Скрининг продуцентов бактериоцинов среди бактерий, выделенных из различных источников

Горбатко, Екатерина Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Скрининг продуцентов бактериоцинов среди бактерий, выделенных из различных источников
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Скрининг продуцентов бактериоцинов среди бактерий, выделенных из различных источников"

На правах рукописи

Горбатко Екатерина Сергеевна

Скрининг продуцентов бактериоцинов среди бактерий, выделенных из различных источников

03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2009

003459373

Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, г. Москва и в ГОУ ВПО Московском государственном университете прикладной биотехнологии, г. Москва

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор кандидат технических наук

Блинкова Лариса Петровна Машенцева Наталья Геннадьевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

Баснакьян Ирина Арташесовна Лиходед Владимир Гаврилович

Ведущая организация:

ГОУ ВПО Российский Государственный Медицинский Университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Защита состоится « с^^Цд^-З. 2009 г. в часов на заседании

Диссертационного совета Д 001.035.01 при ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН по адресу: 105064, г. Москва, Малый Казенный переулок, д. 5а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН.

Автореферат разослан « г.

Учёный секретарь диссертационного Совета

кандидат биологических наук > " И.В.Яковлева

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Бактериоцины - это синтезируемые бактериями антимикробные вещества белковой природы, различающиеся по спектру и способу действия, локализации генетических детерминант, биохимическим свойствам. Бактериоцины имеют как узкий, так и широкий спектр активности, что особенно характерно для бактериоцинов грамположительных бактерий (Jacob F., 1953; Кудлай Д.Г., Лиходед В.Г., 1966; Tagg I., 1976; Блинкова Л.П., 2003).

Общепринятыми критериями бактериоцинов являются (Tagg J:, 1976; Блинкова Л.П., 1986): антибактериальное действие синтезируемых штаммом субстанций на близкородственные микроорганизмы; иммунитет продуцента к собственному бактериоцину; образование «лакун» - проявление летального синтеза бактериоцина для единичной клетки-продуцента; отсутствие литического действия, свойственного ферментам; принадлежность к белкам (низкомолекулярным или высокомолекулярным).

В связи с необходимостью поиска новых лекарственных средств, обусловленной недостатками традиционных антибиотиков, в последнее время возродился интерес к бактериоцинам (Kalmokoff М., 1996; Тео А., 2005).

Известно, что эффективность действия пробиотических культур, помимо активизации факторов иммунитета, связана также с антибактерйальным действием этих штаммов, обусловленным синтезом бактериоцинов (Стоянова Л.Г., 2008). В составе пробиотических препаратов бактериоцины и продуцирующие их штаммы, посредством избирательного воздействия на микрофлору, нормализуют микробный ценоз при некоторых патологиях у человека и животных (Reid G., 2002).

Однако вопрос частоты встречаемости бактериоцинпродуцирующих бактерий среди отдельных таксономических групп микроорганизмов, а также физиолого-биохимических особенностей микробов-антагонистов, изучен недостаточно (Padilla С., 2001).

Следует также отметить, что для стран с развитой пищевой промышленностью наиболее актуальным является вопрос поиска безвредных и эффективных средств, увеличивающих сроки хранения продуктов питания. Вместо традиционных химических консервантов с этой целью начали применять бактериоцины и бактерии-продуценты (АЬее Т., 1995; Ross R., 1999; Cleveland J., 2001; Millette M., 2004).

Наиболее изученным считается бактериоцин низин, продуцируемый некоторыми штаммами Lactococcus ¡actis (Стоянова Л.Г., 2008), и его стандартизованный препарат низаплин, производителем которого является компания «Aplin&Barrett Ltd» (Великобритания) (de Vuyst L., 1994). Известно, что бактерии образуют широкий спектр бактериоцинов, которые тоже имеют практический потенциал, однако, прикладные исследования бактериоцинов как ,

консервантов касаются, в основном, низина (de Vuyst L., 1994; Cintas L., 1998j Ross R., 1999; Friedrich-Karl L., 2003; Ghrairi Т., 2004).

Поиск природных консервантов, отвечающих требованиям потребителей и производителей - также важный вопрос для нашей страны. К сожалению, изучение бактериоцинов в России ведется в недостаточной степени (Червинец В.М., 2007).

В связи с тем, что генетически обусловленная возможность синтеза бактериоцинов у микробов наиболее полно экспрессируется при оптимально подобранных условиях культивирования (Leroy F., 1998; de Vuyst L., 1999; Cheigh С., 2002; Блинкова Л.П. 2003), достижение максимальной продукции антимикробного вещества требует экспериментального подбора питательных сред и режимов культивирования.

Таким образом, проблема поиска и изучения свойств новых бактериоцинпродуцирующих штаммов, перспективных для последующего создания медицинских препаратов, а также для использования в пищевой промышленности, является актуальной.

Цель работы - проведение скрининга продуцентов бактериоциноподобных веществ и бактериоцинов среди микроорганизмов, выделенных из продуктов питания, объектов окружающей среды и клинического материала.

Задачи исследования:

1. Отобрать штаммов-антагонистов среди культур, выделенных из пищевых продуктов, объектов окружающей среды, клинического материала, и изучить физиолого-биохимические свойства наиболее активных продуцентов.

2. Подобрать питательную среду и основные параметры культивирования для роста выбранных продуцентов и синтеза антибактериальных веществ.

3. Доказать принадлежность к бакгериоцинам ингибиторных субстанций, продуцируемых высокоактивными штаммами.

4. Исследовать воздействие физико-химических факторов на антибактериальную активность бактериоцинов.

Научная новизна.

Получена информация о частоте встречаемости штаммов-антагонистов среди микроорганизмов, выделенных из продуктов питания, объектов окружающей среды и клинических образцов.

Впервые выделены нетоксичные бесплазмидные штаммы Micrococcus luteus С-1, С-3, С-5, С-7, продуцирующие бактериоцины (микрококцины).

Антибактериальная активность микрококцинов, синтезированных штаммами М. luteus С-1, С-3, С-5, С-7, сохраняется при кипячении 60 мин, автоклавировании при 112°С - 20 мин, в условиях рН от 2,0 до 10,0 и 7,5% NaCl, при однократном замораживании и оттаивании.

Практическая значимость.

Создана лабораторная коллекция оригинальных бактериоцин-синтезирующих культур, которые могут быть использованы при разработке

антибактериальных препаратов для медицины, пищевой промышленности и в научных исследованиях.

Штамм Micrococcus luteus NCTC 2665 предлагается для дальнейшего изучения в качестве индикатора при скрининге бактериоцинпродуцирующих микроорганизмов разных таксономических групп.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Среди изученных при скрининге штаммов, изолированных из воздуха, воды, продуктов питания и клинических образцов, антибактериальной активностью обладали 57,8 %.

2. Охарактеризованы и идентифицированы как Micrococcus luteus С-1, С-3, С-5, С-7 высокоактивные штаммы-антагонисты, перспективные для дальнейшего изучения с целью практического применения.

3. Подобрана питательная среда и основные режимы культивирования, обеспечивающие одновременный рост штаммов Micrococcus luteus С-1, С-3, С-5, С-7 и синтез микрококцинов.

4. Антибактериальные вещества, синтезируемые штаммами Micrococcus luteus С-1, С-3, С-5, С-7, относятся к бактериоцинам и обладают высокой устойчивостью к действию изученных физико-химических факторов.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 155 страницах, состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 240 работ отечественных и зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 21 рисунком.

Апробация материалов диссертации. Апробация диссертации состоялась на научной конференции отдела микробиологии ГУ НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН 10 ноября 2008 г. Материалы диссертации представлены на Выездном пленуме НОГР клшшко-патогенетические аспекты желудочно-кишечного дисбиоза при заболеваниях органов пищеварения: диагностика, лечение и профилактика (Москва, 10-11 ноября 2005 г.), Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология. Совершенствование иммуно-биологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 12-22 ноября 2006 г.), Международном конгрессе «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические аспекты» (Санкт-Петербург, 15-16 мая 2007 г.), IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007 г.), III и IV Московских международных Конгрессах "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 1418 марта 2005 г. и 12-16 марта 2007 г.). Материалы диссертации, представленные на Конкурс молодых ученых в рамках Международной научно-практической конференции "Биотехнология. Вода и пищевые продукты" (11-13 марта 2008 г.), награждены медалью и дипломом.

Содержание работы

Материалы и методы исследования

Бактериальные штаммы. Молочнокислые микроорганизмы для проведения экспериментов взяты из лабораторной коллекции Московского государственного университета прикладной биотехнологии. Клинические штаммы для исследования получены из лаборатории микробиологии условно патогенных бактерий ГУ НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН (40 штаммов), из Городской клинической больницы № 15 им! О.М. Филатова (56 штаммов), из Научного центра здоровья детей РАМН (58 штаммов).

В качестве тест-культур использованы следующие отечественные и международные музейные штаммы: Micrococcus luteus NCTC 2665, Staphylococcus aureus Wood 46, Staphylococcus aureus ATCC 6538-P, Staphylococcus aureus FDA 209P, Escherichia coli M-l, Escherichia coli 168/59, Escherichia coli Su 3912/41, Escherichia coli K12S, Escherichia coli С 600 Salmonella enterica Typhimurium LT2, Salmonella enterica Abony IHE 103/39, Salmonella enterica Typhi H 901 ГДР, Shigella sonnei «S-form», Providencia rettgeri 1, Proteus vulgaris R-8, Proteus vulgaris ATCC 1331, Enterobacter aerogenes 418, Klebsiella pneumoniae 1954, Serratia plymuthica 1, Enterococcus durans 8/62, Enterococcus faecalis 1, Alcaligenes faecalis 415, Pseudomonas aeruginosa 27/99, Pseudomonas aeruginosa 9022, Candida albicans ATCC 885-653.

Контрольным бактериоцинпродуцирукмцим штаммом являлся колициногенный штамм Escherichia coli AB 247 (col I).

Питательные среды. В исследовании использовали диффузионные среды АГВ (НПО «Питательные среды», г. Махачкала) и Мюллера-Хинтона («HiMedia», Индия), традиционные питательные среды для выращивания широкого набора микроорганизмов - СПА, СПБ (НПО «Питательные среды», г. Махачкала), L-бульон и LB-бульон («Difco», США), триптиказо-соевый бульон - ТСБ («Difco», США), среда Тодда-Хьюитта («Difco», США), лактагар и МРС-агар («НИЦФ», г. Санкт-Петербург), а также минимальную среду М9 и пять созданных нами сред: №1, №2, №3, СПАС №26, СПАС №4а.

Состав среды № 1 (г/л): бактопептон («Difco», США) - 20, глюкоза («Maize products», Индия) - 2,5, NaCl - 5, К2НРО4 («Реатэкс», г. Москва)- 2,5 (pH 7,2±0,2).

Состав среды № 2 (г/л): бактопептон («Difco», США) - 20, глюкоза («Maize products», Индия) - 2,5, NaCl - 5, К2НР04 («Реатэкс», г. Москва)- 2,5, триптон соевый («Difco», США) - 3 (pH 7,2±0,2).

Состав среды № 3 (г/л): бактопептон («Difco», США) - 10, дрожжевой экстракт («Рапгеас», Испания) - 1, NaCl - 5, К2НРО4 («Реатэкс», г. Москва) - 2 (pH 7,2±0,2).

Состав среды СПАС № 26 (г/л): пептон ферментативный («Бастион», г. Курск) - 10, гидролизат соевой муки («НИЦФ», г. Санкт-Петербург) — 10, К2НР04 («Реатэкс», г. Москва) - 2,5, NaCl (ОАО «МЗХР», р.п. Малиновое

озеро) -5, дрожжевой экстракт («Рапгеас», Испания) - 1, крахмал («НПОК», г. Коренево}- 2,5 (pH 7,2±0,2).

Состав среды СПАС № 4а (г/л): ферментативный гидролизат казеина («ФГУН ГНЦ ПМБ», г. Оболенск)- 10, гидролизат соевой муки («НИЦФ», г. Санкт-Петербург) - 10, NaCl (ОАО «МЗХР», р.п.Малиновое озеро) - 5, дрожжевой экстракт («Рапгеас», Испания) - 1, глюкоза («Maize products», Индия)-2,5 (pH 7,2±0,2).

Методы изучения свойств штаммов и антибактериальных веществ.

При скрининге продуцентов среди молочнокислых бактерий, выделяющих в процессе роста молочную кислоту, использовали микропланшетный экспресс-метод с ее нейтрализацией (Yasushi Kawai, 1977).

Для выявления штаммов-антагонистов применяли модификацию метода отсроченного антагонизма с учетом коэффициента подавления (Кп) роста индикатора (Блинкова Л.П., 2003). Коэффициент подавления вычисляли по формуле Кп=Дз/Дм, где Дз - средний диаметр зоны отсутствия роста индикаторной культуры (в мм), Дм - средний диаметр макроколонии штамма (в мм). Кп=1,1 - 2,0 указывал на низкую степень антибактериальной активности, средняя степень активности выражалась Кп=2,1 - 4,0; при высокой степени активности Кп=4,1 - 6,0 и при Кп=6,1 и более штамм имел очень высокую степень антибактериальной активности.

Изучение морфологических, тинкториальных, физиолого-биохимических свойств активных бактерий-продуцентов проводили стандартными методами с использованием дифференциально-диагностических сред и тест-систем (НПО «Питательные среды», г. Махачкала)

Чувствительность к антибиотикам проверяли на среде АГВ и Мюллера-Хинтона с дисками, содержащими карбенициллин, гентамицин, тетрациклин, эритромицин, стрептомицин, неомицин, амоксициллин («НИЦФ», г. Санкт-Петербург).

Испытание штаммов-продуцентов на токсичность определяли на беспородных белых мышах массой 19-21 г при введении внутрибрюшинно по 0,5 мл живой культуры с концентрацией клеток 5,5±0,5х109 млрд. клеток/мл (ГФ XI). Концентрацию клеток устанавливали по отраслевому стандартному образцу мутности ГИСК им. J1.A. Тарасевича.

Культивирование проводили в пробирках, колбах, флаконах, используя посевную дозу, соответствующую 10 об%. Оптическую плотность считывали на планшетном ридере Dynatech MR5000 («Dynatech», Германия) при длине волны 450 нм в микролуночных планшетах («Медполимер», г. Санкт-Петербург).

Выделение плазмидной ДНК выполняли по методике Anderson D., 1983.

Выявление белкового компонента бактериоцина, чувствительного к протеазам, проводили, используя растворы протеолитических ферментов лизоцим, химотрипсин («Serva», Германия); трипсин, проназу Е, папаин («Merck», Германия), в конечной концентрации 1 мг/мл. Молекулярную массу белка определяли с помощью электрофореза в 12,5-15% ПААГ с применением прибора Mini VE («Amersham Biosciences», Великобритания). Исходный

материал готовили путем растворения в дистиллированной воде лиофильно высушенного стерильного фильтрата культуральной жидкости продуцентов, выращенных на среде М9, с конечной концентрацией 2 мг/мл

Статистическую обработку данных проводили с использованием параметрических критериев (Х±т) при уровне достоверности р<0,05 и с помощью компьютерной программы Microsoft Office Excel.

Результаты исследований и обсуждение

Скрининг штаммов, продуцирующих антагонистические вещества, физиолого-биохимичсская характеристика и идентификация выбранных высокоактивных культур

Из 38 штаммов микроорганизмов родов Enterococcus, Staphylococcus, Pediococcus, Lactobacillus, выделенных из зарубежных ферментированных колбас, выявлены 17 штаммов (44,7%), которые обладали антибактериальной активностью в отношении санитарно-показательной микрофлоры для продуктов питания - S. enterica Typhimurium LT2, P. vulgaris АТСС 13315, E. coli С 600, S. aureus FDA 209P. Для дальнейшего изучения отобраны молочнокислые культуры - продуценты педиоцинов P. pentosaceus В-8994, В-8888, В-8955 и P. acidilactici В-8893, В-8902.

Среди 33 микроорганизмов, выделенных из отечественных продуктов питания, воды и воздуха 20 штаммов (60,6%) ингибировали рост штамма M. luteus NCTC 2665, использованного для предварительного скрининга. Четыре штамма-продуцента С-1, С-3, С-5 и С-7 с этим индикатором имели наиболее высокие коэффициенты ингибиции.

Из 154 клинических изолятов 93 (60,4%) являлись продуцентами антагонистических веществ, подавляющих рост индикаторов М. luteus NCTC 2665, С. albicans АТСС 885-653, Е. coli 168/59, Р. aeruginosa 27/99, К. pneumoniae 1954. Основная часть культур относилась к микроорганизмам видов S. aureus (32,5%), Р. aeruginosa (9,7%), Е. coli (13%), К. pneumoniae (13%), С. albicans (12,3%). Остальные микроорганизмы составили 19,5% (табл. 1).

Из данных таблицы 1 видно, что 100% штаммов Р. aeruginosa оказались продуцентами антибактериальных веществ с высоким коэффициентом подавления. Следует также отметить, что 53% штаммов Р. aeruginosa подавляли рост индикатора M. luteus NCTC 2665. Штамм С. albicans АТСС 885653 был чувствителен к 60% культур, Е. coli 168/59 - к 87%, К. pneumoniae 1954 - к 40%, индикаторный штамм Р. aeruginosa 27/99 - к 33% изученных псевдомонад. В связи с участившимися случаями развития очагов нозокомиальных инфекций, вызванных Р. aeruginosa (Митрохин С.Д., 2004), актуален поиск антагонистических веществ, ингибирующих рост этого возбудителя. Можно предположить, что высокоактивный штамм-продуцент бактериоцина, эффективный против синегнойной инфекции, следует искать среди клинических штаммов Р. aeruginosa (Padilla С., 2001).

Таблица 1

Частота выявления продукции ингибиторных веществ у клинических культур

микроорганизмов о я о

¡щее количес штаммов а о S 0 a s 'S § 5 Ё ü S M. luteus NCTC 2665 с. albicans АТСС 885-653 Е. coli 168/59 к. pneumoniae 1954 р. aeruginosa 27/99

О о

« абс. % абс. % абс. % абс. % абс. %

S. aureus 50 39 31 62 0 0 1 2 13 26 17 34

Е. coli 20 12 5 25 0 0 11 55 0 0 0 0

К. pneumoniae 20 13 7 35 0 0 2 10 1 5 4 20

С. albicans 18 1 1 6 0 0 0 0 0 0 0 0

Р. aeruginosa 15 15 8 53 9 60 13 87 6 40 5 33

cinetobacter spp. 2 1 0 0 0 0 1 50 0 0 0 0

ctinomyces spp. 2 2 2 100 0 0 0 0 0 . 0 0 0

Candida spp. 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

C.freundii 3 3 3 100 0 0 0 0 0 0 0 0

. aerogenes 4 1 1 25 0 0 0 0 0 0 0 0

. faecalis 2 1 1 50 0 0 0 0 0 0 0 0

. gallinarum 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

. oxytoca 2 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 50

. subflava 1 1 1 100 0 0 0 0 0 0 0 0

. alcaligenes 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

. mirabilis 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

. cohnii sp.cohnii 2 1 1 50 0 0 0 0 0 0 0 0

. epidermidis 4 2 2 50 0 0 0 0 0 0 0 0

. equi 1 1 1 100 0 0 0 0 0 0 0 0

T. paurometabola 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

абс. - количество штаммов-ингибиторов индикатора среди общего количества штаммов % - процент штаммов-ингибиторов индикатора среди общего количества штаммов

Вследствие нерационального применения антибиотиков широкого спектра, при возникновении вторичных иммунодефицитов у ВИЧ-инфицированных, хирургических больных, у контингента больных с онкологическими, гематологическими заболеваниями и др., отмечают часто возникающую контаминацию видами Candida, среди которых доминирует С. albicans (Qi Q., 2005). Персистенция возбудителей, резистентных к противогрибковым антибиотикам, затрудняет лечение инфекций и провоцирует

их рецидивы. Поэтому создание новых препаратов с антикандидозной активностью представляет интерес для практической медицины.

В результате исследования выявлено, что лишь 6% из 154 изученных клинических микроорганизмов подавляли рост тест-штамма С, albicans АТСС 885-653, причем все они относились к Р. aeruginosa (9 штаммов из 15). Что касается антибактериального действия С. albicans, 1 штамм (6%) из 18 изученных изолятов формировал небольшую зону задержки роста М. luteus NCTC 2665 (Кп= 1,6).

Среди других видов клинических микроорганизмов продуцентами антагонистических веществ являлись: Е. coli, К. pneumoniae, С. freundii, S. epidermidis, S. equi, К. oxytoca, N. subflava, E. aerogenes, E. faecalis, Acinetobacter spp., Actinomyces spp.

Для выявления штаммов-антагонистов необходимо подобрать чувствительную индикаторную культуру. Индикаторный штамм должен иметь разные трофические потребности со штаммом-продуцентом, не подавляя синтез вещества вследствие конкуренции за субстрат, быть чувствительным для максимального количества тестируемых на антагонизм штаммов (Papagianni М, 2006).

Среди проверенных клинических культур 41,6% подавляли рост М luteus NCTC 2665 (рис. 1).

а о 40

% a 35

S о

л а b и S S 3U 25

1■- о и 20

X я н 15

я о в я 10

с. С 5

OlЧ 168/59

Р. aeruginosa 27/99

Тсст-культуры

К. pneumoniae 1954

Рис. 1 Информативность индикаторных культур при скрининге штаммов-антагонистов

Испытанный в качестве индикатора штамм Е. coli 168/59 оказался чувствительным к 18,2%, культур, P. aeruginosa 27/99 - к 17,5%, К. pneumoniae 1954 - к 12,9%, и С. albicans АТСС 885-65 - лишь к 6% исследованных изолятов.

Приведенные данные показывают, что при проведении эксперимента М. luteus NCTC 2665 являлся наиболее пригодным индикаторным штаммом для выявления бактериоциноподобных веществ у микроорганизмов разных таксономических групп, что позволяет рекомендовать дальнейшее изучение этого штамма с целью использования в подобных исследованиях.

Для скрининга продуцентов антибактериальных веществ нам были предоставлены штаммы микроорганизмов, выделенные из различного

клинического материала сотрудниками лаборатории микробиологии условно патогенных бактерий ГУ НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН (40 штаммов), Городской клинической больницы № 15 им. О.М. Филатова (56 штаммов), Научного центра здоровья детей РАМН (58 штаммов).

Как видно из диаграммы на рисунке 2, большая часть штаммов выделена из верхних дыхательных путей (отделяемое из зева, отделяемое из носа, мокрота, трахейный аспират), а также из мочи и кала. Незначительный процент составили экссудат из брюшной полости - 2,7%, отделяемое из цервикалыюго канала - 1,9%, плевральная жидкость - 1,9%, сперма - 1,4%, отделяемое из уретры - 0,6%.

Моча 19,2%

ал о,-> /о Кожа 2 7% оделяемое при

Трахейный аспират Отделяемое из флегмоне 4,0%

3.3% влагалища 4,0%

* Экссудат из брюшной полости - 2,7%, отделяемое из цервикального канала - 1,9%, плевральная жидкость - 1,9%, сперма - 1,4%, отделяемое из уретры - 0,6% Рис. 2. Характеристика клинического материала, использованного для выделения культур

Отделяемое из раны и при флегмоне составили 6,6% и 4% от общего количества исследованного клинического материала, причем 10 из 11 штаммов, выделенных из раны, и 5 из 6 штаммов, выделенных при флегмоне, являлись продуцентами бактериоциноподобных веществ. Следует отметить, что среди 33 культур из зева 21 (63,6%) оказалась антагонистически активной.

Высокий процент частоты встречаемости бактериоциногенности у штаммов, выделенных из зева детей, а также из ран как возможных «входных ворот» при инфицировании макроорганизма, позволяет нам высказать предположение о возможной роли бактериоцинов в качестве факторов агрессии при инвазии микробов в ткани организма.

На рисунке 3 приведена характеристика штаммов-антагонистов, выделенных их клинического материала от взрослых (из Городской клинической больницы № 15 им. О.М. Филатова) и детей до 15 лет (из Научного центра здоровья детей РАМН). Общий процент штаммов-антагонистов, выделенных от детей, составил 62 %, тогда как от взрослых -

66%, т.е. штаммы, выделяемые от детей и взрослых, примерно в одинаковом проценте случаев оказались антагонистически активными.

Группа детей из Научного центра здоровья детей РАМН (58 чел)

38%

Группа взрослых из Городской клинической больницы №15 им. О.М. Филатова (56 чел)

34"/

62%

| процент непродуциругощих штаммов Ц процент продуцирующих штаммов

Рис. 3 Частота выделения штаммов-антагонистов из клинического материала от детей до 15 лет и взрослых (%).

Таким образом, было изучено 225 штаммов, из которых антагонистической активностью обладали 130 штаммов, т.е. процент микроорганизмов-антагонистов составил 57,8%.

Среди 33 микроорганизмов, выделенных из отечественных продуктов питания, воды и воздуха для дальнейшей работы отобраны четыре штамма-продуцента С-1, С-3, С-5 и С-7 с высокими коэффициентами ингибиции.

Спектр антагонистического действия четырех отобранных штаммов-продуцентов показан в таблице 2. Между штаммами М. Intens С-1, С-3, С-5, С-7 отмечены различия по спектру антибактериальной активности, обусловленной разным уровнем синтеза бактериоцинов.

При изучении морфологических, тинкториальных, физиолого-биохимических свойств выбранных микробов-антагонистов (табл. 3) определено, что бактериальные клетки размером 0,5x2 мкм, имели сферическую форму, расположены скоплениями различной конфигурации, грамположительные, неподвижные. Всс штаммы не ферментировали сахара, не гидролизовали эскулин и мочевину, желатину разжижали, не синтезировали аргининдигидролазу, лизиндекарбоксилазу, оритиндекарбоксилазу, являлись слабо оксидазоположительными, нитраты не восстанавливали, не вызывали гемолиз. На МПА, содеращим 7,5% NaCl, и при температуре 37±1°С культуры росли слабо, на агаре Симмонса с цитратом не росли. Все штаммы оказались высокочувствительными к карбенициллину, гентамицину, тетрациклину, амоксициллину и нечувствительными к стрептомицину. Штаммы С-1 и С-7 проявили чувствительность к эритромицину, штаммы С-3 и С-5 - умеренную чувствительность. К неомицину оказались чувствительными штаммы С-1 и С-5, а С-3 и С-7 - умеренно чувствительными. Реакции Фогеса-Проскауэра и с метиловым красным отрицательны у всех 4-х штаммов.

Таблица 2

Подавление роста индикаторных культур штаммами-продуцентами _М. Intens С-1, С-3, С-5, С-7_

Индикаторный штамм Коэффициент подавления роста индикаторов штаммами М. luteus, Кп=Дз/Дб

С- 1 С-3 С-5 С-7

М. luteus NCTC 2665 4,5±0,45 5,8±0,65 4,5±0,47 5,0±0,55

S. aureus Wood 46 3,3±0,36 3,4±0,37 3,3±0,36 3,8±0,42

5. aureus АТСС 653 8-P 3,3±0,36 3,3±0,36 3,2±0,35 3,1±0,34

E. coli М-17 0 2,3±0,25 2,8±0,3 0

E. coli 168/59 0 0 0 0

E. coli Su 3912/41 0 1,5±0,16 1,5±0,16 1,5±0,16

E. coli K12S 2±0,22 1,4±0,15 2±0,22 2±0,22

S. enterica Typhimurium LT-2 0 0 0 0

S. enterica АЬопуШЕ 103/39 0 0 2,4±0,26 0

5. enterica Typhi H 901 ГДР 1,1 ±0, 2 1,1±0,12 1,1±0,12 1,1±0,12

S. sonnei «S-form» 0 0 0 0

P.rettgeri 1 2,1±0,23 1,7±0,19 1,7±0,19 1,8±0,2

P. vulgaris R-8 1,6±0,18 1,5±0,16 0 2±0,22

E. aerogenes 418 0 0 0 0

K. pneumoniae 1954 0 0 0 0

S. plvmuthica 1 0 0 0 0

E. durans 8/62 0 0 0 0

E.faecalis 1 0 0 0 0

A. faecal is 415 0 0 0 0

P. aeruginosa 27/99 0 0 0 0

P. aeruginosa 9022 0 0 0 0

C. albicans ATCC 885-653 1,3*0,14 1,1±0,12 0 0

В таблице 3 указаны дифференциально-диагностические признаки, по совокупности которых штаммы С-1, С-3, С-5, С-7 идентифицированы как Micrococcus luteus.

Как видно из данных таблицы, выбранные .нами» штаммы обладали типичными свойствами, характерными для Micrococcus luteus.

Для практического использования штаммов-продуцентов бактериоцинов требованием является отсутствие у них токсичности. Испытание 18-часовых культур продуцентов in vivo в течение 14 дней .не вызвало падежа мышей и снижения их массы и активности, что свидетельствовало об отсутствии токсических свойств у продуцентов М. luteus С-1, С-3, С-5, С-7 при использовании живой культуры с концентрацией клеток 5,5±0,5х109 млрд. клеток/мл.

Таблица 3

Дифференциально-диагностические признаки _Micrococcus luteus С-1, С-3, С-5, С-7_

Дифференциально- Штаммы Micrococcus luteus

диагностические признаки С-1 С-3 С-5 С-7

Цвет колоний на МПА лимонно- лимонно- бледно- лимонно-

желтые желтые желтые желтые

Размер колоний, мм 2-3 2-3 2-3 2-3

Размер клеток, мкм 0,5x2 0,5x2 0,5x2 0,5x2

Окраска по Граму Грам + Грам + Грам + Грам +

Подвижность - - - —

Образование кислоты из глюкозы - - - -

Образование кислоты из маннозы — - — —

Образование кислоты из лактозы - - - —

Гидролиз эскулина - — —

Гидролиз желатины ■ + + +

Восстановление нитрата - - - -

Аргининдигидролаза — —

Оксид аза + ■ + 1

Рост на среде с неорганическим + + + +

азотом

Рост на агаре Симмонса с - . - - -

цитратом

Рост на МПА с 7,5% №С1 + + + +

Рост при 37±1°С + + + +

«+» - наличие признака, «-» - отсутствие признака

Из литературных источников известно, что синтез бактериоцинов чаще всего кодируется на хромосоме или крупной коньюгативной плазмиде у молочнокислых культур (Блинкова Л.П., 2007). С целью более полной характеристики штаммов, изучен плазмидный профиль продуцентов.

Экспериментально доказано, что штаммы М Шеш С-1 - С-7, выделенные из воздуха, не содержали плазмид. Это свидетельствовало о хромосомной локализации генов, ответственных за синтез бактериоцинов (рис. 4, А).

Анализ плазмидного профиля выбранных антагонистически активных молочнокислых культур, выделенных из зарубежных ферментированных колбас, показал, что у штаммов Р. аа<И1ас1т В-8893 и Р. ас'кШасйа В-8902 имеется по одной плазмиде размером примерно 11 т.п.н., что соответствует данным литературы для этого рода молочнокислых бактерий (Foegeding Р., 1992); в тоже время у штаммов Р. репШасеш В-8994, В-8888, В-8955 плазмид не обнаружено (рис.4, Б). Интересно, что плазмиды выявлены именно у штаммов одного вида (Р. асЫНасНеГ), тогда как штаммы, не имеющие плазмид, относились к другому виду (Р. реп^асет).

Рис. 4. А, Б Электрофореграммы плазмидного профиля штаммов микрококков и педиококков

А - дорожки 1-4 - штаммы M. luteus С-1 - С-7, не содержащие плазмид.

M - маркер Fermentas GeneRuler™ 1 kb DNA Ladder .

Б - дорожки 3,5- штаммы P. acidilactici B-8893 и P. acidilactici B-8902, содержащие

плазмиды. Дорожки 1, 2, 4 - штаммы P. pentosacens В-8994, В-8888, В-8955, не

содержащие плазмиды. M - плазмида pBRG1310 размером 12,33 т.п.н. для оценки

мол. массы. S - суперскрученная форма плазмиды, L - линейная, С - кольцевая.

Следует подчеркнуть, что бактериоцины бактерий M. luteus по сравнению с молочнокислыми микроорганизмами мало исследованы.

По данным литературы известно, что метаболиты (каталаза), синтезируемые M. luteus (lysodeikticus), используются зарубежом в производстве сыров, что отражено в списке GRAS (Generally recognized as safe), (21 CFR § 173.153, U.S. Food and drug administration, 2001).

Таким образом, нетоксичные высокоактивные бесплазмидные штаммы-продуценты бактериоциноподобных веществ M. luteus С-1, С-3, С-5, С-7 перспективны для практического применения.

Изучение свойств антагонистических веществ, синтезируемых штаммами M. luteus С-1, С-3, С-5, С-7.

Для определения принадлежности к бактериоцинам антибактериальных субстанций, образуемых штаммами M. luteus С-1 - С-7, были выбраны цитированные ранее критерии (Tagg J., 1976; Блинкова Л.П., 1986).

Результаты ингибирования роста чувствительных штаммов, выраженные в коэффициенте подавления, представлены в таблице 2. Из данных таблицы видно, что наибольший коэффициент ингибирования роста определен в отношении музейных штаммов группы грамположительных кокков, в особенности M. luteus NCTC 2665. Принимая во внимание, что отобранные нами продуценты по совокупности морфологических, тинкториальных и физиолого-биохимических свойств идентифицированы как M luteus, можно заключить, что антагонизм проявлялся, прежде всего, в отношении близкородственной культуры микрококка, что является первичным критерием принадлежности антимикробных субстанций к бактериоцинам.

Один из определяющих признаков принадлежности ингибиторных веществ к бактериоцинам - невосприимчивость штамма-продуцента к собственным бактериоцинам, что выявляют, используя в качестве индикаторной культуры штамм-продуцент (табл. 4).

Таблица 4

Изучение перекрестной чувствительности штаммов М. 1и1еи$

Штамм -продуцент Коэфс шциент подавления штамма-индикатора, (Х±т)

С-1 С-3 С-5 С-7 М. luteus NTCC 2665

С-1 0 0 0 0 4,5±0,45

С-3 0 0 0 0 5,8±0,65

С-5 0 0 0 0 4,5±0,47

С-7 0 0 0 0 5,0±0,55

Как видно из данных таблицы, четыре изученных штамма М. luteus С-1 -С-7 оказались устойчивыми как к собственным ингибиторам, так и взаимно резистентными к синтезируемым веществам. Это указывает на возможное родство синтезируемых субстанций штаммами М. luteus С-1 - С-7.

Феномен бактериоциногении характеризуется следующей важной особенностью: синтез бактериоцина является процессом, летальным для продуцирующей его клетки. В бактериальной популяции, без дополнительных искусственных воздействий, бактериоцин синтезируют только отдельные клетки, которые при этом погибают. Доказательством гибели клетки, продуцирующей бактериоцин, может служить образование неперививаемой «лакуны» - микрозоны отсутствия роста индикаторного штамма (рис. 5).

А Б В Г

Рис. 5. Образование «лакун» единичными клетками продуцента, сопровождающееся гибелью бактерий.

А - М. luteus С-1, Б - М. luteus С-3, В - М. luteus С-5, Г - М luteus С-7.

Определение белковой природы антибактериальных субстанций, продуцируемых штаммами М. luteus С-1 - С-7, проводили путем добавления растворов вышеуказанных протеаз к супернатантам культуральной жидкости. После воздействия ферментов, антагонистическое действие субстанций, не выявлено.

Как показали первоначальные эксперименты по изучению молекулярной массы бактериоциноподобного вещества, размер его молекулы, вероятно, превышает 15 кДа, т.к. после проведения диализа стерильных супернатантов

культуралыюй жидкости штаммов М. Juteus С-1, С-3, С-5, С-7 через калиброванную пленку и последующего титрования диализатов не отмечено подавления роста индикаторного штамма М. luteus NCTC 2665.

Для определения молекулярной массы применяли SDS-электрофорез в ПААГ, по результатам которого выяснено, что в лифилизированном фильтрате культуральной жидкости продуцентов М. luteus С-1, С-3, С-5, С-7 содержатся белковые компоненты (вероятно, структурные элементы клеток) с молекулярной массой более 116 кДа (рис. 6, дорожки 3, 6, 8, 9). В наиболее концентрированном осадке (рис. 6, дорожка 9), полученном после центрифугирования исходной суспензии вещества, видна дополнительная белковая полоса между значениями маркера 66,0 и 45,0 кДа, соответствующая 56,1±0,7 кДа. Можно предположить, что белковый компонент с молекулярной массой 56,1 ±0,7 кДа является бактериоцином (Егоров Н.С.,2004).

1234 5 6789 10

тмащшвшчм i i6,o;

«•"■> 66,0; 45,0; 35,0;

25,0,

18,4; mm 14,4

Рис. 6 Электрофореграмма препаратов в 12,5% ПААГ

1 - исходный метериал, 5 мкл; 2~ исходный метериал, 10 мкл;

3 - исходный метериал, 20 мкл;

4 - супернатант, 5 мкл;

5 - супернатант, 10 мкл;

6 - супернатант, 20 мкл;

7 - концентрат, 5 мкл;

8 - концентрат, 10 мкл;

9 - концентрат, 20 мкл;

10-маркер Fermentas: 116,0; 66,0; 45,0; 35,0; 25,0; 18,4; 14,4 кДа.

Доказано, что субстанции, синтезируемые штаммами М. luteus С-1- С-7, не являлись литическими ферментами, т.к. после воздействия фильтрата культуральной жидкости продуцентов на индикатор М. luteus NCTC 2665 лизиса клеток тест-штамма не наблюдали.

Таким образом, основываясь на общепринятых критериях принадлежности антибактериальных субстанций к бактериоцинам, можно заключить, что отобранные нами высокоактивные штаммы-продуценты М. luteus С-1 - С-7 синтезируют бактериоцины.

С целью характеристики полученных нативных антибактериальных веществ изучено влияние физико-химических факторов на микрококцины, синтезируемые штаммами М. luteus С-1 - С-7. Определено, что бактериоцины

выдерживали кипячение в течение 60 мин и автоклавирование при 112°С 20 мин. Выявленная термоустойчивость микрококцинов, по-видимому, связана либо с комплексным составом вещества, либо с его конформационой структурой. Ингибиторные свойства бактериоцинов сохранялись после однократного замораживания-оттаивания культуральной жидкости продуцентов. Воздействие рН от 2,0 до 10,0 не оказывало подавляющего эффекта на активность бактериоцинов. Аналогичный результат наблюдали при действии 7,5% ЫаС1. После хранения штаммов М. \uteus С-1 - С-7 в лиофилизированном состоянии в течение 2 лет при температуре 4±1°С активность синтезируемых антибактериальных веществ сохранялась.

Стабильность активности бактериоцинов имеет существенное значение для получения на их основе медицинских препаратов и биоконсервантов.

Изучение условий культивирования штаммов М. Шет С-1, С-3, С-5, С-7, продуцирующих бактериоцины. Согласно литературным данным, наилучшим субстратом для синтеза бактериоцинов являются питательные среды, полноценные по наличию трофических компонентов. При этом требуются также оптимальные режимы для выращивания продуцента. Условия для роста микроорганизма и синтеза антибактериального вещества совпадают не всегда. Задачей дальнейших исследований являлось изучение влияния питательных сред и основных режимов культивирования штаммов-продуцентов на накопление биомассы и на выход бактериоцинов.

С целью выбора наиболее пригодного углевода, в СПБ, как наиболее доступную стандартную питательную среду, и в среду М9, которая могла обеспечить биохимическую чистоту вещества, добавляли один из углеводов: глюкозу, сахарозу, лактозу, маннит, мальтозу в концентрации 1% (рис. 7).

2 1,5

0,5

лактоза мальтоза глюкоза маннит сахароза Углеводы

Рис. 7. Влияние углеводов культивировании 24 часа

А - культивирование на среде СПБ, Б

сахароза мальтоза лактоза глюкоза Углеводы

на рост М. ¡Меих

- культивирование на среде М9

С-1 - С-7 при

Как видно из данных рисунка 7 наиболее высокий средний показатель ОП всех штаммов наблюдали при культивировании на среде СПБ с глюкозой по. сравнению с культивированием на СПБ с лактозой, сахарозой, маннитом и мальтозой. Однако при увеличении концентрации глюкозы с 1% до 5 % в

средах СПБ и М9 повышение ОП культуральной жидкости штаммов М. \uteus С-1 - С-7 было не достоверным.

В качестве стимулятора роста в состав питательной среды № 3 добавили дрожжевой экстракт, что увеличило выход биомассы по сравнению со средами № 1 и № 2 (рис. 8).

изученных средах при культивировании 48 часов

1-среда №1,2- среда №2, 3 - среда № 3, М9 - среда М9, М9 с гл. - среда М9 с 1% глюкозы, ЬВ - ЬВ-бульон, ТСБ - триптиказо-соевый бульон, ТН - среда Тодца-Хыоитта, 4а - среда СПАС № 4а, 26 - среда СПАС № 26, СПБ - среда СПБ-бульон.

Данные оптической плотности культуральной жидкости штаммов-продуцентов, характеризующие рост штаммов М. Ыеш при культивировании на 11 традиционных и экспериментальных средах (рис. 8), свидетельствуют о том, что все штаммы активно росли на разработанной нами казеиново-соевой среде с глюкозой и дрожжевым экстрактом (СПАС № 4а). Для штамма С-1 оптимальной оказалась среда СПБ производства НПО «Питательные среды», г. Махачкала.

Отметим, что штамм С-1 характеризовался высоким выходом биомассы на всех средах и имел более длительную фазу экспоненциального роста - до 48 ч (рис. 8, 9). Начало экспоненциальной фазы роста штаммов М. Ыеш С-3, С-5, С-1 на среде СПАС № 4а соответствовало 12 часам культивирования, а ее окончание - 24 часам. Высокие показатели накопления биомассы микрококками получены при использовании 18-часовой посевной культуры и термостатировании при 37±1°С в течение 48 часов.

Динамику синтеза микрококцинов штаммами М. Ыеш С-1, С-3, С-5, С-7 изучали на плотной питательной среде при тех же условиях. Со срока 12 ч проявлялся биосинтез бактериоцинов, закончившийся к 72 часам (рис.9).

Рост штамма С-1 на среде N5 4а

О 12 24 36 43 30 72 Время культивирования, ч

Рост штамма С-3 на среде № 4а

1,5 . 1 !0,5 0

0 12 24 36 48 50 72 Время культивирования, ч

Рост штамма С-5 на среде № 4а

1,5

1 -

0 12 24 36 48 60 12 Время культивирования, ч

Рост штамма С-7 на среде № 4а

1,5

, 1 Ы

0 12 24 36 48 60 72 Время культивирования, ч

Рис. 9 Рост штаммов М. 1шет С-1, С-3, С-5, С-7 на среде СПАС №4а

--кривая роста штаммов М. 1и1еш С-1, С-3, С-5, С-7

—^—-кривая синтезабактериоцинов штаммами М Шеий С-1, С-3, С-5, С-7

При изучении синтеза бактериоцинов штаммами-продуцентами М. 1Шеш С-1 - С-7 через 72 часа культивирования как параметр оценки использовали процент подавления роста тест-штамма М /м/ем5 ЫСТС 2665 по сравнению с максимальной величиной (С)П=0,790±0,086), принятой за 100 % (рис. 10).

и я 50

ч се 40

ч о 30

н 20

о 0

й-

2 3 М9 МЭ 1В та ТО 4а 26 СПБ ПнтЯ'ЯЬьные среды

«60 ¡50

I40

|зо

в 20

|ю ё 0

-|Э -г т т \г ■ь

т тн у а 6

3 М9 МЗ 1.В ТСБ "Ш 4а 26 СПБ ПтЗДёльные среды

■ 50

Ч 40

ч « в 30

ь-в 20

о 10

К 0

н1 г[ НЬ

_ _ £ _

- - - -

2 3 МЗ М9 1.В ТСо "Ж 4а 26 СПБ Петгё-^льные среды

3 МЭ М9 1-В ТС6 та 4а 26 СПБ ПытВГОдьные среды

В г

Рис. 10. Подавление роста индикаторного штамма М. 1Мет N0X0' 2665 под действием микрококцинов, синтезируемых штаммами М. Шеиэ С-1 - С-7

А - М. \uteus С-1, Б - М. Ыеш С-3, В - М. 1и1еш С-5, Г - М. Ыеш С-7.

Как видно из данных рисунка 10 среда СПАС № 4а являлась благоприятной для продукции бактериоцинов у штаммов М. luteus С-1, С-3, С-5, С-7. Для штамма С-1 наибольший процент подавления роста тест-штамма наблюдали на среде Тодда-Хьюитта.

При экспериментальном изучении влияния углеводов на синтез бактериоцинов установлено, что повышение концентрации глюкозы с 0,5% до 5,0% незначительно увеличило процент подавления роста индикаторного штамма М. luteus NCTC 2665 всеми продуцентами.

Таким образом, для наибольшего накопления биомассы, а также для эффективного синтеза бактериоцинов высокоактивными штаммами-продуцентами М. luteus С-1 - С-7 оптимальна питательная среда СПАС № 4а. -казеиново-соевая среда, дополнительно обогащенная стимулятором роста и энергетическим субстратом (дрожжевой экстракт и глюкоза, соответственно).

Выводы:

1. Установлено, что среди 225 микроорганизмов, выделенных из различных источников, частота встречаемости штаммов-антагонистов составляет 57,8%: из продуктов питания и объектов окружающей среды - 52,1%; из клинических образцов - 60,4%.

2. Определено, что среди индикаторных культур, использованных при скрининге продуцентов антибактериальных веществ среди клинических изолятов, Micrococcus luteus NCTC 2665 оказался наиболее чувствительным штаммом.

3. На основании изучения физиолого-биохимических свойств показано, что нетоксичные штаммы-антагонисты С-1, С-3, С-5, С-7, выделенные из воздуха, относятся к Micrococcus luteus.

4. Экспериментально доказана принадлежность к бактериоцинам (микрококцинам) антибактериальных субстанций, продуцируемых штаммами М. luteus С-1, С-3, С-5, С-7.

5. Показано, что микрококцины, синтезируемые штаммами М. luteus С-1, С-3, С-5, С-7, сохраняли активность при кипячении 60 мин, автоклавировании при 112°С 20 мин, в условиях рН от 2,0 до 10,0 и 7,5% NaCl, при однократном замораживании/оттаивании.

6. Выявлена хромосомная локализация генов, ответственных за синтез бактериоцинов штаммами М. luteus С-1, С-3, С-5, С-7, P. pentosaceus В-8994, В-8888, В-8955 и наличие плазмид размером 11 т.п.н., контролирующих продукцию педиоцинов у P. acidilactici В-8893 и В-8902.

7. Подобрана казеиново-соевая питательная среда СПАС №4а, обеспечивающая одновременный эффективный рост микрококков и синтез бактериоцинов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

. 1. -Дорофеева (Горбатко) Е.С., Машенцева Н.Г., Хорольский В.В., Блинкова Л.П. Изучение возможности использования молочнокислых микроорганизмов-продуцентов бактериоцинов в мясной промышленности // Биотехнология: состояние и перспективы развития. - Материалы Третьего Московского международного Конгресса. - Москва, 14-18 марта, 2005. -часть 2. - с. 98-99.

2. Дорофеева (Горбатко) Е.С., Блинкова Л.П., Машенцева Н.Г., ГоробецО.Б., Хорольский В.В. Бактериоцины в составе пробиотиков и пищевых продуктов как природные ингибиторы патогенов // Выездной пленум НОГР клинико-патогенетические аспекты желудочно-кишечного дисбиоза при заболеваниях органов пищеварения: диагностика, лечение и профилактика. Сборник тезисов. - Москва, 10-11 ноября 2005. - с.83.

3. Блинкова Л.П., Горобец О.Б., Дорофеева (Горбатко) Е.С. Использование бактериоцинов при дисбиозах, обусловленных грибковыми патогенами Успехи медицинской микологии.- М.: Национальная академия микологии, 2006. -Т. 7. -с.137.

4. Блинкова Л.П., Машенцева Н.Г., Хорольский В.В., Горобец О.Б., Дорофеева (Горбатко) Е.С. Биотехнологические условия синтеза бактериоцинов // ЖМЭИ. - 2006. - 2. - с.83-89.

5. Дорофеева (Горбатко) Е.С., Блинкова Л.П., Батуро А.П., Романенко Э.Е., Леонова А.Ю., Машенцева Н.Г., Лаптев И.А. Поиск и изучение физиолого-биохимических и генетических свойств бактериоцинпродуцирующих штаммов // Тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней». - Москва, 21-22 ноября 2006. - с.41.

6. Дорофеева (Горбатко) Е.С., Блинкова Л.П., Катосова Л.К., Поликарпова С.В. Изучение клинических штаммов микроорганизмов, синтезирующих бактериоцины с антибактериальной и антикандидозной активностью // Успехи медицинской микологии- М.: Национальная академия микологии, 2007. - Т. 9. - с.286.

7. Баранова Е.А., Хорольский В.В., Блинкова Л.П., Машенцева Н.Г., Дорофеева (Горбатко) Е.С. Изучение молочнокислых микроорганизмов, продуцентов бактериоцинов // Биотехнология: состояние и перспективы развития. - Материалы Четвертого Московского международного Конгресса. - Москва, 12-16 марта, 2007. - с. 154

8. Дорофеева (Горбатко) Е.С., Блинкова Л.П., Машенцева Н.Г., Лаптев И.А., Баранова Е.А. Бактериоциноподобные вещества и локализация генов, контролирующих их синтез, у новых кандидатов в пробиотики // Международный конгресс «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические аспекты». Санкт-Петербург, 15-16 мая, 2007. - Научно-практический журнал «Клиническое питание». - №1-2. - с. 38.

9. Машенцева Н.Г., Хорольский В.В., Дорофеева (Горбатко) Е.С., Бучинская А.Г., Каниковская A.A., Синеокий С.П. Скрининг молочнокислых микроорганизмов-продуцентов бактериоцинов и изучение возможности их использования в мясной промышленности // Журн. Биотехнология. - 2006. -№6. - с. 20-27.

10. Блинкова Л.П., Альтшулер M.JL, Дорофеева (Горбатко) Е.С., Горобец О.Б. Генетический контроль продукции и действия бактериоцинов // ЖМЭИ. - 2007. - ч. 2. - с. 97-104.

11. Блинкова Л.П., Дорофеева (Горбатко) Е.С., Калягина С.Ю. Изучение бактериоциногении клинических штаммов // Материалы IX съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - 2007. - В 3 т. Т.2. - с. 290-291.

12. Баранова Е.А., Хорольский В.В., Машенцева Н.Г., Блинкова Л.П., Горбатко (Дорофеева) Е.С., Лаптев И.А. Иммобилизация штаммов-продуцентов бактериоцинов стартовых культур как средство повышения их жизнеспособности // Биотехнология: Вода и пищевые продукты.- Материалы Пятого Московского международного Конгресса. - Москва, 11-13 марта, 2008.-с. 49.

13. Горбатко (Дорофеева) Е.С., Машенцева Н.Г., Блинкова Л.П., Хорольский В.В., Лаптев И.А., Баранова Е.А. Микрококки как продуценты бактериоцинов, перспективынх для получения консервантов биотехнологической продукции // Биотехнология: Вода и пищевые продукты: материалы Пятого Московского международного Конгресса. -Москва, 11-13 марта, 2008. - с. 84.

14. Блинкова Л.П., Дорофеева Е.С., Батуро А.П., Романенко Э.Е., Катосова Л.К., Поликарпова C.B., Пивкина Н.В. Выявление бактериоциногенности среди возбудителей оппортунистических инфекций // Вестник РАМН. - 2008. - №4,- с. 14-18.

15. Блинкова Л.П., Горбатко Е.С., Катосова Л.К., Поликарпова C.B., Пивкина Н.В. Изучение частоты распространения признака бактериоциногении среди возбудителей условно патогенных инфекций // Материалы Всероссийской научной конференции «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекцонных заболеваний» 17-18 апреля 2008 г. - Вестник Российской BMA. - прилож. 2 (22), ч. 1.-е. 227228.

16. Машенцева Н.Г., Хорольский В.В., Блинкова Л.П., Баранова Е.А., Горбатко Е.С., Лаптев И.А. Генетические детерминанты синтеза педиоцинов // ЖМЭИ. - 2008. - № 6. - с. 3-6.

Заказ №499. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06 www.postator.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Горбатко, Екатерина Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Бактериоцины и бактериоциноподобные вещества и их продуценты

1.2 Методы выявления синтеза и получения бактериоцинов.

1.3 Влияние условий культивирования на биосинтез бактериоцинов.

1.4 Применение бактериоцинов и их продуцентов для профилактики и терапии инфекционных заболеваний.

1.5 Применение бактериоцинпродуцирующих микроорганизмов и бактериоцинов в пищевой промышленности.

1.6 Генетический контроль продукции и действия бактериоцинов.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Штаммы, питательные среды, оборудование.

2.2 Методы изучения физиолого-биохимических особенностей штаммов-продуцентов бактериоциноподобных веществ.

2.3 Методы выявления бактериоцинпродуцирующих бактерий.

2.4 Метод периодического культивирования бактериоцинпродуцирующих штаммов.

2.5 Методы изучения свойств антагонистических веществ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ГЛАВА 3. СКРИНИНГ ШТАММОВ, ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И ИДЕНТИФИКАЦИЯ КУЛЬТУР, ПРОДУЦИРУЮЩИХ АНТАГОНИСТИЧЕСКИЕ ВЕЩЕСТВА.

3.1 Проведение скрининга штаммов-продуцентов бактериоциноподобных веществ среди ферментированных продуктов питания и объектов окружающей среды.

3.2 Скрининг продуцентов бактериоциноподобных веществ среди клинического материала.

3.3 Изучение биологических свойств высокоактивных штаммовантагонистов, выделенных из воздуха.

3.4 Анализ плазмидного профиля штаммов-продуцентов бактериоциноподобных веществ.

ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ АНТАГОНИСТИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ, СИНТЕЗИРУЕМЫХ ШТАММАМИ М. LUTEUS С-1, С-3, С-5, С-7.

4.1 Оценка ингибиторных субстанций, содержащихся в нативных препатартах, по критериям принадлежности к бактериоцинам.

4.2 Изучение влияния физико-химических факторов на активность бактериоцинов.

ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ДЛЯ ШТАММОВ М. LUTEUS С-1, С-3, С-5, С-7, ПРОДУЦИРУЮЩИХ БАКТЕРИОЦИНЫ.

5.1 Подбор питательных сред для роста штаммов-продуцентов и биосинтеза микрококцинов.

5.2 Подбор режимов периодического культивирования штаммовпродуцентов М. luteus.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Скрининг продуцентов бактериоцинов среди бактерий, выделенных из различных источников"

Актуальность проблемы. Бактериоцины и бактериоциноподобные вещества - антибактериальные, в основном, комплексные, субстанции белковой природы. Бактериоцины различаются по спектру активности, способу действия, генетическому контролю, биохимическим свойствам. Многие бактериоцины действуют в отношении близкородственных продуцентам видов бактерий, однако иногда имеют довольно широкий спектр действия, что особенно характерно для бактериоцинов грамположительных бактерий (Jacob F., 1953; Кудлай Д.Г., Лиходед В.Г., 1966; Tagg I. ,1976; Блипкова Л.П., 1984).

Некоторые авторы относят бактериоцины к классу антибиотиков, среди которых известны поли пептидные субстанции. Главные отличия между этими веществами заключаются в том, что бактериоцины синтезируются на рибосомах, а антибиотики создаются вне рибосом с участием специальных ферментов (Brock Т., 1963; Егоров Н.С., 1999; Hein Т., 2005). В связи с необходимостью поиска новых лекарственных средств, обусловленной недостатками антибиотиков (быстрое формирование лекарственно устойчивых форм, подавление факторов иммунитета, аллергизация организма и т.д.), в последнее время возродился интерес к бактериоцинам (Kalmokoff М., 1996; Reid G., 2002; Тео А., 2005).

Известно, что эффективность действия пробиотических культур помимо активизации факторов иммунитета, связана также с синтезом бактериоцинов. В составе пробиотических препаратов бактериоцины и продуцирующие их штаммы, посредством избирательного воздействия на микрофлору, нормализуют микробный ценоз при некоторых патологиях у человека и животных (Heller К., 2001; Бельмер С.В., 2002; Виноградская С. Е., 2005). В литературе имеются данные по использованию бактериоцинов и пробиотических препаратов на основе штаммов-продуцентов при лечении стафилококковых инфекций (Lachowicz Т., 1973), вагинальных инфекций

Barberis I., 1997; Lepargneur J., 2002), в борьбе с возбудителями угревой сыпи (Barefoot S., 2005). Препарат «Томицид», антибактериальным компонентом которого является лактококцин, в настоящее время применяют при ангинах, пиодермиях, дерматозах, при нагноениях в ранах и др. (Блинкова Л.П., 1986).

Поэтому изучение возможности продуцировать бактериоцины представителями нормофлоры особенно актуально при создании пробиотиков и терапевтических препаратов. Однако вопрос наличия бактериоцинпродуцирующих микробов и частоты их встречаемости среди отдельных видов микроорганизмов, циркулирующих в макроорганизме, а также физиолого-биохимических особенностей бактерий-антагонистов, изучен недостаточно.

Следует также отметить, что для стран с развитой пищевой промышленностью наиболее актуальным является вопрос поиска безвредных и эффективных препаратов, увеличивающих сроки хранения продуктов питания. Вместо традиционных химических консервантов с этой целью начали применять бактериоцины и бактерии-продуценты (АЬее Т., 1995; Ross R., 1999; Cleveland J., 2001; Millette M., 2004).

Наиболее известным считается бакгериоцин низин, продуцируемый некоторыми штаммами Lactococcus lactis (Стоянова Л.Г., 2008), и его стандартизованный препарат низаплин, производителем которого является компания «Aplin&Barrett Ltd» (Англия) (de Vuyst L., 1994). Известно, что бактерии образуют широкий спектр бактериоцинов, которые тоже имеют практический потенциал, однако, прикладные исследования бактериоцинов как консервантов касаются, в основном, низина (de Vuyst L., 1994; Cintas L., 1998; Ross R., 1999; Friedrich-Karl L., 2003; Ghrairi Т., 2004).

Поиск природных консервантов, отвечающих требованиям потребителей и производителей — актуальный вопрос и для нашей страны. К сожалению, изучение бактериоцинов в России ведется в недостаточной степени (Червинец В.М., 2007).

Таким образом, проблема поиска и изучения свойств новых штаммов-продуцентов бактериоцинов, перспективных для последующего создания медицинских препаратов и для использования в пищевой промышленности, а также подбор питательных сред и оптимальных условий культивирования для синтеза бактериоцинов является актуальной.

Задачи исследования:

1. Отобрать штаммы-антагонисты среди культур, выделенных из пищевых продуктов, объектов окружающей среды, клинического материала, и изучить физиолого-биохимические свойства наиболее активных продуцентов.

3. Доказать принадлежность к бактериоцинам ингибиторных субстанций, продуцируемых высокоактивными штаммами.

4. Исследовать воздействие физико-химических факторов на антибактериальную активность бактериоцинов.

Научная новизна.

Получена информация о частоте встречаемости штаммов-антагонистов . среди микроорганизмов, выделенных из продуктов питания, объектов окружающей среды и клинических образцов.

Практическая значимость.

Создана лабораторная коллекция оригинальных бактериоцин-синтезирующих культур, которые могут быть использованы при разработке антибактериальных препаратов для медицины, пищевой промышленности и в научных исследованиях.

Основные положения, выносимые на защиту:

2. Охарактеризованы и идентифицированы как Micrococcus luteus С-1, С

3. С-5, С-7 высокоактивные штаммы-антагонисты, перспективные для дальнейшего изучения с целью практического применения.

3. Подобрана питательная среда и основные режимы культивирования, обеспечивающие одновременный рост штаммов Micrococcus luteus С-1, С-3,

С-5, С-7 и синтез микрококцинов.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Горбатко, Екатерина Сергеевна

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что среди 225 микроорганизмов, выделенных из различных источников, частота встречаемости штаммов-антагонистов составляет 57,8%: из продуктов питания и объектов окружающей среды -52,1%; из клинических образцов - 60,4%.

5. Показано, что микрококцины, синтезируемые штаммами М luteus С-1, С-3, С-5, С-7, сохраняли активность при кипячении 60 мин, автоклавировании при 112°С 20 мин, в условиях рН от 2,0 до 10,0 и 7,5% NaCl, при однократном замораживании/оттаивании.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящая работа посвящена антагонистически активным веществам белковой природы - бактериоцинам, которые в настоящее время весьма перспективны для применения в качестве антибактериальных средств. Следует отметить, что при скрининге новых штаммов-продуцентов с целью получения биоконсервантов для пищевой промышленности основное внимание уделяют культурам, выделенным из ферментированных мясных и молочных продуктов, микрофлора которых сформирована естественным путем (Enan G., 1996; Ehrmann М.А., 1999).

В соавторстве с сотрудниками Московского государственного университета прикладной биотехнологии нами были изучены 38 штаммов микроорганизмов, выделенных из ферментированных колбас испанского, итальянского и венгерского производства, микрофлора которых сформирована естественным путем. Культуры в результате последующей идентификации причислены к родам Enterococcus, Staphylococcus, Pediococcus, Lactobacillus (Машепцева Н.Г. и др., 2006). Из них 17 штаммов обладали антибактериальным действием в отношении индикаторов, относящихся к санитарно-показательной микрофлоре. Наиболее антагонистически активные штаммы P. pentosaceus В-8994, В-8888, В-8955 и P. acidilactici В-8893, В-8902 продуцируют педиоцины, которые, как известно, термостабильны, сохраняют антибактериальную активность в широком диапазоне рН и имеют низкую молекулярную массу (Vadyvaloo V., 2002; Degnan А., 1992; Christensen D., 1992; Buyong N., 1998; Chen C., 2004). Размер плазмид, отвечающих за синтез бактериоцинов у педиококков, составляет приблизительно 7.5 - 22 т.п.н. (Bukhtiyarova М., 1994). Информация о сходстве среди различных педиококков, педиоцинов и педиоциногенных факторов побудила нас исследовать генетические характеристики 2 культур P. acidilactici и 3 культур P. pentosaceus. В результате выявлено, что синтез бактериоцинов у штаммов P. acidilactici кодирован на плазмиде, размером примерно 11 т.п.н., что подтверждено экспериментами по элиминации плазмид. У штаммов P. pentosaceus плазмид не обнаружено (Машепцева Н.Г. и др., 2008).

Культуры P. pentosaceus В-8994, В-8888, В-8955 и P. acidilactici В-8893, В-8902 и продуцируемые ими бактериоцины в настоящее время дополнительно изучаются соавторами.

Представляло интерес изучить частоту встречаемости бактериоцинпродуцирующих штаммов среди микроорганизмов, выделенных не только из продуктов питания, но и из других объектов окружающей среды (воздух, вода, почва), и, что очень важно, из клинического материала от условно здоровых или больных взрослых и детей (Krzeminski Z.,1996; Padilla С.,2001; Inoue Т.,2006). Среди 225 изученных нами культур, изолированных из различных источников, антагонистической активностью обладали 130 штаммов, т. е. процент микроорганизмов-антагонистов составил 57,8 %. При этом из 154 изученных клинических изолятов 93 (60,4%) были продуцентами ингибиторных веществ, подавляющих рост индикаторных штаммов М. luteus NCTC 2665, С. albicans АТСС 885-653, Е. coli 168/59, P. aeruginosa 27/99, К. pneumoniae 1954. Основной процент изученных нами штаммов составили микроорганизмы видов S. aureus (32,7%), P. aeruginosa (9,7%), Е. coli (13%), К. pneumoniae (13%), С. albicans (12,3%). При этом Pseudomonas aeruginosa являлся наиболее активным продуцентом антагонистических веществ, что согласуется с работам исследователей Чили (Padilla С., 2001) и других авторов.

Взаимосвязь между источником выделения штамма-продуцента бактериоцинов и его антибактериальной активностью мало освещена в публикациях (Padilla С., 2001; Qi Q., 2005). Поэтому был проведен анализ данных скрининга продуцентов бактериоцинов среди клинических образцов и выявлено, что наибольший процент штаммов-антагонистов выделен из зева детей и ран у взрослых. В связи с этим можно высказать предположение о роли бактериоцинов как факторов агрессии при проникновении микробов в макроорганизм через «ворота инфекции», какими могут быть раны и зев.

Небольшой процент выделяемых из образцов бактериоциногенных штаммов объясняется, по-видимому, ' недостатком исследований или несовершенством методов по выявлению этих антибактериальных веществ. При этом выбор наиболее чувствительного индикаторного штамма играет существенную роль (Papagianni М., 2006) В связи с этим в нашей работе был осуществлен подбор оптимального индикаторного штамма для выявления ингибиторного действия штаммов-антагонистов, а также выбран метод выявления антагонизма в жидкой среде. Наиболее чувствительным индикатором для исследований такого рода по нашим данным оказался музейный штамм Micrococcus luteus NCTC 2665.

В ходе проведенных экспериментов нами удалось выделить 4 бактериоциппродуцирующих штамма, идентифицированных как Micrococcus luteus С-1, С-3, С-5, С-7, которые, помимо молочнокислых бактерий, также представляют интерес из-за отсутствия у них токсичности. Например, в реестре для ингредиентов, имеющих статус GRAS, отмечено, что каталазу, синтезируемую Micrococcus lysodeikticus {М. luteus), применяют в производстве сыров (21 CFR § 173.153). Однако, такие метаболиты как . бактериоцины М. luteus мало исследованы и до настоящего времени в России не изучались (Pridmore D., 2006; Kim М., 2005).

Культуры-продуценты Micrococcus luteus С-1, С-3, С-5, С-7, оказались активными против широкого спектра условно патогенных и патогенных музейных штаммов. Нами проведено также изучение других биологических свойств бактериоцинпродуцирующих штаммов, например, физиолого-биохимические особенности. Анализ плазмидного профиля продуцентов показал отсутствие у штаммов плазмид, следовательно, синтез антибактериальных веществ кодирован на хромосоме. Хромосомная локализация генов выявлена также у штаммов P. pentosaceus В-8994, В-8888,

В-8955. Продукциия педиоцинов у P. acidilactici В-8893 и В-8902 контролируется плазмидой размером 11 т.п.н.

Тестирование штаммов Micrococcus luteus С-1, С-3, С-5, С-7 на токсичность в эксперименте на белых мышах показало безвредность культур. Это доказывает их перспективность для практического использования.

С целью интенсификации синтеза антибактериальных веществ микробами- продуцентами Micrococcus luteus С-1, С-3, С-5, С-7 нами осуществлен выбор наиболее оптимальных питательных сред и режимов культивирования продуцентов, обеспечивающих одновременное накопление биомассы и биосинтез. Из 11 традиционных и специально сконструированных питательных сред наиболее пригодной для выращивания и эффективного синтеза бактериоцинов штаммами-продуцентами Micrococcus luteus С-1 - С-7 оказалась соево-казеиновая среда с глюкозой и дрожжевым экстрактом (СПАС № 4а). Известно, что интенсивная продукция бактериоцинов либо соответствует оптимальным условиям роста штамма, либо требует других параметров (Dempster R., 1982; Mataragas М., 2004). В нашем исследовании выяснилось, что исходные значения рН среды (7,2±0,2) существенно не различались как при накоплении биомассы штаммом-продуцентом, так и при максимальном синтезе. Оптимальные значения температуры (37±1 °С) соответствовали этому показателю для мезофилов.

Поскольку микроорганизмы могут продуцировать различные антибактериальные вещества, в первую очередь, органические кислоты и литические ферменты, необходимо дифференцировать эти метаболиты от продукции бактериоцинов (Егоров Н.С., 1999). Основываясь на общепринятых критериях принадлежности веществ к бактериоцинам было доказано, что ингибиторы, продуцируемые штаммами Micrococcus luteus С-1, С-3, С-5, С-7, относятся к бактериоцинам.

При рассмотрении перспективы применения бактериоцинов, синтезируемых выделенными нами штаммами Micrococcus luteus С-1, С-3, С

5, С-7, необходимо, чтобы антибактериальная активность вещества была стабильна при воздействии на субстанции определенных агрессивных факторов среды. Например, для участия в ферментативных процессах, происходящих при производстве продуктов питания требуется устойчивость консервантов к низким кислотным значениям рН, воздействию NaCl в концентрации до 7,5 % (Leroy F., 1999; 2003; Cheigh С., 2002). Кислотоустойчивость необходима также для успешного прохождения бактериоцина через кислую среду желудочно-кишечного тракта в составе пробиотических продуктов или других антибактериальных препаратов.

При изучении основных физико-химических свойств бактериоцинов из штаммов Micrococcus luteus С-1, С-3, С-5, С-7, выяснено, что субстанции устойчивы к воздействию испытанных концентраций NaCl, кислот и щелочей; кипячению в течение 60 мин и автоклавированию при 112 °С в течение 20 мин. Ингибиторные свойства бактериоцинов сохранялись после однократного замораживания-оттаивания культуральной жидкости продуцентов. После хранения штаммов М. luteus С-1 - С-7 в лиофилизированном состоянии течение 2 лет при температуре 4±1°С активность синтезируемых антибактериальных веществ также сохранялась.

В заключение можно отметить, что целесообразно дальнейшее продолжение работы по изучению бактериоцинпродуцирующих штаммов Micrococcus luteus С-1, С-3, С-5, С-7 с целью их прикладного применения.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Горбатко, Екатерина Сергеевна, Москва

1. Баранова И.П., Егоров Н.С., Козлова Ю., Максимов В.Н. Оптимизация среды для биосинтеза низина культурой Streptococcus lactis методом математического планирования эксперимента // Научные доклады высшей школы. Биологические науки. 1974. № 3. - С. 94-98

2. Баранова И.П., Егоров Н.С., Исакова Н.С., Ходжаев М.Н., Попов М.Н., Козлова Ю.И. Использование отечественных кремнеземных адсорбентов для выделения низина из нативного раствора // Биотехнология. 1989. № 5. -С. 588-591.

3. Баранова И.П., Егоров Н.С., Ходжаев М.Н. Применение метода лиофилизации для хранения низинобразующих штаммов культуры Streptococcus lactis штамм 4968 // Научные доклады высшей школы. Биологические науки. 1989. № 2. - С. 497-499.

4. Баранова И.П., Клюева JI.M., Егоров Н.С., Исакова Н.С., Ходжаев М.Н., Бартошевич Ю.Э. Выделение низина из нативного раствора и его очистка на катеонитах // Антибиотики и химиотерапия. — 1992. № 37.

5. Баранова И.П., Заславская П.Л., Егоров Н.С. Некоторые данные о культурально-морфологических особенностях форм диссоциации низинобразующего стрептококка // Антибиотики и химиотерапия. 1995. № 4. - С. 3-7.

6. Бельмер С.В., Гасилина Т. В. Рациональное питание и состав кишечной микрофлоры // Вопросы детской диетологии. № 5., М. 2003. - Т. 1. - С. 17— 20.

7. Блинкова Л.П. Перспективы использования бактериоцинов для профилактики и терапии инфекции // Журн. микробиол. 1984. №5. -С. 1014.

8. Блинкова Л.П. Получение томицида нового бактерийного препарата и изучение его биологической активности. Автореф. дис. д-ра биол. наук. М., 1986.-25с.

9. Блинкова Jl. П. Бактериоцины: критерии, классификация, свойства, методы выявления // Журн. микробиол. 2003. № 3. - С. 109-113.

10. Ю.Виноградская С. Е., Батдыев Ч.М. Из истории домашнего айрана. Вестник СевКавГТУ, серия «Продовольствие»,-2003 -№ 1 (6). - С. 48-50.

11. Государственная фармакопея СССР, XI, вып. 2, 1989, 400 с.

12. Грушина В. А. Изучение Streptococcus lactis штамм МГУ в связи с биосинтезом низина. // Автореферат дис. кандид. биол. наук. МГУ. Москва. 1984.-20 с.

13. Егоров Н.С., Баранова И.П. Бактериоцины. Образование, свойства, применение // Антибиотики и химиотерапия. 1999. - № 6. - С. 33-40.

14. Н.Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках: Учебник для вузов. Изд. 6-е, перераб., доп. М.: 2004, 528 с.

15. Карликанова С.Н., Кимова Э.Т., Виноградская С.Е. Антибиотически активные молочнокислые бактерии в производстве продуктов гарантированного качества // Обзорная информация. М.: ЦНИИТЭИ, 1983. -С.41 -42.

16. Кудлай Д.Г., Лиходед В.Г. Бактериоциногения. Л.: Медицина, 1966.-204 с.

17. Литвинова М.Н., Силева Н.Н. Повышение способности к биосинтезу низина Streptococcus lactis II Труды ВНИИ срдств защиты растений и бактериальных препаратов. 1976. - В. 4. - С. 84-89.

18. Машенцева Н.Г., Хорольский В.В., Блинкова Л.П., Баранова Е.А., Горбатко Е.С., Лаптев И.А. Генетические детерминанты синтеза педиоцинов // Журн. микробиол. 2008. -№ 5.-е. 3-6.

19. Микробиология: методические рекомендации к лабораторным занятиям иконтроль самостоятельной работы студентов. / Лысак В.В., Желдакова Р.А. -Мп.: БГУ, 2002.- 100 с.

20. Митрохин С.Д. Значение синегнойной палочки в инфекционной патологии человека // Инфекции и антимикробная терапия. 2004. № 06(3). - С. 10-15

21. Стоянова Л.Г. Новые бактериоцины лактококков и их практичесоке использование. Дисс. док. биол. наук. МГУ. Москва. 2008. 356 с.

22. Червинец В.М., Бондаренко В.М., Самоукина А.М, Червинец Ю.В. Скрининг непатогенных антагонистических активных штаммов Enterococcus faecium И Журн. микробиол.- 2007—4.1— с. 57-61

23. Шарга Б.М., Туряица А.И. Исследование антимикробного спектра действия бактериоцинов и бактериофагов некоторых штаммов Klebsiella II Микробиол. журн. 1993. № 55(5). - С. 59-68.

24. Щетко В.А., Головнева Н.А., Грель М.В., Астапович Н.И. Закономерности продукции бактериоцино-подобных соединений бактериями р. Bifidobacterium: Материалы Междунар. науч. конф. молодых ученых "Молодежь в науке 2004", Минск, 8 - 13 ноября 2004 г.

25. Aasen I., Moretro Т., Katla Т., Axelsson L., Storro I. Influence of complex nutrients, temperature and pH on bacteriocin by Lactobacillus sakei CCUG 42687 // Appl Microbiol Biotechnol 2000. - Vol. 53(2). - P. 159-166.

26. Abee Т., Krockel L., Hill C. Bacteriocins: modes of action and potentials in food preservation and control of food poisoning // Int J Food Microbiol. 1995. - Vol. 28.- P. 69-185.

27. Aly R., Shinefield H., Maibach H. Bacterial interference among Staphylococcus aureus strains // Bacterial interference. CRC Press, Boca Raton, Fla. 1995.1. Vol. 59.-P. 13-23.

28. Anastasiadou S., Papagianni M., Ambrosiadis I., Koidis P. Rapid quantifiable assessment of nutritional parameters influencing pediocin production by Pediococcus acidilactici NRRL B5627 // Bioresour Technol. 2008. - Vol. 99(14).-P. 6646-6650.

29. Andersen L. Biopreservation with FloraCam L-2 // Fleischwirtschaft. 1995. -Vol. 75 - P. 1327-1329.

30. Anderson D., McKay L. Simple and rapid method for isolating large plasmid DNA from lactic streptococci // Appl Environ Microbiol.-1983.-Vol. 46(3).-P. 549-552.

31. Baccus-Taylor G., Glass K., Luchansky J., Maurer A. Fate of Listeria monocytogenes and pediococcal starter cultures during the manufacture of chicken summer sausage. // Poult Sci. 1993. - Vol. 72(9). - P. 1772-1778.

32. Barberis I., Pajaro M., Godino S., Aichino C. In vitro inhibition of the growth of Gardnerella vaginalis by bacteriocins produced by strains of Pseudomonas aeruginosa II Enferm Infect Microbiol Clin. 1997. - Vol. 15(9). - P. 473-476.

33. Barefoot S., Grinslead D., Jenseniin G. A heat-stable bacteriocin produced by Propionibacterium jensenii P126 // Appl Environ Microbiol. 1992. - Vol. 58(1).-P. 215-220.

34. Bizani D., Brandelli A. Influence of media and temperature on bacteriocin production by Bacillus cereus 8A during batch cultivation // Appl Microbiol Biotechnol. — 2004. Vol. 65(2). - P. 158-162.

35. Brook I. The role of bacterial interferens in otitis, sinusitis and tonsillitis otolaryngology // Haed. Neck. Surg. 2005. - Vol. 58. - P. 1205-1209.

36. Buchanan S. Bacterial metal detectors // Mol Microbiol. 2005. - Vol. 58(5). - P. 1205-1209.

37. Bukhtiyarova M., Rongguang Y., Bibek R. Analysis of the pediocin AcH gene cluster from plasmid pSMB74 and its expression in pediocin-negative Pediococcus acidilactici strain // Appl Environ Microbiol. 1994. - Vol. 60 (9).1. P. 3405-3408.

38. Buzby J., Roberts T. Economic costs and trade impacts of microbial foodborne illness // World Heath Stat. 1997. - Vol. 50(2). - P. 57-66.

39. Cascales E., Buchanan S., Duche D., Kleanthous C., Lloubes R., Postle K., Riley M., Slatin S., Cavard D. Colicin biology // Microbiol Mol Biol Rev. 2007. -Vol. 71(1).-P. 158-229.

40. Chen C., Sebranek J., Dickson J., Mendonca A. Combining pediocin with post-packaging irradiation for control of Listeria monocytogenes on frankfurters // J. Food Prot. 2004. - Vol. 67. - P. 1866-1875.

41. Chikindas M., Venema K., Ledeboer A., Venema G., Kok J. Expression of lactococcin A and pediocin PA-1 in heterologous hosts // Lett Appl Microbiol. -1995.-Vol. 21(3).-P. 183-189.

42. Chikindas M., Novak J., Caufield P., Schilling K., Tagg J. Microbially-produced peptides having potential application to the prevention of dental caries // Int J Antimicrob Agents. 1997. - Vol. 9(2). - P. 95-105.

43. Chinachoti N., Matsusaki H., Sonomoto K., Ishikazi A. Utilization of xylose as an alternative carbon source for nisin Z production by Lactococcus lactis Ю-1 // J. Fac. Agric Kyushu Univ. 1997. - Vol. 43. - P. 437-448.

44. Christensen D., Hutkins R. Collapse of the proton motive force in Listeria monocytogenes caused by a bacteriocin produced by Pediococcus acidilactici II Appl. Environ. Microbiol. 1992. - Vol. 58. - P. 3312-3315.

45. Cintas L., Casaus P., Holo H., Hernandez P., Nes I., Havarstein L. Enterocins L50A and L50B, two novel bacteriocins from Enterococcus faecium L50, are related to staphylococcal hemolysins // J Bacteriol. 1998. - Vol. 180(8). - P. 1988-1894.

46. Cladera-01ivera F., Caron G., Brandelli A. Bacteriocin-like substance production by Bacillus licheniformis strain P40 // Lett Appl Microbiol.- 2004. Vol. 38(4). -P. 251-256.

47. Clarke D., Robson R., Morris J. Purification of two Clostridium bacteriocins by procedures appropriate to hydrophobic proteins // Antimicrob. Agents Chemother. 1975. - Vol. 7. - P. 256-264.

48. Cleveland J., Montville Т., Nes I., Chikindas M. Bacteriocins: safe, natural antimicrobials for food preservation // International Journal of Food Microbiology. 2001. - Vol. 71. - P. 1-20.

49. Coderre P., Somkuti G. Cloning and expression of the pediocin operon in Streptococcus thermophilus and other lactic fermentation bacteria // Curr. Microbiol. 1999. - Vol. 39.-P. 295-301.

50. Corona A. Which is the right antibiotic treatment for ventilator-associated pneumonia? // Crit Care Med. 2007. - Vol. 35(7). - P. 1808-1809.

51. Daba H., Lacroix C., Huang J., Simard R. Influence of growth conditions on production and activity of mesenterocin 5 by a strain of Leuconostic mesenteroides II Appl. Microbiol. Biotechnol. 1993. - Vol. 39. - P. 166-173.

52. Dajani A., Wannamaker L. Demonstration of a bacterial substance against beta-hemolytic streptococci in supernatant fluids of staphylococcal cultures // J. Bacteriol. 1969. - Vol. 97. - P. 985-991.

53. Daret S. New inhibitors targeting bacterial RNA polymerase // Trends Biochem. Sci. 2004. - Vol. 29. - P. 159-162.

54. Daeschel M., Klaenhammer T. Association of a 13.6-megadalton plasmid in Pediococcus pentosaceus with bacteriocin activity // Appl Environ Microbiol. -1985. Vol. 50(6). - P. 1538-1541.

55. Degnan A., Yousef A., Luchansky J. Use of Pediococcus acidilactici to control Listeria monocytogenes in temperature abused vacuum-packaged wieners // J. Food Prot. 1992. - Vol. 55. - P. 98-103.

56. Delgado S., Florez A., Mayo B. Antibiotic susceptibility of Lactobacillus and • Bifidobacterium species from the human gastrointestinal tract // Curr Microbiol.- 2005. Vol. 50(4). - p. 202-207.

57. Delves-Broughton J., Blackburn P., Evans R., Hugenholtz J. Applications of the bacteriocin, nisin // Antonie van Leeuwenhoek. 1996. - Vol. 69. - P. 193-202.

58. Dempster R., Tagg J. The production of bacteriocin-like substances by the oral bacteriocin Streptococcus salivarius II Arch. Oral. Biol. 1982. - Vol. 27. P. 151-157.

59. Derkach E., Derkach W. Effect of the purified antibiotic neocid on the peripheral blood of laboratory animals // Antibiotiki. 1970. - Vol. 15(3). - P. 274-276.

60. Drosinos E., Mataragas M., Nasis P., Galiotou M., Metaxopoulos Growth and bacteriocin production kinetics of Leuconostoc mesenteroides El31 // J,J Appl Microbiol. 2005. - Vol. 99(6). - P. 1314-1323.

61. Duncan S., Doherty C., Govan J., Neogrady S., Galfi P., Stewart C. Characteristics of sheep-rumen isolates of Pseudomonas aeruginosa inhibitory to the growth of Escherichia coli 0157 // FEMS Microbiol Lett.-1999.-Vol.15.180(2).-P.305-10.

62. Ehrmann M., Remiger A., Eijsink V., Vogel R. A gene cluster encoding plantaricin 1.25beta and other bacteriocin-like peptides in Lactobacillus plantarum TMW1.25 // Appl. Environ. Microbiol. 1999. - 65. - P. 5350-5356.

63. Enfedaque J., Ferrer S., Francesc Q. et al. Identification of E.coli surface components involved in bacteriocin binding and translocation // Can J Microbiol. 1996. -Vol.42(l). -P. 19-26.

64. Ennahar S., Sonomoto K., Ishizaki A. Class Ha bacteriocins from lactic acid bacteria: antibacterial activity and food preservation // J Biosci Bioeng. 1999. -Vol. 87(6).-P. 705-716.

65. Ferrendez A., Norn N., Gasson M. et al. High-level coproduction of the bacterocins nisin A and lactococcin A by Lactococcus lactis II J. Dairy Res. -2004. Vol. 71.-P. 216.

66. Florey IT. The use of micro-organisms for therapeutic purposes // Yale J. Biol. Med. 1946.-Vol. 19.-P. 101-117.

67. Florey H., Chain E., Heatley N., Jennings M., Sanders A., Abraham E., Florey M. Antibiotics // Oxford University Press, London. 1949. - P. 417-565.

68. Foegeding P., Thomas A., Pilkington D., Klaenhammer T. Enhanced control of Listeria monocytogenes by in situ-produced pediocin during dry fermented sausage production // Appl Environ Microbiol. 1992. - Vol. 58(3). - P. 884890.

69. Franke C., Tiemersma J.,. Venema G., Kok J. Membrane topology of the lactococcal bacteriocin ATP-binding cassette transporter protein LcnC. Involvement of LcnC in lactococcin a maturation // J Biol Chem. 1999. - Vol. 26-274(13).-P. 8484-8490.

70. Franz C., Schillinger U., Holzapfel W. Production and characterization of enterocin 900, a bacteriocin produced by Enterococcus faecium BFE 900 from black olives //Int. J. Food Microbiol. 1996. - Vol. 29(2-3). - P. 255-270.

71. Friedrich-Karl Lticke Utilization of microbes to process and preserve meat // Applied and Environmental Microbiology. 2003. - Vol. 7. - P. 3833-3839.

72. Gahan С., O'Driscoll В., Hill С. Acid adaptation of Listeria monocytogenes can enhance survival in acidic foods and during milk fermentation // Appl. Environ. Microbiol. 1996. - Vol. 62. - P.3128-3132.

73. Gardiner G., Rea M., O'Riordan В., O'Connor P., Morgan S., Lawlor P., Lynch P., Cronin M., Ross R., Hill C. Fate of the two-component lantibiotic lacticin 3147 in the gastrointestinal tract // Appl Environ Microbiol. 2007. - Vol. 73(21).-P. 7103-7109.

74. Ghrairi Т., Manai M., Berjeaud J., Frere J. Antilisterial activity of lactic acid bacteria isolated from rigouta, a traditional Tunisian cheese // J Appl Microbiol. -2004. Vol. 97(3). - P. 621-628.

75. Ghrairi Т., Frere J., Berjeaud J. et al. Lactococcin MMT24, a novel two-peptide bacteriocin prodused by Lactococcus lactis isolated from rigouta cheese // Int. J. Microb. 2005. - Vol. 105. - P. 389-398.

76. Giacomini A., Squartini A., Nuti M. Nucleotide sequence and analysis of plasmid pMD136 from Pediococcus pentosaceus FBB61 (ATCC43200) involved in pediocin A production // Plasmid. 2000. - Vol. 43(2). - P. 111-22.

77. Gillor O., Nigro L., Riley M. Genetically engineered bacteriocins and their potential as the next generation antimicrobials // Current Pharmaceutical Design. -2005. Vol. 11.-P. 1-9.

78. Giraffa G., Gatti M., Beltzame A. Antimicrobial activity of lactic acid bacteria isolated from fermented meat products // Ann Microbiol Enzimol. 1994. - Vol. 44(1).-P. 29-34.

79. Goebel W., Barry G., Jesaitis M., Miller E. Colicin К // Nature (London). -1955. Vol. 176.-P. 700-701.

80. Grahami D. , McKay L. Plasmid DNA in strains of Pediococcus cerevisiae and Pediococcus pentosaceus II Appl Environ Microbiol. 1985. - Vol. 50(2). - P. 532-534.

81. Gratia A., Fredericq P. Deversite des souches antibiotiques de Escherichia coli et etendue varibile de leur champ d'action // Ibid. 1932. - P. 1032 - 1033.

82. Gray E., Wannamaker L. Bactericidal substance from Staphylococcus aureus. Biological properties //J.Exp. Med. 1970. - Vol. 131.-P. 1004-1015.

83. Guasch J., Enfedaque J., Fetter S. et al. Bacteriocin 286, a chromosomally encodcd bacteriocin produced by most Serratia marcescens biotypes // Res Microbiol. 1995. - Vol. 146(6). - P. 477-483.

84. Gutierrez J., Criado R., Martin M. et al. Production of enterocin P, an antilisterial pediocin-like bacteriocin from Enterococcus faecium P13, in Pichia pastoris II Ant Agents and Chemotherapy. 2005. - Vol. 49. - P. 3004-3008.

85. Hale E., Hinsdill R. Characterization of a bacteriocin from Staphylococcus aureus strain 462 // Antimicrob. Agents Chemother. 1973. - Vol. 4. - P. 634640.

86. FIale J., Nicholas C., Heng, Ralph W. et al. Identification of nlmTE, the locus encoding the ABC transport system required for export of nonlantibiotic mutacins in Streptococcus mutans II J. Bacteriol. 2005. - Vol. 187. - P. 50365039.

87. Hansen J., Banerjee S., Buchman G. Potential of small ribosomally synthesized bacteriocins in design of new food preservatives // J. Food Saf. -1989. Vol. 10.-P. 119-130.

88. Hansen N. Antibiotics synthesized by posttranslational modification // Annu. Rev. Microbiol. 1993. - Vol. 47. - P. 535-564.

89. Hein Т., Qamirani E., Ren Y., Kuo L. C-reactive protein inhibits endothelium-dependent NO-mediated dilation in coronary arterioles by activating p38 kinase and NAD(P)H oxidase // Arterioscler Thromb Vase Biol. 2005. -Vol. 25(5).-P. 995-1001.

90. Heller K., Burt В., Eklund S. Sugared soda consumption and dental caries in the United States // J Dent Res. 2001. - Vol. 80(10).-P. 1949-1953.

91. Hirao I., Harada Y., Nojima Т., Osawa Y., Masaki H., Yokoyama S. In vitro selection of RNA aptamers that bind to colicin E3 and structurally resemble the decoding site of 16S ribosomal RNA // Biochemistry. 2004. - Vol. 23-43(11).1. P. 3214-3221.

92. Holland W., Halil Т., Elliott A. The effect of environmental factors on ventilatory function in schoolchildren // Aspen Emphysema Conf. 1968. - Vol. 11.-P. 259-272.

93. Horn N., Fernandez A., Dodd H. et al. Nisin-controlled production of pediocin PA-1 and colicin V in nisin- and non-nisin-producting Lactococcus lactis strains // Appl. Environ. Microb. 2004. - Vol. 70. - P. 5030-5032.

94. Horn N., Martinez M., Martinez J., Hernandez P., Gasson M., Rodriguez J., Dodd H. Enhanced production of pediocin PA-1 and coproduction of nisin and pediocin PA-1 by Lactococcus lactis II Appl. Environ. Microbiol. 1999. - Vol. 65.-P. 4443-4450.

95. Hugas M., Garriga M., Aymerich M. Functionality of enterococci in meat products // Int J Food Microbiol. 2003. - Vol. 1-88(2-3). - P. 223-233.

96. Hurst A., Rayman M., Aris B. Nisin: a possible alternative or adjunct to nitrite in the preservation of meats // Appl Environ Microbiol. 1981. - Vol. 41(2).-P. 375-380.

97. Inoue Т., Tomita H., Ike Y. Вас 32, a novel bacteriocin widely disseminated among clinical isolates, of Enterococcus faecium II Antimicrob Agents Chemother. 2006. - Vol. 50(4). - P. 1202-1212.

98. Ivanovics G., Alfoldi L. Bacteriocinogenesis in Bacillus megaterium IIJ Gen Microbiol. 1957. - Vol. 16(3) - P. 522-530.

99. Jack R., Tagg J., Ray B. Bacteriocins of Gram-Positive Bacteria // Microbiological rewiews. 1995. - Vol. 59(2). - P. 171-200.

100. Jacob F., Simonovitch L., Wollman E. Comparison between the induced biosynthesis of colicine and of bacteriophage and between their mode of action.1953. Vol. 84(1).-P. 313-318.

101. Jetten A., Vogels G., de Windt F. Production and purification of Staphylococcus epidermidis bacteriocin // J. Bacteriol. 1972. - Vol. 112. — P. 235-242.

102. Jozefowicz-Piatkowska H., Piatkowski K. Determination of bacteriocinogenic types of strains of Proteus mirabilis II Med Dosw Mikrobiol. -1994.-Vol. 46(3).-P. 151-160.

103. Johnson J., Doyle M., Cassens R., Schoeni J. Fate of Listeria monocytogenes in tissues of experimentally infected cattle and in hard salami // Appl. Environ. Microbiol. 1988. - Vol. 54. - P. 497-501.

104. Joosten H., Nunes M., Devreese B. et al. Purification and characterization of enterocin 4, a bacteriocin produced by Enterococcus faecalis INIA 4 // Appl Environ Microbiol. 1996. - Vol. 6-6(11). P. 4220-4223.

105. Kalmokoff M., Bartlett F., Teather R. Are ruminal bacteria armed with bacteriocins? // J Dairy Sci. 1996. - Vol. 79(12). - P. 2297-2306.

106. Kantor A., Montville Т., Mett A., Shapira R. Molecular characterization of the replicon of the Pediococcus pentosaceus 43200 pediocin A plasmid pMD136 // FEMS Microbiol Lett. 1997. - Vol. 15-151 (2). - P. 237-244.

107. Kecskes G., Belagyi Т., Olah A. Early jejunal nutrition with combined pre-and probiotics in acute pancreatitis—prospective, randomized, double-blind investigations // Magy Seb. 2003. - Vol. 56(1). - P. 3-8.

108. Kelstrup J., Gibbson R. Bacteriocins from human and rodent streptococci // Arch. Oral. Biol. 1969. - Vol. 14.-P. 251-258.

109. Khouiti Z., Simon J. Carnocin KZ213 produced by Carnobacterium piscicola 213 is adsorbed into cells during growth. Its biosynthesis is regulated by temperature, pll and medium composition // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. -2004.-Vol. 31(1).-P. 5-10.

110. Kim M., Kong Y., Baek H., Hyun H. Production, purification, and characterization of micrococcin G05, a bacteriocin produced by Micrococcus sp.

111. G05 isolated from kimchi// J Food Prot. 2005.- Vol. 68(1).-P. 157-163.

112. Kim M., Kong Y., Baelc H., Hyun PI. Optimization of culture conditions and medium composition for the production of micrococcin G05 by Micrococcus sp. G05 //J Biotechnol. 2006. - Vol. 2-121(1). P. 54-61.

113. Klaenhammer T. Bacteriocins of lactic acid bacteria // Biochimie. 1988. -Vol. 70(3).-P. 337-349.

114. Kleanthous C., Walker D. Immunity proteins: enzyme inhibitors that avoid the active site // Trends Biochem Sci. 2001. - Vol. 26. - P. 624-631

115. Kleerebezem M. Quorum sensing control of lantibiotic production; nisin and subtilin autoregulate their own biosynthesis // Peptides. 2004. - Vol. 25. - P. 1405-1414.

116. Kleinkauf H., von Dohren H. Nonribosomal biosynthesis of peptide antibiotics // Eur. J. Biochem. 1990,- Vol. 192. - P. 1-15.

117. Kojic M., Strahinic I., Topisirovic L. Proteinase PI and lactococcin A genes are located on the largest plasmid in Lactococcus lactis subsp. lactis bv. diacetylactis S50 // Can J Microbiol. 2005. - Vol. 51(4). - P. 305-314.

118. Korshunov V., Kafarskaia L., Volodin N., Tarabrina N. The correction of dysbiotic disorders of the vaginal microflora by using a preparation made from highly adhesive lactobacteria // Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol. 1990. -Vol. (7).-Vol.-P. 17-19.

119. Kot В., Bukowski K., Jakubczak A. Analysis of bacteriocinogenic properties of Yersinia enterocolitica strains // Med. Dosw. Microbiol. 1999. - Vol. 51(1-2). - P. 91-101.

120. Krzeminski Z., Majda-Stanislawska E. Antagonistic properties of bacterial flora in the mouth and throat of children // Med Dosw Mikrobiol.b 1996. - Vol. 48(3-4).-P. 117-121.

121. Krier F., Revol-Junelles A., Germain P. Influence of temperature and pH on production of two bacteriocins by Leuconostoc mesenteroides subst. mesenteroides FR52 during batch fermentation // Appl. Microbiol. Biotechnol.1998. Vol. 50(3).-P. 359-363.

122. Lachowicz T. Investigations on staphylococcus // Zentralbl. Bacteriol. Parasitenkd Infektionskr. Hyg. Abt. 1 Orig. Reihe A. 1965. - Vol. 196 - P. 340351.

123. Lachovicz Т., Brodzicki S. Stimulation of staphylococcin A, production and some properties. In: Staphylococci and staphylococcae infections // Warsaw: Polish Medical Publishers. 1973. - P. 450-456.

124. Laemmli U. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature (London). 1970. - Vol. 227. - P. 680-685.

125. Lejeune R., Callewaert R., Crabbe A., De Vuyst L. Modelling the growth and bacteriocin production by Lactobacillus amylovorus DCE 471 in batch cultivation//J. Appl. Bacteriol. 1998. - Vol. 84.-P. 159-168.

126. Lepargneur J., Rousseau V. Protective role of the Doderlein flora // J Gynecol Obstet Biol Reprod (Paris). 2002. - Vol. 31 (5). - P. 485-494.

127. Leroy F, Foulquie, Moreno MR, De Vuyst L. Related Articles Enterococcus faecium RZS C5, an interesting bacteriocin producer to be used as a co-culture in food fermentation // Int J Food Microbiol. 2003. - Vol. 1-88(2-3). - P. 235240.

128. Leroy F., de Vuyst L. A combined model to predict the functionality of the bacteriocin-producing Lactobacillus sakei strain CTC 494 // Int. J. Food Microbiol. 2003. - Vol. 80(1). - P. 89-97.

129. Leroy F., de Vuyst L. Bacteriocin production by Enterococcus faecium RZS C5 is cell density limited and occurs in the very early growth phase // Int. J. Food Microbiol. 2002. - Vol. 72(1-2). - P. 155-164.

130. Leroy F., de Vuyst L. Temperature and pH conditions that prevail during fermentation of sausages are optimal for production of the antilisterial bacteriocin sakacin К // Appl. Environ. Microbiol. 1999. - Vol. 65(3). - P.974-981.

131. Leroy F., de Vuyst L. The presence of salt and a curing agent reduces bacteriocin production by Lactobacillus sakei CTC 494, a potential starter culturefor sausage fermentation // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. - Vol. 51(2). — P. 249-254.

132. Li Hong, Jin Tao Study on the inhibition effect of nisin // J. Amer. Sci.-2005 .-Vol. 1 (2).-P.33-3 7

133. Liao Y., Zhang J., Lu X. Bactericidal peptide targeted against penicillin/methicillin-resistant Staphilococcus aureus an engineered multidomain protein machine // Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban. -2003. -Vol. 34.-P. 605-609.

134. Liu W., Hansen J. Enhancement of the chemical and antimicrobial properties of subtilin by site directed mutagenesis // J. Biol. Chem. 1992. - Vol. 267. - P. 25078-25085.

135. Mahajan V., Srikanth Т., Agarwal L., Pseudomonas aeruginosa: isolation from ocular tissues. Aeruginocin typing and its relationship to corneal pathogenicity in rabbits // Int Ophthalmol. 1982. - Vol. 4(3). - Vol. 169-176.

136. Maqueda M., Galvez A., Bueno M., Sanchez-Barrena M., Gonzalez C., Albert A., Rico M., Valdivia E. Peptide AS-48: prototype of a new class of cyclic bacteriocins // Curr Protein Pept Sci.-2004.-Vol. 5(5).-P.399-416.

137. Marqueda M., Golvez A., Bueno M., Peptid AS-48: Prototype pf a new class of cyclic bacteriocins //Curr.Protein Pept.Sci.-2004.-Vol.5.-P. 1-18

138. Mataragas M., Drosinos E., Tsakalidou E., Metaxopoulos J. Influence of nutrients on growth and bacteriocin production by Leuconostoc mesenteroides LI24 and Lactobacillus curvatus L442 // Antonie Van Leeuwenhoek.-2004.-Vol.85(3).- Vol.191-198.

139. Meghrous J., Huot M., Quittelier M., Petitdemange H. Regulation of nisin biosynthesis by continuous cultures and by resting cells of Lactococcus lactis subsp. lactis II Res. Microbiol.-1992.- VoU43.-P.879-890.

140. Meitert E. Sur les bacteriocines de Corynebacterium diphtheriae. II. Etude des bact6riocines produites par C. diphtheriae, C.ulcerans, C.atypique, C.hoffmanii et C.xerose II Arch Roum. Pathol. Exp. Microbiol.-1969.- Vol.28.-P.1086-1097.

141. Metchinikoff E. The prolongation of life // Optimistic studies. William1. Heinemann, London. 1907.

142. Miller K., Ray P., Steinmetz Т., Hanekamp Т., Ray B. Gene organization and sequences of pediocin AcH/PA-1 production operons in Pediococcus and Lactobacillus plasmids // Lett Appl Microbiol.-2005.- Vol.40(l).-P.56-62.

143. Millette M., Smoragiewicz W., Lacroix M. Antimicrobial potential of immobilized Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC 11454 against selected bacteria // J. Food Prot.-2004.- Vol.67(6).-P. 1184-1189.

144. Mora L. Diaz N., Buckingham R., de Zamaroczy M. Import of the transfer RNase colicin D requires site-specific interaction with the energy-transducing protein TonB // J Bacteriol.-2005.- Vol.l87(8).-P.2693-2697.

145. Moretro Т., Aasen I., Storro I., Axelsson L. Production of sakacin P by Lactobacillus sakei in a completely defined medium // Lett. Appl. Microbiol.-2000,- Vol.30(2).-P.126-129.

146. Mosbahi K., Walker D., James R., Moore G., Kleanthous C. Global structural rearrangement of the cell penetrating ribonuclease colicin E3 on interaction with phospholipid membranes // Protein Sci.-2006.- Vol.15(3).-P.620-627.

147. Mota-Meira M., Morency H., Lavoie M. In vivo activity of mutacin B-Ny266 // Microbiol.-2007.- Vol.73(21).-P.7103-7109.

148. Motlagh A., Bukhtiyarova M., Ray B. Complete nucleotide sequence of pSMB 74, a plasmid encoding the production of pediocin AcH in Pediococcus acidilactici II Lett Appl Microbiol.-1994.-Vol.l8(6).-P.305-312.

149. Motta A., Brandelli A. Influence of growth conditions on bacteriocin production by Brevibacterium linens II Appl. Microbiol. Biotechnol.-2003.-Vol.62(2-3).-P. 163-167.

150. Motta A., Cannavan F., Tsai S., Brandelli A. Characterization of a broad range antibacterial substance from a new Bacillus species isolated from Amazon basin 11 Arch Microbiol.-2007.- Vol.l88(4).-P.367-75.

151. Murtvedt-Abildgaard C., Nissen-Meyer J., Jelle В., Grenov В., Skaugen M.,

152. Nes I. Production and pH-dependent bactericidal activity of lactocin S, a lantibiotic from Lactobacillus sake // Appl. Environ. Microbiol.-1995.- Vol.61.-P.175-179.

153. Niedzielin K., Kordccki H., Birkenfeld B. A controlled, double-blind, randomized study on the efficacy of Lactobacillus plantarum 299V in patients with irritable bowel syndrome // Eur J Gastroenterol Hepatol.-2001.- Vol. 13(10).-P.l 135-1136.

154. Nemeth A., Gasparik-Reichardt J., Farkas J. Identification and characterization of bacteriocins produced by lactic acid bacteria // Fleischwirtschaft-1996.-Vol.70(10).-P. 1042-1044.

155. Nes I., Bao Diep D., Havarstein L., Bruberg M., Eijsink V., Holo H. Biosynthesis of bacteriocins in lactic acid bacteria // Antonie van Leeuwenhoek.-1996,- Vol.70.-P.l 13-128.

156. Nes I., Holo H. Class II antimicrobial peptides from lactic acid bacteria // Biopolymers.-2000.- Vol.55(l).-P.50-61.

157. Nettles C., Barefoot S. Biochemical and genetic characteristics of bacteriocins of food-associated lactic acid bacteria. // J. Food Prot.-l993.-56.-P.338-356.

158. Nissen-Meyer J., Holo H., Havarstein L. A novel lactococcal bacteriocin whose activity depends on the complemetary action of two peptides // J Bacteriol.-1992.- Vol. 174(17).-P.5686-5692.

159. Nissen-Meyer J., Larsen A., Sletten K. Purification and chracterization of plantaricin A, a Lactobacillus plantarum bacteriocin whose activity depends on the action of two peptides //J Gen Microbiol.-1993.- Vol. 139(9).-P. 1973-1978.

160. Nissle A. Ueber die Grundlagen einer neuen aursa'chlichen Beka'mpfung der pathologischen Darmflora // Dtsch. Med. Wochenschr.-1916.-Vol.42.-P.l 181-1184.

161. Noonpakdee W., Santivarangkna C., Jumriangrit P., Sonomoto K., Panyim S. Isolation of nisin-producing Lactococcus lactis WNC 20 strain from ham, atraditional Thai fermented sausage. // Appl. Environ. Microbiol.-2002.-Vol.68.-P.6051-6058.

162. Osmanagaoglu O., Beyatli Y., Gunduz U. Cloning and expression of a plasmid-linked pediocin determinant trait of Pediococcus acidilactici F // J Basic Microbiol.-2000.- Vol.40( 1 ).-P.41 -49.

163. Ozelci H., Stacker В., de Margerie H. Production of colicine by single bacteria //Nature.-1959.- Vol.l(184).-P.337-339.

164. Padilla C., Brevis P., Lobos O., Hubert E., Zamorano A. Production of antimicrobial substances, by hospital bacteria, active against other microorganisms // J Hosp Infect.-2001.-Vol.49(1).-P.43-47.

165. Parente E., Hill C. A comparison of factors affecting the production of two bacteriocins from lactic acid bacteria // J. Appl. Bacteriol.-1992.-Vol. 73.-P.290-298.

166. Parente E., Ricciardi A. Effect of nitrogen and carbohydrate sources on lactic acid and bacteriocin production by Enterococcus faecium DPC1146 // Agro-Industry Hi Tech.-1994.-Vol.5.-P.35-39.

167. Parker M., Tucker A., Tsernoglou D., Pattus F. Insights into membrane insertion based on studies of colicins // Trends Biochem. Sci.-1990.-Vol. 15,-P.126-129.

168. Perez Pulido R., Abriouel H., Ben Omar N., Lucas Lopez R., Martinez Canamero M., Galvez A. Plasmid profile patterns and properties of pediococci isolated from caper fermentations // J Food Prot.-2006.-Vol. 69(5).-P.l 178-1182.

169. Pridmore D., Rekhif N., Pittet A., Suri В., Mollet B. Variacin, a new lanthionine-containing bacteriocin produced by Micrococcus varians: comparison to lacticin 481 of Lactococcus lactis II Appl Environ Microbiol.- 1996.1. Vol.62(5).-P. 1799-1802.

170. Pierrat O., Maxwell A. Evidens for the role of DNA strand passage in the mechanism of action of microcin В17 on DNA gyrase // Biochemistry.-2005.-Vol.44.-P.4204-4215.

171. Pommier S., Gavioli M., Cascales E., Lloubes R. Tol-dependent macromolecule import through the Escherichia coli cell envelope requires the presence of an exposed TolA binding motif // J Bacteriol.-2005.-Vol. 187(21 ).P.7526-7234.

172. Prasad S., Morris P., Hansen R., Meaden P., Austin B. A novel bacteriocin-like substance (BLIS) from a pathogenic strain of Vibrio harveyi II Microbiology.-2005.-Vol. 151.-P.3051-3058.

173. Qi Q., ITu T, Zhou X. Frequency, species and molecular characterization of oral Candida in hosts of different age in China // J Oral Pathol Mcd.-2005.-Vol.34(6).-P.352-356.

174. Rawis R. Identification and characterization of bacteriocins produced by lactic acid bacteria // Chem Eng Ncw.-1997.-Vol.75(22).-P.35-39.

175. Ray P., Sanchez C., O'Sullivan D., McKay L. Classification of a bacterial isolate, from pozol, exhibiting antimicrobial activity against several gram-positive and gram-negative bacteria, yeasts, and molds // J Food Prot.-2000.-Vol.63(8).-P.l 123-1132.

176. Razavilar V., Genigeorgis C. Prediction of Listeria spp. growth as affected by various levels of chemicals, pH, temperature and storage time in a model broth // International Journal of Food Microbiology.-1998,- Vol.40.-P.149-157

177. Reid G., Soboh F., Bruce A., Mittelman M. Effect of nutrient composition on the in vitro growth of urogenital lactobacilli and uropathogens // Can J Microbiol.-1998.- Vol.44(9).-P.866-871.

178. Reid G. The potential role of probiotics in pediatric urology // J Urol.-2002.-Vol.l68(4-l).-P.1512-1517.

179. Rodelas В., Gonsales-Lopes J., Salmeron V. Bacteriocin produced by astrain of Rhizobium leguminosarum bv viceae // РЖ Биология,-1996,-Vol.5(143).-P.22.

180. Rodriguezf M., Cintas L., Casaus P., Martinez M., Suarez A., Hernandez P. Detection of pediocin PA-1-producing pediococci by rapid molecular biology techniques//Food Microbiol.-1997.-Vol,14(4).-P.363-371.

181. Rogers A. Effect of the medium on bacteriocin production strains of Streptococcus rawtara//J.Appl.Microbiol.-1972.-Vol.24.-P.294-295.

182. Rollema H., Kuipers O., Both P. Improvement of solubility and stability of the antimicrobial peptide nisin by protein engineering // Appl. Envir. Microb.-1995,- Vol.61.-P.2873-2878.

183. Ross RP, Galvin M, McAuliffc O, Morgan SM, Ryan MP, Twomey DP, Meaney WJ, Hill C. Developing applications for lactococcal bacteriocins. // Antonie Van Leeuwenhoek. 1999 Jul-Nov;76(l-4):337-46.

184. Sablon E, Contreras B, Vandamme E Antimicrobial peptides of lactic acid bacteria: mode of action, genetics and biosynthesisAdv Biochem Eng Biotechnol. 2000;68:21-60

185. Salcido S. National Patient Safety Goals: pressure ulcers // Adv Skin Wound Care.-2007.-Vol.20( 12).-P.630-632

186. Schillinger U., Liicke F. Antibacterial activity of Lactobacillus sake isolated from meat // Appl. Environ. Microbiol.-1989.-Vol.8.-P.1901-1906.

187. Schlegel R., Slade H. Properties of a Streptococcus sanguis (Group H) bacteriocin and its separation from the competence factor of transformation // J. Bacteriol.-1973 .-Vol .115 .-P.655-661.

188. Schoeman H., Vivier M., Du Т., Dicks L., Pretorius I. The development of bactericidal yeast strains by expressing the Pediococcus acidilactici pediocingene (pedA) in Saccharomyces II Saccharomyces cerevisiae Yeast.-1999.-Vol.15.-P.647—656.

189. Schved F., Lalazar A, Henis Y, Juven B. Purification, partial characterization and plasmid-linkage of pediocin SJ-1, a bacteriocin produced by Pediococcus acidilactici И J Appl Bacterid.-1993.-Vol.74(l).-P.67-77.

190. Senne M., Gilliland S. Antagonistic action of cells of Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis against pathogenic and spoilage microorganisms in fresh meat systems // J Food Prot.-2003.-Vol.66(3).-P.418-425.

191. Spangler R, Zhang S., Krueger J., Zubay G. Colicin synthesis and cell death // J Bacteriol.-1985.-Vol.l63(l).-P.167-173.

192. Stein T. Bacillus subtilis antibiotics: structures, syntheses and specific functions // Mol. Microbiol.-2005.-Vol.56.-P.845-857.

193. S. Ray, M. Johnson, B. Ray. Bacteriocin plasmids of Pediococcus acidilactici II J Industrial Microbiology.-1989.-Vol.4.-P.163-171.

194. Sweet C., Halliwell G. Regulation of cellvibriocin activity // Microbios.-1977.-Vol.20(81 -82).-P. 173-182.

195. Tagg J., Read R., McGiven A. Bacteriocine production by group A streptococci // Pathology.-1971.-Vol.3.-P.277-278.

196. Tagg J., Dajani A., Wannamaker L. Bacteriocins of Gram-Positive Bacteria // Bact. Rev.-1976.-Vol.40(3).-P.722-756.

197. Teo A., Tan H. Inhibition of Clostridium perfringens by a novel strain of Bacillus subtilis isolated from the gastrointestinal tracts of healthy chickens // Appl Environ Microbiol.-2005.- V.71(8).-P.4185-90.

198. Tolonen M., Saris P., Siilca-Aho M. Production of nisin with continuous adsorption to Amberlite XAD-4 resin using Lactococcus lactis N8 and L. lactis LAC48 // Appl Microbiol Biotechnol.-2004.-Vol.63(6).-P.59-65.

199. Torreblanca M., Mesequer I., Rodrigues-Valera F. Halocin H-6, a bacteriocin from Haloferax gibbonsii II J Gen Microbiol. 1989. - Vol. 135(10). -P. 2655-2661.

200. Ungermann V., Goelce K., Fiedler H.-P., Za'hner H. Optimization of fermentation of gallidermin and epidermin. In Jung G., Sahl H.-G. Nisin and novel 1 antibiotics // Escom Publishers. 1991. - P. 410-421.

201. Upreti G., Hinsdill R. Production and mode of action of lactocin 27: bacteriocin from a homofermentative Lactobacillus II Antimicrob Agents Chemother.-l 975.-Vol.7(2).-P. 13 9-145.

202. Varcamonti M., Nicastro G., Venema G., Kok J. Proteins of the lactococcin A secretion system: lcnD encodes two in-frame proteins // FEMS Microbiol Lett. -2001. Vol. 13-204(2).-P. 259-263.

203. Venema K., Haverkort R., Abee Т., Haandrikman A., Leenhouts K., de Leij L., Venema G., Kok J. Mode of action of LciA, the lactococcin A immunity protein // Mol Microbiol. 1994. - Vol. 14(3). - P. 521-532.

204. Venema K., Venema G., Kok J. Lactococcal bacteriocins: mode of action and immunity // Trends Microbiol. 1995. - Vol. 3(8). - P. 299-303.

205. Vincent P., Bellomino A., de Arcuri B. et al. Commun. MccJ25 C-terminalis involved in RNA-polymerase inhibition but not in respiration inhibition // Biochem. Biophys. Res. 2005. - Vol. 331. - P. 540-551.

206. Wang Y., Li Y., Zhang Q., Zhang X. Enhanced antibiotic activity of Xenorhabdus nematophila by medium optimization // Bioresour Technol. 2008. -Vol. 99(6).-P. 1708-1715.

207. Wooley R., Ritchie В., Currin M., Chitwood S., Sanchez S., Crane M. In vitro inhibition of Salmonella organisms isolated from reptiles by an inactivated culture of microcin-producing Escherichia coli II Am J Vet Res. 2001. - Vol. 62(9).-P. 1399-1401.

208. Yildirim Z., Johnson M. Detection and characterization of a bacteriocinproduced by Lactococcus lactis subsp. cremoris R isolated from radish // Lett Appl Microbiol. 1999. - Vol. 28(2). - P. 157-161.

209. Yuan J., Zhang Z. Site-directed mutagenesis of the hinge region if nisin Z and properties of nisin Z mutants // Appl. Envir. Microb. 2004. - Vol. 64. - P. 806-815.

210. BIOTECHNOLOGY. WATER AND FOODSTUFFS

211. БИОТЕХНОЛОГИЯ. ВОДА И ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ»1. March 11-11. МПШЛ РОССИИ11 -13 марта1. Пол патронажем1. Правительства Москвы

212. Under Ihe paltonage ot Moscow Government

213. Moscow, Novy Arbat Str.t 36/9 (the House of Moscow Government

214. AfocKoo, Новый Арбат, 36/9 (Здание Правительства Москвы)www moibidichwoddJii1. ТЕХНОЛОГИИ

215. Горбатко Екатерина Сергеевна

216. Микрококки как продуценты бактериоцинов перспективных для получения консервантов биотехнологической продукции»медалью

217. Шли* (I (Ы rr»|fi« СпинПм.

218. PvtiMtvt И tb< Нпси Stiti №nntj tl A^pUtJ HrfwtailefJL1Йи1с1«« if Ik* biiia kutrnj *l IfrkrtUr^ Mmoi

219. U-СЫпм! «I tW Рпртя СмяМн. k Sm lfttKfewl*ty AiitcUtlw. Iitf «у

Информация о работе

Горбатко, Екатерина Сергеевна
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.07

Диссертация

Скрининг продуцентов бактериоцинов среди бактерий, выделенных из различных источников - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы