Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка условий для обеспечения развития и криоконсервации эмбрионов крупного рогатого скота, полученных вне организма

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка условий для обеспечения развития и криоконсервации эмбрионов крупного рогатого скота, полученных вне организма"

PCCGliiiOiíAii AnAJU^t CiyibC;íG,-:0^i/:í;Tn4.h!Lí.v ¡¡.v'K ЧАУЧ!1с|-ис0!к,Д0ЬЛТ]^!ЪС1й'н1 KHCTîUJ'l ce!fbCKüXü®Sl1CTB!i7.n{0íí ШОГКХНСКОГГЛ

¡la nr.u'ux ptkoihc;:

к-1сял /.piiж яавг'н'■''!л ?k&ts/4№ усдозки ;-ля (рчсяе'шш развития с ¿^покочж'рап.:::.!

s:.:hP/U;höb крупного рогатого скота, псйучшчых кю еже!:;.- -л

ОЗ.г;.1.:^ .с -,

а в т u т" xi о г г .■. '<-Дяссора-акия не. соиок-тп*; ..-чаио." и

- ■ С/""'"'11 '' ' "

!

/

У

Диссертационная работа выполнена в Научао-пронзьодотввнноы

С/иотсхно-тсгическок центре по глвотноаодогву (Бгзотехцзктр).

Научный руководитель - доктор биологических каух, профессор,

член корреспондент РАСХН Прокофьев М.И.

Официальные оппоненты: доктор биологических наугс,

Дьяк ОН 05 Л .11.

кандидат биологических наук, ' Захарче.-асо В.И.

Ьэдущее учеиездечпа: Всероссийский институт зивотноводотва

Защита диссертации состоится "_ ", 1833г.

е ....... час. на 'заседании специализированного совета'

Л .0^0 .'.0.01 г.ри Всероссийском научно-Есследоз&тольоком цнстп-тую сельскохозяйственной биотехнологии

Адрсо*. ¿2'/£53, г. 1оскса, ул. Псковская, 12, хорауо 4.

С д^ссортдцкой можно озяокомитьоя с библиотеке. института

Диторсфорат разослан " @ " ,1993у.

-■чупьй секретарь *

епбцмилкзьроваиного совета

каздвцат биологических наук ! . •''' ' < <•-,. С.А.Молгкоза

I. Общая характеристика работы

1.1. Актуальность темы. В последние годи биотехнология животноводства бурно развивается во всех странах мира. Одним • из биотехнологичоских методов, широко используемых в селекции, является метод трансплантации ранних эмбрионов. Однако внедренио этого метода в практику животноводства тормозится отсуствием достаточного числа эмбрионов животных с высоким генетическим потенциалом, так как от коровы получают примерно 20 полноценных эмбрионов в год. Кроме того, это обусловлено значительными материальными затратами на получение эмбрионов. Одним из путей снижения стоимости эмбрионов может быть получение яйцеклеток из яичников при убое высокоценных коров после выбраковки их на мясо и дальнейшее оплодотворение яйцеклеток вне организма.

В настоящее время большое внимание уделяется разработке способа оплодотворения ооцитов вне организма, что позволяет более интенсивно использовать в воспроизводстве высокоценных в племенном отношении коров и быков. Разрабатываются методы, позволяющие обеспечить условия для оплодотворения яйцеклеток крупного рогатого скота вне организма до стадии бластоцистц: на монослое эпителиальных клеток яйцевода коров ( Коj ¿кала. 1|. оЛ- , 1990, ^д/ах^сх^о с/А аХ,

1991), на монослое гранулезных клеток коров ( Ьг>га и. и

о

Р^а^и. Ст. , 1989, 1990, Хи^лсс*. еА аХ , 1991). В последние годы удалось разработать метода замораживания к оттаивания оплодотворенных вно организма эмбрионов крупного рогатого скота (Ь>До Р. и ГПсхгип Р ,.1978, ГП<хс'-'.р Л. а± , 1984, Ц. Р

Однако выход биологически полноценных эмбрионов остается

низким. Поэтому продолжаются интенсивные исследования с использованием современных биологических методик.

1-2. Цель и загачи исследований. Це.тыэ настоящей работы явилась разработка и усовершенствование условий развития вне организма ранних эмбрионов крупного рогатого скота до стадии бластоцист.ы и обеспечение их длительного хранения

Б процессе работн предстояло решить следующие заяача:

1. Изучить влияние продолжительности созревания ооцигов крупного рогатого скота Ене организма на их дапыгейисо развитее .

2. Исследовать влияние различных способов капацитации на ст^одогворяг.иую способность сперм быка и способность оплодотворенных вно организма яйцеклеток коров к формированию дроблщихся зародышей.

3. изучить возможность использования унифицированной среды в систем дозревания ооцитсв, оплодотворения и ранних стадий развития эмбрионов крупного рогатого скота вне организма.

4. Сравнить эффективность развития эмбрионов крупного рогатого скота до стадии бластсцистн на моноелое эпителиальных. клеток яйцевода коров и кролика,

5. Изучить эффективность разных способов замораживания получению: вне организма эмбрионов крупного рогатого скота на стадии бластоцистн, а также усовершенствовать способ замораживания яйцеклеток и ранних корул крупного рогатого скота для использования их в качестве эмбрионального материала при клонировании.

1.3. Научная новизна работы. В результате проведенных экспериментов впервые показано, что созревание ооцитоб крупного рогатого скота вне организма в точение 10 часов но сравнении с созреванием в течение 24 часов не влияет на процесс дробления зародышей и развитие их до стадии бластоцистн. Впервые изучена динамика установления равновесия спермиав в осадка и надссадочнол жидкости при проведении процосса капацитации. Разработай прием пятикратного увеличения числа сперматозоидов, пригодных ЭЛтодотеорения вне организма яйцеклеток крупного рога?«!1«) окота путем смены среди над осадком спермы» Предложена унифицированная среда для созревания ооцвтов, оплодотворения и дальнейшего культивирования эмбрионов крупного рогатого скота. Продемонстрирована возмо.-хность использования монослоя эпителиальных клеток яйцевода кролика на эффективность культивирования эмбрионов крупного рогатого скота. Усовершенствована схема замораживания оплодотворенных вне организма эмбрионов крупного рогатого скота.

1.4. Практическая значимость работн. Усовершенствован способ кряокбнсорвации эмбрионов крупного рогатого скота, получэнных вне организма, с использованием этиленгликоля, кочорий обеспечивает вешслошоть АЦ заыорожппшх и оттаянных эмбрионов. Предложат могод смен сред при проведении процедуры каяацитации спермы, в 3-4 раза повитавший эффективность использования замороженной спермы быка при оплодотворении вне организма яйцеклеток крупного рогатого скота. Предложена уяяфицироваинаг среда для кегшьзогшил на всех

этапах оплодотворения яйцеклеток крупного рогатого скота.

1.5. Апробат.тия работы. Результаты работы доложены на научной конференции "Биотехнология в разведении и воспроизводстве новых генотипов сельскохозяйственных животных", которая состоялась в г. Харькове в 1993г.; в Научно-производственном биотехнологическом центре по животноводству

в 1992г.

1.6. Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 101 странице . машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, обсуждения, выводов и практических предложений. Цифровой материал представлен в 10 таблицах, иллюстрирован 14 рисунками. Список литературы включает 122 источника отечественных и зарубежных авторов.

2. Материалы и методы исследований

Эксперименты проводились на аспирироваиных из яичников яйцеклетках крупного рогатого скота. С мясокомбината яичники доставляли в течение 1,5-<- часов в термосе при температуре 20°С. Затем их промывали три раза в физиологическом растворе. Ооциты аспирировали из фолликулов диаметром 2-6 мм и отбирали только окруженные несколькими слоями кумулюса. Процедуру дозревания яйцеклеток проводили в покрытых миноральншл маслом каплях (0,2мл) среды М-199 с 15$ - ной эстралыюй сывороткой коровы и с добавлением острадиола - IЧр (I мкг/мл) в СО^.-инкубаторе при температуре 39°С.

Для оплодотворения вне организма использовали замороженную сперму одного быка. После процедуры оттаивания и "всплывания" сперматозоиды капацитировали в среде С-Р-ТА1.Р с 5,ед. гепарина в течение 2 часов и добавляли в 0,2 мл капли со средой для оплодотворения (^¡гл!- ТА1Р) (Рсыт*i~.iL

, 1986). Используемая концентрация спорматозовдов обычно была 1,5x10® /мл. Яйцеклотпи промывали один раз и переносили в капли со сперматозоидами для дальнейшего культивирования в СО.,-инкубаторе в течение 18 или ¿4 ч (в зависимости от задач эксперимента).

Развитие эмбрионов крупного рогатого скота до стадии морулы и бластоцисты проводилось на монослое эпителиальных клеток яйцевода коровы или кролика. Клетки эпителия яйцевода получали путем промывания пли соскоба со слизистой яйцевода. После их культивирования в 0,2 мл каплях среды М-199 под маслом в С02-инкубаторе в течение двух суток образовывался монослой, куда и вносили зиготы крупного рогатого скота. Каждые трое суток проводили частичную смену среды. Культивирование на эпителии обычно продолжаюсь до 8 суток. Достигшие стадии бластоцисты 7- и 8-суточныэ эмбрионы заморшхивали в приборе для замораливания ЗЭМ-4.

Замораживание бластоцист проводили по следующей схеме: эмбрионы помещали в модифицированный фосфатно-солевой буфер (ФСБ) с 20$ феталъной сыворотки коров и 10% этиленги-коля на 20 мин. Затем эмбрионы помещали в соломинки и замораживали по стандартной методике в. приборе для програш-ного заморалшвания - ЗЭМ - 4. Оттаивание соломинок с эмбрионами проводили следующим образом: 10 секунд на воздухе и

- D —

1П секунд г- водяной бано (37°G). Затем содержимое соломинки вплетали в раствор ФСБ с 20% астральной сыворотки коров и с0% сахарозы. После троекратного про:,'икания имбрионов в ФСБ, их переносили на монослой эпителиальных клеток яйцевода корот; и культивировали в течоние суток с долью их мор-

фОЛОГИЧО ij КОЙ О! юнки.

Трансплантацию замороаонных и оттаянных. эмбрионов проводила нехирургачесш-ы путем толкам-рсцкпиоытш с синхрони-

ЗИР0В:>ЛН0Й ОХОТОЙ.

Для проведения процосса созревания ооцитов, оплодотво-реккя к культивирования эмбрионов крупного рогатого скота гспользсвали также унифицированную срсду, приготовленною на основе среды 1Л-Г29 с добавлением кофеина (4 мкг/мп) и опитедиатышх клеток яйцевода корсвы. Процедуру созревания ООП,итов, их оплодотворение и культивирование проводили в одних и тех se каплях унифицированной среды J/1-I99.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием биометрических методов (H.A. Плохкнский,

19'Л)).

3. Результаты исследований 3.1. Влияние продолжительности созревания ооцитов крутшого рогатого скота на их дальнейшее развитие после оплодотворения вне организма

Важным олементом в системе оплодотворения яйцеклеток вне организма является выявление оптимальных параметров продолжительности созроычния ооцитоп. Культилнрошнии фол. ;íi :у .¡'-¡рних ооцитов обычно проводится в то40НПО 22-'¿& часов

(Ы Л. оХ, , 1989).

Нами были оценены два периода созревания ооцитов крупного рогатого скота - 18 и 24 ч. Эффективность времени созревания оценивалась по проценту дробящихся зародышей ч достигших стадии бластоцисти. Установлено, что продолжительность периода, в точение которого можно начинать процедуру оплодо-ТЕорения после начала созревания ооцитов, довольно игрока (6 часов). Так, получен примерно одинаковый процент дробящихся зародышей (71,-,9$ к 75,9^) я одинаковое число бласто-цист (25,6$ и 24,'¿%) как при 18ч, так и при 24 ч созревании ооцитоз (таблица I).

Таблица I

Развитие эмбрионов в зависимости от продолжительности периода созревания ооцитов

Продолжительность времени созревания ооцитов Число ооцитов Число ЧИСЛО" дробящихся зародцш:^ бластаппсл' п % п %'

18 часоз 55 39 70,9а 10 25,6а

24 часа 87 66 75,9е5 16 24,2б

ра,б>0'05

Полученные данние свидетельствуют не только о том, что ооциты длительное время не теряют своей способности к оплодотворению, но такжо и о возможности проведения процедуры оплодотворения в удобное для исследователя время,

3.2. Исследование влияния различных способов капацитаиии на оплодотворяющую способность спермы и способность опло-

- О -

дотворенннх яйцеклеток к формированию дробящихся зародышей вне организма

Важнейшим звеном в процессе оплодотворения яйцеклеток крупного рогатого скота вно организма является наличие полноценных сперматозоидов. Исследователями разработаны оригинальные приемы капацитации путем отделения живой спермы от неживой после процедуры оттаивания замороженной спермы. Этот ми-тод назг.вается "всплываиием". Его сущность заключается в наслоении оттаянной спермы на дао пробирки со средой и всплывали.'! :кивых юте ток поело инкубации. Было предложено проведение инкубации в течение 45-60 тт. Мы решили проверить, действительно ли всплшзание в течение 45-60 минут - оптимальное время, которое необходимо для сбора как мо:кно большого числа сперматозоидов быка. Нами установлено, что уже через 5 мин инкубации осанка сдермиев со средой концентрация всплыв-пкх спьрмиев достигала 3,ЗхЮ6+0,46хЮС спормиов/мл и не повышалась, если время инкубации увеличивалась до 60 минут -3,(;хК-6+0,41х106 опермиев/мл (таблица 2).

Таблица 2

Эффективность "вешшвания" спермиев в зависимости от времени

инкубации

Время инкубации Число опытов Число спормиев/мл

5 мин 5 3,3хю6+0,46х106

16 мин 6 3,8хЮ6+0,53хЮ6

мин 5 1,9хЮ6+0,75х106

45 мин 5 ¿,8х106±1. ,7^х106

(,0 мин 6 3,их10С+0,4Гх106

В дальнейших экспериментах было изучено влияние продолжительности "зсшшвания" спермиев быка на их оплодотворяющую способность. Было проанализировано два интервала инкубации: 15 .мин и 60 мин.

Таблица 3

Оплодотворяющая способность спермы бшса в зависимости от продолжительности времени "всплывания" спермиев бшса

Время ишсубации Число ооцитов Число дробящихся зародышей Число морул и бластоцист

п % п %

15 мин 253 ' 164 65, Оа 34 21,0а

60 мин 184 96 52,1б 23 24,06

Ра>б>0,05

Как видно из данных таблицы 3, время инкубации не оказывало влияния на эффективность дробления оплодотворенных вне организма яйцеклеток крупного рогатого скота: 65,0$ (164/253) и 52,1% (36/184), соответственно, при 15 мин и 60 мин "всшпйания". Таким образом, согласно нашим данным можно значительно сократить процедуру всплывания с 45-60 мин до 5-15.мин, что в свою очередь ускоряет, а значит и повышает эффективность.процедуры оплодотворения. Это особенно на~-но при практическом применении метода оплодотворения вне организма яйцеклеток крупного рогатого скота.

Известно, что модцу спермой в разбавитоле и средой ТА1Р при процедуре "всплывания" существует динамическое раз-

повесиз. Наш било показано, что при добавлении свежих порции среди того --се объема над одним и там ко осадком спорки с продсарктслонии отбором предыдущей порции, при инкубации в течение 15 мпп, число всшшвзбй спермы оставалось приморно одигапозш, в пределах 1,8x10е - 2,1x10° спер?лиов/мд (таблица 4) „

Таблица 4

Число всплывших спормяов в зависимости от добавления свокой порции среды того ;.;е объема над одной л той г.;е порцией спермы в разбавителе

Г? среди, добавленной Чпг»ло Число опзрмпев/мд

по порядку ОПЫТОВ

I г/ 5 6 2,1х106+0,21х106 1,8х1сЧо,2ПхЮ6

3 0 1,1х10'3Ю,28хЮ6

4 6 2,1хЫБ+1;,42х106

5 5 2^хГ06+0,34х106

Как видно из таблицы 4, даже если сроду ЪМР над ссод-ксп спармиев меняли пять раз, то когцоитрадля спормиеь в ной оставалось приблизительно той ко, что и бита в первой л^рцип среды, в которую был подслоен эякулят с келточнш

г. р ,

разбавителем, а именно, 2,0x10 и 2,1x10 спермиев/мл,

соитестствочно.

Таким образом, в пятой порции среды над осадком спермы с разбавителем удается получить такую же концентрацию ткпгых :л»ф:л.:о!', как и при первом ое добавлении. Причем, оплодо-

творящая способность спермы п последующих сменах сред хотя и понижается (процент дробящихся эмбрионов при трехкратной смене среды составил 47,0$ против 65,0^ в первой порции среды) , выход полноценных эмбрионов остается пржерно одинаковым: при одно- и трехкратной смен сред 21,0 и 2и,3^ соответственно (таблица 5).

Табл:ща 5

Влияние смены среди на оплодотворяющую способность сперш бика

Кратность смены среды Число ооцитов Число дройщппхея зародите^ п % Число морул и бластош'.ст п

I 253 164 65, Оа 34 21,0В

3 220 103 47,06 21 20,Зг

Ра,б<0'05 Рв,г>0'05

Такш образом, используя прием многократных смен сред, мо;?.-но в несколько раз увеличить эффективность использования одной порции эякулята, что особенно'ва-хно, когда используется сперма от высокоценных быков - производителей. •

3.3, Изучение всзмо;шости использования унифицированной среды в системе дозревания ооцитов, оплодотворения и ранних стадий развития эмбрионов крупного рогатого скота вне организма

Необходимым компонентом успешного развития метода оплодотворения я!щеклеток крупного рогатого скота вне организма в производственных условиях является разработка сред,-необходимых

при культивировании эмбрионов разных стадий развития, от созревания и оплодотворения до стадии бластоцисты. Причем, в производственных условиях такие среды должны быть просты по составу и как можно более универсальны для разных стадий и этапов развития эмбрионов, а также давать высокий процент развивающихся зародышей.

Нами были проведоны эксперименты с использованием модифицированной среды (унифицированная среда) на всех этапах систолы оплодотворения яйцеклеток крупного рогатого скота от стадии созревания и оплодотворения до стадии блас-тоцисты. Для созревания часть ооцитоз переносили в капли с традиционно используемой средой М-199 (контроль), а другую часть в капли с унифицированной средой (УС) (опыт) и культивировали в СС^-инкубаторе в течение суток. Оплодотворение контрольных ооцитов проводили как обычно в среде ТА1-Р с каяацктированной с гепарином спермой (замороженной). Ооциты опытной группы ые пер-эносили в другую сроду и оплодотворение проводили в тех :хе каплях таким :ке способом капацитированной спермой. Через двое суток после оплодотворения проводили оценку эффективности дробления. В результате проведенных экспериментов получены следующие результаты: в опытной группе из 121 ооцита дробились 57 (47,1$), в контрольной - из 194 ооцитов дробились 97 (50,0?) (таблица 6).

Таблица 6

Использование унифицированной среды (УС) для культивирования и оплодотворения вне организма эмбрионов крупного рогатого скота

Схема культивирования Число ооцитов Число дробящихся

зародышей

п %

Унифицированная

среда 121 57 47,1а

,4-199 194 97 50,06

Р;0,05 .

Таким образом, процент дробящихся эмбрионов в контрольной группе, где использовались две среды (М-199 и ТАЦР) и в опытной, с одной унифицированной средой, не различался (Р>0,05). Полученные нами данные дают основание предполагать, что для созревания и оплодотворения ооцитсв, а также для дальнейшего культив.чрованая эмбрионов достаточно применение только одной унифицированной среды, которая содержит необходимые компоненты для развития эмбрионов до стадии бластоцисты.

3.4. Использование монослоя эпителиальных клеток яйцевода кролика для культивирования эмбрионов крупного рогатого скота до стадии бластоцисты

Согласно литературным данным культивировании ранних эмбрионов крупного рогатого скота до стадии бластоцисты удатось провести с использованием яйцевода временного ре-

цигшента: овцы ( !~и • Ц. Ц .,&япс}оп I, Л, ), кролика {¡¿-хала П1.С1. 1986), на монослоо грану-

лезных юте ток (Ив. г ^ У. и 1агегл С? , 1989), а также эпителиальных клеток яйцевода крупного рогатого скота ( сц-с-гъ '^ ' а£-). Однако использование вре-

менного реципиента представляет собой трудоемкий и дорогостоящий метод, тогда как при культивировании на монослое клеток корон появляется вероятность переноса инфекции клетками того же вида. Б наших опытах показана возможность успешного культивирования ранних эмбрионов коров на монослов эпителиальных клеток других видов животных, в частности, яйцевода кролика. Нами были использованы эпителиальные метки яйцевода кролика, полученные на второй день после овуляции (таблица 7).

Таблица 7

Сравнение эффективности развития эмбрионов крупного рогатого скота на ыонослое эпителиальных клеток яйцевода коров и кролика

Тип клеток яйцевода на ыонослоэ Число ооцитов Число дробящихся эмбрионов п %. Число бластоцист в %

,Кролика Коровы 63" 73 49 50 77,8а 68,5б 8 16,3В 12 ■ ¿4,0Г

Оказалось, что эпителий яйцевода кролика способен поддерживать в культуре развитие эмбрионов"крупного рогатого скота. И хотя процент развившихся бластоцист из числа дро-

бящихся эмбрионов был на 8% ниже при сокультинврозании с эпителиальными ¡метками яйцевода кролика по сравнения с эпителиальными клетками яЛпевода коровы, пройденные нами эксперименты убедительно показывзют, что эпителиальные глотки яйцевода кролика способны подцор^изать разгатие раинах эмбрионов коров.

3,13. Изучение эйектиьнооти разных способов заглорачсквания

оплодотворенных вне организма эмбрионов крупного рогатого скота

При г/ассово:': получении оялодотзорошшх вкэ организма эмбрионов крупного рогатого скота в полях научного и практического использования обязательно встает проблема их хранения.

Что иаспотся проблчми длительного хранения оплодотворенных в организме :;шзотного эмбрионов, то в сбоо времл сна была ревеаа путем их заиораетвышг в жидком азоте с использованием различных криопротоктороя, наиболее эффективным из которых оказался глицерин. Оплодотворенные вне организма смбрногш, обладая меньшей -жизнеспособностью, потребовали разряоотки новых приемов замораживания.

Согласно литературным данныгл кот единого мления по испатьзовадкэ в качество криопротектора для замораживания оплодотворенных сне организма смбрионов крупного рогатого скота какого - то одного вещества. Поэтому нами было изучено глиняг.0 различных криолрстокторов на :кизнеспособность эмбрионов ;.оров. 1гвля проварени защитные свойства глицерина

и этиленгликоля при заморатаЕании эмбрионов, полученных вне организма. В опытах использовались 7-8-дневные блас-тоцисты коров, которые после введения криопротоктора подвергались замораживанию, а затем оттаиванию и культивированию вно организма на монослов эпителиальных клеток яйцевода коров.

Таблица 8

Влияние различных протекторов на жизнеспособность оттаянных эмбрионов крупного рогатого скота

Число бластоцист Тип криопротектора Хорошее качество эмбрионов после оттаивания п % .

30 глицерин 0 0

III этиленгликоль 46 41,0

Как видно из таблицы 8, использование в качестве крио-протектора глицерина в наших условиях замораживания не обеспечило сохранения жизнеспособности оплодотворенных вне организма эмбрионов крупного рогатого скота. Применение того же рбжима замораживания с использованием этиленгликоля обеспечило сохранение жизнеспособности у 41,0$ бластоцист. При дальнейшем культивировании замороженных и оттаянных бластоцист на монослое эпителиальных клеток яйцевода коровы 12,бластоцист вылупились.

3.6. Разработка способов замораживания яйцеклеток и ранних морул крупного рогатого скота для использования их ' в качество материала при клонировании эмбрионов

Необходимым эмбриологическим материалом для клонирования эмбрионов.крупного рогатого скота являются яйцеклетки и эмбрионы яа стадия мору.та. Если учесть, что эта две стадии нужны в эксперименте одновременно, то понятно, что вьт.мванисз морул вместе и параллельной хирургической операцией по извлочению яйцеклеток не только трудоемкая, но и весьма дорогостящая процедура. Поэтому особое значение придается в этом плане оплодотворенным вне организма эмбрионам. Для более удоб.чого их применения необходимо было бы заморозить как морулн, так и яйцеклетки,.а затем их от-таить в день эксперимента.

!.!ы изучали возможность замора-кивания созревших и оплодотворенных вне организма яйцеклеток и 5-6-дневнах морул крупного рогатого скота. В качестве криопрстектсра использовался этиленгликодь, а замораживание проводили с помоцыо стандартной методики на приборе для замораживания.эмбрионов ЗЭУ. - 4 производства г. Харькова!. Оценка качества эмбрионов по морфологическим показателям проводилась сразу после оттаивания.

Таблица 9

Эффективность замораживания яйцеклеток и эмбрионов крупного рогатого скота на разных стадиях развития

Стадия Число Хорошее качество после оттаиЕа-

разЕПТия "эмбрионов ния

п %

Яйцеклетка 13 0 0

Ыорула (5 дней после оплодотворения) 12 2 17,0

Морула (бдней после оплодотворения) 38 14 38,0

Анализируя данные таблицы 9, мо>.шо видеть, что 14 (38$) из 38 замороженных 6-дневных морул после оттаивания оказались нормального качества, и только 2 (17,0$) из 12 замороженных 5-дневных морул имели нормальное.качество после оттаивания. Таким образом, чем меньше стадия развития, тем труднее поддерживать кизнеспособность оттаянных эмбрионов. При замораживании яйцеклеток не удаюсь сохранить их жизнеспособность после оттаивания.

3.7. Приживляемость бластоцист, полученных вне организма, после их замо] аясивания, оттаивания и трансплантации реципиенту

Наиболее объективным критерием полноценности заыоро-

жонно-оттачшшх эмбрионов, полученных при оплодотворении вне организма, является юс пршхивляомостъ после поресадки реципиенту. В связи с тем, что существуют опроделоннне трудности при трансплантации замороженных. и оттаянных эмбрионов, полученных вне организма, нами было проведено ряд экспериментов по изучению этой лозмо-шости. Для транс-плантации телкам - реципиентам били отобраны заморошнныо и оттаянные 7-8-суточные бластоцистн, полученные при оплодотворении вне организма (таблица 10).

Таблица 10

Влияние возраста замороженных и оттаянных бластоцкст, полученных псслз оплодотворения вне организма, на эффективность их приживляемости после трансплантации

Возраст эмбриона Число реципиентов Получено с тельностей

п %

7 суток 16 о 12,5.

8 суток 21 0 0

Как видно из таблицы 10, из 21 -пересаженных замороженных и оттатнных восьмисуточных эмбрионов ни один не прижился, в то время как из 16 пересаженных семисуточных замороженных и оттаянных эмбрионов две пршхшшсь (12,5,0. Таким образом, замороженные и оттаянные оплодотворенные вне организма эмбрионы способны развиваться в организме реципиента, хотя эффективность прикивляемости еще низкая И этот прием требует дальнейшего совершенствования.

4. Выводы

1. Продолжительность созроьания ооцитов крупного рогатого скота вне организма в течение 18 часов по сравнению с созреванием в точение 24 часов не влияет на оплодотворявшую способность яйцеклеток (70,9$ и 75,9$ дробящихся зародышей) и развитие их до стадии бластоцисты (25,6$ и 24,2$). Отсюда можно заключить, что продолжительность созревания ооцитов коров может быть увеличена с 18 часов до 24 часов без снижения их дальнейшей полноценности при оплодотворении вне организма.

2. Продолжительность инкубации осадка спермы не влияет на число всплывших сперматозоидов. Концентрация всплывших сперматозоидов через 5 минут после начала инкубации осадка

А Л

со средой достигала 3,3x10 +0,46x10 спорматозовдов/мл и не повышалась, если время инкубации увеличивалась до 60 мин-

л /»

3,0x10 +0,41x10 сперматозоидов/мя. Не выявлено влияния этого параметра на оплодотворяющую способность сперматозоидов, а именно, при инкубации в течение 15 и 60 мин получено примерно одинаковое число дробящихся зародышей (65,0$ и 52,1$ соответственно).

3. Пятикратная смена среды над осадком спермы с разбавителем в такой же кратности увеличивает выход живых сперматозоидов. Одно- или трехкратная смена среды над осадком спермы также не оказывает существенного влияния на дальнейшее развитие эмбрис ов крупного рогатого скота вне организма до стадии морулы и бластоцисты: получено 21,0$ и 20,3$ морул и бластоцист, соответственно, при одно- и трехкратной смене среды.

4. Предложена унифицированная среда для созревания ооцитов, оплодотворения и дальнейшего культивирования эмбрионов крупного рогатого скота вне организма. При использовании этой среды эффективность дробления зародышей составила 47,1$ по сравнению с 50,0$ при использовании традиционной среды М-199 (Р>0,05).

5. Использование эпителия яйцевода кролика в качестве монослоя для культивирования эмбрионов крупного рогатого скота обеспечивает примерно одинаковую эффективность развития эмбрионоз до стадии бластоцисты, как и эпителий яйцевода коровы (16,3$ и 24,0$ бластоцист из числа дробящихся эмбрионов, соответственно).

6. Предложена схема замораживания оплодотворённых вне организма эмбрионов крупного рогатого скота-на стадии блас-тоцисты с использованием этялеитлтоля. Применение этилен-гликоля при замораживании 7-8-дневных эмбрионоз на стадии бластоцисты обеспечило сохранение жизнеспособности 41,0$ эмбрионов.

7. Показана возможность замораживания и оттаивания оплодотворенных вне организма эмбрионов крупного рогатого скота на ранних стадиях развития (5-6-дневные морулы). Эффективность использования таких эмбрионов сравнительно низкая, 17-383.

8. Получено две стельности в результате пересадки замороженных и оттаянных оплодотворенных виз организма эмбрионов крупного рогатого скота. При этом все стельности (12,5;:!) была получены после пересадки 16-ти семидневных эмбэионов, тогда как из пересаженных восьмидневных заморо-

женных и оттаянных .эмбрионов, ни один из 21-го не прилился.

5. Практические предложения и рекомендации

1. Для криокоцсорвации эмбрионов крупного рогатого скота, полученных при оплодотворении вне организма, предлагается использбБать метод замораживания с использованием этиленгликоля, который обеспечивает сохранение жизнеспособности у 41,0$ замороженных и оттаянных эмбрионов.

2. Для увеличения в 3-5 раз эффективности использования замороженной и оттаянной спермы быка при оплодотворении вне организма яйцеклеток крупного рогатого скота предлагается метод смены среды над осадком при проведении процедуры капацитацми.

6. Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Эрнст Л.К., Прокофьев М.И., Сураева Н.Ы., Лагутина И.С., Кесян А.З., Удавленникова H.H., Долгохатский Л.И., 1-айер П.К. Созревание ооцитов, оплодотворение и дальнейшее развитие эмбрионов крупного рогатого скота вне организма после пересадки реципиентам. Вестник сельскохозяйственной науки.-1992.-Я 5-6.-стр. 99-104.

2. Proto.].L(?a Ш. I., v.^/is-t L.H., baraeixa- N Ш-, Lcu^uitnxx 1 JS | Ü. T .. UdCLuLunnLkuuii A/Ä/, DnL.£j.o£ui"KI<r ¿^ G . 3 . (bovine, oo mjiz. a~L (Ъл,

zafiosi- aiL-tit r't\Ljji dsuueiop na.nct <-4*-v(4b.-d a.u.r.1 -Hcui <Ln ¿ii to raitpLtJL'ls,

ItuLUoc^^oto^ - _ 4GlJ