Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Соматический эмбриогенез и полиэмбриогенез хвойных IN VITRO на примере ели обыкновенной (PICEA ABIES L. KARST)

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Соматический эмбриогенез и полиэмбриогенез хвойных IN VITRO на примере ели обыкновенной (PICEA ABIES L. KARST)"

российская академия наук

БОТАНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ имени В. Л. КОМАРОВА

СОМАТИЧЕСКИЙ ЭМБРИОГЕНЕЗ И ПОЛИЭМБРИОГЕНЕЗ ХВОЙНЫХ IN VITRO НА ПРИМЕРЕ ЕЛИ ОБЫКНОВЕННОЙ (PICEA ABIES L. KARST)

03.00.12 —физиология растений

На правах рукописи

БОЖКОВ Петр Валерьевич

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

санкт-петербург 1994

Работа выполнена в Санкт-Петербургском научно-исследовательском институте лесного хозяйства.

Ведущая организация — Санкт-Петербургский химико-фармацевтический институт.

Защита состоится « » 1994 г, в ^^ часов на

V заседании специализированного совета К 002.46.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук при Ботаническом институте имени В. Л. Комарова РАН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Проф. Попова, 2, БИН, зал Ученого Совета.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ботанического института имени В. Л. Комарова РАН.

Научный руководитель — кандидат биологических наук ЛЕБЕДЕНКО Л. А.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук МЕДВЕДЕВ С. С.; кандидат биологических наук КОЗЫРЕВА О. Г.

Автореферат разослан

1994 г.

Ученый секретарь специализированного со кандидат биологических

О. С. ЮДИНА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одним из наиболее вшчатляицих успехов в области культивирования тканей и органов высших растений in vitro, имеющим важное общзбиологическое значение и определившим основные тенденции современной биотехнологии растений, явилась возможность регуляции всех стадия эмбрионального развития растительного организма в культуре in vitro, когда эмбриональной инициалы) выступает не зигота, как при половом эмбриогенезе in situ, а отдельная клетка или группа клеток культуры.

О повышенном интересе к проблеме изучения соматического эмбриогенеза (СЭ) хвойных может свидетельствовать тот Факт, что за короткий промежуток времени, - начиная с 1985 года, когда впервые были получены соматические проростки Picea аЫ»з /Пакman, vor» Arnold, 1S8S/ и Lour ix decidua /Nagmani , Bonga, i085/, - ПО ДЭННОЙ ПрО-

блэме опубликовано уже более 200 оригинальных работ и 20 обзоров.

Актуальность проблемы СЭ хвойных объясняется двумя основными причинами. Во-пврвых, очевидную ценность представляет любая информация об особенностях регуляции цигодемеренцщювки и морфогенеза у хвойных, занимающих особое Филогенетическое положение - между споровыми и цветковыми растениями. Уникальность СЭ хвойных проявляется в том, что доминирующим путем новообразования соматических эмбрионовг независимо от таксономического положения растения, выступает расщепление прозмбрио, как при дсливажной полизмбрионии у

ВИДОВ Pirna» in situ -"Singh, 1878/. ПОЭТОМУ, СОМЭТИЧеСКШ ЗМбрИОНЫ

хвойных, в отличиэ от покрытосеменных растений, развивается не из каллуса, а в, так называемой, "эмбрионально-суспензорной массе" (ЭСМ), состоящей в норме только из расщепляющихся соматических прозмбрио /ourzan,less/. Для акцзнтирования полиэмбрионального характера развития соматических вибрионов хвойных, в литературе все чаще используется, вместо традиционного термина "соматический эмбриогенез", более адекватный по смыслу термин "соматический полиэмбриогенез" (СТО) /Durzan.iase/.

Вторая причина актуальности проблемы связана с возможностью разработки на основе СЭ и СПЭ высокоэффективных методов размножения хвойных, имеющих важное хозяйственное и ценозообразуицее значение, и несущих основную нагрузку в газовом балансе ноосферы. Значительный прогресс, достигнутый за последние несколько лет в

ОбЛаСТИ рвГеНвраЦИИ ХВОЙНЫХ ИЗ СОМаТИЧеСКИХ ЭМбрИОНОВ /Roberts.

1993/, доказывает, что этот путь является наиболее эффективным даю преодоления проблемы "сильной детерминированности" хвойных, с

которой связано широкораспространенное представлвшю о трудности культивирования этих объектов.

В настоящей работе проводилось исследование особенностей Физиологической регуляции процессов СПЭ в культуре незрелых и зрелых ПОЛОВЫХ зародышей ели обыкновенной (Picea ab¿es L.Karst). При этом особое внимание было уделено сравнительному анализу полученных данных с литературными сведениями по СЭ и GIB у других представителей ХВОЙНЫХ, ОТНОСЯЩИХСЯ К родам iorix, Picea, Pinus И

Ps&uda t aliga.

Шль и задачи исследования. Целью исследования было изучение особенностей Физиологической регуляции на отдельных этапах СПЭ ели обыкновенной. В основные задачи исследования входило: 1) на этапах индукции СПЭ и стабилизации зкбриогокных клеточных линий (линий ЭСМ) в культуре зрелых зародышей - изучить роль восстановленного к окисленного азота, и оценить вклад генотипической принадлежности семян и состава питательной среда в общую вариацию показателей СПЭ; 2) на этада созревания соматических эмбрионов - исследовать совместный эфч«кт абсцизовой кислоты (АБК) и 6-бензиламинопурина (БАП); 3) на этапе прорастания соматических эмбрионов - выяснить Физиологическую роль частичного обезвоживания соматических эмбрионов; 4) на этада адаптации соматических проростков in vivo - определить ключевые Факторы, влияющие на адаптационную способность проростков. Крот основных задач были решены и многие частные вопросы, некоторые из которых-возникали уже в процессе экспериментальной работы.

Новизна результатов. Впервые проведено детальное изучение особенностей Физиологической регуляции всех последовательных процессов СПЭ в культуре незрелых и зрельа (труднокультивируемых) зародышей северных генотипов ели обыкновенной.

Подтвержден Феномен Фазовой сюцифичности СПЭ /Весwar et ai., toss/, когда уровень эмбриогенной активности ¿n víh-o в значительной степени зависит от стадии развития полового зародыша.

Впервые получены данные о ключевой роли азотного баланса питательной среды в процессе длительного поддержания пролиФеративно) активности ЭСМ (стабилизации линий ЭСМ) в культуре зрелых зарода-шей ели обыкновенной. Высказано предположение, что определенная модификация питательных сред по азотному балансу даст возможность получить эмбриогенныэ культуры из вегетативных тканей взрослых особей хвойных.

Впервые обнаррозн уникальный "с-еновариант" ХМ, характеризую

щийся гетерогенной структурой и независимым характером протекания процессов старения и пролиферации.

Открыт явно выраженный синергичный ЭФФвкт АБК и БАП на развитие соматических эмбрионов ели обыкновенной: совместное применение Фитогормонов многократно повышает выход зрелых соматических эмбрионов и индуцирует созревание в рэгенерационно неактивных (под действием одной АБК) линиях ЭСМ. Получены экспериментальные данные, доказывающие что в основе повышенной способности частично обезвоженных соматических эмбрионов к прорастанию лежит снижение содержания АБК в эмбриональных тканях и<или снижение чувствительности клеток к АБК.

Проведенная работа явилась первым опытом успешной адаптации соматических проростков ели обыкновенной tn vivo для северных регионов.

Научно-практическое значение работы. Основное значение результатов исследований состоит в том, что они способствуют углублению знаний о Физиологической природе онтогенеза' соматических эмбрионов хвойных. Обнаружение общих закономерностей в Физиологических особенностях СПЭ in vitro и эмбриогенеза in si tu является дополнительным и независимым доказательством существования единой системы генетического контроля процессов пролиферации и дифференциации при онтогенезе соматических и половых зародышей.

Трактовка полученных данных в русл« концепции Д.Дарзена и П.Гупта об общевидовом характере проявления кливажной полиэмбрио-нии в культуре половых зародышей хвойных (концепция "соматического полиэмбриогенеза хвойных") /Durzan.1988, Durzan,Gupta. 1988/ не

только подкрепляет саму концепцию, но и способствует установлению единой терминологии в области изучения морфогенеза хвойных ¿n vitro. Наблюдаемое расщепление соматических црозмбрио ели обыкновенной, для которой несвойственна кливажная полиэмбриония in s¿tu, является экспериментальным доказательством возможной реверсии к более древним в эволюционном отношении организмам - представителям рода Pin-us - под влиянием Факторов культивирования.

Практическое значение работы состоит в разработке протокола культивирования для высокоэффективного размножения зрелых семян ели обыкновенной через СПЭ.

Публикация и апробация результатов. По материалам диссертации опубликовано 6 работ, одна работа находится в печати. Материалы были представлены на Международной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология" (Новосибирск,1988), на xxvi Сес-

сии Комиссии т. Л.А.Иванова ш анатомии, физиологии и экологии лесных растений (Пэтрозаводск, 1991), в Докладе о наиболее важных отечественных и зарубежных достижениях в области науки, техники и производства по лесному хозяйству (Москва, 1992) и на Рабочем совещании в "Центре по применений биотехнологии в сельском хозяйстве** (саба) (Сан-Франциско, 1893).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 194 страницах, включая 30 таблиц и 15 рисунков, и содеркиг введение, три главы (обзор литературы, материалы и катода, результаты и обсуждение), заключение, вывода и список литературы из 213 публикаций.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДУ ИССЛЕДОВАНИЯ

Растительный материал. Исходным материалом для наших опытов служили зрелые и незрелые семена ели обыкновенной (Picea аы&в (L. )Karst), собранные с конкретных материнских деревьев в границах Ленинградской области и любезно про доставленные В.И.Долголшшбьш.

Индукция СПЭ и подюр!Уаю1в пролиФвративной активности. Незрелые зародыши эксплантировали на модифицированную агаризованну» среду фон Арнольд и Эрикссона (lp) /von Arnol d, Er; lesson. i sei /, с пониженным до 5,6 мМ содер:ани9м и добавлением 0,3 мМ

l-глутамина, 1% или 3% сахарозы и Фитогормонов (2,4-дихлорФенокси-уксусная кислота (2,4-Д) или а-нафтилуксусная кислота (БУК) в отдельности и в комбинации с БАН или кинетшюм) в концентрациях 5,0 мкМ или 10,0 мкМ. ЭСМ поддерживали на среде 1/2lp без моносахаров, с 0,3 мМ l-глутамина, 3% сахарозы, 1,0 ккМ ауксина и 1,0 мкМ БАП.

Зрелые зародыш культивировали в трех сериях экспериментов. Все среда, независимо от состава минеральной основы, содержали комплекс витаминов среды lp, 2% сахарозы, 10,0 мкМ НУК, 5,0 мкМ БАП и 0,7% агара.

В первой серии зародыши материнского генотипа М379 культивировали на полных и разбавленных 1:1 средах, икающих минеральные ОСНОВЫ следующих стандартных сред: LP, МСМ /Вогптап.1981/, DBM-1

/Gresshoff ,Doy,1972/, SH /Schenk , Hi. 1 debrandt, 1972/ И КОДИФИЦЯрО-ванной СрЭДЫ Брауна И Лоуренса (BLG) /Amerson et al. ,1985/.

Во второй серии зародыши материнского генотипа'N384 культивировали на среде 1/2lp в 12 модификациях, различающихся по азотному балансу (табл.1). Из l-аминокислот изучали влияние аргинина, аспарагина, гдутамина и пролива.

В третьей серии зародыши материнских генотипов ыыБОО, 501,

Таблица 1

Концентрации азотсодержащих ионов (мМ) в основной питательной среде (1/2lp) и модифицированных питательных средах (xnm)

NH

Среды с различным содержанием no" 1,0 8,0 16,9

33.8

О

4.0 7.5 15,0

inm1

INM2 inm4 INM3

inm5 INM9

IKM3 INM6 1/2lp inm11

inm7

inm10

inm12

Таблица 2

составы (мМ) модифицированных сред lp <i~e), l (б) и bmg-i (7)

Ингредиенты

Питательная среда

1 2 3 4 5 в 7

0,78 14,2 21,3 26,3 42,5 9,40 23,1

0,22 4,00 6,00 7,50 12,0 10,3 3,40

5,00 - - - - - -

1,25 1,25 1,25 1,25 1,25 1,25 0,63

0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 3,75 0,75

0,60 0,60 0,60 0,60 0,60 0,07 1,50

1,22 22,2 33,3 41,3 66,5 30,0 29,9

0,22 0,22 0,22 0,22 0,22 0,52 0,13

1/2lp 1/2lp 1/2lp 1/2lp U2LP 1/2l 1/2ms

Макросоли: кмо

з

NH^N03

KCl

КН PO г *

MgSO *7Н О

= 4 2

СаС1 -2Н О 2 2

Общий азот

NH+/NO~

А 3

Микросоли и FeEDTA

Примечание: Все среда соде мина, 2% сахарозы, 10,0 "

:али витамины по 1/2lp, 3,0 мМ ь-глута-5,0 мкМ БАП и 0,756 агара.

О

502 культивировали на семи питательных средах (табл.2>. Среда 1-е являлись производными от среда 1/2lp с пониженным до 0,22 молярным соотношением мн4/моэ и общим содержанием неорганического азота, варьирующим в диапазоне 1,22-66,5 мМ. Среда 6 и 7 имели минеральные основы сред l /Litvay et ai..íaeis, с разбавлением 1:1, и

BMG-1 /Krogstrup,1986/, СООТВвТСТБвННО.

Эмбриогенные культуры инкубировали в темноте при 23±1*С. Опыты проводили в трех повторностях, по 20 зародышей в-каждой повтор-ности.

Созревание соматических эмбрионов. Использовали среду 1^2lp с 0,3 мМ L-глутамина, 2% сахарозы и 0,756 агара. АБК вводили в среду индивидуально или совместно с БАП.

Изучение влияния генотипа и возраста ЭСМ, азотного баланса

поддерживающей среда и среда для созревания на развитие соматических эмбрионов проводилось на 9 линиях ЭСМ возраста 8 и 30 месяцев. В среду для созревания добавляли 15,2 мкМ АБК и 5,0 мкМ БАП на один пассаж; затем ЭСМ субкультивировали на среде с одной АБК.

В каждом опыте брали по 4-5 секторов ХМ (вес каждого сектора около 400 мг) от конкретных линий ЭСМ. Культуры инкубировали при 23±1°С на свету (1500 лк; 16-часовой Фотошриод).

Проращивание соматических эмбрионов. Зрелые соматическш эмбрионы проращивали на агаризованных и жидких средах 1/4lp и 1/4 sh, а также на минеральных основах данных сред. Испытывали 3 варианта ориентации эмбриона на поверхности агара /вес«аг ot ai., 1689/. Применяли темновое предкультивированке (2 суток), разную экспозицию Фотопэриода (16 и 24 часа) и красный свет (600-700 нм). Освещенность под красным светофильтром - 500 лк, а без Фильтра -1500 лк. Процедуру частичного обезвоживания соматических эмбрионов проводили ПО методике /Roberts et al. ,1890/; ЭКСПОЗИЦИЯ - 3-25 суток; темдаратура - 4°С или 23±1'С.

Опыты проводили в 3-5 повторностях, по 10-15 соматических эмбрионов в каждой повторности.

Адаптация соматических проростков ®х vttrwn. проводилась по двум схемам: 1) двухэтапная адаптация: 2 месяца в лабораторной микротеплице (23+1 "с, 2000ж, 16-часовой Фотошриод), затем в производственной теплице с мблкокашльным опрыскиванием; 2) прямая адаптация в производственной теплице.

Показатели СПЭ. Основными показателями СПЭ были следующие: 1) общая эмбриогенная активность, как процентное отношение числа эксплантатов, образовавших ЭСМ в течение 5 месяцав культивирования, к общему числу зксплантированных зародышей; 2) частота образования линий ЭСМ, как процентное отношение числа линий ЭСМ через 3 и 5 месяцев культивирования к общему числу зксплантированных незрелых или зрелых зародышей, соответственно (линия ЭСМ регистрировалась в случае образования, как минимум, двух ЭСМ весом 200-250 мг каждая, увеличивающихся в размере более чем в 2 раза за 3-не-дельный пассаж); 3) частота превращения ЭСМ в линии ЭСМ, как процентное отношение числа линий ЭСМ через 5 месяцев культивирования к общему числу зародышей, образовавших ЭСМ в течение 5 месяцев культивирования.

При созревании соматических эмбрионов вычисляли значение общего выхода зрелых эмбрионов с 1 г ЭСМ. На этапе проращивания определяли частоту корнеобразования (%), среднюю длину корня (мм)

и побега (мм) 3-нвдельных проростков. Приживаемость (Ж) регенеран-тов ex vitrvm определялась через 2 месяца выращивания в лаборатории, или в конце вегетационного периода в теплице.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Изучение инициации £Щ £ УЧ9Т0М ФЭ30В0Й СШШФИЧВОСТИ змбриогенной Р9ЭШИ В культуре незрелых зародышей ели обыкновенной уже в начальном пассаже можно различить три "Феноварианта" неморФогеиных каллу сных тканей и бесцветную, полупрозрачную, структурированную ткань - ЭСМ, имеющую гипокотильное, реже - семядольное происхождение, и состоящую из соматических проэмбрио, погруженных в слизистый матрикс. На одном незрелом зародыш образуется от одного до четырех тийов тканей. Такая полиморфность - характерный признак змбриогенных культур ХВОЙНЫХ /Jain at ai..1988; Tremblay, 1990/.

Наблюдалась значительная вариабельность паттернов пролиферации и жизнеспособности образовавшихся тканей. Если в начальном пассаже скорости пролиферации неморюгенных каллусов и ЭСМ примерно одинаковы, то при последующем субкультивировании происходит постепенная некротизация каллусов, сопровождаемая ювышенмэм пролиФвративной активности ЭСМ. Это указывает на селективный характер влияния питательной среда на пролиФеративную активность разных тканей. В ряде случаев происходило новообразование ХМ из уже некротизированного каллуса. Данный процесс значительно стимулировался исключением ауксина из состава среда на 1-2 пассажа. Если предположить, что механизм такого запаздывания змбриогенной реакции основан на дифференциации неспециализированных каллусных клеток в эмбриогенно детерминированные, то есть все' основания утверждать принципиальную возможность превращения каллусных клеток, образующихся при культивировании вегетативных тканей взрослых особей хвойных, в эмбриогенные.

ЭСМ легко отделяется от других тканей уже во 2-3-м пассаже и субкультивируется отдельно, образуя при этом генетически стабильную УИо,von Arnold.1989/ И МОрфОЛОГИЧвСКИ ГОМОГвННуЮ КЛвТОЧНуЮ

линию - линию ХМ, сырой вес которой увеличивается, в среднем, в 5-6 раз за каждый пассаж. Вероятность некротизации стабилизированной линии ЭСМ крайне мала, что свидетельствует о низких уровнях аккумуляции и окисления Фенольных соединений в змбриогенных клетках, отличающихся по этому признаку от быстро стареющих клеток органоге'нной ткани ели /Ширяева и др., 1991/. Поэтому высокая

Рис.1. Зависимость частоты образования линий ЗСМ ели обыкновенной от стадии развития заро-даей и от типа ауксина.

1 - среда с 10,0 мкМ 2,4-Дк 5,0 мкМ БАП;

2 - среда с 10,0 мкМ КУК и 5,0 мкМ БАП.

жизнеспособность .линий ЭСМ кошт сохраняться в течение многих .лет (в нашем банке культур поддерживаются линии ЗОН, полученные от незрелых и зрелых зародышей в 188Э году).

Микроскопические исследования показали, что уш через 2 недели культивирования ЭСм состоит из щомосгаз вторичны* проакбраи с хорошо выраженными эмбриональными и сусшнзорными ярусами, характерными для проэмбриогенеза хвойных in situ /Тренин, isss/. Наряду с прогыбрио встречаются и одиночные клетки двух типов: удлиненные вакуолизировэнпые и более мелкие, изодаа:готричоскоя Формы. При ас-симэтричном делении удаиввнных клеток образуется инициальная эмбриональная (мелкая, с густой цитоплазмой) и инщиальная сусган-зорная (крупная, вытянутой <юрмы, вакуолизированная) клоп«:, последующее многократное деление которых приводит к Формировании црозмбрио. Дальнейшее новообразованно проэкбрио идет, как правило, цугем расщепления эмбрионального яруса у»э сторнированных про-зкбрио, - аналогична клизанной полиэкбрионии у видов Pi nus in s au /si ngh,iQ7B/. Последнее наблюдение еще раз подтверждает адокват-ность концепции "соматического полиэмбриогеноза хвойных".

Повышенная э&йркогенная. ашявкость частично дкморенцирозая-ного эксплантата, по сравнена с болзо зрелым, где отсутствует, так называемый, "градиент относительной зрелости", ккевт множество доказательств /Williams,Mah©swaran,lS36/. ХВСННЬВ НО ЯВЛЯЮТСЯ исключением; большая часть экспериментальных работ по изучения СЭ и СПЭ хвойных выполнена на незрелых зародашах или макрогамэтофигах /Dunstan, 1эзз/. Наш показано, что максимум общей эмбриогонной активности и частоты образования линий ЭСМ в культура зародышей оли обыкновенной приходится на короткий период эмбриональной дифференциации /Raghavan.1976/ - 7-8 НвДвЛЬ П0СЛ9 ОПЛОДОТВОрОНИЯ (рИС.1). По-видимому. признаки повышенной эмбриогенной активности для заро-

H/vh Л/fU гг/т l/ум/ /е/м/ 29/t/M

ОО-

дьшй ВИДОВ Picea ЯВЛЯЮТСЯ ОбЩИМИ - ДИФФврвНЩфОВаННЫ8, НО еЩЭ слабо развитые семядоли, длина 1,5-2,0 ММ /Весwar ©t al. , 1 В88/ И НИЗКИЙ уровень аккумуляции запасных белков /Roberts et al. , 1083/. У зародышей ВИДОВ Larix, Pinus И Pseudotsuga МаКСИМуМ ЭМбрИОГбННОЙ активности vitro наблюдается в середине-конце периода эмбриональной "селекции" /Raghavan,1876/: ЧврЭЗ 2-3 НвДвЛИ ГОСЛв ОПЛОдотворения у Larix /von Aderkas et al. ,1387/ И ЧврвЗ 4-5 НЭДЭЛЬ -у Pinus /Весwar et а1.»1Э88/ И Pseudotsuga /Durzan,Gupta, 1987/.

Для индукции СПЭ и образования линий ЭСМ в культуре незрелых зародышей ели единственным критическим Фактором является обязательное присутствие в среде ауксина и цитокинина с молярным соотношением И. НУК оказалась более эффективным, по сравнению с 2,4-Д, индуктором- СЮ и стимулятором образования линий ХМ, особенно, для более развитых 9-10-недельных зародышей, в культуре которых применение 2,4-Д дает "нулевой" эффэкт (рис.1). Не исключено, что 2,4-Д менее эффективно взаимодействует с рецептором, чем НУК.

Общая эмбриогенная активность зрелых зародышей, культивированных на различных стандартных средах (см. "Материалы и метода"), - как и следовало ожидать, принимая во внимание Феномен Фазовой специфичности эмбриогенной реакции, - значительно снижалась (более чем в 2 раза), по сравнению с незрелыми. Наряду с несколькими "Феноварианташ" неморФогенных каллусных тканей и ЭСМ, зрелые зародыши продуцировали также и органогенный каллус, покрытый адвентивными почками и хвоеподобными выростами. Среды sh и 1/2sh оказались наиболее благоприятными для индукции органогенеза.

Зависимость общей эмбриогенной активности зрелых зародышей от концентрации среды (1 норма и 1/2 нормы) определялась общим содержанием в последней неорганического азота. Так, разбавление сред lp и мсм, богатых азотом (>30,0 мМ), значительно повышало, а среды dbm-i, обедненной азотом (12,9 мМ), напротив, - снижало рассматриваемый показатель. Максимум общей эмбриогенной активности достигнут на средах 1/2мсм и dbm-i, содержащих примерно равные количества неорганического азота (15,9 мМ и 12,9 мМ, соответственно) и имеющих близкие значения молярного соотношения nh /nos (0,23 и 0,30, соответственно). Однако, во всех случаях, за исключением среды 1/2lp, нам так и не удалось получить активно пролиФерирующие линии ЭСМ: большая часть "индуцированных" ЭСМ некротизировала, а оставшиеся обладали замедленным ростом. Это доказывает низкую Эффективность стандартных питательных сред для поддержания пролиФе-ративной активности ХМ в культуре зрелых зародашей ели. Очевидно

также и то, что высокая эффективность питательной среда на этапе индукции еще не означает, что данная среда обладает хорошей поддерживающей способностью.

Особенности регуляции ияру^йУ СПЭ и поддержания пролиФвра-тивной активности -В культуре зрелых зародышей Роль азотного баланса питательной среда в регуляции СЗ и СПЭ хвойных и по сей день остается практически неизученной, несмотря на хорошо доказанную важность этого Фактора при культивирования покрытосеменных растений.

Отмеченное выше снижение общей эмбриогенной активности и еще более выраженное снижениэ частоты образования линий ЭСМ при пароходе от незрелых зародашей ели обыкновенной к зрелым, характерно также И ДЛЯ других ВИДОВ ХВОЙНЫХ /Весwar et al. ,1088/. МЫ ПОПЫТались разрешить проблему путем проведения детального исследования роли азотсодержащих соединений в рассматриваемых процессах. Акцент на образовании и продолжительном субкультивировании линий ХМ был сделан не случайно, поскольку эти вопросы занимают важное место в биотехнологии клонирования семян через СПЭ и в изучении старения клеток. Литературные сведения по данным вопросам весьма скудные.

Для каждого варианта концентрации аммония и нитрата (табл.1) характерна своя определенная зависимость общей эмбриогенной активности от концентрации аминного азота. Характер зависимости определялся также и типом аминокислоты. Аргинин и цролин оказались слабыми стимуляторами образования' ЭСМ. Глутамин и аспарагин, напротив, повышали в ряде случаев общую эмбриогенную активность. При этом глутамин, как правило, более эФФеь-лшан, чем аспарагин, особенно, в средах inmi и inm2. Добавление в среду, где единственным источником азота является глутамин (inmi + 3,0 мМ глутамина), всего лишь 1,0 мМ нитрата (inm2 + 3,0 мМ глутамина) приводит к более чем 2-кратноыу увеличению общей эмбриогенной активности. Таким образом, для индукции CID у ели необходимо одновременное присутствие в среде как восстановленной, так и окисленной Формы азота.

Стабилизация линий ЭСМ является более зависимым от азотного баланса питательной среды процессом, требующим обязательного присутствия в среде глутамина или аспарагина. Не являясь сильными индуцирующими агентами, они выступают эффективными промоторами расщепления проэмбрио ЭСМ. Оптимальные концентрации амидов не зависят от баланса аммония и нитрата, и составляют 3,0 мМ и 1,0 мМ, соответственно. Это указывает на независимый характер использования амидов эмбриогенными культурами Picea ab¿es. в наших экспериментах

Рис.2. Зависимость частоты образования линий ЭСМ из зрелых зародыша

Рхс&а аЫе-$ ОТ ЭЗОТНОГО

баланса питательной среда (все среда с 3,0 мМ I—глутамина).

стимуляция образования ХМ под действием аспарагина была менее выраженной, по сравнению с глутамином. По-видимому, хвойные являются скорее "глутаминовыми", чем "аспарагиновыми" растениями; ведь именно глутамин аккумулируется в больших количествах в вегетативных почках хвойных к началу периода их активного роста /Оиг2ап «и. а1. ,1973/. Механизм стамулирувдего действия амидов на расщепление прозмбрио ЭСМ пока не выяснен, но он вряд ли сводится только к высвобождению аммония при участии глутаминазы, поскольку аммоний в наших опытах не был стимулятором образования линий ХМ.

Другим важным Фактором, определяющим стабилизацию линий ХМ в культуре зрелых зародышей ели обыкновенной выступает молярное соотношение мн+/ксГ. из рис.2 видно, что оптимум этого соотношения для сред с 3,0 ММ глутамина составляет около 0,2. Примечательно, что ни одна та сред, используемых для СЭ и СПЭ хвойных,, не имеет близкого молярного соотношения ын+/мсГ. Максимальная частота образования линий ЭСМ (33%) получена на среде 1ммю (7,5 мМ ин+, 33,8 мМ моэ) + з,о мм глутамина (рис.2). *'

Совместное влияние генотипа семян и состава пигательноя сщпьк Проблема генетической детерминированности процессов развития в культуре чп «¡(го является предметом активных дискуссий. Наряду с чисто генетическим эффектом, определяющим .принципиальную возможность индукции СЭ, особый интерес таюке представляет генетически опосредованное влияние питательной среда, - как одного из эпигенетических Факторов, влияющих на экспрессию генов, контролирующих СЭ /Mat.hias.Fukи! ,1986/.

Эксперименты по культивированию зрелых зародышей трех материнских генотипов ели обыкновенной на питательных средах различного состава (табл.2) показали, что зависимости общей эмбриогенной активности и частоты образования линий ЭСМ от концентрации неорганического азота (среда 1-5) имеют различный характер и Форма этих зависимостей опосредована генотипически. Среда з полностью блоки-

ровала индукция СЮ. В средней, для семян трах генотипов, среда i к 4 оказались более ЭФФективньши, чей среда г и з. Кроме этого на среде 4, (аналогична по составу вышеописанной среде inmlo + 3,0 глутамина) достигнут каксимум частоты превращения ЭСМ в линии ЭСЕЛ, составившие, в среднем, 72%.

Если на средах 1-4, некротизация .линий ЭСМ происходила крайне редко, и ЭСМ была морфологически гомогенное, то на среде 6 наблюдалась высокая частота образования линий гетерогенной ЭСМ, где агрегаты прозмбрио чередуются с рыхлым глобулярным каллусом, подверженным некротическим процессам. Примечательно, что линии гетерогенной ЭСЫ имеют необычайно высокую, по сравнению с линиями прозрачной гомогенной ЭСМ, интенсивность пролиферации. Здесь наблюдается как бы независимо© протекание процессов старения и пролиферации. Стараясь объяснить это явление, которое явно противоречит положению о том, что между размножением растительных клеток и их отмиранием сущзствует отчетливый антагонизм, мы предположили, что на пролиферацию каллусных клеток оказызавт сильное стимулирующее действие некий "ростовой Фактор" слизистого матрикса, окружающего прозмбрио /Durzan,1989/. НЬЭМбрИОГвННЫЙ КЭЛЛУС ХВОЙНЫХ, В СВОЮ очередь, монет накапливать значительные количества Фвнольньж соединений, окисление которых, - одна из причин гибели клеток и старения тканей /Гамбург и др.,1вэо/. В рассматриваемой ситуации, крайне низкое содержание в сред© 6 кальция (0,15 мМ) должно служить дополнительным стимулом -синтеза Фвнольных соединений /Маргна, 1990/. Еще один Фактор питательной среды, определяющий тенденцию старения в линиях гетерогенной ЭСМ, - это повышенная в 200 раз, по сравнению со средой lp, концентрация меди, используемой в клетках в составе полиФенолоксвдазы /Ззпромэтов,isss/.

Поскольку в линиях гетерогеной ЭСМ наблюдалась некротизация не только каллуса, но и, хотя и в меньшей степени, соматических прозмбрио, можно предположить, что некротизация последних вызвана избытком в культуральных сосудах этилена, выделяемого каллусом

/Wann et al. ,1987; Hughes, 1981/. В ЭТОЙ связи ПреДСТЭВЛЯвТСЯ интересным оценить: каким образом отразится введение в среду в ингибиторов действия этилена (Адноз, cociz и др.) на жизнеспособности и паттерне пролиферации гетерогенных ЭСМ. В настоящей работе мы испытали действие лдкоа и coci2 только при культивировании зрелых зародышей на модифицированной среде lp и не обнаружили какого-либо стимулирующего эффекта на индукцию СПЭ и стабилизацию линиа ЭСМ.

ДвухФакгорный дисперсионный анализ показал, что питательная

среда определяет 32% (р<0,001), а генотип сэмян, - „таъ о% (р£ 0,с5) и 2% (р>0,05) от общей вариации показателей индукции сев и стабилизации линий ЗСМ, соответственно. Столь низкий вклад генотипа в общую варианта, очевидно, есть следствие того, что доноры семян росли в одном насаждений с постоянным фоном пыльцы. В этом случае существенными будут только материнский и аддитивный эффзк-ты, а оффокт опылителя окажется невыратанным. При другом под5оро родительских пар послэдииа ЭФФвкг, го-видиаому, ногат быть бодзэ сдаственным} тем болоо что у звояных злороиласгаая насдз-

дуется ОТ ОТЦОВСКОГО родите,.®! /Оопд аЬ а!. ,1332/.

Регуляция сощавйЕИй соматических згбрэтоноп

Роль ДБК п ЕАЩ. Оп-срыт явно выраженный синергичныа эффект АБК и БАП на рзззяга» еензпгегских £:-:брюнов. СоЕмэстасо дсбавлзшэ ДЕК (7,6 нй»> и ЕЛИ (1,0 мкМ) в среду на один пассза, с послэдую-дкм удалением дагохяш», значительно повстает выход зрелых сояа-тичосюпс сг.Зрнонсв в парнем цшиэ созревзнкя, по сравнению с варианте:« действия одной Ш. (тгбл.З). Аналогичная обработка во втором циаяэ созревания не дает полочигольеого зрсоета, которая достигается в это", случае путей повышения кенцэнтргшгл БАП до 5,0 ?'-:с.М или, - увеличоаяя продсшшто.гьлости сог^естного применения горио-зов до 2 пассятаа (табл.3). Причина оелгблэния сшерппного тз ДЕК и БАП мскэт состоять в пргвнкенЕИ клеток проэ"брио к гор<э-ягм з ходз первого цтгсла созрэазння. Перенос ЗСМ с 4-го пассгяа по бззгерконщи ерэду пргводег к снйшяш выхода зрела соматических эмбрионов рези к пол-гсму блокирован!?» доеревания (табл.3).

Дпя вариантов сов?лэстного действия АБК и БАП характерно

Л^Г-<>ЗЗЫ ОйрЭЗОЕЯНИЯ оОе^'Х СОМЗТТТ^ОСХИХ. г!'бр"ОПОВ»

яотерзп тс", г^одол-озтэльнеэ, чем вкъз ковцэнтрацкя БАП та! боль™?,

ОГО ДвйСТВИЯ.

Проведение посгэдукчза серия экспериментов, где три лиееи ЗСМ апп.чзлфовались в отдельности, подтвердило существование синерп-ч-нсго ?^отсго ЛЕК и БАП и продемонстрировало геЕоишячесяую детер-кп;ирсвп:шость как сбаэго уровня созревания соматических эмбрионов, так и паттерна зависимости выхода зрелых соматических эмбрионов от концентрацки БАП. В среднем, для трех проанализированных .линий ЭСМ, етгпягальнкки концентрациями БАП для 7,6 икй и 15,2 мкМ АБК были 1,0 гч<М и 5,0 мкМ, соответственно.

Следует отметить, что совместное применение АБК и БАП позволяет не только значительно повысить выход зрелых соматических эмбрионов (до 500 с 1 г ЭСМ), но и индуцировать созревание в

Таблица 3

Влияние АБК и БАП на выход зрелых соматических эмбрионов в двух последовательных циклах созревания

Регуляторы роста (мкМ) в пассажах г-1х Выход зрелых

соматических эмбрионов

О I .)(«д1+)(«-^11->)(+1У-»Н«:-у-1х->) с 1 г ЗСМ

Первый цикл созревания

<<-7,6 АБК-►> 68±1

(7,6 АБК+1,0 БАП)(<-7,6 АБК-0(1,0 НУК+1.0БАП) 264+21

Второй цикл созревания

<*--7,6 АБК—-О 176±24

(<-7,6 АБК-► >(«-О--►) 163±19

<7,6 АБК+1,0 БАП>(<-7,6 АБК-► ) 166±31

<7,8 АБК+1,0 БАП)(»—7,6 АБК—♦)(<-р-► ) 138±34

(«—7,6 АБК+1,0 БАП—► )(<-7,6 АБК-►) 352+43

(♦—7,6 АБК+1,0 БАП—►)(7,6АБК)(<-О->> О

(7,6 АБК+5,0 БАП)(<-7,6 АБК-► > 199±33

(7,6-АБК+5,0 БАП)(«—7,6 АБК—►)<«-:-О-►) 8±4

(«—7,6 АБК+5,0 БАП—► )<<---7,6 АБК-►) 382+68

(♦—7,6 АБК+5,0 БАП—►)(7,6АБК)(<-£-О О

реГенерационно неактивных под действием одной АБК линиях ЭСМ.

; Обнаруженный ЭФФект, наиболее вероятно, основан на том, что БАП, стимулируя белковый синтез в клетках соматических проэмбрио /Кулаева,1в7з/, активирует тем самым их расщепление. В результате увеличивается количество зрелых соматических проэмбрио на единицу сырого веса ЭСМ, АБК на данном этапе, по-видимому, не способна ингиЗировать процесс расщепления проэмбрио, а только блокирует их преждевременное прорастание /Ajnmirato,iQ77/. удаление БАП из состава среда может выступать тармиссивным стимулом дяя перехода соматических проэмбрио в фазу созревания, когда основную роль в стимуляции постепенного {true-to-type) развития эмбрионов и ингибиро-вании ИХ преждевременного прорастания играет АБК »t>urzan.Gupta, iosa/. рроверка гипотезы может расширить представление о взаимодействии АБК и щггокининов в регуляции морфогенеза.

ЕОЛЬ негормональных Факторов. Проблема замещения одной питательной среда на другую в многоступенчатом процессе СПЭ хвойных требует специального изучения. Нами обнаружено, что глутамин в составе среда"дяя созревания блокирует развитие соматических.эмбрионов,, если ЭСМ подцэрживалась на среде с нитратом, аммонием (cnh+з/

cno~]=0,22) и глутамином. Оптимальным азотным балансом в этом случав будет комплекс аммония и нитрата, взятых в более высоком, чем в поддерживающей среде, соотношении - 0,44. Если же в составе поддерживающей среды единственным источником восстановленного азота был глутамин, а ншрат присутствовал в пороговой концентрации (1,0 мМ), то для созревания соматических эмбрионов необходим весь комплекс азотсодержащих соединений: нитрат + аммоний + глутамин.

В дяигельнопассируемых культурах обнаружен стимулирующий пост-эФФект амидного азота поддерживающей среды на развитие соматических эмбрионов: созревание не наблюдалось, если ЭСМ поддерживалась на среде без амидов.

Примечательно, что возраст линий ЭСМ не оказывал заметного влияния на частоту созревания соматических эмбрионов ели, которая зависела только от генотипа и условий культивирования. Напротив, в омбриогенных культурах покрытосе?яенных ввдов Фактор возраста может сильно ограничивать регенерацию /сь©п et ai. ,1988/.

Регуляция прорастания соматических эмбрионов

Влияние светового режима, состава питательной среды и ориентации соматического эмбриона■ Обнаружено, что облучение красным светом при 16-часовом Фотопериоде приводит к двухкратному снижению частоты корнеобразования (до 17%), но увеличивает среднюю длину корня более чем в два раза (до 1,8 мм) относительно контроля (32% и 0,8 мм, соответственно). Контролем служил опыт без светофильтра при 16-часовом Фотопериоде. Темновое предкультивирование соматических эмбрионов слегка повышало частоту корнеобразования (до 42%); однако, длина корня увеличивалась почти вдвое (до 1,4 мм). Независимо от варианта опыта, развитие корня и побега носило асинхронный характер: сначала удлинялись гипокотиль и семядоли, после чего ПОЯВЛЯЛСЯ Kcv-рень /Krogstrup et al. ,1990/. РОСТУ КОрНЯ часто препятствовало образование чехлика из каллусной ткани вокруг корневой меристемы, являющееся результатом пролиферации оставшихся суспензорных клеток.

Прорастание стимулировалось, когда семядоли и гипокотиль контактировали с питательной средой (табл.4). В этом случае среда имитирует роль макрогаметофита, поставляющего питательные вещества в раззивающийся зародыш, главным образом, через семядоли /Brown,

Gif ford, 1958/.

Максимальные значения частоты корнеобразования (80Ж) и длины корня (3,3 мм) получены на среде, состоящей только та 1/4 минеральной основы среды sh и 2% сахарозы; соматические эмбрионы про-

Таблица 4

Прорастание соматических эмбрионов при разных вариантах ориентации на поверхности агаровой среда

Ориентация соматических эмбрионов Частота корнеобразования, % Средняя длина, мм

корень побег

вертикально, корневой зоной в агар 32±8 0,8±0,2 4,7±0,5

на косом агаре 67±0 2,4±0,9 4,2±0,7

вертикально, семядолями в агар 67±17 2,7±0,3 4,6±0,6

Примечание: Питательная среда - 1/4ьр с 2% сахарозы; световой режим культивирования - 18-часовой Фотопериод.

ращивались на косом агаре. Однако, использование данной процедуры для соматических эмбрионов второго цикла созревания (см. выше) доказало их низкую ризогенную активность; частота корнеобразования и длина корня снизились до 45% и 1,8 мм, соответственно. Возможно причина этого кроется в высоком уровне аккумуляции АБК эмбриональными клетками, достигнутом за два последовательных цикла созревания. Ингибирующее действие высоких доз АБК на прорастание соматических эмбрионов хвойных имеет ряд экспериментальных доказательств

/Dunstan et al.,1938; Roberts et al.,1990/,

ЭФФект частичного обезвоживания соматических эмбрионов еще раз свидетельствует, что в онтогенезе соматических эмбрионов и половых зародышей много общего: и те и другие требуют обязательного снижения содержания воды в тканях перед прорастанием /Bewiey, Black.1983/. Однако, для нормального прорастания соматических эмбрионов хвойных необходима не полная дегидратация, как в процессе покоя семян, а лишь незначительная потеря вода (около 15Ж), наблюдаемая только в условиях высокой (> 95SS > влажности воздуха

/Roberts et al.,1990/.

Использование процедуры обезвоживания полностью снимало инги-бирующий эффект продолжительного субкультивирования ЭСМ ели в присутствии АБК. Дегидратированные соматические эмбрионы отличались от контрольных синхронным развитием апикальных меристем и повышенной скоростью элонгации корня и побега.

Температура обезвоживания не оказывала заметного влияния на частоту корнеобразования, если экспозиция обезвоживания не превышала 9 суток (рис.3). Увеличение экспозиции до 16 суток и более снижало частоту корнеобразования в вариантах холодного обезвоживания (при 4°С), по сравнению с обезвоживанием при 23+1"С. Максимумы

Рнс.З. Влнянш частичного обезвоживания сокзтических эмбрионов на их прорастаниэ на косом агаре.

1 - температура 4*С;

2 - температура 23±1°С. Питательная среда - генеральная основа среда sh, разбавленная 1:3, с 2% сахарозы. Световой режим - 16-часовой Фотопериод.

частоты корнеобразовэния (1005?) и дайны корня 3-недрльных проростков (6,6 мм) получепы в варианте 16-суточного обезвоживания при 23±1°С (рис.3).

Наиболее адекватное объяснение Физиологической основы проявления эФФеета частичного обезвоживания, - зто снижение содержания АБК В эмбриональных тканях /Figueiredc, et al. ,1851/. Не ИСКЛЮЧ0НО, ЧТО снижается И уровень чувствительности клеток К АБК /Kernode et ai.,iQS9/, Обнаружено также, что обезвоживание подавляет жизнеспособность суспензорных клеток, пролиферация которых, как откечалось выше, приводит к образованию чехлика, мешающего развитии корня.

Адаптация соматических проростков vitrvm

Низкая адаптационная способность регенерантов хвойных vtt-rwn является серьезным препятствием для крупномасштабного применения методов микроклонирования в лесном хозяйстве. В единственной работе, посвященной вопросзм адаптации соматических проростков

Picea abies /Васwar et al. ,1989/, прИЖИВавМОСТЬ Не Превышала 30".

Мы обнаружили, что стадия развитхи апикальной почки на мокент переноса проростков, полученных из необезвоженных соматических эмбрионов, «к ^ctr-um выступает критическим Фактором: только проростки с распустившейся почкой (достигшие статуса автотрофности) способны выживать и продолжать рост в субстрате. Однако, частота распускания апикальной потаи ¿п vitro у необезвоженных соматических зкбртонов зфайне низка, вследствие их замедленного роста. Прикивпекость проростков с апикальной почкой составила 41% за 2 месяца выращивания в лабораторных условиях. Выжившие за этот период растения в дальнейшем погибали, если их не переносили в производственную тешкцу. Гибель растений в лабораторных условиях, по-видиус^у, обусловлена плохой аэрацией субстрата и сильным варьированием влажности воздуха з течение суток.

Таблица 5

Влияние частичного обезвоживания соматических эмбрионов на приживаемость проростков в производственной теплице

Опыт Субстрат Приживаемость

контроль торФ:лерлит (3:1) 44

обезвоживание торФ:перлиг (3:1) 85

то же торф:опилки (3:2) 87

то же смесь ТПК 72

Примечание: Проростки, полученные из необезвоженных соматических эмбрионов (контроль), предварительно подращивались 2 месяца в лабораторной микротешице.

Стерильность субстрата не оказывает значительного влияния на приживаемость, а выжившие растения растут даже лучше в нестерильном субстрате. Возможно, что в процессе автоклавирования субстрата происходит распад термолабаяьных соединений, входящих в состав гумифицированного органического вещества торфа.

Экспериментально доказано, что частичное обезвоживание соматических эмбрионов существенно повышает адаптационную способность проростков. Приживаемость в производственной теплице составила от 72% до 87% для разных субсгратов (табл.5). Интересно, что частичное обезвоживание содействовало приживаемости проростков с нераспустившейся в условиях in vitro апикальной почкой. Поэтому, при выращивании посадочного материала из частично обезвоженных соматических эмбрионов ели вовсе необязательно селектировать проростки по признаку наличия эпикотиля.

За три месяца адаптации в теплице длина главного корня и высота надземной части составили, в среднем, около 70 мм и 30 мм, соответственно. Двухлетние регенеранты имели надземную часть высотой 75-80 мм, превышая по данному показателю обычные сеянцы ели обыкновенной, выращиваемые, как и в данной работе, без внесения минеральных удобрений ^Жигунов,1е®4/.

Разработан протокол культивирования для размножения зрелых семян ели обыновенной через СПЭ. Хотя генотипический Фактор оказывал заметное влияние на эффективность СПЭ, средние значения показателей СПЭ при использовании данного протокола культивирования значительно выше, по сравнению с известным аналогом /вэс«аг et

al. ,1989; Verhagen,Wann,1В89/, ОСОбвННО, НЗ ЭТЭПЗХ СОЗреВЭНИЯ СОматических эмбрионов и адаптации проростков « vurwn.

выволы

1. Уровень эмбриогенной активности незрелых половых зародышей

ОЛИ обыкновенной (Pice-a abiss L. Karst) in vitro ЗаВИСИТ ОТ СТЭДИИ развития зародыша en situ и достигает максимума через 7-8 недель после оплодотворения (на стадии активного развгтгкя семядолей). Определенное соотношение ауксина и цитокинина в питательной среда является главным Фактором инициации соматического полиэмбркогенеза (СПЭ) в культуре незрелых зародышей. НУК - более эффективный, по сравнению с 2,4-Д, индуктор СПЭ, особенно, для более развитых (9-10-недельных) зародышей.

2. Зрелые зародыши характеризуются относительно низким уровнем эмбриогенной активности и способны продуцировать активно про-лиФерирующке линии эмбрионально-суспензорной массы (ЭСМ) только в присутствии анидного азота, физиологическая роль амидов состоит в стимулировании расщепления соматических прозмбрио. Частота образования линий ЭСМ зависит не то.*ько от общего содержания неорганического азота, но и от молярного соотношения аммония и нитрата.

3. Генотип семян влияет не только на процесс индукции СПЭ, но и на последующую стабилизацию линия ЭСМ. Зависимости показателей индукции СПЭ и стабилизации линий ЭСМ от состава питательной среды имеют различный характер. Форма этих зависимостей опосредована генотипически.

4. Впервые обнаружен явно выраженный синергичный эФФект АБК и БАП на развитие соматических эмбрионов ели. Добавление БАП (1-5 мкМ) в среду, содержащую АБК (7-15 мкМ), на 1-2 пассажа приводит к многократному увеличению выхода зрелых соматических эмбрионов и индуцирует созревание в регенерапионно неактивных линиях ЭСМ. Данный ЭФФект, видимо, основан на известной способности цитокини-нов стимулировать синтез белка, что может привести к активации расщепления прозмбрио, последующее нормальное развитие которых после удаления из среды БАП контролируется АБК.

5. Частичное обезвоживание зрелых соматических эмбрионов приводит к синхронизации развития апикальных меристем и увеличению скорости элонгации корня и побега на сильно разбавленной питательной среде. Высказывается предположение, что ЭФФект обезвоживания основан на снижении содержания АБК в дегидратированных эмбриональных тканях и/или снижении чувствительности клеток последних к АБК.

6. Соматические проростки, полученные из частично обезвоженных соматических эмбрионов, отличаются повышенной адаптационной способностью in vivo.

.го-

Материалы диссертации представлены в т публикациях:

1. Божков П.В., Ширяева Г. А. Огттимизация среды для Формирования адвентивных побегов в культуре зрелых эмбрионов ели европейской -V В кн.: Биология культивируемых клеток и биотехнология. -Новосибирск, 1988. - с.247-248.

2. Божков П.В., Лебеденко Л.А., Ширяева Г.А. Клональное микроразмножение ели европейской путем соматического эмбриогенеза // Анатомия, физиология и экология лесных растений. Материалы xxvi сессии Комиссии им. Л.А.Иванова (Петрозаводск, 1991). - Петрозаводск, 1992. - с.19-21.

3. Лэбеденко Л.А., Ширяева Г.А., Божков П.В. Анатомические и гистохимические особенности Формирования адвентивных почек ели европейской в культуре зародышей ¿п vitro // Там же. - с.99-102.

4. Ширяева Г.А., Лебеданко Л.А., Божков П.В. Регенерация ели европейской in vitro и причины вариабельности морФогенетического потенциала // Там же. - с.203-206.

5- Bozhkov P. V. ■ Lebedenko L. А. , Shi гуав va в. A. A pronounced synergistic effect of abscisic acid and B-benzyladenine on Norway spruce CPícea abi&s L. Karst} somatic embryo maturation // Plant Cell Reports. - 1093. - v.11, - p.386-380.

6. Божков П.В., Лебеданко Л.А., Ширяева Г.А. Способ микрокло-нального размножения ели обыкновенной ин вигро " Патент Российской Федерации N1761057; заявлено 09.07.90; действует с 16.04.93; Бюл. N34.

7. Bozhkov P. v.. Mi k hi i na S. В. . Shiryaeva G. A. Lebedenko L. A. Influence of nitrogen balance of culture medium on Norway spruce CPicaa abi&s CL. Э Karst} somatic polyembryogenesis: high frequency establishment of embryonal-suspensor mass lines from mature zygotic embryos J. Plant Physiol. - 1093 CB ШЧЗТИЗ

Поди, ii печать 21.12.93. Объем T,zo и.л. Tup, IÜ0 экз. йак. ПО-3. С.-Петербург, jíiiveilHuíi пр., ¿5