Совершенствование этиологической диагностики обострений хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких у детей

Саматова, Елена Валерьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Совершенствование этиологической диагностики обострений хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких у детей
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование этиологической диагностики обострений хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких у детей"

005060735

На правах рукописи

Саматова Елена Валерьевна

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ЭТИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ОБОСТРЕНИЙ ХРОНИЧЕСКИХ

ИНФЕКЦИОННО-ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

ЛЕГКИХ У ДЕТЕЙ

03.02.03 - Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

61':0:І ¿013

Челябинск — 2013

005060735

Работа выполнена на кафедре клинической лабораторной диагностики и бактериологии факультета повышения квалификации и профессиональной переподготовки Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Уральская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

■ доктор медицинских наук, доцент

Боронина Любовь Григорьевна

Официальные оппоненты:

Бурмистрова Александра Леонидовна доктор медицинских наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Челябинский государственный университет», кафедра микробиологии, заведующая

Иванов Андрей Михайлович доктор медицинских наук, профессор, ФГКВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С. М. Кирова» Министерства обороны Российской Федерации, кафедра клинической биохимии и лабораторной диагностики, заведующий

Ведущая организация: Федеральное бюджетное учреждение науки «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера».

Защита _ диссертации состоится « ¿У- » ¿¿/¿РА?б/ 2013 года в часов на заседании Диссертационного совета Д 208.117.03 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, по адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации. г"

Автореферат разослан _2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Ю.С. Шиїїікова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования и степень её разработанности

Проблема хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких (ХИВЗЛ) у детей была и остается одной из наиболее актуальных и сложных вопросов в педиатрии и клинической медицине в целом (Хронические заболевания легких у детей. Под ред. H.H. Розиновой, ЮЛ. Мизерницкого. М.: Практика, 2011. 224 е.). Статистические и эпидемиологические данные подтверждают рост распространенности ХИВЗЛ у взрослого и детского населения (Пульмонология детского возраста: проблемы и решения. Под ред. ЮЛ. Мизерницкого, А.Д. Царегородцева, A.A. Корсунского. М., 2008. Вып. 8. 176 е.). Нередко бронхолегочные болезни, начавшись у детей, продолжаются в зрелом возрасте, приводят больных к инвалидности, а иногда - к смертельным исходам.

Несмотря на значительные успехи, достигнутые в диагностике и лечении обострений ХИВЗЛ у детей, многие вопросы, затрагивающие эту патологию, требуют обсуждения. Существующая нормативная база по лабораторной диагностике ХИВЗЛ рассчитана преимущественно на взрослых пациентов (Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях ЛПУ: приказ М-ва здравоохранения СССР № 535 от 22 апреля 1985 г. М., 1985. 126 е.; Барлетт Д.Д. Инфекции дыхательных путей. М.: Бином, 2000. 192 е.; Зубков М.Н. Практическое руководство по клинической микробиологии и антимикробной терапии для врачей стационарной помощи. М.: Издательство МГУП, 2002. 272 е.).

В руководствах как отечественных, так и зарубежных существуют значительные разночтения в соотношении и составе клеточных элементов, количестве просматриваемых полей зрения и других приемов микроскопического исследования мокроты у взрослых с инфекционной бронхолегочной патологией. А микробиологическое исследование мокроты в педиатрии вообще не имеет широкого применения из-за трудностей в сборе материала и отсутствии однозначных критериев микроскопической оценки качества мокроты для культурального исследования (Зубков М.Н. Практическое руководство по клинической микробиологии и антимикробной терапии для врачей стационарной помощи. М.: Издательство МГУП, 2002. 272 е.).

Для бактериологического анализа отделяемого дыхательных путей наиболее часто используют 5% кровяной агар, среду для посева и выделения Streptococcus pneumoniae по прописи Л.К. Катосовой, агар с сердечной вытяжкой, которые имеют либо низкие ростовые свойства для «прихотливых» микроорганизмов, в частности для пневмококка, или высокую себестоимость из-за применения дефицитных компонентов в приготовлении, которые недоступны для большинства практических лабораторий (Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях ЛПУ: приказ М-ва

здравоохранения СССР № 535 от 22 апреля 1985 г. М., 1985. 126 е.; Кречикова О.И. и соавт. Выделение, идентификация и определение чувствительности к антибиотикам Streptococcus pneumoniae. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2000. Т. 2, № 1. С. 88-89).

Исследования последних лет свидетельствуют, что неспорообразующие анаэробы и их ассоциации с аэробами играют важную роль в развитии как острой, так и обострения хронической инфекции при легочной патологии. Но из-за трудностей, связанных с выделением анаэробных бактерий и необходимым для этого временем, диагноз анаэробных инфекций нередко основывается только на предположении (Белобородова Н.В. и соавт. Диагностика анаэробной инфекции у детей методом хроматографии: метод, рекомендации. Режим доступа:

http://\vww.rusmedserv.com/microbiology/mikrdiag/article_10.html).

Поэтому для своевременной и качественной диагностики обострений ХИВЗЛ у детей требуется изучение этиологической роли разных микроорганизмов, в том числе их биотипов и серотипов, их антибиотикочувствительности и оценка диагностических возможностей, как культурального исследования клинически значимого материала, так и других лабораторных методов. Кроме того, выявление возбудителей необходимо как для назначения рациональной этиотропной антибактериальной терапии, так и прогнозируемой эмпирической, а также для применения различных методов профилактики обострений ХИВЗЛ у детей.

Цель исследования

Усовершенствовать методы и критерии оценки результатов этиологической диагностики обострений хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких у детей.

Задачи исследования

1. Оценить диагностическую ценность для культурального исследования у детей образцов мокроты, обнаруживающих при микроскопии менее 25 полиморфноядерных лейкоцитов и более 10 десквамированного плоскоклеточного эпителия.

2. Разработать доступную питательную среду для выделения, культивирования бактерий и ускоренный способ обнаружения ß-лактамазопродуцирующих штаммов Moraxella catarrhalis из клинического материала.

3. Определить критерии оценки результатов выявления маркеров бактериальной инфекции методом газожидкостной хроматографии при обострении хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких у детей.

4. Установить частоту встречаемости серотипов Streptococcus pneumoniae, выделенных при обострении хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких у детей в Екатеринбурге и Свердловской области.

5. Оценить возможность использования и диагностическую значимость различных методов определения этиологии обострения хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких у детей.

Методология и методы исследования

С 2009 по 2011 гг. был обследован 241 ребенок в возрасте от года до 17 лет, проживающий в Екатеринбурге и городах Свердловской области, с обострением разных нозологических форм ХИВЗЛ: бронхоэктатической болезни (п = 133) и хронического бронхита (п = 108). Дети проходили лечение в торакальном отделении ГБУЗ СО «Областная детская клиническая больница № 1» г. Екатеринбурга. Среди пациентов было 132 (54,8%) мальчика и 109 (45,2%) девочек (соотношение 1,2:1). В динамике обследовано 95 детей.

В контрольную группу были включены дети без инфекционной бронхолегочной патологии (воронкообразная деформация грудной клетки, инородное тело дыхательных путей, атрезия пищевода, рубцовый стеноз пищевода, стеноз трахеи, у которых в общем анализе крови признаков воспаления нет) (п = 45).

Для решения поставленных цели и задач исследования использовались следующие методы: микроскопический, культуральный, молекулярно-генетический, непрямой иммунофлюоресценции, газожидкостной хроматографии, серологический (иммуноферментный анализ).

Исследование одобрено локальным комитетом по этическим вопросам при ГБУЗ СО «ОДКБ № 1» протокол № 24 от 30.10.2012 года.

Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора

Достоверность результатов работы, обоснованность выводов и рекомендаций базируется на достаточном числе наблюдений и использовании современных методов статистической обработки материалов исследования, при консультативном участии специалистов в области математического анализа, с использованием программ: Statistica ® (Data analysis software system, StatSoft) версия 6.0, Microsoft Excel.

Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на III международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения - 2009. К 160-летию академика И.П. Павлова» (Санкт-Петербург, декабрь 2009); конференции с международным участием «Фармация и общественное здоровье» (Екатеринбург, февраль 2010); XII-ом международном конгрессе по антимикробной терапии Межрегиональной ассоциации по клинической микробиологии и антимикробной химиотерапии (Москва, май 2010); VII международной научно-практической конференции «Актуальные научные достижения 2011» (Чехия, июнь-июль 2011); Российской научно-практической конференции «Национальные дни лабораторной медицины России-2011» (Москва, октябрь 2011); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы эпидемиологии на современном этапе» (Москва, октябрь 2011); XIII-ом международном медицинском форуме «Стандарты и порядки медицинской

помощи, как основа повышения эффективности здравоохранения» — межрегиональной междисциплинарной научно-практической конференции «Современные стандарты и технологии диагностики, лечения и профилактики инфекционных болезней» (Нижний Новгород, апрель 2012); заседании общества эпидемиологов, микробиологов, паразитологов Свердловской области (Екатеринбург, февраль 2013).

Личное участие автора в получении научных результатов, изложенных в диссертации, выразилось в проведении научно-информационного поиска, анализа и обобщении данных специальной литературы, в предложении основной идеи и цели исследования, в разработке необходимых методологических подходов, в проведении 95% всех лабораторных исследований и сборе всего необходимого фактического материала. В едином целом автор представил современные методы диагностики (газожидкостную хроматографию, метод непрямой иммунофлюоресценции, полимеразную цепную реакцию, иммуноферментный анализ) и культуральное исследование, участвовал в разработке кровяно-сывороточного агара и способа выявления ß-лактамазопродуцирующих штаммов Moraxella catarrhalis. Автор сформулировал положения, выносимые на защиту, выводы и подготовил диссертационную работу.

Положения, выносимые на защиту

1. Определяющей характеристикой микроскопической оценки годности мокроты у детей для культурального исследования является наличие в мазке 1 и более полиморфноядерных лейкоцитов при отсутствии десквамированного плоскоклеточного эпителия, 10 и более полиморфноядерных лейкоцитов при 1-9 клеток десквамированного плоского эпителия, более 25 полиморфноядерных лейкоцитов при 10-24 клеток десквамированного плоского эпителия, в других случаях образцы не должны подлежать бактериологическому анализу.

2. При комплексном подходе к обследованию детей установлено, что помимо основных пневмотропных микроорганизмов, неспорообразующие анаэробы вызывают обострение хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких в 31% случаев.

3. Доказана диагностическая ценность метода газожидкостной хроматографии для выявления маркеров анаэробной инфекции в бронхоальвеолярном лаваже, мокроте, плевральном выпоте при обострении хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких у детей.

Научная новизна

Разработан и внедрен «Способ выявления ß-лактамазопродуцирующих оксидазопозитивных грамотрицательных диплококков, подозрительных на принадлежность к Moraxella catarrhalis» и получено положительное решение от 3 сентября 2012 г. о выдаче патента на изобретение по заявке от 15 июля 2011 г., №2011129509/10.

Разработана и внедрена «Питательная среда для выделения, культивирования и определения гемолитических свойств бактерий из клинического материала (кровяно-сывороточный агар)» и получено

положительное решение от 27 июля 2012 г. о выдаче патента на изобретение по заявке от 08 июля 2011 г., № 2011128466/10.

Установлена частота встречаемости серотипов S. pneumoniae, выделенных при обострении хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких у детей в Екатеринбурге и Свердловской области.

Определены критерии оценки результатов выявления маркеров бактериальной инфекции методом газожидкостной хроматографии при обострении хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких у детей.

По результатам комплексного подхода к обследованию детей установлена частота обострений хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких, вызванных неспорообразующими анаэробами: в монокультуре - 17,8% {Bacteroides spp.; Fusobacterium micleatum; Peptostreptococcus spp) и в ассоциации с основными пневмогропными микроорганизмами - 13,2% (Bacteroides spp. + 5. pneumoniae; Propionibacterium spp. + Pseudomonas aeruginosa + Escherichia coli\ Peptostreptococcus spp. + Bacteroides ureolyticus + Staphylococcus aureus; Eubacterium spp. + Respiratory Syncytial Virus).

Теоретическая н практическая значимость работы

Полученные данные могут быть использованы в работе практических лабораторий, а также при обучении в медицинском ВУЗе, включающем обучение ординаторов, курсантов факультетов повышения квалификации врачей и последипломной переподготовки специалистов.

Разработан алгоритм действий при микроскопической оценке качества мокроты у детей для культурального исследования.

Разработанные питательная среда для выделения, культивирования и определения гемолитических свойств бактерий из клинического материала (кровяно-сывороточный агар) и способ выявления ß-лактамазопродуцирующих оксидазопозитивных грамотрицательных диплококков, подозрительных на принадлежность к М. catarrhalis позволяют достоверно улучшить этиологическую диагностику обострений хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких у детей, вызванных 5. pneumoniae и ß-лактамазопродуцирующими штаммами М. catarrhalis.

Определена область применения метода газожидкостной хроматографии в диагностике обострений хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких у детей.

Установлена частота встречаемости у детей с обострением хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких различных серотипов S. pneumoniae, входящих в состав конъюгированных пневмококковых вакцин.

Предложен комплексный подход к обследованию детей с помощью газожидкостной хроматографии, метода непрямой иммунофлюоресценции, полимеразной цепной реакции, иммуноферментного анализа и культурального исследования для увеличения результативности этиологической диагностики обострений хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких.

Внедрение результатов исследования в практику

Разработаны и используются в учебном процессе кафедры клинической лабораторной диагностики и бактериологии факультета повышения квалификации и профессиональной переподготовки ГБОУ ВПО «Уральская государственная медицинская академия» Минздрава России учебно-методические пособия: 1) «Микробиологическое исследование мокроты у детей»; 2) «Лабораторные методы обнаружения, идентификации и определения резистентности к антибиотикам Moraxella catarrhalis».

Разработаны и внедрены в работу лаборатории клинической микробиологии ГБУЗ СО «ОДКБ № 1» (г. Екатеринбург): 1) алгоритм действий при микроскопической оценке качества мокроты у детей для культурального исследования; 2) способ выявления ß-лактамазопродуцирующих оксидазопозитивных грамотрицательных диплококков, подозрительных на принадлежность к Moraxella catarrhalis-, 3) критерии оценки результатов выявления маркеров бактериальной инфекции методом газожидкостной хроматографии при обострении хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких у детей; 4) питательная среда для выделения, культивирования и определения гемолитических свойств бактерий из клинического материала (кровяно-сывороточный агар). Питательная среда для выделения, культивирования и определения гемолитических свойств бактерий из клинического материала (кровяно-сывороточный агар) также внедрена в работу микробиологической лаборатории МБУ «Детская городская клиническая больница №11» (г. Екатеринбург).

Публикации

Автор имеет 48 опубликованных работ, из них по теме диссертации опубликованы 23 научные работы общим объёмом 151 печатная страница, в том числе 6 статей в научных журналах, которые включены в перечень российских рецензируемых научных журналов для опубликования основных научных результатов диссертаций, а также 1 работа в зарубежном научном издании.

Объем и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 131 странице машинописного текста, иллюстрированы 23 таблицами и 20 рисунками, состоят из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 153 источника, из них 84 - отечественных и 69 -зарубежных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Применительно к цели и задачам был сформирован дизайн исследования (таблица 1).

Таблица 1 — Дизайн исследования

I РАЗДЕЛ

Всего детей — 286

Микробиологическое исследование

мокроты, бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ), плеврального выпота, крови, мочи

отделяемого со слизистой зева, БАЛ, крови, мочи _

Дети с обострением ХИВЗЛ, п = 241

Дети без инфекционной бронхолегочной патологии, п = 45

II РАЗДЕЛ

Всего детей с обострением ХИВЗЛ — 241

1) Исследование устойчивости к антимикробным препаратам выделенных в диагностическом титре штаммов Н. influenzae, S. pneumoniae, М. catarrhalis

2) Молекулярно-генетическое типирование выделенных штаммов S. pneumoniae _111 РАЗДЕЛ___

_Всего детей с обострением ХИВЗЛ — 69_

Изучение роли вирусных и труднокультнвируемых бактерий определение IgG и IgM в сыворотке крови методом непрямой иммунофлюоресценции _IV РАЗДЕЛ__

Всего детей — 90

Изучение состояния гуморального иммунитета

определение нммуноферментным анализом в парных сыворотках крови уровня ^О

Дети с обострением ХИВЗЛ, п = 45

Дети без инфекционной бронхолегочной патологии, п = 45

V РАЗДЕЛ

Всего детей — 55

1) Определение мнкробных маркеров методом газожидкостной хроматографии в

мокроте, БАЛ, плевральном выпоте, сыворотке крови

БАЛ, сыворотке крови

2) Выявление ДНК Н. influenzae н S. pneumoniae методом ПЦР

мокроте, БАЛ, плевральном выпоте, сыворотке крови, моче

БАЛ, сыворотке крови, моче

Дети с обострением ХИВЗЛ, п = 45

Дети без инфекционной бронхолегочной патологии, n = 10

Объем проведенных исследований показан в таблице 2. Таблица 2 - Перечень материалов и методов исследования

№ п/п Направления исследований Методы исследования Объем исследований (проб)

БАЛ Мок рота Плевральный

1. Микробиологическое исследование выпот

1.1 Микроскопия мазка с окраской по Граму 1.2 Выделение аэробных и факультативно- 419 419 155 155 10 10

1. Микробиологические анаэробных культур и их идентификация 1.3 Выделение анаэробных культур и их идентификация 35 10 10

исследования 2. Микробиологическое исследование отделяемого со слизистой зева - выделение аэробных и факультативно-анаэробных культур и их идентификация 35

3. Посев крови на наличие микроорганизмов 55

4. Посев мочи на стерильность 55

Продолжение таблицы 2_

2. Исследование устойчивости к антимикробным препаратам 1. Диско-диффузионный метод 2. Метод серийных разведений - тест-системы АТВ НАЕМО, АТВ STREP 5 для полуавтоматического анализатора АТВ Expression (bioMerieux, Франция) 3. Тест с ннтронефином: 3.1 Я. influenzae 3.2 М. catarrhalis 55 143 112 32

3. Молекулярно-генетическое типирование штаммов S. pneumoniae Методом мультиплексной ПЦР с различными праймерами 56 штаммов

4. Изучение роли вирусных и труднокультиви-руемых бактерий Определение IgG и IgM в сыворотке крови методом непрямой иммунофпюоресиенши к Рагшгфиегса, серсгшпы 1,2,3; bifhemaA, В; R&pimtory Syncytial Virus; Adenovirus, Chbmidophyla pneumoniae, Mytxplasma ркпатпкк; CccdeVa bumeüt, Legionella рпеитср/гНа, серогруппа 1 (Vircell microbiologists, Испания) 69

5. Определение микробных маркеров методом газожидкостной хроматографии (ПКХ) Изучение количественного и качественного содержания короткоцепочечных жирных кислот методом ГЖХ в: 1. бронхоальвеолярном лаваже 2. плевральном выпоте 3. мокроте 4. сыворотке крови 35 10 10 55

6. Изучение состояния гуморального иммунитета Определение иммуноферментным анализом в парных сыворотках крови уровня IgG к полирибозилрибитолфосфату Я. influenzae типа b и к бактериальным антигенам, полученным из клеток микроорганизмов: бескапсульного штамма Н. influenzae; S. pneumoniae; S. aureus; E. coli; Klebsiella pneumoniae; P. aeruginosa 180

7. Выявление ДНК Н. influenzae и S. pneumoniae методом ПЦР в клиническом материале Выявление методом ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле («АмлиСенс Neisseria spp., Haemophilus spp., Streptococcus spp. - Eph», ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Москва) в: 1. бронхоальвеолярном лаваже 2. мокроте 3. плевральном выпоте 4. сыворотке крови 5. моче 35 10 10 55 55

Микроскопический метод

Оценка диагностической ценности мокроты для культурального исследования проводилась путем окраски проб по Граму согласно общепринятой методике (Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-

диагностических лабораториях ЛПУ: приказ М-ва здравоохранения СССР № 535 от 22 апреля 1985 г. М„ 1985. 126 е.).

Кулыпуральный метод

Сбор и доставку клинических материалов проводили согласно методическим указаниям 4.2.2039-05 «Техника сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории». Использовали количественный метод посева мокроты и БАЛ, согласно приказу МЗ СССР № 535 от 22.04.85 «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях ЛПУ», на питательные среды Эндо, желточно-солевой агар, шоколадный агар, агар Сабуро, а также на предлагаемую нами питательную среду для выделения, культивирования и определения гемолитических свойств бактерий из клинического материала - кровяно-сывороточный агар (КСА). Диагностический титр для мокроты > 106 КОЕ/мл, БАЛ > 104 КОЕ/мл. БАЛ и мокрота также исследовались количественно на анаэробы, путем посева на чашки Петри с КСА и последующей инкубацией в газ пакете - GENbag anaer (bioMerieux, Франция) при 37 "С до 7 суток. Плевральный выпот засевали на: две чашки Петри с КСА (одна из них помещалась в газ пакет - GENbag anaer, другая в аэробные условия атмосферы); в жидкую тиогликолевую среду (прорегенерированную в течение 15 мин и залитую после посева стерильным вазелиновым маслом); двухфазную коммерческую питательную среду -HEMOLINE DIPH-F (bioMerieux, Франция). Культуральное исследование отделяемого со слизистой зева осуществлялось в контрольной группе (дети без инфекционной бронхолегочной патологии) для обнаружения носительства И. influenzae, S. pneumoniae, S. aureus, E. coli, К. pneumoniae, P. aeruginosa, для чего посев проводился на Эндо, желточно-солевой агар, шоколадный агар и КСА. Для выявления генерализации процесса у детей с обострением ХИВЗЛ и бессимптомной бактериемии и бактериурии у детей без инфекционной бронхолегочной патологии исследовали кровь на наличие микроорганизмов с помощью коммерческих флаконов для прибора ВАСТЕС 9050 (Becton Dickinson, США) и мочу на стерильность путем посева на КСА и шоколадный агар по методу Айзенберга (Essential procedures for clinical microbiology. Editor in chief H.D. Isenberg. Washington, D.C.: ASM PRESS, 1998. 842 p.). Каждая партия питательных сред подлежала внутреннему контролю. Контроль качества Haemophilus Test Medium и обогащенного кровью агара Мюллера-Хмнтона осуществлялся штаммами Я influenzae АТСС 49247, АТСС 49766 и S. pneumoniae АТСС 49619. У выделенных микроорганизмов проводили видовую идентификацию классическими бактериологическими методами и с использованием тест-систем для полуавтоматического (АТВ Expression, bioMerieux, Франция) и автоматического (MicroScan WalkAvvay 96, Siemens, Германия) анализаторов.

Типирование штаммов Streptococcus pneumoniae методом мультиплексной полимеразной цепной реакции

Определение серологических типов S. pneumoniae осуществлялось методом мультиплексной ПЦР. Праймеры (Syntol, Россия), специфичные для

различных генов S. pneumoniae, синтезированы на основании нуклеотидных последовательностей (Serotyping Streptococcus pneumoniae by Multiplex PCR. D.A. Brito et al. J. Clin. Microbiol. 2003. Vol. 41, № 6. P. 2378-2384).

Метод газожидкостной хроматографии

Способ определения короткоцепочечных жирных кислот (КЖК, С2-С6 с изомерами) в биосубстратах складывался из двух этапов: 1) процесса пробоподготовки - к 1 мл исследуемого образца (сыворотки, БАЛ, мокроты) в эппендорф добавляли 0,1 мл 1 N HCL и 0,1 мл аа-диметилмаслянной кислоты (в качестве «внутреннего стандарта» - для количественного определения содержания КЖК). В случае исследования плеврального выпота к 1 мл его добавляли 0,2 мл 1 N HCL и 0,1 мл аа-диметилмаслянной кислоты. Скоагулированные белки в сыворотке отделяли центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 мин, а в БАЛ, мокроте, плевральном выпоте — 13,5 тысяч об/мин 30 мин; 2) непосредственно газожидкостного хроматографического анализа по методике предложенной М.Д. Ардатской, Н.С. Иконниковым, О.Н. Минушкиным (Пат. 2220755 Рос. Федерация «Способ разделения смеси жирных кислот фракции С2-С6 методом газожидкостной хроматографии». Ардатская М.Д., Иконников Н.С., Минушкин О.Н. № 2002119447; заявл. 23.07.02; опубл. 10.01.04).

Серологический метод исследования

Использовали скрининговые иммуноферментные тест-системы для определения IgG к условно-патогенным бактериям и «ИФЛ-IgG-AT HIB» (ООО «Навина», Россия). Пробы крови для исследования брали с соблюдением всех правил асептики и антисептики. Первая проба крови забиралась в начале обострения (3-4 день госпитализации), а вторая в конце второй недели. Все дети не были вакцинированы против Я. influenzae типа b и S. pneumoniae.

Сыворотки исследовали по предложенной производителем методике, результаты анализа оценивали согласно инструкции к тест-системе.

Результаты исследования

В результате проведенного сравнительного анализа количественного культуралыюго исследования мокроты у детей установлено, что учет количественного соотношения десквамированного плоскоклеточного эпителия (ДПКЭ) и полиморфноядерных лейкоцитов (ПЯЛ; > 1 ПЯЛ при отсутствии ДПКЭ, > 10 ПЯЛ при 1-9 ДПКЭ, > 25 ПЯЛ при 10-24 ДПКЭ) при микроскопической оценке качества мокроты у детей, позволяет выявить статистически значимо большее количество проб, пригодных для посева (93 из 155 проб, р = 0,001), а также увеличивает частоту обнаружения диагностически значимых микроорганизмов в титре > 106 КОЕ/мл (45 проб) по сравнению с использованием общепринятого соотношения клеточных элементов (более 25 ПЯЛ и менее 10 ДПКЭ, 11 проб) (Внебольничная пневмония у взрослых: практические рекомендации по диагностике, лечению и профилактике: пособие для врачей. А.Г. Чучалин и соавт. Москва: Российское респираторное общество, МАКМАХ, 2010. 106 е.). На основании этого разработан алгоритм действий при микроскопической оценке качества мокроты у детей для

культурального исследования: 1) окраска мазка образца мокроты по Граму: 2) определение среднего количества ДГ1КЭ в поле зрения путем микроскопии 25 полей зрения при объективе х10 микроскопа; 3) определение среднего количества ПЯЛ в поле зрения путем микроскопии 25 полей зрения при объективе х40, затем умножить на 4 для перерасчета на объектив х10 (так как четко отдифференцировать ПЯЛ от других клеток крови, особенно при наличии вязкого секрета, разрушенных клеток, фибрина и слизи практически невозможно при 100-кратном увеличении); 4) учет количественного соотношения ДИКЭ и ПЯЛ: если > 1 ПЯЛ при отсутствии ДПКЭ, > 10 ПЯЛ при 1-9 ДПКЭ, > 25 ПЯЛ при 10-24 ДПКЭ осуществляется посев мокроты, в других случаях образцы не должны подлежать бактериологическому анализу.

С целыо совершенствования этиологической диагностики обострений ХИВЗЛ была разработана питательная среда для выделения, культивирования и определения гемолитических свойств бактерий из клинического материала — кровяно-сывороточный агар (КСА) следующего состава: на 100 мл основы приготовленной из сухого питательного агара для культивирования микроорганизмов (ГМФ - агар) при 45 °С добавляют эритроцитарную массу из донорской крови человека - 3 мл, сыворотку крупного рогатого скота - 5 мл, дрожжевой экстракт - 3 мл. При сравнении эффективности разработанной нами питательной среды с 5% кровяным агаром (который регламентируется приказом МЗ СССР № 535 от 22.04.85 «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях ЛПУ») используемых в течение 2009 г. для посева клинического материала: БАЛ, мокрота, плевральный выпот (п = 150) от детей с обострением ХИВЗЛ выявлено, что применение предлагаемого КСА позволяет повысить выделение S. pneumoniae из клинического материала на 52,7%. С помощью КСА обнаружено 19 штаммов, а на 5% кровяном агаре - 9 штаммов пневмококка (р = 0,048).

Эффективность предлагаемого нами способа выявления ß-лактамазопродуцирующих штаммов М. catarrhalis тестировалась в течение 2009 г. на клиническом материале: БАЛ, мокрота (п = 147) от детей с обострением ХИВЗЛ. Разработанный способ повышает выделение ß-лактамазопродуцирующих штаммов М. catarrhalis из клинического материала на 66,7%. Так нами обнаружено 12 ß-лактамазопродуцирующих штаммов М. catarrhalis, а при посеве на КСА без использования диска с пенициллином 10 ЕД. всего 4 штамма (р = 0,04). Предлагаемый способ позволяет выделить чистую культуру подозрительную на принадлежность к М. catarrhalis, уже в первые сутки после посева клинического материала и провести окончательную идентификацию, а также выдачу результата чувствительности к антимикробным препаратам уже на второй день исследования, что сокращает сроки определения этиологии инфекции.

Обнаружено, что при использовании только культурального исследования лидирующее место в этиологии обострения ХИВЗЛ занимают следующие микроорганизмы: на первом месте 48,4% Н. influenzae, на втором S. pneumoniae - 18,6%, на третьем М. catarrhalis - 10,6% случаев. В 41,1%

случаев наблюдалось постоянство микрофлоры, которое характерно не только для одного конкретного вида, но и для ассоциаций микроорганизмов выделяемых от 95 детей с обострением ХИВЗЛ обследованных в динамике.

Установлено, что применение только метода непрямой иммунофлюоресценции позволило обнаружить IgM к С. pneumoniae (2,9%), М. pneumoniae (4,4%), Adenovirus (1,5%), Respiratory Syncytial Virus (2,9%), Influenza A (5,8%), Influenza В (2,9%), Parainfluenza, серотипы 1, 2, 3 (2,9%), L. pneumophila, серогруппа 1 (1,5%). Во всех случаях IgM выявлены только к одному из перечисленных выше возбудителей.

В свою очередь, определено, что процент выявления ДНК Я influenzae и 5. pneumoniae методом ПЦР в клиническом материале из нижних дыхательных путей у детей с обострением ХИВЗЛ составил 31,1%. При этом одновременно ДНК Я. influenzae и S. pneumoniae в БАЛ обнаружено в 2,2% случаев. А в сыворотке крови выявлена только ДНК пневмококка в 2,2% случаев, что подтверждено культурально - S. pneumoniae выделен из плеврального выпота и крови. В свою очередь Я. influenzae и S. pneumoniae в моче не обнаружены, но выявление в 6,7% случаев их ДНК в данном материале всегда сопровождалось выделением из БАЛ соответствующего возбудителя. Ни в одном из исследованных клинических материалов у детей без инфекционной бронхолегочной патологии (контрольная группа) ДНК Я. influenzae и S. pneumoniae не обнаружена. Следовательно, выявление ДНК Я. influenzae и S. pneumoniae методом ПЦР можно использовать только как дополнительный тест при диагностике обострений ХИВЗЛ.

Достоверные различия «диагностического» уровня IgG в первой сыворотке у детей с обострением ХИВЗЛ и без инфекционной бронхолегочной патологии обнаружены только для Я. influenzae типа b и S. pneumoniae. Кроме того, лишь у детей с обострением ХИВЗЛ наблюдалась сероконверсия IgG: к Я. influenzae типа b в 15,6% случаев, к бескапсульному штамму Я. influenzae -6,7%, к S. pneumoniae - 11,1%, к Е. coli - 2,2%, к Р. aeruginosa - 2,2%, к S. aureus - 4,4%. При этом одновременное обнаружение сероконверсии IgG сразу к двум микроорганизмам выявлено у троих детей с обострением ХИВЗЛ. Таким образом, однократное обнаружение «диагностического» уровня IgG к возбудителю не всегда свидетельствует об этиологии обострения ХИВЗЛ, при исследовании IgG необходимо оценивать парные сыворотки крови совместно с учетом культурального и других методов диагностики, а также клиники, прививочного анамнеза и перенесенных ранее заболеваний.

В данной работе впервые определен спектр серотипов 5. pneumoniae, выделенных при обострении ХИВЗЛ у детей в Екатеринбурге и Свердловской области. Первенство было разделено между серотипами 6А, 6В; 23F; 19F и неделимой совокупностью - 8, 9V, 9А, 11F, IIA, ИВ, HC, 11D, 12F, 15А, 33F, которые в сумме составляют 73,1% от всех выявленных серотипов. Интерес представляла не только частота обнаружения того или иного серотииа S. pneumoniae у отдельных больных, но и их соответствие серотипам, входящим в состав конъюгированных пневмококковых вакцин. В результате этого выявлено совпадение с серотипами входящими в 7-валентную

конъюгированную вакцину на 96,3%, 10-валентную - 98,2%, 11-валентную и 13-валентную на 100%. что делает возможным использование любой конъюгированной пневмококковой вакцины для снижения уровня пневмококковой инфекции у детей с обострением ХИВЗЛ на Среднем Урале.

В ходе проведенных исследований уточнена чувствительность к антимикробным препаратам, как основных микроорганизмов, так и доминирующих бактериальных ассоциаций. С 2009 по 2011 гг. существенных изменений в антибиотикорезистентности штаммов Н. influenzae, выделенных у детей с обострением ХИВЗЛ, не отмечено. Штаммы Н. influenzae до сих пор остаются высокочувствительными к аминопепициллинам (97,6%) и цефалоспоринам II поколения. У детей с обострением ХИВЗЛ доля нечувствительных штаммов S. pneumoniae к пенициллину составляет 20,4%. что превышает данные последних многоцентровых исследований по России на 9,2% и требует постоянного мониторинга антибиотикорезистентности и коррекции лечения по результатам антибиотикограмм в каждом конкретном случае. Высокий уровень (92,3%) ß-лактамазопродуцирующих штаммов М. catarrhalis, может привести к неэффективности применения природных пенициллинов, амино-, карбокси-, или уреидопенициллинов для терапии обострений ХИВЗЛ, вызванных данным возбудителем. В связи с обнаружением культуральным методом в 11,2% проб БАЛ, мокроты и плеврального выпота от детей с обострением ХИВЗЛ бактериальных ассоциаций возникает необходимость оценки результатов их чувствительности в совокупности, так как наличие в ассоциации одного из микроорганизмов, обладающего каким-либо механизмом резистентности к ß-лактамным антибиотикам, может привести к неудачам в терапии данным классом антимикробных препаратов.

Основными маркерами, выделяемыми аэробными, в том числе и факультативно-анаэробными микроорганизмами, являются уксусная (С2), а анаэробными - пропионовая (С3) и масляная (С4) кислоты. Анаэробный индекс - это отношение суммы концентраций пропионовой и масляной кислот к уксусной кислоте. В зависимости от качественного и количественного состава КЖК в различных клинических материалах при обострении ХИВЗЛ у детей нами определены критерии оценки результатов выявления маркеров бактериальной инфекции (таблица 3). Результаты собственных исследований, подтвержденные посевами образцов на питательные среды, приведенные в таблице 3, позволили установить, что увеличение уксусной кислоты и изокислот свидетельствуют о наличии в клиническом материале аэробных микроорганизмов. И наоборот преимущественное повышение пропионовой и/или масляной кислот, а, следовательно, и смещение анаэробного индекса в более отрицательные значения указывают на анаэробные микроорганизмы. Совместное повышение уксусной, пропионовой, масляной кислот и изомеров КЖК указывают на ассоциацию микроорганизмов (аэробных и анаэробных) в клиническом материале.

Таблица 3 - Изменение качественного и количественного состава КЖК, характеризующего тип микроорганизма в различных клинических материалах у детей с обострением ХИВЗЛ, (медиана и диапазон) _

Клинический материал Е кжк, мкг/г Уксусная кислота Сг, мкг/г Пропионовая (масляная) кислота С3(С4), мкг/г Изокислоты (£ изоС„, мкг/г) Анаэробный индекс, усл. ед. Тип микроорганизма, определяемого при бактериологическом анализе

БАЛ 7 (6,7-7,3) 6,1 (5,8-6,4) 0,1 (0,095-0,105) 0,3 (0,28-0,032) -0,033 (-0,031--0,035) Микроорганизм отсутствует

17 (16,1-17,9) 15,4 (14,8-16) 2 1 (0,93-1,07) -0,022 (-0,021 --0,023) Аэробный микроорганизм

10 (9,5-10,5) 8,3 (7,9-8,7) 1,2 (1,12-1,28) — -0,087 (-0,083--0,091) Анаэробный микроорганизм

15 (14,4-15,6) 12 (11,5-12.5) 1,2 (1,12-1,28) 1,2 (1,12-1,28) -0,075 (-0,072 - -0,079) Ассоциация микроорганизмов (анаэробы и аэробы)

Плевральный выпот В норме данный клинический материал отсутствует

0 20 (18,8-21,2) - ¡,2 (1,12-1,28) -0,083 (-0,079--0,087) Аэробный микроорганизм

0 И (10,4-11,6) 1,5 (1,4-1,6) - -0,335 (-0,314--0,356) Анаэробный микроорганизм

0 17,2 (16,2-18,2) 1,5 (1,4-1,6) 1,5 (1,4-1,6) -0,308 (-0,289-0,327) Ассоциация микроорганизмов (анаэробы и аэробы)

Мокрота В норме данный клинический мате риал отсутствует

0 51 (48,5-53,5) - 4,3 (4,09-4,51) -0,080 (-0,077--0,083) Аэробный микроорганизм

0 30 (28,3-31,7) 4,1 (3,85-4,35) - -0,328 (-0,308--0,358) Анаэробный микроорганизм

0 42 (39,8-44,2) 4,1 (3,87-4,33) 4,3 (4,09-4,51) -0,298 (-0,280--0,316) Ассоциация микроорганизмов (анаэробы и аэробы)

Примечания: 1 - в пробе может обнаруживаться одновременно Сз и С4 или только одна из кислот; 2 - показатель не изменяется или имеются минимальные изменения

Сравнивая диагностические возможности разных методов определения этиологии обострения ХИВЗЛ у детей, мы установили, что при использовании только культурального исследования возбудитель обнаружен у 51,1% пациентов (рисунок 1).

Культуралъный метод Мегод непрямой ГЖХ Выявление ДНК ИФА

иммунофлюоресиенции, S. pneumoniae, (еероко)шерсия IgG к

IgM Н. influenzae Н. influenzae типа Ь.

методом ПЦР бескапсульному штамму Н. influenzae, S. aureus,

~~~ Z S. pneumoniae, Е. coli.

□ Возбудитель не установлен

J К. pneumoniae,

В Возбудитель установлен ____j P. acniginosa)

Рисунок 1 - Сравнительная характеристика диагностических возможностей разных методов определения этиологии обострения ХИВЗЛ у детей (п = 45)

В свою очередь, как видно из рисунка 1, применение метода непрямой иммунофлюоресценции (IgM) позволило выявить патоген у 24.4% детей, иммуноферментного анализа (сероконверсия IgG) - 35,6%, ДНК Н. influenzae и 5. pneumoniae методом ПЦР в клиническом материале выявлены у 28,9%, а маркеры микроорганизмов обнаружены хроматографически у 84.5% пациентов. Таким образом, наибольшую эффективность имеет ГЖХ. С одной стороны хроматографический метод позволяет выявить обострения ХИВЗЛ, в которых принимают участие анаэробы в 31% случаев, тогда как культуральный - только в 13,3% (р = 0,03). Но с другой стороны достоверных различий в обнаружении аэробов данными методами нет (р > 0,05). Таким образом, использование ГЖХ не отменяет культуральное исследование, но может применяться в совокупности с ним для ускоренного выявления маркеров бактериальных возбудителей обострений ХИВЗЛ, в первую очередь анаэробных микроорганизмов, значительно сокращая время, необходимое для их выделения.

Необходимо отметить, что лишь комплексное использование всех методов диагностики (культурального исследования, газожидкостной хроматографии, метода непрямой иммунофлюоресценции, полимеразной цепной реакции, иммуноферментного анализа), позволяет произвести максимальную этиологическую расшифровку обострений ХИВЗЛ у детей - в 88,6% случаев установлен возбудитель, из них ассоциации микроорганизмов -26.4%, а в монокультуре - 62,2%.

Обострения ХИВЗЛ у детей связаны как с монокультурами: аэробных -40%. в том числе факультативно-анаэробных, бактерий (Н. influenzae — 15,6%;

S. pneumoniae - 6,7%; M. catarrhalis — 6,7%; 5. aureus - 2,2%; C. pneumoniae -4,4%: M. pneumoniae — 2,2%; L. pneumophila, ceporpynria 1 - 2,2%), неспорообразующих анаэробных бактерий - 17,8% (Bacteroides spp. - 6,7%; F. micleatum - 6,7%; Peptostreptococcus spp. - 4,4%) и вирусами - 4,4% {Parainfluenza серотипы 1, 2, 3 — 2,2%; Influenza A — 2,2%), так и с ассоциациями микроорганизмов: бактериально-бактериальными - 15,4% (S. pneumoniae + Н. influenzae — 2,2%; М pneumoniae + //. influenzae — 2,2%; Propionibacterium spp. + P. aeruginosa + E. coli - 4,4%; Bacteroides spp. + S. pneumoniae -- 4,4%; Peptostreptococcus spp. + B. ureolyticus + S. aureus - 2,2%), бактериально-вирусными — 8,8% (Stenotrophomonas maltophilla + Influenza А — 4,4%; Enterobacter cloacae + Influenza В — 2,2%; Eubacterium spp. + Respiratory Syncytial Virus — 2,2%), бактериально-грибковыми - 2,2% (£. coli + Candida glabrata + Candida krusei + Candida tropicalis - 2,2%).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Данные полученные при решении поставленных задач позволяют рекомендовать комплексное использование современных методов диагностики (газожидкостной хроматографии, метода непрямой иммунофлюоресценции, полимеразной цепной реакции, иммуноферментного анализа) и культуралыюго исследования клинически значимых материалов, с учетом клинических симптомов, общеклинических лабораторных анализов, прививочного анамнеза и перенесенных ранее заболеваний для проведения адекватной антибактериальной терапии и снижения частоты обострений ХИВЗЛ у детей.

ВЫВОДЫ

1. Доказана диагностическая ценность проведения культурального исследования у детей образцов мокроты, содержащих: 1 и более полиморфноядерных лейкоцитов при отсутствии десквамированного плоскоклеточного эпителия, 10 и более полиморфноядерных лейкоцитов при 19 клеток десквамированного плоского эпителия, более 25 полиморфноядерных лейкоцитов при 10-24 клеток десквамированного плоского эпителия, в других случаях образцы не должны подлежать бактериологическому анализу.

2. Разработанный состав питательной среды для выделения, культивирования и определения гемолитических свойств бактерий из клинического материала (кровяно-сывороточный агар) и способ выявления ß-лактамазопродуцирующих оксидазопозитивных грамотрицательных диплококков, подозрительных на принадлежность к Moraxella catarrhalis позволяют повысить выделение из клинического материала Streptococcus pneumoniae на 52,7% и ß-лактамазопродуцирующих штаммов Moraxella catarrhalis на 66,7%.

3. Определены критерии оценки результатов выявления маркеров бактериальной инфекции в зависимости от качественного и количественного состава короткоцепочечных жирных кислот в различных клинических материалах при обострении хронических инфекционно-воспалительных заболеваниях легких у детей.

4. При обострении хронических инфекционно-воспалителъных заболеваниях легких у детей доминируют серотипы Streptococcus pneumoniae 6А, 6В; 23F; 19F и неделимая совокупность - 8, 9V, 9А, 1 IF, IIA, IIB, HC, 11D, 12F, 15A, 33F, которые в сумме составляют 73,1% от всех выявленных серотипов.

5. Установлено, что использование только культурального метода для определения этиологии обострения хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких у детей в 48,9% случаев неинформативно, в то время как метод газожидкостной хроматографии в 84,5% эпизодов позволил определить маркеры бактериального возбудителя. Но лишь комплексный подход к обследованию детей позволяет в 88,6% случаев установить причины обострений хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Проводить комплексное обследование детей с обострением ХИВЗЛ, включающее параллельное назначение следующих исследований: культуральное исследование клинического материала из нижних дыхательных путей; выявление маркеров анаэробной инфекции методом газожидкостной хроматографии в БАЛ, мокроте, плевральном выпоте; определение методом непрямой иммунофлюоресценции IgG, IgM в сыворотке крови к возбудителям атипичных пневмоний; выявление методом ПЦР в клиническом материале из нижних дыхательных путей ДНК //. influenzae и 5. pneumoniae; определение уровня IgG иммуноферментным анализом в парных сыворотках крови к Н. influenzae типа b и 5. pneumoniae.

2. При культуралыюм исследовании внедрить предлагаемый алгоритм действий при микроскопической оценке качества мокроты у детей: осуществлять посев образцов, содержащих 1 и более полиморфноядериых лейкоцитов при отсутствии десквамированного плоскоклеточного эпителия, 10 и более полиморфноядериых лейкоцитов при 1-9 клеток десквамированного плоского эпителия, более 25 полиморфноядериых лейкоцитов при 10-24 клеток десквамированного плоского эпителия, в других случаях образцы не должны подлежать бактериологическому анализу.

3. Для посева клинического материала из нижних дыхательных путей и выявления S. pneumoniae, ß-лактамазопродуцирующих штаммов М catarrhalis использовать кровяно-сывороточиый агар, следующего состава: на 100 мл основы приготовленной из сухого питательного агара для культивирования микроорганизмов (ГМФ - агар) при 45 "С добавляют эритроци гарную массу из донорской крови человека - 3 мл, сыворотку крупного рогатого скота — 5 мл, дрожжевой экстракт - 3 мл и способ обнаружения ß-лактамазопродуцирующих штаммов М. catarrhalis основанным на применении диска с пенициллином 10 ЕД., вокруг которого подавляется рост большинства микроорганизмов, являющихся представителями нормальной микрофлоры верхних дыхательных путей.

4. Внедрить в работу практических лабораторий газожидкостную хроматографию для выявления маркеров бактериальной инфекции в БАЛ, мокроте, плевральном выпоте при обострении ХИВЗЛ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ АВТОРОМ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Лавриненко, Е.В. Этиологическая диагностика бронхолегочных заболеваний у детей / Е.В. Лавриненко // Санкт-Петербургские научные чтения : материалы III международного молодежного медицинского'конгресса. - Санкт-Петербург, 2009. - С. 109.

2. Воронина, Л.Г. Антибиотикорезистентность основных патогенов, вызывающих бронхолегочные заболевания у детей на Среднем Урале, 2005-2009 гг. / Л.Г. Воронина, С.М. Блинова, Е.В. Лавриненко // Вестник уральской медицинской академической науки. - 2010. - Т. 30, № 2. - С. 711.

3. Воронина, Л.Г. Микробиологический мониторинг антибиотикорезистентности основных патогенов, вызывающих бронхолегочные заболевания у детей и оптимизация антибактериальной терапии / Л.Г. Воронина, С.М. Блинова, Е.В. Лавриненко // Фармация и общественное здоровье : материалы ежегодной конференции. - Екатеринбург : Изд-во УГМА, 2010. - С. 503-505.

4. Лавриненко, Е.В. Этиологическая диагностика хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких у детей / Е.В. Лавриненко // Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения : материалы 65-й Всерос. науч.-практ. конф. молодых учёных и студентов с международным участием. — Екатеринбург : Изд-во УГМА, 2010. - С. 437-439.

5. Достоверность микроскопического и культурального исследования мокроты / Е.В. Саматова, Л.Г. Воронина, С.М. Блинова, МЛ. Кукушкина, С.С. Устюгова // Клиническая лабораторная диагностика : материалы науч.-практ. конф. «Национальные дни лабораторной медицины России-2011». — 2011. -№ 9. - С. 47.

6. Саматова, Е.В. Клиническое значение грибов при хронических инфекционно-воспалигельных заболеваниях легких у детей / Е.В. Саматова, Л.Г. Воронина // Проблемы медицинской микологии : тезисы XIV Всерос. науч.-практ. конф. по медицинской микологии (Кашкинские чтения). — 2011. -Т. 13, №2.-С. 108.

7. Микробиологические и клинические аспекты инфекций, вызванных Streptococcus pneumoniae, у детей / Л.Г. Воронина, Е.В. Саматова, H.A. Зюзева, И.В. Вахлова // Уральский медицинский журнал. -2011. - Т. 91, № 13. - С. 59-66.

8. Саматова, Е.В. Микробные ассоциации при хронических инфекционно-воспалительных заболеваниях легких у детей / Е.В. Саматова, Л.Г. Воронина // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия : тезисы XIII Международного конгресса MAKMAX/ESCMID по антимикробной терапии. -2011.-Т. 13, №2, приложение 1.-С. 30.

9. Воронина, Л.Г. Микробный пейзаж нижних дыхательных путей у детей, больных хроническими инфекционно-воспалительными заболеваниями легких / Л.Г. Воронина, Е.В. Саматова // Актуальные научные достижения 2011 : материалы VII международной науч.-практ. конф. - Чехия : Publishing House «Education and Science», 2011. — С. 51-53.

10. Воронина, Л.Г. Состояние иммунитета к Haemophilus influenzae у здоровых детей и с хроническими инфекционно-воспалительными заболеваниями легких / Л.Г. Воронина, Е.В. Саматова // Вестник уральской медицинской академической науки : материалы IX Российской конференции иммунологов Урала. - 2011. - Т. 35, № 2/1. - С. 105-106.

11. Этиологическая значимость микроскопического исследования мокроты у детей с острой и хронической бронхолегочной патологией / Л.Г. Воронина, Е.В. Саматова, С.М. Блинова, М.П. Кукушкина // Вестннк уральской медицинской академической науки. — 2011. - Т. 36, № 3. - С. 8488.

12. Воронина, Л.Г. Этиология и резистентность к антимикробным препаратам инфекций бронхолегочной системы у детей / Л.Г. Воронина, Е.В. Саматова // Актуальные проблемы эпидемиологии на современном этапе : материалы Всерос. науч.-практ. конф. с международным участием. - Москва,

2011.-С. 70-71.

13. Воронина, Л.Г. Антибиотикорезистентность Streptococcus pneumoniae, выделенных при различных формах детских инфекций на Среднем Урале / Л.Г. Воронина, Е.В. Саматова // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия : тезисы XIV Международного конгресса MAKMAX/ESCMID по антимикробной терапии. — 2012. - Т. 14, № 2, приложение 1. — С. 19.

14. Воронина, Л.Г. Ассоциации Moraxella catarrhalis с другими бактериями при заболеваниях дыхательной системы у детей / Л.Г. Воронина, Е.В. Саматова // Воронцонские чтения : материалы V региональной науч.-практ. конф. - Санкт-Петербург, 2012. - С. 39.

15. Воронина, Л.Г. Изучение роли Haemophilus influenzae в этиологии инфекций органов дыхания у детей / Л.Г. Воронина, Е.В. Саматова // Медицинский Альманах. - 2012. - Т. 21, № 2. - С. 36-40.

16. Воронина, Л.Г. Изучение роли Streptococcus pneumoniae в этиологии инфекций у детей / Л.Г. Воронина, Е.В. Саматова // Клиническая лабораторная диагностика : материалы науч.-практ. конф. «Национальные дни лабораторной медицины России-2012». - 2012. - № 9. - С. 80.

17. Воронина, Л.Г. Лабораторные методы обнаружения, идентификации и определения резистентности к антибиотикам Moraxella catarrhalis : учеб.-метод. пособие / Л.Г. Воронина, Е.В. Саматова. - Екатеринбург : Изд-во УГМА,

2012.-51 с.

18. Микробиологическое исследование мокроты у детей : учеб.-метод. пособие / Л.Г. Воронина, Е.В. Саматова, М.П. Кукушкина, С.М. Блинова. -Екатеринбург : Изд-во УГМА, 2012. - 37 с.

19. Саматова, Е.В. Особенности микробиоцеиоза нижних дыхательных путей при хронических инфекционно-воспалительных

заболеваниях легких детей и антибиотикорезистентность основных патогенов / Е.В. Саматова II Вестник уральской медицинской академической науки. — 2012. — Т. 38, № 1. — С. 45-50.

20. Распространение пневмококковых инфекций у детей в Екатеринбурге и резистентность к антибиотикам S. pneumoniae / Л.Г. Воронина, Е.В. Саматова, С.М. Блинова, М.П. Кукушкина, С.С. Устюгова, E.H. Исламова, Е.Ю. Панова, Т.Н. Терновая // Вестник первой областной клинической больницы. - 2012. -Вып. XXV, № 1-2 (51). — С. 27-32.

21. Серотипирование штаммов Streptococcus pneumoniae методом мультиплексной ПЦР, выделенных у детей на Среднем Урале / Е.В. Саматова, А.М. Друй, Г.А. Цаур, Л.Г. Воронина // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2012. - № 5. — С. 25-30.

22. Питательная среда - кровяно-сывороточный агар - для выделения, культивирования и определения гемолитических свойств бактерий из клинического материала : заявка 2011128466/10 Рос. Федерация : МПК С 12 N 1/20 [Электронный ресурс] / Воронина Л.Г., Саматова Е.В. (РФ) -№ 2011128466/10 ; заявл. 08.07.11; опубл. 20.01.13, Бюл. №2.-1 электрон, опт. диск (CD-ROM).

23. Способ выявления ß-лактамазопродуцирующих оксидазопозитивных грамотрицательных диплококков, подозрительных на принадлежность к Moraxella catarrhalis : заявка 2011129509/10 Рос. Федерация : МПК С 12 Q 1/04, С 12 R 1/01 [Электронный ресурс] / Воронина Л.Г., Саматова Е.В. (РФ) -№ 2011129509/10 ; заявл. 15.07.11 ; опубл. 20.01.13, Бюл. №2.-1 электрон, опт. диск (CD-ROM).

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БАЛ - бронхоальвеолярный лаваж

ГЖХ - газожидкостная хроматография

ГМФ - агар - гидролизат мяса ферментативный-агар

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДПКЭ - десквамированный плоскоклеточный эпителий

КОЕ/мл - колонеобразующих единиц на миллилитр

КСА - кровяно-сывороточный агар

КЖК - короткоцепочечные жирные кислоты

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЯЛ - полиморфноядерные лейкоциты

усл. ед. - условные единицы

ХИВЗЛ - хронические инфекционно-воспалительные заболевания легких АТСС - American Type Culture Collection (американская коллекция типовых культур) С2 - уксусная кислота С3 - пропионовая кислота С4 - масляная кислота С6 - капроновая кислота У изоСп - суммарный уровень изокислот

£ КЖК - суммарный уровень короткоцепочечных жирных кислот

На правах рукописи

Саматова Елена Валерьевна

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ЭТИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ОБОСТРЕНИЙ ХРОНИЧЕСКИХ ИНФЕКЦИОННО-ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЛЕГКИХ У ДЕТЕЙ

03.02.03 — Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Челябинск-2013

Подписано в печать 15.05.2013. Формат 60x84 1Л6 Усл. печ. л. 1,2. Тираж 100 экз. Заказ № 139. Отпечатано в типографии ГБОУ ВПО УГМА Минздрава России, г. Екатеринбург, ул. Репина, д. 3

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Саматова, Елена Валерьевна, Челябинск

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Уральская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

На правах рукописи

0420І

Саматова Елена Валерьевна

03.02.03 - Микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель: Воронина Любовь Григорьевна доктор медицинских наук, доцент

Екатеринбург - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.............................................................................. 5

ГЛАВА 1. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПРИ ОБОСТРЕНИИ ХРОНИЧЕСКИХ ИНФЕКЦИОННО-ВОСПАЛИТЕЛБНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЛЕГКИХ У ДЕТЕЙ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)............................................................................................. 15

1.1 Эпидемиологическая характеристика хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких у детей.................................... 15

1.2 Этиология и антибиотикорезистентность ведущих бактериальных патогенов, вызывающих обострение хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких у детей.................. 17

1.3 Микроскопическое исследование мокроты у детей........................ 21

1.4 Особенности культивирования бактериальных пневмотропов.......... 25

1.5 Состояние некоторых показателей гуморального иммунитета у здоровых и больных хроническими инфекционно-воспалительными заболеваниями легких детей......................................................... 26

1.6 Клиническое значение короткоцепочечных жирных кислот

при бронхолегочной патологии..................................................... 28

1.7 Применение полимеразной цепной реакции в диагностике обострений хронических инфекционно-воспалительных заболеваний

легких............................................................................................................. 31

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.................... 34

2.1 Контингент обследованных детей и объем проводимых исследований........................................................................... 34

2.2 Микроскопический метод........................................................ 37

2.3 Культуральный метод............................................................ 37

2.4 Методы определения чувствительности к антимикробным препаратам............................................................................... 39

2.5 Типирование штаммов Streptococcus pneumoniae

методом мультиплексной полимеразной цепной реакции..................... 40

2.6 Метод непрямой иммунофлюоресценции.................................... 43

2.7 Метод газожидкостной хроматографии....................................... 43

2.8 Серологический метод исследования........................................... 48

2.9 Выявление дезоксирибонуклеиновой кислоты Haemophilus influenzae и Streptococcus pneumoniae методом полимеразной цепной реакции в клиническом материале................................................... 49

2.10 Статистические методы обработки результатов исследования......... 50

ГЛАВА 3. СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СПОСОБОВ ВЫЯВЛЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПНЕВМОТРОПОВ ИЗ КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ПРИ ОБОСТРЕНИИ ХРОНИЧЕСКИХ ИНФЕКЦИОННО-ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЛЕГКИХ У ДЕТЕЙ.................................................................................... 51

3.1 Микроскопическая оценка годности мокроты у детей для культурального исследования....................................................... 51

3.2 Создание питательной среды для выделения, культивирования и определения гемолитических свойств бактерий из клинического материала (кровяно-сывороточный агар)......................................... 57

3.3 Разработка способа выявления ß-лактамазопродуцирующих оксидазопозитивных грамотрицательных диплококков, подозрительных

на принадлежность к Moraxella catarrhalis....................................... 61

ГЛАВА 4. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭТИОЛОГИЧЕСКОЙ РОЛИ АЭРОБНЫХ, ФАКУЛЬТАТИВНО-АНАЭРОБНЫХ И АНАЭРОБНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ ПРИ ОБОСТРЕНИИ ХРОНИЧЕСКИХ ИНФЕКЦИОННО-ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЛЕГКИХ У ДЕТЕЙ............................................................................................................... 65

4.1 Частота выявления микроорганизмов культуральным методом....... 65

4.2 Частота обнаружения IgM и IgG к вирусам и труднокультивируемым бактериям методом непрямой

иммунофлюоресценции......................................................................... 70

4.3 Частота выявления дезоксирибонуклеиновой кислоты Haemophilus influenzae и Streptococcus pneumoniae в клиническом материале методом

полимеразной цепной реакции............................................................................................................................70

4.4 Уровень IgG к Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus....................................................................................................................................73

4.5 Биологические особенности основных бактериальных патогенов............77

4.5.1 Биовары Haemophilus influenzae..........................................................................................77

4.5.2 Серотипы Streptococcus pneumoniae..................................................................................78

4.6 Чувствительность к антимикробным препаратам......................................................81

4.6.1 Haemophilus influenzae........................................................................................................................................................81

4.6.2 Streptococcus pneumoniae..........................................................................................................................................84

4.6.3 Moraxella catarrhalis................................................................................................................................................86

4.6.4 Доминирующие бактериальные ассоциации..............................................................87

ГЛАВА 5. ОЦЕНКА ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕТОДА ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ ДЛЯ УСКОРЕННОГО ВЫЯВЛЕНИЯ МАРКЕРОВ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ИНФЕКЦИИ ПРИ

ОБОСТРЕНИИ ХРОНИЧЕСКИХ ИНФЕКЦИОННО-

ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЛЕГКИХ У ДЕТЕЙ................................90

ЗАКЛЮЧЕНИЕ................................................................................................................................................103

ВЫВОДЫ................................................................................................................................................................109

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ........................................................................................111

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ......................................................................................................................113

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................................................114

БЛАГОДАРНОСТИ......................................................................................................................................131

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования и степень её разработанности

Проблема хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких (ХИВЗЛ) у детей была и остается одной из наиболее актуальных и сложных вопросов в педиатрии и клинической медицине в целом [8, 79, 131]. Статистические и эпидемиологические данные подтверждают рост распространенности ХИВЗЛ у взрослого и детского населения [2, 14, 64, 79, 81, 138, 139, 141]. Особенности течения хронических заболеваний легких, их клинико-функциональная эволюция на различных возрастных этапах (ребенок-подросток-взрослые) являются предметом интереса и педиатров, и терапевтов, так как под наблюдение педиатров переходят подростки в возрасте до 18 лет [14, 46].

Несмотря на значительные успехи, достигнутые в диагностике и лечении обострений ХИВЗЛ у детей, многие вопросы, затрагивающие эту патологию, требуют обсуждения. В частности, в настоящее время не совсем ясна причина, связанная с инфицированием респираторного тракта тем или иным видом микроорганизмов при обострении ХИВЗЛ у детей. Можно отметить ряд факторов, влияющих на микробный пейзаж бронхиального дерева: вид и распространенность морфологических изменений структур бронхов и легких; особенности среды, в которой находится ребенок; воздействие антибактериальных средств; особенности внутрибольничных штаммов бактерий стационаров, в которые госпитализируется ребенок [5]. Не меньшее значение в последующем инфицировании больного определенным видом микроорганизма имеет типоспецифический иммунитет, влияющий на серотиповую и биотиповую принадлежность возбудителя [20, 60, 101]. Мукоцилиарный аппарат слизистой дыхательных путей несет главную ответственность за стерильность нижних дыхательных путей. Его повреждения

при вирусных инфекциях или других вредных воздействиях, приводят к колонизации нижних дыхательных путей микроорганизмами, заселяющими носоглотку (например, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae). Бактерии интенсивно размножаются там и становятся причиной развития бронхита, пневмонии или обострения ХИВЗЛ.

Существующая нормативная база по лабораторной диагностике хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких рассчитана преимущественно на взрослых пациентов [9, 17, 22, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 80].

Для бактериологического анализа отделяемого дыхательных путей наиболее часто используют 5% кровяной агар, среду для посева и выделения Streptococcus pneumoniae по прописи JI.K. Катосовой, агар с сердечной вытяжкой, которые имеют либо низкие ростовые свойства для «прихотливых» микроорганизмов, в частности для пневмококка, или высокую себестоимость из-за применения дефицитных компонентов в приготовлении, которые недоступны для большинства практических лабораторий [15, 47, 62].

Кроме того, инфекции дыхательных путей являются самой частой причиной назначения антибиотиков. По данным фармацевтической промышленности, на их лечение приходится приблизительно 2/3 всех выписываемых антибактериальных препаратов, что является основной причиной злопоутребления антибиотиками и способствует развитию резистентности микроорганизмов. На сегодняшний день наблюдается рост частоты выделения возбудителей инфекционно-воспалительных заболеваний легких у детей с множественной устойчивостью к антибиотикам [18, 21, 64, 70, 87, 89, 94, 100, 111].

Цель исследования

Задачи исследования

Методология и методы исследования

Исследование одобрено локальным комитетом по этическим вопросам при ГБУЗ СО «Областная детская клиническая больница № 1» протокол № 24 от 30.10.2012 года.

Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора

Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на III международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения - 2009. К 160-летию академика И.П. Павлова» (Санкт-Петербург, декабрь 2009); конференции с международным участием «Фармация и общественное здоровье» (Екатеринбург, февраль 2010); ХП-ом международном конгрессе по антимикробной терапии Межрегиональной ассоциации по клинической микробиологии и антимикробной химиотерапии (Москва, май 2010); VII международной научно-практической конференции «Актуальные научные достижения 2011» (Чехия, июнь-июль 2011); Российской научно-практической конференции «Национальные дни лабораторной медицины России-2011» (Москва, октябрь 2011); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы эпидемиологии на современном этапе» (Москва, октябрь 2011); XIII-ом международном медицинском форуме «Стандарты и порядки медицинской

помощи, как основа повышения эффективности здравоохранения» -межрегиональной междисциплинарной научно-практической конференции «Современные стандарты и технологии диагностики, лечения и профилактики инфекционных болезней» (Нижний Новгород, апрель 2012); заседании общества эпидемиологов, микробиологов, паразитологов Свердловской области (Екатеринбург, февраль 2013).

Личное участие автора в получении научных результатов, изложенных в диссертации, выразилось в проведении научно-информационного поиска, анализа и обобщении данных специальной литературы, в предложении основной идеи и цели исследования, в разработке необходимых методологических подходов, в проведении 95% всех лабораторных исследований и сборе всего необходимого фактического материала. В едином целом автор представил современные методы диагностики (газожидкостную хроматографию, метод непрямой иммунофлюоресценции, полимеразную цепную реакцию, иммуноферментный анализ) и культуральное исследование, участвовал в разработке питательной среды для выделения, культивирования и определения гемолитических свойств бактерий из клинического материала (кровяно-сывороточный агар) и способа выявления ß-лактамазопродуцирующих оксидазопозитивных грамотрицательных диплококков, подозрительных на принадлежность к Moraxella catarrhalis. Автор сформулировал положения, выносимые на защиту, выводы и подготовил диссертационную работу.

Положения, выносимые на защиту

1. Определяющей характеристикой микроскопической оценки годности мокроты у детей для культурального исследования является наличие в мазке 1 и более полиморфноядерных лейкоцитов при отсутствии десквамированного плоскоклеточного эпителия, 10 и более полиморфноядерных лейкоцитов при 1 -9 клеток десквамированного плоского эпителия, более 25 полиморфноядерных лейкоцитов при 10-24 клеток десквамированного плоского эпителия, в других случаях образцы не должны подлежать бактериологическому анализу.

Информация о работе

Саматова, Елена Валерьевна
кандидата медицинских наук
Челябинск, 2013
ВАК 03.02.03

Диссертация

Совершенствование этиологической диагностики обострений хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких у детей - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Совершенствование этиологической диагностики обострений хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких у детей - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы