Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности андрогенеза IN VITRO в процессе создания дигаплоидных линий рапса

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Особенности андрогенеза IN VITRO в процессе создания дигаплоидных линий рапса"

Р Г 5 ОД

ЛКЛДЕНИЯ НАУК БЕЛАРУСИ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И ЦИТОЛОГИИ

на правах рукописи АБАДОВСКАЯ Татьяна Викторовна

ОСОБЕННОСТИ АНДРОГЕШ-ЗА IH VITRO D ПРОЦЕССЕ СОЗДАНИЯ ДНГАПЛОИДИМ ЛИНИИ РАПСА

оз. оо. is - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации ha соискание ученой степени кандидата биологических наук

Нинск - 1994

Работа выполнена в БелНИИ чемле«елия и кормов АА" РВ

Научный руководитель: доктор биологических наук И. А. ГОРДЕЙ

Остальные о;.лонеиты: доктг "> биологических наук

член-коррвепондвнт AHB В. Н. РЕШЕТНИКОВ

Ведущее учреждение: Белорусская сельскохозяйственная академия, г. Горки

"14 " часов на гаседании специализированного совета К 006.02.01 по ведите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических чаук по специальности 03.00.1б-Генетика в Институте генетики и цитологии AHB iio адресу: 220734, г. Минск, уд. Ф. Ско-рины,. 27

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной науч1 )й библиоте ке им. Я. Коласа AHB.

Автореферат разослан " кС" ct-W1994 г.

Учейый секретарь специализированного совета,

кандидат биологических наук Е. В. Л0ВАН0К

кандидат биологических наук

П. А. ОРЛОВ

Защита диссертации состоится

в

Институт генети-и и цитологии AHB, 1994 г.

ОБШАЯ ХАГАКТЕРИСТИКА ¿АБОЛ

Актуальность тепы. Методы культуры клето! и тканеР in Itro нашли широкое применение в iгнетико-.ел.кционных исследования». Наибольшее распространение получил нетод культуры пыльников и никроспор. Андрогенез in vitro дает возможность рьализааии то-типотентчости клеток к регенерапии растения из микроспоры и пыльцевого гериз. 01«<рытие этого явления характеризуется как одно из самых значительных в биологии растений с номента публикации пердей работы по культуре пыл ликов зо лет назад (Guha s., Haheshwari S.С., 1964).

Уникальность рапса заключается в его способности к прямому пыльцевому эмбриоидогенесу в к/льтуре пыльников in vitro, в способности к вторичному змбриоидогенезу. в высокой .^генерационной способность отсутствии альбиниэна у гаплоидов, возможно, это связано с перманентной гетерозиготностью ¿той культуры. Рапс - при'хшнлй амФидиплоид, гибрид сурепииы и капусты (2п-38). Его гетерозигот.юсть и связанны* с ней иег.генон.]ый гетерозис обуславливают, скорее всего, повышгнную жизнеспособность энбриоудов и увеличивают выход гаплоидов,

Аналгз современного состояния исследований по иьдукиии гаплоидов у рапса показал, что еше остается нерешенный 1яд проблем. Недостаточно изучена генотипичесчая специфичность и механизмы индукиии эмбрисиг.огенеза в культуре пыльников m vitro. Остается проблема оптимизации условий зырашивания чо-нориых рас r'HKrt и методов предобработки изолированных пыльников. Не вылвг. >но значе"ие отдельных компонентов среды .-ля индукции новообразований и регенерации растений. Не выяснена ин-дупируюшч/ роль стрессовых экзогенных Факторов в культуре in vitro. Нуждаются j дальнейшей оптимизации методы дигаплоидиза-ции полученных гаплоидов. остается проблема эффективного, использования дигаплоидных линий в гетерозисной и реконбинапи* онной селекчии. эти ч другие нерешенные проблемы определяют актуальность глшх исследовании.

Цель и задачи исследования. Целью исследования является изучение особенностей андроген&за in Vito Brarslna пария, разработка методов инду<иии злбриоисогенеза и регенерации рас-

тений и создание селекиионно-ценных дигаплоидных линий.

В задачи исследования входило: 1. изучить генотипическ»ю специфичность пряного и вторичного энбриоидогенеза и регенерации гаплоидов в культуре иыльников in vitro Раиса; .

?.. изучить роль стрессовых температур г.ри внгашивании донорных растении на эффективность эмеркоидогенеза;

3. выявить влияние воздействия зкзоггнных Факторов в культуре пыльников in vitro, оптимизировать питательные среды;

4. усовершенствовать методы индукции дигаялоидов с испольиова-ниек колхицина, изучить возможность спонтанной дипаплоидизаиии;

5. провести селекционно-генетическое изучение созданных лигап-лоиьов и включить их в селекционный пропесс.

Научная новизна работы. Выявлена видовая и генстипическая специфичность рапса, основанная на его способности к пряному пыльцевой/ эибриоидогенезу. высокой регенерационкой спосоа-ности, в отсутствии альбинизма у гаплоидов. Исследовано влияние воздействия стрессовых температурных «акторов пси выращивании донорных растений на андрогекеэ in vitro Показана роль Физических экзогекьых Факторов на выход эмбриоияов. Экспериментально обоснованы кодификации питательных сред, способствующие значительному увеличению частоты эмбриоидогенеза. оптимизированы условия культивирования пыльников и методы ш.'джиии дмгаплоидов. Разработана система создания константных линии рапса в культуре пыльников in vitro, позволявшая сушестаенно повысить эффективность создания селекционно-ценных дигаплокаов для использования их в гетерозис.чсй и рекомбинаиноннол селекции и прямого создания сортов.

Практическая ценность работы. В результате проведенной работы созданы селекционно-ценные дигаплсилы рапса, характеризующиеся стабильностью, низким содержанием зруковой кислоты и глюкозинолатов, Наиъслее перспективные из них включены в селекционный процесс.

Апробация работа, основные положение яиссергаиионноя работы доложены на;

1. конференции "Стратегии и новые методы в селекции к семено-

вэдстве сельскохозяйственных культур" (г. Хоаино» 1994 г.).

2. Научной конференции "Генетическая инженерия и биотехнология" (г. Минск. 1994 г.).

3. заседаниях отдела биотехнологии и генетики БелНИИЗкК (г. Жедино. 1991-1994 гг).

По материалам диссертации опубликовано 3 научные работы.

Структура и обьен диссертации. Диссертация изложена на 115" страницах машинописного текста и состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов, списка литературы; включает 15 таблиц, г рисунка. Описок литературы содержит 184 наименования, из них I 38 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использование!. 6 сортообразиов и гибридов озимого рапса: ¿2 (отбор из copra Liradonna (Германия»i. 4436/86 (сортообразец из Польши). Lirabon (Германия). F1H3 <Отрад-ненский к Тисмениикий). F1H41 (Arabella (Германия! х S1 (Чехословакия)). F1H67 tLirabon (Германия) х Рох1б0 (Польша)); и 4 гибрида ярового рапса: е9881/8. 88601/7, 69eei/5. 3903/1. Семенной натериал предоставлен лабораторией селекции крестоцветных культур БелнИйЗиК. Исходный материал характеризуется различной урожзянсстыо, озимый - зимостойкостью, низким содержанием эруковои кислоты 1до 0.3у.) и глюкозинолатов (до 20 мниольлг с^млн).

Исследования выполнены в отделе биотехнологии и генетики Белорусского научно-исследовательского института земледелия и кормов в 1991-1994 гг. в основу исследований положен метод культуры пыльников in vitro рапса. Донорные растения опрашивали на опытном участке отдела биотехнологии и генетики, а также в камерах искусственного климата с двумя температурными режимами: 1. »1vc лень/чо'С нечь; чо'с лень/«5"С ночь rph !0-часовсм Фотопериоде. Выделение пыльников и различные манипуляции во рреня культивирования изолированного материала проводили в асептических условиях. Отбор бутонов производили на оптимальном для рапса ранней еднеялермой стадии развития микроспор. чго соответствует с.п?-дук-шим морфологическим признакам

бгтона: длина пшьниха равна г-э. 5 мн, лепестки равны от 1/3 до г/3 длины шяышка. Стериализаиню бутонов осушествлялн в г*-растворе гиоохлорнта натрия в течение 5-т нин. Перед посадкой изолированные бутоны подвергали обработке низкой положительной температурой (+Ч*С. 1-3 ,дня). после чего пыльники высаживали на питательные среды. В качестве контрольной среды использовали сред/ КА (Keller, Armstrong, t977) и ч ее модификации: агар заменялся на агароэу. глотании на г-шл-дминову» кислоту, глстамин и серии на гидролиэаты казеина и лактальбу-мина. Для стимулирования процесса андрогенега семена, изолированные бутоны подвергали действие -Физических факторов ( гаи-ма-издучение, лазерное излучение). для каждого эксперимента на питательные среды высаживали не менее 100 пыльников в грех по-вторностях. Культивирование пыльников осуществляли в тенноте при температуре »55*С u-з дня), а затем при «25*с до иоявленич з)1бс>иоидле (3-4 недели). После появлении, змбриоипов на поверхности пыльникового мевка. пробирки выставляли на свет до позеленения эмбриоидов; затем их пересаживали на среду HS murashiee. SKooe. 1962) с 1/2 содержанием по минеральным элементам и содержанием сахарозы ¿0 г/л для регенерации растений, для недифферен пированных энбриоидос использовали среду HS с Блп <<нг/л) и HVK (0.25 мг/л). Полученные укоренившиеся растения в Фазе г-з листьев подвергали дигапяоишзавии путей воздействия водным раствором колхицина на корневую систему (0.osz-раствор кслхииина. te часов; о. \г-раствор колхипяна. 4 часа). использовали метод спонтанной дигаплоидизаоии. Окрепшие растения высаживали в грунт, а во время цветения их изолировали.

Исходные сортообразоы и полученные дигаплоиды рзпса подвергали анализу по элементам продуктивности растения. Ныли определены основные биохинические показатели диг-ашшиаов и их исходных *орм.

• Выявлена роль отдельных "»акторов и их -взаимодействие в систене индукции дигаплопдов рапса с испольговаииеи дисперсионного анализа полученных экспериментальных данных, вычислены корреляции между показателями глемс-кгог структуры урожая и биохимическими признаками с частотой энриоицогеиеаа. Математическая обработка проводилась н.) персональной -"?ЬМ с использованием программы CSS. Start Graf)с.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУХЛЕНИЕ

I. Генетическая специфичность

изучение эмбриоидогенноа способности микроспор различных генотипов рапса в идентичных условиях выявило значительную вариабельность этого признака. Обращает на себя внннаиие белее высокая 1мбриоидогснная способность озимого рапса по сравнению с яровым <£-ис. t.2). Средняя частота эмбриоидов первого -чь. 4JZ, а второго - 1,ог'■'■ . Это связано, вероятно, с различием в образ* жизни тех и других Форм рапса. Озимые форны рапса Формируются в более стрессовых условиях, что способствует по-вымению уровня переключения развитая никроспор с ганетоФитного на спорофитныя путь. Яровые же Формы этим свойством обладают в меньшей мере, достоверные различия были также обнаружены среди отдельных представителей тех и других форм.

о наших исследованиях на первых этапах генотипы ярового рапса оказались неотзывчивыми на культуру пылькикоб in vitro. Модифицируя условия культивирования и питательные среды, удалось индуцировать змбриоидогенез у ярового Раиса, выход первичных эмбргоидов варьировал от 0,63 до 1.34;: (Рис. 2).

В зависимости от генотипа частота пыльцевого экриоидоге-неза у озимого рапса варьировала от 0. зо до 169. чту.. Статистический анализ полученных данных показывает достоверное влнянне генотипа донорных растении на анарогенеп in vitro <F Факт. -б. 70 > Fe£ -г. 40). Выход эмбриоидогенних пыльников изменялся от 0.30 до ю. о/, у озиного рапса, практически один энбриоидогенннй пыльник давал ю эмбриоидов. эти данные подтверждают вырод. что ключевым номентон в инлукпий анпроге-leca in vitro рапса является генотипическая специфичность icxi-дного материала

Энбрноидогеннзя способность гибрилсв F^ находится на юстаточно высоком уровне, хотя имеется существенное различие гежду ними. Поскольку геном Егаззкэ napus является перманент-о гетерозиготным, о чем говорилось выше, то и варьирование астоты прямого эмбрнологенеза ют 12.96 до 30, ЧЬ'-) у трех ибрияов Г у о?ич-:-го рапса также отражает влияние генотипа на

- лв -

150-

100 -

50 н

4«9/вв

•*) г,

Лнровом Г1 М образцы

П М1

г» ми

Ошод 1И1|ж.м1(Нмока.

Гис.1 Гвнотмпическ&я специфичность частоты эибрясвдогвнваа у озимого рапса

1.03

/---Ыукй/-—/

оброэии

I Оишл мери.МаОриочд.

РИа2 Генотяпическан специфичность частоты рмбриондогеиеэа у ярового рапса

- э -

энбриоипогенез. Иол/чения селекционно-ценны* дигаплоидов у гибридов способствует Формирование у пик необычных рекомби-кзнтных гамет, использование культуры пыльников и микроспор

увеличивает их реализацию.

Для индукции регенерантов первичные змбрисиды переносили на среду HS (с i/г-содержанием но минеральным элементам!. Часть эмбриоидов регенерировала растения. Формируя побеги и корни, в наших исследованиях частота получения растений из первичных эмбриоидсв варьировала от 12.96 до 69.69:' (Рис. 3). Причем наибольшую регекераиионну» способность показал гисрид F1H3. в -ni бррмя как у наиболее эмбриоидогенкого образца 22 она была почти в 2 раза меньше. Таким образом высокий эмбриои-догенный потенциал среди лонорного материала не всегда соответствует высокому уровню прямой регенераиии. высокая регенерационная способность гибридов обусловлена скорее всего их гетерозиготным состояние» и проявлением эффекта гетерозиса по регенерации. Результаты ндгаих исследований согласуются с исследованиями Keller v. A. (1964). Chbone P. V. et al. П98Ч). которые показали, что частота получения прямых регекерангов находится под генетическим контролем и прямой эмбриоидогенез и регенерация контролируется разными генетическими системами.

Аномальные эмбриоиды развивались в недифференцированный каллу: в Биде утолшенногс гипокотиля и сросшихся котиледонов. Гияокотильные зкепланты в оптимальных условиях инкубирования способны заклааыйать вторичные эмбриеиды. тем самым повышая суммарный выход гаплоидных регенерантов. Метод вторичного эмб-риокдогенеза разработали Thomas Е.. Wenzel й.(19751. Коэффициент размножения вторичных эмбриоидов в наших исследованиях ьо-выиалеч при пассировании аномальных эмбриоидов на среде "HS с БАП и НУК. Вторичные змбриоиды при субкультивирсвании на свежих сгедах после 7-4-недельного культивирования регенерировали растения. Коэффициент размножения вторичных эмбриоидов варь-игоьгл от 2.45 до i7,à& у озимого рапса. Причем, генотип, показавший максимальную прямую регенераиионну» способность, имел самый большой коэффициент размножения вторичных эмбриоидов. Наблюдалась газисиместь ре генерационной способности генотипов и иклукиии вторичны!: .змбриондов. Таким образом, гены, повышающие прямую регенераиьт. растении. способствуют вторичному змбриоило-

-id-

ea Прк_ pvT. X ОН Kvjç.poaun. ■ ЕШ2 Uюр. per. Я

Рис.Э Генотнпхчвская специфичность частоты регенерации у озимого р^пса

Полпмм услоиня + 15'д«мь/-*-10'ночь + 10 д«ь/+Ь ноч-

Температуре в *С ,, i!

CÍ23 'lue—lu эибриимдиг«»!.

r¡ tu4 Влияние температуры выр&щжяання донорных растений ранга на и»бр*опдогбнеэ

- TI

генез/. Способность Формировать вторичные змбриоиды и регене-уанты сохранялась в течение год»*, этот еенсден но*ет быть использован в селекционных программах и для полуц.ч».л селгкиц-онго ценных генотипов рапса при генетичесхих манипуляций «i условиях изолированной культуры. Выход вторичных регенерантов на loo 'ксплзнтов варьировал от 31.91 до I2d,57x (Рис. 3). Характерно то. что наибольшей вторичной регенерашюнной способностью обладал гибрид V1H3, который инел наибольшую прямую ре-генераиионную способность, а также наибольшим коэффициент размножения вторичных энбриоидов.

Генетические систечы. контролирующие регекерацишныс процессы из энбриоидов в культуре пь'пьннкоа in vitro, .-.епст- . в уют на все эташ создания дигаплслдов. и. следовательно, генотшшческая специфичность исходного материала является определявшей в эффективности метода культуры пыльнчков m vj tro рапса. ¡

¿. экзогенные >г'дуиируюиио Факторы ч процессе создания пи-апиоидов. ,.

Донсрные растения окрашивали в полевых условиях и а камерах искусственного климата с двумя температурными режимами.

частота прямого пыльцевого г чбрксидогенеза почти ч 6 раз „-чаше

t

в камере искусственногл климата с более низким температурным режином. чем в полевых условиях и в камерг с более высоким температурным режимом ,?ис. 4). лиали- полученных д?чных дает возможность '•дзлагь выгод о достоверном влиянии на лндрогеиез in vitro стрессовых условий при выращивании сонорных растения , (РФакт. -4,65 > Fos =4.03) Низкие температуры меняют программу развития микроспор, способствует увеличению частот! экериои-догеннык Р-зерен, тем санын увеличивая выход гаплоидов. . |

Хоподовая обработка изолированных бутокоз низкими положительными температурами <+4*с. 1-3 дня) и культивирование пьиь- , чипов затеи при повышентых темлерат^ах (+33 °с.С. 3-4 неаели) завершает процесс дифференциации эмбриоидогек-; них микроспор. у озимого рапсг по хмвнрним ,с коптролок выход змбриоидов увеличился в , $ раз*; '(Риф 5 репса эта т_мператур1Ые вони «мем* е!ва вольш^е. Чнл>Ц]тРУ^>йа«!'

(О

у

В.54

--Д5»--------

иОйМЯтк,

— vpshwït*-?* txm&.i/tw«

— U ья&г/Ш'т

0.31

Хон:рсль

ввЯ Oaxuwi

fuie

i-3 ami

I (ДЯ1С

Рис.

1'ОЛЬ ХОЛОДОВОЙ OOjnrtOTKl! пплышков на

частот/ эмбриэядогонога рапса

4

Muctoiu эмОрионао! енеио. %

0

КА КА(о)

'«'Я>Ж

КА(3) КЛ(1550) ¡<Л(Гь<Ю) КА(1700) *Aft«oo)

Пиюте/н,ннр среди' Рис. 6 Влипну состава питательных сш на эмбриовдогвноз озимого ранга

значение. что. возможно. связано с их генотилической специфичностью. эериоидогенкый потенциал ликроспор ярового рапса был увеличен в 5 раз по сравнению с контролем, таким образом температурные иоки способствуют переключению развития микроспор с нормального ганетоФитного пути на спороФитный путь развитая и увеличению соответственно частоты пыльиевого энбркоидогенеза.

Мы проводили обработку ганиа-лучами изолированных бутонов озимого и ярового рапса в дозах от 30 до во Гр. семян перед посалкон в дозах от 100 до 300 Гр с целью увеличения выходэ эмбриоидов. но достоверного увеличения частоты пкльдевого эмб-риоидогенеза не наблюдалось. Была предпринята попытка изучения влияния лучей лазера на андрсгенез in vitro рапса. Лля этого лучами лазера (длина волны - С32.в ни. мощность - 50 мВт/кв. см) обрабатывали бутоны (Z-Z часа в течение 3 дней) и изолированные пыльники (2-3 часа в день, в течение первых б сут. культиеироваиия). Воздействие лазера негативно сказывается на процессе эмбриоидогенсза в культуре пыльников in vitro озимого и ярового рапса.

Лля успешного культивирования изолированных пыльников вахным моментом является подбор оптимального состава питательной среди. Наличие агара в питательной среде приводит к изменению Физической и химической характеристики среды в связи с увеличением в ней токсичных примесей, вводиных ьнесге с агаром (Debereh, 1903). Нами бил заменен агар на более очинённую ага-роя/. ири этом частота эмбрноидсгенеза увеличилась с 3.42 до

ч.твя <гис. б).

При замен!-: гдютанина на глютачииовую кислоту достоверного увеличения частоты эмбрисидогенеза не наблюдалось.

Была произведена замена аминокисло.- (сериил и глютанина) на гиаролизаты лактальбумина и казеина в различных концентрациях, причем наблюдалось достоаегное увеличение выхода эибри-оидов как у озимого так и у ярового рапса (Рис. б.7!. Наиболее оптимальной концентрацией гидролизата лактальбумина для ярового рапса была концентрация 7ЬО мг/л. частота пыльцевого эмбриои-дсгенеза по ср-гйкешш с контролем увеличилась почти в 3 раз.

V осиного рапса частота эмб.жоидогенезэ на среде с концентрацией гидрслизатд лактздьб/мина 500 мг/л была равной I в, 3, чю более чем э 5 раз превосходит выход энвгис тдов на

- ГА -

Hacwia »мбриоил« «нюо. X

1.4 if "

Гкнспельние среды

Рис.7 Елкяняо состав» питательных сред на емОриоидоганеа ярового рапса

со so 10

:ю ¡¡о ю о

Гис.О Эффективность дшгаплоядхэацяи оаимого рапса методом колхкцмнированхя

% Ф*ТЛИПЛМ> ponnwH

__________ /----

- — —........ ------- ; :

/ /

/ „ ✓ •■ ......

V.

.4«« ¡РУТ •■ .•''У*

/ / / У

Кож рол. ОД|ЪХ р-р (18 час.) U.IX р-р (4 час.)

контрольной среде. Среда с зоо иг/л гмдролизата казеина показала высокую частоту эмбриоилоген^эа (13.45 ¡о. для озимого рапса рекомендованы кгльтурадьныо среды с заменой серина и глютамина на гидрслизаты казеина к лантальбумина «500 нг/а). Анализируя влияние различыых модификаций контрольной среды на частоту эквриоикогенеза у Вгатса паи» каин была показана роль отдельных ее компонентов, исследуя влияние модификации культурзльных сред на уровень эмвриоидогенеза. установили, что их состав с высоким уровнем достоверности влияет на данный признак (РФакт. -16. 90 > =4.03).

Для переведа гаплоидных растений (П--19) на диплоидный уровень (гп-30) применяли колхицин. действие которого строго специфично и заключается в подавлении веретена деления. Полученные регенеранты в Фазе 3-4 листьев подвергали обработке кояхииина. часть проростков не обрабатывали, исспчдуя возкс#-ность спонтанной пояиплоидизаиии. которая может достигаться благодаря редупликации хромосом, слиянию ядер, а также в результате формирования микроспор с кередуиированным числом хромосом. Морфологические особенности полученных растении-регене-раитов и их Фертильность являются надежным критерием эффективности дигаплоидизаиии. дигаплоиды. как правило. Фертильны и Формируй? стручки о семенлни Стерильные, елгбораэзитые растений с меньшими размерами вегетативных и репродуктивных органов являются пплоидани. данные показизают (Рис. в» преимущества второго способа обработки, то есть относительно высокая концентрация и непродолжительная окспозииия увеличивают выход ди-гаплоидсв более чем в г раза по сравнению с более низкой кон-ие.мтрзциеи и длительной экспозицией. необходимо отметить достаточно высокий уровень спонтанной „иплоилюаиии у гаплоидов рапег (19.

3. селекционно-генетическое изучение подученных дигаплои-дов рапса.

Учшыьая то. что акдрогенные дигаплоиды предст-зеляют со-¿•.'й результат!» рокомбинаиш; донор»: ix растений, нани были иэу-чрны основные количественные и качественные признаки полученных ли'.чплоидних линий и их исходных Форн. Данные по гчме.чтам

Условия выгапшвакил донлрных растений: мо*с день/*Э*с ' ночь, 15-часовой ♦отопериод

Стадия отбора бутонов с растении • ранняя одноядерная стадия развития, микроспор (величина пыльника £-3.5 мм, величина лепестка равна 1/з-г/з величины пыльника.

Предобработка изолированных бутонов при температуре *4*с. . 1-} дня.

Питательная среда для индукиии эмбриоидогенеза: среда КА с заменой глютамина и серина на 500 мг/л гидролиз з га ка зеина или гидролиэата лактальбумина для озимого рапса; на 750 мг/л гидролизата лактальбумина для ярового рапса.

Питательные среды для регенерации растении: среда ,43 с 1/2-содержания по минеральным элементам для дифференцированных энбгиоидое и среда из с бап (i мг/я) и нук (о. г; мг/л) для недифференцированных эмбриоидов.

Диглплоидизация гаплоидов: обработка рггенеюнтов в фдг>е{ 3-4 листьев о.1^раствором колхиаина. экспозиция 4 часа, спонтанная дигаплоидизаиия.

1ШШШ ГШ____ПШ

Высадка регенерантов в ионитиую почву. !

________________________\

Рис.9. Система культуры пыльников ш уиго рапса.

продуктивности растения были подвергнута сдно+акторноиг дисперсионному анализу Подобранный исходник материал характеризовался значительными различиями по основным количественным признакам. Дигаплоиды характеризуются высокой зыровнениостыо по анализируемом признакан. При сравнении количественных признаков у исходных форм и полученных от них дигаплоидов отмечено варьирование этих показателей у дигаплоидов в ту и другую сторону от исходных форм, эп: данные дают возможность выбрать подходящие генотипы для включения их в селекционный процесс.

Содержание эруковой кислота у исходных Форм и большинства дигаплоидов было равным кулю и только у трех дигаплоидов превышало допустимое значение. По содержанию глюксзинолатов исходный материал характеризовался значительными различиями, наблюдалось варьирование данного показатели у дигаплоидов по сравнению с исходными Формами. Характерно снижение содержания масла к увеличения содержания белка у дигаплоидов по сравнению с исходными Формами, наела и белок э семенах рзпеа - антагонисты (PathaK г.ч а;., 1973). а метод культуры пыльников in vitro требует мобилизации всех запасных белкоа для регенерааи-онных процессов.

на основе полученных результатов исследований нани предложена система культуры пыльников xn vitro рааса "Рис.V).

выводы

1. видовой специфичностью Erassica napus в культуре пыль-никоь it: vitro является его способность к индукаии прямого пыльцевого эмбриоидогенеза и регенерации, а также в определенных условиях к индукции вторичного экбу-иоидегенеза.

2. г?нотипическая специфичность исходного натериала является определявшей н эффективности метода культуры пыльников in v)tro Более высокой эмбриоидогенной способностью обладает озимыи рапс по ерзвнению с яровым, а также имеется достоверное различие частоты зибркоидогекеза тех и других Форм в зависимости от гонстипа.

3. показана генотиническач специфичность индукций прямых регенерантов и вторичных эмориоидов; отсутствие связи нэ^ду уровнем прямого пыльцевого эмбгиоидогенеза и пропессок регеае"

- IP -

рагич указывает на разный их генетический контроль.

4. Стрессовые условия <+10°с день/*5*с ночь, 16-часовой Фотопериод) при вырашивэнин донориых растений способствуют

- увеличению вь:?:ода энбриоидов в культуре пыльников in vitro parca¡ воздействие температурный шокоь на изолированные -ыль-ники (+4°с, 1-3 дня! »35*С. 1-3 дня) способствует переключению разьитю микроспор с гачетофитного на спорофитный путь развития и повышению частоты энириоидогенеза.

5. В системе индукции дигаплоидов -n vitro сушестзенную роль играют отдельные компоненты культтральной среды, в частности. занена агара на агарозу достоверно увеличивает выход ¿мбриоидов! замена гяютанина и серина на гидролизаты лакталь-бунина и казеина в коицентргчии 500 мг/л ножет быть реконендо-

( вака для оэинто рапса, а для ярового рапга - гидролизат лак-^ тальеумина в концентрации 750 мг/л.

6. ЭФФектквкчм способом дигаплоидизаили является нетод обработки корневой системы гаплоидов в Ф'.зе 34 «шстьев О, U-растиром колхиччна. экспсзииия 4 часа; ье следует пренебрегать спонтанной диплоидизаииеи гаплоидов Finca.

(. Р"сработана эффективная система получения дигаплоидов в культуре ьыльг.йков m vitro рапса, основанная на использовании генстипической специфичности эьбриоидогенных и регенера.;и-онных процессов, стрессовых ус. овий выраиивання. донорных растении, тенпературнах токов при кул* тиви^оваки.1 пыг.ьннкоз и оптимальных питательных сред.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Лб адресная т. в., Морозова в. в. Индукция, пыльиевого энбри-оиген'за в культурр пыльников panca//vi съезд Белорусского общества генетиков и селекционеров. Горки, 1992. -с. 20

2. Абадовская т.п.. Гор :ей И. А. Прямой пыльцевой эмбриогенез л индукции дигаплоидов рапса//Тез. докл. научной конференции, стратегии и новые нетоды в сечекпии и семеноводстве сельскохозяйственных культур. Жодлно. 1994. -с. 46.

3. Абадовская Т. в.. Гордой и. а. Роль гегог».па и индуиируотих Факторов в культуре пыльников оэиного рапс.а//Тез. докл. научной конференции. Генетическая инженерия и биотехнология, йинск. 1994. -с. 3.