Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Состояние эритроцитов в разные сроки длительной алкогольной интоксикации и коррекция выявленных нарушений инсулином

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Состояние эритроцитов в разные сроки длительной алкогольной интоксикации и коррекция выявленных нарушений инсулином"

СМОЛЕНСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ

АКАДЕМИЯ

ргв од

1 ? ОМ Й54

На правах рукописи

СМИРНОВА Людмила Михайловна

СОСТОЯНИЕ ЭРИТРОЦИТОВ В РАЗНЫЕ СРОКИ ДЛИТЕЛЬНОЙ АЛКОГОЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ И КОРРЕКЦИЯ ВЫЯВЛЕННЫХ НАРУШЕНИЙ ИНСУЛИНОМ

03. 00. 04 — биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Смоленск — 1994

Работа выполнена на кафедре 'биохимии Смоленской государственной медицинской академии.

Научный руководитель — заслуженный деятель науки, доктор медицинских наук, профессор Н. Б. Козлов.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

член-корреспондент АМН России, доктор медицинских наук, профессор Л. Ф. Панченко;

доктор медицинских наук, профессор В. В. Алабовский.

Ведущее учреждение — Российский государственный медицинский университет им. Н. И. Пирогова.

Защита диссертации состоится «_»_ 1994 г.

в_час. на заседании специализированного ученого

совета К 084.34.01 Смоленской государственной медицинской академии (214019, г. Смоленск, ул. Крупской, 28).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Смоленской государственной медицинской академии.

Автореферат разослан «30» лея/к. —1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета, профессор

Н. Ф. ФАРАЩУК.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

Алкоголизм становится в настоящее время все более актуальной медико-биологической и социально-экономической проблемой. Постоянно увеличивающееся производство и потребление алкогольных напиткоъ в большинстве экономически развитых стран мира, ухудшающиеся вследствие этого многие показатели здоровья населения, значительный материальный урон, наносимый алкоголизмом обществу, выдвинули борьбу с ним в разряд важнейших задач, стоящих перед медициной и бгологией.

Несмотря на то, что наука накопила весьма обширные данные о нарушениях, возникающих в организме под влиянием этанола, многие последствия алкогольной интоксикации не имеют в настоящее время однозначного объяснения. Большую значимость в этой проблеме приобретают экспериментальные наблюдения, Причем особого внимания заслуживает изучение тонких механизмов воздействия этанола на клеточном, субклеточном и молекулярном уровнях.

К числу малоизученных вопросов патогенеза алкоголизма относится вопрос о состоянии эритроцитов при алкогольной интоксикации. Исследования в этом направлении весьма актуальны, поскольку от свойств эритроцитов и возможностей выполнения юли своих функций во многом зависит состояние практически всех органов и систем организма. Ряд фактов свидетельствует о том, что в эритроцитах наблюдается интегрированное отражение наиболее общих метаболических процессов, происходящих в организме, в том числе, и в головном мозге, при различных патологических состояниях (Багинский П.П.,1969: Чиркии А.А.,1981: Янкелевич Ю.Д.,1992). Кроме того, эритроциты являются универсальной и доступной моделью для изучения мембранотропных эффект ов этанола (Chin J.,19??; Чуии Г.А.,1981: Goldstein D.,1981).

Экспериментальные и клинические исследования преимущественно освещают морфологические изменения популяции эритроцитов и структурные перестройки в их мембранах при алкогольной интоксикации (Тухтаев К.Р.,1988; Cuequen-Duchesne М. .1988: Branchey М.Н.,1990). Имеющиеся в литературе сведения об активности отдельных ферментов и содержании некоторых метаболитов в эритроцитах фрагментарны, противоречивы и не дают представле-

ния об изменениях метаболизма клеток в развитии заболевания (Викулин С.В.,1988; Сторожок С.X.,1984; Хлебутина Т.А., 1988; Носенко И.А.,1989). Крайне мало работ, отражающих последствия отмены этанола на метаболизм эритроцитов, а также влияние фармакологических средств, используемых при лечении алкоголизма (Балаклеевский А.й.,1988; Островский Ю.М.1988).

Цель работы:

изучить физико-химические свойства, показатели метаболизма и функций эритроцитов в динамике развития хронической алкогольной интоксикации, а также в условиях применения инсулина при отмене этанола.

Задачи исследования:

1.произвести определения среднего диаметра, среднего корпускулярного объема эритроцитов, индекса сферичности, осмотической и кислотной резистентности;

2.определить показатели утилизации глюкозы клетками, интенсивности гликолиза в них, активность гексокиназы, содержа ние АТФ и активность Иа, К-АТФазьг,

3.исследовать эффективность применения инсулина в период после прекращения алкоголизации для фармакологической коррекции изменения свойств эритроцитов и метаболизма в них, вызванных длительной алкогольной интоксикацией:

4.с целью оценки кислородтранспортной функции эритроцитов определить содержание 2,3-ДФГ в них при.длительной алкогольной интоксикации, в период "отмены" и в условиях применения инсулина после прекращения алкоголизации.

Научная новизна работы.

Впервые продемонстрировано изменение размеров эритроцитов ж их устойчивости к гемолитическим воздействиям (гипотонические растворы ИаС1 и соляная кислота) в динамике длительной алкоголизации и после ее прекращения. Установлено, что эти изменения сопряжены с изменениями обменных процессов в эритроцитах, возникающих в результате алкогольной интоксикации и в постинтоксикационный период.

Впервые выявлены снижение способности эритроцитов утилизи-^ ровать глюкозу при алкогольной интоксикации и ускорение про-

цессов катаболизма, ведущих к метаболическому истощению красных клеток крови.

Показано, что нормализация измененных при длительной алкоголизации показателей физико-химических свойств эритроцитов и обменных процесоов в них после прекращения введения этанола происходит очень медленно и не завершается в полной мере ири окончательном обновлении клеток в кровяном русле.

Отчетливо продемонстрирован нормализующий эффект инсулина на свойства эритроцитов и характер метаболизма в них в период отмены этанола.

Впервые изучено изменение содержания в клетках 2,3-дифос-фоглицерата после прекращения алкоголизации и влияние введения

инсулина в указанных условиях на этот показатель.

•

Научно-практическая значимость полученных результатов состоит в том, что они являются важной частью комплексного исследования патогенеза алкоголизма.

Полученные данные существенно расширяют представления о состоянии эритроцитов при длительной алкоголизации, в период после ее прекращения и в определенной мере позволяют разработать критерии оценки степени тяжести интоксикации. ,

Снижение утилизации глюкозы и интенсификация катаболичес-ких процессов наряду с другими характерными изменениями состояния эритроцитов могут служить одним из критериев длительного воздействия на организм этанола.

Обнаруженный положительный эффект введения инсулина на физико-химические свойства и состояние обменных процессов в эритроцитах в периоде после прекращения длительной алкоголизации позволяет рекомендовать более широкое применение гормона в арсенале средств, используемых для купирования абстинентного синдрома и лечения алкоголизма. Кроме того," результаты этих опытов дополняют сведения о механизмах действия инсулина.

Предложенный нами способ определения активности На.К-АТФа-зы в интактных эритроцитах может быть использован » .^¿оратор-но-клинической практике. ••

Апробация работы.

Материалы исследований доложены на заседании кафедры биохимии Смоленской государственной медицинской академии (1991,.

1994), совместном заседании Смоленского отделения Российского общества биохимиков, фармакологов, патофизиологов, биологов (1992, 1994).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано ? печатных работ. Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 179 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследований, заключения, выводов и библиографического указателя, ¿,-нимащего 42 страницы и включающего 233 источника отечественной и 139 зарубежной литературы. Работа иллюстрирована 26 таблицами и 5 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ. Материалы и методы исследования.

Эксперименты выполнены на 380 белых беспородных крысах самцах с массой тела около 150г в начале алкоголизации и 190-250г перед забоем. Хроническую алкогольную интоксикацию вызывали ежедневны?,) внутрижелудочным введением 40% раствора этилового спирта из расчета 4г 96% этанола на 1кг массы тела.

Исследовались эритроциты крови 6 групп декапитированных животных:

контрольных — 1 группа, получавших алкоголь в течение 15 суток — 2 группа, получавших алкоголь в течение 30 суток — 3 группа, на 4-е сутки после прекращения 30-дневной алкоголизации —

4 группа,

на 9-е сутки после прекращения 30-дневной алкоголизации —

5 группа,

а таксе тех тавотных, которым после прекращения 30-дневной алкоголизации в течение 3 дней вводили инсулин в дозе 3 МЕ/кг (содержание сахара в крови при максимальном снижении составляло 2,2 - 2,8мМ) — 6 группа. Средний диаметр эритроцитов определяли галометрически по методике, разработанной во 2 МОЛГМИ (1981), средний объем эритроцита рассчитывали делением гематокритной величины 1мкя

крови на число эритроцитов в том же объеме. Определение осмотической резистентности эритроцитов производили унифицированным методом в модификации Идельсона Л.И. (1974); кислотную резистентность определяли по методу Терскова И. А. и Гительзона И.И. в модификации Воробьева А.Й.(1961).

Для изучения способности эритроцитов утилизировать глюкозу использовали тест Соловьева Ю.А. и Чиркина A.A. (1990), в котором концентрацию глюкозы в среде инкубации измеряли глюкозоок-сидазным методом с помощью "GOD - POD - Glucose Test". Finland.

Интенсивность гликолиза устанавливали по приросту содержания молочной кислоты в среде инкубации эритррцитов при утилизации глюкозы, причем содержание лактата определяли с помощью "Test-Combination Laktate" ("Boehringer Mannheim", ФРГ).

Активность гексокиназы (К.Ф.2.7.1.1.) в гемолизатах эритроцитов измеряли спектрофотометрически в глюкозо-6-фосфатде-гидрогеназной системе по скорости восстановления НАДФ. Оптимальные концентрации компонентов реакционной смеси для получе-' ния стабильных результатов выбирали на основе методик различных авторов (Алейникова Т.Д. и др.,1978; Кильдема Л.А. и др.,1969; Шапот B.C. и др.,1976; Salas М., Venuela-E., 1963).

Содержание АТФ в эритроцитах определяли биолюминесцентным методом. Модифицируя описанный способ (Бровко Л.Ю.» Угарова H.H. и др.,1978; Атауллаханов Ф.И., 1984; Stanley P.E.,1989), мы применяли внешний стандарт АТФ, что позволило получать воспроизводимые результаты.

Для оценки активности Na.K-АТФазы использовали методический подход, принципиально отличающийся от существующих методик,— изучали не мембранные препараты, а интактные эритроциты. При этом мы опирались на способ определения функциональной активности сердечной мышцы по активности На,К-АТФазы, предложенный Алабовским В.В. с соавт.(1985).Данный тест отличается физиологичностью: для работы фермента клетки используют собственные запасы АТФ. Активность Na.K-АТФазы опент—¿отся по разности концентраций ионов калия в средах инкубации с уабаином и без него при одинаковом количестве эритроцитов.

Содержание 2,3-ДФГ определяли неферментативным колориметрическим методом Dyce В.J.(1973),модифицированным и описанным Виноградовой Й.Л. с соавт.(1976) и Рапопортом 1.1.(1978).

Результаты опытов были подвергнуты статистическому анализу с использованием критериев Стыодента (Ойвин И.А.,I960) и Вил-

коксона "анна-Уитни (Гублер Е.В.,1973).

t

Результаты исследований и их обсуждение.

Результаты опытов показали, что изменения физико-химических свойств эритроцитов и метаболизма в них под влиянием длительной алкогольной интоксикации развивались постепенно. 15-суточная алкоголизация животных в дозе 4г/кг не отразилась на основных физико-химических характеристиках эритроцитов: средний корпускулярный объем, средний диаметр, индекс сферичности, осмотическая р зистентность не отличались от контрольных значений. ■ За этот же срок интоксикации, соответствующий периоду двукратного обновления эритроцитов в кровяном русле крыс в норме (Западнюк И.П., Западнюк В.И.,1983), не изменились показатели углеводно-энергетического обмена: скорость утилизации глюкозы, интенсивность гликолиза в опытах in vitro, активность гексокиназы и уровень АТФ в клетках. Вместе с тем. в этот период наблюдалось некоторое снижение активности мемб-ранносвязанного фермента — Na.K-АТФазы. Такое изменение при нормальном содержании АТФ в эритроцитах, вероятно, во многом связано с определенными структурными перестройками в их мембранах, обусловленными, в частности, активизацией процессов ПОЛ (Сторожок С.А.,1984; Фонякова 0.Г.,1991).

Удлинение сроков алкоголизации до 30 с у то:: привело к существенный изменениям как физико-химических свойств, так и процессов метаболизма в красных клетках крови.Наблюдалось значительное увеличение размеров эритроцитов — среднего объема и среднего диаметра (рис.1). Выявленный макроцитоз эритроцитов оказался устойчивым: оба показателя нормализовались лишь на 9 сутки после прекращения введения этанола, т.е. за время полного обновления'эритроцитов в кровяном русле крыс в норме. Причиной ыакроцитоза и его устойчивости, по-видимому, следует считать совокупный результат различных эффектов этанола и его метаболита ацетальдегида, к которым относятся не только непосредственное юс действие-на мембраны и обменные процессы в красных клетках крови, но и поражения отдельных органов,изменения метаболизма всего организма.

Рис.1. Размеры эритроцитов интактных крыс и подвергавшихся алкоголизации.

6,3

$0

Средиий диаметр эритроцита, мкм.

-52

К?

Средний объем эритроцита,мкм. т*

I И Ш £? Т VI I 2 Ш 17 7 7Г I- контроль, Ц- 15сут.алкогол., Щ- ЗОсут.алкогол., IV- 4сут."омены", у- 9сут."отмены", VI- инсулин при "отмене". « - изменения, достоверные по отношению к контролю.

Об изменениях в качественном составе эритроцитов через 30 суток алкоголизации свидетельствуют также результаты.определения осмотической и кислотной резистентности. Так, основная масса эритроцитов отличалась повышенной устойчивостью к гипотоническим растворам ЯаС1 и к кислоте. Поскольку к этому сроку произошло перераспределение клеток по стойкости к гемолизу по сравнению с контролем (табл.1, рис.2), не исключено, что установленные сдвиги обусловлены не только прямым воздействием этанола или его метаболитов на клетки в кровяном русле, но и изменениями состояния эритропоэтической системы, определяющей возрастные особенности диркулирующих эритроцитов. Повышение кислотной и осмотической резистентности, укрупнение клеток можно трактовать как результат значительного омоложения состава эритроцитарной популяции (Гительзон И.И..Терсков И.А.,1961) и как косвенное свидетельство ускоренного разрушения эритроцитов в организме. Известно, что мембраны стойких к гемолитическим воздействиям эритроцитов имеют изменений лшшдный состав, в котором обычно увеличено содержание холестерина (Альпидовс-кий В.К.,1982); деформируемость таких клеток значительно снижена (Карабанов Г-Н.,1986). Однако, в условиях выбранной нами модели хронического алкоголизма изменения качественного состава эритроцитов существенно не отразились на основных количест-

венных показателях красной крови — содержании эритроцитов, гемоглобина, гематокритном показателе — во Есе сроки наблюдений.

Табл.1, осмотическая резистентность эритроцитов (%гемолиза).

% №01 Контр. 15суток ЗОсуток 4сутки Эсутки Инсулин

алкогол. алкогол. "отмены" "отмены" ("отмена")

1 2 3 4 5 6

0,75 3,95 3,85 5,42* 4,99* 2,46* 4,61

0,65 3,57 3,50 5,36» 4,96* 2.19* . 4,59

0,60 3,77 4,02 4,92* 4,68 2,60* 4,92

0,55 8,73 9,30 5,70 8,53 7,65 7,40

0,50 38,09 42,41 16,11* 27,50* 53,44* 30,00

0,45 74,94 70,88 59,57* 70,43 89,51* 78,79

0,40 93,83 92,97 86,23* 91,06* 92,94 92,54

« - достоверность различий с показателем в контроле.

После прекращения введения этанола крысам на 4 сутки характер отклонений осмотической и кислотной резистентности от нормы сохранился, хотя количественно эти изменения были менее выражены, чем в 1-ый день"отмены". При этом анализ результатов определения кислотной резистентности позволяет выявить группу "сверхстойгах" клеток, возможно, продуцированных костным мозгом в ответ на "лишение" алкоголя.Продукция эритроцитов с аномально высокой кислотной резистентностью, наблюдаемая при ряде экспериментальных анемий и хронических интоксикациях ядами, расценивается как явление приспособительного характера: клетки выходят с большей стойкостью, но с меньшим сроком жизни (Воробьев А.И.,1961). Через 9 суток после прекращения алкоголизации животных полной нормализации указанных физико-химических свойств красных клеток крови не произошло: при постепенном снижении резистентности к гемолизу большей части клеток до нормы к этому сроку выявлялась значительная доля низкостойких эритроцитов.

Рис.2. Кислотная резистентность эритроцитов

При определении скорости утилизации глюкозы эритроцитами в оптимальных условиях in vitro (Соловьев Ю.А., 1990) установлено ее резкое снижение после 30-суточной алкоголизации животных (табл.2), причем данный показатель нормализовался лишь к 9 суткам "отмены". Учитывая, что в физиологических условиях потребление глюкозы клетками определяется многими факторами, мы обратили внимание на первый и основной лимитирующий этап е& утилизации эритроцитами — реакцию фосфорилирования с участием гексокиназы (Панин Л.Е.,1983). Исследования показали, что во все сроки наблюдений динамика изменений показателя утилизации глюкозы эритроцитами и активности гексокиназы в них была однонаправленной. Это дало нам основание предположить, что нормальной скорости утилизации глюкозы эритроцитами препятствовала сниженная активность гексокиназы. Подтверждением можно считать результаты опытов, в которых при увеличении в среди инкубации содержания неорганического фосфата, являющегося активатором гексокиназы, способность утилизировать глюкозу нормализовалась.

Содержание АТФ в эритроцитах после 30-дневного введения этанола крысам оказалось ниже нормы (табл.2). Однако наиболее

Табл.2. Некоторые показатели метаболизма эритроцитов.

Контроль 15 суток 30 суток "отмена", "отмена", инсулин

алкогол. алкогол. 4 су TIC 9 сутки 4С. "ОТМ".

Утилизация

глюкозы, 1,22010,166 0,94040,138 0,7б2±0,121 0,78740,110 0,88840,134 0,88640,095

имояь/ п»8 п-7 п=9 П*10 п=8 Пз9

1МЯН.К&..Ч2С. Р>0,05 Р<0,05 Prt),0S R>0,05 • Fí>0,Q5

Прирост о

лактата. 1,6940,33 1,65*0,40 1,8440,36 1,62+0,42 1,4640,20 1,6040,31

ямоль/ п=9 п=8 П-10 П«7 П-8 п»8

1млн.кл..час. Р>0,05 Р>0,05 Р>0,05 Р>0,05 Р>0,05

Актив.гексо- 1,68±0,11 1,5340,1* 0,9740,15 1,2540.13 1,5540,14 2,0640,16

киназы.мкмоль п=12 П*7 П*11 П»10 п»8 п-8

НАДФН+Н/1мин. 1гНЬ Р>0,05 Р<0,001 PCO,05 Р>0,05 Р<0,05

Содержание АТФ 2,64±0,12 2,3340,17 2,2240,08 1,7910,09 2,07±0,08 2,37±0,05

мкмоль/1'г Hb П«14 п=8 П=>14 П=41 п=8 п=8

Р>0,05 FV0.01 Р<0,001 Р<0,001 Р=0,05

Активность

Na.K-АТФазы, 0,28840,039 0,20040,017 0,61040,086 0,32540,071 0,237±0,033 0,27440,079

нмоль К/ П=9 " П=7 п=12 п=7 П-В п=9

1млн.кл..час. • Р-0.05 Р<0,01 Р>0,05 Р>0.05 Р>0.05 ,

- и -

низкий уровень АТФ отмечен нами через 4 дня после прекращения алкоголизации. Эти факты заслуживают особого внимания, поскольку энергетически истощенные эритроциты неизбежно подвергаются ускоренной деструкции в организме (Атауллаханов Ф.И.,1984). Кроме того, учитывая сходство эритроцитов по некоторым параметрам с другими клетками, в том числе и клетками головного мозга, справедливым представляется следующий вопрос. Если наименьший уровень АТФ в период "отмены" наблюдается не только в эритроцитах, то не является ли тяжелое состояние организма (субъективное и объективное) при абстиненции следствием энергетического голода клеток?

При выяснении роли гликолиза в генезе нарушений энергетического обмена красных клеток крови нами было показано, что скорость накопления молочной кислоты эритроцитами в оптимальных условиях инкубации не зависела от количества утилизированной глюкозы и была приблизительно одинаковой для всех групп животных (табл.2).. Это дает основание предполагать, что активность гликолитических ферментов в эритроцитах не подавляется при алкогольной интоксикации. Вместе с тем, in vivo, т.е. при нормальной концентрации глюкозы, замедление ее фосфорилирова-ния в эритроцитах может отразиться на интенсивности гликолити-ческого образования АТФ. Дальнейшее снижение уровня АТФ в первые дни после прекращения алкоголизации правомерно было бы объяснить резкой перестройкой метаболизма клеток в связи с дефицитом этанола или ацетальдегида как энергетических субстратов, в качестве которых они могли бы использоваться незрелыми клетками в обход гликолитического пути.

Несмотря на то, что результаты изучения гликолиза не позволяют с достаточной определенностью оценить роль этого пути метаболизма глюкозы в генезе нарушений энергообеспечения в эритроцитах, анализ данных выявляет важные особенности клеток алкоголизированных животных. Сопоставление показателей утилизированной глюкозы и продуцированного при этом лактата показало, что' после 30-дневного введения этанола крысам эритроциты производили молочной кислоты больше, чем ее могло стехиометри-чески образоваться из всей поглощенной глюкозы — в среднем на 21%. В таких же условиях эритроциты контрольных животных превращали в лакта'т около 70% утилизированной глюкозы. Возможным объяснением интенсивного образования молочной кислоты в опытах

in vitro, что не исключено и в организме, является представление об осуществлении гликолиза за счет структурно-функциональных компонентов клетки. Отмеченный эффект, по-видимому, следует считать характерным для алкогольной интоксикации и его можно рассматривать как компенсатсрную реакцию в ответ на снижение уровня АТФ.

Выраженность эффекта (нарушение соотношения между поглощенной глюкозой и образовавшимся лактатом) имела определенную динамику. Уже через 15 суток от начала алкоголизации в эритроцитах проявилась тенденция к усилению продукции лактата (87% поглощенной глюкозы). Достигнув максимума через 30 суток и превысив теоретически возможное значение прироста молочной кислоты на 21%, этот показатель снижался после отмены этанола. На 4 сутки превышение теоретической величины составило 3%. а к 9 суткам количество образовавшегося лактата соответствовало 82% утилизированной глюкозы.

Учитывая вышеизложенное, при объяснении низкого уровня АТФ при длительной алкоголизации животных можно сделать предположение, которое приемлемо и для постинтоксикационного периода, о смещении равновесия между энергосинтезирующими и энергоути-лизирующими процессами в сторону преобладания последних. Предположение исходит прежде всего из результатов определения в интактных клетках активности Иа.К-АТФазы, которые свидетельствуют о резком ее возрастании после 30-суточной алкоголизации животных(табл.2). Вместе с тем, в литературе приводятся доказательства того, что, кроме натриевого насоса, в мембранах эритроцитов протекают и другие, не изученные пока, АТФ-утили-зирующие процессы (Рапопорт С. и др., 1987).Поскольку через ,4 дня после прекращения алкоголизации наблюдается уменьшение активности Иа,К-АТФазы до нормы и одновременно снижается уровень АТФ, можно представить, что в этот период активируются иные мембранные АТФазы.

Характер метаболизма в эритроцитах определяет их функциональную активность, отражающую, в первую очередь, способность к связыванию, переносу и отдаче кислорода. Эта функция эритроцитов при алкоголизме заслуживает особого внимания в связи с тем, что алкоголь угнетает окислительно-восстановительные процессы в тканях и тканевое дыхание (Кириленко Н.И.,1982). При сохранении количественных гематологических показателей в уело-

виях выбранной модели хронической алкогольной интоксикации содержание 2,3-ДФГ в эритроцитах крыс, подвергавшихся 30-суточ-ной алкоголизации, было выше нормы{13,40 против 11,40 мкмоль Р/1г НЬ). Этот результат, согласующийся с выводами других исследователей (Викулин C.B.,1989; Носенко И.А.,1989), по-видимому, свидетельствует как о наличии гипоксического состояния, так и о включении компенсаторной реакции на него. На 4 сутки после прекращения введения этанола содержание 2,3-ДФГ в эритроцитах соответствовало контролю, что можно расценивать как доказательство нормальной обеспеченности тканей кислородом. С другой стороны, нэ исключено, что при сохранении гипоксического состояния у крыс и после отмены алкоголя метаболические изменения в эритроцитах в этот период отразились на процессах, от которых зависит уровень указанного соединения.

Приведенная попытка анализа причин указанных изменений ■ свойств эритроцитов и метаболизма в них при алкоголизации и после ее прекращения отражает многообразие воздействующих факторов и их сложную взаимосвязь. Возможно, именно первичный мембранотоксическиЕ эффект этанола вызывает нарушения углеводно-энергетического обмена в клетках, что наряду с другими факторами сокращает срок их жизни в кровяном русле. При этом, однако, эффект этанола на мембраны эритроцитов может реализоваться через его гепатотоксическое воздействие, приводящее, например, к накоплению холестерина (Benedetti А.,1986;Бельчен-ко Д.А. и др.,1988). Не исключено также, что вследствие вовлечения в патологический процесс костного мозга в кровяное русло выходят ретикулоциты с нарушениями метаболизма. По этим соображениям была осуществлена попытка коррекции указанных нарушений в эритроцитах in vivo, для чего был выбран известный регулятор обменных процессов — инсулин.

Введение инсулина животным в период "отмены" (в первые 3 дня) приводило к боле* быстрому уменьшению размеров эритроцитов, возросших за время алкоголизации, причем средний объем клеток через 3 суток инсулинотерапии не отличался от нормальной величины (рис.1).

Распределение эритроцитов по осмотической стойкости полностью соответствовало контрольному; нормализующие сдвиги произошли также в кислотной резистентности. Данные этих экспериментов показывают, что при инсулинотерапии изменялись не толь-

ко скорости процессов, обеспечивающих формирование определенного состава клеток крови, но и их направленность.

Утилизация глюкозы эритроцитами животных, которым вводили инсулин, достигла уровня в контроле. При этом, подтверждая предположение о связи снижения данного показателя с замедлением фосфори жирования глюкозы в клетках крови при алкогольной интоксикации, резко возросла и даже превысила значение контрольного уровня активность гексокиназы (табл.2).

Введение инсулина способствовало нормализации уровня АТФ в эритроцитах. Поскольку накопление лактата в среде инкубации эритроцитов животных, которым вводили инсулин, протекало с обычной скоростью, то это можно было бы расценить как отсутствие прямого эффекта гормона на гликолитические ферменты, если их активность не была подавлена в результате алкогольной интоксикации. В таком случае, при активации гексокиназной реакции, вероятно, увеличивается поток глюкозы по пентозофосфатно-му пути превращений. Действительно, установлено, что инсулин может направлять обмен глюкозы по- этому пути посредством активации глкжозо-6-фосфатдегидрогеназы в печени и других тканях (Лабори А.Т.,1970; Сандуляк Л.И. ,1987).

Важно отметить, что в результате инсулинотерапии изменилось соотношение между количеством утилизированной глюкозы и приростом лактата при инкубации эритроцитов указанной группы животных. Поскольку количество образовавшегося лактата в этих опытах соответствовало в среднем 90% утилизированной глюкозы, т.е. приблизилось к контрольной цифре, то становится очевидным нормализующее действие инсулина на характер метаболических процессов в клетках при алкогольной интоксикации. Этот вывод согласуйся с концепцией об анаболическом аспекте механизма действия гормона (Старосельцева Л. К. ,1973; Не«БЬо1те Е.А.,19??; ИаЫпоч/Иг I). ,1978).

Другой особенностью проявления эффектов инсулина можно считать разнонаправленные изменения уровня АТФ и активности Иа,К-АТФазы в эритроцитах. Несмотря на повышение уровня АТФ, который является активатором ИаД-АТФазы, в период введения инсулина активность этого фермента, возросшая при алкоголизации, снижается до контрольного значения. Это дает основание предполагать, что активность Иа.К-АТФазы в данных условиях эксперимента в большей мере связана с другими факторами — и.

- 15 -

возможно, со структурными изменениями мембран.

Пути реализации всех перечисленных эффектов инсулина, как и многих других его эффектов, сложны и требуют особого изучения. Учитывая результаты наших опытов (проявление эффектов инсулина за 3 дня его введения), мы не исключаем возможности непосредственного действия гормона на мембраны эритроцитов, что находит отражение в изменениях физико-химических свойств клеток и обменных процессов в них. Кроме того, можно предположить, что введение инсулина в период "отмены" влияет на процессы эритропоэза и эритродиэреза, соотношение скоростей которых, как известно, отражает динамическое равновесие в качественном и количественном составе красных клеток крови. При этом достаточно важным является общеметаболический эффект инсулина на уровне организма в целом. Возможно, именно совокупность различных эффектов гормона определяет также уровень 2,3-ДФГ в эритроцитах при введении инсулина крысам после прекращения алкоголизации. По результатам наших опытов, повышенное содержание 2,3-ДФГ после инсулинотерапии снизилось до контрольного уровня.

ВЫВОДЫ.

1.Ежедневное введение алкоголя крысам в течение 15 суток в дозе 4г/кг приводит к незначительному снижению активности На,К-АТФазы. Другие изученные показатели метаболизма клеток не изменяются. К этому сроку наблюдений средний объем эритроцитов, средний диаметр, осмотическая резистентность не отличаются от контрольных значений.

2.30-дневное введение этанола в указанной дозе вызывает увеличение среднего объема и среднего диаметра эритроцитов.Основная масса, клеток отличается повышенной осмотической резистентностью. Кислотная резистентность практически всей популяции эритроцитов увеличена.

3.Ежедневное введение этанола в течение 30 суток вызывает существенные изменения метаболизма в эритроцитах: уменьшается утилизация гдгкозы эритроцитами; снижается активность гексоки-назы; понижается уровень АТФ; увеличивается активность йа,К-АТФазы; возрастает содержание 2,3-ДФГ. Скорость образования молочной кислоты эритроцитами in vitro не изменяется. При этом количество образовавшегося лактата превосходит величину его пгозукции из утилизированной глюкозы.

4.На 4 сутки после прекращения 30-дневной алкоголизации средний объем эритроцитов увеличен; средний диаметр достоверно уменьшается, но не достигает значения в контроле. Изменения осмотической резистентности, выявленные через 30 суток ежедневного введения этанола, сохраняются. Основная масса эритроцитов имеет повышенную кислотную резистентность, прйчем в этот период выявляются клетки с аномально высокой стйкостью к кислоте,

5.На 4 день после прекращения введения алкоголя утилизация глюкозы уменьшена, снижена активность гексокйназы, хотя количественна эти изменения менее выражены, чем в 1-й день "отмены". Уровень АТФ к этому сроку достоверно уменьшается даже по отношению к первому дню после прекращения 30-суточной алкоголизации. Активность Иа.К-АТФазы, возросшая за период алкоголизации, снижается до контрольного значения. Скорость образования молочной кислоты эритроцитами этой группы животных не отличается от нормы. Имеет место несоответствие между количеством образовавшегося лактата и поглощенной глюкозы.

6.К 9 суткам после прекращения 30-дневной алкоголизации осмотическая и кислотная резистентность основной массы клеток снижается до нормы, однако по сравнению с контролем увеличено содержание эритроцитов с низкой стойкостью к гемолитическим воздействиям. Содержание АТФ достоверно увеличивается, однако остается сниженным по отношению к контролю. Другие показатели физико-химических свойств эритроцитов и обмена в них не отличаются от контрольных.

7.Введение инсулина в дозе 3 МЕ/кг после прекращения алкоголизации способствует более быстрой нормализации свойствен' показателей метаболизма клеток, измененных в результате длительной алкогольной интоксикации. После трехдневного введения .инсулина (на 4 день "отмены") средний объем эритроцитов, утилизация глюкозы, активность Ка,К-АТФазы, скорость образования молочной кислоты, содержание 2,3-ДФГ не отличаются от соответствующих значений в контроле, а активность гексокйназы превышает контрольный показатель. Выявляется нормализующий эффект инсулина на уровень АТФ.

- 1С -

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1.Для оценки степени тяжести алкогольной интоксикации и эффективности терапевтических действий целесообразно использовать данные о состоянии эрироцитов.

2.В качестве эффективного средства для нормализации обмена веществ, нарушенного при длительной алкогольной интоксикации, можно рекомендовать инсулин.

3.В лабораторно-клинических исследованиях свойств эритроцитов при различных патологических состояниях приемлемо использование предложенного нами способа определения активности Ка.К-АТФазы в интактных эритроцитах.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1.Смирнова Л.М. Изменения размеров и формы эритроцитов в процессе экспериментальной длительной алкогольной интоксикации //Актуальные вопросы педиатрии и детской хирургии: Тезисы науч. докл. - Смоленск, изд-во СГМИ, 1991. - С. 85 -86.

2.Смирнова Л.М., Козлов Н.Б. Изменения физико-химических свойств эритроцитов в процессе алкогольной интоксикации, в период "отмены" и введении при этом инсулина. Смоленск,1992. -11с. - Деп. в ВИНИТИ 18.05.92. N 1629-1392.

3.Смирнова Л.М., Козлов Н.Б. Изменение активности Ма,К-АТФази в интактных эритроцитах крыс в динамике алкогольной интоксикации животных //Актуальные проблемы физического воспитания и ¿здоровья населения: Тезисы науч. докл. - Смоленск, изд-во СГМИ, 1992. - С.68 -69.

4.Смирнова Л.М., Макаренко Т.Г., Емельянов В.В., Козлов Н.Б. Энергетическое состояние эритроцитов при длительной алкогольной интоксикации животных //Использование современных методов в диагностике, лечении и профилактике заболеваний: Сб. науч. трудов. - Смоленск, изд-во СГМИ, 1993. - С.96 -97.

5.Макаренко Т.Г., Смирнова Л.М., Козлов Н.Б. Изменение активности гексокиназы мозга крыс при хронической алкогольной интоксикации. //Новые методы в диагностике, лечении, реабилитации и профилактике патологических состояний: Сб. науч. трудов.* Смоленск, изд-во СГМИ, 1994. - С.80 - 81.

6.Смирнова Л.М., Макаренко Т.Г., Козлов Н.Б. Состояние гликолиза в эритроцитах в условиях длительной алкогольной интокси-

нации и в период "отмены" этанола //Новые методы в диагностике, лечении, реабилитации и профилактике патологических состояний: Сб. науч. трудов. - Смоленск, изд-во СГМИ.1994.-С.108-109.

7.Смирнова Л.М., Козлов Н.Б. Утилизация глюкозы, активность гексокиназы и уровень АТФ в эритроцитах при длительной алкогольной интоксикации, в период "отмены" и при введении инсули-на//Бюлл. экспер. биол. и мед. - 1994. - Ы 1. - С. 29 -32.