Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологические свойства бактериоцинов фитопатогенных ксантомонад - возбудителей бактериозов растений

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Биологические свойства бактериоцинов фитопатогенных ксантомонад - возбудителей бактериозов растений"

11,1 мр.иш |\\копнем

РГй од

! 5 £303

Садомов Владимир ЭдуардошР!

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БАКТЕРИОЦПИОВ ФИТОПАТОГЕШ1ЫХ КСАНГОМОНАД— ВОЗБУДИТЕЛЕЙ БАКТЕРИОЗОВ РАСТЕНИЙ

Специальность 03.00.23 — 1>ии1схмо.ш1 ми

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации па сонскаппс учении счснснп кандидата биологических наук

Москна. 2000

Рабога выполнена в лаборатории бактериофагии Государственного Научного Центра прикладной микробиологии

Научный руководитель:

кандидат биологических наук ЕЛ: Жилспков

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, профессор Р.В. Бороник кандидат технических наук, доцент О.И. Тихомирова

Ведущее учреждение

АООТ «Биохиммаш»

Защита состоится « »

2000 года в часов на заседании

диссертационного совета Д 053.34.13 Российского химико-технологического университете им.Д.И. Менделеева: 125047, Москва, А 47, Миусская пл., д.9.

С диссертацией можно ознакомиться и научно-информационном центре РХ'ГУ им. Д.И. Менделеева.

Автореферат разослан « » 2000г.

Учёный секретарь

диссертационного совета Д. 053.34.13,

кандидат биологических наук И.И.Гусева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Интерес к исследованию явления бакте-риоциногении как одной из форм проявления антагонизма между микроорганизмами обусловлен задачами научного и практического характера:

¡.Изучение бактериоциногении необходимо для понимания закономерностей борьбы между бактериями на уровне штаммов и видов за преобладание в той или иной экологической нише.

2. В сфере таксономических вопросов бактериоциногения служит пы-яилению филогенетического родства между микроорганизмами.

3. Одна из фундаментальных задач молекулярной биолог ии — изучение эволюционной связи между фагами и макромолекулярными бакгерио-цинами.

4. Бактериоцины наряду с фагами могут быть использованы в качестве удобных инструментов идентификации бактерий.

В последнее время растёт число сторонников идеи об использовании бактериоцинов для контроля инфекционных заболеваний человека и бактериозов растений.

Состояние вопроса. Все известные к настоящему времени патовары ХашИотопав сатрс51пз (около 140 форм ) являются возбудителями бактериозов растений, многие из которых — экономически значимые культуры. На сегодня ещё не решена проблема разработки экснрсссс-методов идентификации ксантомонад. Представляет интерес выяснение перспектив применения бактериоцинов для типирования патоваров X. сатрсБитз. Другой актуальный аспект—оценка возможностей использования препаратов бактериоцинов в качестве средств защиты растений от ксантомопадных бактериозов. Бактериоциногения ксантомонад — практически неисследованная область микробиологии. Отсюда очевидна необходимость проведения поиска ксантомонадных бактериоцинов и изучения их свойств.

К настоящему времени из всех известных надмолекулярных бакте-риоципов наиболее исследованными являются ниоцины R-типа Pseudomonas aeruginosa. Данные ДНК-ДНК гибридизации свидетельствуют о близком родстве между представителями родов Pseudomonas и Xanthomonas. В связи с этим резонна постановка вопроса о чувствительности ксаптомонад к исев-домонадным пиоцинам R-типа и о дальнейшем практическом применении данных бактериоцинов в растениеводстве.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение способности патоваров X. campcslris продуцировать макромолекулярные бактериоцины и анализ чувствительности фитопатогеиных ксантомонад к R-пиоцинам псевдомонад.

Для реализации цели в исследовании были поставлены следующие задачи:

1. Изучить бактериоциногснность патоваров X. campestris (12 форм) на основе обработки клеточных суспензии индуцирующим агентом — ми-томицином С.

t

2. Провести исследование свойств выделенных надмолекулярных бактериоцинов ксантомонад.

3. Изучить антимикробную активное!I. нсеидомипадных К-шшцмпои по отношению к иатоварам X. campestris с применением традиционных н новых методических подходов.

4. Оценить перспективы практического использования псевдомонад-ных и ксантомонадиых макромолекуляршлх бактериоцинов в идетифпка-ции патоваров X. campestris и в контроле бактериозов растений.

Научная повита. Впервые представлены доказательства антимикробного действия R-пиоцинов псевдомонад по отношению к отдельным па-товарам X. campestris. Выделены н частично охарактеризованы два ранее не

описанных макромолекулярных бактериоцина, продуцируемых клетками X. campestris pv. phaseoü и X. campestris pv. pelargonii.

Теоретическое и практическое значение. Чувствительность ксаи-томонад к псевдомонадным бактериоцинам подтверждает заключение о филогенетическом родстве представителей родов Pseudomonas и Xanthomonas.

Селективное антимикробное действие псевдомонадных и ксантомо-надных бактериоцинов на патовары X. campestris даёт основание для вывода о реальной возможности разработки схем бактериоцинотипированля фито-патогенных представителей Xanthomonas.

В работе аргументирована перспективность применения R-пиоципов и ксантоцина в качестве средств защиты растений от ксантомонадных бактериозов.

Апробации работы. Результаты диссертационной работы были доложены: нй Международной конференции по защите картофеля, г. Черновцы (Украина), 1998г.; на научном семинаре ГНЦ ПМ 22мая 1999г.

Публикации. Основные положения диссертации отражены » 44 печатных работах.

Структура и объём работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов исследования, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (149 источников). Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста, содержит 45 электронных микрофотографий, 11 графиков и гпсюграмм, а также 9 таблиц.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

В обзоре литературы освещены предпосылки диссертационной работы и аргументирована целесообразность поставленных задач. Первая час п. обзора посвящена описанию отдельных фитопатогенных форм X. campcstiis, использованных в исследовании. Во второй части рассмофено явление бак-

ние бактериоциногении, изложена известная на сегодня информация о надмолекулярных бактериоцинах и проанализирован предшествующий опыт применения антимикробных агентов белковой природы в растениеводстве.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Бактерии. Штаммы ксантомонад, использованные в диссертационной работе, представлены в таблице 1. Все бактериальные культуры получены в Музее Бактерий и вирусов ГНЦ ПМ. Псевдомонадиые штаммы будут перечислены ниже.

Питательные среды. Выращивание всех штаммов мнкрооргашпмои проводили в бульоне Хоттингера (БХ). В отдельных экспериментах использовали агаризованную питательную среду (ХА), приготовленную на основе БХ.

Получение и очистка R-пиошшов псевдомонад, Бактериоцины получали путём обработки клеточных суспензий митомицином С по методике (Farmer, Herman, 1969). Очистку пиоцинов проводили как описано в работе (Kageyama, 1964). Концентрацию пиоциновых частиц в препаратах определяли электронно-микроскопическим методом (Shinomiya, Shiga, 1979).

Выделение макромолекулнрных (шктериошшов ксантомонад. В данной части работы применяли вышеупомянутые методики с отдельными модификациями.

Определение чувствительности ксантомонад к пиошшам. Используя традиционное спот-тестирование (Адаме, 1961), анализировали характер роста тест-культур в зонах нанесения бактериоцинов.

Флуорнметрия. В исследовании взаимодействия макромолекуляр-ных бактериоцинов с клетками ксантомонад в прису тствии флуоресцентного мембранотропного зонда 8-анилин-1-нафгалинсульфоната магния (ЛПС) применяли методику (Uratani, Kageyama, 1977).

Электро-ориентаииопная спектроскопия систем бактериоиип- ( клетка. Ориентацию микроорганизмов вдоль или поперёк силовых линий прилагаемого к ячейке неоднородного поля регистрировали турбидиметрн-ческим методом (Фомченков, Мирошников и др., 1975). В данной части работы применяли методические подходы, описанные ранее при изучении взаимодействия фагов с бактериями на основе ЭО-спектроскопии (Жиленков и др., 1997, 1998).

Изучение электпофоретической подвижности клеток, обработанных бактериоиипами, Электрокинетический потенциал (ЭКП) бактерий определяли на приборе «Zetasizer - 2с» (Malvern, Англия) методом лазерной допплеровской спектроскопии (Мирошников и др., 1986). Этот же прибор использовали для анализа коэффициентов диффузии клеток в нейтральном фосфатно-цитратном буферном растворе.

Анализ редуиируюшей активности ксантомонад в системах бик-териошш-клетка-краситель. В работе применяли краситель янус зелёный как инструмент изучения дыхательной активности бактерий при воздействии на ни* биоцидных агентов (Жиленков и др., 1993).

Выделение нуклеиновых кислот (НК) дефектных ксантомонад-ных фигов и анализ ivc свойств. Тип НК фагов определяли по методике (Bradley, 1966). Препараты НК выделяли из очищенных суспензий фага как описано в руководстве (Маниатис и др., 1984). Содержание ГЦ-иар нуклео-гидов в НК исследовали по методу (Fredericq et al., 1961). I Ipeiiapar ДНК (liara к с известным ГЦ-составом применяли в качестве контроля.

Электронная микроскопия В исследовании применяли vi леродиме и коллодиевые плёнки-подложки. Фиксированные препараты кот pac í провали 1% водным раствором уранилацетата или 2% фосфорновольфраматом натрия (Brenner, Home, 1959). В экспериментах по иммуно-элекфопноП микроскопии исследовали взаимодействие бактерноцпнон с гомолопгшмми

и гетерологичными антисыворотками, полученными традиционным способом (Гольдфарб, 1961). Суспензии бактерноцин-антисыворотка исследовали на электронном микроскопе «Hitachi И - 300» (Япония) по методике (Beckendorph, 1973).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Исследование спектров антимикробного действия R-пчошшов но отношению к патовавам X. campestris. Пиоцины, изолированные из клеток Ps. aeruginosa 1401, Ps. aeruginosa 1410, Ps. aeruginosa 1635, Ps aeruginosa 27/99, Ps. putida 37 и Ps. stutzeri 28, условно обозначены нами> как R38, R1670, R4262, R27/99, RP37 и RS28, соответственно. Результаты епот-тестирования перечисленных R-пиоцинов на патоварах X. campestris суммированы в таблице 1. Знак «+» свидетельствует о наличии зоны ингибирова-ния тес г-культуры, знак «-» — об отсутствии эффекта.

Чувствительность патоваров X. campestris к К-ниоциыам по данным сиот-тестиривании

_Таблица I

Тест-о&ьскт Бактериоцин

R38 R1670 K4262 R27/99 Rl'37 KS28

X.campcstris

pv. campcslris H-611 - + - + + +

pv. bcgoniac B-608 + - - - 4 -

pv. bcticulu U-544 f •- i ( i

pv. carolac D-GI2 - i - i i

pv. desmodii 13-615 - t i ■I i -

pv. juglandis B-620 - - - - - -i

pv. maculifoliigardciiiau li-621 + , - - - (

pv. nialvaccaruin B-623 - - + - + -

pv. pclargonii И-625 - - - - 4

pv. phascoli U-627 + f - i +

pv. vasculoruni ü-631 - t- - + -

1 pv. vesicatoria B-607 i - l- +

Для более полного изучения обнаруженных эффектов в работе при-

менён ряд других методических подходов.

Электронная микроскопия систем пиоиин-ксантомонада. Данные электронной микроскопии наглядно подтверждают взаимодействие пиоци-нов с чувствительными ксантомопадами. Первоначально бактериоцины за-

крепляются на поверхности клетки посредством хвостовых фибрилл. Частицы с сокращёнными хвостовыми чехлами можно обнаружить на бактериальной стенке после 15-минутной инкубации системы.

Фл tmempun. Система АНС-клетка характеризуется определенным уровнем флуоресценции, отклонение от кою-рого может служить показателем изменений структурных и электрических свойств мембран при воздействии на микроорганизм бактериоцина.(Рис. 1 ).13 системе АНС — P.aeruginosa РА01670 — RI670 интенсивность флуоресценции зонда не изменяется, так как клетка-продуцент нечувствительна к «своему» бактериоцину. Результаты флуориметрических опытов приведены в таблице 2,

Взаимодействие пиоцннов с клеткам» патоварнантои X. carnpestris поданным флуориметрнн

Таблица 2

Рис.1. Кинетика изменения интенсивности флуоресценции lem мембранотропного зонда в системах ЛНС-клстка-R-1670.

1—АНС-Х. carnpestris pv.campestris-пиоцин

2—АНС-Р. aeruginosa PA01670-R1670

'1 ccr-ftdi.cKT Ьактсриоцин

R38 К1670 R4262 R 2 7/99 KP37 KS2X

X. carnpestris

pv.campestris - 50 - 52 44 32

pv.bcgoniae 27 - - - 42 -

pv. beticola 35 - 37 48 - 37

pv.carotac - 25 - 43 - 41

pv. desmodii - 40 42 50 38 -

pv.juglandis - - - - - 51

pv. maculiioliigardcniae 50 - - - 47 50

pv. malvacearum - - 40 - 50

pv. pelargonii - - - - 51 40

pv. phaseoli 47 50 - 51 35 3X

pv. vasculorum - 50 - 38 - -

pv. vesicatoria — 25 — 42 27 -

Примечание. В таблице представлены значения Д1ет в процентах, показывающие увеличение интенсивности флуоресценции мембранотропного зонда в суспензии в течение 15 минут с момента внесения пиоцина; знак «-» показывает, что lern в системе не изменяется; погрешность измерения Д1ет составляет ±3%.

Существенно подчеркнуть, что .эти данные коррелируют с результатами микробиологических экспериментов (таблица 1).

Энектро-

■ —ориептаиионныи она-

jiin суспензий ксанто-монада — пиоиин. Результаты электро-орие-

Рис. 2. Электро-ориентационные спектры контрольной нтационного • анализа суспензии X. campestris pv. campestris (1) и опытного

образца ксантомонада - R1670 (2). Соотношение клетка различных суспензий : пиоцин — 1 : 30.

г .. ксантомонада-пиоцин

f—частота поля; U — изменение выходного напряже- ,

ния установки в милливольтах. позволяют сделать за-

ключение об активном характере взаимодействия псевдомонадных надмолекулярных бактериоцинов с клетками чувствительных патоваров X. campes-tris. Один из типичных графиков этой серии экспериментов подтверждает сказанное (Рис. 2). Во-первых, уменьшение ЭО-эффекта опытного образца на низких и средних частотах говорит об изменении z-потенциала клетки. С другой стороны, высокочастотный участок спектра свидетельствует об изменении электропроводности цитоплазмы, повреждённой пиоцинами клетки в результате нарушений барьерной функции её мембран (Мирошников и др., 1986).

Об изменении поверхностного заряда обработанной пиоцинами ксап-томонадной клетки свидетельствуют результаты изучения ЭКП микроорганизмов (Рис. 3). На рисунке можно сравнить опытный вариант с двумя мо-

дельными системами, в которых пиоцин II1670 и фаг ф02 взаимодействуют с чувствительными к ним псевдомонадами.

По полученным данным все ЭКП имели отрицательные значения потенциалов. В гистограмме (Рис. 3) приведены их абсолютные значения.

Оиенка подвижности Ксантомонад. обработанных ниоиинами. Результаты определения гидродинамических размеров микроорганизмов на основе показателей светорассеяния представлены на рис. 4. Регистрируемый на приборе 2е1аз12ег-2 коэффициент диффузии клетки обратно пропорционален её размеру, что учтено при построении гистограммы.

ЭКП. ив *

эооо

ИМ -IOOO

wo яде

Рис. 3. Значения электро-кинетического Рис. 4. Среднестатистические рачмеры ин-

потенциала (ЭКП) бактериальных клеток. В каждом варианте светлый столбик соот-

тактных (светлые столбцы) и обработанных инактивирующнм агентом клеток

ветствует интактным клеткам, затемнённый (затемнённые столбцы) но данным свето-— микроорганизмам, проинкубированным рассеяния.

с циоцинами или фагами (1 : 50). 1 — P. aeruginosa РАО 38 + гжоцин R1670;

1 — P. aeruginosa РЛ038 + пиоции R1670;

2 — P. aeruginosa РАО 1670 + фаг ф()6;

2 — X. campestris pv. campestris + пиоцнн 3 — X. campestris pv. campestris + фаг ф06;

R1670;

3 — P. aeruginosa РАО 1670 + фаг ф02. Ошибка измерения ЭКП составляет ±0,2мв.

4 — X. campestris pv. campestris + миошш RI670;

5 — P. aeruginosa РЛ038 ь 0.5% niyiapo-вый альдегид.

Образцы 1-4 инкубировали 3U минут при температуре 30°С н бульоне Хопннгсра.

Псевдомонадный пилеспецифичный фаг ф06 использован в двух модельных системах. Штамм P. aeruginosa РАО 1670 является кле паж-хозяином бактериального вируса. При взаимодействии с микроорганизмом X. campestris pv. campestris фаг адсорбируется на пнлях ксашомонады. но не лизирует клетку. В дополнительной контрольной системе клетки I'. nerugi-

поэа РА038 были инактивированы альдегидом. Сравнение опытной и модельных систем позволяет сделать заключение об увеличении «хаотичности» движения обработанных пиоцинами ксантомонад, что может быть связано с нарушениями функционирования двигательного аппарата. клеток.

еоо «оо тоо *оо

ООО вОО /ОС ММ

Исследование влияния пиоиинов на способность ксантомонад ре-дукироаать лнус зелёный.

На рис.5А представлены спектры поглощения януса зелёного на трёх стадиях инкубации суспензии краситель - X. сатрсзЦзз ру. сатрезту.

„с«-. Последовательное изме-

Рис. 5. Спектры поглощения красителя януса зеленою в

системах пение окраски от голу-

янус - клетка (А) и краситель - клетка - ниошш К1670 (Б).

График Л График Н бон до розовой, наблю-

1.—спектр красителя в на- Спектр януса зелёного в

чальный момент инкубации суспензии краситель- даемое и визуально, ха-

копгролмюго обпазцаяпус клстка-К 1670, зарегнет-

V . ■ . ■ растеризует нормальное

- л.сашрсзШз pv. ситрсзитэ риронанпиП и момспг 1

внесения шющша. а гак- 11ршскатк. окислит ель-же после 90- и 180-

минутной инкубации, но-восстановп тельных Спектр не изменяется со

временем. процессов дыхательной

2.—спектр нослс 90-минутпой инкубации

3.—спектр восстановленного красителя после 180-минутной инкубации.

цепи в микроорганизмах. Обратная картина наблюдается в опытном образце, включающем обработанные пиоцином клетки. Спектр поглощения красителя не изменяется си временем, что отражает нарушение дыхательной активности ксантомонад (Рис. 5Б)

- 13В других опытных образцах с пиоцинами и чувствительными к ним пат опарами X. campestris отмечены те же закономерности. В различных вариантах наблюдалось лишь варьирование временного интервала редукции януса зелёного в контролях (от 2,5 до 4 часов).

Обобщая вышеизложенное, можно считать доказанным явление антимикробного действия R-пиоцинов на клетки отдельных патоваров X. campestris.

Выделение и частичная характеристика надмолекулярных бак-териоиинов фитопптогенов X. campestris. Все латовары использованной коллекции X. campestris были изучены на наличие индуцибельпых макромо-лекулярных бактериоцинов. В качестве индуцирующего агента применяли митомицин С (концентрация от 0,1 до 1 мкг/мл). В результате, из двух патоваров изолированы бактериоцины.

Дефектный фаг патовара X. campestris pv. phaseoli Положительный результат получен при использовании индуктора, конечная концентрация которого составляла 0,5 мкг/мл. Выделенному бактериоцину дано название PLX- 1.

Частицы PLX - 1 ингибируют развитие шести патоваров X. campestris (pv. vesicatoria, vasculorum, malvacearum, campestris, bcticola, pelargonii). l'oci других шести патоваров не угнетается частицами. На газонах чувезвшель-ных к PLX-1 ксантомонад антимикробный агент не образует пя1сп лизиса. Этот факт наряду с данными электронной микроскопии позволяет сделать заключение, что PLX-1 —дефектный фаг.

Выделенный фаг принадлежит А1-морфопшу (Reanncy, Ackemiann, 1982). Расстояние между апикальными противоположными вершинами нзо-метричной головки частицы составляет 48 им. Фаг имеет сокращающийся хвостовой отросток длиной 225 им и шириной 18 им. Иитактнын отросток имеет 46 поперечных рядов субъединиц.

По данным электронной микроскопии дефектный фаг адсорбируется на поверхности чувствительных клеток с последующим сокращением отростка. При этом головка остаётся заполненной, т.е. ДНК не инъецируется в клетку. Таким образом, в системе фаг-клетка частица PLX-1 инактивируег. микроорганизмы так же, как бактериоцины PBSX-типа убивают бациллярные формы (Okamoto et al., 1968; Reanney, Ackermann, 1982).

Применение других методических подходов (флуориметрия, ЭО-спектроскопия, редукция януса зелёного) подтвердило активное взаимодействие PLX-1 с чувствительными ксантомонадами.

Препарат PLX-1 после окрашивания акридиновым оранжевым (Bradley, 1966) приобретает ярко-зелёное свечение. Это указывает на то, что PLX-] является ДНК-содержащим фагом. Процентный состав ГЦ-лар в его ДНК составляет 63,6%. По полученным в параллельном исследрвании данным ДНК клетки-продуцента X. campestris pv. phaseoli содержит 65% ГЦ-пар нуклеотидов. Есть основание для предположения, что головка PLX-I, как и частицы PBXS-типа, содержит бактериальную нуклеиновую кислоту.

Макромолекулярпый бактерионин патовара X. campestris nv. pelargonü. Бактериоцин другого типа обнаружен в суспензии X. campestris pv. pclargonii при использовании митомицнна С с конечной концентрацией 0,3 мкг/мл. Изолированному бактериоцину дано название ксантоцин СР1.

По данным электронной микроскопии частица СР1 имеет структурное сходство с R-пиоцином псевдомопад. Чехол ксангоцина в интактной форме содержит 30 поперечных рядов субъединиц. Размеры чехла в песо- • кращённом состоянии — 108 х 18 им.

Аппарат адсорбции ксангоцина состоит из базальной пластинки и 8-ми фибрилл длиной 14 нм. В окончаниях фибрилл заметны утолщения.

Из двенадцати патоваров X. campestris четыре штамма чувствительны ' к бактериоцину. По данным спот-тестирования рост патоваров campestris, carotae, beticola и vesicatoria ингибируется ксантоцином СР1.

Электронно-микроскопическое исследование образцов ксантоцин-клетка показало, что взаимодействие бактериоцина с поверхностью микроорганизма сопровождается сокращением отростков. Результаты экспериментов по флуориметрйи образцов АНС-ксантомонада-СР1 позволяют сделать заключение о быстроте взаимодействия бактериоцина клеткой. Интенсивность флуоресценции Iem зонда в опытных препаратах увеличивается до нового стационарного уровня в течение 7 минут. 13 экспериментальных вариантах с патоварами campestris, carotae, beticola и vesicatoria значение Д1ет соответственно составляет 35, 40, 50 и 50 процентов. Применение электрооптических методов подтвердило тот факт, что ксантоцин активно взаимодействует с внешней мембраной чувствительной клетки и изменяет электропроводность её цитоплазмы. ЭО-спектры опытных суспензий отличаются от контрольных спектров на всех использованных частотах. Опыты по изучению редукции красителя януса зелёного в суспензиях, повреждённых ксантоцином клеток четырёх патоваров, показали, что частицы СР1 угнетают дыхательную активность чувствительных ксантомоиад.

Проверку предположения о серологическом родстве между ксантоцином СР1 и R-пиоцинами проводили с применением иммупо-элеюропиои микроскопии. D результате показано, что СР1 и тюции R1670 не имеют общих поверхностных антигенных детерминант.

ВЫВОДЫ

I. Проведённые исследования показали, что надмолекулярные бакю-риоцины R-типа, продуцируемые клетками Pseuiiomonas aeruginosa, Ps. putida и Ps. stutzeri, обладают антимикробной активностью по отношению к отдельным патоварам фитОпатогена Xanthomonas campestris.

2. Корреляция данных микробиологического сног-тестирования, флуориметрии и электронной микроскопии служит доказательством активного характера взаимодействия К-пиоцинов с клетками ксантомонад.

3. В исследовании систем бактериоцин-клетка впервые применены методы электроориентационного анализа. В результате показано, что в обработанных пиоцинами ксантомонадах изменяется электрокинетический потенциал и нарушаются барьерные функции клеточных мембран.

4. Показано, что взаимодействие R-пиоцинов с клетками патоваров X. campestris сопровождается угнетением дыхательной активности микроорганизмов и нарушением функционирования их двигательного аппарата.

5. Клетки Xanthomonas campestris pv. phaseoli способны продуцировать индуцибельный дефектный бактериофаг PLX-1, проявляющий антибактериальную активность по отношению к ряду других патоваров данного вида. При взаимодействии частиц PLX-1 с чувствительной клеткой ДНК фага не инъецируется в микроорганизм.

6. Выявлено, что фитопатоген X. campestris pv. pelargonii способен продуцировать надмолекулярный бактериоцин, ксантоцин СР1, который угнетает рост отдельных патоваров X.campestris, что подтверждается результатами микробиологических и биофизических экспериментов. Показано, чго между ксантоцином СР1 и R-пиоцинами нет серологического родства.

7. Представлено обоснование целесообразности дальнейшей разработки схемы идентификации патоваров X. campestris на основе их чувствительности к определённым сочетаниям псеидомонадных и ксантомонадных бактериоцинов.

Возможные пути практического использовании полученных результатов. Селективное действие R-пиоцинов по отношению к определённым патоварам X. campestris вызывает интерес с точки зрения использования данных бактериоцинов в идентификации ксантомонад. Для разработки

схем пиоцинотипнрования штаммов X. campestris необходимо дальнейшее проведение исследований как с другими патоварами, так и с новыми бакте-риоцинами. Возможно также применение для этих целей и ксантомонадных бактериоцинов наряду с R-пиоцинами.

Целесообразно отметить ещё одно направление практического применения бактериоцинов в растениеводстве. К настоящему времени достаточно аргументировано использование микробов-антагонистов при их интродукции л искусственные и естественные биоценозы с целью угнетения развития фитопатогенов (Алёшина и др., 1975; Г'укасян, Гродницкая, 1998). Предварительное изучение взаимодействия тех или иных бактериоцинов с возбудителями бактериозов значительно облегчит скрининг подходящих для таких целей бактерий. На наш взгляд, в таких исследованиях будет плодотворным применение методических подходов, описанных в диссертационной работе. Рассмотрим ещё один аспект использования бактериоцинов в растениеводстве. Мы считаем перспективным применение псевдомонадных R-пиоцинов для предпосевной обработки семян, поражённых фитопатоген-ными ксантомонадами. Эта точка зрения аргументирована следующими соображениями. Во-первых, пиоцины не уступают антибиотикам и химическим агентам но части эффективное™ антимикробного денет мня. Во-вторых, фитопатогенные микроорганизмы довольно быстро приобретают устойчивость к антибиотикам в результате генетической трансмиссии R-плазмид (Lai, Panopolous, Shafer, 1977). Применение комбинаций (сочетаний) пиоцинов с различной рецепторной специфичностью практически исключает вероятность возникновения в популяциях X, campestris бактерио-циноустойчивых форм. В-третьих, получение препаратов пиоцинов не связано с большими материальными затратами. Культуры Р. aeruginosa неприхотливы в отношении ростовых потребностей. Процедура выращивания концентрированных (109—5-109кл/мл) суспензий псевдомонад и их обра-

ботка индуцирующим агентом не сопряжены с технологическими трудностями.

Результаты настоящего исследования могут служить предпосылками в дальнейшей разработке антибактериальных препаратов псевдомонадных и' ксаитомонадных бактериоцинов для контроля бактериозов растений, вызываемых патоварами X. campestris.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ИЗЛОЖЕНО Б СЛЕДУЮЩИХ ПУБЛИКАЦИЯХ

1. Садомов В.Э., Жиленков Е.Л., Новиков И.А., Негрий В.Ф. Бактерицидная активность пиоцина R-типа Pseudomonas aeruginosa РА01670, по отношению к патоварам Xanthomonas campestris // Сельскохозяйственная биология. — 1999. — №3.—С.97-104.

2. Садомов В.Э., Жиленков Е.Л., Негрий В.Ф., Фомченков В.М. Бактерицид, продуцируемый Xanthomonas campestris pv. pelargonii // Защита и карантин растений. — 1999. —№8. — С.40.

3. Жиленков Е.Л., Фомченков В.М., Новиков И.А., Садомов В.Э., Оборотов М.В. Изучение взаимодействия фагов и микроорганизмов с использованием методов флуориметрии и электроориенгационной спектроскопии // Вестник РАМН. — 1999. — №. 12 — С.24- 29. '

4. Садомов В.Э., Новиков И.А., Фомченков В.М., Жиленков E.J1. Выделение и изучение макромолекулярных бактериоцинов фигопатогенов Xanthomonas campestris // Проблемы медицинской и экологической биотех-нологиии: Тез. докл. научн. конф. — Оболенск, 1999. — С.207.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Садомов, Владимир Эдуардович

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Состояние вопроса.

Цель работы.

Научная новизна.

Теоретическое и практическое значение.^

1.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ

1.¡.Характеристика отдельных фитопатогенов Xanthomonas campestris.

1.1.1. Род Xanthomonas (Bergey's Mannul of Determinative Bateriology, 1986).

1.1.2. Свойства отдельных патоваров вида X. Campestris.

1.1.2.1. Xanthomonas campestris pv.campestris.

1.1.2.2. Xanthomonas campestris pv. phaseoli.

1.1.2.3. Xanthomonas campestris pv. carotae.

1.1.2.4. Xanthomonas campestris pv. beticola.

1.1.2.5. Xanthomonas campestris pv. begoniae.

1.1.2.6. Xanthomonas campestris pv. juglandis.

1.1.2.7. Xanthomonas campestris pv. malvacearum.

1.1.2.8. Xanthomonas campestris pv. pelargonii.

1.1.2.9. Xanthomonas campestris pv. vesicatoria.

1.1.3. Ксантомонады — возбудители бактериальных болезней растений.

1.1.4. Методы борьбы с возбудителями бактериальных болезней растений.

1.2. Бактериоцины и их применение в растениеводстве.

1.2.1. Типы бактериоцинов.

1.2.2. Макромолекулярные бактериоцины.

1.2.2.1. Дефектные бактериофаги.

1.2.2.2. Бактериоцины R-типа Pseudomonas aeruginosa.

1.2.3. Бактериоцины фитопатогенных микроорганизмов.

1.2.4. Применение бактериоцинов в растениеводстве.

1.2.4.1. Контроль бактериозов с помощью интактных микроорганизмов, продуцирующих бактериоцины.

1.2.4.2. Контроль бактериозов растений, осуществляемый с помощью препаратов очищенных бактериоцинов.

2. МАТЕРИАЛЫ и МЕТОДЫ

2.1. Бактерии

2.2. Бактериальные и эукариотические вирусы.

2.3. Питательные среды.

2.4. Получение и очистка R-пиоцинов псевдомонад.

2.5. Выделение макромолекулярных бактериоцинов из клеток патоваров X. campestris.

2.6. Определение чувствительности ксантомонад к бактериоцинам методом спот-тестирования.

2.7. Флуориметрия.

2.8. Электроориентационная спектроскопия систем бактериоцин-микроорганизм.

2.9. Изучение электрофоретической подвижности клеток, обработанных бактериоцинами.

2.10. Анализ редуцирующей активности ксантомонад в системах бактериоцин-клетка-янус зеленый.

2.11. Выделение нуклеиновых кислот дефектных ксантомонадных фагов и анализ их свойств.

2.12.Электронная микроскопия.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Изучение чувствительности патоваров X. campestris к R-пиоцинам отдельных представителей рода Pseudomonas.

3:1.1. Выделение очищенных препаратов пиоцинов.

3.1.2. Исследование спектров антимикробного действия К-пиоцинов по отношению к патоварам X. сатрев^в.

3.1.3. Ингибирование роста X. сатревШв ру. сатревМв X. сатревЫэ ру. сатревМэ пиоцином К 1670.

3.1.4. Электронно-микроскопическое исследование взаимодействия между пиоцином Ы1670 и клеткой X. сатрез^э ру. сатрев^в.

3.1.5. Изучение чувствительности ксантомонад к псевдомонадным фагам.

3.1.6. Флуориметрия суспензий АНС-ксантомонада-бактериоцин.

3.1.7. Электро-ориентационный анализ бактериальных суспензий, обработанных фагами и бактериоцинами.

3.1.8. Определение электрокинетического (ЭКП) потенциала микроорганизмов.

3.1.9. Оценка подвижности микроорганизмов, обработанных пиоцинами и фагами.

3.1.10. Исследование влияния пиоцина Ш670 на способность клеток Х-сатрев^я ру. сатрев^в редуцировать янус зеленый.

3.2. Выделение и частичная характеристика надмолекулярных бактериоцинов фитопатогенных представителей X. сатреэМв.

3.2.1. Дефектные фаги патовара X. сатреБМэ ру. рЬавеоН.

3.2.1.1. Морфология дефектных фагов Ххатрев^в ру. рЬаэеоН.

3.2.1.2. Антимикробная активность частиц РЬХ-1 по отношению к патоварам X. сатревМэ.

3.2.1.3.Электронно-микроскопическое изучение взаимодействия частиц РЬХ-1 с клетками патоваров X. сатрев^в.

3.2.1.4. Флуориметрия систем АНС-ксантомонада-РЬХ-1.

3.2.1.5. Электроориентационная спектроскопия препаратов ксантомонада-дефектный фаг.

3.2.1.6. Исследование влияния дефектного фага РЛХ-1 на дыхательную активность ксантомонад.

3.2.1.7. Изучение нуклеиновой кислоты дефектного фага РЬХ-1.

3.2.2. Выделение и частичная характеристика бактериоцина Х.сатреэЫв ру. ре!а

§опп.

3.2.2.1. Морфология и размеры макромолекулярного бактериоцина X. сатревМв ру. ре1а

§01Ш.

3.2.2.2. Антимикробная активность ксантоцина СР1 по отношению к патоварам X. сатревМв. Микробиологические тесты.

3.2.2.3. Изучение взаимодействия ксантоцина СР1 с чувствительными ксантомонадами на основе биофизических методов.

3.2.2.4. Изучение серологического родства между К-пиоцинами и ксантоцином СР1.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биологические свойства бактериоцинов фитопатогенных ксантомонад - возбудителей бактериозов растений"

Актуальность проблемы.

Интерес к исследованию явления бактериоциногении как одной из форм проявления антагонизма между микроорганизмами обусловлен задачами научного и практического характера:

1. Изучение бактериоциногении необходимо для понимания закономерностей борьбы между бактериями на уровне штаммов и видов за преобладание в той или иной экологической нише.

2. В сфере таксономических вопросов бактериоциногения служит выявлению филогенетического родства между микроорганизмами.

3. Одна из фундаментальных задач молекулярной биологии — изучение эволюционной связи между фагами и макромолекулярными бакте-риоцинами.

4. Бактериоцины наряду с фагами могут быть использованы в качестве удобных инструментов идентификации бактерий.

5. В последнее время растёт число сторонников идеи об использовании бактериоцинов для контроля инфекционных заболеваний человека и бактериозов растений.

Состояние вопроса.

Все известные к настоящему времени патовары ХапШотопаБ сат-ревйТБ (около 140 форм ) являются возбудителями бактериозов растений, многие из которых — экономически значимые культуры. На сегодня ещё не решена проблема разработки экспрессс-методов идентификации ксантомо7 над. Представляет интерес выяснение перспектив применения бактериоци-нов для типирования патоваров X. campestris. Другой актуальный аспект— оценка возможностей использования препаратов бактериоцинов в качестве средств защиты растений от ксантомонадных бактериозов. Бактериоцино-гения ксантомонад — практически неисследованная область микробиологии. Отсюда очевидна необходимость проведения поиска ксантомонадных бактериоцинов и изучения их свойств.

К настоящему времени из всех известных надмолекулярных бактериоцинов наиболее исследованными являются пиоцины R-типа Pseudomonas aeruginosa. Данные ДНК-ДНК гибридизации свидетельствуют о близком родстве между представителями родов Pseudomonas и Xantho-monas. В связи с этим резонна постановка вопроса о чувствительности ксантомонад к псевдомонадным пиоцинам R-типа и о дальнейшем практическом применении данных бактериоцинов в растениеводстве.

Цель работы.

Изучение способности патоваров X. campestris продуцировать мак-ромолекулярные бактериоцины и анализ чувствительности фитопатоген-ных ксантомонад к R-пиоцинам псевдомонад.

Для реализации цели в исследовании были поставлены следующие задачи:

1. Изучить бактериоциногенность патоваров X. campestris (12 форм) на основе обработки клеточных суспензий индуцирующим агентом — ми-томицином С.

2. Провести исследование свойств выделенных надмолекулярных бактериоцинов ксантомонад. 8

3. Изучить антимикробную активность псевдомонадных R-пиоцинов по отношению к патоварам X. campestris с применением традиционных и новых методических подходов.

4. Оценить перспективы практического использования псевдомонадных и ксантомонадных макромолекулярных бактериоцинов в идентификации патоваров X. campestris и в контроле бактериозов растений.

Научная новизна.

Впервые представлены доказательства антимикробного действия R-пиоцинов псевдомонад по отношению к отдельным патоварам X. campestris. Выделены и частично охарактеризованы два ранее не описанных макромолекулярных бактериоцина, продуцируемых клетками X. campestris pv. phaseoli и X. campestris pv. pelargonii.

Теоретическое и практическое значение.

Чувствительность ксантомонад к псевдомонадным бактериоцинам подтверждает заключение о филогенетическом родстве представителей родов Pseudomonas и Xanthomonas.

Селективное антимикробное действие псевдомонадных и ксантомонадных бактериоцинов на патовары X. campestris даёт основание для вывода о реальной возможности разработки схем бактериоцинотипирования фи-топатогенных представителей Xanthomonas.

В работе аргументирована перспективность применения R-пиоцинов и ксантоцина в качестве средств защиты растений от ксантомонадных бактериозов. 9

1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Цель настоящего литературного обзора — освещение предпосылок диссертационной работы и аргументация целесообразности поставленных задач. Первая часть обзора посвящена описанию отдельных фитопатоген-ных форм X. campestris, использованных нами в исследовании. Во второй части рассмотрено явление бактериоциногении, изложена известная на сегодня информация о надмолекулярных бактериоцинах и проанализирован предшествующий опыт применения антимикробных агентов белковой природы в растениеводстве.

1.1.Характеристика отдельных фитопатогенов Xanthomonas campestris.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Садомов, Владимир Эдуардович

ВЫВОДЫ

1. Надмолекулярные бактериоцины R-типа, продуцируемые клетками Pseudomonas aeruginosa, Ps. putida и Ps. stutzeri, обладают антимикробной активностью по отношению к отдельным патоварам фитопатогена Xanthomonas campestris.

2. Корреляция данных микробиологического спот-тестирования, флуориметрии и электронной микроскопии служит доказательством активного характера взаимодействия R-пиоцинов с клетками ксантомонад.

3. В исследовании систем бактериоцин-клетка впервые применены методы электроориентационного анализа. В результате показано, что в обработанных пиоцинами ксантомонадах изменяется электрокинетический потенциал и нарушаются барьерные функции клеточных мембран.

4. Взаимодействие R-пиоцинов с клетками патоваров X. campestris сопровождается угнетением дыхательной активности микроорганизмов и нарушением функционирования их двигательного аппарата.

5. Клетки Xanthomonas campestris pv. phaseoli способны продуцировать индуцибельный дефектный бактериофаг PLX-1, проявляющий антибактериальную активность по отношению к ряду других патоваров данного вида. При взаимодействии частиц PLX-1 с чувствительной клеткой ДНК фага не инъецируется в микроорганизм. Сходство генома фага и ДНК его клетки-продуцента по ГЦ-составу даёт основание предполагать, что частицы PLX-1 содержат бактериальную нуклеиновую кислоту.

6. Фитопатоген X. campestris pv. pelargonii способен продуцировать надмолекулярный бактериоцин, ксантоцин СР1, который имеет морфологическое сходство с сокращающимися хвостовыми отростками бактериофагов. Ксантоцин СР1 угнетает рост отдельных патоваров X. campestris, что подтверждается результатами микробиологических и биофизических экс

105 периментов. Показано, что между ксантоцином СР1 и Я-пиоцинами нет серологического родства.

7. Представлено обоснование целесообразности дальнейшей разработки схемы идентификации патоваров X. сатрезйтБ на основе их чувствительности к определённым сочетаниям псевдомонадных и ксантомонадных бактериоцинов.

106

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Рассмотрим возможные пути практического использования полученных в диссертационной работе результатов.

Селективное действие псевдомонадных пиоцинов по отношению к определённым патоварам X. campestris вызывает интерес с точки зрения использования данных бактериоцинов в идентификации различных штаммов ксантомонад. Из таблиц 5 и 6 следует, что каждому из патоваров свойственна чувствительность к определённому сочетанию пиоцинов. Однако, необходимо ещё раз отметить, что приведёнными в таблицах формами не исчерпывается всё многообразие штаммов X. campestris, включающее к настоящему времени около 140 патоваров [142]. Для разработки схем пиоци-нотипирования ксантомонад необходимо проведение исследований как с другими патоварами, так и с новыми бактериоцинами. Целесообразно использовать для этой цели и «собственные» бактериоцины X. campestris. Формулируя идею о пиоцинотипировании ксантомонад, мы ориентируемся и на предшествующий опыт других исследователей. Так, в работе Steensma [131] опубликована схема идентификации различных видов и штаммов рода Bacillus с помощью определенных PBSX-бактериоцинов. Другой яркий пример — работа Borst, De Jong [44], в которой обосновано применение псевдомонадных бактериоцинов для типирования нейссерий. Авторы разработали схему, согласно которой 39 штаммов Neisseria gonorrhoae идентифицируются по чувствительности к сочетанию из 8-ми пиоцинов Р. aeruginosa [44].

Обсуждая вопрос о перспективах использования бактериоцинов в типировании фитопатогенных ксантомонад, мы не принижаем значимости других способов идентификации. Разумеется, ПЦР-диагностика и ДНК-ДНК гибридизация являются высокочувствительными и многообещающи

107 ми методами данного направления. Однако, нужно учитывать, что их реализация требует применения довольно дорогостоящего оборудования. Пока это доступно лишь специализированным лабораториям. Предлагаемый нами метод отличается простотой и не требует больших материальных затрат. Кроме того, пиоцинотипирование можно считать экспресс-методом. При осуществлении идентификации ксантомонад с помощью определенного набора пиоцинов можно использовать репликатор, в отдельные ячейки которого вносятся бактериоцины. Далее проводится спот-тестирование анализируемого патовара посредством репликатора.

Таким образом, полученные в диссертационной работе результаты позволяют сделать заключение о реальности разработки, схемы типирова-ния патоваров X. сатрезйтэ по их чувствительности к псевдомонадным и ксантомонадным бактериоцинам.

Целесообразно отметить ещё одно направление практического применения бактериоцинов в растениеводстве. К настоящему времени достаточно аргументировано использование микробов-антагонистов при их интродукции в искусственные и естественные биоценозы с целью угнетения развития фитопатогенов [6]. Предварительное изучение взаимодействия тех или иных бактериоцинов с возбудителями бактериозов значительно облегчит скрининг подходящих для таких целей бактерий. На наш взгляд, в таких исследованиях будет плодотворным применение методических подходов, описанных в диссертационной работе.

Рассмотрим ещё один аспект использования бактериоцинов в растениеводстве. Мы считаем перспективным применение псевдомонадных Я-пиоцинов для предпосевной обработки семян, поражённых фитопатоген-ными ксантомонадами. Дефектный фаг РЬХ-1 для таких целей неудобен в связи с его быстрой инактивацией инородным материалом. Ксантоцин СР1, по нашему мнению, можно применять для контроля отдельных ксантомо

108 надных бактериозов. Этот бактериоцин, как и R-пиоции, сохраняет антимикробную активность продолжительное время даже в неочищенных лиза-тах. Наша точка зрения аргументирована следующими соображениями. Во-первых, пиоцины не уступают антибиотикам и химическим агентам по части эффективности антимикробного действия. Во-вторых, фитопатогенные микроорганизмы довольно быстро приобретают устойчивость к антибиотикам в результате генетической трансмиссии R-плазмид [103]. Применение комбинаций (сочетаний) пиоцинов с различной рецепторной специфичностью практически исключает вероятность возникновения в популяциях X. campestris бактериоциноустойчивых форм. В-третьих, получение препаратов пиоцинов не сопряжено с большими материальными затратами. Культуры P. aeruginosa неприхотливы в отношении ростовых потребностей.

Процедура выращивания концентрированных (109—5-109 кл/мл) суспензий псевдомонад и их обработка индуцирующим агентом не сопряжены с технологическими трудностями.

В будущем мы планируем апробировать на практике метод обработки семян пиоцинами и оценить эффективность этого способа в борьбе с ксантомонадными бактериозами растений.

Результаты настоящего исследования могут служить предпосылками в дальнейшей разработке антибактериальных препаратов псевдомонадных и ксантомонадных бактериоцинов для контроля бактериозов растений, вызываемых патоварами X. campestris.

109

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Садомов, Владимир Эдуардович, Москва

1. Адаме М. Бактериофаги / Пер. с англ. М.: Иностранная литература, 1961.-527 с.

2. Белътюкова К.И., Гвоздяк Р. И. Результаты использования некоторых антибиотиков в борьбе с бактериозами и другими болезнями сельскохозяйственных растений // Применение антибиотиков в растениеводстве -Ереван: Из-во АН Арм. ССР, 1961,- С. 38-49.

3. Ваксман З.А. Антибиотики. М.: Из-во АН СССР, 1946. - 109с.

4. Владимиров Ю.А., Добрецое Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран. М.: Наука, 1980. - 268 с.

5. ГолъдфарбД.М. Бактериофагия. М.: Медгиз, 1961. - 298 с.

6. Гукасян А.Б., Гродницкая И.Д. Интродукция микробов-антагонистов в лесные и искусственные биоценозы // Защита и карантин растений. 1998. - № 9. - С. 13.

7. Жтенков Е.А. Изомеризация аппарата адсорбции Т-чётных бактериофагов: Автореф. дис. .канд. биол. наук. М., 1984. - 16 с.

8. Жиленков Е.Я., Месянжинов В.В., Селиванов H.A. и др. Бактериофаг Т4 как модель для изучения кооперативных двигательных процессов // Докл. АН СССР. 1978. - Т. 238, №6. - С. 1471-1475.

9. Жиленков E.JI., Степанов A.B., Фомченков В.М. и др.Изучение начальных стадий взаимодействия умеренного фага ф04 с клеткой Pseudomonas aeruginosa//Микробиология. 1997. - №4. - С. 532-538.

10. М.Жиленков E.JI., Фомченкое В.М., Новиков И.А. и др. Экспресс-методы скрининга поверхностно-активных биоцидов //Биоповреждения в промышленности: Тез. докл. научн. практ. конф. 4.1.- Пенза, 1993.- С. 6-8.

11. Лабинская A.C. Микробиология с техникой микробиологических исследований. М.: Медицина, 1978. - С. 394.15 .Лакович Д. Основы флуоресцентной спектроскопии. М.: Мир, 1986.-С. 27.

12. Лебедев А.Д., Левчук Ю.Н., Ломакин A.B., Носкин В.А. Лазерная корреляционная спектроскопия в биологии. Киев: Наукова думка, 1987. -256 с.

13. Лурия С., Дарнелл Дж., Балтимор Д., Кэмпбелл Э. Общая вирусология. М.: Мир, 1981.-200 с.

14. Маниатис Е., Фрич Э., Сэмбрук Д. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование / Пер. с англ. М.: Мир, 1984. - 480 с.

15. Матвеева Е.В., Чумаевская М.А. Диагностика бактериального увядания сельскохозяйственных ратений и меры борьбы с ним.: Методические указания. М., 1986. - 20 с.

16. Матышевская М.С. Влияние фитопатогенных бактерий на фи-зиолого-биохимические свойства растений // Фитопатогенные бактерии. -Киев: Наукова думка, 1975. 236 с.

17. Мирошников А.И., Фомченкое В.М., Иванов А.Ю. Электрофизический анализ и разделение клеток. М.: Наука, 1986. - 184 с.1.l

18. Мишустин E.H., Трисвятский JI.А. Микробы и зерно. М.: Из-во АН СССР, 1963.

19. Мурас В.А., Гвоздяк Р.И., Житкевич Н.В., Азимцев А.Г. Чувствительность к антибиотикам гладких и шероховатых форм некоторых фи-топатогенных бактерий // Микробиол. журн. 1985. - Т. 47, № 5. - С.53-57.

20. Наумов H.A. Болезни сельскохозяйственных культур. М.: Наука, 1952.-310 с.

21. Овчаров К.Е. Физиологические основы всхожести семян. М.: Наука, 1969. - 280 с.

22. Ордин А.П. Влияние микрофлоры на всхожесть зерна пшеницы при хранении // Вопросы семеноводства, семеноведения и семенного дела: Сб. научн. трудов. Киев: Урожай, 1964. - Вып.2. - С. 334-338.

23. Пересыпкин В.Ф., Тютерев С.Л., Баталова Т.С. Болезни зерновых культур при интенсивных технологиях их возделывания. М.: Агро-промиздат, 1991. - 272 с.

24. Селиванов H.A., Жиленков ЕМ., Месяжинов В.В. и др. Изучение кооперативноти изменения положения хвостовых фибрилл бактериофага T4D // Докл. АН СССР. 1978. - Т.242, №4. - С.949-952.

25. Справочник по защите растений /Под. ред. Ю.Н. Фадеева. М.: Агропромиздат, 1985. - 415 с.

26. Фихман Б.А. Микробиологическая рефрактометрия. М.: Медицина, 1967. - 280 с.

27. Фомченков В.М. Исследование электроориентации и диэлектро-фореза клеток турбидиметрическим методом: Автореф. .канд. физ.-мат. Наук. Ин-т биофизики СО АН СССР, Пущино, 1982. - 17 с.

28. Фомченков В.М., Денесюк А.И. Теоретическая модель высокочастотной релаксации электроориентации бактериальных клеток // Электронная обработка материалов. 1980, № 2 (92). - С. 65-70.112

29. Фомченков В.М., Иванов А.Ю., Мирошников А.И., Чугунов В. А. Электрофизический анализ повреждения внешней мембраны клеток Escherichia coli //Микробиология. 1990. - Т.59, вып. 1. - С. 19-25

30. Фомченков В.М., Мазаное А.Л., Чугунов В.А. и др. Изменение электрических характеристик бактериальных клеток при нарушении барьерной функции цитоплазматической мембраны // Микробиология. 1986. -Т.55, вып. 5. - С. 754-759.

31. Фомченков В.М., Мирошников А.И., Иванов А.Ю., Кувшинникова В. В. Диэлектрофоретическое поведение клеточных суспензий //Электронная обработка материалов. 1975, № 2 (62). - С. 60-64.

32. Abo-El-Dahab М.К., El-Goorani М.А. Antagonism among strains of Pseudomonas solanacearum //Phytopathology. 1969. - V/ 59. - P. 1005-1007.

33. Ackermann H.-W., Brochu G. Phage-like bacteriocins // Laskin A.I. and Lechevalier H.A. CRC Handbook of Microbiology. 2nd ed. -V. 2. - CRC Press, Boca Raton, Fla. - 1978. - P.691.

34. Ackermann H.-W., Dubow M.S. Viruses of Prokaryotes. // General properties of bacteriophages. CRC Press, Boca Raton, Fl. 1987. - V. 1. - P. 202.

35. Ackermann H.-W., Gauvrean L. Phages defectifs chez Chromobacte-rium // Zentralbl. Bacteriol. Parasitenkd. Infektionskr. Hyg. Abt. 1 Orig. Reihe A. 1972. - V. 221.-P. 196.

36. Bayer M.E. Adsorbtion of bacteriophages to adhesions between wall and membrane of Escherichia coli // J. Virol. 1968. - V. 2. - P.346-356.

37. Beckendorph S.K. Structure of the distal half of the bacteriophage T4 tail fiber//J. Mol. Biol. 1973. -V. 73.- P.37-53.

38. Bergey's Mannual of determinative bacteriology. 8th ed. - Baltimore: London: Williams and Wilkins Comp. - 1974. - 1268 p.

39. Birdsell D.C., Hathaway G.M., Rutberg L. Characterization of temperate Bacillus bacteriophage ф105 //J. Virol. 1969. - V. 4., №3. - P. 264 -270.113

40. Bradley D.E. Ultrastructure of bacteriophages and bacteriocins // Bacteriol. Rev. 1967. - V. 31. - P.230-314.

41. Bradley D.E. The adsorbtion of Pseudomonas aeruginosa pilus-dependent bacteriophages to a host mutant with non-contractile pili // Virology. -1974.-V. 58. P.149-163.

42. Bradley D.E., Dewar C.A. II J. Gen. Virol. 1967. - V. 1. - P.179.

43. Brenner S., Home R. W. A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses // Biochim. Boiphys. Acta. 1959. - V. 34. -P. 103-110.

44. Chatterjee A.K., Starr M.P. Transfer among Erwinia spp. and other enterobacteria of antibiotic resistance carried on R factors 11 J. Bacteriol. 1972. - V. 112.-P. 576-584.

45. Christofi N., Wilson M.I., Old D.C. Fimbriae and haemaglutinins in erwinias of the cerotovora group // J. Appl. Bacteriol. 1979. - V. 46. - P. 179183.

46. Cornil A.-V., Babes V. II Les bacteries. Paris.: Balliere. - 1886. -P.182-189.

47. Crowley C.F., De Boer S.H. Sensitivity of some Erwinia carotovora serogroups to macromolecular bacteriocins // Can. J. Microb. 1980. - V. 26, №9.-P. 1023-1028.

48. Cuppels D., Hanson R.S., Kelman A. Production of bacteriocin-like compounds by Pseudomonas solanacearum // Abstr. Ann. Meet. Am. Phytopathol. Soc.- 1975.-№ 155.114

49. Cuppels D., Hanson R.S., Kelman A. Isolation and characterization of a bacteriocin produced by Pseudomonas solanacearum //J. Gen. Microb. 1978. -V. 109.-P. 295-303.

50. De Ley J., Park I. W., Tijtgat R., Van Ermengem J. DNA homology and taxonomy of Pseudomonas and Xanthomonas // J. Gen. Microb.-1966. V. 42. - P. 43-56.

51. Dalrymple B., Mattick J.S. An analysis of the organization and evolution of tipe 4 fimbrial (Me Phe) subunit proteins // J. Mol. Biol. 1987. - V. 25. P.-261-269.

52. Echandi E. Biological control of bacterial cancer of tomato with bac-teriocins from corynebacterium michiganense // Cappels et al. Abstr. Ann. Meet. Am. Phytopathol. Soc. - 1975. - № 154.

53. Echandi E. Bacteriocin production by Corynebacterium michiganense // Phytopathology. 1976. - V. 66. - P. 430-432.

54. Elleman T.C. Pilins of Bateroides nodosus: Molecular basis of sero-typic variation and relationship to other bacterial pilins // Microb. Rev. 1980. -V. 52. - P. 233-247.

55. Endo F., Tsuyama H., Hakatani F. Studies on the productionof antibacterial agent by Erwinia carotovora and its properties // Ann. Phytopathol. Soc. Jap. 1975.-V. 41.-P. 40-48.

56. Engler G et al. Agrocin-84 sensitivity: a plasmid determined property in Agrobacterium tumefaciens // Mol. Gen. Genet. 1975, - V. 138. - P. 345-350.

57. Erskine J.M., Lopateck L. In vitro and vivo interactions between Erwinia amylovara and related saprophytic bacteria // Can. J. Microbiol. 1975. -V. 21.-P. 35-41.

58. Foglesong M.A., Markovetz A.J. Morphology of Bacteriophage-like particles from Fusobacterium symbiosum // J. Bateriol. 1974. - V. 119, № 1. -P.325-329.115

59. Fredericq E., Oth A., Fontaine F. The ultraviolet spectrum of deoxyribonucleic acids and their constituents // J. Mol. Biol. 1961. - V. 3. - P. 11-17.

60. Fredericq P. Sur la pluratite des récepteurs d'antibiose de E. coli // C. R. Soc. Biol. 1946.-V. 140.-P. 1189-1190.

61. Fredericq P. On the nature of colicinogenic factors: a review // J. Theor. Biol. 1963. - V. 4. - P. 159-165.

62. Garrett C.M.E., Panagopoulos C.G., Crosse J.E. Comparison of plant pathogenic pseudomonads from fruit trees // J. Appl. Bacteriol. 1966. - V. 29. -P. 342-356.

63. Garro A.J., Marmur J. Defective bacteriophages // J. Cell Physiol. -1970.-V. 76. -P. 253.

64. Glagolev A.N., Skulachev V.P. //Nature. 1978. - V. 272. - P. 280.

65. Goodman R.N. In vitro and in vivo interactions between components of mixed bacterial cultures isolated from apple buds // Phytopatology. 1965. -V. 55.-P. 217-221.

66. Gratia A. Sur un remarquable example d'antagonisme entre deux souches de colibacille // C. R. Soc. Biol. 1925. - Y. 93. - P. 1040-1041.

67. Gratia A. Antagonisme microbien et «bacteriophagie» // Ann. Inst. Pasteur Paris. 1932. - V. 48. - P. 413-437.

68. Haag W.L., Vidaver A.K. Purification and characterisation of syringa-cin 4-A, a bacteriocin from Pseudomonas syringae 4-A // Antimicrob. Agents Chemother. 1974. - V. 6. - P. 76-83.

69. Haahtela K, Tarkka E., Korhonen T.K. Type 1 fimbria-mediated adhesion of enteric bacteria to grass roots // Appl. Environ. Microbiol. 1985. - V. 49.-P. 1182-1185.

70. Hamon Y. Contribution a l'etude des pyocines // Ann. Inst. Posteur. -1956.-V. 91.-P. 82-90.116

71. Hamon Y., Maresz J., Peron Y. Description de quelques épreuves permattant la distinction entre les phages létaux de lysogenie et les bacteriocines // C. R. Acad. Sei. Ser. D. 1968. - V. 267. - P.1118.

72. Hamon Y, Peron Y. Les propriétés antagonistes réciproques parmi les Erwinia. Discussion de la position toxonomique de ce genre // C. R. Acad. Sei. -1961.-V. 253.-P. 913-915.

73. Hamon Y., Peron Y. Les Bacteriocines, elements taxonomiques eventuels pour certains bacteries // C. R. Acad. Sei 1962. - V. 254. - P. 28682870.

74. Hantke K., Braun V. Fluorescence studies on the first steps of phage-host interactions // Virolog. 1974. - V. 58. - P.310-312.

75. Hardy K.G. Colicinogeny and related phenomena // Bacteriol. Rev. -1975. V. 39, № 4. - P.464-515.

76. Hayashi T., Baba T., Matsumoto H., Terawaki Y. Phage conversion of cytotoxin production in Pseudomonas aeruginosa // Molec. Microbiol. 1990. -V. 4, №10.-P. 1703-1711.

77. HildebrandD.C., Palleroni N.J.,Schroth M.N. Deoxyribonucleic acid relatedness of 24 xanthomonad strains representing 23 Xanthomonas campestris pathovars and Xanthomonas fragariae I I J. Appl. Bacteriol. 1990. - V. 68. - P. 263-269.

78. Hildebrand D.C., Schroth M.N. A new species of Erwinia causing the drippy nut disease of life oaks // Phytopathology. 1967. - V. 57. - P. 250-253.117

79. Hollow ay B. W., Krishnapillai V. Bacteriophages and bacteriocins I I Clarke P.H. and Richmond M.N. (ed) Genetics and biochemistry of Pseudomonas. London: John Wiley and sons. -1975. - P. 99-132.

80. Htay K, Kerr A. Biological control of crown gall: seed and root inoculation // Appl. Bacteriol. 1974. - V. 37. - P. 525-530.

81. Ito S., Kageyama M. Relationship between pyocins and a bacteriophage in Pseudomonas aeruginosa // J. Gen. Appl. Microbiol. 1970. - V.16. -P.231-240.

82. Ito S., Kageyama M., Egami F. Isolation and characterisation of pyocins of Pseudomonas aeruginosa // J. Gen. Appl. Microbiol. 1970. - V. 16. - P. 205-214.

83. Jacob F. Biosynthese induite et mode d'action d'une pyocine antibiotique de Pseudomonas pyocyanea // Ann. Inst. Pasteur Paris. 1954. - V. 86. -P. 149-160.

84. Jacob F., Lwoff A., Simonovich A., Wollman E. Definition de quelques termes relatifs à la lysogènie // Ann. Inst. Pasteur Paris. 1953. - V. 84. P.222.

85. Kageyama M. Studies of a pyocin. I. Physical and chemical properties // J. Biochem. 1964. - V. 55. - P. 49-53.

86. Kageyama M., Egami F. On the purification and some properties of a pyocin, a bacteriocin produced by Pseudomonas aeruginosa // Life Sei. 1962. -V. 9.-P. 471-476.

87. Kageyama M, Ikeda K, Egami F. Studies of a pyocin. III. Biological properties of the pyocin // J. Biochem. 1964. - V. 55. - P. 59-64.

88. Kageyama M., Shinomiya T., Aihara Y., Kabayashi M. Câracterisa-tion of a bateriophage related to R-type pyocins // J. Virol. 1979. V. 32, №3. -P. 951-957.118

89. Kaziro F., Tanaka M. Studies of the mode of action of pyocin. I. Inhibition of macromolecular synthesis in sensitive cells // J. Biochem. 1965. - V. 57.-P. 689-695.

90. Kerr A. Biological control of crown gall: seed inoculation // J. Appl. Bacteriol. 1972. - V. 35. - P. 493-497.

91. Kerr A., Htay K. Biological control of crown gall through bacteriocin production // Physiol. Plant Pathol. 1974. - V. 4. - P. 37-44.

92. Labedan B., Letellier L. Energetics of the first steps of the phage infection // J. of Bioenergetics and Biomembranes. 1984. - V. 16, № 1. - P. 1-8.

93. Lacy G.N., Leary J. V. Transfer of antibiotic resistance plasmid RP1 into Pseudomonas phaseolicola in vitro and in planta // J. Gen. Microb. 1975. -V. 88. - P. 49-57.

94. Lai M., Panopoulos N.J., Shaffer S. Transmission of R plasmids among Xanthomonas spp. and other plant pathogenic bacteria // Phytopatology. -1977. V. 67, № 8. - P. 1044-1050.

95. Lazar I., Crosse J.E. Lysogeny, bactericinogeny and phage types in plum isolates of Pseudomonas morsprunorum Wormald // Rev. Roum. Biol. Ser. Bot. 1969. - V. 14. - P. 325-333.

96. Liew K.W., Alvarez A.M. Biological and morphological characterization of Xanthomonas campestris bacteriophages // Phytopathology. 1981. -V. 71, №3.-P. 269-276.

97. Matthews P. Bacteriocin activity in Pseudomonas morsprunorum and P. syringae // John Innes Inst. Ann. Rept. 1965. - V. 1964. - P35-36.119

98. Mclntyre J.L., Kuc J., Williams E.B. Protection of pear against fire blight by bacteria and bacterial sonicates // Phytopathology. 1973. - V. 63. - P. 872-877.

99. Moore L.W. Biological control of crcwn gall with an antagonistic Agrobacterium species // Hanson R, Kelman A. Production of bacteriocin-like compaunds by Pseudomonas salanacearum. Abstr. Ann. Meet. Am. Phytopa-thol. Soc.- 1975.-№155.

100. Morse S.A., Vanghan P., Jonson D., Iglevski B.N. Inhibition of Neisseria gonorrhoeae by a bateriocins from Pseudomonas aeruginosa // Antimicrob. Agents and chemotherapy. 1976. -.V. 10. - № 2. - P. 354-362.

101. Nelson G.A., Semeniuk G. An antagonistic variant of Corynebacte-rium insidiosum and some properties of the inhibitor // Phytopathology. 1964. -V. 54.-P. 330-335.

102. New P.B., Kerr. A. Biological control of crown gall: field measurements and glasshouse experiments // J. Appl. Bacteriol. 1972. - V. 35. - P. 279287.

103. Nomura M. Colicins and related bacteriocins // Annu. Rev. Microbiol. 1967. - V. 21. - P. 257.

104. Okabe N. Studies on Pseud, solanacearum. V. Antagonism among the strains of P. solanacearum // Rept. Fac. Agric. Shizuoka Univ. 1954. - V. 4. - P. 37-40.

105. Okabe N., Goto M. Bacteriophages of plant pathogens // Ann. Rev. Phytopathol. 1963. - V. 1. - P. 397-418.

106. Okamoto K., Mudd J. A., Mangan J et al. Properties of the defective phage of Bacillus subtilis // J. Mol. Biol. - 1968. - V. 34. - P. 413-428.

107. Ozaki M., Higashi F., Saito H. et al. Identity of megacin A with phospholipase A // Biken J. - 1966. - V. 9. - P. 201.120

108. Panopoulos N.J., Guimaraes W.V., Cho J.J., Schroth M.N. Conju-gative transfer of Pseudomonas aeruginosa R factors to plant pathogenic Pseudomonas spp. V. 9. -P. 201.IIPhytopathology. 1975. - V. 65. - P. 380-388.

109. Paters on A.C. Bacteriocinogeny and lysogeny in the genus Pseudomonas // J. Gen. Microbiol. 1965. - V. 39. - P. 295-303.

110. Plate C.A., Suit J.L., Jetten A.M., Luria S.E. Effects of colicin K on a mutant of Escherichia coli deficient in Ca , Mg activated adenosine triphosphatase // J. Biol. Chem. 1974. - V. 249. - P. 6138-6143.

111. Reanney D.C., Ackermann H.-W. Comparative biology and evolution of bacteriophages // Adv. Vir. Res. 1982. - V. 27. - P. 205-280.121 .Reeves P. The Bacteriocins 11 Bacteriol. Rev. 1965. - V. 29. - P.24.25.

112. Reeves P. The Bacteriocins. New York: Springer-Verlag, 1972.

113. Riggle J.H., Klos E.J. Relationship of Erwinia herbicola to Erwinia amylovora // Can. J. Bot. 1972. - V. 50. - P. 1077-1083.

114. Romantschuk M., Bamford D. The causal agent of halo blight in bean, Pseudomonas syringae pv. phaseolicola, attaches to stomata via its pili // Microb. Pathog. 1986. - V. 1. - P. 139-148/

115. Sawada H., Azegami M., Ishii S. Lytic enzyme produced by Pseudomonas aeruginosa concomitantly with bacteriophage PS 17. Purification, characterization and comparison with PRl-lysozyme // J. Biochem. 1981. - V. 89. -P. 275-284.

116. Schroth M.N., Thomson S.V., Hildebrand D.S., Moller W.J. Epidemiology and control of fire blight // Ann. Rev. Phytopathol. 1974. - V. 12. - P. 389-412.

117. Shinomiya T., Ina S. Genetic comparison of bacteriophage PS 17 and Pseudomonas aeruginosa R-type pyocin // J. Bacteriol. 1989. - V. 171, № 5. -2287-2292.121

118. Shinomiya T., Ohsum M, Kageyama M. Defective pyocin particles produced by some mutant strains of Pseudomonas aeruginosa // J. Bacteriol. -1975.-V. 124.-P. 1508-1521.

119. Shinomiya 71, Shiga S. Bactericidal activity of the tail of Pseudomonas aeruginosa bacteriophage PS 17 // J. Virol. 1979. - V. 32, № 3. - P.958-967.

120. Smidt M.L., Vidaver A.K. Bacteriocin production by Pseudomonas syringae PS W-l in plant tissue // Can. J. Microb. 1982. - V. 28. - P. 600-604.

121. Steensma H.Y., Robertson L.A., van Elsas J.D. The occurrence and taxonomic value of PBSX-like defective phages in the genus Bacillus // Antonie van Leeuwenhock. 1978. - V. 44. - P. 353-366.

122. Stemmer W.P.C., Sequeira L. Fimbriae of phytopathogenic and symbiotic bacteria//Phytopathology. 1987. - V. 77. - P. 1633-1639.

123. Stirm S., Bessler W., Fehmel F. et al. Isolation of spike-formed particles from bacteriophage Lysates It Virology. 1971. - V. 45. - P. 303.

124. Stirm S., Bessler W., Eehmel F. et al. Über eine Bakteriophagen-induzierte Colansäure-Depolymerase // Zentrabi. Bakteriol. Parasitenkd. Inf. Hyg. Abt. 1 Orig. Reiche A. 1974. - V. 226. - P. 26.

125. Stonier T. Agrobacterium tumifaciens Conn.II. Production of an antibiotic substance //J. Bacteriol. 1960. - V. 79. - P. 889-898.

126. Tagg J.R., Dajani A.S., Wannamaker L.W. Bacteriocins of grampositive bacteria // Bacteriol. Rev. 1976. - V. 40. - P. 722.

127. Takashi K., Yasuhiko O., Ishii Shin-ichi Isolation and characterization of pyocin R1 fibers // J. Biochem. 1982. - V. 91, №.3. - P. 825-835.

128. Uratani Y, Kageyama M. A fluorescent probe response to the interaction of pyocin R1 with sensitive cells // J. Biochem. 1977. - V. 81. - P. 333341.122

129. Van den Mooter M. and Swings J. Numerical analysis of 295 phe-notypic features of Xanthomonas strains and related strains and an improved taxonomy of the genus // Int. J. Syst Bacteriol. 1990. - V. 40. - P. 348-369.

130. Van Doom J., Boonekamp P.M., Oudega B. Partial characterization of fimbriae of Xanthomonas campestris pv. hyacinthi // Mol. Plant. Microbe Interact. 1994. -V.l.- P. 334-344.

131. Vauterin L., Swings J., Kerstens K. Grouping of Xanthomonas campestris pathovars by SDS-PAGE of proteins // Gen. Microbiol. 1991. - V. 137. -P. 1677-1687.

132. Vauterin L., Swings J., Kerstens K et al. Towards an improved taxonomy of Xanthomonas // Int. J. Syst. Bacteriol. 1990. - V. 40. - P. 312-316.

133. Vervliet G., Holsters M., Teuchy H. et al. Characterization of different plaqe-forming and defective temperate phages in Agrobaterium strains // J. Gen. Virol. 1975. - V. 26. - P. 33-48.

134. Vesper S.J. Production of pili (fimbriae) by Pseudomonas fluores-cens and correlation with attachment to corn roots // Appl. Env. Microb. 1987. -V. 53.-P. 1397-1405.

135. Vidaver A.K., Mathys M.L., Thomas M.E., Schuster M.L. Bacte-riocins of the phytopathogens Pseudomonas syringae, P. glycinea and P. phaseo-licola // Can. J. Microbiol. 1972. - V. 18. - P. 705-713.

136. Vidaver A.K., Schuster M.L. Characterization of Xanthomonas phaseoli bacteriophages // J. Virol. 1969. - V. 4, № 3. - P. 300-308.

137. Wrather J.A., Kuc J., Williams E.B. Protection of apple and pear fruit tissue against fireblight with nonpathogenic bacteria // Phytopathology. -1973.-V. 63.-P. 1075-1076.

138. Yokokura T., Kodaira S., IshiwaH., Sakurai T. Lysogeny in lactoba-cilli // J. Gen. Microb. 1974. - V. 84. - P. 277-284.123

139. Yokota S.I., Hayashi T., Matsumoto H. Identification of the lipopolysaccharide core region as the receptor site for a cytotoxin-converting phage ф CTX // J. Bateriol. 1994. - V. 176, № 17. - P. 5262-5269.