Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Разнообразие, распространение и методы диагностики бактерий родов Xanthomonas и Clavibacter, поражающих томат

ВАК РФ 06.01.07, Плодоводство, виноградарство

Автореферат диссертации по теме "Разнообразие, распространение и методы диагностики бактерий родов Xanthomonas и Clavibacter, поражающих томат"

На правах рукописи

/

/ /'

КОРНЕВ КОНСТАНТИН ПАВЛОВИЧ

РАЗНООБРАЗИЕ, РАСПРОСТРАНЕНИЕ И МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ БАКТЕРИЙ РОДОВ ХАИТНОМОЫАБ И СЬА УШАСТЕЯ, ПОРАЖАЮЩИХ ТОМАТ

Специальности: 06.01.07 - защита растений, 03.02.07 — генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ОЯ ЛШ 005538952

Москва-2013

005538952

Работа выполнена в лаборатории бактериальных болезней растений ГНУ ВНИИ фитопатологии РАСХН (Московская область, г. Голицыно)

Научный руководитель: доктор биологических наук,

Игнатов Александр Николаевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

заведующий кафедрой генетики и биотехнологии ФГБОУ ВПО «Российский государственный аграрный университет -МСХА имени К.А. Тимирязева», Соловьев Александр Александрович

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории биотехнологии Всероссийского научно-исследовательского института селекции и семеноводства овощных культур Шумилина Дарья Владимировна

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский

институт овощеводства

Защита состоится 17 декабря 2013 года в 1300 на заседании диссертационного совета Д.220.043.04 при Российском государственном аграрном университете - МСХА имени К.А. Тимирязева по адресу: 127550, г. Москва, ул. Прянишникова, д.15. т/ф. (499) 976-24-92.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке имени Н.И. Железнова РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева.

Автореферат разослан «15» ноября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Актуальность темы. Томат (Solanum lycopersicum L.) - широко распространенная в мире сельскохозяйственная культура. По данным ФАО, на территории России ежегодно производится более 2 млн. т. урожая томата (FAO, 2011). Значительный экономический ущерб данной культуре наносят бактериозы, в том числе черная бактериальная пятнистость и рак томата (Ахатов и др., 2013).

Возбудитель черной бактериальной пятнистости Xanthomonas vesicatoria был впервые описан в 1920 г. (Doidge, 1920, 1921) и в настоящее время выявлен более чем в 70 странах. Плоды томата при заражении этим фитопатогеном часто становятся не пригодными для употребления в пищу, а пораженность растений в открытом грунте может достигать 100%. Источниками инфекции являются семена и растительные остатки (Gardner, Kendrick, 1921; Lewis, Brown, 1961; Bashan et al., 1982). В настоящее время Xanthomonas vesicatoria разделен на четыре самостоятельных вида: X. euvesicatoria (Jones et al., 2006), X. vesicatoria (ex Doidge 1920, Vauterin et al., 1995), X.perforans (Jones et al., 2006), X. gardneri (ex Sutic 1957, Jones et al., 2006), которые отличаются друг от друга по биохимическим и молекулярно-генетическим признакам. Однако, в литературе имеются сведения о распространении на территории России лишь одного вида - ^ vesicatoria (Матвеева и др., 1999).

Другое не менее важное заболевание — бактериальный рак томата, возбудителем которого является Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith, 1910; Davis et al., 1984). В настоящее время этот фитопатоген распространен более чем в 54 странах. Основными источниками данного бактериоза являются зараженные семена, рассада и растительные остатки (Grogan, Kendrick 1953; Strider, 1969; Chang et al., 1989; Gitaitis et al., 1991).

На территории Российской Федерации распространение возбудителей черной бактериальной пятнистости и рака томата недостаточно изучено, а с учетом последних таксономических работ видовой состав рода Xanthomonas, поражающих томат, фактически не известен. В то же время, в отечественной литературе отсутствуют сведения о методах идентификации данных фитопатогенов для своевременного выявления и диагностики возбудителя в зонах возделывания томата и при анализе семенного материала.

Цели и задачи исследований. Цель настоящей работы — изучить видовое разнообразие, распространение на территории России и методы диагностики бактерий родов Xanthomonas и Clavibacter, поражающих томат. Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи:

1. Провести сбор материала для составления коллекции штаммов родов Xanthomonas и Clavibacter, поражающих томат.

2. Исследовать культурально-морфологические, биохимические и патогенные свойства изучаемых видов бактерий родов Xanthomonas и Clavibacter.

3. Провести молекулярно-генетический анализ штаммов исследуемых видов родов Xanthomonas и Clavibacter.

4. Усовершенствовать методы диагностики исследуемых видов бактерий.

5. Изучить распространение данных видов фитопатогенов томата на

территории России.

Научная новизна исследований.

- Впервые в Российской Федерации выявлены и идентифицированы виды возбудителей черной бактериальной пятнистости томатов, принадлежащих к Xanthomonas euvesicatoria, X vesicatoria, X. gardneri, X. campestris pv. raphani, X. arboricola, показано их распространение.

- Определены последовательности генов dnaK, rpoD, jyuA, ргрС и fabY для российских штаммов 5 видов фитопатогенных ксантомонад, поражающих томат, наибольшее генетическое расстояние между этими видами показано по генам dnaK и ргрС, что указывает на возможность их использования для разработки видоспецифичных молекулярных маркеров.

- Впервые обнаружены штаммы X. arboricola, поражающие томат.

- Впервые описана и изучена патогенная для растений томата и картофеля раса бактерии Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis {Сmm).

- Определены последовательности генов gyrB, recA, rpoB, tomA, atp, gpt, rpoB, recA, arsB, glnA, spt, sos, ssrA штаммов российской популяции Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis и близкородственных видов и родов бактерий, показано наибольшее генетическое расстояние между группами подвида Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis по генам gpt, arsB, glnA и sos, что указывает на возможность их использования для разработки молекулярных маркеров специфичных для томатной и картофельной рас патогена.

Практическая значимость работы.

Штаммы Xanthomonas euvesicatoria, X. vesicatoria, X. perforons, X. gardneri, X. campestris pv. raphani, X. arboricola и Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis депонированы в Государственную коллекцию фитопатогенных микроорганизмов (ГНУ ВНИИФ).

Оптимизированы молекулярно-генетические методы идентификации видов рода Xanthomonas и Clavibacter.

Получены данные о распространении исследуемых видов фитопатогенов на территории России, которые могут быть использованы для мониторинговых исследований фитосанитарного состояния.

Показана возможность заражения расой Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis не только растений томата, но и картофеля, который может являться потенциальным резерватором патогена.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Среди фитопатогенных бактерий, поражающих томат, идентифицированы 5 видов рода Xanthomonas и подвид Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis.

2. У подвида Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis установлена картофельная раса, способная заражать томат и картофель, что следует учитывать при планировании защитных мероприятий.

3. Идентификация видов возбудителей черной бактериальной пятнистости возможна методом мультилокусного генотипирования по генам dnaK и ргрС, а для подвида Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis — по генам глюкозо-1-фосфат тимидилтрансфераза (gpt), арсенат пермеаза (arsB), глутамин-синтетаза (glnA), сос-репрессор (sos).

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 58-м Международном симпозиуме по защите растений (Тент, Бельгия, 2007); Третьем региональном симпозиуме стран Балтии по агробиотехнологии (Санкт Петербург, 2007); Втором Международном симпозиуме по болезням томатов (Кушадасэ, Турция, 2007); Двадцать второй международной научной школе молодых ученых, аспирантов по болезням растений, и молекулярной биологии (Хуутилая, Финляндия, 2008); Научно-практической конференции по молекулярной биологии в ВНИИСБ (Москва, 2008); 61-м Международном симпозиуме по защите растений (Гент, Бельгия, 2009); 8-й Международной конференции по патологическим вариантам Pseudomonas syringae и родственным патогенам (Оксфорд, Англия, 2010).

Публикации по теме диссертации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 5 статей в журналах, включенных в перечень рецензируемых научных журналов, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, экспериментальной части, выводов, списка литературы и приложения. Материал изложен на 144 страницах машинописного текста, содержит 20 таблиц и 29 рисунков. Список использованной литературы включает 241 источник, из них 209 иностранных.

Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю А.Н. Игнатову, сотрудникам лаборатории бактериальных болезней растений ВНИИ фитопатологии РАСХН - Е.В. Матвеевой, Э.Ш. Пехтеревой, В.А. Политыко, а также Н.И. Будынкову; специалистам ARS USDA - N.W. Schaad, A. Sechler, Е. Постниковой; специалистам ФГБУ «ВНИИКР» - Е.С. Мазурину, И.О. Камаеву.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение. Приведено обоснование актуальности темы исследования, ее научная новизна, теоретическое и практическое значение, сформулированы цель и задачи исследования.

Глава 1. Обзор литературы

В главе рассмотрены вопросы биологии, в особенности, систематики, молекулярной биологии, патогенеза бактериальных патогенов томата видов рода Xanthomonas и Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, а также даны сведения об их вредоносности. Приведены сведения о видовом и расовом составе данных возбудителей бактериозов томата, распространении и основных методах их диагностики.

Глава 2. Методы и материалы

Сбор материала. В 2005-2010 гг. были проведены обследования растений томата открытого и защищенного грунта в 6 республиках, 1 крае и 16 областях, относящихся к 8 регионам Российской Федерации: Центральному, ЦентральноЧерноземному, Нижневолжскому, Средневолжскому, Северо-Кавказскому, Северо-Западному, Волго-Вятскому и Уральскому. Кроме того, отбирали клубни и растения картофеля с симптомами увядания и кольцевой гнили. Всего было изучено более 1500 образцов, выделено и идентифицировано 248 штаммов, которые были депонированы во Всероссийскую коллекцию фитопатогенных бактерий ВНИИ фитопатологии РАСХН. Для сравнительного анализа использовали также штаммы из Американской коллекции типовых культур (АТСС).

Выделение возбудителей в чистую культуру производили методом истощения, посевом на последовательный ряд чашек Петри (не менее 10 чашек) для получения отдельных колоний. Были использованы питательные среды YDC, NBY, PSA, картофельный агар с генциан-виолетом.

Изучение морфологических, биохимических и физиологических свойств бактерий. Проводили анализ признаков, важных для идентификации патовариантов, подвидов и видов изучаемых патогенов в соответствии с методическими руководствами Kiraly et al., 1970; Матвеевой и др., 1990; Schaad et al., 2001.

Определение реакции сверхчувствительности и патогенных свойств. Все изоляты были протестированы на способность вызывать реакцию сверхчувствительности (СЧР) методом инфильтрации суспензии бактерий в листья растений табака ([Nicotiana tabacum). Штаммы с положительной СЧР использовали для определения патогенных свойств при помощи заражения растений-дифференциаторов и растений-хозяев. Заражение растений-дифференциаторов проводили методом обрезания ножницами 1/3 листовой пластинки, методом опрыскивания растений бактериальной суспензией с повреждением поверхности листьев, методом прищипывания (клиппинг), методом инъекции в стебель (Матвеева и др., 1990).

Заражение растений-хозяев. Для оценки патогенности изолятов возбудителей были использованы представители семейства Пасленовых (Solanaceae): перец сладкий (Capsicum аппиит) сорт «Подарок Молдовы», баклажан {Solanum melongena) сорт «Солярис»; физалис (Physalis) сорт «Королек»; томат (Solanum lycopersicum) сорта «Fl Кострома», «Carmello», «Soprano». Кроме того, для Стт были исследованы Пасленовые (Solanaceae) — картофель (Solanum tuberosum) сорта «Батя» и «Удача», Капустные (Brassicaceae), Злаковые (Gramineae), Бобовые (Fabaceae).

Математическую обработку результатов опытов проводили методом дисперсионного анализа с последующим попарным сравнением по критерию Дункана при помощи пакета статистических программ Statistica v.6.01 («StatSoft», США).

Молекулярно-генетический анализ. ДНК бактерий выделяли при помощи модифицированного SDS-CTAB метода (Tsygankova et al., 2004). ДНК амплификацию проводили с использованием наборов компании Диалат (Москва) при оптимизированных температурно-временных параметрах на амплификаторах GeneAmp PCR System 9700, («Perkin-Elmer», США) и Eppendorf MasterCycler Gradient («Eppendorf», Германия). ПЦР «в реальном времени» проводили на амплификаторе Cepheid Smart Cycler II (США). Амплифицированные продукты разделяли в 1,5% агарозном геле с бромистым этидием и документировали при помощи системы UVP-DocIt (Великобритания). Для клонирования продукты ПЦР очищали при помощи набора «Wizard PCRPreps» («Promega», США). Выделенные ПЦР-фрагменты, специфичные для видов рода Xanthomonas, клонировали в Escherichia coli DHlOß с использованием наборов реактивов «pGEM-T and pGEM-T Easy Vector Systems» («Promega», США). Выделение и очистку плазмидной ДНК проводили с помощью набора «Wizard MiniPrep» («Promega», США). Прямое секвенирование нуклеотидных последовательностей (Sanger et al, 1977) проводили с применением набора реактивов BigDye Terminator v.3.1 Cycle Sequencing Kit («Applied Biosystems», США) на автоматическом секвенаторе DNA Analyzer 3730 («Applied Biosystems», США).

Для ПЦР-анализа штаммов рода Xanthomonas были использованы следующие праймеры: ERIC1R/2, BOXA1R и его модификации (Louws et al., 1994), С152 (Yao, 1995), IaaH/IaaH2 (Latha et al., 2006), 4 пары SCAR-праймеров: BS-XeF/R, BS-XvF/R, BS-XpF/R, BS-XgF/R (Koenraadt et al., 2009). Для MLST (мультилокусного генотипирования) были определены нуклеотидные последовательности фрагментов 5 генов - dnaK, rpoD, jyuA, prpC,fabY{Young et al., 2008; Ignatov et al., 2007).

Для ПЦР-анализа штаммов рода Clavibacter были использованы следующие праймеры: С152 (Yao, 1995), BOXAIR и его модификации (Louws et al., 1994), Cmm 5/6 (Dreier et. al., 1995); PSAl/PSAR (Pastrik & Rainey, 1999; Pastrik, 2000), 14 nap STS праймеров (Rijlaarsdam et al., 2004). Для MLST анализа были определены нуклеотидные последовательности фрагментов 13 генов: gyrB, recA, rpoB, tomA, с праймерами CmGyrB59/669, CmRecA80/545, CmrpoB 144/В1041, CmTomA34/1446 (Stackebrandt et al., 2007) и atp, gpt, rpoB, recA, arsB, glnA, spt, sos, ssrA с оригинальными праймерами. Для ПЦР в реальном времени использовали коммерческие наборы Nova Primers Cmm (California inc., США).

Биоинформационный анализ данных. Первичное сравнение полученных нуклеотидных последовательностей с последовательностями базы данных ГенБанка проводили с помощью программы NCBI BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Проверку, выравнивание и редактирование последовательностей вручную проводили с помощью программы CodonCode aligner (CodonCode Corporation, USA; www.codoncode.com) и редактора «BioEdit v.7.0.5.3» (Hall, 1999). Подбор праймеров и проб осуществлялся с помощью программ Oligo v.6.01 (Molecular

Biology Insights Inc., США) и SNPs Finder (http://snpsfinder.lanl.gov/). Анализ последовательностей проводили с помощью программы MEGA 4.0 (Tamura et al., 2007). Попарные генетические расстояния между последовательностями были определены по двупараметрической модели Кимуры (Kimura, 1980). Дендрограммы строили методами ближайшего связывания («neighbor-joining»; Saitou & Nei, 1987), максимальной парсимонии (Fitch, 1977) и минимальной эволюции (ME; Saitou and Nei, 1987). Устойчивость кластеров определяли с помощью бутстреп-анализа («bootstrap-analysis») путем построения 500 альтернативных дендрограмм.

Глава 3. Результаты исследований и обсуждение

3.1 Выделение бактерий, идентификация, составление коллекции штаммов

Из пораженных растений томата девяти различных зон Российской Федерации в чистую культуру были выделены и охарактеризованы 57 штаммов бактерий вида Xanthomonas vesicatoria и 184 штамма бактерии подвида Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm). Кроме того, 21 штамм подвида Cmm был выделен из образцов картофеля, идентифицирован и охарактеризован наряду с остальными штаммами данного подвида. Суммарное количество штаммов различных видов представлено в табл. 1.

Табл. 1 Общее количество депонированных в Государственную коллекцию штаммов исследуемых фитопатогенов из пасленовых культур

Род, вид, подвид Выделенное число штаммов

Род Xanthomonas

Xanthomonas euvesicatoria 5

Xanthomonas vesicatoria 30

Xanthomonas gardneri 1

Xanthomonas arboricola 1

Xanthomonas campestris pv. raphani 6

Получено из международных коллекций 14

Род Clavibacter

Clavibacter michiganensis ssp. michiganensis, выделенные из томата 184

Clavibacter michiganensis ssp. michiganensis, выделенные из картофеля 21

Всего 262

3.2 Характеристика бактерий рода Xanthomonas, выделенных из растений томата на территории России

Культурально-морфологическая характеристика. На агаризованной среде YDC, PSA при инкубации более двух дней при температуре 27°С все исследуемые штаммы бактерий рода Xanthomonas, поражающие растения томата, формировали желтые, выпуклые, гладкие, блестящие, вязкие, маслянистые и клейкие колонии.

Биохимические свойства. Большая часть изученных биохимических признаков для рода Xanthomonas соответствовала описаниям из литературы (Bergey, 1980, 1987; Schaad, 1980, 2000; Stall et al, 1994; Bouzar et al, 1995; Vaunterin et al, 1995). Штаммы X. euvesicatoria, X. gardneri и X. arboricola не имели пектолитической и амилолитической активности в отличие от штаммов X. vesicatoria, X. perforans и X. campestris pv. raphani. Подавляющее большинство штаммов возбудителя были оксидазоотрицательными, не имели аргининдигидролазы, уреазы, не образовывали индол, не редуцировали нитраты в нитриты, гидролизовали казеин, эскулин, крахмал, твин 80 и желатин. Большинство штаммов использовали цитрат, лактат, малонат и сукцинат и быстро редуцировали лакмусовое молоко. Образование кислоты наблюдали на арабинозе, лактозе, маннозе, сахарозе, трегалозе, целлобиозе, фруктозе, глюкозе и галактозе. Все штаммы были устойчивы к Си2+ (200 мкг/мл).

Для выделения фитопатогенов в чистую культуру весьма эффективным является использование селективных сред. Селективность обычно достигается введением в среду одного или нескольких антибиотиков. Нами методом диффузии в агаре оценивалась чувствительность видов Xanthomonas euvesicatoria, X. vesicatoria, X. perforans и X. gardneri к набору антибиотиков (табл. 2). Наибольшая чувствительность (подавление роста бактерий) была показана к левомицетину, стрептомицину, эритромицину, гентамицину и канамицину. Изученные штаммы были в основном устойчивы к нистатину и цефалексину.

Табл. 2 Чувствительность штаммов бактерий рода Xanthomonas к 10 антибиотикам

Антибиотики, содержание в диске Зона ингибирования роста в см Среднее значение для рода Xanthomonas

X. euvesicatoria X. vesicatoria perforans X. gardneri

Ампициллин 10 мкг 0,17 0,08 0,10 0,77 0.28е"

Гентамицин 10 мкг 0,62 0,79 0,75 1,00 0,79"

Левомицетин 30 мкг 1,17 1,09 1,83 1,42 1,38"

Канамицин 30 мкг 0,51 0,68 0,67 1,08 о о"

Налидиксовая кислота 30 мкг 0,59 0,50 0,78 0,51 0,604с

Нистатин 80 мкг 0,00 0,00 0,00 0,00 0

Полимиксин Б 300 ЕД 0,53 0,52 0,45 0,63 0,53"с

Стрептомицин 30 мкг 0,56 0,78 0,74 1,48 0,89"

Цефалексин 30 мкг 0,01 0,04 0,00 0,00 0,0

Эритромицин 15 мкг 0,80 1,00 0,98 1,38 1,04a"

Примечание: обработку данных проводили с помощью дисперсионного анализа (Р=14,1; /7=0,1*10"6) с последующим попарным сравнением по критерию Дункана. Разными буквами обозначены значимые различия (р<0,05)

Определение патогенных свойств. Было установлено, что растения перца сорта «Подарок Молдовы» и физалиса сорта «Королек» не восприимчивы к поражению патогеном. На томате методом опрыскивания получали быстрый

визуально регистрируемый результат (появление хлорозов в местах повреждения). Появление симптомов наблюдали через 14 дней (в некоторых случаях через 8-10 дней). Однако, наибольшее проявление патогенности на растениях томата были выявлены при помощи метода инъекции. Появление листовых пятнистостей наблюдалось через 30 дней, но при этом методе чаще наблюдалась гибель растений. Тестирование патогена методом прищипывания не показало значимых результатов. Все изученные штаммы видов р. Xanthomonas из российской и международной коллекций характеризовались сравнительно высокой агрессивностью по отношению к растениям томата.

3.2.2 Молекулярно-генетическая характеристика

Случайный ПЦР-анализ. Предварительное исследование генетической дифференциации штаммов рода Xanthomonas было проведено методом гер-ПЦР с праймерами ERIC1/ERIC2, BoxS3, С-152,1ааН/1ааН2.

Совокупные данные по ПЦР-генотипированию были использованы для построения дендрограммы (рис. 1), показывающей группировку штаммов X. euvesicatoria и X. gardneri в один кластер, тогда как виды X. campestris pv. raphani и X. vesicatoria были соответственно распределены между 2 и 3 кластерами. Референтный штамм X. perforans 938 во всех случаях группировался со штаммами видаХ euvesicatoria. Три штамма X. arboricola 417 и 1577, 1579 были также сгруппированы с X. euvesicatoria, хотя имели четкие отличия по отдельным фрагментам. Полученные результаты были проверены секвенированием фрагментов ДНК 5 генов (MLST) у представительных штаммов отдельных групп и ПЦР-анализом с ранее опубликованными специфичными праймерами для каждого из видов.

ПЦР со SCAR-маркерами. Изучение коллекции ДНК бактерий со специфичными наборами праймеров для 4-х групп бактериальной пятнистости (Koenraadt et al., 2009) - показало наличие положительной реакции только в случае с парой праймеров BS-Xg F/R. Фрагмент размером 154 н.п. наблюдался у штаммов № 322, 324, 346, 411, 412,435, 444, 511, 512, ранее сгруппированных вместе на основании данных биохимических тестов и результатов случайной ПЦР как вид X. gardneri. Штаммы видов X. euvesicatoria, X. vesicatoria и X. perforans не давали ожидаемых фрагментов

MLSA. Дифференциация штаммов рода Xanthomonas, выделенных из растений томата, была проведена методом MLSA с учетом данных, полученных при помощи rep-PCR и биохимических методов. Были определены нуклеотидные последовательности фрагментов 5 генов dnaK, rpoD, fyuA, prpC, fabY (Ignatov et al., 2007; Young et al., 2008). Наибольшие генетические расстояния между видами рода Xanthomonas были показаны по генам ргрС и dnaK, что может быть использовано для разработки видоспецифичных молекулярных маркеров. Кластеризация штаммов по участкам данных генов (рис. 2, 3), в целом, совпадала с таковой, полученной для совокупных данных по ПЦР-генотипированию (рис. 1). В то же время два штамма (1577, 417), выделенные из растений томата, относятся к виду X. arboricola, 6 штаммов

(432, 1572-1574, 111R) — к X campestris pv. raphani. MLSA показал высокую степень сходства последовательностей штаммов р. Xanthomonas из российской коллекции с секвенированными последовательностями штаммов соответствующих видов.

X. euvesicatoria'perforans + X. arboricola

X. vesicatoria 1 группа ] X. campestis pv. raphani X. vesicatoria 2 группа

X. campestis pv. raphani

X. gardneri

100 i Xv Ы 377 Xv Ы378 Xv Ы 384 Xv Ь1381 Xv Ы 380 Xvb1382 Xv Ы667 Xv Ы669 Xv Ы670 Xv Ы668 Xv Ы675 Xvb1671 Xv Ы673 Xv Ы672 Xv Ы674

X. vesicatoria 3 группа

Рис. 1 Дендрограмма сходства штаммов рода ХаМНотопая по результатам ПЦР-анализа с прайм ерам и ВОХвЗ, 1ааНЯааН2, BS-Xg, построенная методом максимальной парсимонни. Устойчивость, определенная бутстреп-анализом (500 альтернативных дендрограмм), дана в процентах над ветвями

Рис.2 Дендрограмма сходства штаммов рода ХаШНотопся для последовательностей 40 фрагментов гена ргрС, построенная методом ближайшего связывания. Устойчивость, определенная бутстреп-аналнзом (500 альтернативных дендрограмм), дана в процентах над ветвями

Xv432

NCPPB1946T

1572 IHR ¡574

1573

NCPPB1711 Xcampestris pv. Tncanae ICMP 574 X campesina raphani ICMP1404T X campestris camp est ris LMG8004 Xcampestris campestrisA TCC33913 X campestris catrq>estr¡s ICMP13 T X campestris campestris ICMP6S41 1377 ¡663

X vesicatoria ICMP1I5 Xv A TCC3593 7(ICMP63T) Xv5235

X vesicatoria JCMP696 Xv56

X arboricola arbor i cola ICMP3S X vesicatoria ICMP9S93 417 1577

X hortorum hederae ICMP1 Xv322 1241 Xv324 Xv435 Xv444 XvGA2

X gardneri ICMP166K9T . X oryzae oryzae 1CMP3125\1 X oryzae oryzae 1CMP440T X oryzae oryzicola 1CMPS 743 T X citri citri ICMP24T Xv93S

X perforan* ICMP1669QT 1585

X euvesicatoria ICMP109 Xvl53

X euvesicatoria 85-10

Xv415

¡581

X axonopotñs vesicatoria ICMP4779 X euvesicatoria 1CMP172 X vesicatoria ¡CMP1643 X vesicatoria ICMP8037

X. campesíis pv. raphani

X. vesicatoria

j,

arboricola

X. gardneri

] X. perforans

X. euvesicatoria

Рис. 3 Дендрограмма сходства штаммов рода ХапИютогиа для последовательностей 48 фрагментов гена йпаК, построенная методом ближайшего связывания. Устойчивость, определенная бутстрен-анализом (500 альтернативных дендрограмм), дана в процентах над ветвями 12

3.3 Характеристика штаммов СкшЪасШ тШи^апетг* виЬрБ. писЬ'щапет'к

3.3.1 Оценка культуральных, биохимических и патогенных свойств

Для оценки свойств изучаемых штаммов С1т1Ьас1ег michiganensis виЬрБ. michiganensis из каждой точки обследования отбирали пару представительных штаммов.

Культурально-морфологическая характеристика. Четырехдневная инкубация бактерий Стт на среде УБС приводила к образованию выпуклых, ровных, круглых (2-3 мм в диаметре), непрозрачных, мукоидных колоний от бледно-желтого до ярко-желтого цвета, которые на 7 день и более выделяли слизь.

Биохимические свойства. Все тестируемые изоляты были грамположительными коринобактериями, с окислительным типом дыхания (табл. 3). Наблюдался рост колоний на селективной среде СЫБ, тогда как на среде ТТХ рост был слабый. Все изоляты утилизировали соль уксусной кислоты.

Табл. 3 Биохимические свойства штаммов Clavibacter michiganensis subps. michiganensis (Стт), выделенных из растений томата, клубней и растений картофеля, в сравнении с подвидом Clavibacter michiganensis subps. sepedonicus (Cms)

Признак Штаммы, кол-во

Стт Cms

выделенные из томата выделенные из картофеля

Группа Тест

Г* 38к 18к 1к Зк 1т* 1к 1к

Рост на среде CNS + + + + + + + +

TTC + w w w w - + +

Редуцирующие вещества Рибоза + + + + + + + +

Сорбит - - - - + - +

Утилизация Инулин - - - + - - +

Ацетат + + + + + + + +

Формиат + + + + + - - -

Гидролиз Казеин - - - - - - - -

Эскулин + + + + + + + +

Примечание: * — по литературным данным; «+» — наличие признака, «—» — отсутствие признака, «+\—» — вариабельное проявление признака, «у/л — слабый рост; «т» — типовые штаммы, «к» — коллекционные штаммы.

Различия между штаммами наблюдались в их способности окислять углеводы. Так, три выделенные из картофеля штамма слабо окисляли сорбит, а один штамм утилизировал инулин. Следует отметить, что в нашем исследовании штаммы подвида яерес1отсш (Московская обл., Белоруссия) вопреки литературным данным окисляли рибозу и слабо окисляли инулин,

тогда как по остальным свойствам различий обнаружено не было (БсЬаас! й а1, 2001).

Для выделения бактерий в чистую культуру проводили сравнение чувствительности штаммов двух подвидов рода С1т1Ъас1ег, включая выделенные из картофеля штаммы Стт, к 10 видам антибиотиков. Результаты показали, что наибольшее ингибирование роста колоний у всех изученных штаммов вызывали ампициллин, гентамицин, левомицетин, стрептомицин и эритромицин (табл. 4). Напротив, налидиксовая кислота, нистатин и полимиксин Б выраженного бактерицидного воздействия не оказывали. В целом, чувствительность подвидов бактерий по отношению к группам антибиотиков различалась слабо.

Определение патогенных свойств. Инъекция в стебель изолятов, вызывающая в естественных условиях вилт растений, приводила к гибели рассады в течение 2 дней. Прищипывание листовой пластинки (клиппинг) вызывало в местах повреждения развитие хлорозов, переходящих в некрозы. Применение метода обрезания ножницами 1/3 листовой пластинки не приводило к быстрому развитию некроза или гибели растения, позволяя наблюдать последовательное проявление симптомов болезни.

Табл. 4 Чувствительность штаммов бактерий рода С1ахпЬаШг к 10 антибиотикам

Антибиотики, содержание в диске Зона ингибирования роста в см Среднее значение показателя для всех штаммов

Стт, выделенные из картофеля Стт СтЗ

п=10 п=1 п=2

Ампициллин 10 мкг 1,69 ± 0,11 1,20 1,68 ± 0,58 1,65* ± 0,11

Гентамицин 10 мкг 0,98 ± 0,07 1,50 1,13 ± 0,68 1,04'' ± 0,10

Левомицетин 30 мкг 1,23 ± 0,08 1,25 1,10 ± 0,10 1,21е'' ± 0,07

Канамицин 30 мкг 0,66 ± 0,04 0,70 0,78 ± 0,43 0,68е ± 0,06

Налидиксовая кислота 30 мкг 0,01 ± 0,01 0,00 0,00 ± 0,00 0,0 V ± 0,01

Нистатин 80 мкг 0,02 ± 0,02 0,00 0,00 ± 0,00 0,0У ± 0,02

Полимиксин Б 300 ЕД 0,00 ± 0,00 0,00 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00

Стрептомицин 30 мкг 1,36 ± 0,07 1,60 1,35 ± 0,65 1,38е ± 0,09

Цефалексин 30 мкг 0,43 ± 0,02 0,60 0,88 ± 0,38 0,51е ± 0,07

Эритромицин 15 мкг 1,99 ± 0,12 2,6 1,3 ± 0,45 1,93" ± 0,14

Примечание: «п» - количество штаммов. В таблице приводятся среднее значение показателя и ошибка среднего. Обработку данных проводили с помощью дисперсионного анализа для каждого подвида в зависимости от вида антибиотика (Р=1,49; />=0,1), по чувствительности каждого подвида в отдельности ко всем изученным антибиотикам (Р=0,77; р=0,47) и влияния вида антибиотиков на бактерии рода С1сп>&ас1ег (Р=36,0; /гО^МО"6). с последующим попарным сравнением критерием Дункана. Разными буквами обозначены значимые различия (р<0,05).

Искусственное заражение штаммами Стт вызывало поражение растений томата, тогда как остальные растения семейства Пасленовых, растения семейств Капустных, Злаковых и Бобовых были устойчивы к данному патогену.

Выделенные из картофеля штаммы Стт вызывали после искусственного заражения томата и картофеля некроз и увядание. На некоторых растениях перца после двух недель инкубации появились слабые хлорозы. Остальные растения сем. Пасленовых, а также представители Капустных, Злаковых и Бобовых, были устойчивы. Таким образом, среди Стт встречаются штаммы способные поражать картофель, который в естественных условиях может выступать в роли резерватора патогена.

3.3.2. Молекулярно-генетическая характеристика

Изучение генетических свойств бактерий Стт проводилось на представительных штаммах, выделенных из различных зон Российской Федерации. Были идентифицированы также штаммы Стт, выделенные из картофеля.

Случайный ПЦР-анализ. Сравнение фрагментов ДНК 64 штаммов Стт посредством ДНК-фингерпринтинга методом АР-РСЯ с праймером С-152 позволило выделить четыре основные группы паттернов. Их примеры представлены на рис. 4. Две большие группы формировали изоляты с наиболее часто повторяющимися спектрами (рис. 4: 1-6 и 7-9, соответственно). Первая группа изолятов, в целом, была сходна с контрольным штаммом Стт (рис. 4: 1). Вторая группа обладала более насыщенным спектром, длина фрагментов составляла от 220 до 830 п.н. (рис. 4: 7-9). Третью группу сформировали изоляты очень схожие с изолятами 1 группы, но отличающиеся несколькими дополнительными фрагментами (рис. 4: 10-11). В четвертую группу вошли изоляты № 1628 и 1629, выделенные из образцов картофеля, они обладали самым насыщенным спектром из всех изучаемых изолятов и штаммов (рис. 4: 12 и 13).

М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 М 13 14

Рис. 4 Электрофореграмма ПЦР продуктов, амплифицированных с праймером С-152

Обозначения: М - маркер, дорожки 1-11 (штаммы, выделенные из томатов) - 1205, 1230, 1234, 1237, 1238, 1436, 1437, 1439, 1441, 1616, 1639; дорожки 12, 13 (штаммы, выделенные из картофеля) - 1628, 1629; дорожка 14 -С/га 204.

Несмотря на высокий уровень гетерогенности исследуемых штаммов Стт, все они отличались от штамма Cms 204 (рис. 4: 14), что говорит о выраженной генетической дифференциации двух подвидов Clavibacter michiganensis.

Специфический ПЦР-анализ штаммов, выделенных из растений томата и картофеля, с парой праймеров СММ5/СММ6, рекомендованных для диагностики возбудителя рака томата, показал однородную положительную реакцию с ожидаемым продуктом амплификации 614 н.п. Данный фрагмент локализован на последовательности ДНК гена pat-1, кодирующего эндонуклеазу, являющемся одним из факторов, вызывающим увядание растений (Dreier et al., 1995; Burger et al., 2005). Таким образом, было подтверждено, что подавляющее большинство исследованных штаммов, включая поражающие картофель, относились к подвиду Стт.

Поскольку у исследованных штаммов Стт была выявлена высокая гетерогенность, все они были также исследованы на принадлежность к подвиду sepedonicus со специфичной праймерной парой PSA 1/R. Положительная реакция наблюдалась лишь у штамма Cms 204.

STS-ПЦР. При ПЦР амплификации ДНК изучаемых штаммов с 14 парами праймеров, разработанных на основе AFLP фрагментов специфичных для подвида Стт (Rijlaarsdam et al. 2004), положительная реакция наблюдалась для пар, гомологичных генам рибосомного белка 50S L3 (El F/R) и пермеазы типа ABC (Dil F/R). Однородные профили для всех изолятов Стт, размером 100 н.п. и 110 н.п. были получены с праймерами Dl 1 и El.

ПЦР в реальном времени. Для подтверждения полученных ранее результатов идентификации штаммов Стт, выделенных из картофеля, был использован метод ПЦР в реальном времени с набором праймеров и зондом «Nova Primers» СММ специфичных для подвида Clavibacter michiganensis ssp. michiganensis (California seed & Plant Lab, Inc, США).

Данный ПЦР-анализ в реальном времени подтвердил полученные ранее результаты: все штаммы Стт, выделенные из картофеля, реагировали положительно с превышением трешхолда в промежутке с 21 по 27 цикл. Положительный результат показал также контрольный штамм, выделенный из томата (№ 1201). Как и ожидалось, штаммы Cms и Xanthomonas gardner i (GA2), использованные в качестве отрицательного контроля не прореагировали.

MLST/MLSA. Первоначально для проведения MLST/MLSA были использованы праймеры для амплификации фрагментов генов gyrB, гесА, гроВ и ITS 16S-23S, разработанные для изучения таксономического положения видов семейства Microbacteriaceae (Stackebrandt et al., 2007), в которое входит род Clavibacter. Из предложенного набора генов только гесА и гроВ позволяли дифференцировать штаммы Стт от остальных подвидов. Поэтому следующим этапом было создание и усовершенствование системы MLST для исследуемого фитопатогена. Основой для разработки праймеров являлось сравнение геномов подвидов Стт и Cms. Всего было разработано 13 пар праймеров. В результате оптимизации была подобрана универсальная температура отжига (58°С), а

также протокол, подходящий для всех пар праймеров. При дальнейшем тестировании были отбракованы 4 пары праймеров. Для всех штаммов Стт были успешно секвенированы фрагменты 9 генов (atp, gpt, rpoB, recA, arsB, glnA, spt, sos, ssrA). Из всего исследованного набора наиболее информативными были последовательности генов gpt и glnA (рис. 5, 6, 7), а также arsB и sos. По этим четырем генам были показаны наибольшие генетические расстояния между группами подвида Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis.

Следует отметить, что штаммы Стт, выделенные из картофеля, имели тенденцию дифференцироваться от остальных штаммов данного подвида, выделенных из томата, что свидетельствует об их генетической обособленности. Полученные биохимические и генетические данные, а также результаты заражения растений-дифференциаторов (картофеля и томата), позволяют выделить картофельную расу подвида Стт.

¡70933 Стга-Р •70440 Сппа-Р ]70441 Спго-Р |9—24 СЫН 00

¡9-21 СМИ 00 Í0-2 СНЫ ООО Í0-6 СММ ООО 1С-16 СММ 00 50-17 СММ 00 :0-27 СМИ 00 Ю-29 СММ 00 io-зэ СММ 00 ÍG04 СММ ООО ;9—6 СММ ООО 19—е смм ооо

¡180 СММ ООО {186 СММ ООО :202 СММ ООО |РН56 СММ 00 57 Ста ООО | 59 Ста ООО ! €0 Стз ООО I 74 Ста ООО ;ГН 23 Стал О j 30 Cmi ООО ¡ 39 Стп ООО |ГН36 Ста 00 ¡ 62 Cmfc 000 i 82 Cmi 000 jFH 54 Cff 0

Рис. 5 Выравненные нуклеотндные последовательностей полиморфного участка гена глутамин-синтетазы (¿>1пА). Точками обозначена идентичность нуклеотидов в последовательностях, красным цветом обозначены единичные мутации у штаммов Стту выделенных из картофеля.

3.3.3 Характеристика картофельной расы Стт

Практическое значение картофельной расы заключается в том, что она способна поражать два вида растений Пасленовых, одно из которых (картофель) может служить потенциальным резерватором фитопатогена, и, тем самым, затруднять меры защиты от бактериального рака томата.

Культурально-морфологические и биохимические свойства штаммов картофельной расы не отличались от таковых, для типового штамма Стт >1СРРВ2979Т, за исключением способности окислять сорбит.

Обнаружения. В 2004 г. на базе лаборатории бактериальных болезней ВНИИФ из картофеля впервые были выделены желтопигментированные фитопатогенные бактерии, относившиеся к виду С1сы1Ъас1ег michiganensis.

Рис. 6 Дендрограмма сходства штаммов подвидов С1аУ1Ьас(ег на основе последовательностей гена построенная методом наибольшей парсимоннн. Устойчивость, определенная бутстреп-анализом (500 альтернативных дендрограмм), дана в процентах над ветвями

СЮ4СММ 180 СММ 9-21 СММ 0-2 СММ 9-6 СММ 0-27 СММ 0-33 СММ Н54 С»

0-29 СММ 202 СММ 6 СММ 0-16 СММ 0-17 СММ

эдсмм 1520 Стш-Р

д1| 147829108(етЫАМ711867 1| СММ

• 9-24 СММ 70440 Стт-Р 70439 Стт-Р

' 70441 Стт-Р

• 62 от

• РН 28 Ств

• 82 Ст1

74 Ств Э0Ст1 57 Слп 59 Ств

0<|169155030|втЫАМв49034.1| СМ8 . РН 96 И

39 Стп ' РНЭв Стп

Штаммы подвида Стт

Штаммы подвида Стт, выделенные из картофеля

Штаммы подвидов С1ач1Ьас1ег т1сЫ%апет1$

Рис. 7 Дендрограмма сходства штаммов подвидов С1ау№ас(ег на основе последовательностей гена#//ь4, построенная методом ближнего соседа. Устойчивость, определенная бутстреп-анализом (500 альтернативных дендрограмм), дана в процентах над ветвями

18

Первые изоляты были выделены из сосудистой системы клубней (возле покоящихся почек) картофеля, собранных на территории Калининградской области. В течение 2006-2007 года аналогичные бактерии выделялись неоднократно из вегетирующих растений картофеля с симптомами увядания и краевого некроза листьев и из клубней в Московской, Калининградской и Нижегородской областях. Раннее развитие заболевания в 2006 г. на ряде участков Московской области привело к полной гибели растений к середине июля.

Симптоматика заболевания. Основное развитие заболевания происходит в период вегетации. Источник первичной инфекции — зараженные клубни картофеля, остатки зараженных растений. Проявление болезни на вновь зараженных растениях картофеля начинается с краевых хлорозов листовой пластинки, переходящих затем в некрозы, в результате чего листья засыхают и опадают. Отмечается преимущественное заражение листьев через гидатоды и механические повреждения листьев и стебля. Патоген распространяется вниз по сосудистой системе, заражает формирующиеся клубни, и на поздней стадии развития болезни наблюдается системное увядание растения и мацерация стеблей. Бактерия не вызывает значимого поражения клубней во время хранения в зимний период (в отличие от возбудителя кольцевой гнили).

Диагностика. Штаммы картофельной расы определяются согласно протоколам, разработанным для возбудителя бактериального рака томата. Специфичный ПЦР анализ с праймерами СММ5/СММ6 показал однородную реакцию изолятов с ожидаемым для Стт продуктом амплификации длиной 614 н.п., соответствующему гену патогенности (patl). Возможно использование генов gpt и glnA для разработки молекулярных маркеров специфичных для томатной и картофельной рас патогена.

3.4 Распространение возбудителей черной бактериальной пятнистости и рака томатов на территории Российской Федерации

По результатам исследования вид X. euvesicatoria был отмечен в СевероКавказском регионе, вид X. vesicatoria - в Средневолжском, Нижневоложском и Северокавказском регионах. Вид X. gardneri был выделен из образцов полученных из республики Татарстан, в то время как вид X. campestris pv. raphani поражал томат в Северо-Кавказском и Средневолжском регионах. Вид X. arboricola был выявлен в растениях из Северо-Кавказского региона (табл. 5).

Возбудитель рака томата был выделен из образцов на территории семи регионов (табл. 5). Исследование некоторых образцов томата показало их смешанное заражение возбудителями двух изучаемых бактериозов. Подобный факт был отмечен при изучении заболеваний томата в Киевской области (Сидоренко, Айзенберг, 1972) и в Белоруссии (Комарова и др., 1994).

В образцах томата наряду с возбудителями черной бактериальной пятнистости и бактериального рака присутствовали и другие фитопатогенные бактерии: Pectobacterium carotovorum, Pseudomonas syringae, Ps. corrugata, полусапротрофные виды: Ps. marginalis, Pantoea agglomerans и Bacillus pumilus.

Штаммы картофельной расы подвида Стт были выделены из образцов картофеля в трех областях, относящихся к трем регионам (табл. 5). В пораженных образцах картофеля также были выявлены сопутствующие виды: Л. таг^таИз и Рап(оеа agglomerans.

Табл. 3 Распространение возбудителей черной бактериальной пятнистости и бактериального рака

Возбудитель Регион, субъект России

X. euvesicatoria Северо-Кавказский, Северная Осетия

X. vesicatoria Средневолжский, Нижневоложском и Северокавказский; Татарстан, Северная Осетия, Краснодарский край, Астраханская область

X. gardneri Средневолжский, Татарстан

X. campestris pv. raphani Северо-Кавказский регион, Северная Осетия, Карачаево-Черкессия; Средневолжский, Татарстан

X. arborícela Северо-Кавказский, Северная Осетия

Clavibacíer michiganensis ssp. michiganensis Центральный: Московская и Ивановская области; Центрально-Черноземный: Воронежская область; Нижневолжский: Волгоградская область; Средневолжский: Ульяновская область, республики Татарстан и Мордовия; Северо-Кавказского: Ростовская область, Краснодарский край и республика Кабардино-Балкария; Северо-Западный: Тверская и Псковская области; Волго-Вятский: Кировская и Пермская области;

Совместное заражение Xanthomonas sp. + Cmm Центральный, Московская область

Северо-Западный, Псковская, Тверская области

Средневолжский, Татарстан

Clavibacíer michiganensis ssp. michiganensis картофельная paca Северо-Западный, Калининградская область

Центральный, Московская область

Волго-Вятский, Нижегородская область

выводы

1. В результате изучения фитопатогенных бактерий, поражающих томат, было выявлено 5 видов рода Xanthomonas и подвид Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis. 262 выделенных штамма патогенов были депонированы во Всероссийскую коллекцию фитопатогенных бактерий ВНИИ фитопатологии РАСХН.

2. Изученные культурально-морфологические и биохимические свойства видов бактерий родов Xanthomonas и Clavibacter, поражающих растения томата, в большинстве случаев не отличались от таковых для типовых штаммов.

3. При исследовании свойств патогенности бактерий рода Xanthomonas, выделенных из растений томата, было установлено, что данные фитопатогены поражают исключительно растения томата, тогда как остальные представители сем. Пасленовых (перец, физалис) оставались устойчивыми к данному патогену. Статистически значимые различия по агрессивности к растениям томата среди видов рода Xanthomonas выявлены не были.

4. Идентифицированные штаммы Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, выделенные из картофеля, представляют собой самостоятельную расу, которая характеризуется специфическими генетическими и биохимическими признаками, а также способностью заражать растения томата и картофеля.

5. Наибольшая чувствительность бактерий родов Xanthomonas и Clavibacter, поражающих растения томата, проявлялась по отношению к антибиотикам широкого спектра действия: левомицетину, стрептомицину, эритромицину, гентамицину. Нистатин для данных фитопатогенов не оказывал выраженного воздействия, при этом Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis был мало чувствителен к налидиксовой кислоте и полимиксину Б, а виды рода Xanthomonas к цефалексину.

6. Определение последовательностей генов dnaK и ргрС методом мультилокусного генотипирования позволяет точно идентифицировать виды рода Xanthomonas, поражающие томат.

7. Дифференцирующими последовательностями, позволяющими диагностировать подвид Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis от остальных, являются участки генов gpt, arsB, glnA, sos.

8. Дифференциация выделенных из картофеля штаммов Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis от остальных основана на анализе последовательностей генов глутамин-синтетазы (glnA) и глюкозо-1-фосфат тимидилтрансферазы (gpt).

9. В результате обследования 23 субъектов Российской Федерации виды рода Xanthomonas, поражающие растения томата, выявлены в пяти областях и краях, подвид Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis

обнаружен на территории семи регионов. Отмечено также совместное заражение обоими фитопатогенами растений томата.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПРОИЗВОДСТВУ

Виды рода Xanthomonas, поражающие томат, могут быть выделены в чистую культуру с помощью антибиотиков: ампицилина, полимиксина Б и цефазолина; Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis — с применением налидиксовой кислоты, нистатина и полимиксина Б.

Идентификация видов рода Xanthomonas при наличии референтных штаммов может быть осуществлена с помощью случайного праймера BoxS3, MLST/MLSA - секвенирование последовательностей генов dnaK и ргрС. Для диагностики подвида Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis рекомендуется использовать праймеры СММ5/6, MLST/MLSA - гены gpt, glnA, arsB, sos.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в журналах из списка ВАК РФ

1. Карлов, А.Н. Диагностика зараженности семян томата возбудителем бактериального рака методом ПЦР / А.Н. Карлов, Ф.С. Джалилов, Г.И. Карлов, К.П. Корнев, Е.В. Матвеева, А.Н. Игнатов // Известия ТСХА. -2007.-В.1.-С. 21-25.

2. Игнатов, А.Н. Новые возбудители бактериозов и прогноз их распространения в России / А.Н. Игнатов, Н.В. Лунина, Е.В. Матвеева, К.П. Корнев, Э.Ш. Пехтерева, В.А. Политыко // Защита и карантин растений. - 2009. - №. 4. - С. 38-41.

3. Корнев, К.П. Новый бактериальный патоген картофеля / К.П. Корнев, Е.В. Матвеева, Э.Ш. Пехтерева, В.А. Политыко, А.Н. Игнатов // Защита и карантин растений. - 2009. - №6. - С. 12.

4. Корнев, К.П. Черная бактериальная пятнистость томатов в России / К.П. Корнев, Е.В. Матвеева, Э.Ш. Пехтерева, В.А. Политыко, А.Н. Игнатов, Н.В. Пунина // Защита и карантин растений. - 2010. - №5. - С. 48-49.

5. Игнатов, А.Н. Xanthomonas arborícela — бактериальный патоген поражающий различные культуры в России / А.Н. Игнатов, Н.В. Пунина, Е.В. Матвеева, К.П. Корнев, Э.Ш. Пехтерева, В.А. Политыко // Защита и карантин растений. - 2010. - №4. — С. 41-43.

Публикации в других изданиях

6. Kornev, K.P. Genetic diversity of bacteria associated with diseased plants / K.P. Kornev, E.Sh. Pekhtereva, T.V. Kolganova, E.V. Matveeva, N.W. Schaad, A.N. Ignatov // Материалы Международного симпозиума стран Балтии для студентов, аспирантов и молодых ученых. — Санкт-Петербург. -2007.-С. 59.

7. Kornev, K.P. Identification of Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm) strains pathogenic for potato in Russian Federation /

К.Р. Komev, A.N. Ignatov, E.V. Matveeva, E.Sh. Pekhtereva, N.W. Schaad // Материалы 22ой Международной научной школы Балтийских стран по фитопатологии. - Финляндия. - 2008. - Р. 34.

8. Kornev, К.Р. Xanthomonas species causing bacterial spot on tomato in Russian Federation / K.P. Kornev, E.Sh. Pekhtereva, A.N. Ignatov, E.V. Matveeva, N.W. Schaad // ISHS, Acta Horticulturae. - 2009. - V. 808. - P. 247-249.

9. Kornev, K.P. Infection by Xanthomonas vesicatoria and Clavibacter michiganensis on tomato plants in Russian Federation / K.P. Kornev, E.V. Matveeva, E.Sh. Pekhtereva, N.W. Schaad // ISHS, Acta Horticulturae. - 2009. -V. 808.-P. 243-245.

10.Punina, N.V. Occurrence of Xanthomonas campestris pv. raphani on tomato plants in Russian Federation / N.V. Punina, A.N. Ignatov, K.P. Kornev, E.V. Matveeva, V.A. Polityko, N.W. Schaad // ISHS, Acta Horticulturae. - 2009. -V. 808.-P. 287-290.

П.Корнев, К.П. Бактерия Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis -патоген картофеля / К.П. Корнев, А.Н. Игнатов, Е.В. Матвеева, Э.Ш. Пехтерева, В.А. Политыко, Н.В. Шаад // 50 лет на страже продовольственной безопасности страны. Юбилейный сборник трудов ВНИИ фитопатологии РАСХН. - Большие Вяземы. - 2008. - С. 219-233. 12.Игнатов, А.Н. Основные направления развития методов диагностики фитопатогенных организмов / А.Н. Игнатов, К.П. Корнев, М.В. Мокрякова, Е.С. Мазурин, А.Н. Карлов // Доклады ТСХА. - Москва. -2009.-В. 281.-С. 22-24.

Заказ № 50-а/11/2013 Подписано в печать 14.11.2013 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:zak@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Корнев, Константин Павлович, Москва

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт

фитопатологии

На правах рукописи

04201451076

КОРНЕВ КОНСТАНТИН ПАВЛОВИЧ

РАЗНООБРАЗИЕ, РАСПРОСТРАНЕНИЕ И МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ БАКТЕРИЙ РОДОВ ХАИТНОМОИАЗ И СЬА ПВАСТЕЯ, ПОРАЖАЮЩИХ ТОМАТ

Специальности 06.01.07 - защита растений 03.02.07 - генетика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель -доктор биологических наук А.Н. Игнатов

Москва-2013

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ....................................................................................4

СПИСОК ПРИНЯТЫХ В РАБОТЕ СОКРАЩЕНИЙ И ТЕРМИНОВ............7

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...........................................................8

1.1 Черная бактериальная пятнистость томата..................................9

1.2 Бактериальный рак томата.....................................................20

Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..........................32

2.1 Сбор материала..................................................................32

2.2 Коллекция штаммов исследуемых фитопатогенов.......................33

2.3 Изучение морфологических, биохимических и физиологических свойств бактерий..........................................................................34

2.4 Определение реакции сверхчувствительности и патогенных свойств.......................................................................................40

2.5 Статистическая обработка данных..........................................42

2.6 Молекулярно-генетические методы.........................................43

2.6.1 Выделение ДНК..........................................................43

2.6.2 Молекулярно-генетический анализ бактерий рода ХапМотопая................................................................................44

2.6.3 Молекулярно-генетический анализ бактерий рода С1аугЬас1ег...................................................................................46

2.7 Разработка и подбор праймеров..............................................49

2.8 Биоинформационный анализ данных......................................49

Глава 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ...........................................50

3.1 Выделение бактерий, идентификация, составление коллекции штаммов.......................................................................................50

3.2 Характеристика бактерий родаХаШкотопаБ, выделенных из растений томата на территории России..............................................51

3.2.1 Оценка культуральных, биохимических и патогенных

свойств бактерий рода ХаЫкотопаБ......................................51

3.2.2 Молекулярно-генетическая характеристика бактерий рода ХапЖотопаз.................................................................................57

3.3 Характеристика бактерий ОауЛаМег michiganensis БиЬрБ. michiganensis, выделенных из растений томата на территории России........61

3.3.1 Оценка культуральных, биохимических и патогенных свойств.......................................................................................61

3.3.2 Молекулярно-генетическая характеристика бактерий подвида С1аугЬаМег michiganensis эиЬзр. michiganensis...............67

3.3.3 Характеристика картофельной расы Стт........................88

3.4 Распространение возбудителей черной бактериальной пятнистости и рака томата на территории Российской Федерации.......................90

РЕКОМЕНДАЦИИ ПРОИЗВОДСТВУ...............................................94

ВЫВОДЫ...................................................................................95

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................................97

ПРИЛОЖЕНИЕ..........................................................................124

ВВЕДЕНИЕ

Томат (Solanum lycopersicum L.) - широко распространенная в мире сельскохозяйственная культура. По данным ФАО, на территории России ежегодно производится более 2 млн. т. урожая томата (FAO, 2011). Значительный экономический ущерб данной культуре наносят бактериозы, в том числе черная бактериальная пятнистость и рак томата (Ахатов и др., 2013).

Возбудитель черной бактериальной пятнистости Xanthomonas vesicatoria был впервые описан в 1920 г. (Doidge, 1920, 1921) и в настоящее время выявлен более чем в 70 странах. Плоды томата при заражении этим фитопатогеном часто становятся не пригодными для употребления в пищу, а пораженность растений в открытом грунте может достигать 100%. Источниками инфекции являются семена и растительные остатки (Gardner, Kendrick, 1921; Lewis, Brown, 1961; Bashan et al., 1982). В настоящее время Xanthomonas vesicatoria разделен на четыре самостоятельных вида: X. euvesicatoria (Jones et al., 2004), X. vesicatoria (ex Doidge 1920, Vauterin et al., 1995), X. perforans (Jones et al., 2006), X. gardneri (ex Sutic 1957, Jones et al., 2006), которые отличаются друг от друга по биохимическим и молекулярно-генетическим признакам (Vauterin et al., 1991). Однако, в литературе имеются сведения о распространении на территории России лишь одного вида - X vesicatoria (Матвеева и др., 1999).

Другое не менее важное заболевание - бактериальный рак томата, возбудителем которого является Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith, 1910; Davis et al., 1984). В настоящее время этот фитопатоген распространен более чем в 54 странах. Основными источниками данного бактериоза являются зараженные семена, рассада и растительные остатки (Grogan, Kendrick 1953; Strider, 1969; Chang et al., 1989; Gitaitis et al., 1987, 1991).

На территории Российской Федерации распространение возбудителей черной бактериальной пятнистости и рака томата недостаточно изучено, а с учетом последних таксономических работ видовой состав рода Xanthomonas, поражающих томат, фактически не известен. В то же время, в отечественной литературе отсутствуют сведения о методах идентификации данных фитопатогенов для своевременного выявления и диагностики возбудителя в зонах возделывания томата и при анализе семенного материала.

Цели и задачи исследований. Цель настоящей работы - изучить видовое разнообразие, распространение на территории России и методы диагностики бактерий родов Xanthomonas и Clavibacter, поражающих томат. Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи:

1. Провести сбор материала для составления коллекции штаммов родов Xanthomonas и Clavibacter, поражающих томат.

2. Исследовать культурально-морфологические, биохимические и патогенные свойства изучаемых видов бактерий родов Xanthomonas и Clavibacter.

3. Провести молекулярно-генетический анализ штаммов исследуемых видов родов Xanthomonas и Clavibacter.

4. Усовершенствовать методы диагностики исследуемых видов бактерий.

5. Изучить распространение данных видов фитопатогенов томата на территории России.

Научная новизна исследований.

- Впервые в Российской Федерации выявлены и идентифицированы виды возбудителей черной бактериальной пятнистости томата, принадлежащих к Xanthomonas euvesicatoria, X. vesicatoria, X. gardneri, X campestris pv. raphani, X. arboricola, показано их распространение.

- Определены последовательности генов dnaK, rpoD, fyuA, ргрС и fabY для российских штаммов 5 видов фитопатогенных ксантомонад, поражающих томат, наибольшее генетическое расстояние между этими видами показано

по генам dnaK и ргрС, что указывает на возможность их использования для разработки видоспецифичных молекулярных маркеров.

- Впервые обнаружены штаммы X. arboricola, поражающие томат.

- Впервые описана и изучена патогенная для растений томата и картофеля раса бактерии Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm).

- Определены последовательности генов gyrB, recA, rpoB, tomA, atp, gpt, rpoB, recA, arsB, glnA, spt, sos, ssrA штаммов российской популяции Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis и близкородственных видов и родов бактерий, показано наибольшее генетическое расстояние между группами подвида Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis по генам gpt, arsB, glnA и sos, что указывает на возможность их использования для разработки молекулярных маркеров специфичных для томатной и картофельной рас патогена.

Практическая значимость работы.

Штаммы Xanthomonas euvesicatoria, X. vesicatoria, X. perforons, X. gardneri, X. campestris pv. raphani, X. arboricola и Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis депонированы в Государственную коллекцию фитопатогенных микроорганизмов (ГНУ ВНИИФ).

Оптимизированы молекулярно-генетические методы идентификации видов рода Xanthomonas и Clavibacter.

Получены данные о распространении исследуемых видов фитопатогенов на территории России, которые могут быть использованы для мониторинговых исследований фитосанитарного состояния.

Показана возможность заражения расой Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis не только растений томата, но и картофеля, который может являться потенциальным резерватором патогена.

СПИСОК ПРИНЯТЫХ В РАБОТЕ СОКРАЩЕНИЙ И ТЕРМИНОВ

AFLP - анализ полиморфизма длины амплификационных фрагментов

ВОХ-ПЦР - амплификация повторяющихся BOX последовательнотей

Стт - Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis

Cms - Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus

Cmt - Clavibacter michiganensis subsp. tessellarius

Cmn - Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis

Cmi - Clavibacter michiganensis subsp. insidiosum

РСЧ (HR) - реакция сверхчувствительности

ПЦР - полимеразная цепная реакция

СТАВ - цетилтриметиламмонийбромид, цетавлон

ТТХ (TTC) - 2,3,5-трифенил-тетразолиум хлорид

PSA - пептозно-сахарозная агаризованная питательная среда

SDS - додецилсульфат натрия

YDC - кальциево-декстрозно-дрожжевая агаризованная питательная среда

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Овощные культуры семейства пасленовых, возделываемые на территории России, представлены картофелем {Solanum tuberosum), томатом (Lycopersicum esculentum Mill.), перцем (Capsicum annum), баклажаном {Solanum melongena), физалисом {Physalis) и табаком {Nicotiana). Среди них томат является одной из самых востребованных сельскохозяйственных культур, уступая по площади возделывания лишь картофелю. К примеру, в России в 2009 г на территории более чем 117 тыс. га было произведедено около 2 млн тонн томата (FAO, 2011). Данный вид пасленовых представляет собой теплолюбивое растение короткого дня, произрастающее на плодородных почвах при относительно высокой влажности, поэтому в России томат в умеренной зоне выращивают в условиях защищенного грунта. Эта культура легко поражается различными видами фитопатогенов (Ахатов и др., 2013), а с учетом экономического значения томата представляется важным изучение бактериозов, существенно снижающих его урожайность.

Среди бактериозов томата в настоящее время известны следующие: черная бактериальная пятнистость, вызываемая различными видами рода Xanthomonas; бактериальный рак (возбудитель Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis et al., 1984); листовая пятнистость и вершинная гниль плодов (возбудитель Pseudomonas syringae pv. tomato)-, некроз сердцевины стебля (возбудитель Ps. corrugata Roberts and Scarlett 1981 emend. Sutra et al. 1997), крапчатость, пятнистость и мягкая гниль плодов (возбудитель Pectobacterium carotovorum (Jones 1901) Wal dee 1945 emend. Gardan et al. 2003), корневой рак томата (возбудитель Agrobacterium tumefaciens Smith and Townsend 1907, Conn 1942) (Ахатов и др., 2006). Из них высокое фитосанитарное значение имеют представители рода Xanthomonas и Clavibacter, легко распространяющиеся в окружающей среде и быстро заражающие новые растения, вызывая при этом снижение качества плодов и

гибель растений. Кроме того, негативное влияние оказывают такие факторы, как снижение генетического разнообразия возделываемых сельскохозяйственных культур и активное распространение бактерий, в том числе и через семенной материал, в результате расширения международной торговли.

В настоящее время актуальным представляется исследовать распространение возбудителей черной бактериальной пятнистости и бактериального рака томата на территории Российской Федерации, а также предложить методы диагностики для точной идентификации исследуемых фитопатогенов, что является предпосылкой для успешной борьбы с ними. Данный обзор посвящен подробной характеристике указанных выше двух родов фитопатогенов томата.

1.1 Черная бактериальная пятнистость томата

Возбудитель: Xanthomonas vesicatoria (Doidge, 1920) Vauterin et al., 1995.

Таксономическое положение

Группа: Proteobacteria Класс: Gammaproteobacteria Порядок: Xanthomonadales Семейство: Xanthomonadaceae

Синонимы: Bacterium vesicatorium (Doidge 1921), Bacterium exitiosum (Gardner, Kendrick, 1921), Pseudomonas vesicatoria, Phytomonas vesicatoria (Hayward, Waterson, 1964), Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Doidge 1920) Dye 1978.

Впервые данный вид бактерии был описан в 1920 году Е.М. Дойдж (Doidge, 1920, 1921) как Bacterium vesicatorium, а заболевание названо - рак томата. М.В. Гарднер и Дж.Б. Кендрик (Gardner, Kendrick, 1921) описали схожую болезнь в США под названием «бактериальная пятнистость», а её

возбудитель был отнесен к виду Bacterium exitiosa. Следует отметить, что Дойдж описала Bacterium vesicatorium как организм со слабыми амилолитическими свойствами, а М.В. Гарднер и Дж.Б. Кендрик охарактеризовали В. exitiosa как строго амилолитический вид. В этот же период С.Д. Щербаков (Sherbakoff, 1918) описал бактериальную пятнистость перца, позднее Б.Б. Хиггинс (Higgins, 1922) установил, что этот возбудитель является близкородственным с В. vesicatorium и В. exitiosa, но отличается по нескольким физиологическим свойствам.

Изучение физиологических и биохимических свойств этих патогенов позволили М.В. Гарднеру и Дж.Б. Кендрику (Gardner, Kendrick, 1923) сделать заключение, что они идентичны и относятся к одному виду - Bacterium vesicatorium Doidge. В 1925 г. он был переименован в Pseudomonas vesicatoria, в 1930 г. назван как Phytomonas vesicatoria и в 1939 г. возбудитель черной бактериальной пятнистости был отнесен к роду Xanthomonas (Hayward, Waterson, 1964), а позже отнесен к подвиду X. campestris pv. vesicatoria (Vauterin et al., 1995). На основании данных ДНК:ДНК-гибридизации возбудитель был разделен на 4 вида - Xanthomonas euvesicatoria, X. vesicatoria, X. perforans и X. gardneri (Jones et al., 2004). Однако, в литературе зачастую указанные виды р. Xanthomonas рассматриваются как комплекс видов под названием X. vesicatoria (син. X. campestris pv. vesicatoria).

Морфологическая, биохимическая и культуральная характеристика

Возбудитель черной бактериальной пятнистости представляет собой грамотрицательные, бесспоровые, аэробные, оксидазоотрицательные, подвижные палочки, размером 0,6-0,7 х 1,0-1,5 мкм. На питательной среде YDC патоген образует колонии с ровными краями, круглые, слизистые, блестящие, желтые (Schaad et al., 2001). Бактерии данного вида образуют

кислоту из арабинозы, глюкозы, галактозы и фруктозы (отдельные штаммы не производят кислоту). Обладают каталазоположительными свойствами, выделяют H2S из пептона и гидролизуют крахмал, но не продуцируют индол, не редуцируют нитраты, желатин разжижают медленно. Оптимальная температура для роста бактерий вида X vesicatoria варьирует 28-30°С; рН=6,8 (Матвеева и др., 1999).

Распространение

В соответствии с данными Европейской организации защиты растений (ЕРРО) патоген X. vesicatoria распространен более чем в 70 странах Старого и Нового Света, нанося существенный экономический ущерб в регионах с субтропическим климатом (PQR database, 2006; ЕРРО Bulletin, 2013).

Данная болезнь отмечена в Российской Федерации и странах СНГ на томате и перце (рис. 1.1). Заболевание в разное время было выявлено в Краснодарском (Авезджанова, 1968) и Алтайском краях (Рыбалко, 1994; Матвеева и др., 1999), Читинской, Омской, Астраханской, Волгоградской, Ростовской (Матвеева и др., 1999), Московской (Авезджанова, 1968) и Воронежской областях (Шнейдер, Паршина, 1972), республиках Северного Кавказа (Матвеева и др., 1999). Также наблюдалось развитие черного бактериоза в Казахстане (Никитина, Лапухина, 1961; Фирсов, 1980), Грузии (Цилосани и др., 1975), Белоруссии (Поликсенова, 2001; Прищепа, Певец, 2004), Молдавии и на Украине (Сидоренко, Айзенберг, 1975; Гусева, Атлуханов, 1985, 1990; Кабашная, Шабан, 1989). На настоящий момент подробные данные о распространенности и вредоносности этого заболевания в Российской Федерации отстутствуют.

Симптомы бактериоза и пути его передачи

Симптомы черной бактериальной пятнистости могут проявляться на томате в течение всего периода вегетации растений. На семядолях, листьях,

черешках, стеблях, плодоножках, плодах и околоплодниках сначала появляются мелкие водянистые просвечивающие точечные пятна, позднее чернеющие, округлой или неправильно-угловатой формы (до 1-3 мм), окруженные желтой каймой. При сильном поражении пятна сливаются, листья желтеют, сеянцы могут погибнуть (Ахатов и др., 2006). На зеленых плодах поражение имеет вид парши или выпуклых черных точек. Симптомы на ранней стадии поражения плодов могут быть схожи с симптомами рака томата, но, в отличие от последнего, чёрные точки окружены водянистой каймой. Позднее пятна увеличиваются до 6-8 мм, приобретая вид язвочек с зеленоватой зоной вместо водянистой каймы, ткань под язвами загнивает. Зрелые плоды, как правило, поражаются значительно реже. Начальные симптомы заболевания на растениях перца те же, что и на томате.

Рис. 1.1 Распространение черной бактериальной пятнистости на территории бывшего СССР по данным Всероссийского института защиты

растений (Агроатлас, 2005)

Среди факторов, оказывающих влияние на возникновение и развитие эпифитотий черной бактериальной пятнистости большое значение имеют температура и относительная влажность воздуха, количество и частота

выпадения осадков (Goode, Sasser, 1980). Наиболее интенсивно болезнь развивается при температуре воздуха 25-30°С и высокой относительной влажности воздуха (Матвеева и др., 1999). В отдельные годы пораженность растений в открытом грунте достигает 100%, плоды могут быть инфицированы до 70%, что делает их не пригодными для употребления в пишу.

Одним из основных источников инфекции являются зараженные семена, где бактерии X vesicatoria могут сохранять жизнеспособность до 10 лет (Gardner, Kendrick, 1921; Gardner, Kendrick, 1923; Lewis, Brown, 1961; Bashan et al., 1982). В растения бактерии проникают через устьица и повреждения на листьях (Dañe, Dañe, 1994; Gitaitis et al., 1992). Важным фактором распространения и сохранения инфекции являются также неубранные зараженные растительные остатки (Krupka, Crossan, 1956; Bashan et al., 1986). Клетки возбудителя на поверхности растений-хозяев, сорных растениях сем. пасленовых и их остатках могут сохранять патогенные свойства в тече�