Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Повышение эффективности метода культуры пыльников риса IN VITRO для создания исходного селекционного материала

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Повышение эффективности метода культуры пыльников риса IN VITRO для создания исходного селекционного материала"

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ РИСА

¿' I 0 Он

На правах рукописи

• 2 5"

КРАСНИКОВА Ольга Всеволодовна

УДК: 631.527.8:633.18

у -•

ПОВЫИЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ НЕТОЛА КУЛЬТУРЫ ПЫЛЬНИКОВ РИСА 1Н У1ТКО ДЛЯ СОЗДАНИЯ ИСХОДНОГО СЕЛЕКЦИОННОГО МАТЕРИАЛА

спеииальность: Об. 01. 05. - селекция и семеноводство

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискаяие ученой степени кандидата биологических наук

\

Краснодар, 1994

Диссертационная работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте риса

Научный руководитель - академик РАСХН. доктор биологических

наук Алешин Е. п.

Официальные оппоненты - доктор биологических наук

Воробьев Н. в.

- кандидат сельскохозяйственных наук, доцент варчукова а. я.

Ведущее предприятие - краснодарский сельскохозяйственный

биотехнологический центр

Зашита диссертации состоится _ 1994 г.

в ¿0- час. на заседании спеииализированого совета к 020.66. 01 при всероссийском научно-исследовательском институте риса.

Адрес: 353204. г.Краснодар, пос.Белозерный. Всероссийский НИИ риса.

с диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института риса

Автореферат разослан

1994 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

Л

Е-н- Сорочинская

с

О ИНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность тени. Клеточные технологии, основанные на культивировании in vitro органов, тканей, клеток и изолированных протопластов высших растении, могут облегчить и ускорить традиционный селекционный процесс, к ним относится и экспериментальная гаплоидия (Нуромцев и др., 1990). Гаплоидные клетки растения позволяют легче обнаружить рецессивные нутации. экспрессию введенного извне генетического материала, а также наиболее удачные комбинации генов при комбинационной селекции (Гужов и др.. 1991). Спонтанное или искусственное удвоение числа хромосом превращает гаплоид в фертильиое гомозиготное диплоидное растение. Вовлечение удвоенных гаплоидов в селекционный процесс позволяет создать изогешше линии для получения гетерозисных гибридов в течение года, тогда как метод инбридинга требует для этого около Ч--6 лет. Использование изо-генных дигаплоидных линия, полученных при культивировании пыльников in vitro, облегчает селекционеру оценку и отбор искомых комбинаций признаков, позволяет в г-3 раза ускорить процесс создания сорта для самоопыляющихся растений, в том числе и для риса.

ограничением метода культуры пыльников in vitro является пониженная, со сравнению с соматическими тканями, регенераии-онная способность каллусных тканей генеративного происхождения и особенно высокая доля альбиносов среди регенерантов. дости-гаюиая у некоторых генотипов 100'/. (Хучеренко. 1991). Альбинос -ные растения не могут давать нормальные мужские и женские гаметы даже при гетеротрофных условиях культивирования и бесполезны для селекпии. Поэтому преодоление возможности их появления в процессе андрогенеза in vitro наиболее актуально.

■ирокону использованию данного метода препятствует также отсутствие надежных биохимических маркеров для оценки морфоге-нетического потенциала культуры пыльников риса и идентификации дигаплоидных линий, несущих селекционно-ценные изменения.

Цель н задачи исследований. Цель настоящей работы - по -

I

вышение эффективности метода культуры пыльников риса in vitro для создания исходного селекционного материала.

В связи с этим в задачи исследования входило:

1. оптимизировать состав индукционной питательной среды для каждого изученного сорта риса с целью увеличения частоты каллусообразоваяия и выхода зеленых пыльцевых регенераятов.

2. Выявить принципиальную возможность использования Ферментных систен в качестве биохимических маркеров морфогенеза культуры пыльников риса in vitro и применения их для оценки гомозиготных диплоидных линяй.

3. Исследовать Физиологическое состояние различных растительных тканей риса, полученных в процессе андрогенеза In vitго, с помошью сверхслабых свечений и установить возможность их практического применения в экспериментальной гаплоидии.

4. Разработать оптимальные условия культивирования In vitro пыльников карликовых форм риса.

5. Изучить морфобиологические характеристики карликовых Форм риса отечественной селекции.

Научная новизна исследований. При выполнений поставленных задач впервые проведены биотехнологические исследования карликовых Форм риса, созданных на основе нутанта Алексеенко. При культивировании in vitro пыльников этих Форм установлено, что они являются генетическим источником повышенного выхода зеленых пыльцевых регенерантов. сопряженного со степенью интенсивности формы.

для каждого изученного генотипа, как высокорослых, так и карликовых Форм, был оптимизирован состав индукционной питательной среды и выявлена положительная зависимость регенерации зеленых пыльцевых проростков от частоты каллусообразования. Ьпервые исследовали влияние концентрации глицина в индукционном i-'^ де на частоту образования зеленых пыльцевых регенераи-

-3- _

той. в результате била обоснована и предложена модификация питательной сгоды с повышенным содержанием глицина.

Приоритетными r нашей стране являются исследования по возможности использования изоферментного анализа и сверхслабых с сечений дли поекяйния эффективности метода культуры пальников р;u: a in vitro.

Практическая зиачкмость работы. Полученные методой культуры пыльников две гомозиготные карликовые линии изучены и переданы в коллекцию ВНИИ риса, они представляют интерес как исходный материал с заведомо известными генетически детерминированными изменениями метаболизма.

Модифицированный состав индукционной питательной среды, а также применение биохимических и биофизических методов опенки материала, полученного при культивировании пыльников in vitro, позволяет сократить затраты и время на получение гомозиготных дигаплоиддых линий риса.

Апробация работа. Результаты исследований докладывались на Всесосзной конференции молодых ученых-рисоводов, г. Краснодар (1991); международных конференциях молодых ученых-рисово-доп. г.Краснодар (1992.. 1993).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Структура в объем диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов, предложений к внедрению и списка литературы из гоо наименований, из них 130 зарубежных авторов. Работа изложена страницах машинописного текста, содержит

Z4 таблицы и 9 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы проведения исследовании

Исследования проводились в лаборатории гаплоидии и протопластов Всероссийского НИИ риса с 19&9 по 1993 год.

^ндрогенез m vitro - образование гаплоидного растения из микроспоры или пыльцевого зерна - связано с переключением развития спорогенных клеток с обычного для них гаметоФитного пути развития на спорофитный. данный Феномен лег в основу иетода культуры изолированных пыльников (Горбунова и др.. 1993).

В качестве донорных генотипов для культивирования пыльников in vitro ны использовали районированные сорта риса кулон. кпх-1. солнечный. Краснодарский 424 и Кубань 3. различающиеся по морфобиологическин характеристикам, выбор данных генотипов определился в ходе предварительных исследований, которые выявили их высокую регенеравдонную способность. Кроме того, изучали карликовые образцы из коллекции ВНИИ риса: мутант Алексе-енко. кдз-1. кдз-г. кдзо-з и КГЗ-4.

за основу были приняты методики культивирования растений, описанные Бутенко Р. Г. (1964). Харченко H.H. (1966) и Кучеренко Л. А. (1991). в некоторых случаях проводилась оптимизация условий культивирования. Растения-доноры выращивали в условиях камер искусственного климата (КИК), в теплице и на вегетационной площадке.

Стадии развития пыльцы, пригодной для культивирования m vitro, определяли по морфологическим показателям растений, перед инокуляцией иа питательные среды метелки риса подвергали предобработке пониженной температурой (4°С) в течение 4-ю суток. а затем стерилизовали o.oix раствором сулены в течение ю минут. Пыльники культивировали в чашках Петри на твердой ага-ризованноя среде N6 (Chu. 19751 при температуре 25-гб'С в темноте. в целях оптимизации этой индукционной среды для отечественных образцов риса состав ее варьировали по регуляторам роста (концентрация и сочетание), содержанию глицина и двухвалентного хелеза.

Образовавшийся каллус никроспоркального происхождения для индукции ог"*йоге)1еза субкультивировали на питательную среду

иурасиге и скуга (Murasiuee, SKooe. 1962).' Появление пыльцевых регенерантов регистрировали на стадии проростков. Для сопоставимости полученных данных во всех опытах частоты каллусо-образования и регенерации определяли в расчете на 100 высаженных пыльников.

для получения растений-регенерантов первого поколения Pi. зеленые пыльцевые проростки с хорошо развитой корневой системой в Фазе трех листьев пересаживали в почву и выращивали в кик при повышенной влажности воздуха до полного созревания.

Содержание пигментов в листьях растении риса определяли по стандартным методикам (Алешин Е.П. и др.. 1902).

Изоферментный анализ эстеразы. глутаматдегидрогеназы и алкогольдегидрогеназы недифференцированного каллуса и пыльцевых регенерантов риса проводили совместно с пустиным в. г. по модифицированному методу электрофореза в нелинейном градиенте концентрации полиакриламидного геля (8-iez) (Devis. 1964; Шус-тин. 1990). гистохимическое выявление изоФерментов проводили стандартными методами (Левитес. 1986).

Методом сверхслабых свечений совместно с Молоковым л. г. определяли жизнеспособность светлых, темных и некротических каллусных тканей, корней и листьев зеленых и альбиносных рас-тений-регенерантов (Тарусов, 1968; Тур и др. . 1963).

При статистическом обработке биометрических данных на персональном компьютере определяли среднюю, ошибку средней, коэффициент вариации, дисперсионным анализом устанавливали достоверность действия Факторов по Фишеру (г) (Доспехов. 1965).

оптимизация состава индукционной питательной среды для культивирования пыльников риса

Проведенный анализ литературных данных позволяет'эаклю чить. что метод культа м лиюванных - пыльников "риса -дерепвк

тнвен для внедрения в практику генетико-селекоионных и биотех-нологическик исследований (Харченко. Циловский. 1962; Shen et al.. 1903 и др.). Еирокому использованир этого нетода мешает его низкая эффективность. И прежде всего - преимущественная регенерация альбиносных растений из мнкроспориального каллуса (Еучерекко. Харченко. 1975; Chaiett. 1980).

Изучение биологических особенностей растений-альбиносов показало, что у них нарушен процесс трансформации протопластид в хлоропласта (Chen Y. et al. . i9Sñ). Вследствие этого, хлоро-♦клл-белковый комплекс альбиносов обеднен по сравнению с нормальными зелеными пыльпевыни проростками (Chen X. et al.. 1968). Одни авторы объяснят- это делецлей ялоросластной ДНК при генезисе пластид (Livore. 1988; Zhang et al. . 1993), другие - изменениями, происходящими в ДНК ядер пыльцевых зерен в ионент индукции (XlKuchl et al., 1987; Кучеренко, 1591).

Итак, предотвратить образование альбиносов при культивировании пыльников риса in vitro не представляется возможным. Однако ка частоту их появления, кроме генотипа (Reddy et al.. 19Ь5), влияет также состав питательной среды, температура инкубации и предобработки пыльников, а также другие Факторы, поддавшиеся оптимизации (Torrizo, Zapata. 198&; Chen Y. et al. , 1991 и др. ). Именно составу индукционной питательной среды всегда уделялось особое внимание (Негсу, Zapata 1990), так как процесс каллусогенеза имеет приоритетное значение при культивировании пыльников m vitro (Ыалв, 1978).

Для повышения эффективности метода культуры пыльников риса. мы изучали впияние на андрогенез in vitro индукционной среды Kb. и прежде всего - регуляторов роста, входящих в состав этой среды.

С учетом литературных данных (Huang et al.. 1986; Roux. Sartca, 1991 и др. ), мы составили Ь вариантов, различакхаихся по сочетанию и концентрациям экзогенных гормонов. Далее изучали их влияние ча каллусогенез (таол. 1! и органогенез культур

таблина 1

Влияние регуляторов роста на каллусогенез из пыльников риса,

Вариант

1 2 3 4 5 : б

Кулон 17. 0 68. 0 12. 0 4. 0 - -

Солнечный 33, 0 б. 0 б, 5 3, 5 10.0 27.0

КПХ-1 0, 6 5. 0 56. 0 - 18. 0

Краснодарский 424 20, 0 28. 0 26, 0 14. 4 - -

Кубань 3 - 22. 0 - 4, 0 - -

Примечание: 1 - 2.4-д - гмг/л;

г - г.4-д - г иг/л. <£-нук - гнг/я; з - 2.4-д - 2 иг/л. оС-нук - гмг/л;

4 - г.ч-а - 1.5 мг/л. кинетин - о, 5 нг/л;

5 - 2,4-Д - 2 мг/л, еС-НУК - 2 мг/л, кинетин -0.5 чг/л;

6 - г.ч-а - 4 мг/л. сС-нук - г мг/л, кинетин - 1 мг/л.

/

пыльников районированных сортов риса.

При добавлении к основном/ составу индукционной среды Н6 ауксинов сС-КУК и 2,4-д (по г мг/ю. частота каллусообразовзния достигала у сорта Кулон - бе/.. Краснодарский 424 - ¿в/.. Кубань 3 - ¿'¿у.. Внесение кинетина в среду Мб вызвало увеличение этого показателя у сорта Солнечный до 27/.. а у сорта КПХ-1 -до 50/..

Максимальная частота регенерации отмечалась при том же варианте гормонального состава индукционном среды, что и максимальная частота каллусообразования. и составила у сорта КИХ-1 - 05,4/:, Солнечный - 51/.. Кулон - 35/.

диалогичная зависимость наблюдалась также при изучении влияиия регуляторов роста в составе индукционном среды Мб на ннхо.ч -з^лелык регенерангов (табл. ¿).

Таблииа 2

Влияние регуляторов роста на выход зеленых пыльцевых проростков. от рбшего числа регенерантов

: вариант

1*орт ; - 1 £ 3 4 : 5 6

КУЛОН 45 50.0 6 47 - -

Солнечный 30 - 15 16 33 26

КПХ-1 - - 18 42 - 15

Краснодарский 424 10 16.4 И 7 - -

Кубань з - 20.0 - С - -

Примечание: номера вариантов те же. что в табл. 1

Как видно из табл. г. манипулируя гормональным составом индукционной питательной среды, нам удалось достичь очень высоких показателей частоты регенерации зеленых пыльцевых проростков. особенно для сортов риса интенсивного типа. Это связано с тем. что у этих сортов наблюдается более активный синтез пигментов, в частности хлорофилла, и поэтому они обладают более высокими потенциальными возможностями в условиях in vitro, чем традиционные высокорослые сорта (см. табл. 5),

Таким образом, результаты проведенных исследований подтверждают преимущество одновременного включения в состав индукционной среды нб таких регуляторов роста, как ¿-hvk. 2.4-д к кинетин.

Возможная взаимосвязь гормонального состава индукционной питательной среды с концентрацией ионов железа Fea+ <Kuo et al.. 1978). дала основание изучить влияние этого микроэлемента на процесс каллусогенеза. При культивировании in vitro пыльников сорта Солнечный оказалось, что с увеличением концентрации ионов железа Fe** в 6 раз по сравнению с основным составом ии-< дукаионной1 среды Нб, улучшилось качество каллуса, регенерахшон-

I

I -

ная способность возросла в 25 раз. выход зеленых регенерантов достиг 32'/.. Исходя из полученных результатов, можно предположить. что повышение содержания двухвалентного железа в условиях in vitro ведет к интенсификации дыхания на первом этапе культивирования пыльников и к ускорению процессов развития растений.

Как упоминалось выше, состав индукционной среды варьировали и по содержанию аминокислоты глицина - основного предшественника биосинтеза порФнринов (табл. 3).

Таблица з

Влияние концентрации глицина в индукционной среде на культуру пыльников сорта краснодарский 424

Концентра-:каллусооб-:Некроти-:Регене-: Регенеранты

ция гяици-:разование, :ческий -.рация, :---------------------

на. мг/л : '/■ : каллус. /.: у. : всего, шт. : зеленых.

2(контроль) г. 0 0 1.0 4 0. 0

4 3, 7 0 1. 4 . 14 7, 0

10 5. 7 0 3. б 11 9. 0

20 8. 0 0 5.2 38 3. 0

40 13. 0 г 7. 3 35 28. 0

60 27, 0 42 15.4 74 6. 7

во 26. 0 40 го. 2 85 3. 5

Изучение влияния глицина на процесс андрогенеза in vitro показало, что при увеличении концентрации глицина от 2 мг/л до еО мг/л, повышаются частоты каллусообразования и регенерации. Однако содержание глицина в индукционной питательной среде свыше 40 мг/л угнетаюше действовало на каллусную культуру риса, а возрастание количества регенерантов происходило за очег альбиносов. Наксимальныи выход зеленых пыльцевых проростков у сорта Краснодарским 424 отмечался при содержании гличина н и» аукционном питательной сргде - mi л. Это 6«ьй4ни< гся kjm.

что повышение концентрации экзогенного глиздна стимулировало процессv Фотобиссингеэа хлорофилла у пыльцевых регенерантов. Аналогичные результаты были впоследствии получены и для карликовых форм риса.

итак, варьируя гормональный состав индукционной питательной среды, содержание в ней глицина и двухвалентного железа, нам удалось повысить выход зеленых пыльцевых регенерантов с учетом каждого конкретного генотипа.

Изоферментные маркеры при изучении культуры пыльников риса in vitro

Биохимические и генетические маркеры широко используются исследователями для решения ряда задач биохимии, генетики, селекции и других областей науки (Конарев. 19ез).

Нгшеи задачей было выявление принципиальной возможности использования Ферментных систеи в качестве маркеров морфогенеза культуры пыльников in vitro отечественных образцов риса. Гак как изофермейты являются продуктами экспрессии различных генов или результатом аллельного состояния одного гена (Giasz-mann. 1965), то по данным изоФерментного анализа можно судить о генетической структуре организма, популяции, сорта. Совокупность отдельных вариантов изоФермектов может служить генетическим маркером генотипов и/или генофондов (Созинов. 1905).

Методом электрофореза в градиенте концентрации полиакрил-амидного геля (8-16/) был проанализирован изоферменткый состав зстеразы (Est), гдутаматдегидрогеназы (ГДГ) и алкогольде-гидрогеназы (АДГ) каллуса и пыльцевых регенерантов риса. Результаты исследований показали различнуо степень изменчивости анализируемых Ферментных систек риса.

Интенсивность проявления АДГ варьировала в зависимости от генотипа и ткани растения. У каллуса. полученного при культи-вкроваиии пыльников сорта Кулон, о на вообще не проявлялась.

А у каллусэ. индуцированного из пыльников сорта краснодарский 424 и мгганта ллексеенко. адг проявлялась в виде одной новиой изоФормы. характерной для 4-10-дневкых проростков семян риса' (С1азгшпп ег а1.. 1988).

При изучении интенсивности проявления компонентов ГДГ. мы установили различия между каллусом, зелеными и альбиносныки пыльцевыми регенерантами риса (рис. 1).

0.5

шш

< '••"УМ-.?:.

2

3

4

9

6

? ша

8

Рис. 1. схема электроФореграммы ГДГ.

Сорт кулон: 1 - неморфогенный каллус;

2 - норфогенныЯ каллус;

3 - зеленые регенеранты;

4 - альбиносные регенеранты.

У неморфогенного каллуса, в отличие от морфогенного. наблюдался дополнительный компонент з. выявленный также в листьях альбиносов. Анализ лзоферментных спектров гдг данного генотипа показал, что в листьях зеленых пыльцевых проростков медленно-мигрируюший блок- представлен только двумя компонентами 1 и 2. тогда как у альбиносов - вестью (1 - б). Возможно, что различие набора изоферментов гдг зеленых и альбиносных регенерантов вызвано повышенной активностью биохимических реакций при от-

сутстени Фотосинтеза у альбиносов.

ИзоФерментные спектры неспецифических эстераз наиболее хорошо изучены, генетически детерминированы и использовались исследователями для определения генетического Родства между видами риса (Ра)атсьапи. Б1с1спч. 1977), идентификации сортов риса ШакаваЛга, 1977; шустин. 1990). а также в качестве маркера морФогенетического потенциала риса (НаЬезмагап. 5гее Капвазапц, 1988; СиЫегйоп:. 1990).

сравнивая на электрофорегрдммах изоферменты харак-

терные для каллуса и пыльцевых регенерантов сортов кулон и Краснодарский 424, мы отметили их различие в чоне компонентов со средней подвижностью. Оказалось, что в листьях зеленых регенерантов сорта Краснодарский 424 активность неспецифических эстераз значительно выше, по сравнению с таковой в листьях альбиносов (рис. 2).

0.5

+

Рис. г. схема электроФореграмны Est.

Сорт Краснодарский 424: 1 - контроль;

с - зеленые регенеранты; : альбиноскые регенеранты.

контролем в этом опыте служили зеленые листья исходного сорта Краснодарским цгч. ЭлектроФоретическия анализ Est показал исчезновение оыстромигрирушего компонента 17 у зеленых регенерантоь по сравнению с родительским сортом. Вероятно, эта потеря экспрессии аллели вызвана воздействием условий культивирования in vitro. Различия в интенсивности проявления компонентов Eat у зеленых и альбиносных пыльцевых регенерантов объясняются их разными метаболитическими путями развития. А отсутствие блока изоферментсв Est (с ti по 16) у растений-альбиносов сорта Краснодарский 424 возможно является результатом потери экспрессии генов в связи с делеиией хлоропластной ДНК при генезисе пластид (Zhang et al.. 1993).

В результате проведенных экспериментов, мы выявили перспективность применения ГДГ и Est в качестве маркеров морфоге-нетического потенциала культуры пыльников риса.

Параметры сверхслабых свечении каллусных тканей и пыльцевых регенерантов рис^

После открытия сверхслабых свечений живых тканей растительных организмов (Тарусов, 1968). было начато широкое использование этого явления для оценки Физиологического состояния клеток при действии солей Шой. 1968). высоких и низких температур (Китлаев и др.. 1972), гербицидов (Алешин Е. п.. Алешин H. Е. . 1993) и т. д.

Изучение нами параметров сверхслабых свечения каллусных тканей, полученных при культивировании in vitro пыльников сор- тов риса, показало, что оки зависят от качества, возраста и Физиологического состояния анализируемого материала. Самые высокие отношения интенсивности длительного послесвечения к интенсивности хемилюминесиенции (En/Sx) наблюдались у светлых каллусных тканей, наиболее жизнеспособных и обладатих высоким регенерационнын потенииалон. Вспышки хенилюкинесиениии (hx).

характерные для некротического каллуса. отмечались и другими исследователями в пронессе гибели организмов (Журавлев и др.. 1965).

Различия параметров сверхслабых свечений зеленых и альби-носных регенерантов. подученных из светлых каллусных тканей мккросдориального происхождения ври одинаковых условиях культивирования. сьши вызваны в первую очередь влиянием генотипа исследуеных сортов (табл. 4),

Таблица ч

интенсивности длительного послесвечения (Бп) и хе-нилминесцениии (Бх) и их максимальных величин Ш и Ьх зеленых и альбиносных регенерантов

:Регене- : Бп : эх :Бп/Бх: Пп ьх : ьп/ьх

сорт : рант :--------------: :-------------:

:импульс/иг. с : : имгульс/мг

Солнечный 1 « 3. 35 3. 14 1. 07 36. 39 21. 01 1.7 3

"1 \ КПХ-1 2 О. 30 1.30 0. 23 5, 24 21. 19 0. 25

1 2. 90 г. 13 1. 36 58, 56 24, 37 2. 40

2 О. 52 1.35 0. 39 6. 75 15, 52 0. 43

Кулон 1 г, 66 2. 40 1. 20 51. зг 25. ьа 1.

2 о. 34 0. 67 0. 51 4. 00 Ь, 10 0. 65

Краснодарский

424 1 1. 75 2. 04 0. во г&. оо 1 з, бе 1. 90

2 0. 34 1. 10 0. 31 5. 1У И. 97 0, 43

КФакт. = 41,76 Ртабл. - г. 75 р= 4. /5

Примечание: » 1 - зеленый

2 - альбиносныи

Установлено, что интенсивности и максимальные величины длительного послесвечения > зеленых иыльиевых регенерантов всех сортов риса оыли в несколько раз иыие. чем > а/гьбиносных. 1яч> объясняется отсутствием начальных процессов Фотосинтеза у

последних, вследствие того, что пластиды альбиносов утрачивают свои нормальные функции и не предоставляют достаточно материалов для синтеза белков и хлорофилла (Wane et al. . 1978).

различия по интенсивности хенилюминесиенции не так значительны. потому что у альбиносных пыльцевых регенерантов процесс выживания основан на активизации углеводного обмена.

в ходе исследований также было выявлено, что параметры сзерхслабых свечений находятся в зависимости от качества индукционной среды и от тканевой специфичности для каждого из изученных генотипов.

итак, анализируя параметры длительного послесвечения, мы получаем возможность выделить кадлусные ткани, наиболее способные к регенерации зеленых пыльцевых проростков еше на стадии дедиФФерешшации. С применением метода сверхслабых свечений исчезает необходимость выращивать до полной спелости все полученные при культивировании пыльников in vitro зеленые ре-генеранты. так как на стадии проростков среди них выявляются наиболее жизнеспособные, с высоким Фотрхимическим потеициалон.

таким образом, использование биохимических и биофизических методов опенки материала, полученного при культивировании пыльников m vitro, позволяет сократить время и затраты на создание гомозиготных линий риса.

карликовые формы риса как генетический источник повышения выхода зеленых пыльцевых регенерантов

Повышенная эффективность фотосинтетического аппарата у .*ртов риса интенсивного типа связана с большим количеством ♦отосннтезируюсшх структур на единице плоаади листа (Алешин Е. П. . Алешин Н. Е. , 1993). Известно также, что плотность мезо-Фильных тканей, содержащих хлоропласта, возрастает у риса в эволюционном ряду: сорта индийского подвида трздииионные сорта японского подвида - сош^ненные гт i -ш hoo/ iv п' дридл

(Tsunoda, Khan. 1968). В тон же порядке понижается уровень эндогенных гиббереллинов (Hamamura, Prechachart. 1977). в этом эволюционном ряду у риса происходит возрастание отзывчивости на азот и усиление агрохимическои интенсивности, так как при снижении уровня гиббереллина в тканях растений риса возрастает активность нитратредуктазы (Алешин н. Е. и др.. 1963). Поэтому доноры интенсивности для селекционной работы ишут среди карликовых и полукарликовых Форм риса с низким содержанием эндогенных гиббереллинов (Kobayashi et al.. 1989).

одним из источников генов карликовости такого типа является мутант Алексеенко. подученный методом химического мутагенеза из сорта Краснодарский 424 (Алексеенко. 1989). Низкое содержание эндогенных гиббереллинов. карликовость, высокая крен-ниеФильность и повышенное содержание хлорофилла мутактной ♦ормы говорят об ее перспективности как исходного материала в селекции (Авакян и др. . 1986). Более активный синтез пигментов мутанта Алексеенко по сравнению с районированными сортами дал нам основание предположить, что такая Форма может отличаться и повышенным выходом хлороФидльных пьшьиевых регенерантов.

в нашей работе впервые было проведено культивирование пыльников мутанта Алексеенко m vitro и оптимизирован состав индукционной питательной среды N& для данного генотипа, выход зеленых пыльцевых проростков у мутанта Алексеенко оказался в 4.2 раза выше, чем у исходного сорта Краснодарский 424 и достигал 69У-. Это объясняется изменениями в биосинтезе гиббереллинов. " так как биосинтез терпенов прямо связан с хлоропластами.

Пример мутанта Алексеенко свидетельств} ,'т. что источником генетически детерминированного повышенного выхода зеленых пыльиевых регенерантов являются Формы риса, синтезирующие пониженное количество гиббереллинов. Для подтверждения этого, мы изучили ряд карликовых ооразцов риса, полученных на основе мутанта Алексеенко (Зеленскии. Третьяков. 1969): КДЭ-1, КЛЗ-г, кдзо-з и КТЗ-4. Они различались нежду собой по Форме и габиту-

су куста. типу метелки, размеру и Форме зерновок. Все эти образцы характеризовались заведомо известными изменениями метаболизма - пониженный биосинтезом эндогенных гиббереллинов. Вследствие этого, мы предположили, что новые карликовые формы риса обладают повышенной эффективностью фотосинтеза. В ходе исследований было определено содержание хлорофилла и каротино-кдов в растениях карликовых образцов и районированных сортов риса (табл. 5).

таблица 5

Содержание пигментов в листьях карликовых форм риса в сравнении с районированными сортами.

мг/г сырого вешества

/ _

Образец : хлорофилл : Хлорофилл : Каротиноиды "а" : "в"

КДЗ-1 1. 40 0. 46 1. 07

КДЭ-2 2, 11 0. 64 1*53

КДЗо-З г. 24 0. 69 1.63

КТЗ-4 ^ 1. 90 0. 60 1. 40

Мутант Алексеенко 2. 30 0. 72 1. 56

Краснодарский 1. 31 0.46 0. 96

Спальчик -1» 89 0. 70 1.09

славянец 1.97 0. 55 1. 51

ГФакт. 13.7 7.5 2. б

РТабл. З.б З.б 3. б

Оказалось, что мутант Алексеенко обладает наиболее активным синтезом пигментов среди всех изученных образцов. Меньшее содержание хлоро*иллов "а" и "б" и каротиноидов у новых карликовых Фори. возможно, объясняется тем. что они были созданы в результате скрещивания мутанта Алексеенко с высокорослыми сортами вниир 7630 и Пршсусанский.

сумнариое содержание хлорофилла у всех карликовых форм риса соответствует показателям, определенный для районированных интенсивных сортов риса спальчик и сдавянец, и значительно превосходит их в сравнении с традиционным высокорослым сортом Краснодарский 421. это соответствует генетико-Физиологической модели детерминации степени интенсивности Формы, предложенной Алешиным Е. П. и Алешиным н. Е. (1993). следовательно, все изученные карликовые Формы риса обладают метаболизмом, направленность которого свойственна интенсивным сортам, кроме того, высокое содержание хлорофилла в листьях этих форм позволило прогнозировать их перспективность как генетических источников повышенного выхода зеленых пыльцевых регенерантов. для подтверждения этого, мы культивировали пыльники новых карликовых образцов риса в условиях m vitro (табл. 6).

Таблица б

Влияние модифицированной индукционной среды Нб» на культивирование пыльников in vitro новых карликовых форм риса

:Каллусообра-: Регенера-Образец : зованне. / : ция, /

Регенеранты

всего, шт.

зеленых.

хдз-1

кдз-г

КДЗо-З КТЗ-4.

12 4

го зо

13

14 14 24

128 53 53 43

65 17 45

59

Примечание: » основная среда Кб с добавлением:

г. 4-д. г мг/л; сС-нук, г мг/л: глицин, ъо мг/л.

Результаты, приведенные в табл. 6. показывают, что выход зеленых иильцеиих проростков у мутанта Алексеенко, КДЗ-1 и -ч превышает аналогичный показатель цля всех оцененных районированных сортов интенсивного типа (ин. табл. ¿). а образец

ХДЗО-З по выходу зеленых регенерантов не уступая максимальным значениям этого показателя для сортов кулон и солнечный, обладающих самой высокой способностью к регенерации зеленых пыльцевых проростков среди отечественных интенсивных сортов риса.

Исключение составил образец КДЗ-2. частота каллусообразо-вания которого была всего чу-. а еыход зеленых регенерантов -на уровне высокорослых сортов, для данного генотипа следует дополнительно оптимизировать условия культивирований пыльников in vitro, особенно на первой стадии, о высоких потенциальных возможностях образца КДЗ-2 говорит тот Факт, что содержание пигментов у него было гораздо вызе, чем у образца КДЗ-i идентичного происхождения (см. табл. 5). показавшего выход зеленых пкльиевых регенерантов - 05/.

Учитывая, что новые карликовые Формы риса имеют гибридное происхождение, в ходе исследования ны выделили у двух из них гомозиготные линии. При культивировании in vitro пыльников карликов КДЗ-1 и КДЗо-З нами были получены диплоидные растения •регенеранты: КДЗ-1-р и КДЗО-З-Р.

При сравнении полученных образцов с родительскини Формами оказалось, что синтез пигментов у растений этих гомозиготных линии идет активнее, а Фенотип и вегетационный период не изменялись. по всем биометрическим показателям коэффициент вариации у растений-регенерантов был значительно ниже, чей у исходных Форм, особенно по мадоизмеичивым признакам: высоте растений и длине метелки, это свидетельствует об исключительно высокой выровненности этих растений в популяции и подтверждает их гонозиготнур природу, линии КДЗ-i-p и КДЗО-З-Р после детального изучения были переданы в коллекцию ВНИИ риса и рекомендованы нами для дальнейших исследований.

Несомненный интерес представляло дать агробиологическую оценку новых карликовых форм риса, которая ранее не проводилась. Дпй этого, кроме Фенологических наблюдения и учетов, сделан полный биометрический анализ растений (табл. 7).

Результаты биометрического анализа растении карликовых Форм риса (Я * бк)

таблица 7

Образец

Высота растений. СИ

длина метелки. с м

колосков на '. Пасса зерна : отношение метелке, шт. : с растения. : зерна к / : г : соломе. 1:

-----.---------------------------------

Насса 1000 зерен, г

КДЭ-1 » КДЭ-1-Р » ' КДЗ-2 КДЗО-З 'КДЗо-З-Р КТЗ-4. Иутант • Адексеенко

19. Ч 1 0,20

18.6 t о. 10 го.б 1 о.^г

21.7 » 0. 53

гг. 4 10.26

9.0 1 0. 15

в, 4 4 0.04

7.9 1 0. 24

.9. О » О, 30

9.5 t 0. 13

45. 1 1 2.60 1.2 ± 0. 13 28. 1 1 1. 64 1. 1 ± 0. 14

24. 3 4 О. 39. 8.5 ±0.31

24.8 1 2.56

42.7 * 5.28 39.0 1 1.40

25.8 1 1.38

1.3 10. 26

1.0 ± 0. 15

■ /

1.1 tO.ll

1. 1 ± О. 14

0.9 1 0.04 О. 8 ± 0,04

0.5 1 О, 08 1.0 * 0. 12

1. 1 ± О. 05 1. 3 ♦ 0. 10

30. 1 1 О. 70 31,4 ¡. 0,61

28.6 i 0.48

29.7 £ 0,72 30. 1 1 0. 38 23, б £ 0. 54

1

ГО

0

1

1в.е ♦ О, 37 . Г. 4 1 <5. 16 29.9 11.13 1.3 10.17 1.3 1:0.07 22. 3 £ О. 88

Примечание:4опыта проводились в теплице в 1992 г.

• - на вегетационной плошадке в 1993 г.

в целях выявления потенциальных созможностея продуктив ности карликовых Форм риса, на примере образца кдз-i-F, мы ви-разншали его при разреженном и загущенном посеве (I и 15 растении на сосуд соответственно).

диализ полученных данных показал, что растения КДЗ-1-Р при большой площади питания Формировали исключительно моемые растения: продуктивная кустистость увеличилась в 'j. 5 раз. озерненность метелок возросла на чо/.. а масса зерна с растения увеличилась в ю раз.

Исходя из полученных результатов, мы рекомендуем выращивать новые карликовые Форны риса так же, как и мутант Алексе -енко (Алексеенко. 1991). в вегетационных сосудах в камерах искусственного климата при разреженном посеве и освещении 20 клк.

Итак, изученные нами карликовые Формы риса отечественной селекции явля«угся источником генетически детерминированного повышенного выхода зеленых пыльцевых регенерантов и представляют значительный интерес как исходный материал, обладающий генами карликовости, обусловливающими в конечном итоге повышение интенсивности сорта.

выводы

1. использование метода культуры пыльников риса m vitro способствует ускорению традиционного селекционного процесса. Зирокону применению метода препятствует низкая частота каллу-сообразования изолированных пыльников и преимущественная регенерация альбиносных растений."

г. Повышение эффективности метода культуры изолированных пыльников обеспечивается в значительной степени за счет оптимизации первой стаяли культивирования.

3. предложены модификации индукционной питательной среды по составу и соотношению регуляторов роста и содержанию микроэлемента Feоптимальные для районированных сортов: Кулон.

солнечныя. кпх-i. краснодарский 424 и Кубань з с целью выявления потенциальных возможностей данных генотипов в условиях m vitro. при этом частоты каллусообразования для сортов интесив-ного типа составляли 43-&8'/-. а для традиционных высокорослых сортов - гг-гв/.,

4. Установлено, что с повышением частоты каллусообразова-ния увеличивалась частота регенерации зеленых пыльцевых проростков. v сортов интенсивного типа она варьировала от 32 до бох. а у высокорослых сортов от 20 до 28/..

5. изучено влияние концентрации глицина в индукционной питательной среде на андрогенез in vitro. При повышенном содержании этого предшественника Фотобиосинтеза хлорофилла -50 мг/л - частота каллусообразования возросла в 5-7 раз. а частота регенерации зеленых пыльцевых проростков - в 4-5 раз при культивировании in vitro пыльников как высокорослых, так и карликовых форм риса.

6. Использование изоферментных спектров неспецифических эстераз и глутаматдегидрогеназы может служить объективным показателен корфогеиётическогс потенциала культуры пыльников риса. __

7. Параметры сверхслабых свечений позволяют выделять кал-лусные ткани, обладающие высоким регенераоионным потеоиалом. и наиболее жизнеспособные зеленые пыльцевые проростки на ранних стадиях их формирования.

С. Установлено, что карликовый образец риса игтант Алек-сеенко и созданные на его основе другие карликовые Формы с пониженным биосинтезом гиббереллинов. являются источником генетически детерминированого повышенного выхода зеленых пыльцевых регенерантов. это проявляется в положительной зависимости реакции генотипа на культивирование пыльников in vitro от степени интенсивности сорта.

9. Оптимизированы условия культивирования m vitro карликовых форм риса, в процессе исследований созданы две гомози-

готные карликовые линии: КДЗ-l-p и кдзо-з-р. проявляющие высокую константность по основным биометрическим покзателяи. Обе линии переданы в рабочую коллекцию внии риса.

10. Для дальнейиего эффективного использования новых карликовых фори риса в качестве исходного селекционного материала изучены их норфобиологическке характеристики и оптимальные условия выращивания.

пред/02ения к внедрению

1. при культироваянни in vitro пыльников отечественных образцов риса рекомендуется использовать индукционную питательную среду Мб следующей кодификации: основной состав N&. дополненный - глицин - 50 мг/л. oC-hvk - г иг/а. ¿.ч-й - г мг/л. кинетин - о. 5 мг/л.

г. с целью ловыпекня качества оценки каллусных тканей и определения морфогёнетического потенциала культуры пыльников риса предлагается применять в качестве маркеров изоФегментные спектры неспецифических эстераз и глутаматдегидрогеназы. А для выделения каллусных тканей, обладающих высоким регенерационнын потенциалом, и наиболее-|хизнеспособных регенерантов использовать параметры их сверхслабых свечений.

по магериалан диссертации опубликованы работы:

1. Красникова о. в. , Авакян э. р. . Алешин н. е. . харченко п. н. . Алешин е. п. Генетические аспекты решения проблемы побшю-ния выхода хлорофилльиых пыльцевых регенерантов риса. // ДОКЛ. ВАСХНИУ1. - 1991. - N 4. - С. 13-14.

2. Красникова О. В. Изучение влияния индукционной среды на культивирование пыльников in vitro некоторых сортов риса. // Тез. Всес. конф. молодых ученых-рисоводов. - Краснодар. 1991. - С. 12.

3. Красникова о. в. . Нолоков л. г. Сверхслабые свечения каллусных тканей и регенерантов риса. // тез. докл. междунар. ко.чф. молодых ученых-рисоводов. - Краснодар. 1992. - С. 12.

4. Красникова 0. в. Карликовые формы риса как генетический источник повышения выхода зеленых регенерантов в культуре иыльникое. // рис России. - 1993. - т. 1. HI. - С. 12.

5. Красникова О. В. . Зеленский Г'. л. сравнительное изучение карликовых Форм риса. // Рис России. - 1993. - т. 1. Ш. -

с. 13.

\