Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Совершенствование метода культивирования оплодотворенных ин витро эмбрионов крупного рогатого скота

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование метода культивирования оплодотворенных ин витро эмбрионов крупного рогатого скота"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХООЯЯСТВЕННЫХ НАУК НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ

На правах рукописи .

ШРЕПЮ МЕЛО Вильма

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДА КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ОПЛОДОТВОРЕННЫХ ИН ВИГРО ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

Оа 00.23. Биотехнология

Авторефе рат Диссертации яа соискание учено* степени кандидата билогических наук

МОСКВА - 1992

Диссертационная работа выполнена в научно-производственной биотехнологическом центре по животноводству (биотехцентр).

Научный руководитель - доктор биологических наук,

профессор М. И. Прокофьев

Официальные оппоненты - доктор биологических наук.

Кудрявцев И. В. • кандидат биологических наук, Захарченко ЕЕ

Ведущее учреждение: Московский Государственный Университет,

в..... час. на заседании специализированного совета д. ОБО. 40.01

ори Российском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии

Адрес: 127253, г. Москва, ух Псковская, дом 12, корпус 4.

О диссертацией можно ознакошггься в библиотеке института

кафедра эмбриологии

Защита диссертации состоится

Автореферат разослан

1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета каидхдет биологических йаук

С. К Мелхяова

- 1 -

I. Общая характеристика работы.

Актуальность темы: В течение ряда последних лет для улучшения генетического потенциала крупного рогатого скота широко применяют новый метод разведения животных - трансплантацию эмбрионов. Он позволяет получать от генетичесют выдающейся коровы-донора 20 и более эмбрионов в год. Это достигается тем, что самка освобождается от необходимости плодоношения и вырашивания потомства в послеотельный период. Кроме того, проводится стимуляция самок с целью увеличения выхода яйцеклеток, которые затем извлекает на стадии ранних зародышей и пересаживают менее ценным в генетическом отношении реципиентам. Таким образом, при применении метода трансплантации эмбрионов можно эффективно испрльзовать высококачественных самок как доноров эмбрионов.

Важным фактором, сдерживающим широгае применение этого мето- . да в практике разведения сельскохозяйственных животных, является низкий выход эмбрионов от коровы-донора (3-4 эмбриона на одно извлечение) и высокая их стоимость вследствие дороговизны гормональных препаратов для стимуляции полиовуляции и необходимости передержки коров-доноров.

Устранение этого сдерживающего фактора ученые видят в разработке метода созревания и оплодотворения яйцеклеток крупного рогатого скота вне организма С разработкой этого метода яичники, полученные с мясокомбината от телок и высокопродуктивных коров, выбракованных по причинам, не связанным о нарушением воспроизводительной функции, могли бы бьггь подходящим и дешевым источником ооцитов. Последние можно доводить до зрелости, оплодотворять и культивировать ин витро до достижения ими такой стадии развития.

на которой возможна их пересадка.

Достижения последних лет в получении потомства крупного рогатого скота из яйцеклеток, созревших в культуре (Brackett et al., 1982, Эрнст Л. К. и др., 1983, Hanada et al. , 1986), явились подтверждением,возможности создания таких условий, которые способны обеспечить полноценное созревание по крайней мере части яйцеклеток, помещенных в культуру.

Однако эффективность получения оплодотворенных ин витро эмбрионов на стадии, пригодной для трансплантации, ещг неудовлетворительная. В большинстве лабораторий мира получение морул и блас-тоцист из оплодотворенных ин витро яйцеклеток составляет не более 20-25Х. Отсюда вытекает необходимость дальнейших исследований по совершенствованию метода оплодотворения яйцеклеток крупного рогатого скота ин витро, включая использование новых культуральных сред и добавок к ним, культивирование на монослое с соматическими клетками, подбор спермы быков и другие.

Большим преимуществом технологии трансплантации эмбрионов является то, что полученные после трансплантации телята скорее приспосабливаются к условиям существования, что очень ваяно для развития скотоводства в развивашкхоя странах, где необходим ценный генетический материал.

Колумбия по сравнению с другими тропическими странами имеет то преимущество, что обладает различными местными породами крупного рогатого скота, распространенными по всей территории. Эти породы хотя и представляют собой большую ценность для будущего развития скотоводства, быстро исчезают иэ национального облика. Это частично объясняется недостатком знаний об их истинной генетической ценности и об их возможном вкладе в развитие скотоводства страны. Тагам образом, техника получения ооцитов ив янч-

ников коров, условия их созревания, оплодотворения и культивирования эмбрионов могут сказаться очень полезными для моей страны и внести определенный вклад в решение задач, которые в настоящее время стоят перед специалистами в этой области.

Цель и задачи исследований. Целью работы явилось совершенствование метода культивирования оплодотворенных ин витро эмбрионов крупного рогатого скота для их последующей трансплантации.

В процессе работы предстояло решить следующие конкретные задачи:

1. Усовершенствовать метод культивирования ранних эмбрионов коров, полученных из яйцеклеток, созревших и оплодотворенных вне организма, при совместном культивировании с монослоем эпителия яйцевода и гранулезных клеток.

2. Сравнительное изучение влияния культуральных сред и других материалов, применяемых при культивировании яйцеклеток, на их созревание, оплодотворение и развитие ин витро.

3. Изучение индивидуальных различий между коровами-донорами и медду быками-производителями по качеству гамет.

4. Получение телят после пересадки эмбрионов, полученных из созревших и оплодотворенных ин витро ооцитов.

Научная новизна работы. Продемонстрирована возможность преодоления митотического блока развития оплодотворенных ин витро эмбрионов крупного рогатого скота на 8-16-клеточной стадии и получения высокой эффективности достижения ими стадии морулы и бластоцисты путем использования ыонослоя эпителиальных клеток яйцевода и гранулезных клеток.

Впервые показана одинаковая эффективность созревания, оплодотворения и развития ранних эмбрионов крупного рогатого скота в культуральных средах, пластиковых чашках и минеральном масле оте-

чественного и импортного производства.

. Получены новые научные факты, свидетельствующие о том, что для объективной оценки оплодотворяющей способности быка с использованием метода оплодотворения ин витро необходимо учитывать три критерия: процент дробления яйцеклеток к числу осемененных ооци-тов, скорость развития оплодотворенных ин витро яйцеклеток через двое суток после осеменения и процент эмбрионов, достигших стадии морулы и бластоцисты. Впервые выявлена вависимость скорости развития оплодотворенных ин витро эмбрионов через 44-46 часов после осеменения и дальнейшим развитием их до стадии морулы и бласто-цистк

Практическая значимость работы. Усовершенствование методики культивирования оплодотворенных ин витро эмбрионов крупного рогатого скота с применением монослоя эпителиальных клеток яйцевода обеспечило получение 47.7Х морул и бластоцист к числу дробящихся яйцеклеток, что делает ее экономически целесообразной для использования в практике трансплантации эмбрионов. В результате выявленной зависимости скорости развития оплодотворенных ин витро эмбрионов с процентом достижения ими стадии морулы и бластоцисты предложен метод селекции дробящихся яйцеклеток через двое суток после осеменения, позволявший получать высокий процент (69,2 -64,ЗХ) эмбрионов, пригодных для пересадки. Предложен новый быстрый метод определения оплдотворяющей способности спермы быков путем оплодотворения ин витро с использованием не одного, как это было известно, а трех критериев оценки. Получение полноценных эмбрионов методом оплодотворения ия витро подтверждено продолжением ю развития после пересадки реципиентам и рождением жизнеспособного потомства.

Апробация работа Результаты, представленные в работе, были

доложены на Всесоюзной конференции молодых ученых в г.Полтаве, 1991 г.; в Научно-производственном биотехнологическом центре по животноводству, 1992 г.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, выводов, обсуждения и практических предложений. Цифровой материал представлен в 15 таблицах, иллюстрирован фотографиями. Список литературы включает 124 источник отечественных и зарубежных авторов.

Извлечение ооцитов. Яичники и яйцеводы коров доставляли с Ыосковского мясокомбината в термосе при температуре 30-35'С в течение 1-1,5 часов. Ооциты извлекали аспирацией с помощью шприца и иглы типа "Рекорд" N 12 в среду К-199 о добавлением 52 феталь-' ной сыворотки коров, канамицина и гепарина. Для культивирования отбирали ооциты с компактной кумулюсной массой.

Созревание ооцитов. Отобранные для опыта ооциты помешали в культуральную среду ТСИ-199 с добавлением 202 астральной сыворотки коров и канамицина, по 20-30 яйцеклеток в капли с 200 мкл среды под слоем минерального масла. Ооциты культивировали при 38,5 - 39 С в увлажненной атмосфере 5Х СО^. 6Х 0А и 90Х Н^в течение 22-24 часов.

Капацитация спермы. Для оплодотворения использовали замороженную сперму. Соломинку с замороженной спермой оттаивали в водяной бане при температуре 39-40*С в течение 10 секунд. Для капаци-тации спермы использовали модифицированный метод РагпзЬ с соавторами (1986г.)

2. Материал и методы исследований.

Оплодотворение ооцитов. Оплодотворение созревших ооцитов проводили в микрокапельках среды ГАЬР, рН 7,6 - 7,8, покрытых минеральным или вазелиновым маслом. Созревшие ооциты частично отделяли • от кумулюсных клеток путем многократного промывания их пипеткой в среде ТСМ-199. В капельки помещали по 20-30 ооцитов и туда лз добавляли по 50 мкл спермы. Таким образом, концентрация спермы была 2*10*спермиев/мл.

Культивирование эмбрионов. Череэ 20 часов культивирования со спермой ооциты отмывали в М-199 среде и помещали в культуру клеток эпителия яйцевода коров либо на монослой гранулезных клеток. Смену среды проводили через каждые 48 часов, а все культивирование продолжалось 7 дней.

Получение монослоя эпителия яйцевода. Яйцеводы доставляли одновременно с яичниками. Эпителий яйцевода извлекали двумя способами: а) промыванием яйцеводов средой и-199 со стороны бахромки и б) яйцевод препарировали, трижды промывали в среде М-199 и получали эпителиальнные клетки выдавливанием их из просвета яйцевода в среду М-199 давящим поглаживанием яйцевода от центра к концу тупой стороной скальпеля. Эпителий собирали в коническую побирку и дважды отмывали его средой. Культивирование эпителия проводили в 200 мкл каплях среды М-199 с 151 эстральной сыворотки коров с добавлением канамицина (1мш/ил), под минеральным или вазелиновым маслом во влажной атмосфере БХ СОА в воздухе или 5Х и 90Х .

ГЬлучение монослоя гранулезных клеток. Монослой гранулезных клеток формировался в процессе культивирования клетками, мигрировавшими из кусков гранулегы, прикрепившихся ко дну чаши Петри и из клеток, диспергированных в среде при пипетировании яйцеклеток перед оплодотворением. Культивирование гранулезных клеток осуществляли в покрытых минеральным маслом 0,2 мл каплях среды

М-199 с 201 астральной сыворотки коров с добавленном канамицина (1 мкг/мл), в СО инкубаторе при температуре 39* С, в т.ечение 3-4 суток в зависимости от условий эксперимента.

Трансплантация зародышей. Для пересадки зародышей использовали различные модифицированные катетеры Кассу, которые в прямом назначении используются для искусственного осеменения. Зародыш заправляли в тонкую соломину длиной 8 см и диаметром 1 мм. . Заправленную соломину стерильным пинцетом вставляли в наконечник, который присоединяли к основной трубке прибора с поршнем и закрывали защитным чехлом.

Перед пересадкой зародышей животное фиксировали в станке, хвост привязывали бинтом к отейникку. Прямую кишку освобождали от содержимого. Регсгально определяли, в каком яичнике находилось желтое тело и его состояние. Наружные половые органы и область промежности тщательно мыли теплой водой с мылом, затем дезинфицировали 962-ным этанолом или 22-ным раствором диоцида.

Катетер, введенный во влагалище, осторожно под ректальным контролем не травмируя слизистую оболочку, продвигали через шейку матки. Катетер вводили ближе к верхушке рога матки, прилегающего к яичнику с желтым телом. После пересадки зародышей, животным-реципиентам обеспечивали оптимальные условия кормления и содержания. Через два месяца после пересадки проводили диагностику беременности ректальным методом. Окончательным показателем эффективности пересадок зародышей являлись роды у животных реципиентов.

Статистическую обработку полученных результатов проводили по методу больпих и маши выборок /Е. К. Мгркурьева, 1970/ .

- 8 -

3. Результаты исследований.

3.1. Изучение возможности преодоления митотического блока развития ранних эмбрионов крупного рогатого скота при культивировании ин витро.

3.1.1. Сравнение развития яйцеклеток коров, созревших и

оплодотворенных ин витро на монослое эпителия яйцевода и на монослое гранулезных клеток.

Исследования были проведены на оплодотворенных ин витро зиготах коров. Были приготовлены 2-х дневные культуры эпителиальных клеток яйцевода коров. В культуру этих клеток были помещены зиготы коров для изучения способности развития эмбрионов коров до стадии бластоцисты. Одновременно было исследовано развитие эмбрионов на гранулезе. Монослой гранулезных клеток был получен из клеток, прикрепляющихся ко дну чашки при культивировании ооцитов во время созревания.

В таблице 1 представлены результаты исследования черев 7 дней совместного культивирования эмбрионов с монослоем клеток эпителия яйцевода и гранулезных клеток. Процент эмбрионов, развившихся до стадии морулы, составил 37,22 и 35,22 соответственно, а стадии бластоцисты достигли соответственно 10,62 и 2,82 эмбрионов. Не было отмечено достоверной разницы в количестве эмбрионов, развившихся до предимплантационных стадий в обеих группах (Р> 0,05).

Вместе с тем прослеживается убедительная тенденция увеличения процента эмбрионов, достигших стадии бластоцисты при культивировании ии витро на шнослое эпителиальных клеток (10,52) по

сравнению с культивированными на монослое гранулезных клеток (2.8Х). Можно полагать, что культивирование ранних эмбрионов .крупного рогатого скота на эпителии яйцевода, как более близкой к естественной среде их развития ин виво, по сравнению с гранулезными клетками, создает более оптимальные условия для ранних эмбрионов и обеспечивает их развитие ин витро до более продвинутых стадий.

Таблица 1.

Сравнение эффективности развития зародышей коров в культуре эпителия и на гранулезе.

: Дробящиеся :_Из них на стадии

Показатели : зародыши : морулы._: бластоцисты

: : п : X : п : X

На эпителии

Яйцевода 86 32 37,2 9 10,5

На гранулезе . 71 25 35,2 2 2,8

Цитологический анализ (таблица 2) эмбрионов, достигших стадии морулы проводили на тотальных фиксированных препаратах, окрашенных IX раствором лакмоида. Исследование на 6 сутки после оплодотворения показало, что эмбрионы, достигшие стадии морулы, представляют весьма гетерогенную популяцию, в которой представлены как морулы на стадии бластомеров, так и более продвинутые в своем развитии. Максимальное число бластомеров у проанализированных эмбрионов (п-9) составило 52. Среднее число митозов, приходящееся на один . эмбрион, составило 1,8 + 1,0. Зародыши имели нормальную структу-

- 10 -

ру, число ядер соответствовало числу бластомеров.

3.1.2. Цитологический анализ оплодотворенных ин витро эмбрионов крупного рогатого скота

Таблица 2.

Цитологический анализ зародышей на стадии морулы, полученных ин витро на 6-7 сутки после осеменения.

Возраст зародыша : Число : Число : Число : Среднее число

(суток после осе- : бластомеров: зародышей: митозов : митозов

менения) 5 • : :

6 суток > 20 9 16 1,8 + 1.0

(20-52)

7 суток > 32 17 76 4,6 + 2,8

(32-70)

3.2. Сравнительное изучение влияния культуральных сред и других материалов, применяемых при культивировании яйцеклеток, на их созревание, оплодотворение и развитие ин витро.

Э.2.1. Эффективность созревания и оплодотворения ин витро ооцитов коров и культивирование эародыдей при использовании-среды 189 отечественного и импортного производства

Яйцеклетки из яичников убойных коров культивировали и оплодотворяли ин витро по стандартной для лаборатории методике. Куль-

тивирование яйцеклеток и эмбрионов проводили в среде М-199 отечественного производства - института полиомиелита и вирусных энцефалитов и зарубежного - фирмы Флеу лабораторий. Эффективность развития оценивали через 42-46 часов после оплодотворения по числу дробящихся эмбрионов и через 7 суток после оплодотворения по числу эмбрионов,, достигших стадии морули-бластоцисты.

Таблица 3.

Эффективность созревания ооцитов коров по способности развития после оплодотворения в среде отечественного и импортного производства.

Культуральная среда

Число : Из них ооцитов: дробилось

В том числе

на стадии 2-х _бластомеров

п

Институт

полиомиелита 303 177 Б8,4 33 18,6

Флеу

лабораторие 309 183 59,2 37 20,2

Как видно из таблицы 3 эффективность созревания и культивирования в среде 199 отечественного и импортного производства не отличается от таковой в среде 199 производства Флеу лабораторие. Число яйцеклеток, способных к формированию дробящихся зародышей, составляет 58,АХ и 59,2Х после созревания в среде 199 института полиомиелита и Флеу лабораторие соответственно. Причем, число зародышей с низким потенциалом развития (стадии 2-х бластомеров через 42-46 часов после оплодотворения) также практически одинаково

и составляет 18,6Х и 20,27. соответственно.

Таким образом, результаты этих экспериментов подтверждают одинаковую качественную характеристику культуральной среды М-199 отечественного производства и производства фирмы Флеу лабораторие.

3.2.2. Эффективность созревания и оплодотворения ооцитов коров и культивирования зародышей при использовании одноразовых пластиковых чашек Петри отечественного и импортного производства

Таблица 4

Эффективность созревания и оплодотворения ооцитов коров ин витро в чашах Петри Ш "Ленмедполимер" и производства фирмы "Фалкон" США

Фирма,производящая : Чие-чашки Петри : до

: ооци-тов

Из них

В том числе

дробились: на стадии 2-х кле-:ток черев 42-46 * : часов после опло-: дотворения

п

валкой 301 201 66,8 28 13,9

ГО "Ленмедполимер" 265 165 62,3 25 15,2

Как видно из таблицы 4, невыявлено различий в эффективности развития эьйриовов из ооцитов, сое ре вша и оплодотворенных ин вит

ро, при использовании одноразовых чашек Петри отечественного образца по сравнению с зарубежным аналогом: число яйцеклеток, сформировавших дробящихся зародышей к 42-46 часам после оплодотворения достигало 62,32 при использовании чашек Петри отечественного производства по сравнению с 66,81 фирмы <Салкон. Кроме того, число эмбрионов, достигших к этому времени лишь стадии 2-х бластомеров, то есть, с низкой способностью к дальнейшему развитию, не превышало 15,22 и 13,92 соответственно. ^

3.2.3. Использование минерального масла различного производства при культивировании яйцеклеток и эмбрионов крупного.рогатого скота

Таблица 5.

Влияние минерального масла на полноценность созревания ооцитов, эффективность их оплодотворения и последующего развития.

: Число : Число дробящихся-: . Из них на стадии Масло : ооцитов: зародышей .: __ мэруды-бластоцисты : : Г) : X : П : 2

ВазёЛИНовое 90 37 41,1 9 . 24,3

Минеральное

"Сигма" 82 37 45,1 13 . 35,1

Как видно из таблицы 5 при исследовании минерального масла на полноценность созревания ооцитов коров, эффективность их оплодотворения и последуюцего развития, оказалось, что нет существенной разницы как при использовании вазелинового масла так и минерального фирмы "Сигма". Как видно из таблицы 5 при использовании вазелинового масла отечественного производства и минерального фирмы "Сигма" соответственно дробились 41,IX и 45,IX яйцеклеток, а стадии морулы-бластоцисты достигали 24,ЗХ и 35,IX эмбрионов. Отсюда можно заключить, что вазелиновое масло не содержит каких-либо примесей, оказывающих негативное влияние на развитие ранних эмбрионов крупного рогатого скота

3.3. Способность зародышей к развитию до стадии морулы и бластоцисты в зависимости от стадии развития через 44-46 часов после оплодотворения.

Анализ результатов культивирования зародышей ин витро показало, что зародыши, которые к 44-46 часам после оплодотворения достигли стадии 4-х или 6-и и более бластомеров, обладают одинаковой способностью к формированию морулььбластоцисты (64.3Х и 59,2Х соответственно), з. стадии бластоцисты достигают 18,8Х и 24,2Х зародышей соответственно.

• Оказалось, что достоверно более низким (Р< 0,01) потенциалом к развитию обладают зародыши, достигшие к 44-46 часам после оплодотворения лишь стадии 2-х бластомеров. Так, до стадии морулы -бластоцисты развивались лишь 2 из 56 зародышей, что составило всего З.И.

Таблица 6.

Способность зародышей к формированию морулы и бластоциеты в зави-' симости от стадии развития через 44-46 часов после оплодотворения.

Стадия развития: Число : Из них развились до стадии

черев 44-46 час: зародышей: морулы бластоцисты

после оплодотво: : :

рения : П : X П : X

2 бластомера 56 Оа 0 2в 3,6

4 бластомера .112 616 46,5 21г 18,8

6 и более

Оластомеров 167 Б5б 36,0 38г 24,2

Р аб,вг,авбг < 0,01

3.4. Индивидуальные различия между коровами донорами и между быками-производителями по качеству гамет.

3.4.1. Индивидуальные различия между коровами донорами.

Как видно из таблицы 7 при оплодотворении созревших ин витро яйцеклеток спермой одного быка оплодотворяемость составила в средней 36,7Х, о колебаниями от 21.4Х до 72,7%. Щ>и этом были . отмечены существенные индивидуальные различия по способности ранних эмбрионов формировать нормальные вародьши на более продвинутых стадииях развития. *Ьгало вародывей с низким потенциалом развития (череэ 42-46 часов поста оплодотворения вародыии достигали только 2-х клеточной стадии развития) у разных доноров колебалось от О до

100%, а в среднем 42,ОХ от обшэго числа дробящихся вародышей.

Более продвинутой стадии развития, морулы и бластоцисты, пригодной для нехирургической пересадки достигали в среднем

Таблица 7.

Индивидуальные различия коров-доноров по эффективности получения культивируемых ин витро эмбрионов.

Номер Коровы:

Число извлеченных

ооцитов

Из них дробились

п : процент : от об: иего : числа

Достигли 2-х кле- : Развивались до точной стадии через: стадии морулы 42-46 часов после :. бластоцисты

осеменения

процент от числа дробящихся

1 26 11 42,3 5 45,5 Б 45,5

2 22 6 27,3 г 33,3 г 33; 3

3 14 3 21.4 2 66,7 1 33,3

4 8 4 50,0 - - 2 50,0

б 9 2 22,2 г 400,0 -

6 29 10 <И,5 6 60,0 1 10,0

7 11 8 72,7 1 12.5 4 50,0

8' 17 6 35.3 1 16,7 4 66,7

Всего:

136

60 36,7

21

42,0

19

38,0

П

п

В среднем на одну

корову: 17,0 ¿7,7

2,4 £ 1,8

-172.4 + 1.8 эмбрионов на корову с колебаниями от 0 до 5 эмбрионов. Тагам образом, эти наблюдения позволили установить новый научный факт о значительных особенностях коров по эффективности получения и тех полноценных эмбрионов путем использования технологии оплодотворения ин витро, определить возможности получения оплодотворенных ин витро эмбрионов у коров после убоя.

3.4.2. Индивидуальные различия между быками по оплодотворяющей способности спермы в системе оплодотворения яйцеклеток ин витро.

Для проведения этих (таблица 8) исследований нами были собраны ооциты иэ яичников коров на бойне, проведено их созревание и оплодотворение ин витро ранее описанным методом с использованием спермы разных быков.

Таблица 8.

Индивидуальные особенности оплодотворяющей способности спермы по развитию эмбрионов через 44-46 часов после осеменения.

Кличка : Число : Число дробящихся- : Число зародышей через быка : ооцитов : _ ооцитов . - ._: 42-46 час, после оплодотв. : : : : 2-х клеточн.: 4-6 клеточн. _

: ; П : X : п : X : п : X

Ананас' 198 121 61,1а 17 14,0Г 104 86,0

Лидо 191 125 65,4а 22 17, бГ .103 82,4

Корт 168 1С» 68,4а 24 22,2г 84 77,8

Анилин 164 106 64,6а 25 23, бг 81 ' 76,4

Кирка 122 59 48,46 16 25,4Г 44 74,6

Сувенир 154 71 46,1В 32 45,1Д 39 64,9

Раб < 0,05 Рав < 0,01 Ргд < 0,025

Через 44-46 часов после осеменения была выявлена примерно одинаковая оплодотворящаая способность спермы у 4-х из 6-ти быков по числу дробящихся яйцеклеток (61,и - 68,4%). У двух остальных быков этот показатель был значительно ниже, в пределах 46,1% - 48,4% и эта разница была достоверной (Р<0,05 .0,01).

Нами была также проведена оценка оплодотворяющей способности спермы по показателю низкой потенции развития эмбрионов, то есть, выявлен процент эмбрионов, которые через 44-46 часов после осеменения достигли только двухклеточной стадии развития. Как видно из данных таблицы 8 примерно одинаковый процент таких.эмбрионов был у 5 из 6 быков, в пределах 15-25% к числу дробящихся эмбрионов. И лишь у одного быка под кличкой Сувенир этот показатель был выше, чем у других и эта разница была статистически достоверной (Р< 0,025). Причем, именно у этого быка была отмечена наименьшая оплодотворяемость по результатам дробления яйцеклеток.

Для более объективной оценки оплодотворяющей способности спермы быков путем оплодотворения ин витро нами были проведены дальнейшие наблюдения за развитием эмбрионов до более продвинутых стадий, морулы и бластоцисты (таблица 9)..

Как видно из таблицы 9 судя по проценту сформировавшихся морул и бластоцист прослеживается ранее отмеченная закономерность низкого качества спермы у быка под кличкой Сувенир: лишь 13,7% эмбрионов в этой группе достигли стадии морулы и бластоцисты по сравнению с 21,8 - 30,6% при осеменении спермой других быков, и эта разница была статистически достоверна (Р<0,001 .0,025). Эмбрионы, полученные после осеменения спермой быка по кличке Сувенир, достигли этой стадии только в 2% случаев, тогда, как от других быков, за исключением Анилина, получено от 7,2 до 21,5%

Таблица 9.

Индивидуальные особенности оплодотворяющей способности спермы быков по развитию эмбрионов до стадии морулы и бластоциеты.

Кличка быка Число : Из них достигали стадии

дробящихся: морулы-бластоциеты : бластоцисты

ооцитов : п : X : п X

Ананас 121 37 30,63 11 9,1е

Лидо 122 28 23, Ой 10 8,2е

Корт 79 28 35,4К 17 21,5ж

Анилин 87 19 21,8л 3 - 3,4е

Кирка 69 18 " 26,1м 5 7,2е

■Сувенир 51 7 13,7н 1 2,0е

Рея < 0,025 Рзн < 0,025 Рлн > 0,05 Ркн < 0,001 Рин > 0,05 Рмн >0,05 бластоцист к числу дробящихся эмбрионов.

Использование спермы быка под кличкой Корт обеспечило наивысший процент полученных морул и бластоцист (35,4%) или бластоцист (21, БХ) к числу дроОящихся яйцеклеток и эта разнница была статистически достоверна (Р<0,025) по сравнению с получением эмбрионов на этой стадии, осемененных спермой других пяти быков.

Следовательно, проведенная нами оценка оплодотворяюдай спо- . еоОности спермы быков по показателю развития эмбрионов, до продвинутых стадий (морулн и бластоциты), пригодных для нехирургической пересадки эмбрионов, поэволило получить дополнительные научна» факты о качестве спермопродукции и выявить не только быков с низкой оплодотворяодэй способностью спермы, но и с высокой, что не.

удавалось установить только по проценту дробящихся эмбрионов или их потенции развития через 44-46 часов после осеменения.

3.5. Получение телят после пересадки эмбрионов, полученных из созревших и оплодотворенных ин витро ооцитов.

Наиболее объективным критерием полноценности оплодотворенных ин витро эмбрионов является эффективность их приживаемости после пересадки реципиентам. Поэтому нами была проведена серия пересадок оплодотворенных ин витро эмбрионов 103.реципиентам и оценена приживаемость в зависимости от синхронности между стадией полового цикла у реципиента и возрастом эмбриона

Эмбрионы на стадии бластоцисты, полученные черев 7-8 дней после осеменения ин витро, были пересажены нехирургическим способом реципиентам на 6,7,8 и 9 дни полового цикла

Таблица 10.

Влияние синхронности между стапией полового цикла реципиента и возрастом оплодотворенных ин витро эмбрионов на эффективность их трансплантации.

Синхронность между: Число ре- : Получено беременностей_

возрастом эмбриона ципчентов : : в процентах к

и стадией полового: ; число : числу реципиентов

. цикла реципиента : :

«2 18

41 30

О 31

-1 "14

г и,1

2 6.7 Б 16.1

3 21.4

Как видно из данных таблицы 10 приживляемость эмбрионов была выше в тех случаях, когда синхронность между стадией полового цикла реципиента и возрастом эмбриона быда 0 или -1 день ( то есть возраст эмбриона был на 1 день меньше) по сравнению с +1 и +2 днями, когда возраст эмбриона был больше.

Однако эти различия были статистически недостоверны. И в этом случае можно говорить лишь о тенденции такой зависимости. Вместе

с тем, полученные данные дают основание заключить, что оплодотво-

»

ренные ин витро эмбрионы были получены и продолжали развиваться после пересадки их реципиенту.

4. Выводы.

1. Установлена возможность и выявлены оптимальные условия

культивирования оплодотворенных ин витро эмбрионов крупного paraît

того скота для преодоления митотического блока развития, наблюдаемого на 8-16 клеточной стадии, путем использования в среде культивирования монослоя эпителиальных клеток яйцевода и гранулезных клеток. Применение в качестве монослоя эпителиальных клеток обеспечивало развитие 47,7* эмбрионов до стадии морулы и бластоцисты к числу дробящихся; а гранулезных клеток у 38* эмбрионов до этих стадий.

8. Цитологический анализ оплодотворенных ин витро.эмбрионов крупного рогатого скота на продвинутых стадиях развития, морулы и. бластоцисты, показал, что эмбрионы имели нормальные структуры, число ядер соответствовало числу бластомеров, а наличие митозов свидетельствовало о наршльном функционировании эмбрионов. '

а В экспериментах по культивировании, оплодотворению ин витро ранних эмбрионов крупного рогатого скота усто" чево, что

отечественная культуральная среда М-199 не отличается от таковой производства фирмы Флеу лабораторие (США), пластиковые чашки отечественного и импортного производства, а также отечественное вазелиновое масло и минеральное масло фирмы "Сигма" обеспечивают одинаковую эффективность созревания, оплодотворения и развития ранних эмбрионов крупного рогатого скота ин витро. Эти наблюдения открывают возможность широко испольэовать в системе оплодотворения яйцеклеток крупного ргатого скота отечественные культуральные среды и другие материалы и обеспечивать высокую воспроизводимость результатов опыта

4. "Выявлена существенная зависимость между скоростью развития оплодотворенных ин витро ранних эмбрионов крупного рогатого скота и достижением ими продвинутых стадий морулы и бластоцисты. Установлено, что высокий процент эмбрионов (59,2 - 64,3%) продолжает развитие до поздней морулы и бластоцисты в том случае, когда через 44-46 часов после оплодотворения они находятся на стадии 4-6 бластомеров, дальнейшее их развитие до этих стадий ничтожно мало (3,6%), если в эти сроки эмбрионы достигают стадии 2-х бластомеров.

5. Наблюдаются значительные индивидуальные различия между ооцитами коров доноров по эффективности оплодотворения ин витро и дальнейшему развитию эмбрионов. Процент дробящихся яйцеклеток к .числу осемененных ооцитов составил в среднем 36,7Х с колебаниями от 22,22 до 72,72 у отдельных животных. Стадий морулы и бластоцисты. достигали в среднем 2,4 + 1,8 эмбрионов на корову с колебаниями от 0 до 5 эмбрионов.

6. Выявлены три критерия оценки оплодотворяющей способности спермы быков путем оплодотворения яйцеклеток ин витро: по проценту дробления яйцеклеток к числу осемененных ооцитов, по потенции

раэвития эмбрионов в первые 44-46 часов после осеменения и по проценту эмбрионов, достигших стадий морулы и бластоциеты. Эти новые научные факты представляют практический интерес как с точки зрения применения экспресс-метода оценки оплодотворяющей способности спермы быков, так и в плане более глубокого научного осмысления процесса эмбриогенеза

7. Полноценность оплодотворенных ин витро эмбрионов крупного

рогатого скота подтверждена установлением 12 стельностей после их

»

пересадки и с последующим получением жизнеспособного потомства. При этом отмечена тенденция повышения приживляемости эмбрионов, пересаленных реципиентам в дни цикла, совпадающих с возрастом эмбриона (16,1%) или отстающих на один день (23,1%) по сравнению с пересадкой эмбрионов в возрасте, опережающем на 1-2 дня стадию полового цикла (7,1-11,8%).

Б. Практические предложения.

1. В качестве критерия прогнозирования эффективности оподот-ворения и дальнейшего раэвития эмбрионов рекомендуется использовать показатель раэвития оплодотворенных ин витро эмбрионов через 44-46 часов после осеменения. Процент эмбрионов на стадии 4-6. бластомеров в зтн сроки высоко коррелирует с процентом развития эмбрионов до стадии морулы и бластоциеты, а дальнейшее развитие эмбрионов на стадии 2-х бластомеров ничтожно »ало.

2. Для оценки оплодотворяюией способности спермы быков-производителей экспресс-методом предлагается использовать метод оплодотворения ин витро яйцеклеток крупного рогатого скота. При этом необходимо оценивать о плодот зорящую способность спермы быка по трем показателям: по проценту дробления яйцеклеток, по достп-

жению 4-6 клеточной стадии развития эмбрионов в первые 44-46 часов после осеменения и по проценту эмбрионов, достигших стадий морулы и бластоцисты.

6. Список работ, опубликованных по теме диссертации,

1. Развитие ранних зародышей коров, полученных ив яйцеклеток, соэревшиих и оплодотворенных вне организма, при совместном культивировании с эпителием яйцевода. // Тезисы Докладов Всесоюз. Конф. Молодых ученых г.Плотава, 1991, стр.95 (с соавт.).

2. Культивирование ранних зародышей коров, полученных из яйцеклеток, созревших и оплодотворенных вне организма, на монослое гранулезных клеток. // Тезисы Докладов Всесоюз. Конф. молодых ученых'г. Полтава, 1991,стр. 96-97 (с соавт.).

Подписано в печать 15.05.92. Заказ 597

Формат 60*64/16 Тираж 100_

Москве. Типография Росселмоэакадемии