Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Скрытая инфекция, вызванная вирусом гепатита В: эпидемиологическая, вирусологическая и клинико-морфологическая характеристика

ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Скрытая инфекция, вызванная вирусом гепатита В: эпидемиологическая, вирусологическая и клинико-морфологическая характеристика"

Гордейчук Илья Владимирович

Скрытая инфекция, вызванная вирусом гепатита В: эпидемиологическая, вирусологическая и клинико-морфологическая характеристика

03.02.02 — вирусология

Автореферат

на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

IО Р.НЗ

• »

Москва — 2010

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Михайлов Михаил Иванович

доктор медицинских наук, профессор Ильченко Людмила Юрьевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Лукашев Александр Николаевич

доктор медицинских наук, профессор Мукомолов Сергей Леонидович

Ведущая организация

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский

институт вирусологии им. Д.И. Ивановского» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита диссертации состоится «2( » ¿в/Л 20 И г. в II

часов на

заседании Диссертационного совета Д 001.026.01 при Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН по адресу 142782, Московская область, Ленинский район, п/о Институт полиомиелита)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН

Автореферат разослан « 2.2 »_ 'уЬ^д/Л 2010 г.

(/I«* к/Л

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

Медведкина Ольга Алексеевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Гепатит В (ГВ) представляет собой важнейшую медико-социальную проблему мирового здравоохранения. С читается, что ВГВ-инфекцию перенесли более 2 млрд. человек, при этом около 350 млн. имеют хронический гепатит В (ХГВ). До половины хронически инфицированных лиц погибают от таких осложнений заболевания, как печеночная недостаточность, цирроз печени (ЦП) и гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) [Шахгильдян И.В, Михайлов М.И., Онищенко Г.Г., 2003]. Проблема ГВ актуальна и для Российской Федерации, имеющей регионы, эндемичные по ВГВ-инфекции. Высокий уровень заболеваемости, возможность хронизации инфекции, а также утрата больными трудоспособности и возможность летальных исходов влекут за собой огромный демографический и экономический ущерб для государства.

До недавнего времени считалось, что клинически ВГВ-инфекция может протекать в форме острого или хронического ГВ, или же как длительное персистирование поверхностного антигена ВГВ (HBsAg) в сыворотке крови пациентов при отсутствии клинически выраженного гепатита. Однако было показано, что ДНК вируса может определяться в сыворотке крови и ткани печени пациентов, у которых доступными методами не выявлялся НВзА§. Это явление получило название «скрытая (латентная) ВГВ-инфекция».

Несмотря на возросший интерес к проблеме скрытой ВГВ-инфекции, наблюдающийся в последние годы, до настоящего момента не существует единого мнения о распространенности данного явления в различных группах населения, а также его клинической значимости.

Существенные расхождения в получаемых данных о распространенности скрытой ВГВ-инфекции связаны с использованием при определении НВэА£ и ДНК ВГВ методов с различной чувствительностью, а также с тем, применялись ли в ходе исследования методы выявления ВГВ в ткани печени. Наиболее современные из применяемых тест-систем для иммуноферментного определения HBsAg позволяют детектировать его в сыворотке крови в концентрации 0,01 нг/мл. Оценка распространенности скрытой ВГВ-инфекции при использовании таких тест-систем ранее не проводилось. Кроме того, на настоящий момент практически отсутствуют данные о патоморфологических изменениях в ткани печени при скрытой ВГВ-инфекции.

Цель работы

Определить эпидемиологические, молекулярно-вирусологические и клинико-

морфологические особенности скрытой ВГВ-инфекции у лиц с высоким риском

инфицирования ВГВ и пациентов с хроническими заболеваниями печени неуточненной

этиологии.

Задачи

1. Определить встречаемость скрытой ВГВ-инфекции среди условно здорового населения Республик Тыва — региона РФ, эндемичного по гепатиту В.

2. Выявить скрытую ВГВ-инфекцию у НВзА£-негативных пациентов с хроническими заболеваниями печени, распространенными на территории РФ.

3. Дать молекулярную и клинико-морфологическую характеристику скрытой ВГВ-инфекции.

4. На основании результатов исследования оптимизировать алгоритм диагностики скрытой ВГВ-инфекции у лиц с высоким риском инфицирования ГВ и пациентов с хроническими заболеваниями печени неустановленной этиологии.

Положения, выносимые на защиту

1. С использованием высокочувствительных методов детекции маркеров ВГВ (НВзА§ определялся тест-системой с чувствительностью 0,01 нг/мл; ДНК ВГВ — <125 копий/мл) установлена частота встречаемости скрытой ВГВ-инфекции среди условно здорового населения региона РФ, гиперэндемичного по ГВ (Республика Тыва) — 0,42%.

2. Выявленные случаи скрытой ВГВ-инфекции характеризуются минимальными клинико-биохимическими и морфологическими изменениями, а также низким уровнем виремии и отсутствием в структуре НВзА£ аминокислотных замен, способных повлиять на эффективность его детекции в иммуноферментном анализе.

3. Определение ДНК ВГВ в гепатобиоптатах методом ПЦР с последующим электрон-номикроскопическим исследованием и иммуноцитохимической детекцией вирусных белков в рамках алгоритма обследования НВзА£-негативных пациентов с хроническими заболеваниями печени позволяет выявлять скрытую ВГВ-инфекцию в ранее не диагностированных случаях.

Научная новизна

1. Впервые скрытая ВГВ-инфекция в регионах с различной эндемичностью по ГВ (г. Москва и Республика Тыва) выявлена с использованием иммуноферментных тест-систем с высокой чувствительностью (HBsAg — 0,01 нг/мл).

2. С применением электронной микроскопии и иммунохимических методов исследования биоптатов печени пациента со скрытой ВГВ-инфекцией проведено описание клеточных структур гепатоцитов.

3. По результатам анализа фрагментов последовательностей Б-гена ВГВ, выделенных из образцов сыворотки крови и ткани печени пациентов со скрытой ВГВ-инфекцией, показана их генетическая разнородность.

4. Представленные данные свидетельствуют о нецелесообразности дальнейшего расширения спектра антител, используемых в тест-системах для иммуноферментно-го выявления НВзА£ при диагностике скрытой ВГВ-инфекции.

5. Предложено расширение алгоритма диагностики скрытой ВГВ-инфекции у лиц с высоким риском инфицирования ГВ и пациентов с хроническими заболеваниями печени неустановленной этиологии путем определения ДНК ВГВ в гепатобиоптате с последующим применением электронной микроскопии и иммунохимических методов детекции вирусных антигенов.

Личный вклад автора в полученные результаты

Основные результаты получены лично автором. Автор принимал непосредственное участие во всех этапах проведения работы: определении маркеров ВГВ-инфекции серологическими и молекулярно-биологическими методами, описании клинической характеристики пациентов, филогенетическом анализе последовательностей ДНК ВГВ. Обработка собранного материала и экспериментальная часть работы выполнена на базе Учреждения Российской академии медицинских наук Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН в лабораториях эпидемиологии гепатитов и пато-морфологии вирусных заболеваний.

Практическая значимость

1. В ходе проведенного исследования установлено, что возможность диагностики скрытой ВГВ-инфекции зависит от чувствительности применяемых серологических и мо-лекулярно-вирусологических методов, а также от использования морфологических методов.

2. Применение предложенного алгоритма диагностики скрытой ВГВ-инфекции у лиц с высоким риском инфицирования ВГВ позволяет уточнить этиологию заболевания у лиц с гепатитом неустановленного генеза.

3. Дальнейшее совершенствование серологической диагностики скрытой ВГВ-инфек-ции путем внесения антител к новым антигенным эпитопам при разработке иммуно-ферментных тест-систем является нецелесообразным.

Внедрение результатов и апробация работы

Алгоритм диагностики скрытой ВГВ-инфекции у лиц с высоким риском инфицирования ВГВ и пациентов с хроническими заболеваниями печени неустановленной этиологии внедрен и применяется в научно-исследовательской работе клинического отдела и отдела вирусных гепатитов ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН. Материалы диссертационной работы представлены в виде постерного доклада Р-39 на международном конгрессе по вирусным гепатитам 13th International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease (2009 г., Вашингтон), на VIII Российской конференции с международным участием «Вирусные гепатиты» (2009 г., пос. Московский, Россия), на XI Славяно-Балтийском научном форуме (2009 г., г. Санкт-Петербург), на XV Российской гастроэнтерологической неделе (2009 г., г. Москва), VIII Международном симпозиуме гепатологов Республики Беларусь «Актуальные вопросы гепатологии» (2009 г., Могилев, Республика Беларусь), XVII Российском Национальном конгрессе «Человек и лекарство» (2010 г., г. Москва).

Апробация диссертации состоялась 13 октября 2010 г. на заседании Ученого совета ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН (протокол №212 от 08.10.2010 г.).

Публикации по теме диссертации

По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе 2 статьи — в реферируемых журналах ВАК.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 115 страницах текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав собственных исследований и обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 6 отечественных и 103 зарубежных источника. Диссертационная работа иллюстрирована 25 таблицами, 15 рисунками и имеет 2 иллюстрированных приложения.

Обследование пациентов и забор материала проводились на базе 12 ГКБ г. Москвы, в Поликлинике при Управлении делами Президента РФ и Гепатологическом центре г. Кызыла, Республика Тыва. Забор сывороток крови и биоптатов печени проводилось квалифицированным медицинским персоналом с наличием подписанного пациентами информированного согласия.

Все лабораторные исследования были проведены в лабораториях эпидемиологии гепатитов и патоморфологии вирусных заболеваний ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы исследования

В ходе данной работы было обследовано 923 пациента из следующих групп:

1. 542 человека в возрасте 18-89 лет (в среднем — 44,9 лет), 129 (23,8%) мужчин и 413 (76,2%) женщин, проживающих на территории гиперэндемичного по ГВ региона РФ (Республика Тыва).

2. 200 НВзА£-негативных пациентов с хроническим гепатитом С (ХГС) в возрасте 2092 лет (в среднем — 38 лет), 119 (59,5%) мужчин и 81 (40,5%) женщин, наблюдавшихся в Поликлинике при Управлении делами Президента РФ, г. Москва.

3.181 пациент с хроническими заболеваниями печени, распространенными на территории РФ, в возрасте 19-77 лет (в среднем — 46,5 лет); 101 (55,8%) мужчина и 80 (44,2%) женщин, получавших лечение в отделении гастроэнтерологии и гепатологии ГКБ №12 г. Москвы.У 50 пациентов из данной группы по показаниям, связанным с основным заболеванием, проводилось исследование образцов биопсии печени.

Пациенты из группы условно здорового населения Республики Тыва обследовались в соответствии с алгоритмом диагностики скрытой ВГВ-инфекии среди доноров и условно здорового населения, предложенным А. Ганиной в 2007 г. Если в исследуемом образце определялась ДНК ВГВ, регистрировался случай скрытой ВГВ-инфекции. На основании анкетных данных и результатов исследования сывороточных анти-НВс, проводился анализ влияния возраста, пола, места проживания, а также различных факторов риска инфицирования вирусами с парентеральной передачей на распространенность маркеров перенесенной ВГВ-инфекции.

Нуклеотидные последовательности вирусного генома, выделенные из сывороток крови пациентов, оказавшихся НВзА§-позитивными при первичном скрининге, анали-

зировались с целью определения генотипов и субтипов ВГВ, циркулирующих на территории Республики Тыва.

НВ$А£-негативные пациенты с ХГС, наблюдавниеся в поликлинике при Управлении делами Президента РФ (г. Москва) обследовались в 2 этапа:

1 этап. Сыворотки крови пациентов исследовались на наличие анти-НВс.

На основании данных, представленных в медицинских картах, и результатов определения анти-НВс оценивалось распределение маркеров перенесенной ВГВ-инфекции у пациентов до лечения, в ходе терапии интерферонами и по ее окончании. Кроме того, статистически оценивалось влияние присутствия анти-НВс в сыворотках крови пациентов на уровень биохимических показателей функции печени.

2 этап. Всем пациентам проводился скрининг ДНК ВГВ методом ПЦР.

Пациенты с ХЗП различной этиологии, получавшие лечение в отделении гастроэнтерологии и гепатологии ГКБ №12 г. Москвы обследовались в рамках предложенного алгоритма диагностики скрытой ВГВ-инфекции среди лиц с высоким риском инфицирования ГВ и пациентов с ХЗП неуточненной этиологии:

1 этап. Скрининг НВзА£ с использованием тест-системы с чувствительностью 0,01 нг/мл. HBsAg-пoзитивныe пациенты (п=39) в дальнейшем исключались из исследования.

2 этап. Сыворотки крови пациентов, негативных по НВзАд согласно результатам скрининга, исследовались на наличие ДНК ВГВ методом ПЦР.

3 этап. Ткань печени всех пациентов, которым была проведена биопсия, исследовалась на наличие ДНК ВГВ методом ПЦР, а также анализировалась с применением электронной микроскопии и иммуноцитохимических методов с целью выявления вирусных белков.

Обнаружение ДНК ВГВ в сыворотках крови или ткани печени пациентов на любом этапе исследования рассматривалось как случай скрытой ВГВ-инфекции. При этом проводилось определение вирусной нагрузки методом ПЦР с детекцией в реальном времени, секвенирование амплифицированных участков вирусного генома с целью выявления мутаций в 8-гене и гене полимеразы ВГВ, а также филогенетический анализ.

Лица, у которых была выявлена скрытая ВГВ-инфекция, обследовались под руководством проф. Л.Ю. Ильченко с целью выявления клинических особенностей течения инфекции.

Серологические и молекулярные методы исследования

Забор крови проводился квалифицированным медицинским персоналом в условиях поликлиники или стационара при наличии подписанного пациентами информированного согласия на исследования. С целью сохранения анонимности лиц, чьи сыворотки крови использовались в данной работе, каждому образцу при помощи программного обеспечения производства компании «Алтей» был присвоен номер и штрих-код. В дальнейшем все манипуляции с образцом производились без использования личных данных пациентов.

HBsAg определяли тест-системой с чувствительностью 0,01 нг на 1 мл исследуемого образца — flC-H®A-HBsAg-0,01 (НПО «Диагностические системы», г. Нижний Новгород). При получении положительных результатов проводилось дополнительное исследование с использованием тест-системы для подтверждения результатов выявления HBsAg; анти-НВс определяли тест-системой ДС-АНТИ-НВс того же производителя.

Выделение ДНК ВГВ проводилось из 50 мкл сыворотки крови или столбика биопсии печени длиной =1 см фенол-хлороформом с использованием набора для выделения нуклеиновых кислот производства НПФ «Литех», г. Москва, согласно протоколу производителя. Для выделения нуклеиновых кислот из ткани печени длительность лизиса в феноле увеличивалась до 20 минут. Детекция нуклеиновых кислот в сыворотках крови и биоптатах печени проводилась методом двухступенчатой ПЦР с праймерами к участку перекрытия генов S и Р ВГВ, предложенными А. Basuni и W. Carman (Таблица 1).

Этапы ПЦР: предварительная денатурация при 94 °С — 5 мин; далее — 30 циклов денатурации при 94 °С — 45 е., отжига праймеров при 55 °С — 45с. и элонгации при 72 °С — 1,5 мин. и финальная элонгация при 72 °С длительностью 7 мин. Фрагмент длиной 717 п.о. детектировался методом электрофореза в агарозном геле.

Специфичность ПЦР подтверждалась с использованием во всех постановках нескольких отрицательных контрольных образцов. Контроль чувствительности метода проводился с применением образцов плазмидной ДНК, содержащих клонированные участки ДНК ВГВ в известной концентрации (Bayer). Чувствительность применяемой ПЦР при исследовании сывороток крови и ткани печени составляла <125 копий ДНК ВГВ на 1 мл исследуемого материала на основании тестирования серий предельных разведений образцов с известной концентрацией ДНК ВГВ.

Таблица 1. Олигонуклеотиды, используемые для детекции ДНК ВГВ и амплификации 5-гена (позиции 128-884 генома ВГВ)._

Ген Последовательности Позиции генома ВГВ Положение Направление

S 5'-cctgctggtggctccagttc-3 ' 56-75 Внешний Прямой

S 5'-ccacaattckttgacatactttcca-3' (k=g/t) 979-1003 Внешний Обратный

s 5'-ccgaggactggggaccctg-3' 128-146 Внутренний Прямой

s 5'-ggttagggtttaaatgtatacc-3' 823-844 Внутренний Обратный

Результат обнаружения ДНК ВГВ при помощи ПЦР с первым набором праймеров подтверждался реакцией с праймерами, к участку Х-гена ВГВ по протоколу, предложенному Б. Ру^иока и соавт., 2008 (Таблица 2).

Таблица 2. Олигонуклеотиды, используемые для подтверждения детекции ДНК ВГВ и амплификации участка Х-гена (позиции 1487-1604 генома ВГВ).__

Ген Последовательности Позиции генома ВГВ Положение Направление

X 5'-tgccaactggatccttcgcgggacgtcctt-3' 1392-1421 Внешний Прямой

X 5'-gttcacggtggtctccatg-3' 1607-1625 Внешний Обратный

X 5 '-gtccccttcttcatctgccgt-3 ' 1487-1507 Внутренний Прямой

X 5 '-acgtgcagaggtgaagcgaag-3 ' 1584-1604 Внутренний Обратный

Этапы ПЦР: предварительная денатурация при 94 °С — 5 мин; далее — 35 циклов денатурации при 94 °С — 30 е., отжига праймеров при 55 °С — 30 с. и элонгации при 72 °С — 40 с. и финальная элонгация при 72 °С длительностью 7 мин. Фрагмент длиной 118 п.о. детектировался методом электрофореза в агарозном геле.

В ДНК ВГВ-позитивных образцах определяли вирусную нагрузку методом ПЦР с детекцией в реальном времени с линейным диапазоном определения концентрации ДНК ВГВ 104-107 копий/мл и чувствительностью 103 копий/мл. Процедура проводилась с использованием набора «Биотитр В» (НПО «Литех», Россия) на анализаторе COBAS TaqMan 48 (Roche Diagnostics, США) по протоколу производителей.

Анализ нуклеотидных последовательностей ВГВ

Продукт ПЦР с праймерами к перекрывающемуся участку S/P-гена величиной 717 п.о., вырезали из геля и выделяли из агарозы с помощью набора QIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN, США).

Секвенирование вирусного генома проводилось в.н.с. лаборатории эпидемиологии вирусных гепатитов ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН к.б.н. О.В Исаевой на анализаторах ABI 3130 Genetic Analyser (Applied Biosystems, США) и CEQ 8800

(Beckman Coulter, США) с использованием наборов BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit и Genome Lab Methods Development kit соответственно.

Для генотипирования ВГВ полученные последовательности сравнивались с последовательностями, депонированными в базе данных GenBank, соответствующими всем 8 генотипам «дикого типа» ВГВ. Выравнивание нуклеотидных последовательностей и их филогенетический анализ проводился с использованием программы Mega 4.0.

Серотип вируса определялся по нуклеотидным последовательностям, кодирующим аминокислоты, находящиеся в 122, 160, 127, 134 и 159 позициях S-антигена согласно методам, предложенным Н. Norder и соавт. в 1992 г.

Микроскопическое и иммунохимическое исследование биоптатов печени

Биоптаты печени разделялись на две части. Первая часть не позднее 3 минут с момента проведения биопсии замораживалась при температуре -20 °С на срок до 1 недели с последующей транспортировкой с соблюдением холодовой цепи и глубоким замораживанием при температуре -80 °С на срок до 1 месяца для последующего проведения ПЦР. С целью обнаружения вирионов в печени и их идентификации, вторая часть биоптатов изучалась методом электронной микроскопии (ЭМ) на базе лаборатории патоморфологии вирусных заболеваний ГУ ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН (зав. — профессор Морозов И.А.). Подготовка материала проводилась по методике, принятой в лаборатории. Иммуноцитохимическое (ИЦХ) исследование срезов проводилось с использованием мышиных антител к HBsAg и комплекса золото (частицы размером 520 нм)-протеин А.

Учет результатов проводился вручную на приборе JEM-100C (Jeol, Япония) при ускоряющем напряжении 80 kV с последующим визуальным анализом субмикроскопических патологических признаков в ткани печени больных.

Статистические методы исследования

Статистический анализ корреляции между факторами, влияющими на риск инфицирования ВГВ, и распространенностью анти-НВс среди условно здорового населения республики Тыва производился с помощью двух методов. Влияние факторов, описываемых дихотомическими переменными (пол, место проживания, наличие татуировок, наличие данных о проведенной вакцинации против ГВ) оценивалось путем вычисления коэффициента четырехклеточной сопряженности Пирсона. Для оценки

влияния факторов, описываемых интервальными переменными (возраст), рассчитывался точечно-бисериальный коэффициент корреляции — г. Критическое значение коэффицентов корреляции оценивалась с применением таблиц критических значений коэффициента корреляции Пирсона. Результаты считались достоверными, если вероятность ошибки не превышала 1% (р=0,01). Вычисление стандартного отклонения (СО) выборки по уровню биохимических показателей функции печени производилось при помощи электронных таблиц Cale (пакет OpenOffice 3.2.1).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты обследования условно здорового населения Республики Тыва

В ходе первичного скрининга HBsAg обнаруживался в 61 из 542 (11,3%) образцов. Сыворотки крови HBsAg-позитивных пациентов дополнительно исследовались на наличие анти-НВс, HBeAg, анти-BID и ДНК ВГВ (Таблица 3). В 14 из 29 случаев, когда у HBsAg-позитивных лиц определялась ДНК ВГВ, образцы анализировались методом прямого секвенирования. Полученные последовательности вирусного генома в дальнейшем использовались для сравнения с последовательностями, выделенными от лиц со скрытой ВГВ-инфекцией. Анализ данных, представленных в амбулаторых картах, показал, что у 23/61 (37,7%) имелись данные о проведенной ранее вакцинации против ГВ. Анализ нуклеотидных последовательностей S-гена, выделенных от таких пациентов, показал отсутствие мутаций, способных вызвать нарушение нейтрализации вируса антителами, вырабатываемыми в результате вакцинации.

На втором этапе обследования данной группы проводился скрининг сывороточных анти-НВс. Этот маркер обнаруживался в 81,1% (390/481) образцов.

Таблица 3. Результаты исследования образцов сыворотки крови лиц, проживающих на территории Республики Тыва, положительных по HBsAg согласно данным первичного

Показатели п (%)

Пол, м/ж 17 (27,9)/44 (72,1)

Средний возраст (лет) 42,9 (18-80)

анти-НВс 56 (91,8)

HBeAg 1 (1,6)

ДНК ВГВ 29 (47,5)

анти-ВГО 17 (27,9)

На основании результатов анкетирования и скрининга анти-НВс проведен анализ

влияния возраста, пола, места проживания и факторов риска инфицирования вирусами с парентеральной передачей на распространенность маркеров перенесенной ВГВ-инфекции (Таблица 4).

Таблица 4. Распределение демографических характеристик и факторов риска инфицирования вирусами с парентеральной передачей среди НВБА§-негативных лиц, проживающих на территории Республики Тыва (п=481).___

Показатели анти-НВс-позитивные (п=390) анти-НВс-негативные (п=91) г (р<0,005)

Пол, м(%)/ж(%) 92 (23,6)/298 (76,4) 20 (22)/71 (78) 0,01

Средний возраст, лет 47,3 35,6 0,29

Место проживания, село/город (%) 266 (68,2)/ 124 (31,8) 67 (73,6)/24 (26,4) 0,05

Вакцинация против ГВ (%) 180 (46,2) 43 (47,3) 0,01

Хирургические вмешательства (%) 139 (35,6) 26 (28,6) 0,06

Переливания крови (%) 60(15,4) 10(11) 0,05

Наличие татуировок (%) 22 (5,6) 3 (3,3) 0,04

Комментарии, критический коэффициент корреляции для данной выборки при р<0,005 составляет 0,146. Выделены значения, превышающие критическое.

Единственным фактором, статистически достоверно ассоциированным с наличием

анти-НВс в сыворотках крови обследованных лиц, проживающих на территории

Республики Тыва, являлся возраст, т.е. длительность проживания на эндемичной по ГВ

территории.

Среди 390 НВ5А§-негативных анти-НВс позитивных лиц скрытая ВГВ-инфекция была выявлена в двух случаях, анализ которых представлен в таблице 5.

Таблица 5. Анализ анкетных данных лиц со скрытой ВГВ-инфекцией.

Показатели Характеристики

Номер в базе данных 1549 600

Пол, возраст, лет Ж, 64 М, 25

Род деятельности пенсионерка фельдшер КИБ

Условия проживания село, ч. дом село, ч. дом

Гепатиты А,В и С в анамнезе отрицает отрицает

Вакцинация против ГВ, ГА нет нет

Хирургические операции в анамнезе да нет

Переливания крови нет нет

Наличие татуировок да нет

Малое количество выявленных лиц со скрытой ВГВ-инфекцией в данной группе не позволяет установить статистически достоверную связь между какими-либо их характеристиками и риском формирования скрытой ВГВ-инфекции. Однако следует упомянуть о наличии у одного из них таких факторов риска трансмиссии вирусов с

парентеральной передачей, как наличие татуировок и хирургических вмешательств в анамнезе.

Вирусная нагрузка в обоих образцах составила менее 103 копий ДНК ВГВ на мл. Секвенирование вирусной ДНК показало принадлежность образцов к разным генотипам ВГВ: D и А, и серотипам ayw\ и adwl соответственно. Единственная замена в антигенной я-детерминанте HBsAg, присутствующая в образце 600 (Y134F), согласно литературным данным встречается в популяции «дикого типа» вируса и не может являться причиной снижения эффективности детекции HBsAg в иммуноферментных тест-системах [Hamatake RK, Lau JYN, 2004].

Таблица 6. Распределение генотипов, серотипов ВГВ и аминокислотных замен в образцах, полученных от пациентов с наличием скрытой ВГВ-инфекции._

Номер образца Генотип, субтип Серотип Аминокислотные замены в HBsAg Аминокислотные замены в вирусной полимеразе

600 D ayw 1 F8L, Y134F, Y206C I16T.Y54H

1549 А2 adwl I25V N33S

Выявление скрытой ВГВ-инфекции у HBsAg-нeгaтивныx пациентов с ХГС

Встречаемость анти-НВс составила 96/200 (48%) (Таблица 7). Таблица 7. Распределение анти-НВс среди HBsAg-нeraтивныx пациентов с ХГС (п=200)

Показатели анти-НВс-позитивные (п=96) анти-НВс-негативные (п=104) Г(Р)

Средний возраст, лет 36,55 (23-67) 39,32(20-92) -0,12 (<0,005)

М/Ж% 63 (65,6)/33 (34,4) 56 (53,8)/48 (46,2) 0,12_(<0,005)

Распределение анти-НВс в различных группах пациентов с ХГС

ХГС до лечения (п=64), % 25 (39,1) 39 (60,9) -0,11 (<0,01)

ХГС на лечении (п=40), % 20 (50) 20 (50) не значимо

ХГС после лечения (п=74), % 38(51,4) 36 (48,6) не значимо

ХГС-ассоциированный цирроз печени (п=7), % 4(57,1) 3 (42,9) не значимо

анти-ВГС «+», РНК ВГС «-»(п=15), % 9(60) 6(40) не значимо

Комментарии, критические коэффициенты корреляции для разных выборок рассчитывались отдельно. Выделены значения, превышающие критические.

Статистически достоверно значимыми факторами, влияющими на вероятность присутствия анти-НВс в сыворотках крови пациентов с ХГС, были: мужской пол (р<0,005), проводимый курс интерферонотерапии (р<0,01), а также возраст пациентов (р<0,005). При этом, в отличие от обследованной группы лиц, представляющих условно здоровое население Республики Тыва, установлена обратная корреляция возраста с вероятностью присутствия анти-НВс в сыворотках крови.

Ни у одного из пациентов в данной группе ДНК ВГВ выявлена не была.

Результаты обследования пациентов с НВз/^-негатнвными хроническими заболеваниями печени различной этиологии

Среди 142 НВзА§-негативных пациентов с ХЗП различной этиологии анти-НВс были обнаружены у 50 (35,2%) (Таблица 8). Изменения биохимических показателей функции печени в ходе основного заболевания у обследованных пациентов варьировали в столь значительных пределах, что проведение оценки дополнительного влияния маркеров перенесенной ВГВ-инфекци не представлялось возможным.

Таблица 8. Распределение анти-НВс в различных нозологических группах HBsAg-нeгa-тивных пациентов с ХЗП (п=142)._

Нозологические формы п(7

анти-НВс «+» анти-НВс«-»

Алкогольная болезнь печени (п=52) 13 (25%) 39(75%)

хронический алкогольный гепатит (п=33) с исходом в цирроз печени (п=19) 9 4 24 15

Хроническая ВГС-инфекция (п=48) 22 (45,8%) 26 (54,2%)

хронический гепатит С (п=28) ХГС+апкогольная болезнь (п=12) 12 8 16 4

ВГС-ассоциированный ЦП (п=5) ХГС в сочетании со стеатогепатитом (п=3) 1 1 4 2

ХЗП аутоиммунного генеза (п=12) 6 (50%) 6 (50%)

аутоиммунный гепатит (п=3) первичный билиарный цирроз (п=7) аутоиммунный гепатит с исходом вЦП (п=2) 2 3 1 1 4 1

Неалкогольная жировая болезнь печени (п=15) 5 (33,3%) 10 (66,7%)

Хронический гепатит неуточненный (п=15) 4 (26,7%) 11 (73,3%)

Итого 50 (35,2%) 92 (64,8%)

По результатам ПЦР с чувствительностью <125 копий/мл ни у одного из НВзА§-негативных пациентов с ХЗП различной этиологии ДНК ВГВ в сыворотках крови выявлена не была.

В соответствии с представленным ранее алгоритмом обследования, образцы ткани печени, полученные от 50/142 пациентов с HBsAg-нeгaтивными ХЗП, исследовались на ДНК ВГВ методом ПЦР. У 22% (11/50) обследованных в сыворотке крови определялись анти-НВс. У одной пациентки из этой группы в ткани печени была выявлена ДНК ВГВ. Уровень ДНК ВГВ не превышал 103 копий на 1 мл образца. Вирус относился к генотипу О, серотипу аун>2 ВГВ. При сравнении полученной нуклеотидной последовательности с референсной последовательностью для генотипа Б ВГВ, замен в рамке считывания 8-

гена обнаружено не было.

Результаты определения сывороточных маркеров вирусов гепатитов: анти-ВГС (-); НВэА£ (-); анти-НВс (+); РНК ВГС (-); ДНК ВГВ (-).

Клинически заболевание протекало с незначительным повышением уровня биохимических показателей функции печени и минимальным фиброзом (активность воспаления — А1, индекс фиброза (ИФ) — 1 балл по МЕТАУЖ). До проведения диагностического поиска скрытой ВГВ-инфекции пациентке ставился диагноз неалкогольный стеатогепатит (НАСГ). С целью уточнения стадии и активности патологического процесса была проведена чрескожная пункционная биопсия печени.

Рисунок 1. Вирионы (стрелка), паракристалические включения в матриксе митохондрий (ПВ) (а, х 30 тыс.); иммуноцитохимическое окрашивание НВзАя (б, х 30 тыс.) •— вирионы, экспрессирующие HBsAg на своей поверхности (стрелка), характерные горообразные митохондрии (М).

В ткани печени были обнаружены массивные отложения коллагеновых волокон между гепатоцитами и в перисинусоидальном пространстве Диссе, а также вокруг центральных вен. Стадия развития фиброза была установлена как умеренная (ИФ 2), что свидетельствует о значительной продолжительности хронического гепатита.

В гепатоцитах выявлены множественные вирусные частицы размером 49,281 ±2,63 7 нм, что соответствует данным морфометрии вирионов гепатита В (Рисунок 1а) [8екг Б. е1 а1., 2007]. В ходе иммуноцитохимического исследования биоптатов печени на поверхности обнаруженных вирионов был выявлен HBsAg (Рисунок 16).

Анализ нуклеотидных последовательностей участков генома ВГВ, выделенных от пациентов со скрытой ВГВ-инфекцией

Все последовательности ДНК ВГВ, выделенные от пациентов со скрытой ВГВ-

инфекцией и HBsAg-позитивных лиц, выявленных при первичном скрининге населения Республики Тыва, анализировались филогенетически (Рисунок 2) в программе Mega 4.0 [Tamura К. et al., 2007], а также исследовались на наличие мутаций в участках S- и Р-гена ВГВ (Таблица 9).

Последовательности участков генома ВГВ, выделенные из сывороток крови лиц со скрытой ВГВ-инфекцией, проживающих на территории Республики Тыва, принадлежали к генотипам А и D, серотипам adw2 и ayw 1 соответственно.

В последовательности, относящейся к генотипу А, была выявлена 1 синонимическая (Т465С) и 1 несинонимическая мутация (A73G) приведшая к замене изолейцина на валин в 25 позиции аминокислотной последовательности. В последовательности, относящейся к генотипу D, были выявлены 2 синонимические (Т135С и С465Т) и 4 несинонимические мутации (Т22С, А401Т, A617G и А619С), приведшие к аминокислотным заменам F8L, Y134F и Y206C. Среди упомянутых замен одна (Y134F) находилась в составе основной антигенной a-детерминанты HBsAg.

Следует отметить, что одна из последовательностей, выделенных от пациентов с наличием ВГВ-инфекцией, относится к генотипу А, относительно редко встречающемуся на территории РФ, другая — к нетипичному для РФ серотипу ayw 1 (детерминирован заменой Y134F). Тем не менее, согласно паспорту тест-систем, используемых для определения HBsAg, указанные изменения не могут быть причиной ложноотрицательных результатов.

Также можно исключить возможность снижения уровня репликации вируса по причине накопления в его геноме избытка синонимических замен, поскольку их количество в последовательностях, выделенных от пациентов со скрытой ВГВ-инфекцией не превышало их число в последовательностях, выделенных от HBsAg-позитивных лиц (Таблица 9).

В последовательности S-гена ВГВ, выделенной из ткани печени пациентки с ХЗП, имевшей отрицательный результат ПЦР в сыворотке крови, замен относительно референсной последовательности для соответствующего генотипа выявлено не было.

В ходе проведенного исследования в общей сложности было обследовано 923 лица с повышенным риском инфицирования ВГВ из различных групп населения. В таблице 10 представлены результаты определения анти-НВс и ДНК ВГВ во всех группах обследованных.

57

Tyva762 TyvaS17

Tyva424

Tyva1606 TyvB1527 Tyva1609 DM059405.1 gD consensus 2005

♦m.

EU5S4435.1 gD Estonia 2008 FM200203.1 gDRwanda20G9 EUS943821gC Russia 2008 —Tyva 1333

-Tyva 1355

GQ377SB9.1 gO СМИ 2007 GQ 183470.1 gD Inda2009 DQ41240B.1 gD Ndhalands 2036 EU787436.1gD China 2008 —TyvaS40

г AB263409.1 gD Mongolia 2007 Tyva312

>D

"Чг-1

EU7S74471gD China 2006 Tyva639

-Tyva 1631

~Tyva366

1—Tyva 364 г FJ349228.1 gD Belgium 2005

'-HM229734.1 gDlran 2006

—*Tyva600

IFJ692553.1 gE Haiti 2009 14DQ060G25.1 gE Namibia2005

1-AP007282.1 gE Japan 2005

' DM059406.1 gE consensus 2005

™|CS4C9744.1gB sons. 2006 "HFJ751429.1 gB China 2C06

DM059403.1 gB consensus 2005 -AB540582.1 gB Monesia 2010

ЯГ

_3|-A

^ FJ7094S3.1 gC Chfe2009 !G Q475332.1 gC Soulh Korea 2010 S5J-GUS65217 ! gG Netherlands 2007

'-GQ325774.1 gG USA 2004

AB375165 1 gG Mexco 2008 -DM559402.1 gA consensus 2005 r—»Tyvs1549

EU594395.1 oARusnfaltl«sk2008 EU859898.1 gA Вфит 2009 EU594394.1 gARuWalCUtSk20Q8 AP007263.1 gA. Japan 2005

г EF690512.1 gF Brazil 2007

-??P-AB365450.1 gF Bolivia 2307

AF288626 1 gF Argentina 2001 DM059409.1 gH csnsensus 2005 -АР00726ИдН Japan 2004 1r EU490228 1 <)H Thaland 2008 EF157291 1 gH Japan 2006

}C

}F

o|—С

"U'

H

Рисунок 2. Филогенетический анализ последовательностей ДНК ВГВ Комментарии: Филогенетические взаимоотношения изученных изолятов ВГВ, выделенных от пациентов со скрытой ВГВ-инфекцией (обозначены ♦), а также от лиц, проживающих в Республике Тыва (обозначены Tyva) и прототипных вариантов из GenBank на основании анализа нуклеотидной последовательности участка S-гена ВГВ (618 нт, 149-766; нумерация по прототипному штамму DM059405. Филогенетическое дерево построено по алгоритму Neighbour-joining без коррекции (uncorrected distance), с суммарной длиной ветвей, равной 33,41%. Числа в узлах дерева — процент bootstrap-псевдорепликатов, поддерживающих данную группу (приведены только достоверные значения >70%). Длина всех исследованных последовательностей равна.

Таблица 9. Синонимические и несинонимические мутации в последовательностях Б-ге-на (а) и Р-гена (б) ВГВ, выделенных от пациентов со скрытой ВГВ-инфекцией (выделены подчеркиванием) и НВзА£-позитивных лиц, проживающих на территории Республики Тыва. Анализировались первые 618 нуклеотидных позиций 8-гена (206 аминокислотных позиций соответственно).

а.

№ HBsAg Синонимические замены1 Несинонимические замены1 Аминокислотные замены ГТ СТ

Мл - 3 - - D ayw 2

ш - 2 4 F8L, Y134F, Y206C D ayw 1

1549 - 1 1 I25V А adw2

312 + 7 - - D avwl

366 + 7 4 F20S, T140I, S193L, S204R D ayw2

384 + 6 1 S193L D ayw2

424 + 5 4 F85Y, Т118А, Р127Т D ayw3

639 + 5 - - D avw2

762 + 3 2 Т118А, Р127Т D avw 3

917 + 2 3 I86T, T1I8A, Р127Т D ayv/3

940 + 1 1 G44E D avw2

1333 + 2 4 R24K, S55C, Y206C D ayw 2

1365 + 3 3 S55C, G145S D ayw 2

1527 + I 4 TU5N, Р127Т, W201G, P203Q D ayw 3

1606 + 2 3 Т118А, Р127Т, P203R D ayw3

1609 + 2 4 F19S, T45N, Т118А, Р1271 D ayw 3

F85C, G102C, Р108Т,

1631 + 8 7 G185A, wl91C, W196L, P203Q D ayw2

б.

№ HBsAg Синонимические замены Несиноннмнческне замены Аминокислотные замены

М. - 1 2 A21S, F122L

600 - 3 2 116Т, Y54H

1549 - 1 1 N33S

312 + 1 6 А38Т, Y54H, R110G, M129L, F151L, А194Т

366 + 6 5 А38Т, F122V, M129L, F15IL, S213T

384 + 3 4 А38Т, N76D, M129L, F151L

424 + 4 5 R110G, H126R, S135Y, N139D, L144I

639 + 2 3 А38Т, M129L, F151L

762 + 1 4 V23I, H126R, S135Y, Q149K,

917 + 2 3 H126R, S135D

940 + 2 0 -

1333 + 4 1 L91I

1365 + 2 4 L911, F122L, R153Q, K154Q,

1527 + 2 3 N123K, S135Y, L209W

1606 + 3 3 Y54H, H126R, S135Y

1609 + 1 4 N53K, N118D, H126R, S135Y

1631 А38Т, Y54H, Rl ЮМ, S116Y, M129L,

F151L, F166L, А200Р, M204I

1 — относительно референсных последовательностей для соответствующих генотипов ВГВ; ГТ — генотип; СТ — серотип;

Скрытая ВГВ-инфекция была обнаружена у 3 пациентов. Двое из них находились в группе условно здорового населения Республики Тыва. ДНК ВГВ была обнаружена в HBsAg-oтpицaтeльныx сыворотках крови). Третий случай скрытой ВГВ-инфекции был обнаружен при исследовании ДНК ВГВ в ткани печени пациентки со стеатогепатитом. В сыворотке крови пациентки отсутствовал как HBsAg, так и ДНК ВГВ. У всех обследованных обнаруживались анти-НВс.

Таблица 10. Частота выявления анти-НВс и ДНК ВГВ в исследуемых группах (п=923).

Группы обследованных Анти-НВс Скрытая ВГВ-инфекция Скрытая ВГВ-инфекция у анти-НВс (+) пациентов

Условно здоровое население Республики Тыва (п=48Г), исследование сывороток крови 81,1 0,42 0,51

НВ5А§-негативные пациенты с ХГС (п=200), исследование сывороток крови 48 0 0

Пациенты с ХЗП (п=142'), исследование сывороток крови 35,7 0 0

HBsAg-нeгaтивныe пациенты с ХЗП (п=50), исследование биоптатов печени 22 2 9,1

Достоверность полученных результатов подтверждается следующими фактами. Во-первых в данном исследовании для детекции HBsAg использовалась высокочувствительная тест-система (чувствительность — 0,01 нг/мл). Во-вторых, в каждой постановке ПЦР применялись положительные контрольные образцы с низким содержанием ДНК ВГВ (125 копий/мл), а при исследовании гепатобиоптатов проводился контроль ингибирования вирусной ДНК продуктами лизиса ткани печени. Уровень вирусной нагрузки не превышал нижней границы детекции количественного теста, т.е. 103 копий ДНК ВГВ на мл. На основании полученных данных можно сделать вывод о нецелесообразности ограничения диагностического поиска скрытой ВГВ-инфекции определением ДНК ВГВ в сыворотках крови пациентов и о необходимости молекулярного и ИЦХ исследования ткани печени пациентов с гепатитом неустановленной этиологии (Рисунок 3).

Заключение

В ходе данного исследования с целью вьивления скрытой ВГВ-инфекции и определения ее молекулярно-вирусологических и клинико-морфологических особенностей с применением высокочувствительных методов детекции HBsAg и ДНК ВГВ было проведено обследование трех групп лиц с высоким риском инфицирования

ВГВ. Было показано, что случаи скрытой ВГВ-инфекции имеют место как среди условно здорового населения эндемичного по ВГВ-инфекции региона, так и среди пациентов с характерными для территории РФ заболеваниями печени на неэндемичной территории.

Скрытая Отсутствие

ВГВ-инфекция ВГВ-

инфекции

Рисунок 3. Алгоритм диагностики скрытой ВГВ-инфекции у лиц с высоким риском инфицирования ГВ и пациентов с ХЗП неустановленной этиологии.

Анализ нуклеотидных последовательностей участков Б- и Р-генов вируса, выделенных из сывороток крови пациентов со скрытой ВГВ-инфекцией, в сравнении с последовательностями, выделенными от НВзА£-позитивных лиц на той же территории, показали, что течение ВГВ-инфекции в скрытой форме не связано с наличием мутаций, обуславливающих изменение антигенных эпитопов поверхностного белка вируса или наличием мутаций в последовательности обратной транскриптазы вирусной полимеразы. Во всех выявленных случаях скрытой ВГВ-инфекции имел место низкий уровень вирусной нагрузки (в 2 случаях <103 копий/мл, в 1 — <125 копий/мл). Также во всех установленных случаях скрытой ВГВ-инфекции в сыворотках крови пациентов присутствовали анти-НВс, что свидетельствует в пользу высказываемых ранее предложений о рассмотрении длительной персистенции анти-НВс в отсутствие НВзА§ как признака вирусной репликации на низком уровне.

На основании данных медицинских карт и результатов определения анти-НВс оценивалось распределение маркеров перенесенной ВГВ-инфекции у пациентов с различными нозологическими формами.

Кроме того, статистически оценивалось влияние присутствия анти-НВс в сыворотках крови пациентов на уровень биохимических показателей функции печени. В коде обследования группы лиц с ХЗП было установлено, что ограничение диагностического поиска скрытой ВГВ-инфекции исследованием ДНК ВГВ в сыворотках крови пациентов приводит к ложноотрицательным результатам.

Использование предложенного алгоритма диагностики скрытой ВГВ-инфекции у лиц с высоким риском инфицирования ГВ и пациентов с ХЗП неустановленной этиологии позволило выявить ее у пациентки, в сыворотке крови которой отсутствовали как НВзА§ (тест-система с чувствительностью 0,01 нг/мл), так и ДНК ВГВ (ПЦР с чувствительностью <125 копий/мл) (Рисунок 3). Клинико-биохимические показатели и результаты морфологического исследования ткани печени в случае скрытой ВГВ-инфекции свидетельствуют в пользу наличия гепатита минимальной степени активности и фиброза печени. В ходе электронной микроскопии в ткани печени были обнаружены неспецифические признаки гепатита и специфические признаки ВГВ-инфекции, а также вирусные частицы, по морфометрическим характеристикам совпадающие с вирионами ВГВ, несущие на поверхности HBsAg.

Представленные данные свидетельствуют о целесообразности поиска скрытой ВГВ-инфекции при обследовании пациентов с ХГ неустановленной этиологии. При этом алгоритм диагностики должен включать определение HBsAg тест-системой с чувствительностью 0,01 нг/мл и выше, а также молекулярное, электронномикроскопическое и имму-ноцитохимическое исследования биоптатов печени.

Дальнейшее повышение чувствительности методов детекции HBsAg и ДНК ВГВ в будущем приведет к улучшению диагностики данного явления.

Выводы

1. Встречаемость скрытой ВГВ-инфекции среди условно здорового населения Республики Тыва — региона, эндемичного по ВГВ-инфекции, оцененная с использованием тест-системы для диагностики HBsAg с чувствительностью 0,01 нг/мл и ПЦР с чувствительностью <125 копий ДНК ВГВ/мл, составила 0,42% (2/481).

2. Исследование сывороток крови НВзА§-негативных лиц в неэндемичном по ВГВ регионе РФ (г. Москва) показало, что вероятность присутствия скрытой ВГВ-инфек-

ции низкая даже в группах пациентов с повышенным риском инфицирования ВГВ. При исследовании сывороток крови 200 пациентов с хроническим гепатитом С и 142 пациентов с НВзА§-негативными хроническими заболеваниями печени ни одного случая скрытой ВГВ-инфекции выявлено не было. ДНК ВГВ была обнаружена в биоптате печени у 1 из 50 пациентов с НВзА§-негативными хроническими заболеваниями печени.

3. Выявление морфологических признаков гепатита и фиброза печени при углубленном анализе случая скрытой ВГВ-инфекции свидетельствует о клинической значимости данной формы инфекции.

4. Ни в одном из случаев скрытой ВГВ-инфекции в нуклеотидных последовательностях вирусного генома не было выявлено мутаций, способных обусловить снижение эффективности детекции НВзА§ в иммуноферментных тест-системах. У всех пациентов со скрытой ВГВ-инфекцией отсутствие НВбА§ в сыворотке крови ассоциировалось с низким уровнем вирусной нагрузки.

5. Разработан алгоритм диагностики скрытой ВГВ-инфекции среди лиц с высоким риском инфицирования ГВ и пациентов с хроническим гепатитом неустановленной этиологии, включающий исследование биоптатов печени с применением молекулярных, электронномикроскопических и иммуноцитохимических методов.

Практические рекомендации

1. В обследование пациентов с хроническими заболеваниями печени неуточненной этиологии необходимо включать диагностический поиск скрытой ВГВ-инфекции.

2. Использование высокочувствительных методов определения НВяА§ (чувствительность теста не менее 0,01 нг/мл) и ДНК ВГВ (чувствительность теста не менее 100— 150 копий/мл) позволит улучшить диагностику ВГВ-инфекции и снизить вероятность ее трансмиссии от НВзА§-негативных пациентов.

3. Диагностика скрытой ВГВ-инфекции у пациентов с хроническими заболеваниями печени неустановленной этиологии должна проводиться с определением ДНК ВГВ в ткани печени, а также с использованием специфических морфологических методов (электронная микроскопия, иммуногистохимическое и им-муноцитохимическое исследования).

Работы, опубликованные по теме диссертации

1. Кюрегян К.К., Ганина A.A., Гордейчук И.В., Исаева О.В., Дмитриев П.Н., Марданлы С.Г., Ильченко Л.Ю, Михайлов М.И. Выявление латентного гепатита В у лиц, принимающих психоактивные вещества / Мат. 14 РГН в РЖГГК. — 2008. — N° 5. — При-лож. № 32. — С. 92.

2. Морозов И.А., Княженцева А.К., Ильченко Л.Ю., Гордейчук И.В. Электронная микроскопия в диагностике латентных (скрытых) форм HBV-инфекции // Мат. 14 РГН в РЖГГК. — 2008. — № 5. — Прилож. № 32. — С. 96.

3. Гордейчук И.В., Громова Н.И., Ганина A.A., Кюрегян К.К., Ильченко Л.Ю. Латентный гепатит В в клинической практике (уровень распространения в различных группах населения) / Сб. мат. 3 Национ. конгресса терапевтов. — 2008. — С. 54-55.

4. Гордейчук И.В., Малинникова Е.Ю., Попова O.E. Латентный гепатит В у пациентов с ВИЧ-инфекцией // Мир вирусных гепатитов. — 2008. — № 6. — С. 3-7

5. Морозов И.А., Княженцева А.К., Ильченко Л.Ю., Гордейчук И.В. Иммуноцитохимия в диагностике латентной и поливирусной инфекции гепатотропными вирусами // РЖГГК. — 2010. — № 5. — Приложение № 35. Материалы Пятнадцатой Российской Гастроэнтерологической недели.

6. Гордейчук И.В. Выявление и клинико-морфологическая характеристика скрытой ВГВ-инфекции среди HBsAg-негативных пациентов с хроническими заболеваниями печени // Дальневосточный журнал инфекционной патологии. — 2010. — № 17. — С. 42—49

7. Громова Н.И., Гордейчук И.В., Кюрегян К.К., Ильченко Л.Ю., Михайлов М.И. Кли-нико-эпидемиологические аспекты латентной HBV-инфекции // Кремлевская медицина. Клинический вестник. — 2010. — №. 3. — С. 25-28.

Автор выражает благодарность своим учителям: М.И. Михайлову, Л.Ю. Ильченко, И.А. Морозову, К.К. Кюрегяну и О.В. Исаевой за справедливые замечания и поддержку, оказанную в ходе работы, сотрудникам лабораторий эпидемиологии вирусных гепатитов и патоморфологии вирусных заболеваний за помощь в освоении используемых методов, сотрудникам клинических отделений г. Москвы и Республики Тыва и лично Н.И. Громовой, Д.В. Гордееву за помощь в статистическом анализе данных, а также ученому секретарю ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН O.A. Медведкиной за помощь и внимание.

ДЛЯ ЗАМЕТОК

Подписано в печать 20.12.2010 Формат 60x84/16. Гарнитура "Times New Roman". Бумага офсетная. Печать офсетная. Тираж 90 экз. Заказ 483

ООО «Издательско-Полиграфическая Компания «Информкнига» 141231, Московская обл., Пушкинский район, Поселок сельского типа Лесной, ул.Пушкина, д.8, корпус А

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Гордейчук, Илья Владимирович

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Общая характеристика и особенности цикла репликации ВГВ.

1.2. Клиническое манифестирование и серологические маркеры ВГВ-инфекции.

1.3. Понятие о скрытой ВГВ-инфекции.

1.4. Диагностика скрытой ВГВ-инфекции.

1.4.1. Выявление поверхностного антигена ВГВ.

1.4.2. Определение вирусной ДНК.

1.4.3. Исследование биоптатов печени.

1.5. Распространенность скрытой ВГВ-инфекции.

1.6. Клиническая значимость скрытой ВГВ-инфекции.

1.6.1. Значение скрытой ВГВ-инфекции для службы крови.

1.6.2. Скрытая ВГВ-инфекция после самолимитирующегося острого гепатита В.

1.6.3. Скрытая ВГВ-инфекция у пациентов, имевших хронический вирусный гепатит В и утративших НВб

§.

1.6.4. Скрытая ВГВ-инфекция и фульминантная печеночная недостаточность.

1.6.5. Скрытая ВГВ-инфекция у пациентов с криптогенными хроническими заболеваниями печени.

1.6.6. Скрытая ВГВ-инфекция у реципиентов трансплантации органов и пациентов программного гемодиализа.

1.6.7. Скрытая ВГВ-инфекция и риск реактивации гепатита у иммунокомпромитированных лиц.

Резюме.

Глава 2. Материалы и методы исследования 2.1. Характеристика обследованных лиц

2.1.1. Условно здоровое население Республики Тыва.

2.1.2. Пациенты с хроническим гепатитом С.

2.1.3. Пациенты с хроническими заболеваниями печени, наиболее часто встречающимися на территории РФ.

2.2 Методы исследования

2.2.1. Серологические и молекулярные методы исследования.

2.2.2. Анализ нуклеотидных последовательностей ВГВ.

2.2.3. Микроскопическое и иммунохимическое исследование биоптатов печени.

2.2.4. Статистические методы исследования.

Глава 3. Результаты обследования населения Республики Тыва.

Глава 4. Выявление скрытой ВГВ-инфекции среди

HBsAg-нeгaтивныx пациентов с ХГС.

Глава 5. Результаты обследования пациентов с

HBsAg-нeгaтивными ХЗП различной этиологии.

Глава 6. Анализ нуклеотидных последовательностей участков генома ВГВ, выделенных от пациентов со скрытой ВГВ-инфекцией.

Глава 7. Обсуждение.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Скрытая инфекция, вызванная вирусом гепатита В: эпидемиологическая, вирусологическая и клинико-морфологическая характеристика"

Актуальность темы

Гепатит В (ГВ) представляет собой важнейшую медико-социальную проблему мирового здравоохранения. Считается, что ВГВ-инфекцию перенесло более половины населения Земли, при этом около 350 млн. имеют хронический гепатит В (ХГВ). Каждый год в мире регистрируется более 4 млн. случаев острого гепатита В (ОГВ) и около 1 млн. смертей в результате ВГВ-ассо-циированной патологии печени. До половины хронически инфицированных лиц погибают от таких осложнений заболевания, как печеночная недостаточность, цирроз печени (ЦП) и гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) [6]. В странах Азии и Африки ГЦК, ассоциированная с ВГВ-инфекцией, занимает ведущее место в структуре онкопатологии. Данная проблема существует и на территории Российской Федерации, имеющей регионы, эндемичные по ВГВ-инфекции. Высокий уровень заболеваемости, возможность хронизации инфекции, а также утрата больными трудоспособности и возможность летальных исходов влекут за собой огромный демографический и экономический ущерб для государства.

Открытие В.Б. В1шпЬег§ [15] поверхностного антигена ВГВ (HBsAg) в сыворотке крови австралийских аборигенов в 1965 г., последующее использование этого открытия в диагностике ГВ и создание вакцины сыграли решающую роль в предотвращении инфицирования миллионов людей. Появление методов детекции и количественной оценки ДНК ВГВ в сыворотке крови и ткани печени позволило повысить чувствительность выявления ВГВ-инфек-ции, определить критерии начала лечения и разработать способы оценки его эффективности, а секвенирование вирусной ДНК расширило возможности применения индивидуального подхода в лечении каждого пациента. Кроме того, на основании анализа нуклеотидных замен в ДНК вируса стало возможным оценить риск формирования резистентности при использовании того или иного противовирусного средства.

До недавнего времени считалось, что клинически ВГВ-инфекция может протекать в одной из трех форм (Санитарные правила РФ 3.1.1.2341-08):

1. острый ГВ (ОГВ), характеризующийся симптомами острого поражения печени и интоксикации (с желтухой или без нее) и отличающийся многообразием клинических проявлений и исходов заболевания;

2. хронический гепатит В (ХГВ), характеризующийся длительным воспалительным поражением печени, которое может переходить в более тяжелое заболевание — цирроз и первичный рак печени, оставаться без изменений или регрессировать под влиянием лечения или спонтанно;

3. длительное персистирование поверхностного антигена ВГВ (HBsAg) в сыворотке крови пациентов при отсутствии клинически выраженного гепатита.

Необходимым условием для диагностики ВГВ-инфекции, протекающей в одной из описанных форм, является определение НВбА§ в сыворотке крови.

Однако, еще в 1978 г. был зарегистрирован случай развития острого ГВ у реципиента после переливания крови, содержащей антитела к капсидному белку ВГВ (анти-НВс) в отсутствие HBsAg и антител к нему (анти-НВэ). В дальнейшем было показано, что ДНК вируса может определяться в сыворотке крови и ткани печени пациентов, у которых доступными методами не выявлялся сывороточный НВзА§. Данное явление получило название «скрытая (латентная) ВГВ-инфекция».

Следует отметить, что НВбА§ по-прежнему является основным, а порой и единственным маркером ВГВ, определяемым у доноров крови и других тканей. Так, в РФ в соответствии с санитарно-эпидемиологическими правилами СП 3.1.1.2341-08 для исключения ВГВ-инфекции у доноров крови используется только определение НВзА§.

В Международной классификации болезней Десятого пересмотра фигурирует диагноз «Хронический гепатит неуточненный» (К73.9), который ставится на основании наличия у пациентов гепатита при отсутствии данных о вирусном, токсическом, аутоиммунном или ином поражении печени. Само определение скрытой ВГВ-инфекции свидетельствует о том, что диагностический поиск, ограниченный исследованием НВзА§, окажется неэффективным, а инфицированные лица пополнят группу пациентов с гепатитом неустановленной этиологии.

Другим важным фактором, диктующим необходимость глубокого исследования скрытой ВГВ-инфекции, является возможность ее присутствия при ко-инфекции другими вирусами. Известно, что коинфекция ВГВ у пациентов с хроническим гепатитом С (ХГС) может в значительной мере сказываться на течении заболевания, уровне вирусной нагрузки, а также эффективности лечения. Отсутствие информации об особенностях течения ХГС при коинфек-ции ВГВ, протекающей в скрытой форме, не позволяет разработать рекомендации ведения соответствующих пациентов.

Необходимость исследования распространенности скрытой ВГВ-инфекции в различных группах населения также обусловлена ее возможным онко-генным потенциалом. ВГВ был одним из первых вирусов, для которых была подтверждена связь с канцерогенезом у человека. По разным оценкам ВГВ-инфекция является причиной формирования 60-80% случаев ГЦК, регистрируемых в мире [45]. Известно, что даже пациенты, имевшие ХГВ и утратившие НВзА§, находятся в группе риска формирования ГЦК. При этом факторами риска являются: перинатальное заражение, более 30 лет серопозитивно-сти по HBsAg и наличие цирроза печени [31].

Несмотря на возросший интерес к проблеме скрытой ВГВ-инфекции, наблюдающийся в последние годы, до настоящего момента не существует единого представления о распространенности данного явления в различных группах населения, а также его клинической значимости. Значительные расхождения в получаемых разными исследователями данных о распространенности скрытой ВГВ-инфекции связаны с использованием при определении HBsAg и ДНК ВГВ методов с различной чувствительностью, а также с тем, применялись ли в ходе исследования методы выявления ВГВ в ткани печени. Наиболее современные из применяемых тест-систем для иммуноферментного определения НВэА§ позволяют детектировать его в концентрации 0,01 нг/мл сыворотки крови. До настоящего времени результаты определения распространенности скрытой ВГВ-инфекции при использовании таких тест-систем не приводились. Кроме того, на настоящий момент наблюдается нехватка данных о патоморфологических изменениях в ткани печени при скрытой ВГВ-инфекции.

Цель работы

Определить эпидемиологические, молекулярно-вирусологические и клини-ко-морфологические особенности скрытой ВГВ-инфекции у лиц с высоким риском инфицирования ВГВ и пациентов с хроническими заболеваниями печени неуточненной этиологии.

Задачи

1. Определить встречаемость скрытой ВГВ-инфекции среди условно здорового населения Республики Тыва — региона РФ, эндемичного по гепатиту В.

2. Выявить скрытую ВГВ-инфекцию у НВБА§-негативных пациентов с хроническими заболеваниями печени, распространенными на территории РФ.

3. Дать молекулярную и клинико-морфологическую характеристику скрытой ВГВ-инфекции.

4. На основании результатов исследования оптимизировать алгоритм диагностики скрытой ВГВ-инфекции у лиц с высоким риском инфицирования ГВ и пациентов с ХЗП неустановленной этиологии.

Положения, выносимые на защиту

1. С использованием высокочувствительных методов детекции маркеров ВГВ (НВбА§ определялся тест-системой с чувствительностью 0,01 нг/мл; ДНК ВГВ — <125 копий/мл) установлена частота встречаемости скрытой ВГВ-инфекции среди условно здорового населения региона РФ, гиперэндемичного по ГВ (Республика Тыва) — 0,42%.

2. Выявленные случаи скрытой ВГВ-инфекции характеризуются минимальными клинико-биохимическими и морфологическими изменениями, а также низким уровнем виремии и отсутствием в структуре HBsAg аминокислотных замен, способных повлиять на эффективность его детекции в иммуноферментном анализе.

3. Определение ДНК ВГВ в гепатобиоптатах методом ПЦР с последующим электронномикроскопическим исследованием и иммуноцитохимической детекцией вирусных белков в рамках алгоритма обследования HBsAg-нe-гативных пациентов с хроническими заболеваниями печени позволяет выявлять скрытую ВГВ-инфекцию в ранее не диагностированных случаях.

Научная новизна

1. Скрытая ВГВ-инфекция в регионах с различной эндемичностью по ГВ выявлялась с использованием иммуноферментных тест-систем с высокой чувствительностью (HBsAg — 0,01 нг/мл).

2. С использованием электронной микроскопии и иммунохимических методов исследования биоптатов печени пациента со скрытой ВГВ-инфекцией проведено описание клеточных структур гепатоцитов.

3. По результатам анализа фрагментов последовательностей 8-гена ВГВ, выделенных из образцов сыворотки крови и ткани печени пациентов со скрытой ВГВ-инфекцией, показана их генетическая разнородность.

4. Представлены данные подтверждают нецелесообразность дальнейшего расширения спектра антител, используемых в тест-системах для иммуно-ферментного выявления НВбА§ при диагностике скрытой ВГВ-инфекции.

5. Предложено расширение алгоритма диагностики скрытой ВГВ-инфекции у лиц с высоким риском инфицирования ГВ и пациентов с хроническими заболеваниями печени неустановленной этиологии путем определения ДНК ВГВ в гепатобиоптате с последующим применением электронной микроскопии и иммунохимических методов детекции вирусных антигенов.

Практическая значимость

1. В ходе проведенного исследования установлено, что возможность диагностики скрытой ВГВ-инфекции зависит от чувствительности применяемых серологических, молекулярно-вирусологических и морфологических методов.

2. Применение предложенного алгоритма диагностики скрытой ВГВ-инфекции у лиц с высоким риском инфицирования ХЗП позволяет уточнить этиологию заболевания у лиц с гепатитом неустановленного генеза.

3. Дальнейшее улучшение серологической диагностики скрытой ВГВ-ин-фекции путем внесения антител к новым антигенным эпитопам при разработке иммуноферментных тест-систем является нецелесообразным.

Внедрение результатов и апробация работы

Алгоритм диагностики скрытой ВГВ-инфекции у лиц с высоким риском инфицирования ГВ и пациентов с хроническими заболеваниями печени неустановленной этиологии внедрен и применяется в научно-исследовательской работе клинического отделе и отдела вирусных гепатитов ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН.

Материалы диссертационной работы представлены в виде постерного доклада Р-39 на международном конгрессе по вирусным гепатитам 13th International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease (2009 г., Вашингтон), на VIH Российской конференции с международным участием «Вирусные гепатиты» (2009 г., пос. Московский, РФ), на XI Славяно-Балтийском научном форуме (2009 г., г. Санкт-Петербург), на XV Российской гастроэнтерологической неделе (2009 г., г. Москва), УШ Международном симпозиуме гепатологов Республики Беларусь «Актуальные вопросы гепатологии» (2009 г., Могилев, Республика Беларусь), ХУЛ Российском Национальном конгрессе «Человек и лекарство» (2010 г., г. Москва).

Апробация диссертации состоялась 19 августа 2010 г. на заседании Ученого совета Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН (протокол №1 от 19 августа 2010 г.).

Публикации по теме диссертации

По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе 2 статьи — в реферируемых журналах ВАК.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 115 страницах текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав собственных исследований и обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 6 отечественных и 103 зарубежных источника. Диссертационная работа иллюстрирована 25 таблицами, 15 рисунками и имеет 2 иллюстрированных приложения.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Гордейчук, Илья Владимирович

Выводы

1. Встречаемость скрытой ВГВ-инфекции среди условно здорового населения Республики Тыва — региона, эндемичного по ВГВ-инфекции, оцененная с использованием тест-системы для диагностики НВбА§ с чувствительностью 0,01 нг/мл и ПЦР с чувствительностью <125 копий ДНК ВГВ/мл, составила 0,42% (2/481).

2. Исследование сывороток крови HBsAg-нeгaтивныx лиц в неэндемичном по ВГВ регионе РФ (г. Москва) показало, что вероятность присутствия скрытой ВГВ-инфекции низкая даже в группах пациентов с повышенным риском инфицирования ВГВ. При исследовании сывороток крови 200 пациентов с ХГС и 142 пациентов с НВзАц-негативными ХЗП ни одного случая скрытой ВГВ-инфекции выявлено не было. ДНК ВГВ была обнаружена в биоптате печени у 1 из 50 пациентов с HBsAg-нeгaтивными ХЗП.

3. Выявление морфологических признаков гепатита и фиброза печени при углубленном анализе случая скрытой ВГВ-инфекции свидетельствует о клинической значимости данной формы инфекции.

4. Ни в одном из случаев скрытой ВГВ-инфекции в нуклеотидных последовательностях вирусного генома не было выявлено мутаций, способных обусловить снижение эффективности детекции HBsAg в иммунофермент-ных тест-системах. У всех пациентов со скрытой ВГВ-инфекцией отсутствие HBsAg в сыворотке крови ассоциировалось с низким уровнем вирусной нагрузки.

5. Разработан алгоритм диагностики скрытой ВГВ-инфекции среди лиц с высоким риском инфицирования ГВ и пациентов с хроническим гепатитом неустановленной этиологии, включающий исследование биоптатов печени с применением молекулярных, электронномикроскопических и иммуноцитохимических методов.

Практические рекомендации

1. В обследование пациентов ХЗП неуточненной этиологии необходимо включать диагностический поиск скрытой ВГВ-инфекции.

2. Использование высокочувствительных методов определения HBsAg (чувствительность теста не менее 0,01 нг/мл) и ДИК ВГВ (чувствительность теста не менее 100-150 копий/мл) позволит улучшить диагностику ВГВ-инфекции и снизить вероятность ее трансмиссии от HBsAg-нeгaтивныx пациентов.

3. Диагностика скрытой ВГВ-инфекции у пациентов с ХЗП неустановленной этиологии должна проводиться с определением ДНК ВГВ в ткани печени, а также с использованием специфических морфологических методов (электронная микроскопия, иммуногистохимическое и иммуноцито-химическое исследования).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Гордейчук, Илья Владимирович, Москва

1. Вирусные гепатиты в Российской Федерации 2009. Справочник / Под ред. Г.Г. Онищенко, А.Б. Жербуна. — СПб.: НИЭМ им. Пастера, 2009. — С. 17-41.

2. Ганина А. Лабораторная диагностика и эпидемиология скрытого HBsAg-негативного гепатита В // Труды Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова. — 2007. — №24. — С. 163— 170.

3. Идрисова Л.Р, Кюрегян К.К., Лопаткина Т.Н. и др. Применение высокочувствительной ПЦР для выявления крытой HBV-инфекции у больных с хроническими гепатитами // Клиническая и лабораторная диагностика. — 2005. — № 9. — С. 54.

4. Подымова С.Д. Болезни печени. 3-е изд. — М.: Медицина, 1998. — 708 с.

5. Шахгильдян И.В., Михайлов М.И., Онищенко Г.Г. Парентеральные вирусные гепатиты (эпидемиология, диагностика, профилактика). — М.: ФГОУ «ВУНМЦ Росздрава», 2003. — С. 22-27.

6. Aach R.D., Alter H.J., Hollinger F.B. et al. Risk of transfusing blood containing antibody to hepatitis-B surface antigen // Lancet. — 1974. —Vol. —2. —P. 190-193.

7. Aoki M., Saito Т., Watanabe H. et al. Clinical significance of a highly sensitive enzyme immunoassay of hepatitis В surface antigen using a novel electron spin resonance technique // J. Med. Virol. — 2002. — Vol. 2. — P. 166-170.

8. Bartenschlager R., Junker-Niepmann M., Schaller H. The P gene product of hepatitis B virus is required as a structural component for genomic RNAencapsidation// J. Virol. — 1990. — Vol. 11. —P. 5324-5332.

9. Beck J., Nassal M. Hepatitis B virus replication // World J. Gastroenterol. — 2007. — Vol. 1. — P. 48-64.

10. Bellecave P., Gouttenoire J., Gajer M. et al. Hepatitis B and C virus coinfection: a novel model system reveals the absence of direct viral interference // Hepatology. — 2009. — Vol. 1. — P. 46-55.

11. Berasain C., Betes M., Panizo A. et al. Pathological and virological findings in patients with persistent hypertransaminasaemia of unknown aetiology // Gut. — 2000. — Vol. 3. — P. 429-435.

12. Besisik F., Karaca C., Akyuz F. et al. Occult HBV infection and YMDD variants in hemodialysis patients with chronic HCV infection // J. Hepatol.2003. — Vol. 4. — P. 506-510.

13. Bloquel B., Jeulin H., Burty C. et al. Occult hepatitis B infection in patients infected with HIV: report of two cases of hepatitis B reactivation and prevalence in a hospital cohort // J. Med. Virol. — 2010. — Vol. 2. — P. 206-212.

14. Blumberg B.S., Alter H.J., Visnich S. A "new" antigen in leukemia sera // JAMA. —1965. —Vol. 191. —P. 541-546.

15. Bock C.T., Schwinn C., Locarnini S. et al. Structural organization of the hepatitis B virus minichromosome // J. Mol. Biol. — 2001. — Vol. 1. — P. 183-196.

16. Brechot C. Pathogenesis of hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma: old and new paradigms // Gastroenterology. — 2004. —Vol. 5.1. P. 56-61.

17. Cacciola I., Pollicino T., Squadrito G. et al. Occult hepatitis B virus infection in patients with chronic hepatitis C liver disease // N. Engl. J. Med. — 1999.1. Vol. 1. —P. 22-26.

18. Cacoub P., Terrier B. Hepatitis B-related autoimmune manifestations // Rheum. Dis. Clin. North Am. — 2009. — Vol. 1. — P. 125-137.

19. Carman W.F. The clinical significance of surface antigen variants of hepatitis B virus // J. Viral Hepat. — 1997. — Vol. 4. — P. 11-20.

20. Carman W.F., Korula J., Wallace L. et al. Fulminant reactivation of hepatitis B due to envelope protein mutant that escaped detection by monoclonal HBsAg ELISA// Lancet. — 1995. — Vol. 345. — P. 1406-1407.

21. Carman W.F., Zanetti A.R., Karayiannis P. et al. Vaccine-induced escape mutant of hepatitis B virus // Lancet. — 1990. —Vol. 336. — P. 325-329.

22. Chan H.L. Tsang S.W-C., Leung N.W-Y. et al. Occult HBV infection in cryptogenic liver cirrhosis in an area with high prevalence of HBV infection //Am. J. Gastroenterol. — 2002. — Vol. 5. — P. 1211-1215.

23. Chazouilléres O., Mamish D., Kim M. et al. "Occult" hepatitis B virus as source of infection in liver transplant recipients // Lancet. — 1994. — Vol. 343. —P. 142-146.

24. Chemin I., Zoulim F., Merle P. et al. High incidence of hepatitis B infections among chronic hepatitis cases of unknown aetiology // J. Hepatol. — 2001. — Vol. 3.—P. 447-454.

25. Chen C., Yang H., Iloeje U.H. Hepatitis B virus DNA levels and outcomes in chronic hepatitis B // Hepatology. — 2009. — Vol. 5. — P. 72-84.

26. Chen D.S. Natural history of chronic hepatitis B virus infection: new light on an old story // J. Gastroenterol. Hepatol. — 1993. — Vol. 5. — P. 470-475.

27. Cheung W., Chan H.L-Y., Leung V.K-S. et al. Reactivation of hepatitis B virus infection with persistently negative HBsAg on three HBsAg assays in alymphoma patient undergoing chemotherapy // J. Clin. Virol. — 2010. — Vol. 2. —P. 193-195.

28. Chisari F.V., Pasquinelli C., Shoenberger J.M., et al. Hepatitis С virus core and E2 protein expression in transgenic mice // Hepatology. — 1997. —Vol. 3.—P. 719-727.

29. Chon C.Y., Ahn S.H., Park Y.N et al. Long-term clinical and histological outcomes in patients with spontaneous hepatitis В surface antigen seroclearance // J. Hepatol.— 2005. —Vol.42. — P. 188-194.

30. Dhédin N., Douvin C., Kuentz M. et al. Reverse seroconversion of hepatitis В after allogeneic bone marrow transplantation: a retrospective study of 37 patients with pretransplant anti-HBs and anti-HBc // Transplantation. — 1998. — Vol. 5. — P. 616-619.

31. Douglas D.D., Rakela J., Wright T.L., Krom R.A. et al. The clinical course of transplantation-associated de novo hepatitis В infection in the liver transplant recipient // Liver Transpl Surg. — 1997. — Vol. 2. — P. 105-111.

32. Echevarría J., González R., Torres P. et al. Efficacy of hepatitis В virus (HBV) DNA screening and characterization of acute and occult HBV infections among blood donors from Madrid, Spain // Transfusion. — 2010.1. Vol. 1. —P. 221-230.

33. El-Sherif A., Abou-Shady M., Abou-Zeid H. et al. Antibody to hepatitis В core antigen as a screening test for occult hepatitis В virus infection in Egyptian chronic hepatitis С patients // J. Gastroenterol. — 2009. — Vol. 4.1. P. 359-364.

34. Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap // Evol. — 1985. — Vol. 39. — P. 783-791.

35. Ganem D., Prince A.M. Hepatitis B virus infection — natural history and clinical consequences // N. Engl. J. Med. — 2004. — Vol. 11. — P. 1118— 1129.

36. Gerlich W.H., Brener C., Saniewski M. et al. Occult hepatitis B virus infection: detection and significance // Dig Dis. — 2010. — Vol. 1. — P. 116-125.

37. Gerlich W.H., Glebe D., Schüttler C.G. Deficiencies in the standardization and sensitivity of diagnostic tests for hepatitis B virus // J. Viral Hepat. — 2007. —Vol. 1.—P. 16-21.

38. Gu H., Fang Y., Shang Q.L. et al. Prevalence of occult hepatitis B virus infection among hepatopathy patients and healthy people in China // J. Infect. — 2009. — Vol. 5. — P. 383-388.

39. Hamatake R.K., Lau J.Y.N. Hepatitis B and B protocols // Humana press Inc.2004. —Vol.1.

40. Hass M., Hannoun C., Kalinina T. et al. Functional analysis of hepatitis B virus reactivating in hepatitis B surface antigen-negative individuals // Hepatology. — 2005. — Vol. 1. — P. 93-103.

41. Hepatitis B virus edited by Lai C.L. & Locarnini S. 2-nd edition. — International Medical Press Ltd, 2008.

42. Hollinger F.B. Hepatitis B virus infection and transfusion medicine: science and the occult // Transfusion. — 2008. — Vol. 5. — P. 1001-1026.

43. Hoofnagle J.H. Reactivation of hepatitis B // Hepatology. — 2009. — Vol. 5.1. P. 156-165.

44. Hoofnagle J.H., Carithers R.L., Shapiro C., Ascher N. Fulminant hepatic failure: summary of a workshop // Hepatology. — 1995. —Vol. 1. — P. 240-252.

45. Hui C., Leung N., Yuen S-T. et al. Natural history and disease progression in Chinese chronic hepatitis B patients in immune-tolerant phase // Hepatology.2007. — Vol. 2. —P. 395-401.

46. Hui C., Sun J., Au W.Y. et al. Occult hepatitis B virus infection in hematopoietic stem cell donors in a hepatitis B virus endemic area // J. Hepatol. — 2005. — Vol. 6. — P. 813-819.

47. Hunt C.M., McGill J.M., Allen M.I., Condreay L.D. Clinical relevance of hepatitis B viral mutations // Hepatology. — 2000. — Vol. 5. — P. 10371044.

48. Ie S.I., Thedja M.D., Roni M. et al. Prediction of Conformational Changes by Single Mutation in the Hepatitis B Virus Surface Antigen (HBsAg) Identified in HBsAg-Negative Blood Donors // Virol J. — 2010. — Vol. 1.1. P. 326.

49. Iizuka H., Ohmura K.5 Ishijima A. Correlation between anti-HBc titers and HBV DNA in blood units without detectable HBsAg // Vox Sang. — 1992.1. Vol. 2. —P. 107-111.

50. Ilan Y., Nagler A., Zeira E. et al. Maintenance of immune memory to the hepatitis B envelope protein following adoptive transfer of immunity in bone marrow transplant recipients // Bone Marrow Transplant. — 2000. — Vol. 6.1. P. 633-638.

51. Jeantet D. Chemin I., Mandrand B. et al. Cloning and expression of surface antigens from occult chronic hepatitis B virus infections and their recognition by commercial detection assays // J. Med. Virol. — 2004. —Vol. 4. —P. 508-515.

52. Kao J. Diagnosis of hepatitis B virus infection through serological and virological markers // Expert Rev Gastroenterol Hepatol. — 2008. — Vol. 4.1. P. 553-562.

53. Katchaki J.N., Siem T.H., Brouwer R. Serological evidence of presence of HBsAg undetectable by conventional radioimmunoassay in anti-HBc positive blood donors // J. Clin. Pathol. — 1978. — Vol. 9. — P. 837-839.

54. Katz L.H., Fraser A., Gafter-Gvili A. et al. Lamivudine prevents reactivation of hepatitis B and reduces mortality in immunosuppressed patients: systematic review and meta-analysis // J. Viral Hepat. — 2008. — Vol. 2. — P. 89-102.

55. Khudyakov Y. Coevolution and HBV drug resistance // Antivir. Ther. (Lond.). —2010. — Vol. 3. — P. 505-515.

56. Kimbi G.C., Kramvis A., Kew M.C. Integration of hepatitis B virus DNA into chromosomal DNA during acute hepatitis B // World J. Gastroenterol. — 2005. — Vol. 41. — P. 6416-6421.

57. Komori M., Yuki N., Nagaoka T. et al. Long-term clinical impact of occult hepatitis B virus infection in chronic hepatitis B patients // J. Hepatol. — 2001. — Vol. 6. — P. 798-804.

58. Lalazar G., Rund D., Shouval D. Screening, prevention and treatment of viral hepatitis B reactivation in patients with haematological malignancies // Br. J. Haematol. — 2007. — Vol. 5. — P. 699-712.

59. Lavanchy D. Hepatitis B virus epidemiology, disease burden, treatment, and current and emerging prevention and control measures // J. Viral Hepat. — 2004. — Vol. 2. — P. 97-107.

60. Leistner C.M., Gruen-Bernhard S., Glebe D. Role of glycosaminoglycans for binding and infection of hepatitis B virus // Cell. Microbiol. — 2008. —Vol. 1. —P. 122-133.

61. Leung N. Chronic hepatitis B in Asian women of childbearing age // Hepatol Int. — 2009. — Vol. 3. — P. 24-31.

62. Levast M., Larrat S., Thelu M-A. et al. Prevalence and impact of occult hepatitis B infection in chronic hepatitis C patients treated with pegylated interferon and ribavirin // J. Med. Virol. — 2010. — Vol. 5. — P. 747-754.

63. Loriot M.A., Marcellin P., Walker F. et al. Persistence of hepatitis B virus DNA in serum and liver from patients with chronic hepatitis B after loss of HBsAg // J. Hepatol. — 1997. — Vol. 2. — P. 251-258.

64. Luo K., Hou J., Wang Z. et al . Prevalence of naturally occurring surface gene variants of hepatitis B virus in nonimmunized surface antigen-negative Chinese carriers // Hepatology. — 2001. — Vol. 5. — P. 1027-1034.

65. Madejon A., Manzano M.L., Arocena C. et al. Effects of delayed freezing of liver biopsies on the detection of hepatitis C virus RNA strands // J. Hepatol. — 2000.—Vol. 6.—P. 1019-1025.

66. Marusawa H., Uemoto S., Hijikata M. et al. Latent hepatitis B virus infection in healthy individuals with antibodies to hepatitis B core antigen // Hepatology. — 2000. — Vol. 2. — P. 488-495.

67. Mason A., Sallie R., Perrillo R. et al. Prevalence of herpesviridae and hepatitis B virus DNA in the liver of patients with non-A, non-B fulminant hepatic failure // Hepatology. — 1996. — Vol. 6. — P. 1361-1365.

68. Matsuoka S., Moriyama K., Nirei K. et al. Influence of occult hepatitis B virus coinfection on the incidence of fibrosis and hepatocellular carcinoma in chronic hepatitis C // Intervirology. — 2008. — Vol. 5. — P. 352-361.

69. McMahon B.J., Hoick P., Bulkow L., Snowball M. Serologic and clinical outcomes of 1536 Alaska Natives chronically infected with hepatitis B virus // Ann. Intern. Med. — 2001. — Vol. 9. — P. 759-768.

70. Medrano F.J., Sanchez-Quijano A., Pineda J., Lissen E. Isolated anti-HBc and hepatitis B virus occult infection // Vox Sang. — 1991. — Vol. 2. — P. 140.

71. Nakajima E., Fujii H., Moriyama K. et al. Glyl45 to Arg substitution in HBs antigen of immune escape mutant of hepatitis B virus // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 1992. — Vol. 3. — P. 1152-1157.

72. Nassal M., Junker-Niepmann M., Schaller H. Translational inactivation of RNA function: discrimination against a subset of genomic transcripts during HBV nucleocapsid assembly// Cell. — 1990. — Vol. 6. — P. 1357-1363.

73. Neau D., Lafon M-E., Dabis F., Winnock M. Occult hepatitis B virus infection in HIV-infected patients with isolated antibodies to hepatitis B core antigen: Aquitaine cohort, 2002-2003 // Clin. Infect. Dis. — 2005. — Vol. 5.1. P. 750-753.

74. Norman J.E., Beebe G.V., Hoofnagle J.H., Seff L.B. Mortality follow-up of the 1942 epidemic of hepatitis B in the U.S. Army // Hepatology. — 1993. — Vol. 4. —P. 790-797.

75. Ogata N. Zanetti A.R., Yu M. et al. Infectivity and pathogenicity in chimpanzees of a surface gene mutant of hepatitis B virus that emerged in a vaccinated infant // J. Infect. Dis. — 1997. — Vol. 3. — P. 511-523.

76. Okamoto H., Omi S., Wang Y. et al. The loss of subtypic determinants in alleles, d/y or w/r, on hepatitis B surface antigen // Mol. Immunol. — 1989.1. Vol. 2.—P. 197-205.

77. Onozawa M., Hashino S., Darmanin S. HB vaccination in the prevention of viral reactivation in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation recipients with previous HBV infection // Biol. Blood Marrow Transplant. — 2008.—Vol. 11. —P. 1226-1230.

78. Pollicino T., Navarra G., Mondello S. et al. Occult hepatitis B virus in liver tissue of individuals without hepatic disease // J. Hepatol. — 2008. — Vol. 5.1. P. 743-746.

79. Pollicino T., Raimondo G., Navarra G., et al. Occult hepatitis B virus in liver tissue of individuals without hepatic disease // J. Hepatol. — 2008. — Vol. 5.1. P. 743-746.

80. Prange R., Weir M., Loffler-Mary H. Chaperones involved in hepatitis B virus morphogenesis // Biol. Chem. — 1999. — № 3. — P. 305-314.

81. Saisho H., Imamura T., Yokosuka O. et al. Lamivudine treatment in a patient with hepatitis B virus reactivation after allogenic peripheral bone marrow transplantation // Leuk. Lymphoma. — 2005. — Vol. 6. — P. 915-917.

82. Saitou N., Nei M. The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees // Molec. Biol. Evol. — 1987. — Vol. 4. — P. 406-425.

83. Saldanha J., Gerlich W., Leile N. et al. An international collaborative study to establish a World Health Organization international standard for hepatitis B virus DNA nucleic acid amplification techniques // Vox Sang. — 2001. — Vol. 1. —P. 63-71.

84. Satake M., Taira R., Yugi H. et al. Infectivity of blood components with low hepatitis B virus DNA levels identified in a lookback program // Transfusion.2007.—Vol. 47.—P. 1197-1205.

85. Seitz S., Urban S., Antoni C., Böttcher B. Cryo-electron microscopy of hepatitis B virions reveals variability in envelope capsid interactions // EMBO J. —2007. —Vol. 18. —P. 4160-4167.

86. Sengupta S., Rehman S., Durgapal H. et al. Role of surface promoter mutations in hepatitis B surface antigen production and secretion in occult hepatitis B virus infection // J. Med. Virol. — 2007. — Vol. 3. — P. 220-228.

87. Sheldon J., Soriano V. Hepatitis B virus escape mutants induced by antiviral therapy // J. Antimicrob. Chemother. — 2008. — Vol. 4. — P. 766-768.

88. Sherlock S., Parbhoo S.P. The management of acute hepatic failure // Postgrad Med J. — 1971. — Vol. 47. — P. 493-498.

89. Shire N.J., Rouster S.D., Rajicic N., Sherman K.E. Occult hepatitis B in HIV-infected patients // J. Acquir. Immune Defic. Syndr. — 2004. —Vol. 3.1. P. 869-875.

90. Simonetti J., Bulkow L., McMahon B.J. et al. Clearance of hepatitis B surface antigen and risk of hepatocellular carcinoma in a cohort chronically infected with hepatitis B virus // Hepatology. — 2010. — Vol. 5. — P. 1531— 1537.

91. Tallo T., Tefanova V., Priimagi L. D2: major subgenotype of hepatitis B virus in Russia and the Baltic region // J Gen Virol. — 2008. — Vol. 8. — P.• 1829-1839.

92. Tamura K., Dudley J., Nei M., Kumar S. Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0 // Molec. Biol. Evol. — 2007. — Vol. 24.—P. 1596-1599.

93. Teo E.K., Ostapowicz G., Hussain M. et al. Hepatitis B infection in patients with acute liver failure in the United States // Hepatology. — 2001. — Vol. 4.1. P. 972-976.

94. Torbenson M., Kannangai R., Astemborski J. et al. High prevalence of occult hepatitis B in Baltimore injection drug users // Hepatology. — 2004. — Vol. 1. —P. 51-57.

95. Torres-Baranda R., Bastidas-Ramírez B.E., Maldonado-González M., Sánchez-Orozco L.V. Occult hepatitis B in Mexican patients with HIV, an analysis using nested polymerase chain reaction // Ann Hepatol. — 2006. — Vol. 1. —P. 34-40.

96. Wachs M.E., Amend W.J., Acher N.L. et al. The risk of transmission of hepatitis B from HBsAg(-), HBcAb(+), HBIgM(-) organ donors // Transplantation. — 1995. —Vol. 2. — P. 230-234.

97. Wagner A.A., Denis F., Weinbreck P. et al. Serological pattern 'anti-hepatitis B core alone' in HIV or hepatitis C virus-infected patients is not fully explained by hepatitis B surface antigen mutants //AIDS. — 2004. —Vol. 3. — P. 569-571.

98. Wang J.T., Sheu J.C., Lin J.T. et al. Minimal role of hepatitis B virus in posttransfusion non-A, non-B hepatitis in Taiwan: a study by polymerase chain reaction // J. Formos. Med. Assoc. — 1991. —Vol. 5. — P. 471-475.

99. Yang M., Li 1., Hung Y.S. et al. The efficacy of individual-donation and minipool testing to detect low-level hepatitis B virus DNA in Taiwan // Transfusion. — 2010. — Vol. 1. — P. 65-74.

100. Yotsuyanagi H., Hino K., Kimura S. et al. Frequent presence of HBV in the sera of HBsAg-negative, anti-HBc-positive blood donors // Transfusion. — 2001.—Vol.9. —P. 1093-1099.