, et. al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1991. Vol. 88, № 5. - P. 2001-2005.

201. Raccoon poxvirus live recombinant feline panleukopenia virus VP2 and rabies virus glycoprotein bivalent vaccine / L. Ни, C. Ngichabe, C.V. Trimarchi, et al. II Vaccine. 1997. - Vol. 15, № 12-13. - P. 1466-1472.

202. Recognition of rabies and rabies-related viruses by T cells derived from human vaccine recipients / E. Celis , D. Ou ,B. Dietzschold ,HJ. Koprowski // J. Virol. 1988. - Vol. 62, № 9. - P. 3128-3134.

203. Rudd, R.G. Comparison of sensitivity of BHK-21 and murine neuroblastoma cells in the isolation of a street strain rabies vims / R.J. Rudd, C.V. Trimarchi // J. Clin. Microbiol. 1987. - Vol. 25, № 8. - 145-168.

204. Rudd, RJ. Tissue culture technique for routine isolation of street strain rabies vims / R.J. Rudd, C.V. Trimarchi, M.K. Abelseth // J. Clin. Microbiol. -1980. Vol. 12, № 4. - P. 590-593.

205. Rupprecht, C.E. Rabies re-examined / C.E. Rupprecht, C.A. Hanlon, T. Hemachudha // The Lancet Infectious Diseases. — 2002. — Vol. 2, №6. P. 327343.1. Список литературы

206. Sacramento, D. PCR technigue as an alternative method for diagnosis and molecular epidemiology of rabies virus / D. Sacramento, H. Bourhy, N.Tordo // Molecular and cellular probes. 1991. - Vol. 5, №3. - P. 229-240.

207. Sagara, J. Identification of heat shock protein in the rabies virion / J. Sagara, A. Kawai // Virology. 1992. - Vol. 190, №2. - P. 845-848.

208. Schneider, L.G. The cornea test: a new method for the intra-vital diagnosis of rabies / L.G. Schneider // Zentrabl. Veterinaer. Med. 1969. - Vol. 16, № 1. -P. 24-31.

209. Schoop, U. Praomys (mastomys) natalensis: an African mouse capable of sustaining persistent asymptomatic rabies infection / U. Schoop // Ann. Microbiol. 1977. - Vol. 128, № 2. - P. 289-296.

210. Screening of active Lyssavirus infection in wild bat populations by viral RNA detection on oropharyngeal swabs / J.E. Echevarria, A. Avellon, J. Juste, et al. // J. Clin. Microbiol. 2001. - Vol. 39, № 10. - P. 3678-3683.

211. Sensitivity of different cell lines for rabies virus isolation / M. Tollis, C. Buonavoglia, L. di Trani, E. Vignolo // J. Vet. Med. 1988. - Vol. 35, № 7. -P. 504-508.

212. Servat, A. Tools for rabies serology to monitor the effectiveness of rabies vaccination in domestic and wild carnivores / A. Servat, M. Wasniewski, F. Cliquet // Dev. Biol. 2006. - Vol. 125. - P. 91-94.

213. Smith, A. Bat rabies in the United Kingdom / A. Smith, J. Morris, N. Crowcroft // BMJ. 2005. - Vol. 330, № 7490. - P. 491-492.

214. Smith, J. Case report: Rapid ante-mortem diagnosis of a human case of rabies imported into the UK from the Philippines / J. Smith, L. McElhinney, G. Parsons, et al. // J. Med. Virol.-2003.-Vol. 69, № l.-P. 150-155.1. Список литературы

215. Smith, J.S. A rapid reproducible test for determining rabies neutralizing antibody /J.S. Smith, P.A. Yager, G.M. Baer // Bull World Health Organ. -1973.-Vol. 48, №5. -P. 535-541.

216. Smith, J.S. Molecular epidemiology of rabies in United States / J.S. Smith, L.A. Orciari, P.A. Yager // Semin. Virol. 1995. - Vol. 6, № 4. - P. 387-400.

217. Smith, J.S. New aspects of rabies with emphasis on epidemiology, diagnosis and prevention of the disease in United States /J.S. Smith // Clin. Microbiol. Rew. 1996. - Vol. 9, № 2. - P. 166-176.

218. Sokol, P. Structural proteins of rabies virus / P. Sokol, D. Stance, H. Koprowski // J. Virol. 1971. - Vol. 7, № 2. - P. 241-249.

219. Stantic-Pavlinic, M. Public health concerns in bat rabies across Europe / M. Stantic-Pavlinic // Euro Surveill. 2005. - Vol. 10, № 11. - P. 217-220.

220. Studies on the pathogenesis of rabies in insectinous bats. Role of brown adipose tissue / S.E. Sulkin, P.H. Krutsch, R. Allen, C. Wallis // J. Exp. Med. -1959. Vol. 110, № 3. - P. 369-388.

221. Studies on the structures and antigenic properties of rabies virus glycoprotein analogues produced in yeast cells / S. Sakamoto, T. Ide, S. Tokiyoshi, et al. // Vaccine. 1999. - Vol. 17, № 3. - P. 205-218.

222. Susceptibility of mammalian, avian, fish, and mosquito cell lines to rabies infection / L. Seganti, F. Superti, S. Bianchi, et. al. // Acta. Virol. 1990. -Vol. 34, №2.-P. 155-163.

223. Tepsumethanon, V. Laboratory diagnosis of rabies in Bangkok and the Central Part of Thailand, 2001-2004 / V. Tepsumethanon, V. Sitprija // J. Med. Ass. Thailand Chot. Thangt. 2005. - Vol. 88, № 22. - P. 282-286.

224. Thaenhart, O. Aktueller Stand der epidemioloque, diagnostik und pravention der tollwutt / O. Thaenhart // Prakt. Tierarzt. 1996. - B. 77, № 5. s. 433 -442.

225. The glycoprotein and the matrix protein of rabies virus affect pathogenicity by regulating viral replication and facilitating cell-to-cell spread / R.1. Список литературы

226. Pulmanausahakul, J. Li, M.J. Schnell, В. Dietzschold // J. Virol. 2008. - Vol. 82, №5. - P. 2330-2338.

227. The influence of the type of immunosorbent on rabies antibody EIA; advantages of purified glycoprotein over whole virus / P. Perrin, P. Versmisse, J.F. Delagneau, et al. // J. Biol. Stand. 1986. - Vol. 14, № 2. - P. 95-102.

228. The neural cell adhesion molecule is a receptor for rabies virus / M.I. Thoulouze, M. Lafage, M. Schachner, et al.,// J. Virol. 1998. - Vol. 72, № 9.-P. 7181-7190.

229. The origin and phylogeography of dog rabies virus / H. Bourhy, J.-M. Reynes, E.J. Dunham, et al. // J. Gen. Virol. 2008. - Vol. 89, № 11. - P. 2673 -2681.

230. The rabies-related Yuli virus and identification with panel of the monoclonal antibodies / M.A. Selimov, A.G. Tatarov, A.D. Botvinkin, et al. // Acta virologica. 1989. - Vol. 33, №6. - P. 517-521.

231. The rabies-related Yuli virus and identification with panel of the antinucleocapsid monoclonal antibodies (NC MKAb) / M.A. Selimov, A.G. Tatarov, A.D. Botvinkin, et al. // Rabies Information Exchange. USA, 1987.-P. 5-15.

232. The specificity of rabies virus RNA encapsidation by nucleoprotein / J. Yang, D.C. Hooper, W.H. Wunner, et al. // Virology. 1998. - Vol. 242, № l.-P. 107-117.

233. Toma, B. Fox rabies in France / B. Toma // Euro Surveill. 2005. - Vol. 10, №11.-p. 220-222.

234. Tordo, N. Characteristics and molecular biology of the rabies virus / N. Tordo // Laboratory techniques in rabies. WHO. 4-th ed. - Geneva, 1996. - P. 28-45.

235. Tordo, N. Structure of rabies virus / N. Tordo, O. Poch // Rabies. Boston: Kluwer Academic Publishers, 1988. - P. 25-45.1. Список литературы

236. Tordo, N. The polymerase chain reaction (PCR) for human viral diagnosis / N. Tordo, H. Bourhy, D. Sacramento // PCR technology for Lyssavirus diagnosis. London, 1995. - P. 125-145.

237. Tordo, N. The polymerase chain reaction (PCR) technique for diagnosis, typing and epidemiological studies of rabies / N. Tordo, D. Sacramento, H. Bourhy // Laboratory Techniques in Rabies. Geneva, 1996. - P. 157-170.

238. Tsiang, H. Current concept in rabies / H. Tsiang // Adv. Virus. Res. 1995. -Vol. 2.-P. 2-4.

239. Umoh, J.U. Immunofluorescent staining of rabies virus antigen in formalin fixed tissue after treatment with trypsin / J.U. Umoh, D.C. Blenden // Bull. WHO. 1981. - Vol. 59, № 5. - P. 737-744.

240. Use of a monoclonal antibody for quantitation of rabies vaccine glycoprotein by enzyme immunoassay / M. Lafon, P. Perrin, P. Versmisse, P. Sureau // J. Biol. Stand. 1985. - Vol. 13, № 4. - P. 295-301.

241. Use of anti-glycoprotein monoclonal antibodies to characterize rabies virus in formalin-fixed tissues / C. Warner, M. Fekadu, S. Whitfield, J. Shaddock // J. Virol. Methods. 1999. - Vol. 77, № 1. - P. 69-74.

242. Use of latex agglutination test to determine rabies antibodies in production of rabies antisera in horses / W. Saengseesom, S. Kasempimolporn, S. Akesowan, et al. // Southeast Asian J. Trop. Med. Pub. Health. 2010. - Vol. 41, №6.-P. 1387-1392.

243. Vaughn, J.B. Excretion of street rabies virus in the saliva of dogs / J.B. Vaughn, P. Gerhardt, K.W. Newell // JAMA. 1965. - Vol. 193. - P. 363-368.

244. Velden-de Groot, C.A.M. Microcarrier technology, present status and perspective / C.A.M. Velden-de Groot // Cytotechnology. 1995. - Vol. 18, № 1-2.-P. 51-56.1. Список литературы

245. Wacharapluesadee, S. Nucleic-acid sequence based amplification in the rapid diagnosis of rabies / S. Wacharapluesadee, T. Hemachudha // Lance. -2001. Vol. 358, № 9285. - P. 892-893.

246. Webster, L.T. Early diagnosis of rabies by mouse inoculation. Measurement of humoral immunity to rabies by mouse protection test / L. Webster, J.R. Dawson // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1935. - Vol. 32, № 4. - P. 570-573.

247. Wictor, T.J. Grouth of rabies virus in cell culture / T.J. Wictor, H.F. Clark // The natural history of rabies. Vol. 1. NY: Academic Press, 1975. — P. 155178.

248. Wiktor, T.J. Radioimmunoassay procedure for rabies binding antibodies / TJ. Wiktor, H. Koprowsky, P. Dixen // J. Immunol. - 1972. - Vol. 109, № 3. -P. 464-470.

249. Wiktor, T. Monoclonal antibodies against rabies virus produced by somatic cell hybridization: detection of antigenic variants / T. Wiktor, H. Koprowski // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. - Vol. 75, № 8. - P. 3938-3942.

250. Wilson, M.B. Recent developments in the peroxidase method of conjugating horseradish peroxidase to antibodies / M.B. Wilson, P.K. Nakane // Immunofluorescence and related techniques. Amsterdam: North Holland Publishing Co., 1978. - P. 215-224.

251. World Health Organization Expert Committee on Rabies. Eighth report // World Health Organization Technical Report. Series № 824. - 1992. - 84 p.

252. Zavadova, J. Improving the laboratory diagnosis of rabies and titration of rabies viruses / J. Zavadova, S. Svrcek // Vet. Med. 1994. - Vol. 39, № 11.— P. 663-676.

253. Zimmerman, J. Zur brauchbarkein des cornea tested de Tollwut diagnose / J. Zimmerman // Berl. Munch. Tieraztl. Eachr. 1971. - B. 84, № 9. - S. 172174.

Информация о работе

Истомина, Мария Александровна
кандидата биологических наук
Щелково, 2011
ВАК 03.01.06

Диссертация

Совершенствование методов диагностики и оценки эффективности вакцинопрофилактики бешенства животных - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы