Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Совершенствование метода культуры изолированных тканей для получения регенерантов риса с использованием фузикокцина

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата сельскохозяйственных наук, Аханханзо Корнель, Краснодар

всероссийски! научно-исследовательский институт риса

На правах рукописи

АХАНХАНЗО КОРНЕЛЬ

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДА КУЛЬТУРЫ ИЗОЛИРОВАННЫХ ТКАНЕЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕГЕНЕРАНТОВ РИСА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФУЗИКОКЦЙНА

Специальность Об.01.05 - селекция и семеноводство

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

Научный руководитель -доктор биологических наук Харченко П. Н.

Краснодар, 1999

СТР,

ВВЕДЕНИЕ ____________________________________________ 3

RESUME _______________________________________________ 9

1. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИЗОЛИРОВАННЫХ ОРГАНОВ И ТКАНЕЙ IH VITRO

В СЕЛЕКЦИИ РАСТЕНИИ РИСА _____________________________ 12

1. 1. Значение методов биотехнологии в селекции растений 19

1, 2. Гаплоидный метод в селекционном процессе__________ 33

2. УСЛОВИЯ, МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИИ ______________ 40

2. 1. Условия исследований_____________________________ 40

2. 2. Объект исследований______________________________ 40

2. 3. Происхождение и описание изучаемых' Форм риса______ 44

2. 4. Химические реагенты______________________________ 48

2, 5. Питательные среды, используемые в работе__________53

2. 6. Методика культивирования изолированных органов и

тканей____________________________________________ 54

2. 6. 1. Методика культивирования зачаточных метелок, 54

2, 6. 2. Методика культивирования пыльников__________55

2. Т. Биометрия_________________________________________ 58

2. 8. Терминология_______________________________________ 58

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ И ОБСУЖДЕНИЕ __________________ 61

3.1. Изучение каллусогенеза гибридов F1 из пыльников и

из зачаточных метелок _____________________________ 61

3, 2. Регенерационная способность каллусных тканей из

пыльников и зачаточных метелок гибридов ___________ 62

3. 3. Изучение влияния индукционной питательной среды, содержащей Фузикокцин, на каллусогенез in vitro из

пыльников гибридов риса ___________________________ 65

3.4. Изучение влияния индукционной питательной среды, содержащей Фузикокцин, на каллусогенез in vitro из

зачаточных метелок изучаемых гибридов риса ________ 71

3. 5. Изучение влияния Фузикокдина на регенеракионную

способность каллусных тканей из пыльников гибридов. 74 3. 6. Изучение влияния Фузикокдина на регенерадионную способность каллусных тканей из зачаточных метелок

гибридов Fl _______________________________________78

3, 7, Пересадка регенерантов в почву____________________81

3. 8. Сравнительная характеристика растений, полученных из

каллуса зачаточных метелок и пыльцевого каллуса гибрида К-1424 при различных концентрациях

Фузикокдина_____________I_________________________ 83

4. ХАРАКТЕРИСТИКА ГАПЛОИДОВ РИСА ПО МОРФОЛОГИЧЕСКИЙ И БИОХИМИЧЕСКИМ ПРИЗНАКАМ _______________________________ 87

4. 1. Характристика гаплоидов риса по морфологическим

признакам_________________________________________87

4.г. Определение содержания хлорофилла в листьях гаплоидов риса__________________________________________90

4. 3. Изучение устьичного аппарата гаплоидных и диплоидных

растений риса_____________________________________91

ВЫВОДЫ___________________________________________________94

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ _________________________________ 95

ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА __________________________________ 96

ПРИЛОЖЕНИЕ_______________________________________________115

- 4 -ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы состоит в том, что среди зерновых культур, возделываемых на земном шаре, рис занимает одно из первых мест в продовольственном балансе. Его зерном питается практически половина человечества. При этом большое значение в мировом хозяйстве имеет не только основной продукт рисоводства - рисовая крупа, но также рисовые крахмал, масло, отруби, лузга, солома и другие сопутствующие продукты, используемые в пищевых, кормовых и технических целях (2). Рис возделывают в 108 странах на площади 145 млн. га, средняя урожайность его в последние три года составила 3, 2 т/га. Почти 96'/ производства риса сосредоточено в Азии. Спрос на рис в мире ежегодно возрастает, особенно большой дефицит его в развивающихся странах (И).

По своим биологическим особенностям рис способен Формировать в производственных условиях урожайность более ю т/га, а по теоретическим расчетам он может дать 14-16 т/га.

На основании Физико-геограФического районирования, геологической истории (в т. ч. по отношению к Гондване - центру происхождения рисовых), республика Бенин находится в собственно африканской провинции африканской подобласти Палеоризовой области (2).

В Республике Бенин рис возделывают, в основном, на севере страны по берегам рек. За период независимого развития страны производство риса возросло, однако, урожайность его пока значительно ниже, чем в других больших рисосеющих странах.

Это во многом объясняется низкой агротехникой, слабой селекционной работой и редким применением методов биотехнологии в селекции растений.

В области селекции и растениеводства основные усилия биотехнологов направлены на создание прочной генетической базы растениеводства, коренное изменение на этой основе структуры сортовых ресурсов всего мира, прежде всего зерновых культур. Эта задача должна решаться на основе современных биотехнологических методов в сочетании с традиционными приемами селекции.

Возникшая,на базе цитолого-генетических и Физиологических исследований по регенерации растительных клеток, соматической гибридизации протопластов, культура тканей и клеток дала начало нескольким видам технологии по микроклональному размножению нужных растений с новыми хозяйственно-ценными признаками, в т. ч. за счет гаплоидной и дигаплоидной селекции, по оздоровлению посадочного и посевного материала от вирусов и т. д.

Сомаклональные вариации, усиление мутагенеза с помощью Физических и химических Факторов, использование селективных сред - все эти пути и методы стали сегодня достоянием биотехнологии,- совершенствуются и используются в научных исследованиях и селекционном процессе.

Клеточные технологии, основанные на культивировании in vitro органов, тканей, клеток и изолированных протопластов высших растений, могут облегчить и ускорить традиционный селекционный процесс. К ним относится и экспериментальная гапло-идия (39). Гаплоидные клетки растения позволяют легче обнаружить рецессивные мутации,экспрессию введенного извне генетического материала, а также наиболее удачные комбинации генов при комбинационной селекции (13). Спонтанное или искусственное удвоение числа хромосом превращает гаплоид в Фертильное гомозиготное диплоидное растение. Вовлечение удвоенных гаплоидов в селекционный процесс позволяет создать изогенные линии для по-

лучения гетерозиготных гибридов в течение года, тогда как метод инбридинга требует для этого около 4-6 лет. использование изогенных дигаплоидных линий, полученных при культивировании пыльников in vitro, облегчает селекционеру оценку и отбор искомых комбинаций признаков, позволяет в 2-3 раза ускорить процесс создания сорта для самоопыляющихся растений, в том числе и для риса.

Так как во всех растениях содержатся необходимые для их роста и развития Фитогормоны, такие как гиббереллины, ауксины и цитокинины, то влияние различных биостимуляторов роста на питательную среду для культур in vitro еще на сегодняшний день остается открытым важным вопросом, с целью изучения влияния гормонального состава индукционной среды на каллусогенез и регенерацию проростков, разные исследования проводились, применяя кинетин, 2,4-д, ИУК, НУК в дозах от минимальных до максимальных. Некоторые результаты свидетельствуют о том, что не у всех генотипов индукция и репродукция проходила успешно (7).

Из множества существующих биостимуляторов Фузикокцин аналогичен ГК и крезацину успешно используется в агрономии. В рисоводстве фузикокцин часто применялся в практическом семеноводстве при предпосевной обработке семян, а в тонких селекционных работах, особенно в биотехнологии, не использовался (3, 14,68,116). Поэтому цель нашей работы - совершенствование методов культуры изолированных тканей для получения регенерантов риса с использованием Фузикокцина. В связи с этим в задачи исследований входило:

1) Изучение объектов исследований и понимание биотехнологических процессов в селекции;

2) Выявление способности каждой изучаемой комбинации F1

риса образовывать каллусы из зачаточных метелок и пыльников без применения препарата;

3) Определение интенсивности выхода регенерантов из зачаточных метелок и пыльников изучаемых комбинаций без применения препарата;

4) Установление оптимальных доз Фузикокцина на каллусоге-нез из зачаточных метелок и пыльников 3-х комбинаций F1 риса;

5) Определение влияния Фузикокцина на интенсивность выхода регенерантов из зачаточных метелок и пыльников 3-х комбинаций F1 риса;

6) Разработка необходимых рекомендаций для практического применения методов биотехнологии в селекции.

Научная новизна состоит в том,' что впервые изучалось влияние различных концентраций фузикокцина на тотипотентность клеток зачаточных метелок и пыльников в условиях in vitro 3-х гибридов Fl риса. Получена спонтанная диплоидизация в культуре in vitro пыльников риса при применении препарата Фузикокцин.

Практическая значимость заключается в продолжении работы по культуре тканей и исследований, проведенных в течение нескольких лет для получения линий с ценными качествами, которые передаются в коллекцию ВНИИриса, учитывая применение нового стимулятора роста - Фузикокцина.

Апробация работы - результаты исследований докладывались на краевых конференциях молодых ученых и специалистов г.Краснодара, организованных комитетом по науке, образованию и делам молодежи мэрии г.Краснодара (1998г. ), и на трех городских конференциях ученых рисоводов (199б-1998гг.). По теме исследований опубликованы 3 печатные работы.

Буду всегда признателен научному коллективу Всероссийского научно-исследовательского института риса (ВНИИ риса) и особенно благодарю за величайшую поддержку моего научного руководителя - доктора биологических наук П. Н. Харченко. Также благодарю за внимание к работе академика Н. Е. Алешина

В заключение, хочу поблагодарить всех людей, которые тем или иным способом мне помогли в проведении этой работы. Моим родителям, моей супруге и моему сыну огромное спасибо за неустанную поддержку,

- 9 -RESUME

Les biotechnologies dans les pays en voie de développement ouvrent de grandes perspectives, surtout dans le domaine de l'agriculture. Ces perspectives ne sont pas sans espoir cependant, il ne faudrait pas oublier que chaque progrès porte en soi des conséquences nefastes, contre lesquelles il faut prendre des mesures adéquates.

Les pays en voie de développement doivent concentrer leurs efforts dans l'élaboration de programmes, qui puissent etre réalisables en tenant compte de leurs contraintes financières, de leurs ressources économiques et qui puissent apporter un interet a leurs économies.

Les methodes traditionelies de l'augmentation du rendement des cultures agricoles (la selection, le croisement et autres) s'utilisaient depuis l'apparition de l'agriculture. Elles se sont ameliorees grâce aux découvertes dans le domaine de la genetique, de la physiologie des Plantes et de la biotechnologie. Par exemple, au cours de ces dernieres decennies le rendement du mais a augmente de douze quintaux a soixante-douze quintaux a l'hectare et celui du ble croit en moyenne chaque annee d'un quintal. Ces memes succès ont ete atteints dans la culture du riz, deuxieme cereale mondiale. En ce moment a l'institut international de recherches sur le riz a Hanila aux Phillipines, il y a une collection qui regroupe près de soixante-dix milles variétés de cette culture.

Outre que l'augmentation du rendement des cultures, l'un des grands buts de la selection est aussi la création de variétés, résistantes aux parasites, et aux maladies causees par les bacteries et les virus.

Autre succès de la biotechnologie, l'apparition de nouvelles methodes permettant de croiser des especes différentes donnant parfois des plantes fertiles ce qui n'est pas possible par les methodes traditionelles de la selection.

Le microclonage in vitro a l'aide des cultures de meristemes ou d'autres tissue isoles de la plante dans les conditions steriles sur différents milieux de culture prenent du terrain dans les pays en voie de développement. Les cellules forment des cals selon les milieux culturaux. Les cals sous l'influence des phytohormones (auxines, cytoKinines, giberrel-lines) se morphogenisent et donnent des plantes identiques a la plante mere.

Une autre methode ayant de grandes perspectives dans la selection des plantes est l'obtention rapide des plantes haploides in vitro. Ce qui s'obtient après de longues annees par les methodes traditionelles de la selection. L'obtention des plantes haploides permet aux selectioneurs de detecter les caractères recessifs qui etaient masques par les caracters dominants chez la plante.

Les Plantes haploides sont des plantes steriles. Sous l'influence de la colchicine elles subissent une mutation et deviennent des Plantes dihaploides fertiles qui ont un grand interet pour la selection.

En Chine sur une superficie de quelques millions d'hectares ont ete semees de nouvelles variétés de riz, obtenues grâce a 1'androgenese. A l'institut russe de recherches scientifiques sur le riz a Krasnodar se poursuivent les recherches sur l'obtention de nouvelles variétés par androgese.

L'un des buts de nos travaux de recherches, était d'etu-

dier et de comparer l'influence de différentes concentrations de la fusicoccine dans le milieu cultural inductif de Blaydes sur l'androgenese et sur la culture des primordiaux de la pannicule de trois formes différentes du riz.

Nous remercions tous ceux qui, d'une part et d'une autre ont pris part a l'accomplissement de ces travaux durant les annees 1996 a 1998. A tout le collectif du laboratoire de biotechnologies de l'institut de recherches sur le riz de la russie nous disons merci. A nos maitres de recherches l'académicien Alyochine N. E. et le docteur d'état en sciences biologiques HartchenKo P. N. mes vifs remerciements, A mon epouse, a mon enfant, a mes chers parents infiniment merci pour le soutien tant moral et matériel.

L'auteur, Ahanhanzo Corneille.

1. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИЗОЛИРОВАННЫХ ОРГАНОВ И ТКАНЕЙ IH VITRO В СЕЛЕКЦИИ РАСТЕНИИ РИСА

Первые попытки культивирования изолированных тканей растений относятся к концу прошлого-началу настоящего столетия и связаны с именами крупных исследователей:Фехтига (Н. Vochting), Рехингера (С. Rechinger) и Габерландта (G. Haberiandt). в 1902г. Г. Габерландт, известный ботаник и Физиолог растений, первым четко сформулировал мысль о возможности культивирования in vitro изолированных клеток растений. Однако его собственные попытки выращивания на искусственной питательной среде клеток традесканции не увенчались успехом. Прошло более трех десятилетий прежде чем был достигнут прогресс в этой области (4,39).

Подлинными основоположниками метода культуры изолированных органов, тканей и клеток растений являются Ф. Уайт(P. White), работавший в США, и Р. Готре (R. Gautheret), занимавшийся исследованиями во Франции. в 1934г. Уайт опубликовал работу, из которой явствовало, что изолированные корни томатов могут расти в культуре неопределенно долгое время, если кончики их время от времени переносить на свежую питательную среду. Готре начал свои исследования в области культуры изолированных тканей растений одновременно с Уайтом. Первоначально он также занимался культивированием на искусственной питательной среде кончиков корней, но затем в качестве основного объекта избрал камбиальную ткань стеблей древесных и травянистых растений, после чего занялся культивированием паренхимных тканей корней и клубней (93,94). Избранные объекты оказались очень удачными: многие из введенных Готре тканей до сих пор широко используются в разных лабораториях мира.

В некоторых случаях гибриды, полученные в результате полового скрещивания, не дают жизнеспособных всходов, Тем не менее такие гибриды могут обладать . ценными для селекционера свойствами, например устойчивостью к каким то факторам среды. Благодаря методу культуры изолированных тканей стерильные гибриды можно поддерживать в жизнеспособном состоянии и размножать.

При выведении новых сортов растений селекционеры сталкиваются с низкой всхожестью гибридных семян.

Каковы же пути преодоления низкой всхожести семян? Основоположник метода культуры изолированных растительных тканей Уайт высказал убеждения, что применение разработанного им метода позволит преодолеть Физиологическую стерильность путем выращивания зародышей без эндосперма. Большой вклад в разработку метода изолированных зародышей внесли работы советского исследователя А. И. Заруйковской-Рихтер (1974).

Таким образом, использование метода культуры изолированных зародышей позволяет превратить неполноценные семена в жизнеспособные растения, полезные для практики, но дело не только в этом. Метод изолированных зародышей нашел применение для изучения механизма покоя семян и путей его регулирования.

Кроме того, метод культуры изолированных зародышей позволяет в строго контролируемых условиях изучать морФогенетичес-кие и морФоФизиологические аспекты эмбриогенеза, что необходимо для понимания сущности закономерностей роста зародыша, процессов его дифференциации, коррелятивных связей с эндоспермом и тканями материнского организма в период эмбриогенеза, а также для выяснения возможностей управления этими процессами.

Итак, культивирование изолированных тканей, клеток и про-

топластов, использование методов клеточной селекции и генетической инженерии открывают принципиально новые возможности при выведении сортов сельскохозяйственных растений. Одно из существенных препятствий на пути внедрения нового сорта в практику - невозможность получения в течение одного сезона достаточного количества семян или посадочного материала для хозяйственного использования. Это препятствие устраняется с помошью биотехнологии, которая предлагает селекционерам эффективный и быстрый метод микроразмножения растений. Очень важно и то, что посадочный материал, получаемый этим приемом, генетически идентичен давшему ему начало растению: ведь он возникает из соматических клеток растений. в то же время при половом размножении потомство развивается из зиготы, образованной в результате слияния половых клеток двух родительских особей. Эта зигота содержит гены как отцовского, так и материнского организма, поэтому потомство, возникающее в ходе полового размножения, не идентично одному какому-то родителю, а несет наследственные признаки обоих родителей.

В 1981г. австралийским ученым Ларкиным и СкаукроФтом (114) был предложен термин "сомаклоны" для растений, прошедших стадию неорганизованного роста in vitro