Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Совершенствование культуральной диагностики гонореи (питательные среды и способы определения сахаролитических свойств гонококка)

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование культуральной диагностики гонореи (питательные среды и способы определения сахаролитических свойств гонококка)"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РСШЙСКШ ФЕДЕРАЦИИ МОСКОВСКАЯ. ШДЩШСКАЯ АКАДЕМИЯ т. И.М.СЕЧЕНОВА

На правах рукописи УДК 616.973-078.814

КОЛИКОВА Татыша Гурьовна

С ОВЕРШЕНС ТВОВАШТЗ КУЛЬТТРАЛЬНО.1 -ДИШОСЖИ ГОНОРЕИ (ПИТАТНШШ СРЕШ И СПОСОБА ОПРЕДЕЛЕНИЯ САХЛРОЛИТИ-ЧЕСКИХ СВОЧСТВ ГОНОКОККА)

03.00.07 - Микробиология

АВТОР Е 5Е Р А Т

диссертации па соискание учеяоЗ степени кандидата биологических наук

Москва - 1952

■ л3-.

Работа выполнена в Центральном научно-исследовательском кояно-венерслогическог* институте Министерства здравоохранения Российской Федерации.

научные руководители

Доктор медицинских наук, профессор В.Н.БЕДНОВА Доктор биологических наук, профессор В.£>.РУН0ВА

ОФЩИЛЛЫШ ОППОНЕНТЫ Доктор медицинских наук, профессор С.Д.ВОРОПАЕВА Кандидат медицинских наук, доцент Е.П.ПАШКОВ

Ведущее учреждение - Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И .Мечникова РАМН.

Защита диссертации состоятся " " _1992г.

в часов на заседании специализированного совета (Д 074.05.010) при Московской Медицинской Академии им. П.М.Сеченова по адресу: 119881, г.Москва, Б.Пироговс-кая ул., д.2/6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ММА им. И.М.Сеченова (119042, Москва, Зубовский бульвар,д.37/1).

■ Автореферат разослан " ___1992г.

Учений секретарь . специализированного совета .

кандидат медицинских наук , А.Ю.Глрояов'••"■'

ОБЩАЯ ХАРАКЗЕРИСЖА РАБОТ1

Актуальность проблема. Несмотря на успехи в лечении и профилактике гонореи, эта инфекция остается распространенной з настоящее время. По оценке экспертов ВОЗ (1390) енэгодпо в миро регистрируется 250 дин.человек, заболевших гонореей. По дантгым статистического учета з последние годи в бывшем СССР начался рост заболеваемости гонореей. Если в 1987 г. он составил 36,3 случая на 100 тцс.яитэлей, то в 1988г. он бил уяе 90,7, а в 1989 г. -- 104,9 случаев. Рост этой инфекции продолжается и по настоящее время, при этом темпы его нарастают.

Многие исследователи считают, что причинами роста гонореи гогут бить;, повышение резистентности гонококка к некоторым антибиотикам, появление штаммов, продуцирующих бета-лактамазу, образование Л-^орм гонококка, а такие увеличение числа больных с субъек-тивно-ассимптошоЛ и вялотекущей гонореей. Все это монет быть следствием самолечения и широкого применения лекарственных препаратов в субоптикальных.дозах Ctypолова E.H., Частикова A.B., Антонова I.B., 1983; Шеркарич С.М., 1984; Бедноза В.Н., Данилова Т.Е., Кащева Г.С., 1987;" Оганесян М.Г., 1990; и др.).

Однол из эпидемиологических особенностей гонореи в настоящее время является широкое распространение es гомосексуальным путем (Шакиров М.Т.,1991).--По данным BOS (1990) гомосексуалисты чаще других являются переносчиками венерических болезней ив ряде случаев составляют 50/1 всех больных. Эпидемиологическая опасность усугубляется частой:сменой партнеров, которая может достигать до 120 и более человек з год" ( ffuioox B.R. ,1981). Среди гомосексуалистов широко распространены орогенитальные, аногеннталыше и ороаналыые контакты, что влечег за■ собой, инфицирование ротоглотки и прщлой кшки патогенны.® !,1икроорганизглшя1 (Шакиров М.Т., 1991).

По мнению Ю.К.Скрипкина, Г.Я.Шараповой, Г.Д.Сзлисского (1985) факгорглга, способствующими распространению заболеваний, передающихся половым путем, являются социальные противоречия, приводящие к развитию проституции, порнографии, либерализации интимных отношений, гомосексуализма, половых преступлений и т.д.

Многочисленные сообщения отечественных и зарубежных исследователей свидетельствуют об увеличении числа случаев экстрагевитальной гонореи у лиц с измененным сексуальным поведением. Частота фа-рингэяльной гонореи, по их сообщениям, колеблется от 2,5 до 37$, а анороктальной - от 3 до 75!? (Глозман В.Н., 1978; Капцева Г.С., 1979; Мастбаум М.Д.,1985; Шакиров М. Г. ,1931 ;Бгаао К.В.о! а1. , 1983;С1ау ¿.С. е* а1.,1988; я др.).

Для диагностики гонореи из экстрагениталышх очагов,' а такке из тениталиев у детей и лиц, практикующих орогенитальные и аноге-нитальные половив контакты, методов бактериоскопии мазков и посевов на питальнне среда недостаточно, т.к.'в ротоглотка и прямой кишке могут находиться в качестве резидентной флоры другие грам-отрицательше кокки (Не1«шег1а,Вгап11кпе11а ), Эти микроорганизмы морфологически и тинкториально трудно отличимы от гонококка. Поэтому для идентификации гонококка в таких случаях необходимы специфические дифференциально-диагностические метода.

оа рубежом для этой цели применяют методы иммунофлюоресцен-ции и коагглютинации с поли- и моноклональныш антителами, ишунофер-мэнтный анализ, метод с использованием хрошгенных субстратов, утилизации углеводов и другие. Ряд зарубежных фирм выпускает коммерческие наборы и тест-системы для диагностики гонореи ( рншзаст , вопогш: ^оыосшк МЮТЕК ,АР1 ), Высокая, валютная стоимость соответствующих диагностических наборов не позволяет обеспечить потребности отечественного здравоохранения...'

■ ■ Цель работы. Соверпенствование культуральноЯ диагностики гонореи и .способов идентификации гонококка.

Еадачи исследования.

1. Разработка ново': селективной питательной■ среда для культивирования гонококка I»' выделения его в чистом виде.

2. Конструирование среды даст определения сахаролиткческих свойств гонококка- из стгредиентов, доступных для практических бактериологических лаборатории.

3. Разработка экономичных'способов идентификации гонококка на дийеренцпально-диагностическсЗ среде.

4. Разработка ускоренного теста для определен:« сахаролитпчес-ко:: активности гроштрлцательных коксов, на требующего для своего выполнения питательно;": среды.

Научная новизна работ; 1.

1. Предложена новая селективная среда с линкоглицшом гидрохлорид огл (2 ихг/г.'л) к полит,иконном М сульфатом (20 ЕД/гл) для культивирования гонококка и выделения его в чистой культуре, которая обладает высокими ингибирущими свойствами е отношении сопутствующих гакроорганизглов и не подавляет рост гонококка.

2. Сконструирована три варианта среды ферментации: с желтком куриного яйца (12-15*), сывороткойкрови человека (12-20*) и плаз-

?.:оЛ крови человека (12-14%), позволяющие выявлять типичные сахзроли-тичасют свойства гонококка и других видов граготрицателъных кокков. Для работы в практических бактериологических лабораториях рекомендовано использовать более доступную желточнута среду.

3. Разработан и вне,дрен в практическую работу экономичный од-ночашзчгсй способ идентификации гонококка на аелточной среде ферментации, при котором индикаторные растворы углеводов или стандарт--ные бумажные индикаторные диски с углеводами наносят на поверхность среды в одной чашке Петри,

4. Разработач новый экспресс-тес'т определения сахаролитичес- . ких свойств гонококка и других видов грамотрицательных.кокков с изотоническим раствором хлорида натрия в полистироловых панелях, сокращающий вреда исследования до 10-60 мин аместо 18-24 часов и-не требующий дая своего выполнения .дифференциально-диагностической среды.

Практическая ценность' работы.

Новая селективная среда с линкомицином гидрохлоридом (2 мкг/мл) и полимякспном М сульфатом (20 ЕД/ыл) позволяет высеват! гонококки ь чистой культуре из патологического материала от больяш более чем в 40!^ случаев. Внявляамость гонококка на ней повышается на 3-11% по сравнению с .результатам исследований на не селективной среде,, что особенно ваяно при диагностике хронической и ректальной гонореи.

Разработанные йоаке способы.идентификации гонококка.от других видов грачотрицательщх кокков являются надежными дифференциально--даагностиче сюита тестами. Применений их позволяет осуществлять диагностику гонореи урогенитального тракта у детей и взрослых, а тают экстрагештальных очагов (глотка, прямая кишка) у лиц с из-: шненнш.» сексуальным поведением. •

Внедрение в практику. . . -

Методики приготовления новой селективной среда для культивирования гонококка, аелточной среда ферментации, использования пятичашечного и одночааечного способов дифференциации гонококка от других видов грамотрщателышх кокков рекомендованы к исполь-зованиэ в бактериологических лабораториях конно-венерологичесрих диспансеров приказом й 1570 Минздрава СССР от -4 декабря 1386 "г. "Об.улучшении здязленкя!больных'гонореей и трпхомониазом в акушерских и гинекологических отделениях (палатах, кабинетах), жене-

ких консультациях и урологических кабинетах поликлиник".

Учаним поветом ЦКВИ утверждены два информационных листа: "Способ определения сахаролитических свойств гонококка с помощью стандартных индикаторных дисков с углеводами" (протокол .'5 7 от 27 июня 1989г.) и "Скспресс-тест определения сахаролитических свойств гонококка" (протокол 12 от 17 шаля 1990г.), которые были разосланы в областгзге (краевые) п республиканские кокно-ве-керологическке диспансеры. ■ .

Ученым советом ЦКВИ угвэрядено б рацпредложений, на которые получены удостоверения (.'.' 82 от 4.07.73, ¡Ь 115 от 21.12.81, .>,' 133 от 30.11.82, 134 от 30.11.82, Я 212 от 5.06.89, JS 224 от 24.09.

■so).

Разработанная нами селективная среда с линкомицином гидрохлоридом (2 ккг/мл) 'и полиаяксином М сульфатом (20 ЕДЛдл) согласно приказу Минздрава СССР Ге 1570 используется в практической работе большинства бактериологических лаборатории, занимающихся диагностикой гонореи.

Методики выполнения плгичашечного и одночашечного способов дифференциации гонококка от других видов грамотрицателышх кокков на нелточной среде внедрены в практику бактериологических лабораторий кояно-венерологичеснпс диспансеров в России (Москва, Московская область. Тверь, Нижний Новгород, Екатеринбург, Новосибирск), Литве (Вильнюс), Латвии (Рига), Молдове (Кишинев), Армении (Ере- ;

ван), Кыргызстане (Бишкек), на Украине (Винница) и зарэкоглендова- ,

I

ли себя как надежные дифференциально-диагностическио тесты. I

Экспресс-тест определения сахаролитических свойств гонококка ! и других видов грамотрицателышх кокков внедрен "в. фактическую ра- j боту:бактериологических лабораторий. ЦКВИ, КВД # I, й 3, ц 9 г.Москвы.)

..; б ;•.■■.■

Апробация тзаботы.

Диссертация апробирована на науннол конференции отделов микробиологии и венерологии Центрального научно-исследовательского кояно-зенеролопгческого ннстигута Минздрава Российской Седэрации 18 гарта 1992 г. •

Основные материалы работы долояекы и обсувдены на научной конференции молодых ученых ЦКВИ 22.05.79, IX Всесоюзном съезде " дерматовенерологов в Алма-Ате, 1991г., совместной конференции ЦКВИ с кафедрой ко;шых и венерических болезней 2 ШЛЕИ им. Н.И.Пирогова и Городской клинической больницы .'3 14 им.В.Г.Короленко 26.04.91, заседаниях лабораторное группы Московского общества дерматологов и венерологов 6.06.78, 1.03.90, 20.02.92.

Публикации.

, По материалам диссертации опубликовано 18 научных работ.

Основные положения, выносимые на защиту. ■

1. Разработана новая селективная питательная среда.для куль- , тивирования гонококка и выделения его в чистой культуре.

2. Сконструированы три варианта среды для определения сахаро-литических свойств гонококка и других видов грамотрицателышх кокков. ■1 ":.'.".'•'.

' 3. Предложен экономичный одночашочный способ на яелточнэй среде для идентификации гонококка и других видов грамотрицатель- . . ных кокков.

4. Разработан новый экспресс-тест дифференциации гонококка от других видов грамотрицателышх кокков.

Структура и объем -работы. . ,-.•

. ;' Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований (3 главы), заключения, выводов, указателя литературы. Работа излокени на 125 страницах машинописного текста, иллю-

стрирована 9 таблицами и 4 рисунками. Указатель литературы включает 73 отечественных и 183 зарубежных источника.

РЕЗУЛЬТАТУ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЯ v '

I. Разработка селективной среды с лшгкомпцттном гидрохлоридом и нолстдткспном М сульфатом для культурально": .диагностики гонореи и выделения чистой культуры гонококка. Задача разработки новой селективной среды, необходимой ь лабораторной диагностике гонореи, возникла в связи с прекращением производственного выпуска высоко-токсичного антибиотика ристомицина сульфата, который был необходим для приготовления селективной среды, разработанной Н.М.Овчинниковым и М.З.Яцухой в 1970г., содержащей рпстомицина сульфат (20 ЕД/мл) и полимпкепна М сульфат (25 ЕД/мл).

С целью изучения возможности замены ристомицина сульфата на линкомицина гидрохлорид, нами исследовались варианты селективной среды, содержащей линкомпцина гидрохлорид по 0,04, 0,4, 2,0, 4,0'мкг/гл и полит,иксина М сульфат по Г2,5, 15, 20, 25 ЕД/мя, которые добавляли к мясо-пептонному агару из кроличьего мяса, обогащенному сывороткой .крови крупного рогатого скота (20$) гидроли-затом казеина для парзнтераяьного белкового питания (2%), полута-ропроцентным раствором экстракта кормовых дрояяей (2%).

Первоначально изучали ингибирутощие свойства экспериментальных вариантов селективной среды в отношении чистых хсультур гонококка, стафилококка, грамполошпольной и грамотрицательной палочки, выделенных из патологического материала от больных с воспалительными процессами в урогенитальном тракте. Учет результатов осуществляли через сутки после культивирования микроорганизмов при 36-37° в* Г.0-20^ атмосфере углекислого газа. Контролем служила среда тога' же- состава без; антибиотиков. /:

В результате исследований, проведенных на II штаммах гонокок- р ка и 15 штаммах сопутствующих микроорганизмов, установлены оптимальные концентрации антибиотиков в новой ■ селективной среде -лин-комицина гидрохлорида - 2 икг/мл, полимиксина М сульрата - 20 ЕД/мл. : . Данный комплекс антибиотиков не оказывал ингибирущего действия : на гонококк и в значительной мере подавлял рост других мшфоорга-низмов.

В дальнейшем для оценки ингпбируицих свойств новой селективной среды производили посев патологического отделяемого 786 очагов от 138 больных с подозрением на гонорею. Ростовые качества опытной (селективной) и контрольной (неселективной) сред оценивали по интенсивности роста культур гонококка и сопутствующих микроорганизмов. Оценку осуществляли согласно методике М.В.Яцухи (1985): 4+'обильный сливной рост микроорганизмов по всей поверхности среды, 3+ менее обильный рост, 2+ более 10 колоний, 1+ единичные (до 10) колонии, 0 отсутствие роста микроорганизмов. Результаты этих исследований о.граяены в таблице !..

Исследования показали, что новая селективная среда обладает высокими ингибируицими свойствами в отношении сопутствующих микроорганизмов. Полное их отсутствие отмечалось в 43,5/5 случаев, в.то время как на неселективной среде - лишь з 11,8$. В то же время новая селективная среда способствовала более интенсивному росту гонококка.' Гонококк выявлен на ней в 95,2% случаев, причем наиболее интенсивный рост его отмечался в 63,4$, в то время .как на не.. селективной среде гонококк был обнаружен в 91,случаев, и наи-5 более изтоясийный рост его отмечался дишь э-39,7^. С . ■ ■ При необходимости идентификации гонококка по сахаролитичз.с--'" кжл свойствам, определения чувствительности его к антибиотикам или-выявления бета-лактамазной активности, особенно ваяно быстрое, выделение его в чистой культуре.

Среда

- Таблица I.

Интенсивность роста гонококка и сопутствующих микроорганизмов на неселективно! и новой селективной средах при посеве патологического отделяемого 186 очагов.поражения, от 138 больных.

?ост гонокоюса

I

• 3+

2+

О

Рост соцутструацих микроорганизмов

■ 4+

3+

2+

0

Неселективная 72 '50

38,75 25,9%

Новая селективная 118 34

63,45 18,35

28-

15,0^ 12

6,5^

20

10,85 13

7.0,1

IS

8,65

9

4,8/'

33 36

17,71 19,45

7 15 3,8*

43 52 22

23,15 28,05 11,85

22 61 81

11,85 32,85 43,55

Примечание: цифры 4+, 3+, -2\, 1+ обозначают интенсивность роста микроорганизмов, О - отсутствие роста микроорганизмов.

Сравнительное изучение результатов выделения чистых культур гонококка в первичных посевах от больных на неселективной и новой селективной средах показало значительное преимущество второй. Так, при посеве патологического материала из 385 очагов поражения от 300 больных с различными формами гонореи, гонококк вырос в чистой культуре в первичных посевах из 168 (43,б£) очагов на новой селективной среде и лишь из 48 (12,4%) очагов на неселективной. Результаты представлены в таблица 2.

Таблица 2.

.Результаты выделения гонококка в чистой культуре

в первичных посевах патологического материала от больных.

Среда Число выделенных чистых культур гонококка

Мужчины' .(215) Генщиш (170) Всего очагов(385)

Неселективная V 21 27 48 (12,4^)

Новая селективная 77 9Г 168 (43,63)

Для оценки диагностического значения использования новой селективной среда сравнивали результаты лабораторного обследования 162 больннх бактертос кодяче скшг и б акте рлологэтэ скин методами исследований. Результаты представлены в таблице 3.

• Таблица 3.

Сравнительные результаты обследования больных бактерио- ;

скопическим и бактериологический методами исследования.

Метод исследования Выявление гонокош:а ' " • ■■■•■■;

. ..;. иужчинылх^.)-.-.. ■ ленидош,. (&/1 - зсего аьг)

'СБактериоск'ШчвогаО 108 (8в23 (75,67?;) I3&-.(8âfX^)

Бактериологический , ^ . „ ' ''■''',

на неселактивной среде 116 (92,8$ 34 (91,8^) , 150 (92,6^)

Бактериологически,'; , . , „

на селективной среде- . 123 (93,4^)......37 .(ICO*) 160(98,82)

!

Из таблицы видно, что использование ново:!' селективно-} срз;г: с линкомицином гидрохлоридом (2 ют/мл) и ПОЛИМИКСПУОЛ !.! сульфатом (20 ЕД/мл) повысило качество лабораторной -доагносгш« гонореи при обследовании данной- группы больных на С,2% по сравнение с использованием неселективной среды и на 16,75 по сралкешиз с рз-зультатами бактериоскопии мазков. .

Особенно важное значение имело применение новей селзктпЕксй среда при обследовании больных с хропическпшг и зялогекуяжги Формат гонореи, а такие в диагностике гонореи прямой каикн и глотки. Так, обследование 97 очагов •поранения у 60 больных с хронической гонореей с помощью новой селективной среды способствоБало дсполкх-тельному выявлению гонореи из 10 очагов, что составило 10,25. Использование разработанной нами селективной среды позволило М.Д. Мастбауму (1985), занимаваеиуся диагностикой аноректальной гонореи, при обследовании 230 женэдн ¡¡г 106 мужчин - гомосексуалистов, увеличить выявление гонококка из прямой кишки в 5,£ раз по сравнению с применением питательной среды без антибиотиков.

Таким образом, разработанная в результате проведанных исследований новая селективная среда с линкомицином гидрохлоридом (2 мкг/мл) и полимиксином М сульфатом (20 ЕД/мл) шляется высококачественной средой, повышает эффективность бактериологического метода диагностики-гонореи и способствует выделению чистых культур гонококка в первичных посевах патологического материала от больных.

2. Среды ферментации и способы, определения сяхаролитичэских свойств гонококка. Для диагчоотлхс гопсреи у лиц с измененным сексуальным поведением, а также при подозре.чте гонореи у детей,-.необходимо пргачаш методы идентн^тации гонококка. Нслсолое пш-смяемым для уоА'овьЯ в-нал'их бакгерасдоталесзл: лгоорлор&гх шля-' ется метод определения сахаротатячзских свойств ж{рооуганпзг.:оъ, высоко специфичный и не требующий дополнительной аппаратуры.

2.1. Конструирование среды мл,0, определения сахаролитических сво"ств гонококка. При выполнении этих исследований за основу . била взята среда ферментации-Jubila (1983), имеющая в своем составе асцитичсскуэ падкость, углевода и индикатор. Изучалась возможность замены дефицитной в ' настоящее время асцитической лютости тасгк: обогащазхцимя компонентами, как сыворотка и плазма крови человека, сыворотка крови крупного рогатого скота, дрояяевой ауто-ллзат, гидролизат казеина, желток куриного яйца.

Ростовые свойства исследуемых вариантов среды и способность их выявлять сахаролитическиь свойства гонококка .изучали на музейных втайне», полученных в отделе живых культур ШСК им. JI. А. Тарасовича, а таюне выделенных от больных в отделе микробиологии ЦКЗИ. В результате исследований, проведенных на 128 штаммах гонококка, пололпгтельные результаты пслучэш на трех вариантах среды ферментации: с яелтком куриного яйца (12-155), сывороткой крови человека (12-2?'%) и плазмой крови человека (I2-I4fJ), т.к. на них штамма' гонококка интенсивно росли и типично утилизировали углеводы, т.е. разлагали глюкозу и не разлагали мальтозу.-

Для работы в практических бактериологических лабораториях было рекомендовано использовать, как более-доступную и дешевую, келточную среду ферментации следующего состава: 100 мл мясо-пеп-тонного агара из кроличьего мяса, 13 мл желтка свехего куриного яйца, 1,5г углевода, растворенного в 2 мл дистиллированной воды, 6 мл 0,2% раствора индикатора фенолового красного (рН=7,6).

2.2. ГТятичашечта'-:' способ определения ферментативных свойств гонококка и других видов грамотрицательных кокков. Для определения вида микроорганизма с целью установления этиологического диагноза необходима дифференциация грамотрицательных кокков, выделенных от больных. Согласно данным Еерги (1980) микроорганизмы родов "Oieseria Brnnha-nalla .. отличаются по способности ути-

.тезировать углеводы, что представлено в таблице 4.

Таблица 4.

Сахаролитические свойства грамотрицательных коккоз.

Микроорганизмы

П.вопоггЬовае

tl.nenlnEltl.cLle

И.01соа

И.Патга

Л.эиЪПауа

М.ГХауввоепв

11.писоба

Br.cataxтhallв

Углеводы

глюкоза мальтоза фруктоза.. сахароза ластоза + ' - - _ _

+

+ + + +

+ +

2.

Обозначения: + разложение углеводов,

- отсутствие разложения углеводов, + непостоянный признак разложения углевода. • , Учитывая' вышеизложенное, при обнаружении у больных грамотри-цательных кокков, предложено применять пятичашечныл способ идентификации, т.е. выявлять сахаролитическую активность исследуемого--микроорганизма в отношении пяти углеводэз: глюкозы, мальтозы, фруктозы, сахарозы и лактозы. : '

Чистые суточные культуры грамотрпцателышх кокков гасевалн на поверхность среди ферментации. с желтком цургдого яйца, приготовленной как указэко выше,- ь пяти чалках с разными тгллгод-'зми, в виде двух ьзшасюпэргондикулярных штрихов длиной Г см. Культивировали 18-24 часа в термостате при 36-37°С во злаияой камере без создания атмосферы с повышенным содержанием углекислого газа.

+

Пг;:: разлегвшп углевода красна.! цвет .среда в зоне роста микроба становился .желтым, а при отсутствии разложения углевода среда ос- •

Пг.ткчгд:ечнкм способом определены сахаролитичоские свойства ■ 2ЕЭ ^¡кросргглпзмов: 193 штаммов гонококка и 93 штамма других гра-отр^затольнах кокков, как музейных, так и выделенных от боль-г.::х. 3 качестве контроля использовали среду ферментации с асцити-•;оо':с": жидкостью. На опытной и контрольной средах получены аналогично рззультаты, т.е. все микроорганизмы типично для них утили-опрсвали углевода.

2.3, способ идентификации грамоттенцательннх-

О целью удошаазнпи методики определения сахаролитичес-кпх свойств гонококка и других видоз грамотрицательных кокков катя: разработан способ, при котором индикаторные растворы пяти углевого;; наносили по одной капле на поверхность желточной среды в одно.; чг-лкз, установленной на горизонтальной плоскости. 3 результате сгого среда окрашивалась в красный цвет в пята секторах.

Дед определения оптимальных концентраций углеводов п индикатора испытаны их разные концентрации в растворе. Стабильные результаты получал:: при использовании. 70$ растворов углеводов, содержащих 0,2;» индикатора фенолового красного (рН=7,4-7,5), которые стерилизовали кипячением в водяной бане в течение 15-20 мин и хранили в холодильнике при 4-5°С в течение года.

1*с следуемые чистые культуры грамотрицательных кот-сков засевали е ьцдз двух взаимноперпендикулярных штрихов дайной I см на окра-г:оЕые индикаторными растворами углеводов 'участки среды в пяти • секторах в одной чайке. Вид'микроорганизма определяли по разложе-::хо углеводов, что выражалось в изменении красного'цвета-среда ыа зелтый в соответствующих секторах. ■ ,"■"■

В дальнейшем, с цельэ 'унификации одночащочного способа било рекомендовано использовать отандартн^а фиагше индикаторные дхскя с углеводами, выпускаете предприятием пс производству бактерийных препаратов в Еаянем Новгороде,- вместо индикаторных растворов углеводов лабораторного приготовления. Для этого производили пссоз исследуемой монокультуры на поверхность ыясо-пептонного агар?, ез кроличьего мяса," обогащенного желтка куриного яйца, как ука?а-ко выше, в четырех секторах. Затем на зона посева кявроба накладывали по одному из индикаторных дисков с углеводами: глюкозой,мальтозой, . лактозой и сахарозой. После инкубирования во атакной каттере при 36-37°С в.течение 18-24 часов регкстрировалп результаты исследования. Яри расщеплении углевода микроорганизмом первоначальной красный цвет диска изменялся на желтый, а при отсутствии разложения углевода оставался красным.

Всего одночашечным способом определены сахаролиткческиэ свойства 37Э микроорганизмов: 307 штаммов гонококка и 72 штамма других видов- грамотрицательных кокков,как музейных, так и выделенных от больных. . ' ■

В качестве контроля использовали пятичашечшй способ на средах ферментации с асцитической жидкостью и желтком куриного яйца. Все исследуемые "микроорганизмы проявляли типичные сахаролитические свойства как в контроле, так л в опыте

3. "ксяресс-тест определения сахаролитическпх свойств гонококка п других" видов грамотрицатолъных коккоь.' С целью исключения пшевых продуктов из среды; а тташ сокращения сроков исследования, разработан быстрый даМ'еренЕгааяьно-д^рвоспгчеокгй! тест,при котором разложение углеводов идет за счет конститутивных фешзн-тов густой взвеси микроорганизмов, что сскрашазт вреи'я исследсва-. нля до 10-60 мин.-вместо 18-24'часов.

При разработке теста в качестве основы субстрата изучали трискалеатЕкЗ буферный раствор (рН=7,4), фосфатно-солевой бу^ер-ный раствор СрН=7,2), изотопический 'раствор хлорида натрия (рН=3,8-7,0). Быстрые стабилыше результата регистрировали при использовании изотонического раствора хлорида натрия.

"ля определения оптимальных концентраций углеводов и индикатора в субстрате испытаны 0,1$, 0,3?, О,растворы углеводов к . Л,4*, 0,2*, 0,04^ растворы индикатора фенолового красного (рН=7,4). Лучшие результата получили при использовании индикаторных растворов углеводов, содержащих 0,04$ фенолового красного и 0,5* углевода (глюкоза, мальтоза, лактоза, фруктоза и сахароза).

Установлена прямая зависимость ферма нтагпачо'; активности гонококка от густоты взвеси исследуемой культуры. Более быстрые и четкие результаты получали -со взвесями гонококка, содержащими более 1,5 млрд микробных тел в 0,1 шс изотонического раствора хлорида натрия.

• Методика постановки гкслтесс-теста. В пробирке с 0,5 мл стандартного изотонического' раствора хлорида натрия готовили взвесь исследуемой монокультуры, собранной со скошенного агара из 1-2 пробирок с интенсивным ростом микроорганизма, эмульгировали. Полученную однородную взвесь разливали по 0,1 мл в пять лунок полистироловой панели, а затем добавляли по 0,05 мл стерильных индикаторных растворов,.содержащих 0,6* углевода одного наименования (глюкоза, мальтоза, лактоза, сахароза, фруктоза) и 0,04$ индикатора фенолового красного, в..соответствующие, лунки. Панель помещали в термостат, предварительно накрыв крышкой. Учет результатов результатов реакции ферментации углеводов осуществ- / ляли периодически в течение одного часа. При..' разлояении. угле-; .. вода первоначальный красный цвет субстрата становился келтшл,■"..,. а при отсутствии разложения оставался красным.. Так,' при "наличии .,:■ гонококка изменение красного' цвета' субстрата на аелтый происхо-::

дит только в-лунке с глюкозой.

Всего -экспресс-тестом было идентифицировано ^ микроорганизма: 128 штаммов гонококка, и 25 штаммов других видов грачотрица-тельных коккоз. В качестве 'контроля использовали одночашечнц" способ на яелточнок среде. Все штаммы проявляли типичные сахаро-литические свойства, как в контроле, так и в опыте.

окспресс-тест позволил идентифицировать исследуемые монокультуры в течение 10-60 мин, по сравнению с 18-24 часами при использовании бактериологического метода на среде ферментации. Кроме . того, экспресс-тест экономичен и прост, т.к. для его выполнения не требуется питательная среда из пищевого сырья и дорогостоящие ' ингредиенты, что позволило рекомендовать его для внедретия в практику.

В процессе выполнения данной работы о помощью трех яредлстленных способов-определены типичные сахаролитические свойства 205 музейных штаммов:'.140 штаммов гонококка и 65 других видов гра-лотри-цательных коккоз, 616 штаммов, выделенных от больных: 491 - гонококк и 125 - другие виды грамотрицателъных коккоз. Из 616 обследованных на гонорею лиц удалось подтвердить диагноз гонореи у детей в 71 случае, обнаружить гонококк з экстрагенитальных очагах у 26больнкх, а в урогешттальном тракте - у 394, а такае определить другие виды грамотрицательных кокков из-мочеполовых органов у 8 пациентов,, а из экстрагенитальных очагов - у 117, что не было бы возмоянс без применения теста утилизации углеводов.

Таким образом, предлагаемые наш способы идентификации грам-отрицательных кокков являются нздешымн .даф^еренциапько-даагкостп-ческиш тестами и могут использоваться в бактериологических, лабо-раторшас; коино-венврологачеоких 'учреждений при диагностика гонореи.

18 " В Т.Т В 0 л

I..Разработана новая селективная питательная среда для культивирования гонококка на осаовз мясо-лептонного агара с добавлением лг-п'-сгспска ГЕдрохлэрпда - 2 ккг/мл и полголпссина И сульфата -- 20 ЗГ/мч, которая повышает эффективность бактериологического метода диагностики гонореи.

2. Использование ново;": селективно"! среда обеспечивало выявление гонора;: у больных в 95,2 - 98,8$ случаев. Наиболее интенсивны:: рост колонй1 гонококка на ней регистрирован е 63,4$.

3. Применение новой селективной среды, обладающей высокими икгибпрзг:хсс.1и свойства*.;? в отношении сопутствующих гяпфоорганиз-:.:ов, позволяло выделить гонококк в чистой культуре из первичных посевов патологического отделяемого мочеполовых органов от 300 больных в 43,6$ случаев. ; .

4. Дяя определения сахаролптических свойств гонококка сконструировали три варианта среды ферментации: о желтком куриного яйца (12-15$), сывороткой крови человека (12-20$) и плазмой крови человека (12-14$). Гелтсчыая среда, как более доступная и дешевая, рекомендована для использования в практических бактериологических лабораториях ко::-:но-венерологических учреждений.

5. С целью дифференциации гонококка от других видов грамот-рицателышх кокков, выделенных от больных с воспалительным процессом в урогенитальном тракте или экстрагенптальнцх очагах поражения, впервые предложен одночашечный способ определения, его сахаролптических свойств на еолточной среде с использование!.: индикатор ных растворов пяти углеводов пли стандартных бумажных индикаторных дисков с углевода!.®, ¿.титл способом идентифицировано 379 культур грамотрицательных кокков. .

6. Впервые в напей страна разработан новый экспресс-тэс? определения сахаролитических свойотз гонококка и других видов грамотрпцателышх кокков с изотонически.' раствором хлорида натрия в полистироловшс панелях. Данный тест сокр~д-.эт зре.\п исследования культур до 10-60 мин вместо 18-24 часов и не требует для своего выполнения питательной среды фермонтащп!.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕ1.Е ДИССЕРТАЦИИ

I. Еелточная среда для определения ферментативных свойств гонококка /Т.Г.Коликова, В.Н.Ееднова, Т.И.Данклоьа, М.З.Яцуха //Вестн.дер.гатол.вонерол.-1978.-& 12,- С.13-16 .

. 2. К" вопросу об.зкстрагенитальной локализации гонорейпой инфенцпи /Г.С.Капцева, В.Н.Беднова, З.В.Ковалева, Т.Г.Коликова -//Вестн.дерматол.венерол.-1975,- й 6,- С.39-63 .

3. Колакова Т.Г., Беднова З.Н., Кзшцева Г.С. Определение сахаролитических свойств нейссерий на среде с желтком свежего .куриного яйца //Республ.сборник: Клиника, патогенез, лечение

и профилактика конных и венеричеиих болезней. -Горький,1979.--Ч.2.- С.66-68 .

4. Беднова З.Н., Данилова 'Т.Н.,.Колакова Т.Г. Современные методы лабораторной диагностики гонореи/Л!-лы ХШ респ.конф. дерматовенерол.Эстонии. -Тарту, 1979.-;5 503.- С.27-28 .

• ■ . ■ 5. Колакова Т.Г. Методика приготовления среды с желтком куриного яйца для определения сахаролитических свойств не2с-серий//Иэз.докд. I науч.практ.конф. дерматозенерол. Латвии. --Рига, 1980. - С.66-63 .

3. Лабораторная диагностика, гонореи и трихомониаза на современном гтаг.е /В.Н.Геднова, М.В.Яцуха, Т.Н.Данилова, Т.Г.Коликова . :: др./ /Тез.докл.4-го Украинского съезда дерматовенерол.-Харьков, "£83. -0.72-73 .

7. Гвднсза В.П., Данилова Т.Н., Коликова Т.Т. Среда с поли-:л::со:;нс:.: .".' сульфатом и япнжомицаном гидрохлоридом для культураль-нс:: диагностика гонореи.//Тез.докл.неу^;.-практ.конф. врачей дерма? озонорол,- Взлыпзс, 1281.-С.46-47 .

Б. Результаты научно-прачтяческой апробации сухой ляо&мизи-ровснной' питательной среди для культуральной диагностики гонореи. /З.Н.ГодноЕа, !.!.В..1цуха, Т.Н.Данилсва, Т.Г.Коликова и др.

//Зсст.дорматол.Епкерол.-ГС-е!.-;; 3.-С.38-41 '. • ,

0. Коликова Т.Г. Модификация методики определения сахаролити-чеекпх свойств :шйссер:й.//Тез.доюл.кауч.-практ.конф., посвгщ. ;7С-лет:гэ Туркменского Ш1 косных болезной.-Алхабад,1982.-С.64-66.

10. К вопросу о совершенствовании лабораторной диагаостики гоноре::. /В.Н.Геднова, Т.Н.Данилова, Г.С.Капцева, Т.Г.Коликова :; др./ /йз.докл.1 съезда дерматовенерол4БССР.-Минск,1982.- . С.£"53-204 . '

11. Коликова Т.Г., Данилова Т.Н. Определение сахаролитп-ческкх свойств гонококка с использованием стандартных индикаторных систем.//Тез.доклЛУ Всесоюз.съезда дерматовенерол.-Челябинск , 1989 .-С. 138-199 .

12. Коликова Т.Г. Конструирование среды для определения сахаролитическях свойств гонококка.//Швх.докл.ЩО "Питательные . среды": Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии.--Махачкала, 1990.-С.103-105

13. Результаты изучения сахаролитических. свойств грамотри- ■;•-. цатгльии:-кокков из.уро- и гкстратениталы-шх'очагов поражения. /Т.Г.Коликова, Г.С.Капцева, : Т.Н.Данилова и др./ /1Ьз.докл.9-го.

. Все союз, съезда доркатовекерод.-Алма-Ата,I99T .-43.4C-4I. .

14. Беднова 13.11., Каткова Т.Г., РунопаЗ.З. ¿кслр:сс-т?ст определения сахаролитических свойств гонококка.//Тез.дскл.2-го Всесоюз, съезда дерматоЕенерол.-Алма-Ата,1931.-С.15 .

15. Беднова В .П., Колгкова Т.Г., Данилова Т.Н. Опрэгдтапго сахаролитячееклх свойств гонококка.//Вестн.деркатол.вопорол.-

:-I99I.-.'S 4.-С.25-26 .

16. Данилова Т.Н., Коликова Т.Г. Способ олределонля сехаро-лптяческкх свойств гонококка с помощью стандартных 1пгдика?ор:г:х дисков с углезодата./А!естз.д9р1:атол.Еэнерол.-1991.-:' I.-С.79-79 .

17. Капцева Г.С., Коликова Т.Г. Выявление гонококка и других нейссерий из половых органов и экстрагениталькых очагов.

//М-лы 717. научн.практ.конф.дерматовзнерол.Рязанской обл.-Рязань, 1991.-С.55-57, .

18. Коликова Т.Г,, Капцеза Г.С., Боровик B.S. Диагност::- ■ ческая ценность метода определения сахарэлптнчэскьх свойств гонококка.//М-лц ИХ нэучн.-практ.конф.дерматовзнерол. Рязанской обл.-Рязань,1391.-С.60-61, ...

Заказ 492 тираж 100 экз.Ротапринт ЗДТаТ

М.Пироговская' ул.,д.1