Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сорбенты пространственно-глобулярной структуры и их применение в процессах физико-химической биотехнологии и экологии

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Сорбенты пространственно-глобулярной структуры и их применение в процессах физико-химической биотехнологии и экологии"

С/ЛКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ .ТШОЛОТЖЕСККЙ .Ш'ШТЯ

■■ На правах рукозяеи

« Учетный И I , Для служебного'пользования -

Экз № £3 ' _'

ОЕЕШСОВ Александр Борисович

СОРБЕНТЫ ПРО СТРА НСХВЕННО-ГЛОБУЛЯРНО X СТРУГОТЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В ПРОЦЕССАХ ®ЗИК0-ДСЙ!ЧЕСКОЙ

• • , ;' БИОТЕХЖЛОШ! И ЭШОШ

03,00.23 - Биотехнология. ' 03.00.02 - Биофизика ■

АВТОРЕФЕРАТ.'* . диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

/¡Г! ал. ЛСКСО'ЗЕТА Ь*. а ¡5/Я.

Санкт-ПэгерЬург •1992 '

•■ Рыботь вшгойнека-в Санкт-Детэрбургском государственном техшпескоы удавероятете ' - с.

Научные руководителя: -; • : . ■

доктор технических паук, '- Коляков .'--"-Л!

профессор . - • Всеволод Михайлович \

' кандндаг фазихо-магейагических \ Катудаина

наук, старший! научный сотрудник Нина Васильевна -■•''<:^

Официальные оппоненты: -.,ч .

доктор фйэико-катематЕческих ' Френкель

аауж, профессор- , ; . Сергей Яковлевич '

доктор химических каук, : ' Дыигрснко

профессор . . л ■ ; Леонид Васильевич

Ведущая оргашьедая: Йнсмитут аналитического

Г, л • ■ ' приборостроения РАН "

Защита диссертация соогоитоя " ь^ррд 1993

в Ю часов ка заседании специализированного совета Д.063.25»09 яри Саккт-Петербургском технологическом ипсти* (ХёаМЗ, Сажсг-Пегерйург, Московский пр., д.2б)

С двссэргацией ковно ознакомиться в библиотеке Санкт Пегербургскох-о технологического института ,

ДвгореФврат. разосяад "с^У;" «тняра 1993 г.

Учзяый секретарь

спедиализироведиого сова га, Т.Б.Дисицкая

кандидат технических наук

- £ -

ОВЦАЛ Ш'ШЕРНСтеКд РАБОТУ

Актуальность проблемы. В свр^'л о развитием сорбтхи-окно-хромагографических методов выделения, очистки и кон-цекгрлрованш биологически активных вещесга (БАВ), особое значение приобретает создание и исследование для этих целей новы::, более совериенных хроматографииоких материалов. К ним, в частности, относятся полимерные материалы пространственно-глобулярной структуры (ПГС-полимзры). Для их внутренней структуры характерны микроглобулы очень малого размера (единицы мкм), которые соединены медду собой я а итоге образуют непрерывный пространственны!! каркас.

Сорбционнне свойства ПК-материалов исследовались по отношению к анионам силпшх кислот, мышьяку, сурьме, ло-нш цветных металлов. Это связано с тем, что фильтры-сорбенты на основе ПГС-лолимеров используются, в основном, для удаления неорганических конов из сточных под. Процессы фильтрационной и сорбцконкой счистки сточнкх вод о помощью ПГС-ыатериалов успешно испытаны на целом ряде предприятий цветной металлургии, на промышленных и полупромышленных установках. Бри этом упрощается аппаратурное оформление процесса; удельные скорости пропускания обрзбгты- : вае'шх растворов к элюентов на 1-2 порядка выше,.чем в колоннах с обычными иониташ.

кик&тико-цшамическяй анализ, позволяющий обосновать такие высокие скорости, не проводился. Не проводилось и систематическое изучение геометрик внутренней структуры ПГС-материалов и их ионообменных свойств. Данные о еорб-цконных свойствах ПГС-материалов по отношению к биологическим молекулам и надмолекулярным структурам биологического происхождения вовсе отсутствуют. Эти дальне необходимы для выяснения возможности использования ПГС-сорбея-тов в решении актуальных задач физико-химической биотехнологии г экологии, а такяе для оптимизапии условий работы ПГС-жтериалов.

- 2 -Работа проводилась по открытому плану ЛГУ в соответствии с координационным планом Ж!Р по биофизике АН СССР (шифр 3.28.3) на 1986-1990 гг., программой 0.74.05 ПОТ, раздел 21(ГУ)Н7 и постановлением ШГГ и Президиума АН СССР от 3.02.87 г. & 26/13 "Ксследосанис биологических систем, разработка методов анализа их структуры и способов фракционирования я решение ьа этой основе биотехнологических зздач". ,

Дели и задачи работы-. Целью настоящей работы явилось фундаментальное исследование термодинамических и кинетических аспектов взаимодейст'зт биологически активных веществ с ПГС-матеркалаш и разработка на его базе конкретных методик работы с изделиями из ПГС-магериаяов для решения ряда практических задач. В задачи исследования входило: ■

- исследовать геометрическую и химическую структуру ПГС-иатериалов;

- ксслсдопать сорбгиошше свойства ПГС-магеряалов по отношении к высокомолекулярным веществам - сорбгивам, предсгавлквдиы интерес для задач биотехнологии и экологии ' (определение ссрбдионшх емкостей, природа сорбцвонкых сил и условий обратимой сорбции);

- исслздовать кинетику сороционных процессов на ПГС-матеряалях; - .

на основе результатов целевого Фундаментального ис; следования разработать мето.даси выделения и удаления вирусов кз больших объемов огочшх и природных вод; очистки и концентрирования вируса гриппа на различных этапах производства гриппозной вакцины; разделения белкоь плазш кроа

Научная ноаязна изложенных в работе результатов исследований заключается в следующем:

1. Вперзне проведено систематическое исследование внутренней структуры нового класса сорбционшх материал« ПГС-лолиыерсв.

2. впервые детально исследованы ионообменные свойст] основных типов ПГС-сорбентсв. Определен вед ионообменных групп, их обменная ешсосгь и рК.

3. Впервые исследованы сорбшошше свойства ПГС-

материалов по отношению к биологически активным веществам: аминокислотам, б ежам и вирусам. Изучена зависимость этих свойств ог физико-химических пара.»/,;' гоо* среды; определены _ основнне термодинамические характеристики сороцконнш: процессов. На основе полученных данньх сделана выводы о предполагаемом механизме взаимодействия еорбаг-сорбект.

4. Впервые исследована кииемка сорбционянх.процессов на ПГС-матеркалах. Для качдогэ из сорбтавов определена кятирувдая (наиболее медленная) стадия процесса. Сна,меня-1' ' лась в зависимости от размера сорбтива.

Практическая .значимость работн. На основе результатов целевого фундаментального исследования достигнута следующие практические результаты:

- разработаны методики удаления л вадедеяия патоген- -нах вирусов из больших объемов сточных и природных вод. , Методика были испчтачн на реальных объектах и одобрены Институтом полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН; " ,,

- разработаны методики очксгки и концентрирования вз-•кцянных штаммов вируса гриппа нэ различных этапах получе-

'' ния вакцины. Зти методики прошли успешные испытания в про, мышлениях условиях (Омутнинский химический завод);

г разработана методика быстрого разделения основных " белков плазмы крови.

Публикации и апробация работы. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, получено также 3 авторских • свидетельства на изобретения и I положительное решение о его выдаче. Результаты выполненных исследований докладывались на I Всесоюзном симпозиуме "Препаративная хроматография физиологически активных веществ на пол!«мерш:х сорбен- ' тах" (Ленинград, 1988), на территориальном совещании "Эко- , логические проблемы полиграфической промышленности и метода их решения" (Ленинград, 1989), на Всесоюзном семинаре t) "Электрохимия ионигов" (Краснодар, 1990), на зональной ко-нференсьл "Молекулярная сорбция биологически аотавных веществ" (Пенза, IS30). • ' ' , На явд'иту si '.носятся следующие основные пологгенгл: I. РзШ'.'.юдеЗствке биологически активных веществ с •

ПГС-сорбеитама является полифушвдональным и проявляется в сочетании элекгрогадентного кул о -юеского с кеспецкфическим взаимодействуем, которое является определяющим и проявля- " ется в увеличении энтропии гчсгзда. Вклад энтропийного слагаемого в о1щую энергию взаимодействия повышается « ' увеличением структурной сложности органического иона.

?.. Характер.кинетики сорбции биологически активных 'веществ на ЕГС-сорбактах существенно зависит от природы .соромва. Б зависимости от размеров сорбтиза процесс может лимигировагься внутренней диффузией в жкроглобулы, внешней дальней на поверхности глобул и собственно актом взаимодействуя сорбита о сорбентом.

3. Метол высокоскоростного беэреагентного удаления влруоов из большие объемов вода и их.концентрирования до • урозкя чувствительности методов анализа; методики очистки и концентрирования производственных суспензий вируса гриппа на различных этапах получения вакцины ; методика одноактною разделения основных балков плазмы крови.

Структура к с1ъем работы. Диссертация состоит из введения, ¡нести глав (обзора литературы и пяти глав собственных исследований), заключения, выводов, описка цитируемой литературы из 232 наименований, 2 приложений. Работа выполнена на 185 страницах-машинописного текста, вклв-чает 35 рисукков и 9 таблиц. v •

СЭДШСШЕ РАБО'Д!

I. Обзор латеоатущ.

13 обзора литературы опредэлены задачи выделения, очистки а концентрирования биологически активных веществ. Охарактеризованы основные сорбенты, применяемые для их решения. На многих сорбекках адсорбция БАБ происходит в значительной мере за счет сил неэлектростатической природы: водородных, дисперсионных и ван-дер-ваальсовнх. На некоторых материалах наблюдается слишком сильная неспецифическая адсорбция биоЕолнмеров, мешаздая использовать их для хроматографии БАВ. 3 зависимости от характера распределения сорб-

/

цаонкых центров в материале сорбента, меняется характер кинетики сорбционного процесса. Рассмотрены возможные цуги интенсификации сорбшюншм яроки ¿■ографнческих процессов ■ о участием синтетических полимерию: сорбентов. Приведенн различные методы описания процессов формирования и структурной организации сетчатых полимеров: термодинямикс., химическая и термокинетика, фрактальная геометрия. Особое внимание уделено процессам гетерофззнэй полимеризации с .»• o6pEзoв2Iffie!л макропористых полимеров. Описан евосое полу- : ченяя и известные из литературных данная свойства нового класса сорбвдонннх материалов - ПГС-подилеров-,

2. Матариалы я методы. ' •

Объектами исоледож ниЗ; являлись 5 основных классов Ш'С-материалоэ на основе поллковденоеционных смол: феяоло-формальдегидиоЗ, резординофоршлздигздной, мочевинойорма- ' , льдегидной и /»ю даминоформальдегидноД. Б качестве модельных -• сорбтивов - биологически активных веществ - использовали .аминокислоты, белки и вирусы. Концентрацию аминокислот в растворах определяли фотометрическим методом с использованием иингидрина, концентрацию белка - по оптической плот- . ности на 280 ал в методом Лоури. Состав растворов аналиги-ровали с помощью SDS -электрофореза в лолкакриламаднои ге- . ле. В случае вирусных суспензий использовали реакцию.тема-'.., гглютикапии на 1% куриных эритроцитах, иммуяоформентный анализ, титрование на культуре клеток обезьян, метод Лоури в модификации Петерсона, а такяе спектрогурбидиметрический ; метод, .

3. Исследование геометрической и химической структуры HTC-иатвряалов

Электронномикроскопические исследования структуры ПГС-полииеров показал!, что они иыеэт высокоразвитую сорй- " цшнную поверхность, образованную компактно оиепяенюши микроглобулами микронных размеров. ГдоОулк улоиены неравномерно, и размер разряжений меяду ними в 2-4 раза превышает . píy»;,.epn .»пкрогдойуд. '

."/.oro;:;";.? птутпоа лосо.метрр.л низкого давления показано,

что разброс по размерам "макропор" для каждого образка не превышает 10$. Внутренняя структура микр'оглойул представляет собой плотно сиагнй гель полиэлектролита, благодаря чему суммарная удельная оор^ даоннея поверхность ПГС-мате-рлалаа весьма ьелики (33-700 м2/г). Из данных о распреде-лэншз пор по размерам олределела фрактальная размерность внутренней поверхности. По-видимому, наиболее адекватном моделью для опкдаякя ПТС-полимеров в диапазоне линейных размеров от 10 А до 20 шш является массовый фрактал с размерностью граншда 2,8-2,9.

Методом прямого логенцио,метрического титрования исследованы ионообменные свойства основных тя^ов ЕГС-поли-меров. Они представлены в табл.1.

Таблица I .

: Ионооб.мешше свойства полимерных фильтрующих элементов на. осноео формальдегидньос поликонденсадионных смол

ТИЕ полимера ■ Мономер Обменная емкость (лг-экв/г) рК групп Характеристика

по анионам по катионам по анионам по катионам %

11ФЭЛ-5 1ШЭЛ-8 Фенол Резорцин 0,066 0,030 0 2/400 - 6,50 Неяоно-обмекник Сласкй полифукк-циональ-ькй катиояит

пш-ю Мочевина 0,078 0,011 - - Неионо- •. обыеннкк

1КЭЛ-П Пирокатехин 0,255 1,410 6,90 7,20 Слабый полифунк ш:ональ-ныС катионит

ШЭЛ-15 Меламак 0,430. 0,040 6,75 Слабый лолис5унк шюкаль-шй аклокит

4. Исоледоьалие _оорбцаоишх сдоГ-отт; ПГСг»атеу>1Г>дсв по отношении :; (Зиолсгичес-чд ектавш:..-; зедестгели •

Сорбпиолпые сзойогза ПГС-подиг....роп по отвошекпэ к зяяяокйслогэк изучалась ш примере тмшт, /еЗцня?'» гюпа-рагина, псларагшгао* кислоты и лизини. Зауг.с'^остъ сорбит аминокислот но. ШШ-15 от рН 1>8виоюссг.ого раствора, прбдоузвядпа па рис.1. Б данном случае' рЕ ¿хчетвора ялпяев , ,'на даадопиацию как сорбиаа, так и сорбента. Неблвдалась • достаточно хорошая керрелзшя меясц/ зючошлш и рК'

а;.шкжислот. Сорбьдсо&цш способность ПС;Ш1-15 по отнопонян» I: ачия&кяогдоам уменьшается в ряду: аспармьяовач кислот?., аспарагпн, лейцкн, глицин,- лизин. Такая тепдетшя нож-г быть связана' с характером и- величиной поллр::зйЦки '¿-группы

- Б -

Яа зависимость дияамичес кой сорбционной емкость ПФЭЛ по аминокислотам от концентрации ffe.CC, в растворе (рис.2) также существенно влияет характер £-грушш. Эффект возрастания сорбцьокной способности аминокислот при увеличении концентрации ЛСС более 0,Ь-1 М, в принципе, согласуется о общепринятыми представлениями о физической адсорбции ср-ганичео'лх веш.есгв полимерии.™ сорбентами, когда "движущей оалоЁ" процесса является энтропийный выигрыш.

Термодинамика сорбции'аминокислот изучалась стандартными методами равновесной термодинамики в рамках теории адсорбции Ленгмюра. Результаты представлены в табл.2.

Таблица 2

Термодинамические параметры процесса сорбции аминокислот на П£ЭЛ~1Ь

Аминокислота Т(К) к'= сю/ кто"3 Й/К' от1) Аоо (Ы/мл), хГО"4 (ДжДШ А" (кПд/Ю СчДж/^)

Глицин 277 295 зое 21,9 2,3 0,8 46 440 1330 13,9 Г; 4 0,6 330 82 -16 •

Лейэдн 277 295 306 2,0 3,0 7,8 490 330 130 5,7 2 Т «'»А м -58 -30 -13'

А опарами 277 295 306 15,3 3,5 0,4 65 290 2630 21,3 3,8 1,0 340 86 -17

Аслара-гиковад кислота 277 295 306 0,2 3,4 11,6 о 630 2980 86 1,4 1,9 2,9 -262 -94 -16

Лизин 277 295 306 4,0 0,4 0,2 250 2300 5800 1,9 0,4 | од 324 77 -20

Сорбционнне свойства ПФЭЛ по отнесению к белкам после. довалмсь на сывороточном зльбушше человека (САЧ) иТ-глобулине - основных белках пяазмк ;рош, а также ни оза-льбушне д кональбумне - основных цтл::.;ьсиах белках исход-' ' ¡той аллонтоии.чой падкости, содержащей шрус гриппа - сырья. • " в производстве змрусяых препаратов. "скол вубор сорбтавов позволил увидеть особенности оорбааи на материале ПФЭЛ ' белков, резко отличающихся по своим электрохимическим свойствам и молекулярным массам. Зависимость емкости ЕоЛ-15 ,. по белкам от pH раствора представлена на рис.0. Максвальная сорбция белков происходит вблизи их изоточзк.

Термодинамиче е-кие характеристика сорбции белков на ПФЭЛ оценивались путем формального при- . менения стандартных ' методов равновесной • термодинамики, так ' как описание процес-. са в рамках теории ■ адсорбции Лентаюра не является правоие-ргаш. Результаты представлены в таблице 3.

Оба изученных белка сорбируются на ПФЭЛ с увеличением энтропии система. В данном случае, по-лядвмому, следует говорить о решающем вкладе гидрофобных сил во взаимодействие белок-сорбент, < -

Сорбционнне свойства ЛГС-материалсв по вирусам изучались па „даделышх суспензиях разных итаммов шруса гриппа. .

Области р;1, соответствующие максимальной сорбции и наилучше'; десорбции на ПФЭЛ-IG ('от 7 во ß) практически ссв-к«ли с ооластьп лаксгаалыю''. устойчивости вирусных суспензий.

Рис.3. Зависимость динамической емкости ПФЭЛ-15 по белку от ph' среды: л 1 - овальбушн: 2 - САЧ; 3 - иммуноглобулин; 4 - кональбумин.

Таблица 3

Термодинамические характеристики процесса сорбцпк белков на ПКЛ-15

Белок Т(К) к- хЮ"8 Йлг (м~г), х!06 ^ОО (М/мд), хПГ7 (кДк/М) зоН'к ■ (цЦа/Н)

САЧ 277 ' 298 5,8 5,6 14,6 17, Э 1,4 160 7 -42

.....,... 277 295 303 32,7 11,0 5,1 ч т О,А 9,1 32,4 Е,7 250 35 -40

Кзотзрци* сорбции вируса гриппа на ПФаЯ состояли из двух-грех участков, каждый из которых чмея В>,Д кривых с насыщением. Наличие изгибов у изо: >рм наиболее вероятно . объясняется интенсивной агрегацией вирионов в. поверхностном слое и, возможно, наличием многослойной адсорбции. Процесс был описан в рамках теория адсорб1даи Ленгмюра. Результаты представлены в тьбл.4.

' Таблица 4

Термодинамические параметры процесса сорбции вируса' гриппа штамма Х-79 0Ш2) на ПФЭЛ-15 (однослойная адсорб- . ция)

ТОО К' = =Св=1/2 х10~1С =1/К' аг1). х1011~ А.» {и/т), ПО"10 (ДжМ.К) ¿Л (кДяс/Ю ьЬ при ЗСО I 1кДкД!)

277,0 1,15 0,87

293,0 ' 0,83 1,13 1,25 270 22 -58

307,5 0,43 2,40

5. Ксс;<едоьалле кинетики сорбиа'онных лродессоп на ГГС-матерчалах.

Е задачу исследования входило определение лиштг.ру:о-■¡ей (наиболее медленной) стадии сороцг.и и вычисление из ш'еткческих кривых'среднего времени сорбции.

Б случае г.пруса гриппа. эксперименты проводили в усло-зиях линейной изотермы сорбции. Результаты опытов с лоори-зангем контакта £гз раствора и сорбента свидетельствовали )(.' отсутствич лксЗо краске малом вкладе времени диффуаии в юры в общее врог. т процесса. Антибатше узыензиие ^ и поездной концентргздги суспензий С0 (рис.4) характерно для :леночной или сорбциогаоЁ кинетики, Тешерагуршй коэффм-Д!знт сорбции (рис.5) составил в нашем случае 7% на градус. Такая больтая его взличина, характерна для процесса с зуцественным вкладом собствен^ адсорбционной отадаи. Зрэднее время сорбции вирусов на ПГС-матералах (1,2-4,6 ■мнут) оказалось в 10-20 раз меныье, чем й случае макротори отых кремнеаемоа в тех ке условиях.

15 t,и

Fi!c.4. Генетические кш'.вые сорбции вируса гриппа"на ПФЗЛ при различных исходных концен-т^гциях вирусного белка (мкг/мл): I - 02; 2 - IIS: 3 - 210.

Рис.5. КЕпетическкз приеме сорбшш вируса гриппа tta ПФЭ1 при двух те:.шеос?урах: I - 4иС;

С0=П5 .':кг/;.!л.

Хм

иИлетЕчесхяо эксперименты по сорбцяк САЧ проводили : условиях прямоугольно- азстерш, Поэтому результаты опыт с различными исходныш кошеятрациймз растворов (рис.б) могут в данном ■ случае служить надежным признаком ьнешнед фузвояяой кинетика. Гедшературшй .коэффициент сорбции со гавляа порядка г;а грздуз, что свидетельствует о лимит роваяии процесса внешней дв&эузйей сорбтипа. Среднее вре сорбции СА.Ч на ПФЭЛ (0,04-0 ,40 мин) на 1-2 порядка мены временя сорбции белков на гранулярннх сорбентах; карбоксильных ионитах, кремнеземах или углеродных соро'=н?ах.

р г

0,8 У '•л 1

V 1 1

(\ч 7 1 1 1 1

1 1 ■ 1 ' 1 -1 •. 1 * 1 1

о 5 40

Рио.ь.; Генетические кривые сорб- Рис.7. Кинетические ю . пин САЧ на ПФЭЛ-15- при раз- • вые' сорбции ешйно! личных исходных концентрациях слоты на ПФЭЛ-15 в он (мкг/мд): I - 250: 2-550; •.' с прерыванием контакт! •о - пси; 4 -.4:000. • ■ фаз. Продолжение кике1

ческой кривой: I - в . ■. : опыте без прерывания;

" • ,' •' - после прерывания коят;

• ■ ' . (2 часа).'Со=Г00 мкг/1

Кинетика сорбции аминокислот на ПГС~сорбенгах иэуч! лась на примере сорбцзи эс:га.рг.г:: новой кислоты на матер'/.! Л'?сЛ-15. Опыты проводились в условиях лу.не¡'.мости изотер; сорбция. Йзмеяение конквпграшк вкеадего раствора {¡с вл' ни Ы'.д юштачееккх крпж » иг.; ерггдгро ¡эройе

'Рбции. Это характерно для процессов, лимитируемых мфШ-1 ;ей сорбтива в зерно сорбента. Температурный коэффициент >рбц.чи в данно.м случае составлял 4,3?» на гра;,ус. Это знание удовлетворяет диапазону 4-6$, характерному для внут-даффузяонной кинетики.

Результаты опыта с прерыванием контакте фаз раствора сорбента (рис.7) указывают на значительней, вклад времени :ф5узад э поры з обдее нремя процесса. Наличие четко вы-яеиных линейна!: участков па кинетических кривых в коор-шатах РЛ/ь (р«с.8) является достаточно нздежкам признана внутридиффузиояного типа кинетики: ни один на других цгов, равно как к смешанные типы, нг доет такой начальной тисимостя. ЭсЛек-1вяыЗ коэффициент ¡;!фузии составил ■ |С.Ю-15 ..2/ь> £,то

тение сравнимо с юфГдщиенгаш для гандартних гелевых знигов. Однако, №-& размер глобул ществеяко сокргада-г общее время про-гсса.

Болькая спорость агяотенвя сорбтквов случае ЩС-иоляпе-ов обусловлена высо- ■ дЗГ/1ошеттурТ Г- .

ой проницаемостью Сй=1СР »жгЛм, атерьала.и значитель-

о;1 величиной поверхности гелевых участков. Доставка сорб-явов к центрам сорбции осуществляется непрерывным, часто уроулентшм потоком рг.створа и отлег/ не тормозится.

Таким образом, сорбция на ПГС-и-эгерпяяах сорбтняов, .'..егвд'.х одновременно не'тпелькке келолярже й гарякеяше •рутгяировкя, прогсходу? в зиячгтельяоЗ ;.:?ре за счет в?аимо-•е^.отвк":, которое .>.ю»ю кеалг^-гпровгл-ь как гидрофобное.

^.Уийн.

Рис.З/ Кине'Гйчеочйе кривые* сорбции

млт.лтг* »/<9 Н*УЗТГ_ТСч

Олп «/.огут частично компенсироваться кулолозским оттшпсгвя-¿шед; бдя путем экранировки заряженных групп при росте ион-пой еилн. Участие гидрофобных ока в адсорбции БД: на ГГГС-

1*0 'Л; алах в ряде случаев вадет к их не подпой десорбции :■! потерям. Но эта особенность сорбентов позволяет прогнозировать их наиболее эсГхрсктианое использование для удаления из води л;обнх соединений, способных'.к гидро^юбним взаиио-•двПстьилм. Быстрая кинетика.' сорбции дает асзмоккость резкого ускорения этих процессов ао сравнения с традиционными гранулярными сорбентами.-Предпринятые практические раз расЗотяя являются ш'гйлщ на Луи: дрозде всего к это"; цели.

•'Исходя:из воамоянооги, определенным образом меняя -фпзкко-хлкическке параметру среда, целенаправленно влияк на процеоск'сорбции,'протекания (пзоорбпяи) и десорбции ЕАБ,-' мокко предсказать, что применение ПГС-сорбентов для выделения этих веществ из. сложных растворов также будет ' эД^едакаши. "• •'. . '•

^' Применение ШС-штериалов для решечич прштпеекг '."'задам' биотехнологии; и, ако^Мь'- . .

* :.. • ;Применение ПГС-иатериалов для удаления и выделения • ., вирусов из' с'го'чных и природных вод. , •' ' •

'' ■'• Методика'удаления вирусов состоит в Пропускании вод • ' .вирубноЗ, 'суспензии через ПФЭЛ-Г5 'с'заданными парамет--' ;раш. 'Огштныь/'путем 'было установлено, что ептямадькнй

дмшетп :"макропор" материала составляет .4-8 мкм, а толщ ' сдоя-мохет меняться от 0,4. до 1,5 см. Методика 'опробов&н

на ротавирусе.обеаьДн ¡»А-II, фате X, вирусе гепатита А, , 'вирусах ло'лвоймелита- I а И' типов различных шташов, на 'модЗяькаХ суспензиях'и реальной речной воде. Равработан-ная »¿¡годика обеспечивает- полное удаление иатогеянтс вир . еккх' загрязнений на' вксоких- скоростях обработки води (до ■ 1500..уд.об;/чао, что в 4 раза дистрее по сравнения с'д?рн даазкотоша гракуяяриш ••сорбентами), при наличия внсоясД .'оаксога сорбента по вирусам..'

Способность 1ГГС'.-ч.;тс-р:и'Лов сготре и <"-' большой пф1ъи ТГ.«Й>ОТ М> • СОрбВрОВМ-Ь вирусы й^иилй ПСМПЧ. й-АДГЧу

- 1Г, -

извлечения неопределимо малнх: количеств вирусов из больших объемов води и их колгентрпровен:1я до уровня чувствительно огп методов анализа. В качестве эляирудцего используют бурер, содержащий сильные конкурентные добавки, например, мясной экстракт (Вес( ) в концентрации 3$.

Разработанная методика выделения вирусов из воды такие была проверена па широком классе зирупоь (ротавирус збеэьяя, фаг X, вирус гепатита, рг-зличше штаммы вируса голиомиелита). Оьа бнла успешно опробована гри анализе со-'ер-кгнил патогоньнх вирусоз з ряде водоемов на территории 3оссии и Монголии. Эта методика обеспечивает в 4 раза боль-хук? производительность процесса чыдедения, чем в случае фименения для этих же целе" макропористых кремнеземов.

Высокий фактор концентрирования (дс 700 раз), просто-'к способа (отсутствие дополнительных этапов концентриро-¡анкя) гаргзтнрует широкое применение.методики в лабора-■орьой практике санитарно-эпидемиологических станций.

^ Припенеяде ПГС-штериал'ов для'очпсткл и коякентриро-ання вирусов гриппа на различных этапах производства тзидпозкоД вак^ны., . «

Б данном разделе изложен!* .методические, разработки, на-раэленнне на реионяс более сяокных задач, Состав растзо-оа и, вирусных суспензий на разных стадиях: реального техно-, огического процесса строго регламентирован; т.е. возмож-ости влияния на адсорбшю-десорЛдиэ вирусов существенно гранкченк. -

• Реализуемая' при производстве "хроадтох'рафическоЛ" ршюзяой вакцикн очистка суспензий-гель-хронатографячески зляется 'достаточно длительной' операцией п зачастую ведет значительному разбавлешо суспензии.'Б-сзязи о атю воз- . ¡кают два задачи: концентрирование очищенных суспензий, з стае чающих ТУ на вакцинный пропграг по концентрация ви-Аг, и очистка зг.руешх сусле гаи ."с на промежуточных этапах ?опзводства гриппозной вактшкк с конечной целью полного гказа от стадии гел^-Хг.льтращ:::.

В соответствии о разработанной методикой, исходную суспензии разводя -г водой до содержания 0,03-0,05 М и : добавляет в нее гллден до концентрации 0,1 М. Полученнуэ суспензию пропусгаэт через ПФЭЛ-15 с размером пор 4-6 ихм со скоростью 20-40 мл/мнн.сг^ до насыщения сорбента по вирусу. Десорбцию проводят буфером 0,05 М тркс-НС!, 0,5 М ЙаС1, рН 7,2-7,4. Б итоге удаемся, яспольауя сорбент объемом 25 мл, за 25 минут сконцентрировать в 20 раз .7 л низкогитракного полуфабриката вируса. На таком зь.е сорбенте и за то ке время происходят очистка 1,2 л "ошва", полученного адсорбционной хродгатограысей на МПК, от 90% примесел с одновременный повышением концентрации вирусного препарата. Полученные суспензии могут неоднократно разбавляться до титра ге маггдотинярукхцеЙ активности 2000 МБ, со-отвегатьукщего ТУ на вакцинный препарат. Необратимые потери вируса в ходе всей операции не превышают 20-40$. Константа взаимодействия вируса с сорбентом на несколько порядков выше соответствующей константы у белков. Поэтому сорбция вируса происходит дане при исключительно малой еп хониоятредия к в окружении большого количества примесей. ] этом заключается физическая сущность процессов выделения ! очкстчс!' вирусов за счет сорбции-десорбции *ка ЦФЗЛ..

Особо Актуальной л одновременно самой сложной являет ся задача очистки и концентрирования исходной вирусеодер-глщей. аллантоисной жидкости <БАЖ). ВА1 представляет собоЯ многокомпонентную систему, в ко?оро'' помимо вируса гриппе содержатся в.. большом количестве при/лесные белки, липида я различные соле, в частности, ураты. Зти примеси препятствуют адсорбции вирусов на ПФЭЛ-1Б.

Б соответствии с разработанной методикой, в БАЖ доб? влявт ПЭГ-6000 до концентрации 4%. Суспенаяв.прокачивают через ПФ31-10 до на&щеняя сорбента ло вирусу. Десорбцию вируса гриппа осуществляют буфером 0,05 Й трдс-ИС1, О,С I

, рЯ 7,2-7,3. 'В результате удается сконцентрировать вирус гриппа в 15 раз; эяяаг содсг-тт пе ('елее 5-Г0& при месей беяяовоЗ природы.

Тагам образом, памп разработаны конкретные методики чистки и концентрирования производственных суспензий ' ируса гриппа на самых разных этапах полученмг вакцины: -аляая с исходной Б/Ж и заканчивая очицешаш полуф^брика-с;? вакцины. Эй; методики позволяют резко интенсифициро-ать процесс (ке менее, чем з 20 раз по сравнению с лриме-яемыми для этих целе? МИК).

Применение ПГС-яатеоуслов для разделения белков лазмы крови.

Разделение б-'лкоэ является еще более сложной з?дачей о сравнению о'рассмотрениями ранее. Константы взаимодействия различных белков о ПГС-сорбентами близки по велячи-е, и требуется достаточно тонкое регулирование физико-имкчеекпх параметров 'среда для обеспечения сорбции одних ошонектоз и несорбции других.

Методика одноактного экспресс-разделения белков сос-опт в том, что в исходной смеси доводят рП до значения, оответстаущего- обласги несорбируемости выделяемого беда, и подученный раствор пропускают через ПФЭЛ-15 с лро-кпаемостью материала 25-50 уд.об./час". '

Разработанная методика обеспечиваь-г резкое увеличение рояэводителькости технологического процесса выделения вжов (скорость обработки растворов в данном случае в 60 м больсе по сравнении с применяющейся для- этих же селей цсорбциояно'л хроматогрсфяей на ГЛ1К>.

1. Изучены термодинамические и кинетические аопекты заимодеЯствия биологически активных веществ о материалами рсотранственно-глобулярной структур«*- полимерной матри-зй, представляющей собой бйдисперсное образование из пло-но сштнх гелешх участков, чередует,пхея о разрешениями пкронных размеров. На этой основе разработаны конкретные егодики применение ПГС-натериалов для решения практичес-их задач физико-химической биотехнологии и экологии.

2. особенности пористой структуры ПТС-полимеров:

наличие"транспортных иакропор", малый размер мккроглобул единиц сорбционной активности, малый разброс шкроглобул лор по размерам, хорошая доступность сороцкояной поверх» стм для высонодаленуляршх еорй&тов ~ все это обеспечива! .быструю доставку БАВ к поверхности микроглобул и зиоокие значения сорбциокшх емкостей.

3. Среднее время сорбции БЛБ на ИГС-материалах в де сяткй раз меньше,-чем на традиционных гранулярных сорбен тах. С уменьшением размера сорбтива^сорбпиозшый процесс может лимитироваться собственно актом взаимодействия с поверхностью, внешней либо внутренней дируэяеЯ.

4. Взаимодействие БАБ с Щ'С-сорбенггщ; .»шляется по-лифункпиояальшш, Соотношение адсорбционных сил различие природа зависит от структуры и состава сорбтива, но во всех случаях определякшми являются ван-дер-ваальсовы взаимодействия, которые часто квалк^ициру.отся как гидро-фобяяе,

5. Разнообразие Свойств ПГС-материалов, их технологичность, высокая производительность сорбиионнкх'процессов с их участием, возможность .целенаправленно вл'тять т процессы сорбции, протекания I не сорбции) 'и'десорбции. Е&! за счет изменения условий, позволяет эффективно использ вать их ъ процессах фшко-хЕжческой биотехнологии для быстрого'выделения; очистки й концентрирования биологяч си: активных веществ из водных сред сложного состава. Э резко интенсифицирует процесс» способствует сохранению биологической полноценности выделяемых'"веществ.'

6. Участие гидрофобных сил в адсорбщк Б/ЛЗ на ПГС-ыатерпалах позволяет прогнозировать их эффективное испс зованде в качестве неких неспецифических, своеобразных

. унпзерсельных сорбентоз для кондиционирования и despeai гнего обеззараживания больших объемов природной и сточ! вода (удалей?;я из «ее органических соединений, вирусов, фагев, г5пктериЯ я т.д.).

Основное содержание диссертации изложено в следущих'

работах:

1. Строение и адсорбппояные свойства полиизргс'х фильтров пространственчо-глобуляргюй. структура / в.М.Коликов, Н.Я.Л'дбмЕН, Г.К.Имангазиева, Н.в.Катушкина, Л .Б.Орешков и др.//Препарагианая хроматография физиологически акги-вннх веществ на полимерных сорбентах. Тез.докл. 1-го Всесоюзн.си.чл., Ленинград, ГЭЕ8.-Л.: Наука, IS80.-C.39.

2. Результаты и перспектива использования полимерных фильтрующих элементов для хроматограсйик в биотехнологии/

Л.Б.Орешков, К.Б.Катушкина, П.С.Гркгорьв и др.//Препа-ративная хроматография физиологически активных веществ на полимерных сорбентах. Тез. дог л. 1-го ^сесо-озн.оимл., Ленинград, 1033.-Д.: Наука, 1988.-СЛС.

-3. A.c. I60839I СССР, MKSÏ А6ГК32/12, Cnoeoii получепш вакцинного препарата из пизкотитр&глжх суспензии вируса гриппа/ В.М.Коликов, А.Б.Орешков. Н.З.Катуишвна, В.К. Морозов, С.С.Жутсов, Н.Я.Люб'/ан, Г.К.Имаягазиева; ЛПИ км.1Л.И .Калинина, Омутнинский хим.г,ввод, Ин-т "Казмеха-• нобр" (СССР). -.J8 4618806/30-13; Заявлено 09.12.88; -Но подлежит опубликованию в открытой печати, зарегистр. 22.07.9С.

4. A.c. I607I39 СССР, Ш AGIK39/Ï2» CI2N7/02. Способ концентрирования и очистки суспензии вируса гриппа/ А.Б. .Орешков, Н.В.Катушкина, В.М.Коликов, D.H.Морозов, С.С. Еукбв, Й.Я.Лябяан, Г.К.Ииангаэиева; ХШ' им.Й.К.Калинина, Омутнанский хим.завод, '/н-т "Казмехаяобр" (СССР). -

Я 4640181/30-13; Заявлено 21,12.89;' - Не подлежит опубликования в открытой печати, зарегистр. 15.07.90.

5. Кинетические характеристшси: адсорбция вируса гриппа на полимерных йильтрущих элементах/ А.Б «Орешков, И,В.Ка-

-, туикина, Г.К.Имаягазиева и др./Дурн. <1кз.химии. -1880. - Ï.64. - Ö I. - С.271-273, .

6. Термодинамические характеристики адсорбция вируса гриппа на полимерных фильтрующих элементах/ А.Б.Орешкоз, Н.В.Катуш!яа, В.М.Коликов а др.//2уОя,<Зиз.химки. -I9S0. - Т.64. - » 3. - 0.729-732.

7. Результаты и перспектива использования полимеров пространстве нно-глобулярной структуры в биотехнологии/ Б.1»1.К0ликов, А.,Б.орешков, Н.В,Кагушкяна и ^.//Биотехнология., - 1990. - » 6. - 0,47-43. .

3. Бопмояности использования полпмешах (¿г.льтруяцих элементов из мелшлЕН-формальдегиднои смолы для очистки и концентрирования вирусе и»шпа/ А.Б.Орешков, H.B.ICary-шкина, £.'1."оликов и др .//Биотехнология. - 1991. -

I. - С.57-60.

Ç. Очистка и концентрирование суспеязШ вируса гриппа с понощьо распределительной хроматограф!:!: на полимерных Тпльтруэдих элементах/ Д.Г.ОреыКоз, Н.Г.Катункина,

.i.I. Колике в и др .//Биотехнология. - 7591. - й 3. -С.ЗЭ-42.

10. A.c. I63376I СССР, UKil ООШ/üü. Способ удаления вар/сов из зеды/ J-; .¡Л, Ко Диков, Л.Б.Орешкоэ, Б .3. Катушка- • ка, Л.С.Григорьев, Л.Е.Ь'аева, Н.Я.Любиэк, Г.К.Кшнга-öKsbü; ЛЕЙ им. Калинина, йн-т полпомяели-га и злру-скых веде&алитов АМН ССОР, Ън-ч "Хазйеханобр'ЧСССР). -ü 4624368/30-13. Заявлено 21.II.08; - Не лодланяг опубликованию в открытой печати, зарггястр. 08.17.SO.