Новые бактериоцины лактококков и их практическое использование

Стоянова, Лидия Григорьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Новые бактериоцины лактококков и их практическое использование
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Новые бактериоцины лактококков и их практическое использование"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им М В ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИМ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

СТОЯНОВА ЛИДИЯ ГРИГОРЬЕВНА

НОВЫЕ БАКТЕРИОЦИНЫ ЛАКТОКОККОВ И ИХ ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ

03 00 07 - микробиология 03 00 23— биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 2008.

003170985

Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета Московского государственного университета имени М В. Ломоносова

Научный консультант - доктор биологических наук, профессор Александр Иванович Нетрусов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Нина Борисовна Градова доктор биологических наук, профессор Лариса Петровна Блинкова доктор технических наук Нина Васильевна Нефедова

Ведущее учреждение: Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (г Саратов)

Защита диссертации состоится « 17 » июня 2008 г. в 15 ч 30 мин на

заседании диссертационного совета Д 501 001.21 при Московском государственном университете им М В Ломоносова по адресу 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, д 1, корп 12, биологический факультет, аудитория М 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им М В. Ломоносова

Автореферат разослан «16» мая 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

Н. Ф Пискункова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

Антимикробный эффект молочнокислых бактерий человечество использовало в той или иной форме в течение столетий для продления срока годности пищевых продуктов за счет образования молочной кислоты с сопутствующим понижением pH, а также биологически активных веществ, обладающих бактерицидным действием на микроорганизмы, включая и патогенные формы Ведущее место в объяснении явления антагонизма молочнокислых бактерий отводится бактериоцинам. Бактериоцины - это гетерогенные антибактериальные комплексы, разнообразные по уровню активности, спектру и механизму действия, молекулярной массе, физико-химическим свойствам, но основной биологически активной частью всех бактериоцинов является белковый компонент (Блинкова и др, 1984; 2006; Егоров и др , 1999; Nés et al, 2007) Интерес к использованию бактериоцинов резко возрос Одним из главных аспектов этого интереса является возросший спрос потребителей к качеству продуктов питания и их безопасности для здоровья, поскольку широко используемые химические консерванты и антибиотики, увеличивающие срок хранения продуктов питания, вызывают опасения Наиболее изученным и разрешенным для применения в качестве биологического консерванта (код Е234) является бактериоцин низин, единственный из антибиотиков с 1998 года имеющий "GRAS" (Generally Recognized As Safe) статус, т e признанный Европейским парламентом как безопасный Являясь низкомолекулярным белком, низин легко переваривается с пищей, не оказывая влияния на микробиоту желудочно-кишечного тракта (Ross et al, 1999, Nete et al, 2006) Описаны несколько форм низинов (А, В, С, D, Е, Z, R, Q) и родственных им лактицинов, отличающихся между собой по ряду физико-химических свойств, аминокислотному составу и спектру антибактериального действия, продуцентами которых являются разные штаммы одного подвида Lactococcus lactis subsp lactis Однако активность описанных природных продуцентов низкая (от 579 до 1886 ME/мл) и антимикробный спектр действия низина распространяется, в основном, на грамположительные бактерии (Franz et al, 1997, Buyong et al; 1998, Janes, 1999, Lee, Paik, 2001; Zendo et al, 2003, Yildmm et al, 2004, Porgtharaqkui, Demirci, 2006)

Синтез бактериоцинов - наследственная особенность микроорганизмов, проявляющаяся в том, что каждый штамм способен образовывать один или несколько определенных, строго специфичных для него антибиотических веществ. В большинстве популяций лактококков синтез бактериоцинов можно индуцировать генно-инженерными методами, физико-химическими воздействиями ультрафиолетовыми лучами, мутагенами химической природы, ДНК-тропными веществами, перекисями и другими агентами Разработка методов селекции продуцентов низина началась еще в 70-ые годы ХХ-го века, но, к сожалению, была приостановлена. Вследствие этого в настоящее время имеются немногочисленные данные по этому вопросу.

Сегодня известны два основных производителя низина Фирма "Aplin & Barrett Ltd" (Beaminster, Dorset, UK) производит продукт "Низаплин", a "Chr Hansen A/S" (Hoersholm, DK) - "Кризин". Препараты обеих компаний имеют

очень схожие характеристики, содержат 2,5% активного компонента (низин А), который переводится на антимикробную активность как 1x106 МЕ/г Получают их путем ферментации с помощью селекционного штамма Lactococcus lactis subsp lactis (Breukink, de Kruijff, 1999)

В настоящее время ученые многих лабораторий мира изучают способы направленного синтеза бактериоцинов для создания биологическим путем различных модификаций уже известных бактериоцинов, но с более ценными свойствами или же пытаются получить новые природные сбалансированные бактериоциногенные комплексы, безопасные для использования в качестве биоконсервантов Возможность конструирования новых антимикробных аналогов (бактериоцинов) в перспективе может оказаться главным методом борьбы с антибиотикоустойчивыми патогенными бактериями Особый научный интерес представляют молочнокислые стрептококки серологической группы N, которые по систематическому положению недавно выделены из группы микроорганизмов рода Streptococcus, включающего патогенные формы, и под новым названием Lactococcus отнесены к категории "GRAS". Поэтому лактококки, как и их бактериоцины, могут быть использованы в качестве природных биологических консервантов

Завышенное потребление теплоэнергоресурсов и потери продукции до 30°/о при транспортировке, переработке и хранении являются актуальными проблемами Агропромышленного комплекса РФ Экономический эффект от использования низина в консервной промышленности обусловлен сокращением продолжительности стерилизации продуктов и увеличением сроков их реализации на 15-25% снижаются теплоэнергозатраты, сохраняются биологическая и пищевая ценность продукта питания, продлеваются сроки хранения (Кудряшов и др, 1995). Создание технологии производства бактериоцинов в России позволит отказаться от закупки дорогостоящих препаратов, а использование высокоактивного продуцента определит рентабельноть производства бактериоцинов

Цель и задачи исследования

Цель исследований состояла в получении новых высокоэффективных бактериоцинов, образуемых лактококками рода Lactococcus для практического использования в качестве биологических консервантов Для выполнения поставленной цели были поставлены следующие задачи

• скрининг природных бактериоцинобразующих штаммов лактококков из естественной среды обитания лактококков коровьего и кобыльего молока, кисломолочных продуктов лечебно-профилактического назначения разных территориальных зон, идентификация перспективных штаммов;

• получение активных продуцентов бактериоцинов с использованием методов клеточной инженерии (протопластирования, слияния протопластов) и индуцированного мутагенеза;

• на основе перспективных бактериоцинобразующих штаммов оптимизировать синтез бактериоцинов;

• разработать методы выделения, очистки и идентификации новых бактериоцинов;

• показать возможность практического использования

бактериоцинобразующих лактококков и их бактериоцинов в качестве биологических консервантов Научная новизна работы.

Разработана новая методика получения протопластов у бактериоцинобразующих лактококков, подобраны стабилизирующие буферные системы для регенерации и слияния протопластов, изучено влияние протопластирования на физиолого-биохимические свойства лактококков, в том числе и на синтез бактериоцинов Установлено, что протопластирование и слияние протопластов могут служить методами селекции активных форм Получены продуценты, в 10 - 14 раз превышающие активность родительских штаммов (а с № 1687616, серебряная медаль ВДНХ).

Оптимизирован синтез бактериоцинов компонентным составом среды за счет снижения содержания фосфата, замены углеводного компонента, внесения аминокислот и рН-статирования.

Подобрана защитная среда для получения бактериального концентрата, сублимационной сушки (а с № 1156614, бронзовая медаль ВДНХ))

Разработан способ хранения яичного белка (№ 542501, серебряная медаль ВДНХ).

Разработана схема выделения и очистки новых бактериоцинов, синтезируемых перспективными штаммами L lactis subsp lactis разного происхождения Получены и изучены их индивидуальные компоненты в хроматографически чистом виде Установлено, что бактериоцины, синтезируемые гибридным штаммом F-116 и оригинальным природным штаммом 194, не имеют аналогов в компьютерной базе данных природных биологически-активных веществ BNPD ("Bioactive Natural Product Database", Berdy, Hungary) Получено положительное решение на патент (заявка № 2007148649/13 (053309) от 28 12 2007 Практическая значимость работы.

Новые природные, а также полученные методами клеточной инженерии, индуцированного мутагенеза бактериоцинобразующие штаммы L lactis subsp. lactis пополнили коллекцию - активных продуцентов низина и нового бактериоцина, обладающего уникальным для бактерий этого вида фунгицидным действием Нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК этих бактериоцинобразующих штаммов депонированы в базу данных GenBank.

Использование в качестве ферментационных субстратов для получения бактериоцинов отходов ряда биотехнологических производств представляет реальную возможность решения проблемы защиты окружающей среды при одновременном удешевлении технологического процесса

Разработана технология получения низина, синтезируемого новым штаммом L lactis. subsp. ¡actis, полученным воздействием УФЛ (ТУ 100334585-25-93).

Изучены условия диссоциации продуцентов, что облегчает отбор активных вариантов при их использовании в производстве бактериоцинов

Разработаны лабораторные регламенты на синтез бактериоцинов гибридным штаммом F-116 и природным штаммом L lactis subsp lactis 194 Показана возможность применения этих штаммов и нетоксичного препарата JITC, синтезируемого гибридным штаммом L lactis subsp lactis F-116, в качестве биологических консервантов (Акты опытно-промышленных испытаний от 16 06. 2006г и 19 09 2007г).

Ожидаемый годовой экономический эффект от внедрения штамма 194 в технологический процесс производства колбас в сравнении с препаратом Дельвоцид для Мясокомбината производительностью 100 т в год составит 30,07 млн руб

Результаты исследований вошли в учебники для студентов вузов, подготовленные в соавторстве с сотрудниками кафедры микробиологии биологического факультета МГУ им М В Ломоносова Разработаны курсы лекций и практических занятий для подготовки специалистов в Биотехнологическом центре МГУ.

Работа с 1985 года была поддержана постановлениями Совмина СССР, ГКНТ и Правительства Москвы, Международной Правительственной программой между СССР и Индией, межвузовской программой «Биотехнология в российских вузах», грантами РФФИ 98-04-49822 и 01-0448661 "Управление процессами биосинтеза биологически активных веществ микроорганизмами", ФЦАТП N 60123 01.02 по фундаментальным и поисковым исследованиям и разработкам Минпромнауки России "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники на 2002-2004 годы"; блок 2 "Проектно-прикладные исследования"

Положения, выносимые на защиту

Выделение и идентификация новых бактериоцинобразующих штаммов Lactococcus lactis из молока и кисломолочных продуктов лечебно-профилактического назначения разных территориальных зон.

Селекция активных бактериоцинобразующих штаммов с помощью метода клеточной инженерии (слияния протопластов) и индуцированного мутагенеза

Оптимизация синтеза бактериоцинов компонентным составом ферментационной среды и стабилизацией pH в процессе ферментации Использование в качестве ферментационных субстратов для получения низина отходов ряда биохимических производств.

Разработка способа выделения эффективных бактериоцинов из культуральной жидкости, их идентификация

Практическое использование перспективных бактериоцинобразующих штаммов Llactis subsp. lactis и их бактериоцинов в качестве биологических консервантов

Личный вклад соискателя.

Соискателю принадлежит определяющая роль в выборе направления исследований, постановке цели и задач для ее выполнения, разработке схем проведения экспериментов на всех этапах исследований, анализе и обобщении результатов В работах, выполненных в соавторстве, соискатель лично принимала участие в экспериментах, интерпретации полученных результатов, подготовке научных публикаций, выступала с докладами на конференциях и международных симпозиумах Апробация результатов

Результаты диссертационной работы были представлены и доложены на различных конференциях и международных конгрессах. Сделано более 40 докладов, в том числе "XVI World's Poultry Science Congress", Brasilia, 1978, VI съезде Всесоюзного микробиологического общества, Рига, 1980, Всесоюзной конференции "Создание химико-фармацевтических препаратов биотехнологическими методами", Москва, 1985, WI съезде ВМО "Достижения микробиологии - практике", Алма-Ата, 1983, конференции "МГУ-Главмикробиопрому", 1985, Всесоюзных конференциях1 "Биосинтез ферментов микроорганизмами", Кобулети, 1986, "Биосинтез вторичных метаболитов"», Пущино 1987, "Разработка и применение антибиотиков немедицинского происхождения'", Москва, 1987, "Микроорганизмы -ингибиторы и стимуляторы роста животных и растений", Ташкент, 1989, "Second Int. Symposium on overproduction of microbial products", Czechoslovakia, 1988; "The Forth and Fifth Symposium of Lactic Acid Bacteria", The Netherlands, 1993, 1996, The 2-nd Workship on Lantibiotics, The Netherlands, 1994, The Int conference "Applied biotechnology at the edge of XXI centure" Moscow, April, 1995; The Int scientific and practical conference "Food Ecology Human", Russia, Moscow Dec 1995, XIX-ом Международном симпозиуме "ICFMH-FOOD MICRO", Slovenia, 2004, Всероссийском симпозиуме с международным участием "Биотехнология микробов", М., 2004, Всероссийском симпозиуме с международным участием "Автотрофные микроорганизмы" памяти академика РАН Е Н Кондратьевой, М, 2005, 10-ой Пущинской школе - конференции молодых ученых "Генетика микроорганизмов и биотехнология", посвященная 100-летию со дня рождения С И Алиханяна, 2006, Москва-Пущино; Научно-практической конференции "Интеграция фундаментальных исследований - основа развития современных аграрно-пищевых технологий", Углич, 2007, The Int scientific and practical conference "Biotechology, Water and food stuffs", Moscow, 2008 Публикации.

По материалу диссертации опубликовано 92 печатных работ, в том числе 6 обзоров и разделы в 2-х монографиях, 34 статьи, 53 тезисов, 7 изобретений, включая 2 заявки с положительным решением на патенты.

Соискатель награждена 3 медалями ВДНХ «За достигнутые успехи в развитии народного хозяйства СССР». Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава I) и заключения по литературному обзору, экспериментальной части, которая включает материалы и методы (глава II), результаты и их обсуждения (глава III), заключения, выводов, списка литературы (430 наименований, из них 279 иностранные публикации) и 10 приложений, которые включают методику определения нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК новых штаммов лактококков, заключения о результатах определения патогенных свойств штаммов и бактериоцина JITC; акты опытно-промышленных испытаний, лабораторные регламенты на синтез бактериоцинов штаммами Lactococcus lactis subsp lactis F-116 и 194; расчет экономической эффективности от внедрения в производство штамма 194

Работа изложена на 356 страницах машинописного текста (без приложений), включает 98 таблиц и 63 рисунка; выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета МГУ им MB Ломоносова Некоторые исследования проводили в ГУ НИИНА (Государственном учреждении научно-исследовательском институте по изысканию новых антибиоиков им ГФ Гаузе РАМН), ФГУП НИИгенетика (Федеральном государственном унитарном предприятии научно-исследовательском институте генетики промышленных микроорганизмов), Государственных научных учреждениях (ГНУ) Россельхозакадемии ВНИМИ (Всероссийском научно-исследовательском институте молочной промышленности), ВНИИПБ (Всероссийском научно-исследовательском институте Пищевой биотехнологии), ВНИИ! 111 (Всероссийский научно-исследовательский институт птицеперерабатывающей промышленности), ВНИХИ (Всероссийский научно-исследовательский институт холодильной промышленности).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ. Обзор литературы (глава I) включает 5 разделов, содержащие описание характеристики лактококков (раздел 1), современное состояние вопроса по свойствам, структуре, классификации, биосинтезу и механизму действия бактериоцинов (раздел 2), селекции продуцентов бактериоцинов, включая использование естественного отбора ценных форм, искусственного отбора методом клеточной инженерии (слияние протопластов) и индуцированного мутагенеза (раздел 3), хранение продуцентов (раздел 4), применение молочнокислых бактерий и их бактериоцинов в качестве биологических консервантов (раздел 5), заключение

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Объекты и методы исследования

В работе использовали сырое коровье молоко без консервантов молочных комбинатов г Москвы, Клина (Московская область), г Улан-Удэ (Бурятии), Ирана, кобылье молоко из Башкирии и национальные кисломолочные напитки курунга из Бурятии, кумыс из Башкирии и «Doogh» из Ирана Выделение бактериоцинобразующих лактококков проводили поэтапно

Для выделения мезофильных лактококков из курунги, кумыса и «Doogh» 5% испытуемого материала высевали в жидкую среду MPC (HiMedia, India), используемую для культивирования молочнокислых бактерий и параллельно делали высев на среду Сабуро для выращивания дрожжей, содержащую (г/л)-глюкоза - 40,0, пептон - 10,0, агар -18,0, левомицетин - 0,001 (Стоянова и др , 2006).

Мезофильные лактококки выращивали на агаровых средах в течение 3-4 суток и отделяли от других молочнокислых бактерий по виду колоний на чашке Петри, реакций на каталазу и оксидазу, микроскопировании препаратов Для выделения активных низинобразующих штаммов L ¡actis subsp ¡actis с помощью стерильного репликатора проводили высев кислотообразующих колоний с поверхности агаровой среды, приготовленной на основе гидролизата молока с индикатором, на газон с тест-культурой Bacillus coagulons 429 и параллельно высевали на твердую среду вышеуказанного состава без тест-культуры Отбирали клоны, образующие наибольшую зону задержки роста тест-организма

Морфологию изучаемых штаммов и микробиоты курунги, кумыса и иранского напитка «Doogh» изучали традиционными методами с помощью микроскопа МБИ-15 с фазово-контрастным конденсором КФ-4, а также проводили их электронно-микроскопическое исследование с помощью сканирующего электронного микроскопа "Сап 8сап"фирмы "Gresham", UK (Герхард, 1984, Стоянова, Егоров, 1988)

Идентификацию бактерий проводили, руководствуясь перечнем культуральных и физиолого-биохимических признаков (Хоул и др, 1997; Степаненко, 2006) Физиолого-биохимические свойства наиболее активных по бактериоцинобразующей активности выделенных штаммов лактококков оценивали по потреблению углеводов, потребности в факторах роста, уровню их ингибиторной активности, спектру действия При изучении ферментативной активности был использован ряд углеводов, включающий сахара, сахароспирты, полисахариды Потребность выделенных штаммов в факторах роста изучали по влиянию 20-ти аминокислот, 5 витаминов, пуриновых и пиримидиновых оснований, способных включаться в метаболизм лактококков. Методом дробного исключения определяли один или группу факторов, необходимых для роста (Герхард, 1984, Стоянова, Егоров, 1999) Количество молочной кислоты определяли методом титрования, а качественную реакцию на молочную кислоту проводили по реакции "серебряного зеркала" (Стоянова, 2005)

Бактериоцинсинтезирующую активность молочнокислых бактерий определяли методом диффузии в агар с измерением зоны подавления роста тест-культур В качестве стандарта использовали коммерческий препарат низина «Nisaphn» (фирма "Aplin & Barrett Ltd", UK) с активностью 1x10б МЕ/г, левомицетин, с активностью 100 мкг/мл (ЗАО "Биофарм Право-Альфа", Россия), нистатин (ОАО "Биосинтез") с активностью ЮОООО ед /г. В качестве тест-культур использовали, для низина - В coagulans, левомицетина - Е coli, для нистатина - A niger

При изучении спектра ингибирующего действия штаммов лактококков в качестве тест-культур использовали 5 штаммов грамположительных бактерий.

Micrococcus luteus 128, Mflams 45, Bacillus mycoides 32, В subtilis ATCC 6633, В coagulans 429, Staphylococcus aureus 144, 5 штаммов грамотрицательных бактерий. Alcaligenes faecalis 82, Escherichia coh 52, Pseudomonas aeruginosa 21, Pfluorescens 19, Proteus vulgaris 206, а также пять штаммов микроскопических грибов, включая дрожжи- Aspergillus rnger 369, Pemcillium chrysogenum 32, Fusarium oxysporum 9, Candida guilliermondn 217, Rhodotorula aurantiaca 226 (Стоянова, Аркадьева, 2000) Штаммы были получены из коллекции микроорганизмов кафедры микробиологии биологического факультета МГУ им М В Ломоносова

Чувствительность к антибиотикам определяли методом диффузии в агар с использованием дисков Был испытан ряд антибиотиков, ингибирующих синтез белка и синтез клеточной стенки (Егоров, 2005)

Для подтвержения таксономического положения выделенных штаммов лактококков использовали метод генотипирования, основанный на анализе сходства нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК (Суходолец и др., 2005) Секвенирование очищенных фрагментов генов 16S рРНК проводили по методу Сэнгера (Sanger et al, 1977), используя автоматический секвенатор Beckman Coulter При построении филогенетического дерева использовали последовательности близких по физиолого-биохимическим свойствам референтных штаммов: Lactococcus lactis subsp lactis AB100798, AB118034, AJ419572, L lactis subsp lactis bv diacetylactis AY920468, AY920469, L lactis subsp cremoris AB100792, AB100802, полученные из базы данных NCBI. Секвенирование проводили в ФГУП НИИ генетика

Для проведения селекционной работы по использованию метода слияния протопластов лактококки инкубировали до ранней стадии экспоненциального роста, обеспечивающей достаточный урожай молодых активно растущих клеток Клетки отделяли центрифугированием при 1380 g в течение 20 мин, обрабатывали лизоцимом, растворенным в стабилизирующем буфере в концентрации 1-2 мг/л и выдерживали при 37°С в течение 0-60 мин В некоторых вариантах опыта для усиления действия лизицима клетки перед обработкой лизоцимом выдерживали в буфере с добавлением 0,01% 2-МЭ (меркаптоэтанол, фирма "Ferak", Германия) в течение 10-30 мин, сочетали действие лизоцима с ЭДТА (этилен-диамин-тетраацетат-натрия) и а-амилазой животного происхождения (фирма "Reanal", Венгрия), как рекомендовано рядом исследователей (Gabor, Hotchkiss, 1979; Стоянова и др, 1987,1990, Белясова и др., 2002).

Изучали влияние аминокислот, способных включаться в синтез пептидогликана клеточной стенки лактококков по типу аналога D-аланина, на рост культур и процесс протопластирования (Стоянова и др, 1987, Nouaille et al., 2004). Были использованы глицин, лизин, глутаминовая кислота и DL-треонин в концентрации от 0,1% до 1,0%, которые добавляли в ферментационную среду (Стоянова и др., 1988).

В качестве стабилизаторов использовали семь буферных систем, приготовленных на основе трис-HCl-буфера с добавлением 3 мМ MgCl2 и 0,6 М сахарозы (рН 8,0), 0,9 МКС1 и 0,02 М MgS04 (рН 7,5), 0,9 МКС1 и 0,25 М ЭДТА (рН 7,6); на основе TES-буфера с добавлением 5 мМ СаСЬ и 0,5 М сахарозы (рН 7,2), углеводные: с 0,6 М глюкозы, растворенной в трис-НС1-

буфере, с 0,8 М глюкозы в буфере на основе 0,5 М лимонно-кислого трехзамещенного натрия, 1 М аммония хлористого и 0,05 М ЭДТА (рН 6,4)

Способность протопластов регенерировать клеточную стенку изучали при параллельном высеве на гипертоническую среду соответствующих разведений суспензии протопластов в стабилизирующем буфере и воде (Стоянова, Егоров, 1988, 1990) Клетки, полученные на регенерационной среде, высевали в обрат, культивировали при обычных для L lactis subsp lactis условиях, изучали их морфологические, культуральные и физиолого-биохимические свойства Параллельно проводили высев протопластов из лизирующей смеси в обрат, изучали возможность развития протопластоподобных L-форм в среде с микродозами лизоцима

Для слияния протопластов устанавливали маркированность отобранных штаммов по ряду фенотипических признаков потребность в углеводах, ростовых компонентах и чувствительности к антибиотикам, что послужило основой для составления селективных сред при отборе полученных рекомбинантов

Жизнеспособные протопласты лактококков, отмытые от лизоцима и ресуспендированные в стабилизирующем аммонийно-цитратном буфере, смешивали перекрестно в том же буфере с добавлением ПЭГ-6000 (полиэтиленгликоль, фирма "Reanal", Венгрия) и вышеуказанных стабилизаторов, инкубировали при 37°С в течение 20-40 мин Полученные гибридные штаммы оценивали по скорости роста, ферментативной активности в отношении сбраживания углеводов, накопления бактериоцинов, спектру антимикробной активности

Для изучения плазмидного профиля родительских штаммов и гибридных, полученных в результате слияния протопластов, использовали известный электрофоретический метод с выделением плазмидной ДНК (Румер, Лившиц, 1992)

Экспериментальные исследования по использованию индуцированного мутагенеза для повышения низинсинтезирующей способности лактококков были проведены известными методами по традиционным показателям (Стоянова и др, 2007) В качестве объектов служили природный штамм L lactis subsp lactis 119, выделенный из простокваши Экспериментального завода ВНИМИ, штамм F-116, полученный в результате слияния протопластов, и их протопласты. Были использованы ультрафиолетовые лучи (УФЛ) и химические мутагены, нитрозоэтилмочевина (НЭМ) и нитрозогуанидин (НГ) При обработке химическими мутагенами отмытые от среды молодые культуры экспоненциальной фазы роста и их протопласты ресуспендировали в цитратном буфере (рН 6,4) и обрабатывали раствором НЭМ (20 мг/мл) и НГ (500 мг/мл) в том же буфере Пробы отбирали с разными экспозициями для НГ - 10, 30, 60, 90 минут , а для НЭМ - 30, 60, 90, 120, 150 минут Для каждого опыта просчитывали по 120 колоний

В экспериментах по использованию отходов биотехнологичесих производств для синтеза низина был отобран мутантный штамм 10, полученный ступенчатым воздействием УФЛ на природный штамм 119. В работе использовали следующие субстраты1 картофельный сок после

отделения крахмала и мезги (Москворецкая овощная база); пермеаты культуральных жидкостей Bacillus subtihs и Aspergillus awamori после концентрирования амилолитических ферментов а-амилазы и глюкоамилазы, послеспиртовая барда (Мичуринский спиртзавод), фугат культуральной жидкости Saccharomyces cerevisiae при производстве хлебопекарных дрожжей (Московский дрожжевой завод), обезжиренное молоко (обрат) и сыворотка Экспериментального завода ВНИМИ. К субстратам, представляющим пермеаты В subtilis и A awamori, добавляли глюкозу после стерилизации в виде стерильного 20%-го раствора В послеспиртовую барду было добавлено осахаренное спиртовое сусло, чтобы общее количество глюкозы в смеси составляло 0,5, 1; 2; 3; 4% Изучен биохимический состав вышеуказанных субстратов, как описано в статье (Кудряшов и др., 1995) В качестве контроля использовали обезжиренное молоко

При оптимизации синтеза новых бактериоцинов перспективными штаммами L lactis subsp. lactis (природным штаммом 194 и гибридным F-116) изучали влияние компонентов ферментационной среды. Эксперимент проводили по схеме методом изменения количества или исключения составных компонентов среды уменьшения содержания фосфатов в виде КН2РО4 от 2,0 до 0,5%, увеличения содержания или замена углеводного компонента, изменения содержания дрожжевого автолизата как источника аминного азота, витаминов и нуклеиновых оснований (Стоянова, Левина, 2006). В качестве факторов, влияющих на продукцию бактериоцинов, исследовали 17 источников углеводов в среде в концентрации 1%, глюкозы и сахарозы в концентрации 2% Значительное место в исследованиях занимали вопросы о потребностях лактококков в отдельных аминокислотах, добавляемых в среду культивирования в концентрации 0,01%

Влияние рН-статирования ферментационной среды на синтез бактериоцина проводили в стационарных условиях при 30°С в колбах объемом 450 мл и в ферментере фирмы LKB объемом 5 л с автоматической стабилизацией уровня рН 1N раствором NaOH на уровне 5,9 - 6,0

Изучали диссоциацию штаммов L lactis subsp lactis 194 и F-116 на агаровой среде по характеру диссоциативных изменений их морфологии, а также антибиотической активности диссоциантов к разным тест-организмам на низин, левомицетин, нистатин (В coagulans, Е coli, A mger)

Сравнивали способы хранения молочнокислых бактерий в течение длительного хранения (до 24 лет) по стабильности их производственно-важных физиолого-биохимических свойств, а именно жизнеспособности клеток, бродильной и антибиотической активностей Были использованы различные способы хранения, хранение под вазелиновым маслом, в обрате с частыми пересевами и в лиофильном состоянии. Для повышения устойчивости микроорганизмов к дегидратации при лиофилизации использовали разные криопротекторы 10% сывороточный альбумин, 30% лошадиная сыворотка, 20% раствор сахарозы, комплексные защитные среды, содержащие (в %) 10 сахарозы + 5 желатины, 1 желатины + 10 сахарозы+1 глютамата натрия + 0,5 цитрата натрия, 0,5 лактозы + 0,06 NaCl+ 0,05 (NH4)2HP04 (Стоянова, Пушкарева, 1985, Стоянова, Аркадьева, 2000)

В работе по выделению и идентификации бактериоциноподобных веществ использовали штаммы L lactis subsp. lactis разного происхождения Для выделения бактериоцинов из культуральной жидкости использовали смесь ацетон-уксусная кислота-вода в соотношении Ф1-5. Для препаративного извлечения бактериоцинов использовали в качестве экстрагентов ряд растворителей ацетон, гексан, н-бутанол, метанол и хлороформ в разных концентрациях, как описано в статье (Стоянова и др, 2007)

Для обессоливания экстракта использовали картриджи. Диапак-ЗОзН, Диапак-МПС-200, Диапак-С-16 (ЗАО «БиоХимМак, CT», Москва) Десорбцию проводили ацетонитрилом и трифторуксусной кислотой в различных концентрациях Колоночную хроматографию проводили на носителе Kieselgel 60 фирмы "Merck" (Германия). Анализ полученных фракций проводили методом ТСХ в системе метанол вода (96.4) в сочетании с биоавтографией на тест-организмы В coagulans и В subtilis Спектры снимали на спектрофотометре Shimadzu UV-160 IPC (Япония) Масс-спектры выделенных антибиотиков регистрировали на приборе VISION методом MALDI-TOF в режиме положительных ионов на матрице DHB (2,5-дигидрокси-бензойная кислота) Анализ свойств бактериоцинов проводили помощью компьютерной базы данных BNPD (Berdy, Венгрия)

Для подтверждения белковой природы синтезируемых новых антибиотических комплексов были проведены исследования по влиянию специфического ингибитора синтеза белка левомицетина (100 мкг/мл) на рост продуцентов, синтез белка и синтез бактериоцинов. Белок определяли по методу Лоури (Lowry et al, 1951)

Териостабильность бактериоцинов определяли, прогревая экстракты при 55°С в течение 90, 120, 150 мин, при 100°С в течение 5, 15 и 30 мин, затем охлаждая и тестируя на антагонистическую активность

pH-стабильность бактериоцинов определяли, инкубируя экстракты в интервале pH от 2-х до 10 в течение 4 ч с последующим разведением их в буфере (pH 7), а затем определяя бактерицидную и фунгицидную активность.

Методом лиофильной сушки наработана опытная партия бактериоцина ЛГС, синтезируемого гибридным штаммом F-116. Параметры сушки температура замораживания -40°С, температура сублимации -30°С, максимальная температура продукта 60°С. Сравнивали бактериоцин ЛГС с препаратом "Nisaplm" по уровню антибиотической активности и спектру антимикробного действия.

Токсикологические исследования новых бактериоцинобразующих штаммовL lactis subsp lactis проводили на лабораторных животных (белых мышах и морских свинках) в соответствии с методическими указаниями (МУК 4 1/4/2/588-96). Препарат ЛГС исследовали методом биологических проб и на культуре инфузорий Tetrahimena pyriformis (Игнатьев, Шаблий, 1978).

Экспериментальные исследования по апробации бактериоцина ЛГС и гибридного штамма L. lactis subsp. lactis F-116 для хранения охлажденного мяса и рыбы проводили на технологическом стенде ВНИХИ Сравнивали их эффективность с низином, лизоцимом в концентрации 0,25%, препаратом

ППС-10 (полимерный пленкообразующий состав) Образцы обрабатывали консервантами посредством распыления на поверхность, упаковывали в пленку под вакуумом и хранили в условиях бытового холодильника при 4°С Были проведены микробиологические исследования образцов рыбы через 5, 10, 15 суток хранения, а мяса в течение 85 суток с интервалом 7, 10, 20 дней в соответствии с СанПиН 2.3.2 1078-01 Изучали санитарно-бактериологическое состояние образцов на наличие патогенов, включая бактерии группы кишечной палочки (БГКП), Salmonella gallmarum, Listeria monocytogenes и микроорганизмов, способных развиваться в сырье при температуре, близкой к 4°С Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Enterococcus sp, споровые аэробные и анаэробные формы, включая Clostridium sp, Bacillus с ereus, а также дрожжи и плесени, которые определяли по ГОСТ- 7636-85, Р 51448-99, Р.51921-2002, 31339-2006 Изучали возможность использования гибридного штамма L.lactis subsp. lactis F-116 для обессахаривания яичного белка, как предварительного этапа его обработки перед высушиванием, с целью увеличения срока хранения сухого белка Использовали яичный белок куриных яиц птицефабрики ВНИИПП. Для ускорения процесса ферментации в жидкий яичный белок вносили дрожжевой автолизат в количестве 35мг% по аминному азоту По окончании процесса обессахаривания яичный белок подвергался высушиванию тепловой распылительной сушкой на полупроизводственной установке "Ниро-Атомайзер" (Дания) при температуре 55-60°С в зоне сушки Количество глюкозы определяли ферментным методом с глюкозооксидазой (Стоянова и др, 1979) Контроль качества продукта проводили по ГОСТ 30364.2-96

Проводили эксперименты по использованию культуральной жидкости штамма L. lactis subsp. lactis 194, обладающего фунгицидной активностью, для хранения образцов колбасных изделий сервелат сырокопченый «Зернистый» ТУ 9213038-510-323-26-03, колбаса сырокопченая «Свиная» ГОСТ 16131-86.

Проведена идентификация грибной плесени с поверхности зараженных колбас с использованием классических микологических методов и современных определителей1 по типу колоний, цвету, характеру роста, а также по типу конидий, плодового тела, структуре аскоспор (Raper, Fennel, 1965, Hoog et al, 2000, Klich, 2002)

Образцы колбасных изделий, обсемененные плесневым грибом, были продезинфицированы 70%-ным спиртовым раствором до полного очищения

от гриба, а затем опытные образцы были обработаны культуральной жидкостью штамма 194 с антибиотической активностью 4000 МЕ/мл, рН 4,2 Контрольные (без обработки) и опытные образцы вышеуказанных колбасных изделий были заложены на хранение при температуре 10°С на 2 месяца Статистическую обработку результатов всех исследований проводили с использованием компьютерных программ Excel 200 (Microsoft Inc, 1999), Statistica for Windows, v. 5 0 (StatSoft Inc, 1995), рассчитывая среднюю арифметическую, доверительные интервалы, стандартное отклонение Достоверность различий между средними величинами оценивали с использованием t-критерия Стьюдента (Р<0,05)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Выделение природных активных бактериоцинобразующих штаммов мезофильных лактококков и их идентификация.

Национальные кисломолочные продукты смешанного молочнокислого и спиртового брожений, распространенные среди народов Азии, Башкирии, Ирана, помимо вкусовой и питательной ценности обладают рядом свойств, обуславливающих их применение в лечебно-профилактических целях. Одним из определяющих свойств является их высокая ингибиторная активность по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам. При микроскопировании курунги из Бурятии и «Doogh» из Ирана в поле зрения видны дрожжи и молочнокислые бактерий, представленные палочками и кокками, единичными и собранными в цепочки разной длины. В кумысе, полученном из Башкирии, приготовленном на производственной кумысной закваске, лактококки не были обнаружены. Микробиота кумыса из Башкирии состояла из молочнокислых бактерий Lactobacillus delbrueckii subsp.

Рис.1. Микробиота курунги (1, 2); иранского напитка "Doogh"(3) и кумыса (4). Электронный сканирующий микроскоп (1-3, увеличение 1 х 4000); световой микроскоп (4, увеличение 1х 900).

Нами разработан метод выделения и дифференциации бактериоцинобразующих штаммов мезофильных лактококков из вышеуказанных продуктов (табл. 1), Из курунги было выделено 36 бактериоцинобразующих штаммов с активностью, рассчитанной по низину, от 450 до 2700 МЕ/мл, из них отобран штамм К-205 с активностью 2700 МЕ/мл. Из иранского продукта "Doogh" было выделено 25 штаммов мезофильных кислотообразующих молочнокислых бактерий, 4 штамма из их числа обладали высокой бактериоцинпродуцирующей активностью, отобран штамм ЖЗ с активностью 3400 МЕ/мл. Всего из молока и молочных продуктов

разных территориальных зон выделено более 500 штаммов мезофильных бактериоцинобразующих лактококков.

Первоначальная идентификация включает комплекс фенотипических признаков, основанных на изучении морфологических и физиолого-биохимических свойств лактококкков (Хоулт и др, 1997; Ленгелер и др, 2005) По морфологии и культуральным свойствам все выделенные бактерии близки к молочнокислым мезофильным бактериям рода Lactococcus На плотных агаровых средах с гидролизатом молока или синтетической с фосфатом и дрожжевым автолизатом колонии были круглые блестящие с ровными краями диаметром от 1,5 мм до 3,0 мм При глубинном инкубировании лактококки образовывали колонии лодочкообразной формы

При росте в обрате штаммы образовывали плотный молочный сгусток за 8-10 час с максимальной кислотностью pH 3,9 - 4,5, что характерно для L lactis subsp. lactis. Исключение составляли штаммы 119 из простокваши и К-205 из курунги, которые образовывали за это же время сметанообразный сгусток, по консистенции характерный для лактококка L lactis subsp cremoris. Таблица 1. Отличительные фенотипические признаки выделенных

Продукт Кол-во штаммов Перспективные штаммы МЕ/мл Основные отличительные признаки

Курунга, Бурятия 36 К-205 2500 А1а+, Ara+, Mtf, Dext+, Tcs, St/

«Воо^», Иран 25 IR3 3400 Ala, МаГ, Mtl+, Dext+, Tcs, Rif

Простокваша, г Москва 40 119 2700 Pro+, Ura+, Ara+, Maf, Dext+, Rif

Молоко коровье, г Москва 197 720 300 Ala", Ura+, Mal+, Rif ,Niss

119х 3700 Ala", Ara", Mtl", Dext', Rif

115 2500 Ala\ Suc", Maf , Dext+,Rif

Молоко коровье, г Клин 54 229 2200 Ala+, Ara', Mtl", Dext+,Rifr

Молоко коровье, Бурятия 78 194 3600 Ala+, Ara+, ХуГ, Dext+, Pnr

Молоко коровье, Иран 35 IR1 3100 Ara+, Mtl", Dext+,Kmr, Tcs

IR2 3000 Asn+, МаГ, Suc", Tcs

IR4 2900 Ala+; Mtl", Dext+, St/

Молоко кобылье, Башкирия 55 805 2500 Ala, МаГ; Mtl"; Suc+; Rif , Stí

Для дифференцирования L.lactis subsp. lactis от L lactis subsp. cremoris и от L lactis subsp. lactis bv diacetylactis учитывали характер глубинного роста на плотных средах с гидролизатом молока1 L lactis subsp. cremoris образуют темные круглые колонии на поверхности среды, а L lactis subsp. lactis bv. diacetylactis - глубинные колонии неправильной формы в виде кусочков ваты

К тому же эти подвиды редко встречаются в природных субстратах (Фостер, Нельсон, 1987)

Штаммы лактококков, выделенные из молока Московского региона, слабо или зовсе не сбраживали пентозы - ксилозу и арабинозу, а также маннит, которых всегда мало в молоке и молочнокислых продуктах (ОСТ 46 128-82; Riley et al., 2002). Но штаммы К-205 из и IR-3, выделенные из курунги и напитка "Doogh" (соответственно), являющиеся продуктами смешанного молочнокислого и спиртового брожения и вследствие этого адаптированные к спиртовому субстрату, могли сбраживать сахароспирты, в том числе и маннит, что не характерно для L lactis subsp lactis, но является дифференцирующим признаком для L lactis subsp cremons (табл 1) Таблица 2. Антимикробный спектр действия лактококков

разного происхождения.

Тест-культура Штаммы

119 119х 729 229 194 К-205 IR3 IR4 МГУ Низин, 3000 МЕ/мл

Диаметр зон ингибирования роста, мм

Bacillus mycoides 20,0 16,0 10,0 16,0 19,5 16,0 11,0 24,0 13,0 17,0

Bacillus subtilis 12,0 18,0 10,0 15,0 22,0 20,0 11,0 24,0 16,0 18,0

Bacillus coagulans 17,0 23,0 8,0 15,0 23,0 18,0 20,0 17,0 14,0 21,0

Bacillus cereus 18,5 16,0 10,0 14,0 21,0 19,0 15,0 12,0 16,0 18,0

Micrococcus luteus 21,5 20,0 13,0 20,0 22,5 16,5 21,5 19,0 19,0 25 0

Staphyloco-ccus aureus 16,0 12,0 0 16,0 20,0 17,0 17,0 16,0 12,0 15,0

Alcaligenes faecalis 0 0 9,0 10,0 12,5 12,5 15,0 12,0 0 0

Escherichia coli 0 0 11,0 0 15,0 14,0 19,0 12,0 0 0

Proteus vulgaris 0 0 9,0 0 16,5 16,0 14,0 16,0 0 0

Pseudomonas aeruginosa 0 0 0 0 16,5 15,5 12, 12,0 0 0

Fusarium oxysporum 0 0 0 0 16,5 10,0 12,0 10,0 0 0

Pénicillium chryzogenum 0 0 0 0 17,5 10,5 12,0 16,0 0 0

Aspergillus niger 0 0 0 0 21,0 10,0 14,0 15,0 0 0

Rhodotorula aurantiaca 0 0 0 0 19,5 10,0 13,0 14,0 0 0

Candida guellermondn 0 0 0 0 11,0 12,0 10,0 12,0 0 0

Отличительным признаком молочнокислых бактерий является высокая потребность в сложных питательных веществах, пуринах, пиримидинах, аминокислотах, витаминах Штамм 119 отличался весьма ограниченной

потребностью в ростовых компонентах, но пролин и урацил стимулировали его рост.

Чувствительность штаммов к антибиотикам является не только фенотипическим признаком, но и обязательным, так как при использовании культур, резистентных к лекарственным препаратам, в пищевой и медицинской практике, плазмиды, несущие гены лекарственной устойчивости, могут передаваться в макроорганизм и патогенные бактерий (Temmreman, 2003, Зигангирова и др., 2006). По результатам изучения чувствительности изучаемых штаммов к антибиотикам было выявлено, что штаммы чувствительны к антибиотикам, ингибирующим синтез белка-тетрациклину, доксициклину и левомицетину, в меньшей степени к аминогликозидным антибиотикам - канамицину, сизомицину, неомицину и стрептомицину. Все штаммы чувствительны к антибиотикам, ингибирующим синтез клеточной стенки. Чувствительность к пенициллину является видовым признаком для лактококков. Но штамм 194, выделенный из коровьего молока Бурятии, устойчив к нему, что может быть последствием применения этого препарата при лечении коров

Важным критерием отбора бактериоцинобразующих штаммов является спектр их антимикробного действия. Следует отметить, что лактококки, выделенные из молока и молочных продуктов Бурятии и Ирана, отличались от штаммов Московской области высоким уровнем антибиотической активности, обладали широким спектром антибактериального действия- эффективно подавляли рост как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий. A faecalis, Р vulgaris, Е coli, Р aemginosa, а также мицелиальных грибов A niger. Р chrysogenum, Foxysporum, R aurantiaca, С guilliermondu.

Ингибирование роста микроскопических грибов является неизвестным биологическим свойством для L.lactis subsp. lactis, и мы обнаружили это лишь у лактококков, выделенных из молока Бурятии и Ирана. Следовательно, имеет место и штаммовая специфичность лактококков по синтезу бактериоцинов Представленные данные можно рассматривать не только как пример реакции биологической системы на неблагоприятные факторы внешней среды, но и как системы взаимоотношений дрожжей и лактококков в природных экосистемах.

Таксономическое положение выделенных культур классическими микробиологическими методами идентификации бактериоцинобразующих штаммов лактококков было подтверждено генотипическим методом, основанным на анализе сходства нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК, как Lactococcus lactis subsp lactis (рис 2)

Уровень генетического родства всех изучаемых штаммов по отношению к штаммам L lactis subsp cremoris составил всего 95,4 - 96,6 %, хотя по ряду физиолого-биохимических признаков штамм 119 был близок к лактококкам этого подвида Фингерпринты всех штаммов различаются, что свидетельствует о генетических различиях между выделенными штаммами.

Таким образом, используя основной прием селекции микроорганизмов, основанный на естественном отборе активных продуцентов, были выделены новые оригинальные бактериоцинобразующие штаммы L lactis subsp lactis, проведена сравнительная оценка продуцентов и выбор наиболее

перспективных из них. Разнообразие штаммов, имеющих различное географическое происхождение и обладающих сходными функциональными возможностями, является следствием специфических условий, которые формируются в экологической среде их обитания. Полученные результаты вносят существенный вклад в представление о механизмах адаптации лактококков к стрессовым условиям среды обитания и роли этих микроорганизмов в эволюционных процессах

шт.МГУ Llacüs АВ100798

- F-116

LlactisAJ4\9S12

805

F-119

115

—_ 119х

729

Llactis ABl 18034 119

- - L diactiylactisAY920469

L&aeetylacüs AY920469

__1605

_ 229

___ K-205

-- 194

L crema ris AB100802 1 ¿.cremomAB100792

i-1

0,005

Рис.2. Родственные взаимоотношения штаммов лактококков, основанные на сходстве нуклеотидных последовательностей гена

16S рРНК.

Слияние протопластов бактериоцинобразующих лактококков Llactis subsp. ¡actis как метод селекции.

В исследованиях, проведенных в последние годы, выявлена принципиальная возможность получения суперпродуцентов биологически активных веществ, в том числе и антибиотиков, в результате метода слияния протопластов В отличие от генно-инженерных методов при слиянии протопластов вся ДНК может подвергаться рекомбинации, и в случае удачной рекомбинации можно ожидать возрастание "степени новизны" в получении новых продуктов метаболизма К основным этапам этого метода следует отнести получение протопластов, собственно слияние, культивирование продуктов слияния в селективных условиях и процесс их регенерации

Получение протопластов. Лактококки трудно перевести в форму протопластов общепринятым методом, тес помощью лизоцима Известно, что клеточная стенка низинпродуцирующих штаммов довольно толстая и в зависимости от кислотности среды культивирования составляет от 31% до 42

% от сухой массы клетки. Причем, низин присутствует в ней в виде Са-низинового комплекса, и большая часть его связана с клеточной стенкой (Hurst, 1981; Steen et al, 2003; Mamardi et al, 2005) В связи с этим нами разработана новая методика получения протопластов у бактериоцинобразующих лактококков, подобраны стабилизирующие буферные системы, среды для регенерации протопластов

Для повышения чувствительности клеточной стенки лактококков к лизоциму использовали тиоловое соединение 2-меркаптоэтанол (МЭ), сочетали действие лизоцима с ЭДТА, а-амилазой (табл 3) 2-МЭ разрушает S-S связи в поверхностном белковом слое клеточной стенки, при этом высвобождаются различные ферменты, локализованные в районе клеточной стенки, в частности, кислая фосфатаза, что облегчает таким образом доступность глюкановой матрицы для лизоцима

Таблица 3. Влияние 2-меркаптоэтанола, ЭДТА и а-амилазы на протопластирование штаммов Lactococcus lactis subsp. lactis с помощью

Штамм Система разведен Контроль 2-МЭ 2-МЭ + ЭДТА а-амилаза

72 9 Оптическая плотность, ОП 650

буфер 0,74 0,72 0,53 0,50

вода 0,73 0,60 0,28 0,21

протопласты,% 2,7 17,6 47,2 58,0

1605 буфер 0,75 0,67 0,62 0,59

вода 0,75 0,42 0,49 0,38

протопласты,% 0 14,2 21,0 35,6

119 буфер 0,78 0,66 0,63 0,48

вода 0,77 0,50 0,41 0,22

протопласты,% 1,3 23,4 40,0 54,2

штамм МГУ буфер 0,68 0,58 0,51 0,43

вода 0,68 0,46 0,30 0,20

протопласты,% 0 20,0 41,2 52,7

Внесение в раствор лизоцима в трис-НС1-буфере с 0,25 М ЭДТА способствовало протопластированию всех штаммов Сочетание лизоцима с а-амилазой усилило эффективность формирования протопластов до 52,7 - 58% (в зависимости от штамма). В данном варианте опыта происходит атака пептидоглюкана по двум связям, лизоцим, являясь ацетилмурамидазой, разрывает р (1—>4) связи в пептидогликане клеточной стенки лактококков, а-амилаза действует на а (1—> 4) связи в глюкановой матрице

Но наиболее эффективным было предварительное выращивание лактококков в среде с увеличивающимися концентрациями аминокислот (табл. 4)

Аминокислота, поступая извне и включаясь в синтез пептидогликана по типу сродства к аланину или другим мукополимерным аминокислотам, ингибирует образование связей между пептидными субъединицами и подготавливает клетку к действию литического фермента. Определены минимально ингибирующие рост концентрации глицина, глутаминовой кислоты, лизина и БЬ-треонина для протопластирования лактококков,

отличающихся по низинсинтезирующей активности. Наиболее благоприятным для протопластирования было предварительное выращивание лактококков в среде с БЬ-треонином в концентрации 0,1% для штамма МГУ и 0,2% для штаммов 119 и 1605, что способствовало получению до 98% протопластов

Таблица 4. Влияние оптимальных концентраций Ь-глицнна, Ь-глутаминовой кислоты, Ь-лизина и ОЬ-треонина в среде на протопластирование штаммов 1605 и 119 Ь. 1асй$ виЬБр. 1асй'ж.

Экспозиция, мин Контроль Глицин, 0,2% Глутаминовая к-та 0,2% Лизин, 0,6% Треонин, 0,2%

119 | 1605 119 | 1605 119 | 1605 119 | 1605 119 | 1605

Оптическая плотность, ОП«о

0 1,21 1,15 0,97 0,95 1,10 1,08 0,76 0,79 0,99 1,01

10 1,18 1,15 0,80 0,79 0,91 0,96 0,65 0,66 0,9^ 0,94

20 1Д7 1,13 0,40 0,61 0,73 0,82 0,48 0,58 0,85 0,86

30 1,12 1,07 0,26 0,45 0,65 0,78 0,40 0,55 0,64 0,78

Осмотический шок 1,03 0,99 0,12 0,27 0,21 0,13 0,28 0,39 0,005 0,07

Из 7-ми буферных систем для стабилизации протопластов наиболее эффективным для получения протопластов был стабилизирующий буфер, приготовленный на основе натрия лимоннокислого, хлористого аммония и ЭДТА (рН 6,4)

мин

Рис. 3. Изменение оптической плотности бактериальных суспензий штаммов ЬаШсосст 1ас№ эиЬхр. /асг« 729 и 1605 в лизирующей смеси с аммонийно-цитратным буфером и в дистиллированной воде (а). 1 - штамм 729; 2 -штамм 1605.

По разнице ОПб5о суспензии протопластов в аммнонийно-цитратном стабилизирующем буфере и в воде судили о степени протопластирования

Рис. 4. Электронные микрофотографии Ьааососст 1ас&лиЬвр. /асй'я штамма 119: А — интактные клетки, выращенные в биосинтетической среде; Б — интактные клетки, выращенные в той же среде с добавлением 0,2% ОЬ- треонина; В -протопласты в лизирукяцей смеси; Г - Ь- формы (увеличение 1x40000,1x15000).

Установлено, что протопластирование, регенерация и. реверсия протопластов к клеточной форме, может служить методом повышения синтеза бактериоцинов: низкоактивные штаммы 729 и 1605 увеличили синтез низина в 3 раза (рис,5). При этом популяция потеряла способность к утилизации лактозы и галактозы. У активных штаммов-продуцентов эти изменения не были столь очевидны, а незначительное повышение (5-6%) может быть следствием освобождения низина при разрушении клеточной стенки. ПЭГ способствует агрегации протопластов, их слиянию, вызывает некоторое увеличение антибиотической активности штаммов 729 и 1605 на 15-20%. Инкубирование протопластов с микродозами лизоцима выявило образование Ь- форм, у которых синтез бактериоцинов увеличился на 22 - 30% (у штаммов 1605 и 729) и на 6% у активного низинсинтезирующего штамма 119х.

Протопластирование, регенерация протопластов привели к наследственным изменениям лактококков, которые могут быть связаны с экспрессией генов, а также с проявлением действия "молчащих" генов, что обнаружилось в фенотипе культур с низкой антибиотической активностью. 1

Процесс протопластирования контролировали в фазово-контрастном микроскопе МБИ-15 и по действию осмотического шока (рис.3).

В процессе протопластирования интактные клетки превращаются в протопласты. Цепочки стрептококков разрываются, овальная форма их переходит в сферическую. В поле зрения электронного сканирующего микроскопа (рис. А) видны множественные отдельные протопласты, очевидно отсутствие клеточной стенки. Но, следует отметить, что процесс протопластирования происходит не повсеместно. Имеются клетки с неполным лизисом клеточной стенки, так называемые Ь—формы.

Рис. 5. Уровень антибиотической активности штаммов Ьааососсив 1асШ зиЬэр. /асй'х после протопластирования и регенерации. Примечания: 1 - интактные клетки; 2 - протопласты;

3 - регенерированные в среде с ПЭГ; 4 — регенерированные в среде с ПЭГ и микродозами лизоцима.

Нельзя также полностью исключить внутриштаммовое слияние протопластов и рекомбинантные явления перед регенерацией протопластов. Таким образом, протопластирование можно рассматривать как метод селекции микроорганизмов.

Цель следующего этапа работы состояла в получении новых гибридных штаммов Ь.1асй$ вчЬвр. 1асй$ с помощью метода клеточной инженерии -слияния протопластов. Для образования рекомбинантных форм в результате слияния протопластов необходимы по крайней мере три процесса: цитоплазматическое взаимодействие, взаимодействие ДНК - ДНК, реверсия к клеточной форме.

В таблице № 5 обобщены отличительные физиолого-биохимические признаки шгаммов, что послужило основой для составления селективных сред при культивировании и отборе полученных в результате слияния протопластов рекомбинантов

Таблица 5. Отличительные признаки штаммов ЬасШосст ¡асйъ виЬвр. 1асш, отобранных для слияния протопластов.

Штаммы Признаки Антибиотическая активность, МЕ/мл

729 Аэп", МаГ, ЭжГ, Ригг, №б5 300±12,5

1605 Азп+, МаГ, Бис", Ригг, 500±18,9

119 Лэп", МаГ, 5ис+, Ригг, №вг 2650±72,4

МГУ АэгГ, МаГ, 8ис+, Риг5, №бГ 1980±67,8

В результате исследований по разработке методики слияния протопластов было установлено, что реверсия к клеточной форме зависит от состава компонентов среды. При слиянии с использованием ПЭГ в сочетании с 0,6 М КС1 реверсия не произошла, а при использовании 0,6 М глюкозы или сахарозы реверсия имела место

Таблица 6. Физиолого-биохимические признаки первичных популяций

Родители Признаю! популяций Антибиотическая активность, МЕ/мл

1605x729 Ага+, МаГ , Мб*, Ригк 5150 ±76,4

119x1605 Зис+.Ма^.К^.Биг* 3220±109,0

119хМГУ Ма1+, Рив11, Риг"" 2500±44,5

1605хМГУ МаГ, Тиг, 470±19,8

Результаты показали, что при слиянии протопластов активных бактериоцинобразующих штаммов, как между собой, так и со штаммами с низкой антибиотической активностью, высокоактивные гибриды не были получены. Возможно причина состоит в недостаточной гомологии ДНК-ДНК, а также бактериоциногенности популяций штаммов, отобранных для слияния

2 бо

§ 50- П-рТ"-

5 40 -|

% 30 * ^

? 20 Г~ г -

I Р^Т^-!^

0 02 05 1 25 .1 9 25 3

Активность, МЕ/мл хЮ

! 50-,

\ « <

I зо- г--я

I О 1,1 1,6 1,9 3,1

Рис. 6. Распределение гибридных клонов по низинсинтезирующей активности после слияния протопластов ЬаШсоссиБ 1асНз $иЬвр. \actis родственных штаммов 729 и 1605 на селективных средах с:

1 - глюкозой, 2 - сахарозой, 3 - фузидиевой кислотой, 4- низином Наиболее эффективные гибриды были получены при слиянии родственных штаммов с низкой антибиотической активностью штамма 729 и его мутанта, штамма 1605 Активные клоны были получены при подращивании колоний после слияния протопластов на среде с низином. 35% имели активность в интервале 2850 - 3000 МЕ/мл, 26% - от 3850 до 5100 МЕ/мл (рис 6).

30 ^

20 -I

0 0,2 1,3 2 2,7 3,1 |

I 40

30 I • г

1 ?

20 Ы - -

10 / ' ** * *

0 ~ ■ - 1 1- 1V "

0 1 ъ 2 5 3,1 3 8-5,1

При электронно-микроскопическом исследовании препаратов слившихся протопластов штаммов 729 и 1605 зафиксированы моменты агломерации протопластов, индуцируемой ПЭГ с глюкозой (рис.7 а). На рис.7 (б) нагляден | начальный момент слияния - контакт двух сливающихся протопластов с ] образованием кратерообразного канала, через который происходит слияние ' цитоплазм. Электронные микрофотографии являются иллюстративным подтверждением состоявшегося процесса слияния протопластов у штаммов лактококков.

Рис. 7. Электронные микрофотографии слияния протопластов ЬасЮсоссиъ 1аси$ зиЬБр. 1асй$ штаммов 729 и 1605.

Увеличение 1x3000 и 1x20 000

Штаммы, полученные слиянием протопластов, обладали широким спектром антибактериального действия (табл.7). Следует отметить, что родительские штаммы гибрида имели другой спектр действия: 729 незначительно подавлял рост микрококков, но не подавлял золотистый стафилококк, а его мутант 1605, полученный обработкой УФЛ и этиленимином (Беспалова, Пятницына, 1987) приобрел антибиотическую активность по отношению к нему и избирательно подавлял рост мицелиальных грибов.

Таблица 7. Антимикробный спектр действия родительских штаммов

Lactococcus lactis subsp. lactis 729,1605 и их гибридов.

Тест-культура Штаммы

729 | 1605 | F-116 | F-118 | F-119 | F-146

Диаметр зон подавления роста, мм

Micrococcus luteus 10 12 30 23 28 23

Bacillus subtilis 10 12 22 22 22 21

Bacillus coagulans 9 10 26 20 27 22

Staphylococcus aureus 0 12 21 20 20 19

Alcaligenes faecalis 9 11 22 17 21 17

Serratia marcescens 0 9 21 18 20 17

Escherichia coli 0 11 18 15 19 14

Comomonas terrigena 0 10 18 16 18 16

Aspergilus niger 0 9 17 12 19 16

Fusarium oxysporum 0 9 14 14 15 14

Candida guallermondii 0 9 14 20 18 20

Rhodotorula aurantiaca 0 0 16 14 17 14

Свойства рекомбинантов стабильно сохранялись после рассева и выделения индивидуальных колоний. При слиянии протопластов происходит

перенос как хромосомной, так и плазмидной ДНК, в результате чего формируются не гетерокарионы, а истинные рекомбинанты.

Электрофоретический анализ плазмидных профилей гибридных штаммов Р-116 и Р-119 показал наличие у них как родительских, так и приобретенных плазмид. Родительский штамм 729 имел 5 плазмид размером 11,4; 7,7; 2,6; 2,1 и 1,8 МДа, а штамм 1605 - 2,0; 3,8; 5,0; 8,0; 35 МДа. Гибридные штаммы, полученные при слиянии протопластов, имели плазмиды 11,4; 9,5 МДа и более мелкие плазмиды в разных комбинациях, присутствующие в обоих родителях. Однако штамм Р-116 имел плазмиду 10 МДа, у штамма Р-119 отсутствовали плазмиды 7,7 и 5,0 МДа, т. е. этот штамм потерял по одной из родительских плазмид (рис.8).

739 1405 Р-11Й ?-118 р-119 119

Рис. 8. Плазмидный профиль штаммов Ыасйъ виЬвр. 1асШ.

При компьютерной обработке результатов секвенирования генов 168 рРНК гибридных штаммов Р-119 и Р-116 установлено 100%-ое сходство фрагментов генов 168 рРНК с референтным штаммом Ь.1асй$ БиЬБр. клсНя АМ19572 и их родительскими штаммами 729 и 1605 (рис,2).

Выделен новый стабильный гибридный штамм Ь. 1асйв зиЬвр. \actis Р-116 с активностью 4200 МЕ/мл, что в 12-14 раз выше активности родительских штаммов. Высокая частота возникновения вариантов, превышающих по активности исходные штаммы, делает данный метод весьма перспективным для использования в процессе поддерживающей селекции, обогащения популяции штаммов-продуцентов бактериоцинов активными вариантами.

Индуцированный мутагенез ЬаШсосст 1асШ 8иЬ8й. 1асй$. Изучение закономерностей спонтанной и индуцированной мутагенами изменчивости микроорганизмов по синтезу бактериоцинов, разработка условий, повышающих эффективность действия мутагена, имеет исключительно важное теоретическое и практическое значение. Нами было установлено, что эффективной дозой облучения УФЛ интактных клеток штамма 119 следует считать дозу 76 тыс. эрг/мм2, соотвествующей экспозиции 10 мин (табл.8).

После облучения и культивирования клеток на среде с низином наблюдали следующую сегрегацию клонов по антибиотикообразованию: 30% обладали антибиотической активностью от 1500-2000 МЕ/мл, 40% от 25003200 МЕ/мл и 15% «+ вариантов» от 3080-3800 МЕ/мл, т.е. произошло увеличение активности на 40,4% (рис.9).

Таблица 8. Выживаемость Lactococcus lactis subsp. lactis 119 в

зависимости от времени УФ-облучения

Время облучения, мин Распределение вариантов по низинсинтезирующей активности,%

Потеряли активность Ниже уровня контроля Уровень контроля «+» варианты

0 0 29,0+1,1 71,0+3,0 0

1 12,2+0,7 37,5+2,2 50,3+2,1 0

5 29,3+1,2 36,3+2,7 34,2+1,3 0

10 50,1+2,3 12,0+0,5 25,6+0,9 12,0+0,7

Примечание к-«+-вариантам» относили клоны, продуктивность которых была выше по отношению к исходной

В популяции отсутствовали клоны, чувствительные к низину Феномен бактериоциногении характеризуется важной особенностью1 синтез бактериоцина является процессом, летальным для продуцирующей его клетки В бактериальной популяции, без дополнительных искусственных воздействий, бактериоцин продуцируют только отдельные клетки, которые при этом погибают Остальные клетки являются иммунными к действию гомологичного бактериоцина и сохраняют способность к его продукции в течение бесконечного ряда поколений Высокая концентрация низина в среде замедляет рост микроорганизмов, но оказывает и селективное действие (Литвинова, Силева и др , 1976, Kim et al, 1997)

Рис 9 Сегрегация клонов штамма ¿асЮсоссия 1асш виЬвр. \actis 119 по низинобразующей активности при разных дозах УФ Л. А — спонтанная изменчивость, Б — сегрегеция клонов на среде с низином, В — сегрегеция клонов при обработке УФЛ в течение 10 мин, Г — сегрегеция клонов при двойной обработке УФЛ по 10 мин

При сравнении действия химических мутагенов НГ и НЭМ установлено, что воздействие НЭМ на протяжении всех экспозиций дает наибольшее количество "+" вариантов (рис. 10)

j 100020003000320035003700400045005000

В 1-

Рис 10 Сегрегация клонов штамма Lactococeus 1actis subsp ¡actis 119 по низинобразующей активности при обработке химическими мутагенами а - сегрегация клонов при обработке протопластов НГ-ом, б - сегрегеция клонов при обработке интактных клеток НЭМ-ой, в - сегрегеция клонов при комбинированной обработке интактных клеток УФЛ в течение 10 мин и НЭМ-ой

В результате комбинированного воздействия УФЛ и НЭМ на штамм 119 был отобран вариант № 25 с антибиотической активностью, на 60 % превышающей активность исходного штамма, что составило 4200 МЕ/мл

Стабильные высокоактивные варианты были получены в результате двухступенчатого воздействия УФЛ или комбинированного воздействия УФЛ, НГ и НЭМ на протопластированные клетки штамма 119 (варианты 10, 11 и 52) Они ускорили ферментационный процесс синтеза низина, изменили спектр сбраживаемых углеводов и устойчивость к аминогликозидным антибиотикам, ингибирующих синтез белка, а именно, сизомицину и канамицину. Из популяции штаммов, обработанных ступенчатым воздействием УФЛ, был отобран штамм 10 для исследований по разработке технологии получения низина, который в биосинтетической среде с глюкозой (Баранова и др , 1974) синтезировал низин с активностью 3850 МЕ/мл

Использование в качестве субстратов для синтеза низина отходов биотехнологических производств.

В промышленных условиях для получения низина обычно используют среды, содержащие молоко и молочные продукты, богатые аминокислотами и витаминами, применяют картофельный крахмал, кукурузную муку или другие растительные материалы, отходы ферментативного производства (Лапинска, 1974, Кудряшов и др , 1995)

Из данных, представленных в табл 9, видно, что все испытанные отходы биотехнологических предприятий могут быть использованы для производства пищевого консерванта низина, но лучшими из них являются сыворотка и пермеат культуральной жидкости А awamori.

Уровень низина на основе этого пермеата всего на 4% ниже, чем на сыворотке и достигал 72% по отношению к контролю (обезжиренному молоку) Добавление 0,5% глюкозы увеличивало накопление низина до 77,5%, что даже превысило уровень синтеза низина на основе сыворотки,

используемой фирмой "Aplin & Barrett Ltd" при производстве препарата "Nisaplin"

Использование в качестве ферментационных субстратов вышеперечисленных отходов представляет реальную возможность эффективного решения проблемы защиты окружающей среды при одновременном удешевлении технологического процесса синтеза низина Но все же наиболее перспективными для биотехнологии следует считать штаммы, синтезирующие бактериоцины, отличные от низина, обладающие широким спектром антимикробного действия

Таблица 9. Накопление низина Lactococcus ¡actis subsp. lactis штаммом 10

на отходах биотехнологических производств с добавками глюкозы.

Субстрат РВ*, мг/мл Общий азот, мг/мл Амин-ный азот, мг/мл Фосфор мг/мт Сухие в-ва, % Зольные в-ва, % Накопление низина, %

Обезжиренное молоко (обрат) 3,82 3,32 0,64 1,00 14,0 0,87 100

Сыворотка 3,28 0,60 0,46 0,75 2,42 0,51 76

Картофельный сок 0,10 1,50 1,33 0,40 2,30 0,66 63

Пер к ж А сюатоп 0,55 0,32 0,52 0,82 7,1 0,72 72

Пер к ж +0,5% глюкозы - - - - - - 77,5

Перкж+ 1,5% глюкозы - - - - - - 77,5

Пер к ж + 2,5% глюкозы - - - - - - 61

Пер к ж + 3,5% глюкозы - - - - - - 60

Фугат культуральной жидкости 5 сегешше 0,14 0,37 0,50 0,52 1,00 0,28 65

Барда послеспиртовая 1,30 1,25 0,40 0,75 5,69 0,20 65

Примечания РВ* - содержание редуцирующих веществ, Пер к ж - пермеат культуральной жидкости, "- "измерения не проводили

Оптимизация синтеза бактериоцинов перспективными штаммами Ыасйз эиЬэр. 1асШ.

Вследствие высокой потребности лактококков в биологически активных веществах для синтеза определенного бактериоцина важно выяснить, какой именно компонент ферментационной среды ответственен за рост лактококков и синтез бактериоцина Известно, что углеводы, фосфаты и азотистые соединения являются основными необходимыми компонентами для конструктивного и энергетического обмена лактококков

При изучении влияния разных углеводов на синтез бактериоцинов гибридным штаммом Б-116 и природным 194, синтезирующими бактериоцины широкого спектра антимикробного действия, было установлено, что уровень накопления бактериоцина штаммом 194 в среде с

маннозой повысился на 15%, с галактозой, фруктозой - на 10%, а с сахарозой - на 24% по сравнению со средой, содержащей глюкозу (рис. 11).

углеводы

Оарабиноза нксилоза привоза а галактоза а глюкоза

н сахароза Б раффиноза в мальтоза ®рамноза оманноза

а лактоза сзфрушза пдельцит Вманнитол Иинозитол

шсорбитол а декстрин в крахмал

Рис.11. Влияние углеводов на синтез бактериоцинов штаммами Lactococcus ¡actis subsp. ¡actis 194 (1) и F-116 (2).

Источники азота оказывают важное влияние на образование антибиотических веществ микроорганизмами. Обычно в средах для культивирования лактококков источником азота служат белки и продукты их гидролиза - пептоны, гидролизаты, отдельные аминокислоты (Stuart et al., 1999; Koning et al, 2000). В наших экспериментах при исключении из среды дрожжевого автолизата как источника аминного азота и факторов роста рост культуры и синтез бактериоцина приостанавливался.

Аминокислоты непосредственно участвуют в синтезе структурных белков, различных полипептидов, ферментов, бактериоцинов. Например, треонин, серин, цистеин, лизин и аспарагиновая кислота являются предшественниками лантионина и ß-метиллантионина, входят в состав молекулы низина (Hurst, 1981; Jensen, Hammer, 1993). Нами установлено, что из группы ароматических аминокислот (триптофан, фенилаланин, тирозин) ни одна не индуцировала синтез. При внесении в среду культивирования штамма F-116 изолейцина мы повысили уровень антибиотической активности на 27,5% (табл. 10).

Для штамма 194 наиболее благоприятной была аспарагиновая кислота, при добавлении которой антибиотическая активность культуральной жидкости увеличилась на 16,6%, а внесениев среду лизина и треонина - на 11%, валина, глутаминовой кислоты, серина - на 6% при почти одинаковом накоплении биомассы. Очевидно, что влияние аминокислот на синтез бактериоцинов у исследуемых штаммов неодинаково, штаммы синтезируют разные антибиотические вещества.

Таблица 10. Влияние аминокислот на рост ЬайососсиБ 1асНэ зиЬвр. /асй*5 штаммов Г-116 и 194 и синтез бактериоцнна в ферментационной среде.

Оптическая Антибиотическая (Эпическая Антибиотичес-кая

Амино- плотность, наивность, плотность активность, МЕ/мл

кислоты ОП540 МЕ/мл ОПмо

Штамм F-116 Штамм 194

Алании 0,98 2700 1,10 3150

Аргинин 1,02 3700 1,12 2900

Апарагин 1,11 2600 1,15 3150

Аспарагиновая 1,10 2350 1,21 4200

кислота

Валин 1,10 4600 1,15 3800

Гистидин 0,93 2500 0,91 2200

Глицин 1,05 2600 0,85 2450

Глутамин 1,02 4300 1,00 2900

Глутаминовая 1,10 4500 1,35 3800

кислота

Изолейцин 1,10 5250 1,20 2200

Лейцин 1,10 3200 0,65 1000

Цистеин 0,82 3600 1,20 3350

Лизин 1,20 2900 1,25 4000

Метионин 1,20 1200 1,25 2900

Пролин 0,87 3400 0,82 2600

Серин 1,10 4200 1,25 3800

Тирозин 0,83 1890 0,86 2450

Треонин 1,00 3200 1,15 4000

Триптофан 0,90 1600 0,78 1800

Фенилаланин 0,80 1800 1,00 3150

Контроль 1,06 4200 1,10 3600

При синтезе большинства веществ микроорганизмы нуждаются в неорганических фосфорсодержащих соединениях в виде фосфат-ионов Они необходимы для роста микроорганизмов, синтеза многих жизненно важных соединений Следует отметить, что избыток фосфатов обычно благоприятно влияет на рост биомассы, способствует ассимиляции углеводов, если фосфат выступает как аллостерический регулятор некоторых ферментативных реакций (Novak et al, 1997, Andersen et al, 2001) Однако во время синтеза некоторых антибиотиков, отдельные этапы которого подвержены отрицательному влиянию фосфатов, накопление бактериоцина начинается с момента, когда содержание фосфата в среде снижается (Yother et al, 2002) Изменяя содержание калия фосфорнокислого от 2,0% до 0,5%, мы наблюдали изменение динамики роста штаммов 194 и F-116, а также и уровня антибиотической активности культуральной жидкости (табл. 11). При уменьшении количества фосфата в среде от 2% до 0,5% рост культур и синтез бактериоцина снижался.

Существует корреляция между концентрацией фосфора в среде и использованием углеводов из среды культивирования (Безбородов, 1991, De Vuyst, 1994, Chan et al, 2002) Изучение динамики роста и развития лактококков на средах, содержащих 1,0 - 0,5% КН2РО4 в сочетании с удвоенным содержанием сахарозы или глюкозы, показало, что за 9 часов

инкубирования в среде с 2% глюкозы уровень активности увеличился на 13,8%, при замене глюкозы на сахарозу уровень антибиотической активности увеличился на 24,6%

Таблица 11. Влияние различных концентраций фосфата в ферментационной среде с дрожжевым автолизатом и без него на рост ЫааЫ $иЬзр. 1асй5 штамма 194 и синтез бактериоцина.

Состав среды Биомасса, ОП540 рн Активность, МЕ/мл

Контроль (1,0% глюкоза + дрожжевой автолизат + 2,0% КН2Р04) 1,45 4,2 3600±18,5

с 1,0% КН2Р04 1,05 4,0 3150±14,3

с 0,5% КН2Р04 0,80 3,9 3000±12,0

без КН2Р04 0,32 5,7 800±б,5

без дрожжевого автолизата 0,18 6,6 0

Дисахарид сахароза - наиболее благоприятный углевод для синтеза бактериоцинов, синтезируемых данными лактококками Внесение в ферментационную среду с уменьшенным содержанием КН2РО4 (1%) 70 мг% дрожжевого автолизата, 2% сахарозы и 0,01% изолейцина способствовало повышению уровня бакгериоцинпродуцирующей активности штамма Ь \actis эиЬзр \achs Б-116 на 60%

Оптимальной средой для штамма 194 была среда, содержащая 0,5 % КНгРО^ 2% сахарозы и 0,01% аспарагиновой кислоты, что способствовало повышению синтеза бактериоцина на 59%

рН-статирование ферментационного процесса на уровне 6,0 также способствовало увеличению синтеза бактериоцинов лактококками В итоге синтез бактериоцина штаммом Б-116 был увеличен в 1,9 раза, а штаммом 194 в 1,8 раза (8200 и 6400 МЕ/мл) соотвественно (табл 12)

Таблица 12. Влияние рН-статирования ферментационной среды на рост культуры и синтез бактериоцинов природным штаммом Ьа&ососсиь ¡ас^

Время, час Показатели

рН ОП54о Активность, МЕ/мл

шт 194 Б -116 шт 194 Р -116

0 6,8 0,28 0,20 0 0

3 5,9 0,40 0,32 1700 2050

4 5,6 0,52 0,60 2400 2900

5 6,0 0,80 1,05 3200 4100

6 6,0 1,30 1,34 4200 5840

7 5,9 1,50 1,58 4800 6500

8 5,9 1,60 1,60 5800 7600

9 6,0 1,60 1,66 6150 8200

10 6,0 1,60 1,70 6400 8200

Диссоциация лактококков - продуцентов бактериоцинов.

Результаты изучения спонтанной изменчивости перспективных бактериоцинобразующих штаммов ¿./ас/и БиЬвр 1асШ на агаровых средах показали, что культуры не однородны Было установлено, что природный штамм 194, отобранный по признаку высокого уровня и широкого спектра

антимикробного действия, на оптимизированной среде диссоциировал на О (мелкие, прозрачные колонии) и Б (крупные, белые колонии) Диссоциация штаммов Ь 1асШ БиЬвр 1асШ на в- и Б-варианты имела место при множественных пассажах Причем, вариант в доминировал, составляя около 88% от общего числа анализированных колоний. Клоны, образующие колонии в-фенотипа, обладали более высокой антибиотической активностью. У 0-диссоциантов штамма 194 активность по низину составила 4500 МЕ/мл, по левомицетину - 1630 ед/мл, а фунгицидная активность, рассчитанная по нистатину, - 2200 ед/мл, что на 35,4, 21,8 и 48,5% (соответственно) выше по сравнению с активностью 8-вариантов Возможно, что меньший размер и плотность колоний более активных вариантов отражает способность данной клеточной популяции эффективнее осуществлять функцию продукции химических веществ с антимикробным действием, что влияет и на рост самой бактериальной популяции

Гибридный штамм Р-116 на разных средах диссоциировал по-разному На обедненных средах разброс диссоциантов был большим, чем при инкубировании штамма на полноценных средах. Количественный состав компонентов обедненной среды приближен к составу обезжиренного коровьего молока по содержанию лактозы и пептону казеина Полученные данные по диссоциации продуцентов позволят проводить его селекцию по целевому признаку

Оптимизация способа хранения молочнокислых бактерий. Важной проблемой, решение которой необходимо для обеспечения эффективности биотехнологических производств, является разработка способов длительного хранения культур-продуцентов, обеспечивающих стабильность их жизнеспособности, таксономических показателей и уровня их физиолого-биохимической активности

Таблица 13. Влияние состава защитной среды на выживаемость ЬасЮсосст ¡асИя зиЬэр./яс/« гибридного штамма Г-116 в процессе лнофилизации.__

Состав защитной среды, Количество лактококков/ мл

До лнофилизации После лнофилизации

Сахароза, 20% 1,69*10'" 7,9x10"

Сахароза, 10% + желатина, 5% 1,52x10'" 1,06x10'"

Сахароза, 10 % +желатина, 1 % + глутамат натрия, 1% + цитрат натрия, 0,5% 1,46x1010 1,30x10'°

Лошадиная сыворотка, 30% 1,81x10ю 8,6x10"

Сывороточный альбумин, 10% 1,76x10'" 6,9хЮу

Обезжиренное молоко (обрат) 1,7x10"' 8,2x10"

В зависимости от состава защитной среды выживаемость штамма Б-Пб варьировала от 30% до 90% (табл. 13) В лиофилизированной культуре антибиотическая активность сохранялась на уровне исходной при использовании защитной среды на основе сахарозы, желатины с добавлением глутамата и цитрата Наблюдалась некоторая тенденция к снижению антибиотической активности у лиофилизированных культур, что, возможно, связано с повреждением нуклеиновых кислот, внутриклеточных белков,

пептидов в процессе лиофилизации (Демина, Лысенко, 1989), либо с накоплением в популяции неактивных диссоциантов (Милько и др., 2007), которая может иметь место при анабиозе культур Однако после второго, третьего пассажей культур в обрате физиолого-биохимическая активность изучаемых штаммов полностью восстановлена. Результаты исследований свидетельствовали, что лиофилизация обеспечивала длительную жизнестойкость культур молочнокислых бактерий (до 24 лет).

Оптимальной защитной средой для лиофилизации симбиотической кумысной закваски, состоящей из молочнокислых бактерий и дрожжей, была лактозо-солевая среда, содержащая (в %) 0,5 лактозы + 0,06 NaCl+ 0,05 (NH4)2HP04 Для полного восстановления физиолого-биохимических свойств лиофильно высушенных культур требовалось подращивание их в обрате как элективной среде их обитания

Выделение, очистка и идентификация бактериоцинов.

Сравнительное изучение бактериоцинов, образуемых штаммами L lactis subsp lactis разного происхождения показало, что бактериоцины, синтезируемые штаммами 119х и штаммом МГУ, по физико-химическим свойствам не отличались от низина А обладали основными свойствами, мигрировали к катоду, являлись катионными полипептидами (рис 12)

Рис.12. Тонкослойная хроматография бактериоцинподобных комплексов, продуцируемых гибридным штаммом ЬаШсосст 1ас№ $иЬ$р. /ас?& Г-116, его родителями в сравнении с низином и низинобразующими штаммами МГУ и 119х. Система Ме0Н-Н20 (96:4). Биоавтография на пластинках "БйиГоГ

Из культуральной жидкости гибридного штамма X \actis виЬБр. \actis Б-116 и природного штамма 194 были выделены антибиотические комплексы, представляющие собой сложную смесь биологически активных компонентов Разработана схема выделения и очистки новых бактериоцинов, синтезируемых лактококками, которая представлена в диссертации и статье (Стоянова и др., 2007)

Физико-химические и биологические свойства компонентов антибиотического комплекса, синтезируемого гибридным штаммом Б-116, представлены в таблице 14.

Таблица 14. Физико-химические и биологические свойства компонентов

Свойства Компоненты

ЛГС-В ЛГС-Н1' ЛГС-Н' НизинА

Мол масса, (М+Н)+, m/z, (MALDI-MS) 506,9 3161,6 3353 3353"

UV-VIS спектр, Хщах, нм, (растворитель) 260 (С2Н5ОН) 215 (Н20) 215 (Н20) 215 (Н20)

ТСХ (Si02), Rf в системе Ме0Н-Н20 (96 4) 0,75 0 0 0

Электрофорез на бумаге" в электролите 1) Е], рН=2,4, 550 В, 2 ч, см 0 11 9,5 9,5

2) Е2, рН=1,1,250 В, 3 ч, см 0 4,3 3,3 3,3

Спектр антимиробного действия гр+ и гр- бактерии, грибы гр+ бактерии, включая термостойкую В coagulans

Примечания - получены из фракции ЛГС-Н методом препаративного электрофореза на бумаге в электролите Ei, 550 В, 2,5 ч, проявление реактивом Паули и биоавтографией, - представлено расстояние, пройденное веществом от стартовой линии к катоду в см «0 см» (на линии старта) - электронейтральное вещество, «3,3-11 см» (миграция к катоду) -вещество основного характера.

Анализ свойств этого комплекса с помощью физико-химических анализов и компьютерной базы данных BNPD позволяют сделать следующие выводы

1. Фракции относятся к различным классам органических соединений

2. Основным компонентом бактериоцина ЛГС является электрофоретически неподвижная фракция JITC-H, распадающаяся в кислой среде на две субъединицы с молекулярными массами 3353 и 3161,6 Да По химической структуре и антибиотическому действию фракция JITC-H идентичена полипептидному антибиотику низину А, основному компоненту коммерческого препарата "Nisaplin"; не содержит ароматических группировок (идентичны ИК-, УФЛ-спектры, отсутствие реакции Паули)

3 Компоненты ЛГС-В и ЛГС-С в литературе не описаны и, по нашим данным, являются новыми природными биологически активными веществами На основании проведенных физико-химических исследований компонент ЛГС-В (Rf = 0,83) отнесен к группе алкилароматических кетонов, содержащих также гидроксильные группы, является низкомолекулярным гидрофобным соединением (М = 506 Да) и обладает широким спектром антимикробного и фунгицидного действия Компонент ЛГС-С низкоактивен

Бактериоцинподобный комплекс, продуцируемый природным штаммом Llactis subsp lactis 194, является трехкомпонентным. Основной фракцией этого комплекса является гидрофобная фракция 194-В с молекулярной массой 1995 Да. Она содержит нуклеотидно-пептидные связи, близкая по Rf и биологическому действию к низину (табл.15)

Фракция А - это низкомолекулярное алифатическое соединение, содержащее кетонную группу, двойные связи, обладающее широким спектром антимикробного действия, является новым не описанным в

литературе природным соединением с молекулярной массой 607,5 Да. Фракция Б - электронейтральное в кислой среде алифатическое соединение с двойными связями, обладало незначительной антибиотической активностью в отношении грамположительных бактерий

Таблица 15. Физико-химические и биологические свойства компонентов антибиотического комплекса, образуемого штаммом ЬаШсоссю 1асй$ виЬ$р. 1асЖ 194 в сравнении низином.

Свойства Компоненты

194-А 194-Б 194-В Низин А

Мол масса, (М+Н)+, m/z, (MALDI-MS) 607,5 619,6 1995 3353

UV-VIS спектр, /.„ах, нм, (растворитель) 206,8 (С2Н5ОН) 224,8 (С2Н5ОН) 257,0 (С2Н5ОН) 215,0 №0)

ТСХ (S1O2), Rf в системе Ме0Н-Н20 (96 4) 0,6 0,42 0 0

Электрофорез на бумаге в электролите рН=2,4, 550 В, 2ч, см 0 0 7,6 9,5

Спектр антимиробного действия грам+ и грам-бактерии, грибы грам+ бактерии грам+ бактерии грам+ бактерии

Низкомолекулярные гидрофобные компоненты новых бактериоцинов отнесенные к группе алкилароматических кетонов, содержат реакционноспособные ненасыщенные двойные связи и кетонные группы, что и определяет широкий спектр антимикробного, в том числе и фунгицидного, действия Перечень антибиотиков фунгицидного действия невелик, по структуре - это не полипетиды, а сложные гетероциклические соединения Согласно мнению ряда ученых (АЬее, 1994; Gonzalez, 1996, Vadyvaloo, 2004) быстрое проявление антимикробного эффекта бактериоцинов может свидетельствовать о мембранной направленности действия ингибирующих веществ лактококков, характерной для большинства известных лантибиотиков

Для выяснения природы синтезируемых бактериоцинов были проведены исследования по влиянию специфического ингибитора синтеза белка левомицетина (хлоромфеникола), который препятствует переносу на рибосомы комплекса аминоацил-тРНК (Егоров, 2004), на синтез бактериоцинов перспективными штаммами лактококков При замедлении роста изучаемых штаммов на 50-60 % к концу логарифмической фазы в среде с левомицетином, синтез белка снизился на 70 %, а антибиотическая активность культуральной жидкости уменьшилась на 80% - 90% (рис 13)

6000

5000

»•n-fl-e-в !

Рис. 13. Влияние левомицетина на рост Lactococcus ¡actis subsp. Iactis штаммов 194 и F-116 (А), синтез белка (Б), синтез

6 1000

4000

3000

2000

10 1 5 20 25 I время, час

бактериоцннов (В).

В.

Эти данные дают основание считать, что биосинтез изучаемых бактериоциноподобных комплексов происходит с участием рибосом, и эти комплексы являются низкомолекулярными белками.

Новые бактериоцины термостабильны сохраняют стабильность уровня антибиотической активности при кипячении в течение 30 мин при рН 4,2

Полученные результаты исследований позволяют предположить, что синтезируемые новыми штаммами Ь 1асШ зиЬБр ¡асйв вещества, обладающие бактерицидным и фунгицидным действием, являются новыми уникальными бактериоциноподобными комплексами, ранее не описанными в литературе и не зарегистрированными в банке данных биологически активных веществ

Но следует отметить, что экстракция и очистка бактериоцинов до индивидуальных веществ является дорогостоящей и при использовании препаратов в пищевой промышленности не используется Например, при промышленном получении препаратов "Ы^арЬп" и "Кризин" используют этап распылительной сушки культуральной жидкости Ь 1асШ виЬэр /ас^гд' с последующей стандартизацией сухого препарата солью №С1 до концентрации 1х106МЕ/г.

Антимикробная активность лиофильно высушенного бактериоцина ЛГС, синтезируемого гибиридным штаммом Б-116, составила 1,2x10б МЕ/г в пересчете на активность по препарату «№зар1ш», содержащему 2,5 % чистого низина А.

Бактериоцин ЛГС по активности и спектру антимикробного действия превосходит коммерческий препарат низаплин (табл 16)

BNPD.

Таблица 16. Иигибиториое действие препарата ЛГС иа разные микроорганизмы в сравнении с низаплинам.

Микроорганизмы Концентрация, мг/мл

препарат ЛГС низаплин

5 1 10 1 20 1 40 5 1 10 1 20 1 40

Диаметр зон ингибирования, мм

Bacillus coagulons 10,0 14,0 16,4 19,0 0 10,0 13,0 16,0

Micrococcus flavus 11,0 14,3 20,0 20,0 0 9,0 12,0 14,0

Staphylococcus aureus 10,0 14,0 15,0 20,5 0 10,5 12,0 15,0

Listeria monocytogenes 12,0 16,0 20,0 19,5 0 10,0 12,0 14,0

Salmonella gallinarum 10,5 12,0 14,0 16,5 0 0 0 0

Alcaligenes faciens 9,0 10,0 12,0 14,0 0 0 0 0

Comamonas acidovorans 10,0 12,0 13,0 15,0 0 0 0 0

Escherichia coll 10,0 11,0 12,5 12,5 0 0 0 0

Proteus vulgaris 9,0 10,0 11,5 14,0 0 0 0 0

Serratia marcescens 10,0 11,0 14,0 18,0 0 0 0 0

Pseudomonas aeruginosa 9,0 11,0 12,5 13,0 0 0 0 0

Aspergilus niger 10,0 12,0 15,0 17,0 0 0 0 0

Fusarium oxysporum 9,0 10,0 12,0 14,0 0 0 0 0

Candida guallermondu 10,0 12,0 14,0 17,0 0 0 0 0

Rhodotorula aurantiaca 10,0 13,0 15,0 16,0 0 0 0 0

Установлена эффективность нового бактериоцина ЛГС как биологического консерванта на микробиоту, способную развиваться в продуктах при их длительном хранении в условиях повышенной влажности, и приводящей к микробиальной порче Результаты наших исследований показали, что бактериоцин ЛГС эффективен против патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, включая Ecoli, Sgalhnarum, Р vulgaris, S marsescen, Pfluorescens, S aureus, L monocytogenes, плесени и дрожжи

Токсикологические исследования бактериоцина ЛГС, новых природных штаммов и полученных в результате слияния протопластов и индуцированного мутагенеза, свидетельствовали о их непатогенности (Заключения имеются в приложениях к диссертации)

Практическое использование бактериоцинобразующего штамма L. lactis subsp. lactis F-116 и его бактериоцина ЛГС в качестве биологических

консервантов.

Применение нового бактериоцина ЛГС в сравнении с коммерческим препаратом низина, лизоцимом в концентрации 2,5 мг/мл, препаратом ППС-10 (пленкопокрывающий состав на основе триглицеридов) в сочетании с молочной кислотой увеличило срок хранения охлажденной рыбы от 5-ти до 15 суток , а мяса (говядины) до 45 суток (СанПиН 23 2 1078-01)

Результаты исследований по использованию бактериоцина ЛГС показали, что за 15 дней хранения рыбы уровень бактериальной обсемененности образцов, обработанных данным бактериоцином, значительно ниже 2,6x105

КОЕ/г от 2,1хЮ10( в контроле), а мяса за 45 суток хранения: 1,8х105 КОЕ/г от 3,6х10б(в контроле) Новый бактериоцин является наиболее эффективным по сравнению с низаплином, лизоцимом и консервантом ППС-10 (табл 17, 18). Таблица 17. Изменение общей бактериальной обсемененности образцов

Образец+ консервант Общая обсемененность, КОЕ/г

Длительность хранения, дни

0 5 10 15

Контроль 9,8x105 6,5x106 7,2x108 2,1хЮ10

Лизоцим 2,5 мг/мл 8,45x105 2,9x106 2,8х108 4,8x108

Низаплин 2,5 мг/мл 3,6x105 7,4x105 6,0х107 7,3x108

Бактериоцин ЛГС 2,5 мг/мл 9,9x10" 2,0х105 2,3x10" 2,6x105

Культуральная жидкость L lactis F-116 4,2x106 6,0х107 8,2x108 7,3x105

ППС-10 + молочная кислота 8,3x104 4,4x105 2,2x108 3,9x108

Таблица 18. Изменение общей бактериальной обсемененности образцов мяса говядины, обработанных консервантами, в процессе хранения

Консервант Общая бактериальная обсемененность (КОЕ/г)

Длительность хранения, сутки

Контроль (без обработки) 1 7 15 25 35 45 65 85

3,5x10' 5,5xl0J 1,0x10' 7,2x10" 2,1x10" 3,6x10" 4,0x10' 1,0x10S

Низаплин 2,5 мг/мл 4,2x101 1,5x10' 1,1x10' 6,2x10' 2,6x10" 7,1x10" 2,8x105 5,2x10"

Бактериоцин ЛГС 2,5 мг/мл 3,3x10' 6,3x10"' 1,9x10' 1,9x10' 3,3x10' 1,8x10" 8,6x10" 3,6x10"

Культуральная жидкость L lactis F-116 2,6x105 5,0x105 1,2x10" 3,3x10' 9,9x10" 3,5x10" 3,6x10" 5,4х103

ППС-10 1,5%+ 2% молочной к-ты 7,7x10Z 1,0x10' l,0xl0J 5,0x10' 1,7x10" 9,2x10" 5,2x106 4,2x10'

В контрольном образце мяса и в образцах, обработанных лизоцимом, низаплином после 45 суток хранения были обнаружены бактерии из рода Pseudomonas, энтерококки, анаэробные гнилостные бактерии, вызывающие неприятный запах, ослизнение образцов, изменение цвета от розового, характерного для свежего мяса, до серого Высокая обсемененность этих образцов гнилостными микроорганизмами сохранилась и в последующие дни хранения. В всех образцах, за ислючением образцов, обработанных

бактериоцином и лизоцимом, после 85 дней хранения, были обнаружены дрожжи и плесени.

Апробация бактериоцина ЛГС в опытно-промышленных условиях на Пензенском мясо-перерабатывающем комбинате позволяет рекомендовать бактериоцин ЛГС для длительного хранения охлажденного мяса говядины (Акт опытно - промышленных испытаний от 19.09.07).

Показана возможность применения бактериоцинобразующего гибридного штамма L. lactis subsp. lactis F-116 для увеличения срока хранения сухого яичного белка - пищевого сырья для нужд спецконтингента и пищевой промышленности. Удаление углеводов из свежего яичного белка препятствует реакции образования нерастворимых комплексов (меланоидинов), имеющей место в процессе тепловой сушки и приводящей к снижению качества сухого продукта, его растворимости, а также срока хранения (Kato, 1994; Агафонычев, Каренин, 2006).

Лактококки устойчивы к лизоциму, могут развиваться в яичном белке как субстрате, утилизировать его углеводы. Результаты исследований показали (рис.14), что полное удаление глюкозы прошло за 12 часов инкубирования лактококков в яичном белке как субстрате, при этом рК снизился до 5,2. Добавление дрожжевого автолизата как источника витаминов, пуринов и пиримидинов, необходимых для развития лактококков в яичном белке, ускорило рост и развитие бактерий: процесс ферментации сократился до 9 часов, значение рН снизилось до 5,0, количество лактококков за время инкубирования увеличилось от 2,1х108 до 7,3х109.

время, ч

Рис. 14. Влияние дрожжевого автолизата (1) на потребление глюкозы, изменение рН и синтез бактериоцина при инкубировании Ьас1ососст 1аей'« эиЬвр. Ысйч Е-116 в яичном белке, подкисленном молочной кислотой

(2).Обозначения: —А— глюкоза; —•— рН; —■- - бактериоцин; К - рН нативного яичного белка, подкисленного молочной кислотой.

Сухой яичный белок, предварительно обессахаренный штаммом Б-116, отвечал требованиям стандарта по всем физико-химическим показателям (ГОСТ 30364.2 - 96).

Таким образом, в результате проведенных исследований показана возможность использования нетоксичных бактериоцинобразующих лактококков и их бактериоцинов в качестве биологических консервантов для увеличения сроков хранения продуктов питания и пищевого сырья.

Использование активного природного бактериоцинобразующего штамма L. lactis subsp. lactis 194 для обеззараживания сырокопченых колбас.

Из обсемененных колбасных изделий выделен и идентифицирован плесневый гриб, относящийся к осмотолерантным аскомицетам рода Eurotium с конидиальной стадией, отнесенной к виду Aspergillus repens de Вагу (рис.15).

Рис.16. Влияние обработки культуральной жидкостью ЬаМоспссш 1асНя БиЬвр. 1ас& 194 на обсемененность колбасных изделий.

Обозначения: (1 - без обработки; 2-е обработкой).

Рис. 15. Конидиеносец и конидии плесневого гриба Aspergillus repens de Вагу.

Испытания по использованию природного штамма 194 взамен дорогостоящего консерванта Дельвоцид фирмы «Гист-Брокадес» (Голландия) стоимостью 750 Евро/кг, созданного на основе фунгицидного антибиотика натамицина и используемого при изготовлении сырокопченых колбас (ТУ 4961-02), показали преимущество использования нетоксичных лактококков как по биологическим, так и экономическим показателям. Готовая продукция после обработки культуральной жидкостью штамма 194 соответствовала основным технологическим показателям (ГОСТ 16131-86): по органолептике, консистенции и микробиологическим показателям, что указано в акте испытаний от 16.06.2006 года и показано на рис. 16.

Составлена коллекция активных бактериоцинобразующих лактококков, подобраны условия их хранения, что соответствует задачам таких программных документов, как конвенция «Сохранение биоразнообразия» и «Микробное разнообразие-XXI», а также программе ФЦАТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники»

ВЫВОДЫ

1 Из коровьего и кобыльего молока, из лечебно-профилактических национальных продуктов смешанного молочнокислого и спиртового брожений курунги и Doogh разных территориальных зон выделены и отобраны наиболее перспективные бактериоцинобразующие природные штаммы мезофильных лактококков. штамм 119х с низинсинтезирующей активностью 3700 ME/мл (ас № I55I744) и штамм 194 с активностью 3600 ME/мл, синтезирующий антибиотический комплекс широкого антимикробного действия, что является неизвестным свойством для этих лактококков. Штаммы идентифицированы как Lactococcus lactis subsp. lactis

2 С использованием метода клеточной инженерии и индуцированного мутагенеза получены новые эффективные бактериоцинобразующие штаммы L lactis subsp lactis Установлено, что протопластирование, реверсия протопластов к клеточной форме и слияние протопластов могут служить методами получения активных форм. Получены гибридные штаммы, в 10 - 14 раз превышающие активность родительских штаммов (ас № 1687616, серебряная медаль ВДНХ). Новые штаммы обладали ускоренным синтезом бактериоцина при изменении спектра потребляемых углеводов и чуствительности к разным группам антибиотиков

3 Оптимизирован синтез бактериоцинов новыми штаммами лактококков при изменении состава среды и контроля pH выход бактериоцинов был увеличен в 1,8 -1,9 раза и составил для природного штамма 194 - 6400 МЕ/мл, а для гибридного штамма F-116 - 8200 ME/мл Показана возможность использования в качестве сред для производства бактериоцинов отходов ряда ферментных производств, что удешевляет их получение и представляет реальную возможность решения проблемы защиты окружающей среды

4 Разработаны методы выделения новых бактериоцинов, синтезируемых штаммами L lactis subsp lactis разного происхождения, проведена их идентификация. Установлено, что антибиотический комплекс, синтезируемый гибридным штаммом F-116, представляет собой смесь биологически активных компонентов, относящихся к различным классам органических соединений полипептида низина, а также компонентов группы алкилароматических кетонов с широким спектром антибактериального действия. Природный штамм 194 образует комплекс биологически активных компонентов с низинподобным бактериоцином и низкомолекулярным алифатическим соединением, содержащим кетонную группу и обладающим широким спектром антимикробного действия Антибиотические комплексы являются новыми, ранее не описанными природными соединениями, не имеющими аналогов в компьютерной базе данных природных биологически активных веществ BNPD Заявка на патент № 2007148649/13 (053309)

5 Лактококки синтезируют новые бактериоцины параллельно росту продуцентов Бактериоцины термостабильны, устойчивы в интервале pH от

2,0-4,0, чувствительны к специфическим ингибиторам синтеза белка. Быстрое проявление антимикробной активности может свидетельствовать о мембранном механизме их действия

6 Получен новый нетоксичный препарат - бактериоцин JITC широкого спектра антимикробного действия по отношению к патогенным и условно-патогенным бактериям и другим нежелательным микробам, развивающимся в пищевом сырье при хранении, что позволяет рекомендовать его в качестве биологического консерванта Проведены испытания по использованию бактериоцина для увеличения срока хранения охлажденного пищевого сырья срок хранения рыбы увеличен с 5 до 15 дней, мяса - до 45 суток (Акт опытно-промышленных испытаний от 19 09 2007 г)

7 Выделенные новые природные штаммы бактериоцинобразующих лактококков, а также гибридный штамм F-116 и мутантные низинобразующие штаммы 10, И, 25, 52, полученные в результате индуцированного мутагенеза, являются непатогенными, не обладают токсичностью в отношении лабораторных животных Показана возможность использования штамма F-116 для обессахаривания яичного белка с целью увеличения срока его хранения, а природного штамма 194, обладающего фунгицидным, действием, в качестве консерванта для увеличения срока хранения сырокопченых колбас (Акт испытаний штамма 194 от 16 06 2006 г), что дает основание рекомендовать эти бактериоцинобразующие лактококки для использования в пищевой промышленности в качестве биоконсервантов

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Обзоры и главы в книгах.

1 Стоянова Л Г., Лобзов К И Воробьева Л И Ферментирование яичного белка // ЦНИИТЭИ Минмясололпрома СССР 1974 В 6 27с

2 Стоянова Л Г , Егоров Н С , Полин А Н Слияние протопластов у молочнокислых стрептококков // Антибиотики и медицинская биотехнология 1987 №2 С 89-97

3 Воробьева Л И, Стоянова Л Г, Алексеева М А Микробные метаболиты Изд МГУ 1979 С 88-101

4 Стоянова Л.Г., Егоров Н С, Полин А Н Использование метода слияния протопластов в селекции продуцентов низина // Антибиотики и химиотерапия 1988 № 3 С 203-210

5 Stojanova L.G, Egorov N S Alteration of the physiology biochemical properties of nism prodicing strains of Streptococcus lactis after protoplastmg // "Ingredients and Additives for Food Industry" 1990 Singapore P 24-39

6 Стоянова Л.Г Низин и его использование в пищевой промышленности // АгроНИИТЭИПП 1992 №11 С 15-23

7 Егоров Н С , Баранова И. П Стоянова Л.Г. Низин Условия образования, получение препарата//Антибиотики и химиотерапия 1997 42 №3 С 37-44

8 Стоянова Л Г Молочнокислые бактерии // Практикум по микробиологии Под ред А И Нетрусова М Изд Академия 2005. С 467 - 486

Экспериментальные статьи

9 Стоянова Л.Г. Воробьева Л И Использование микроорганизмов для консервирования яичного белка и повышения его биологической ценности // Микробиологическая промышленность 1979 № 5 С 7-9

10 Стоянова Л.Г., Лобз ов К И, Воробьева Л И Ферментация как способ повышения качества сухих яйцепродуктов // Мясная индустрия 1979 №12 С 23-25

11 Стоянова Л Г, Лобзов К И, Воробьева Л И Бактериальная ферментация яичного белка//Птицеводство 1980 В б С 25-27

12 Стоянова Л.Г., Воробьева ЛИ, Лобзов К И Обессахаривание яичного белка микроорганизмами//Прикладная биохимия и микробиология», 1979 Т ХП № 1 С 629-79

13 Стоянова Л.Г., Понамарева О Я Антибиотическая активность натурального кумыса и консервированного сублимационной сушкой // Молочная промышленность 1982 №4 С 32-35

14 Стоянова Л.Г., Воробьева ЛИ, Лобзов К И Влияние полифосфатов на физико-химические свойства яичного белка // Сб Новое в технике и технологии птицеперерабатывающей промышленности 1975 Труды ВНИИМП Минмясомолпрома СССР Т XIX С 70-76

15. Стоянова Л.Г., Лобзов КИ, Воробьева ЛИ Улучшение пенообразующей способности яичного белка при использовании его в кондитерской промышленности // Хлебопекарная и кондитерская промышленность 1982 №2 С 24-26.

16. Стоянова Л.Г., Лобзов К И, Воробьева ЛИ Меланоидинообразование в сухом яичном белке // Сб Совершенствование технологических процессов переработки птицеводческого сырья Труды ВНИИМП Минмясомолпрома СССР М 1982, С 40-44

17 Stojanova L G, Ponamonova ОI, Spmdonov V A Antibiotiche eigenshuften von kumys // XXI World's milk congress M 1982 V I P.22-26

18 Стоянова Л.Г., Ивлева ТИ, Черепанова ЕИ Технологический процесс промышленного получения ацидофильной пасты и творога фруктового сублимационной сушки на базе сублимационной установки периодического действия Труды ВНИИМП Минмясомолпрома СССР 1982 С 35-37

19 Шумков Е Г, Стоянова Л.Г , Богданов В С , Ладодо К С Перспектива использования кобыльего молока в детском и диетическом питании // Материалы докладов Симпозиума стран-членов СЭВ «Производство и применение диетических продуктов" М 1983 С 30-33

20 Стоянова Л.Г., Полин А Н, Егоров Н С Повышение чувствительности к лизоциму в целях получения протопластов // Биотехнология 1987 Т 3 № 4 С 454-460

21 Стоянова Л.Г., Егоров Н С Влияние некоторых аминокислот на рост молочнокислых стрептококков и процесс их протопластирования // Известия АН СССР 1988 № 6 С 892-899

22 Стоянова Л.Г, Абрамова Л А, Ладодо К С Кобылье молоко сублимационной сушки и возможность его использования при создании продуктов детского и лечебного питания // Вопросы питания 1988 №2 С 64-67

23 Стоянова Л.Г., Полин А Н, Егоров Н С Некоторые аспекты получения стабильных протопластов у Streptococcus lactis // Сб «Технология и техника сыроделия» Госагропром СССР Барнаул 1989 С 79-82

24 Стоянова Л.Г, Егоров Н С Изменение физиолого-биохимических свойств некоторых штаммов Streptococcus lactis после протопластирования и регенерации Материалы докладов Всесоюзной научно-технической конференции «Интенсификация производства и повышение качества сыра» Барнаул 1989 С 140-142

25 Stojanova L.G, Egorov NS The fusion of protoplasts of two unactive strains of Lactococcus l actis f or о btaine о f a ctive n ism p roducing s train //J F ood В lotechnology 1990 V L № I P 559-560

26 Стоянова Л.Г., Егоров H С Некоторые аспекты получения протопластов у моточнокислых стрептококков Streptococcus lactis с помошью лизоцима II Прикладная биохимия и микробиология 1990 Т 26 №4 С. 566-572

27 Егоров Н С, Баранова И.П, Стоянова Л.Г. Кудряшов В Л Разработка питательной среды для низинпродуцирующих стрептококков с использованием отходов ряда биотехнологических производств//Антибиотики и химиотерапия 1994. №38 С 10-13

28 Кудряшов ВЛ, Сергеева И Д, Стоянова Л.Г, Задорожная Т И, Дурицкая Л И Синтез биоконсерванта низина на отходах и вторичном сырье ряда биотехнологических производств//Биотехнология 1995 №12 С 25-28

29 Стоянова Л.Г., Егоров Н С Получение низинпродуцирующих штаммов методом слияния протопластов двух родственных штаммов Lactococcus lactis subsp lactis, низкоактивных по синтезу низину//Микробиология 1998 Т 67 № 1 С 38-44

30 Стоянова JI. Г, Егоров H С Сравнительная характеристика новых штаммов Lacíococcus lactis subsp lactis, полученных методом слияния протопластов // Микробиология 1999 Т 68 №2 С 235-240

31 Stoyanova L.G, S avelieva N V, Е gorov N S , Netrusov AIR egulation o f s ynthesis o f bactenocm from fusant strain of Lactococcus lactis subsp lactis F-II9 In book "Food Microbiology&Hygiene'99" Vandhoven The Netherland 1999 P 313-315

32 Стоянова Л. Г., Аркадьева 3 А Сравнение способов хранения молочнокислых бактерий//Микробиология 2000 Т 69 № 1 С 98-104

33 Stoyanova L.G, Egorov N S , Netrusov AI New food biopreservatives from fusant strains of Lactoœccus lactis subsp lactis // Ann Nutr Metabolit Vienna 2001 V 45 № 1 P 558-559

34 Стоянова Л.Г., Сультимова T Д, Нетрусов А И Влияние фосфата и углеводов на синтез низина Lactoœccus lactis subsp lactis штамм 194 II Вестник Московского Университета сер Биология 2003 №4 С 17-22

35 Стоянова Л.Г, Сультимова ТД, Нетрусов А И Создание банка лиофильных бактериоцинпродуцирующих молочнокислых бактерий // Цитология 2004 Т 46 № 10, С 865-867

36 Стоянова Л.Г. Левина H В Регуляция синтеза бактериоцина рекомбинантного штамма Lactoœccus lactis subsp lactis F-116 компонентным составом среды // Микробиология 2006 Т 75 №3 С 286-291

37 Стоянова Л.Г, Сультимова Т Д, Ботина С Г, Нетрусов А И Выделение и идентификация бактериоцинпродуцирующих штаммов Lactococcus lactis subsp lactis из свежего молока//Прикладная биохимия и микробиология 2006 Т 42 № 5 С 560-568

38 Стоянова Л.Г., Среоши Ш, Егоров НС Вариабельность низинсинтезирующего дикого штамма Lactococcus lactis subsp lactis П9 под действием ультрафиолетовых лучей // Антибиотики и химиотерапия 2006 Т 51 № 11-12 С 11-17

39 Дибирасулаев M А, О В Балыпаков, Дибирасулаев Д M , Стоянова Л.Г, Нетрусов А И, Адылов А В, Алигаджиева Л M Применение дополнительных к холоду технологических средств для увеличения срока хранения охлажденного мяса // Сб материалов научно-практической конференции «Интеграция фундаментальных исследований - основа развития современных аграрно-пищевых технологий» Углич 2007 С 81-84

40 Стоянова Л.Г., Федорова Г Б, Егоров H С , Нетрусов А И , Катруха Г С Сравнение свойств бактериоцинов некоторых штаммов Lactococcus lactis subsp lactis И Прикладная биохимия и микробиология 2007 Т 43 № 6. С 677-684

41 Стоянова Л. Г , Сультимова Т Д , Строева А Р , Нетрусов А И Микробиологическая характеристика нового штамма Lactococcus lactis subsp lactis K-205, выделенного из национального бурятского напитка курунги // Журнал микробиологии, эпидимиологии и иммунологии 2008 № 1 С 60-63

42 Стоянова Л.Г, Сультимова Т Д, Ботина С Г, Нетрусов А И Установление таксономического положения новых бактериоцинйродуцирующих штаммов Latococcus lactis II Вестник Московского Университета сер Биология 2008 № 4 (в печати)

Тезисы докладов

43 Стоянова Л.Г., Воробьева ЛИ, Лобзов К И Консервирование яичного бежа бактериальным способом Материалы XVI Всемирного конгресса по птицеводству M 1978 С 31

44 Агафонычев В П , Стоянова Л.Г., Лысов В С Разработка промышленного процесса производства творога фруктового сублимационной сушки Тезисы докладов научной конференции «Основные направления рационального использования обезжиренного молока, пахты и сыворотки», Ставрополь, октябрь 1981 С 21-22

45 Стоянова Л.Г., Зараев А В , Никифоров Л Л. Консервирование кобыльего молока методом сублимационной сушки Тезисы докладов молодых ученых, Труды ВНИИМП Минмясомолпрома СССР M 1982 15-18 июня С 21-22

46 Стоянова Л.Г, Полин А H, Егоров H С, Захарова Г M Особенности культивирования низинпродуцирующих штаммов молочнокислых стрептококков в связи с

получением протопластов Тезисы докладов Всесоюзной конференции «Создание химико-фармацевтических препаратов биотехнологическими методами» М 1985 С 123-124

47 Стоянова Л.Г, Полин А Н, Егоров Н С , Захарова Г М Техника получения и регенерации протопластов низинпродуцирующих штаммов Тезисы докладов Всесоюзной конференции «Создание химико-фармацевтических препаратов биотехнологическими методами» М 1985 С 21-23

48 Стоянова Л.Г Получение и регенерация протопластов молочнокислых стрептококков Тезисы докладов УП съезда ВМО «Достижения микробиологии -практике» Алма-Ата апрель 1983 Т2 С 141

49 Стоянова Л.Г, Полин А Н , Егоров Н С «Особенности формирования протопластов низинпродуцирующих штаммов Streptococcus lactis Материалы конференции «МГУ -Главмикробиопрому» 4-5 февраля 1985 С 14-15

50 Стоянова Л.Г, Полин АН, Егоров НС р-галактозидазная активность молочнокислых стрептококков Материалы Ш Всесоюзной конференции «Биосинтез ферментов микроорганизмами» Кобулети апрель 1986 С 149-150

51 Стоянова Л Г., Агафонычев ВП, Абрамова Л А Липиды кобыльего молока, обезвоженного сублимационной сушкой, Тезисы докладов Всесоюзной конференции «Биохимия липидов» Алма-Ата 1987 апрель С 216

52 Стоянова Л.Г, Князева М В , Захарова Г М, Егоров Н С Использование клеточной инженерии для получения гибридных штаммов низин-продуцируюших молочнокислых стрептококков Материалы Всесоюзной конференции «Биосинтез вторичных метаболитов», Пушино, 20-22 октября 1987 С 89-90

53 Стоянова Л.Г, Полин А Н, Егоров Н С Спектральные характеристики и биологические свойства низина и низинподобных пептидов, продуцируемых Streptococcus lactis и их гибридами» Тезисы докладов Всесоюзной конференции «Разработка и применение антибиотиков немедицинского происхождения» М 1987 С 45

54 Стоянова Л.Г, Егоров Н С, Омельченко М V Получение новых штаммов молочнокислых стрептококков Streptococcus lactis Тезисы докладов Всесоюзной конференции «Микроорганизмы - ингибиторы к стимуляторы роста животных и растений» октябрь 1989 Ташкент. С 184

55 Stojanova L.G , EgorovN S, Pohn A N Preparation of protoplasts and their fusion to obtaining hybndes of nism-producing strains of Streptococcus lactis Symposium "Genetics and Products formation in Streptomyces and Bacillus" 4-9 May 1987 DDR Waimar P67

56 Stojanova L G, Egorov N S, Polin A N Cell engineenng for selection msin-producing strains of Streptococcus lactis // Second Symposium on Lactic Acid Bactenas The Netherlands Wagemngen 1987 Sept 22-25

57 Stojanova L.G Egorov NS, Pohn AN Effect of protoplasting on the physiology properties of some strains of Streptococcus lactis Second International Symposium on Overproduction of microbial products Czechoslovakia 3-9 July 1988 P 1987

58 Stojanova L.G., Licov V., Pohn A N, Egorov N S Spectral Charactentics and biological properties of nism and similar nism peptides producing Streptococcua lactis and their hybrids 1-stlnt Symposium of Chiral Molecules Pans France 1988 31 May-2June P43

59 Stojanova L G., Egorov N S Fusion of protoplasts of two inactive msin-producing strain of Streptococcus lactis Int Conference "Biotechnology and Food" Stuttgart February 20-24 1989 P 67

60 Kudnayshov V L, Stoyanova L.G, Zadorojnay TI, Sergeeva ID , Dunzkay N The biosynthesis of nism on wastes of fermentative and alcoholic industries «Научно-технический прогресс в перерабатывающих отраслях АПК» Москва, 16-18 мая 1992 Р 96-97

61 Stoyanova L.G, Egorov N S , Omelchenko M V The effect of selective components on the getting of nisin producing fusant strains L lactis The Forth Symposium of Lactic Acid Bacteria The Netherlands, 1993 Sept 5-9 P 54

62 Stoyanova L.G., Egorov N S , Katrucha G S , Fedorova G M Isolation and characterisation of new lantibiotics denved from fusant strain of Lactococcus lactis F-l 16 The 2-nd Workship on Lantibiotics Arnhem The Netherlands 20-23 Nov 1994 P 63

63 Кудряшов В Л, Сергеева И Д , Стоянова Л.Г. Пути повышения производства и применения низина Научно-практическая конференция «Научные основы прогрессивных технологий хранения и переработки сельскохозпродукции для создания продуктов питания человека» Углич 9-12 октября 1995 С 270-272

64 Стоянова Л.Г., Среоши Ш , Егоров Н С, Получение высокопродуктивных штаммов низинпродуцирующих бактерий с помощью мутагенов Конференция Северо-Кавказского региона «Современные достижения биотехнологии» Ставрополь 20-22 сентября 1995 С 78

65 Стоянова Л.Г., Егоров Н С , Баранова И П, Кудряшов В Л Использование отходов биотехнологических производств как основы ферментационных сред для получения низина // Конференция Северо-Кавказского региона «Современные достижения биотехнологии» Ставрополь 20-22 сентября 1995 С 77

66 Kudnayshov V L, Stoyanova L.G., Sergeeva ID, Zadorojnay TI Effectivity of production and application of nisin The Int conference "Applied biotechnology at the edge of XXI centure» Moscow April 13-15 1995 P 145-146

67 EgoTov N S , Stoyanova L.G, Baranova IP, Kozlova UI Optimisation of the temperature regimes for incubation of nisin by producing strains of Lactococcus lactis The Int scientific and practical conference "Food Ecology Human" Russia Moscow Dec 1995 P 76

68 Stoyanova L.G, Egorov N S , Kudnyschov V L Synthesis of biopreservative of nisin on the raw and wastes of biotechnological industries The Int scientific and practical conference "Food Ecology Human" Russia Moscow Dec 1995 P 103

69 Stoyanova L G , Baranova IP, Egorov N S , Kudnyschov V L Effect of aeration on Lactococcus lactis The Int scientific and practical conference "Food Ecology Hyman" Russia Moscow Dec 1995 P41

70 Кудряшов В Л, Стоянова Л. Г., Сергеева И Д, Задорожная Т И Области и эффективность применения консерванта-бактериоцина низина для производства продуктов питания повышенной пищевой и биологической ценности 2-ая Всероссийская конференция «Прогрессивные и экологически безопасные технологии хранения и комплексной переработки сельхозпродукции» Углич I -4 октября 1996 С 320-321

71 Stoyanova L.G., Egorov N S Synthesis of biopreservative by fusant strains of Lactococcus lactis subsp lactis F-II9 Int Symposium "Biotechnology and Food" Budapest Sept 1996 P 46

72 Stoyanova L.G , Egorov N S , Omeltchenko M V Intergenetic protoplast fusion mvohng Lactococcus lacis and Bacillus strain Fifth symposium on Lactis acid bacteria " Genetic Metabolism and application" Veldhoven The Netherlands 1996 September P 12

73 Стоянова Л.Г , Егоров H С , Катруха Г С, Федорова Г Б Новый антибиотический комплекс, продуцируемый рекомбинантным штаммом Lactococcus lactis subsp lactis F-l 16 Международная конференция «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий» 12-15 сентября 2001 г Саранск С 49

74 Stoyanova L G., Netrusov АI, Egorov N S Bactenocines from different strains of Lactococcus lactis subsp lactis 18'th Int ICFMH Symp FOOD MICRO-2002 Norwey Lillihammer August 2002 H-36

75 Stoyanova L., Netrusov A , Egorov N, Sultimova T New bactenocin of Lactococcus lactis subsp lactis for food safety International Congress "Poverty Food & Health in Welfare" July 14 Lisbon Portugal 2003 P 121

76 Stoyanova L.G., A I Netrusov, T D Sultimova, M A Dibirasulaev, D M Dibirasulaev New bactenocin from fusant strain of Lactococcus lactis for meat preservation 19th International ICFMH Symposium "FOOD MICRO 2004" September 12-16 2004 Slovenia P61

77 Савельева T H , Глухова Л П, Праслова Н Т, Стоянова Л.Г, Нетрусов А И Использование электромагнитного процесса для выделения низина Всероссийская научная конференция «Мембраны-2004» (с международным участием) 4-8 октября 2004 М С 168

78 Стоянова Л.Г, Мохаммед Индрис С, Савельева Н А Селекция бактериоцин-продуцирующих штаммов Lactococcus lactis subsp lactis с использованием техники слияния протопластов Всероссийский симпозиум «Биотехнология микробов» (с международным участием) 20-23 октября, 2004 М Изд МАКС Пресс. С 85

79 Сультимова Т Д, Стоянова Л.Г, Нетрусов А И Изучение физиолого-биохимических свойств бактериоцин-продуцирующего штамма 194 Lactococcus lactis subsp ¡actis Всероссийский симпозиум «Биотехнология микробов» (с международным участием) 20-23 октября 2004 М Изд МАКС Пресс С 87

80. Стоянова Л.Г, Сультимова Т Д, Нетрусов А И Создание банка лиофильных бактериоцинпродуцирующих молочнокислых бактерий Материалы международной конференции «Сохранение генетических ресурсов» г. Санкт-Петербург 19-22 октября 2004 С 865

81 Sultimova TD, Stoyanova L.G., Netrusov AI Isolation and characterization of Lactococcus lactis subsp lactis from North Asian traditional fermented drink kurunga 8'th Symposium on Lactic Acid Bacteria The Netherlands, August 28 to September 1 2005 P 123

82 Сультимова T Д, Стоянова Л.Г., Ботина С Г Скрининг бактериоцинпродуцирующих штаммов Lactococcus lactis subsp lactis II Тезисы Молодежной школы-конференции «Актуальные проблемы современной микробиологии», ИНМИ, 1-3 ноября 2005 г // М Изд Макс-Пресс 2005г С 107

83 Сультимова Т Д, Стоянова Л Г, Нетрусов А И Изучение антимикробного спектра действия национального молочнокислого напитка курунги // Тезисы из материалов Всероссийского симпозиума с международным участием "Автотрофные микроорганизмы" памяти академика РАН Е Н Кондратьевой, МГУ им М В Ломоносова, биологический фак-т, 21-24 декабря 2005 г М Изд Макс-пресс,2 005 г С 45

84 Сультимова Т Д, Стоянова Л.Г. Изучение бактериоцинпродуцирующей активности у диссоциантов нового штамма 194 Lactococcus lactis subsp lactis // 10-я Путинская школа-конференция молодых ученых 17-21 апреля 2006 г //Пущино 2006 С 398

85 Стоянова, Л.Г, Милько Е С, Егоров Н С Комбинированное действие ультрафиолетовых лучей и химических мутагенов на дикий бактериоцинобразующий штамм Lactococcus lactis subsp ¡actis 119 и его протопласты Пущино 2006 С 198

86 Stoyanova L.G., Fedorova G М , Katrucha G S , Netrusov АI New antibiotical complex of Lactococci as a bopreservative The International scientific and practical conference Biotechology Water and food stuffs M 2008 P 182

Изобретения.

87 Стоянова Л.Г , Лобзов К И Воробьева Л И Новый способ консервирования яичного белка а/с № 542501 Официальный бюллетень по делам изобретений и открытий № 2 1977

88 Стоянова Л.Г, Пушкарева Е И «Способ получения бактериального концентрата» а/с №1156614 1985

89 Стоянова Л.Г, Егоров Н С , Пятннцына И Н , Задояна С Б Штамм Streptococcus lactis II9x- продуцент антибиотика-консерванта низина а/с №1551744 1990

90 Стоянова Л Г., Егоров НС Штамм Streptococcus lactis F-116-продуцент антибиотика низина а/с № 1687616 1991

91 Тренина М А, Ботина С Г, Стоянова Л.Г , Цыганков Ю Д Штамм бактерий Streptococcus thermophilus для сквашивания молока в процессе приготовления кисломолочных продуктов, включая йогурты Получено положительное решение на патент от 10 04 2008, заявка № 207117139/13 (018635)

92 Стоянова Л.Г , Федорова Г Б, Егоров Н С , Катруха Г С , Нетрусов А И Штамм Lactococcus lactis subsp lactis F-l 19-продуцент двухкомпонентного антибиотика LGS и способ получения антибиотика Получено положительное решение на патент от 28 12 2007, заявка №2007148649/13 (053309)

Нормативно-техническая документация.

• Лобзов К И, Волик В, Стоянова Л.Г «Порошок яичный ферментированный» Технические условия ТУ 49802-80 (взамен ТУ 49320-76 на опытную партию) Минмясомолпром

• Барминцев Н ,И, Мироненко М, Стоянова Л.Г «Молоко кобылье Требование при заготовках» Отраслевой стандарт ОСТ 46 128-82 Минсельхоз СССР

• Стоянова Л.Г., Суворова Л Г, Богданов В С Продукт сухой молочный «Кобомил», Технические условия ТУ 49 983-83 Минмясомолпром

• Стоянова Л.Г., Суворова JIГ, Богданов В С Продукт сухой молочный «Кобомил», Технические условия ТУ 49 983-83 Минмясомолпром

• Кудряшов В Л, Потапова Г И, Стоянова Л.Г. «Препарат антибиотика низина» Технические условия ТУ 10-0334585-25-92 (опытная партия объемом 5 уел т).

• Стоянова Л.Г , Нетрусов А И Лабораторный регламент на синтез бактериоцина ЛГС гибридным штаммом Lactococcus lactis subsp ¡actis F-11 б МГУ 2004

• Стоянова Л.Г, Сультимова ТД, Нетрусов А И Лабораторный регламент на ферментационный процесс синтеза бактериоцина штаммом Lactococcus lactis subsp lactis 194 МГУ. 2005

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01 12 99 г Подписано к печати 14 05 2008 г Формат 60x90 1/16 Услпечл 3,0 Тираж 100 экз Заказ 250 Тел 939-3890 Тел/Факс 939-3891 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им MB Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Стоянова, Лидия Григорьевна

Введение стр.

I. Обзор литературы стр.

1.1 Общая характеристика лактококков Lactococcus lactis Lactococcus lactis и их распространенность. стр.

1.1.1. Морфология и культуральные свойства стр.

1.1.2. Физиолого-биохимические особенности лактококков стр.

1.2. Бактериоцины лактококков Lactococcus lactis стр.

1.2.1. Свойства бактериоцинов стр.

1.2.2. Классификация бактериоцинов стр.

1.2.3. Формирование биологически активных молекул стр.

1.2.4. Механизм действия бактериоцинов стр.

1.2.5. Система иммунности продуцентов к бактериоцинам стр.

1.2.6. Методы выделения и определения бактериоцинов стр.

1.2.7. Условия образования бактериоцинов стр.

1.3. Селекция бактериоцинобразующих лактококков Lactococcus lactis subsp lactis стр.

1.3.1. Выделение бактериоцинобразующих лактококков Lactococcus lactis subsp lactis из природных источников стр.

1.3.1.2. Дифференцирующие среды для выделения Lactococcus lactis subsp lactis стр.

1.3.1.3. Идентификация бактериоцинобразующих лактококков стр.

1.3.2. Слияние протопластов как метод селекции молочнокислых бактерий стр.

1.3.2.1. Получение протопластов стр.

1.3.2.2. Слияние протопластов стр.

1.3.2.3. Регенерация протопластов стр.

1.3.2.4. Селекция рекомбинантов стр.

1.3.3. Генноинженерные методы стр.

1.3.4. Индуцированный мутагенез Lactococcus. lactis стр.

1.3.4.1. Действие физических мутагенов стр.

1.3.4.2. Химические мутагены стр.

1.4. Хранение молочнокислых бактерй стр.

1.5. Применение молочнокислых бактерий и их бактериоцинов в качестве биологических консервантов стр.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Новые бактериоцины лактококков и их практическое использование"

Молочнокислые бактерии известны с глубокой древности, разнообразны области их применения. Классические работы Луи Пастера открыли первые страницы в изучении этой важной группы микроорганизмов (Гутина, 1988). Развитие микробиологии расширило и усовершенствовало области применения этих микроорганизмов. На основе их использования возникли крупные промышленные производства. Антимикробный эффект этой группы бактерий использовался в той или иной форме людьми в течение столетий, в частности, для продления срока годности пищевых продуктов через процессы ферментации за счет образования молочной кислоты с сопутствующим понижением рН, а также бактериоцинов, обладающих бактерицидным действием на специфические группы микроорганизмов, включая и патогенные формы, развивающиеся в продуктах питания в процессе хранения и выделяющие энтеротоксины, что является причиной желудочно-кишечных заболеваний. Но впервые об этом явлении рассказал миру русский биолог Илья Ильич Мечников, который обобщил разрозненные экспериментальные данные в области изучения явления антагонизма молочнокислых бактерий (Мечников, 1911). Учение Мечникова о преждевременной старости человека в связи с постоянной интоксикацией организма продуктами жизнедеятельности гнилостных бактерий кишечника получило не только широкое признание, но и практическое применение.

Эволюционно бактериоциногения микроорганизмов возникла, по всей вероятности, как приспособление к выживанию в условиях конкуренции - это один из способов занять подходящую экологическую нишу. Молочнокислые бактерии, продуцирующие бактериоцины, являются естественной микробиотой пищевого сырья и комбикормов, они обитают в пищеварительном тракте людей и животных, природных и производственных субстратах. Обычно они не занимают доминирующего положения, над ними всегда превалируют различные сапрофитные микроорганизмы, включая споровые и бесспоровые формы, кокки, грамотрицательные бактерии, дрожжи, плесени, вызывающие порчу продуктов питания при длительном хранении, и которые также могут выделять ингибиторные вещества (Блинкова, 1984; 2006; Riley, Wertz, 2002; Mathara et al., 2004; Жарикова, 2005; Зуев, 2004; Balcazar et al., 2007).

Интерес по использованию бактериоцинов, образуемых лактококками, резко возрос. Одним из главных аспектов этого интереса является возросший спрос потребителей к качеству продуктов питания и их безопасности для здоровья. Широко используемые химические консерванты и антибиотики, увеличивающие срок хранения продуктов питания, вызывают опасения. Наиболее изученным и разрешенным для применения в качестве биологического консерванта (код Е234), является бактериоцин низин, единственный из антибиотиков с 1997 года имеющий «GRAS» (Generally Recognized As Safe) статус, т.е. признанный Европейским парламентом как безопасный (European Parliament and Council, 1997). Являясь низкомолекулярным белком, низин легко переваривается с пищей, не токсичен (Ross et al., 1999; Блинкова, 2003; Nete et al., 2006). Описаны несколько форм низинов (А, В, С, D, Е, Z, R, Q) и родственных им лактицинов, отличающихся между собой по ряду физико-химических свойств, аминокислотному составу и спектру антибактериального действия, но продуцентами которых являются разные штаммы одного вида Lactococcus lactis subsp. lactis (Mulders, 1991; Nes et al., 1996; Janes et al., 2001; Lasango et al., 2002; Yildirim et al., 2004; Zendo et al., 2005). Поэтому интерес к получению «естественных антибиотиков», образуемых молочнокислыми бактериями в последние годы возрос. Но активность известных в литературе природных штаммов низкая (от 579 до 1886 МЕ/мл), антимикробный спектр их действия распространяется, в основном, на грамположительные бактерии (Franz et al., 1997; Buyong et al., 1998; Janes, 1999; Lee, Paik, 2001; Zendo et al., 2003; Yildirim et al., 2004; Porgtharaqku, Demirci, 2006). Особый научный интерес представляют молочнокислые стрептококки серологической группы N, которые по систематическому положению недавно выделены из группы микроорганизмов рода Streptococcus, включающего патогенные формы, и под новым названием Lactococcus отнесены к категории «GRAS», куда относятся микроорганизмы, не вызывающие инфекционных заболеваний человека и животных (European Commission, 1996; Хоулт, 1997; Ленгелер и др., 2005).

Синтез бактериоцинов - наследственная особенность организмов, проявляющаяся в том, что каждый штамм способен образовывать один или несколько определенных, строго специфичных для него бактериоциногенных веществ. Синтез бактериоцина можно индуцировать генно-инженерными методами, различными физико-химическими воздействиями: ультрафиолетовыми лучами, мутагенами химической природы, ДНК-тропными веществами, перекисями и другими агентами. Разработка методов селекции продуцентов бактериоцинов началась еще в 60-70-е годы:, но, к сожалению, была преостановлена. Вследствии этого в настоящее время имеются довольно скудные сведения по этому вопросу. Актуальность данного подхода в селекции - сохранение многообразия живых форм на Земле и аккумуляции мутаций, направленных на решение поставленных задач.

Основными приемами селекции являются: • выделение культур из природных источников;

• сравнительная оценка активности продуцентов и выбор наиболее перспективных из них;

• экспериментальное повышение активности культур, включая классические методы мутаненеза и генио-инженерные манипуляции.

Но следует отметить, что использование генетически модифицированных микроорганизмов в пищевой промышленности не допустимо по закону и этическим нормам. В последние годы в генетико-селекционной практике используют индуцированный мутагенз и метод слияния протопластов, как метод гибридизации, позволяющий соединить полные геномы и цитоплазмы родительских штаммов с целью передачи наследственной информации по интересующему признаку, который может возникать спонтанно в природе. В настоящее время учёные многих лабораторий мира изучают пути и способы направленного синтеза бактериоцинов с целью получения биологическим путем различных модификаций уже известных бактериоцинов, но с более ценными свойствами или же получить новые природные сбалансированные бактериоциногенные комплексы, безопасные для использования в качестве биоконсервантов.

Низин является основой промышленного препарата «Nisaplin», который производится Английской фирмой «Aplin & Barrett Ltd», а в последнее время фирмой «Christian Напсеп» (Дания) под торговой маркой «Krisin». Препараты обеих компаний имеют очень схожие характеристики, содержат 2,5% активного компонента, который переводится на антимикробиальную активность как 1000 МЕ/мг (ME - международная единица). Низаплин и Кризин получают путем ферментации селекционного штамма Lactococcus lactis (Breukink, de Kruijff, 1999). Однако низин эффективен только против грамположительных бактерий, к тому же эффективность действия низина снижена из-за его плохой растворимости при рН выше 5,8. а также его способности гидролизоваться протеолитическими ферментами, присутствующими в пищевом сырье (Chung et al, 1989; Cutter, Siragusa, 1994; Nete et al., 2006).

Завышенное потребление теплоэнергоресурсов и потери продукции до 30% при транспортировке, переработке и хранении пищевого сырья являются актуальными проблемами Агропромышленного комплекса (АПК) нашей страны. Экономический эффект от использования бактериоцинов в консервной промышленности велик и обусловлен сокращением продолжительности стерилизации продуктов и увеличением сроков их реализации: на 15-25 % снижаются теплоэнергозатраты, сохраняются биологическая и пищевая ценность продукта питания, продлеваются сроки хранения (Кудряшов и др., 1995). Создание технологии производства отечественного препарата биоконсерванта позволит полностью отказаться от закупки импортных препаратов и обеспечит более низкую цену за счет использования высокопродуктивного продуцента, оптимизации условий ферментации, а использование в качестве питательных сред вторичного сырья АПК служит одним из звеньв решения экологической проблемы.

Для выполнения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

• скрининг природных бактериоцинобразующих штаммов лактококков из естественной среды обитания лактококков: коровьего и кобыльего молока, кисломолочных продуктов лечебно-профилактического назначения разных территориальных зон, идентификация перспективных штаммов;

• на основе перспективных бактериоцинобразующих штаммов оптимизировать синтез бактериоцинов;

• разработать методы выделения, очистки и идентификации новых бактериоцинов;

• показать возможность практического использования бактериоцинобразующих лактококков и их бактериоцинов в качестве биологических консервантов.

Научная новизна работы

Впервые проведен скрининг бактериоцинобразующих штаммов мезофильных лактококков из лечебно-профилактических национальных продуктов смешанного молочнокислого и спиртового брожений курунги (Бурятия), Doogh (Иран), также из коровьего и кобыльего молока разных территориальных зон. Выделены новые высокоактивные бактериоцинобразующие природные штаммы: из свежего коровьего молока Московской области — штамм 119х с низинсинтезирующей активностью 3700 МЕ/мл (а.с. № I55I744), из Бурятии - штамм 194 с активностью 3600 МЕ/мл широкого спектра бактерицидного и фунгицидного действия, что является неизвестным свойством для лактококков этого вида. Выделенные штаммы идентифицированы как Lactococcus lactis subsp. lactis. Разработана новая методика получения протопластов у бактериоцинобразующих лактококков, подобраны стабилизирующие буферные системы для регенерации и слияния протопластов, изучено влияние протопластирования на физиолого-биохимические свойства лактококков, в том числе и на синтез бактериоцинов. Установлено, что протопластирование и слияние протопластов могут служить методами селекции активных форм. Получены продуценты, в 10-14 раз превышающие активность родительских штаммов (а.с. № 1687616, серебряная медаль ВДНХ).

Подобрана защитная среда для получения бактериального концентрата, сублимационной сушки (а.с. № 1156614, бронзовая медаль ВДНХ)).

Разработан способ хранения яичного белка (№ 542501, серебряная медаль ВДНХ). Разработана схема выделения и очистки новых бактериоцинов, синтезируемых перспективными штаммами L. lactis subsp. lactis разного происхождения. Получены и изучены их индивидуальные компоненты в хроматографически чистом виде. Установлено, что бактериоцины, синтезируемые гибридным штаммом F-116 и оригинальным природным штаммом 194, не имеют аналогов в компьютерной базе данных природных биологически-активных веществ BNPD ("Bioactive Natural Product Database", Berdy, Hungary). Получено положительное решение на патент (заявка № 2007148649/13 (053309) от 28.12.2007. Практическая значимость работы

Новые природные, а также полученные методами клеточной инженерии, индуцированного мутагенеза бактериоцинобразующие штаммы L.lactis. subsp. lactis пополнили коллекцию -активных продуцентов низина и нового бактериоцина, обладающего уникальным для бактерий этого вида фунгицидным действием. Нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК этих бактериоцинобразующих штаммов депонированы в базу данных GenBank. Использование в качестве ферментационных субстратов для получения бактериоцинов отходов ряда биотехнологических производств представляет реальную возможность решения проблемы защиты окружающей среды при одновременном удешевлении технологического процесса.

Разработана технология получения низина, синтезируемого новым штаммом L.lactis. subsp. lactis, полученным воздействием УФЛ (ТУ 10-0334585-25-93).

Изучены условия диссоциации продуцентов, что облегчает отбор активных вариантов при их использовании в производстве бактериоцинов.

Разработаны лабораторные регламенты на синтез бактериоцинов гибридным штаммом F-116 и природным штаммом L.lactis subsp. lactis 194. Показана возможность применения этих штаммов и нетоксичного препарата ЛГС, синтезируемого гибридным штаммом L.lactis subsp. lactis F-116, в качестве биологических консервантов (Акты опытно-промышленных испытаний от 16.06. 2006г. и 19.09.2007г.).

Ожидаемый годовой экономический эффект от внедрения штамма 194 в технологический процесс производства колбас в сравнении с препаратом «Дельвоцид» для Мясокомбината производительностью 100 т в год составит 30,07 млн. руб.

Результаты исследований вошли в учебники для студентов вузов, подготовленные в соавторстве с сотрудниками кафедры микробиологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова. Разработаны курсы лекций и практических занятий для подготовки специалистов в Биотехнологическом центре МГУ.

Работа с 1985 года была поддержана постановлениями Совмина СССР, ГКНТ и Правительства Москвы, Международной Правительственной программой между СССР и Индией, межвузовской программой «Биотехнология в российских вузах», грантами РФФИ 98-04-49822 и 01-04-48661 "Управление процессами биосинтеза биологически активных веществ микроорганизмами", ФЦАТП N 60123.01.02 по фундаментальным и поисковым исследованиям и разработкам Минпромнауки России "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники на 2002-2004 годы"; блок 2 "Проектно-прикладные исследования". Положения, выносимые на защиту:

Селекция активных бактериоцинобразующих штаммов с помощью метода клеточной инженерии (слияния протопластов) и индуцированного мутагенеза.

Оптимизация синтеза бактериоцинов компонентным составом ферментационной среды и стабилизацией рН в процессе ферментации. Использование в качестве ферментационных субстратов для получения низина отходов ряда биохимических производств.

Разработка способа выделения эффективных бактериоцинов из культуральной жидкости, их идентификация.

Практическое использование перспективных бактериоцинобразующих штаммов L.lactis subsp. lactis и их бактериоцинов в качестве биологических консервантов.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Стоянова, Лидия Григорьевна

324 ВЫВОДЫ

1. Из коровьего и кобыльего молока, из лечебно-профилактических национальных продуктов смешанного молочнокислого и спиртового брожений курунги и Doogh разных территориальных зон выделены и отобраны наиболее перспективные бактериоцинобразующие природные штаммы мезофильных лактококков: штамм 119х с низинсинтезирующей активностью 3700 МЕ/мл (а.с № I55I744) и штамм 194 с активностью 3600 МЕ/мл, синтезирующий антибиотический комплекс широкого антимикробного действия, что является неизвестным свойством для этих лактококков. Штаммы идентифицированы как Lactococcus lactis subsp. lactis.

2. С использованием метода клеточной инженерии и индуцированного мутагенеза получены новые эффективные бактериоцинобразующие штаммы L.lactis subsp. lactis. Установлено, что протопластирование, реверсия протопластов к клеточной форме и слияние протопластов могут служить методами получения активных форм. Получены гибридные штаммы, в 10^- 14 раз превышающие активность родительских штаммов (а.с. № 1687616, серебряная медаль ВДНХ). Новые штаммы обладали ускоренным синтезом бактериоцина при изменении спектра потребляемых углеводов и чуствительности к разным группам антибиотиков.

3. Оптимизирован синтез бактериоцинов новыми штаммами лактококков при изменении состава среды и контроля рН: выход бактериоцинов был увеличен в 1,8 -1,9 раза и составил для природного штамма 194 - 6400 МЕ/мл, а для. гибридного штамма F-116 - 8200 МЕ/мл. Показана возможность использования в качестве сред для производства бактериоцинов отходов ряда ферментных производств, что удешевляет их получение и представляет реальную возможность решения проблемы защиты окружающей среды.

4. Разработаны методы выделения новых бактериоцинов, синтезируемых штаммами L. lactis subsp. lactis разного происхождения, проведена их идентификация. Установлено, что антибиотический комплекс, синтезируемый гибридным штаммом F-116, представляет собой смесь биологически активных компонентов, относящихся к различным классам органических соединений: полипептида низина, а также компонентов группы алкилароматических кетонов с широким спектром антибактериального действия. Природный штамм 194 образует комплекс биологически активных компонентов с низинподобным бактериоцином и низкомолекулярным алифатическим соединением, содержащим кетонную группу и обладающим широким спектром антимикробного действия. Антибиотические комплексы являются новыми, ранее не описанными природными соединениями, не имеющими аналогов в компьютерной базе данных природных биологически активных веществ BNPD. Заявка на патент № 2007148649/13 (053309).

5. Лактококки синтезируют новые бактериоцины параллельно росту продуцентов. Бактериоцины термостабильны, устойчивы в интервале рН от 2,0-4,0, чувствительны к специфическим ингибиторам синтеза белка. Быстрое проявление антимикробной активности может свидетельствовать о мембранном механизме их действия.

6. Получен новый нетоксичный препарат - бактериоцин ЛГС широкого спектра антимикробного действия по отношению к патогенным и условно-патогенным бактериям и другим нежелательным микробам, развивающимся в пищевом сырье при хранении, что позволяет рекомендовать его в качестве биологического консерванта. Проведены испытания по использованию бактериоцина для увеличения срока хранения охлажденного пищевого сырья: срок хранения рыбы увеличен с 5 до 15 дней, мяса - до 45 суток (Акт опытно-промышленных испытаний от 19.09.2007 г.).

7. Выделенные новые природные штаммы бактериоцинобразующих лактококков, а также гибридный штамм F-116 и мутантные низинобразующие штаммы 10, 11, 25, 52, полученные в результате индуцированного мутагенеза, являются непатогенными, не обладают токсичностью в отношении лабораторных животных. Показана возможность использования штамма F-116 для обессахаривания яичного белка с целью увеличения срока его хранения, а природного штамма 194, обладающего фунгицидным действием, в качестве консерванта для увеличения срока хранения сырокопченых колбас (Акт испытаний штамма 194 от 16.0б.2006г.), что дает основание рекомендовать эти бактериоцинобразующие лактококки для использования в пищевой промышленности в качестве биоконсервантов

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Цель исследований состояла в получении новых высокоэффективных бактериоцинов, образуемых молочнокислыми бактериями Lactococcus lactis subsp. lactis для практического использования их в качестве биологических консервантов.

Для выполнения поставленной цели была проведена селекция бактериоциногенных штаммов L. lactis. subsp. lactis. Первым этапом селекционной работы было выделение лактококков с заданными свойствами из естественной среды обитания молочнокислых бактерий, какой является коровье и кобылье молоко, кисломолочные продукты лечебно-профилактического назначения из разных территориальных зон; сравнительная оценка антимикробной активности вьщеленных штаммов и выбор наиболее перспективных из них. Преимущество метода естественного отбора, основанного на естественной изменчивости популяций бактерий, заключается в том, что свойства микроорганизмов тестирует сама природа. В популяциях бактерий имеет место спонтанная изменчивость. Иногда уже в естественных условиях обитания встречаются наиболее приспособленные формы лактококков, что и определяет их культуральные, физиолого-биохимические свойства, в том числе бактериоцинпродуцирующую активность. Изменчивость морфологических и культуральных свойств микроорганизмов является причиной больших затруднении при их дифференциации, идентификации от таксономически близких и сходных видов бактерий.

Разработан метод выделения и дифференциации наиболее активных бактериоцинобразующих штаммов L. lactis subsp. lactis из числа близкородственных видов, вьщеленных из свежего коровьего и кобыльего молока, молочных продуктов и национальных кисломолочных продуктов смешанного молочно-кислого и спиртового брожений, обладающих лечебно-профилактичеким действием из разных территориальных зон. В результате нами были выделены активные бактериоцинобразующие штаммы мезофильных лактококков, отличающиеся от ранее известных по совокупности физиолого-биохимических свойств и уровню бактериоцинпродуцирующей активности, превышающий уровень активности прежде вьщеленных из природных источников штаммов лактококков. После определения нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК были идентифицированы ряд новых перспективных штаммов, которые депонированы в базу данных GenBank как Lactococcus lactis subsp. lactis.

Из коровьего молока, полученного из Бурятии, выделен оригинальный штамм лактококка 194 с высокой антибиотической активностью (3600 МЕ/мл), синтезирующий бактерициноподобный комплекс антибактериального и фунгицидного действия, что является неизвестным свойством для вида L. lactis. subsp. lactis, выделяемых из молока северных широт, но которое свойственно лактококкам, выделенным из мест с жарким и влажным климатом.

Полученные экспериментальные данные позволяют расширить фундаментальные познания по разнообразию физиолого-биохимических свойств L. lactis subsp. lactis в вопросах адаптации этого вида бактерий к условиям окружающей среды.

Использование метода слияния протопластов показало его перспективность для получения штаммов лактококков с повышенной антимикробной активностью. Нами разработана методика получения протопластов у бактериоцинобразующих лактококков, подобраны стабилизирующие буферные системы для регенерации протопластов, изучено влияние протопластирования на физиолого-биохимические свойства лактококков, в том числе, и на синтез бактериоцинов. Установлено, что протопластирование, ренерация и реверсия протопластов к клеточной форме, может служить методом селекции: низкоактивные штаммы 729 и 1605 увеличили синтез низина в 3 - 4 раза и их антибиотическая активность достигла уровня активных продуцентов.

Проведено слияние протопластов у продуцентов низина, подобраны реагенты для слияния протопластов, среды регенерации и селектируемые компоненты для отбора активных по образованию бактериоцинов гибридов. Выделен новый гибридный штамм L. lactis subsp. lactis F-116, полученный слиянием протопластов двух родственный штаммов с низкой низинсинтезирующей, антибиотическая активность которого составила 4200 МЕ/мл, что в 12-14 раз выше активности родительскиз штаммов (авторское свидетельство № 4729917, серебряная медаль ВДНХ)

Установлена возможность получения стабильных мутантов с активностью до 70%, превышающую активность исходного природного низинсинтезирующего штамма 119, выделенного из молока, в результате индуцированного мутагенеза, включающего действие ультрафиолетовых лучей, химических мутагенов и комбинированного действия мутагенов в сочетании с процессом протопластирования. Полученные штаммы ускоряли ферментационный процесс синтеза низина, изменяли спектр сбраживаемых углеводов и устойчивость к антибиотикам, ингибирующих синтез клеточной стенки и синтез белка бактерий. У этих штаммов выявлена резистентность штаммов к сизомицину, канамицину, рифампицину и неомицину. Разработана нормативно-техническая документация на опытную партию объемом 5 усл.тонн - Технические условия ТУ 10-0334585-25-92 «Препарат антибиотика низина»

В результате изучения условий биосинтеза бактериоцинов, продуцируемых перспективными штаммами лактококков (гибридным штаммом L. lactis subsp. lactis F-116 и природным 194), оптимизирован ферментационный процесс синтеза антибиотиков рН статированием, изменением содержания в базовой среде неорганического фосфата (КН2РО4), дрожжевого автолизата (как источника аминного азота), а также изменения состава углеводов и аминокислот. Показано, что при уменьшении содержания КН2РО4 от 2,0% до 0,5 % в базовой среде, содержащей (в %): глюкозу - 1,0; NaCl - 0,2; MgSC>4 -0,02 и дрожжевой автолизат 35мг% по аминному азоту антибиотическая активность лактококков штамма F-116 снижалась от 4100 до 1150 МЕ/мл (соответственно). Увеличение концентрации дрожжевого автолизата до 70 мг% по аминному азоту в среде с 1,0% КН2РО4 (это количество соответствует содержанию фосфора в натуральном молоке) стимулировало рост лактококка и синтез бактериоцина. При замене в среде глюкозы на сахарозу происходило увеличение антибиотической активности на 24,3 %. При добавлении к ферментационной среде изолейцина на 22,6 %. Внесение в ферментационную среду с 1% КН2РО4 дрожжевого автолизата, 2 % сахарозы и 0,01 % изолейцина способствовало повышению уровня бактериоцинпродуцирующей активности штамма!,, lactis subsp. lactis F-116 в 1,9 раза. Внесение аспарагиновой кислоты в среду культивирования природного штамма 194 способствовало повышению его антибиотической активности на 16,6%%, что указывает на индивидуальные особенности новых штаммов в отношении биосинтеза бактериоцинподобных веществ.

Оптимальной для штамма 194 является среда, содержащая (%): КН2РО4— 0,5; MgS04 — 0,02; NaCl- 0,2; сахароза— 2,0; дрожжевой автолизат с 35-40 мг% аминного азота, 0,01% аспарагиновой кислоты, которая способствует накоплению 4450 МЕ/мл бактериоцина при уменьшении содержания фосфатов в среде культивирования в 4 раза. рН-статирование ферментационного процесса синтеза бактериоцинов перспектиными штаммами лактококков F-116 и 194 способствовало повышению уровня бактериоцинов до 8200 -6400 МЕ/мл соответственно. Сравнивая исследованные физиолого-биохимические свойства выделенных природных культур и полученных в результате селекционной работы (индуцированного мутагенеза, протопластирования, слияния протопластов) со свойствами типовых штаммов, описанных в литературе (Ленгелер, 2005; Nomura etal., 2006; Степаненко, 2006; Kowalczyk, Bardowsky, 2007), можно сделать вывод об особенностях некоторых новых штаммов, о наличии у них свойств, которые у типовых представителей этого вида лактококков в большинстве случаев отсутствуют. Такими особенностями являются усвоение источников углерода, потребность в факторах роста, спектр антимикробной активности. Рост исследуемых культур при неблагоприятных условиях, потребность в отдельных аминокислотах, чувствительность к разным группам антибиотиков и усвоение источников углерода, не утилизируемых типовыми штаммами (спиртов, раффинозы), свидельствует об интенсивности обмена веществ у новых штаммов.

Показано, что для стабильности производственных физиолого-биохимических свойств продуцентов бактериоцинов наиболее эффективным способом их длительного хранения является лиофилизация с использованием сложной защитной среды с глютаматом калия, желатиной и сахарозой, а результаты по изучению диссоциативных переходов бактериоцинобразующих штаммов позволяют проводить поддерживающую селекцию продуцентов в производственных условиях.

Применение в качестве ферментационных субстратов отходов ферментных производств для получения бактериоцинов представляет реальную возможность решения проблемы загрязнения окружающей среды и удешевляет производство антибиотиков.

Нами разработаны методы выделения и очистки новых низиноподобных веществ, не описанные в литературе. Проведено сравнительное изучение бактериоцинов, образуемых разными штаммами L. lactis subsp. lactis. На сновании полученных данных проведена идентификация бактериоцинов, образованных разными штаммами. Получены и изучены индивидуальные компоненты ингибиторных комплексов в хроматографически чистом виде. Из активного штамма L. lactis subsp. lactis 194 был выделен комплекс, представляющий собой смесь двух биологически активных компонентов. Основной фракцией этого комплекса является водо-растворимая фракция В с молекулярной массой 1995 Да, близкая по Rf и биологическому действию к низину. Фракция А - это низкомолекулярное гидрофильное соединение, обладающая широким спектром антимикробного действия и представляет собою новое не описанное в литературе природное соединение с молекулярной массой с 607,5 Да. Анализ свойств бактериоцинподобиого комплекса ЛГС, продуцируемых гибридным штаммом L. lactis subsp. lactis F-116 и состоящего из четырех фракций (ЛГС-Н, ЛГС- Н1, ЛГС-С и ЛГС-В), с помощью компьютерной базы данных BNPD (J. Berdy ) позволяют сделать следующие выводы:

1. Компоненты ЛГС-Н и ЛГС-Н1 являются низинами, причем ЛГС-Н идентичен низину А, основного компонента коммерческого препарата "Nisaplin".

2. Компоненты ЛГС-В и ЛГС-С в литературе не описаны и, по нашим данным, являются новыми природными биологически активными веществами. На основании полученных физико-химических исследований компонент ЛГС-В отнесен к группе алкилароматических кетонов, содержащих также гидроксильные группы, является низкомолекулярным гидрофобным соединением (М= 506 Да) и обладает широким спектром антимикробного и фунгицидного действия. Фракция ЛГС-С является минорной, обладает незначительной биологической активностью.

Для выяснения природы синтезируемых бактериоцинов были проведены исследования по влиянию ингибитора синтеза белка левомицетина (хлоромфеникола) на синтез бактериоцинов перспективными лактококками. Результаты показали, что при добавлении левомицетина к среде для культивирования лактококков синтез белка снизился до 50% от контроля, а образование бактериацинов уменьшилось на 80 - 88,5%. Эти данные дают основание считать, что биосинтез изучаемых антибиотиков происходит с участием рибосом, и синтезируемые бактериоцины по своей природе являются низкомолекулярными белками.

Установлено, что начало синтеза бактериоцинов идет во время экспоненциальной стадии роста бактерий, максимальная продукция антибиотиков происходит в началу стационарной фазы роста лактококков. Новые бактериоцины термостабильны, сохраняют стабильность при кипячение в течение 45 мин, стабильны в интервале рН от 2,0-3,9.

Согласно мнению ряда ученых (АЬее, 1994; Gonzalez, 1996; Vadyvaloo, 2004), быстрое проявление антимикробного эффекта бактериоцинов может свидетельствовать о мембранной направленности механизма их действия. Ингибирующие вещества изучаемых штаммов обладают характерной для большинства известных бактериоцинов скоростью антимикробного действия. По этим свойствам и спектру антибиотической активности эти соединения соответствуют принятому в настоящее время определению бактериоцинов, к которым относят термостабильные пептидно - белковые соединения.

Полученные результаты исследований позволяют предположить, что синтезируемые новыми штаммами L. lactis subsp. lactis соединения, обладающие антимикробным и фунгицидным действием, являются новыми уникальными бактериоцинами, ранее не описанными в литературе и не зарегистрированными в банке данных биологически активных веществ BNPD (J. Berdy).

Разработан лабораторный регламент на синтез бактериоцина ЛГС гибридным штаммом лактококка F-116, рекомендуемого к использованию в пищевой промышленности. Получен новый препарат — бактериоцин ЛГС широкого спектра антимикробного действия с активностью, превышающей активность известного препарата "Nisaplin", изучены его физико-химические свойства, определена безвредность препарата на лабораторных животных (белых мышах и морских свинках), инфузориях в соответствии с методическими указаниями (Игнатьев, Шаблий,1978; МУК 4.1/4/2.588-96).

Установлена антибиотическая активность препарата по отношению к патогенным, условно-патогенным бактериям Staphylococcus aureus, Е. coli, а также штаммам рода Enterococcus, Proteus vulgaris, Salmonella, развивающихся в пищевом сырье при хранении. Все это позволяет рекомендовать полученный препарат в качестве биологического консерванта Проведены опытно-промышленные испытания по его использованию для увеличения срока хранения пищевого сырья: срок хранения мяса, обработанного препаратом ЛГС увеличен с 16 до 45 суток, а рыбы в охлажденном состоянии до 15 дней (Акт от 16.06.2007).

Выполненные токсикологические исследования на экспериментальных животных показали отсутствие токсичности у новых вьщеленных штаммов: низинобразующего штамма 119х, гибридного штамма F-116, штаммов № 10, 25, полученных индуцированным мутагенезом (Акты и справки о патогенности (Приложения 4 - 9).

Показана возможность использования штамма F-116 для обессахаривания яичного белка как предварительного этапа перед его высушванием в целях увеличения срока хранения сухого продукта, а штамма 194, обладающего фунгицидным действием, в качестве консерванта для увеличения срока хранения сырокопченных колбас (см. Акт испытаний штамма 194 от 16.06.2006).

Составлена коллекция активных бактериоцинобразующих лактококков, подобраны условия их хранения, что соответствует задачам таких програмных документов, как конвенция «Сохранение биоразнообразия» и «Микробное разнообразие -XXI», проект ФЦНТП N 60123.01.02. «Технологические процессы хранения и транспортировки сельскохозяйственного сырья и пищевой продукции, обеспечивающие сохранность пищевой и биологической ценности продукции, снижение энергозатрат и потерь массы."

Штаммы депонированы под следующими номерами: bankit858176 L.lactis subsp. lactis F-116 - EF100777, bankit 858460 штамм F-119 - EF100778, bankit858962 729 - EF102814, bankit 858978 1605 - EF102815, bankit 859706 119x - EF114305, bankit 854703 119 -efh4306, штамм мгу - DQ 255952, штамм 115, штамм мгу, 229, 194 под номерами DQ255951 —DQ255954 (соответственно), 119 - ef 100778, К-205-ef 114306

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Стоянова, Лидия Григорьевна, Москва

1. Абрамов Н.И., Мурашова А.О., 1994. Патент №2011352, Россия МКИ А23с 9/12: Способ получения кефира // Опубл. 30.04. 1994. Бюл. №8.

2. Авгиева П.Б., Винаров А.Ю., 1993. Получение мутантов дрожжей Sacharomyces cerevisiae -продуцентов лимонной кислоты // Микробиология. Т.62. В. 2. С.15-17.

3. Агафонычев В.П., Каренин А.И., 2006. Улучшение функциональных свойств яичных продуктов путем ферментации // Новые мировые тенденции в производстве продуктов из мяса птицы и яиц. 17-18 октября. Ржавки. Московская обл. С.125-127.

4. Алиханян С.И. Селекция промышленным микроорганизмов. Наука. 1986.

5. Антипова JI.B., Глотова И.А., Рогов И.А. 2004. Методы исследования мяса и мясных продуктов. М. Колос. 571с.

6. Баран А.А., Тесленко А.Я., 1990. Флокуляпты в биотехнологии. JI. С.8-54.

7. Бартошевич Э.Ю., 1966. Сравнительное изучение генетической активности N-нитрозозтилмочевины с физическими и химическими мутагенами // «Супермутагены» под ред. И.А. Рапопорта. Изд. Наука. С.23-33.

8. Бавина Н.А., Королева Н.С, Хараш В.М., 1993. Патент №2001580, Россия МКИ А23 С.9/12. Способ получения препарата молочнокислых культур. Опубл. 30.10.1993. Бюл. №39-40:

9. П.Баранова И.П., Егоров Н.С., Ходжаев М.Н., 1989. Применение метода лиофилизации для хранения низинобразующих штаммов культуры Streptococcus lactis штамм 4968 // Научные доклады высшей школы. Биологические науки. № 2. С.497-499.

10. Баранова И.П., Клюева JI.M., Егоров Н.С., Исакова Н.С., Ходжаев М.Н., Бартошевич Ю.Э., 1992. Выделение низина из нативного раствора и его очистка на катионитах // Антибиотики и химиотерапия. Т. 37. №З.С.

11. Баранова И.П., Заславская П.Л., Егоров Н.С., 1995. Некоторые данные о культурально-морфологических особенностях форм диссоциации низинобразующего стрептококка // Антибиотики и химиотерапия. Т.40. №.4. С.3-7.

12. Баснакьян И. А., 1992. Культивирование микроорганизмов с заданными свойствами. М. Изд. Медицина. 188с.

13. Безбородов А. М., 1991. Биотехнология продуктов микробного синтеза. М. Изд. ВО "Агропромиздат". С.214-218.

14. Белясова Н.А., Чаевская Т.В., Кандыбович И.И., Гриц Н.В., 2002. Получение и реверсия протопластов у некоторых штаммов бактерий рода Lactococcus II Весщ НАЛ Беларусь Серыя б1ялапчных навук. №1. С.68—72.

15. Белясова Н.А., Чаевская Т.В., Караева О.А., Гриц Н.В., 2002. Разработка метода слияния протопластов и селекция гибридных бактерий у лактококков // Весщ НАН Беларусь Серыя бшлапчных навук. №2. С.84—87.

16. Блинкова Л.П., Машенцева Н.Г., Хорольский В.В., Горобец О.Б., Дорофеева Е.С., 2006. Биотехнологические условия синтеза бактериоцинов // Журн. микробиологии, эпидимиологии и иммунологии. №.2. С.83-89.

17. Бондаренко В.М., Чупринина Р.П., Аладышева Ж.И. и др., 2004. Пробиотики и механизмы их лечебного действия // Эксперим. клин, гастроэнтерол. №3. С. 83-87.

18. Вахитов Т.Я., Петров Л.Н., Бондаренко В.М., 2005. Концепция пробиотического препарата, содержащего оригинальные микробные метаболиты // Журн. микробиол. №5. С. 108-114.

19. Воейков В. Л., Решетов П. Д., Набиев И. Р., 1992. Физико-химичкские методы исследования биополимеров и низкомолекулярных биорегуляторов. М. Изд. Наука. С.63-125.

20. Воробьева Л.И., Абилев С.К., 2002. Антимутагенные свойства бактерий.// Прикладная биохимия и микробиология. Т. 38. С. 115-127

21. Генич Г., 1987. Современные бактериальные закваски для ферментированных молочных продуктов. Киев. С. 110-113.

22. Гейс А., Ринг Е., Тойбер М. 1982. Бактериоцины молочнокислых бактерий. XXI Международный молочный конгресс. Краткие сообщения. М., Т.1. кн.2. С.222-223.

23. Герхард Ф., 1984. Методы общей бактериологии. М. Мир. Т. 1.

24. Гилмар Б., Теплы М., Топорка А., 1978. Получение мутантов с повышенной низинообразовательной способностью с помощью радиоактивного облучения // XIX Международный конгресс по молочному делу.М.

25. Гладкова Е.Е., 1994. Снижение микробной загрязненности в кобыльем молоке при помощи ультрафиолетового облучения // Проблемы племенной работы и экологически чистых технологий в коневодстве. Дивово. С.351-355

26. Гладкова Е.Е., Андрюшин В.В., 1994. Влияние низких температур на микробную загрязненность и основные показатели кобыльего молока // Проблемы племенной работы и экологически чистых технологий в коневодстве. Дивово.С.344-347.

27. Голясная Н.В., Тюрина Н.А., 2000. Возраст культуры клеток Escherihia coli и частота мутаций, индуцированных М-метил-ЬТнитро-М-нитрозогуанидином // Микробиология. Т.69. №6. С.805-809.

28. ГОСТ 9958 81. Изделия колбасные и продукты из мяса. Методы бактериологического анализа. Изд. Стандартинформ. М. 2007.

29. ГОСТ 7636- 85. Рыба, морские млекопитающие, морские беспозвоночные и продукты их переработки. Методы анализа. М. 1988.

30. ГОСТ 16131-86 «Колбасы сырокопченые». Изд. Стандарты. М.1986.

31. ГОСТ 30364.2-96. Продукты яичные. Методы микробиологического контроля. ИПК. Изд. Стандарты. М. 199 6.

32. ГОСТ 10444.15-94. Продукты пищевые. Методы определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов. Межгосударственный совет по стандартизации, метрологии и сертификации. Минск. 1994.

33. ГОСТ Р 51448-99. Мясо и мясопродукты. Методы подготовки проб для микробиологических исследований. ИПК. Изд. стандартов. М.1999.

34. ГОСТ Р. 51921—2002. Продукты пищевые. Методы выявления и определения Listeria monocytogenes. Госстандарт России. М. 2002.

35. ГОСТ 31339- 2006. Рыба, нерыбные объекты и продукция из них. Правила приемки и отбора проб. Изд. Стандартинформ. 2007.

36. Грачева И.М., Грачев Ю.П., 1982. Лабораторный практикум по технологии ферментных препаратов. М. Легкая и пищ. пром-ть.240с.

37. Гриневич Н. Г., 1981. Молочнокислые бактерии. Селекция промышленных штаммов. Минск. Изд. Высшая школа. 164с.

38. Громов Б.В., 1985. Строение бактерий. Л. С.23-29.

39. Громыко О., Федоренко В., 2005. Вплив мутагешв на анйбютичну актившсть Streptomyces nogalater iMeT 43360 продуцента протипухлевого антибютика ногамщшу // BicHHK JlbeiB. Унту. CepiH бюлопчна. В.40. С. 16-22.

40. Грушина В. А., 1984. Изучение Streptococcus lactis штамм МГУ в связи с биосинтезом низина. Автореферат кандид. диссертации. МГУ. Москва.

41. Гуслянников В.В., Подлегаев М.А., 1992. Технология птицы и яйцепродуктов. М. С.167-285.

42. Гутина Н.В., 1988. Очерки по истории физиологии микроорганизмов. М. Изд. Наука.

43. Данилова М.В., Кудрявцев В.П., 1970. Влияние температуры замораживания на выживаемость бактерий при лиофилизации // Микробиология. Т 39. В.6. С.1102-1105.

44. Демина Н. С., Лысенко С. В., 1989. Влияние высушивания на содержание нуклеиновых кислот и мутационные изменения у микроорганизмов // Биол. Науки. №5. С. 87 — 95.

45. Доронин А.Ф., Шендеров Б.А., 2002. Функциональное питание. М. С. 248-251.

46. Дубинин Н.П., 2000. Радиационный и химический мутагенез. М. Изд. Наука. Т.2. С.30-36.

47. Егоров Н. С., Баранова И. П., Козлова Ю. И., 1978. Образование низина иммобилизованными клетками молочнокислых бактерий Streptococcus lactis // Антибиотики. № 10. С.757-761.

48. Егоров Н.С., Грушина В.А., Козлова Ю.И., Баранова И.П., Полин А.Н., 1982. Инактивация низина в культуре продуцента Streptococcus lactis штамм МГУ //Антибиотики. № 10. С.872-874.

49. Егоров Н.С., Баранова И.П., 1999. Бактериоцины. Образование, свойства, применение // Антибиотики и химиотерапия. Т.44, №.6, С.33-40.

50. Егоров Н.С., 2004. Основы учения об антибиотиках. М. Изд. МГУ. С. 167

51. Блинов Н.П., 1989. Химическая микробиология. М. Изд. Высшая школа. С. 448-460.

52. Есииова В.В. С.Л. Кривицкий А.С. 1985. Индуцированный мутагенез плазмидных, а также хромосомных генов, включенных в плазмидную ДНК//Генетика. Т. 21 .№ 8. С.22 -24

53. Есина Е.С., 2005. Влияние глюкозоксидазы на микробиологическую сохранность майонеза // Масла и жиры. № 10. С.13-14

54. Жарикова Г. Г., 2005. Микробиология продовольственных товаров. Санитария и гигиена. М. Изд. АКАДЕМА. С. 182-196.

55. Жубанова А.А., Чижаева А.В., Абдиева Г.Ж., Тулемисова Ж.К., 2001. Изучение механизмов антимикробного действия молочнокислых бактерий, выращенных на различных средах // Вестник КазГУ, серия биологическая. № 1. С.111-117.

56. Заборских Е.И., 1976. Антагонистическая активность молочнокислых стрептококков и их экспериментальная селекция.//Автореф. Канд. Дис. Иркутск.

57. Задояна С.Б., Банникова Л. А., 1982. Изменчивость молочнокислых стрептококков // Молочная промышленность. № 9.С.15-17.

58. Зигангирова Н.А., Токарская Е.А., Народницкий Б.С., Гинцбург A.JL, Тутельян В.А., 2006. Роль молочнокислых бактерий в распространении генов лекарственной устойчивости среди здоровых людей // Журн. Микробиол. № 2. С. 106-109.

59. Зуев B.C., 2004. Сапрофитизм патогенных бактерий // Ветеринарная патология. №.4. С.11-16.

60. Иванов Б.Л., Федорова И.Л., Ковальцова С.В., 1992. Выделение и характеристика новых мутантов дрожжей Sacharomyces cerevisiae с повышенной спонтанной мутабильностью // Генетика. Т. 28. № 5. С.47-52.

61. Иванова Л.А., Войно Л.И., 1985. Методические рекомендации к проведению лабораторных работ по технологии белковых препаратов, аминокислот и липидов. Изд. МТИМП, М.

62. Игнатьев А.Д., Шаблий В.Я., 1978. Использование инфузорий Tetrahimena pyriformis как тест-объекта при биологических исследованиях в сельском хозяйстве. Обзорная информация ВАСХНИЛ. Сер. Животноводство и ветеринария . № 65. 52с.

63. Карликанова С. Н., Кимова Э. Т., Виноградская С. Е., 1983. Антибиотически активные молочнокислые бактерии в производстве продуктов гарантированного качества // М. ЦНИИТЭИмясомолпром. Обзорная информация. Сер. Цельномолочная промышленность.51с.

64. Квасников Е. И., Нестеренко О. А., 1975. Молочнокислые бактерии и их использование. М.: Наука. С.23, 290-359.

65. Квасников Е.И., Коваленко Н.К., Нестеренко О.А.,1982. Молочнокислые бактерии в природе и народном хозяйстве // Прикладная биохимия и микробиология. Т. 18. № 6 С. 821-834.

66. Корнелаева Р.П., Степанепко П.П., Павлова Е.П., 2006. Санитарная микробиология сырья и продуктов животного происхождения. М. ООО «Полиграфсервис». С. 174-338.

67. Костенко Ю.Г., Солодовникова Г.И., Кузнецова Г.А., Самойленко В.А., 1997. Новый бактериальный препарат основа ускоренной технологии производства сырокопченых колбас // Мясная индустрия. № 1. С.9-10.

68. Котельникова Е.А., Гельфанд М.С., 2002. Выработка бактериоцинов грамположительными бактериями и механизмы транскрипционной регуляции // Генетика. Т.38. №6. С.758-772.

69. Королева Н.С, Рожкова И.В., Семенихина В.Ф., 1994. Патент №2011351, Россия МКИ А23с 9/12: Способ получения кефира // Опубл. 30.04. Бюл. №8.

70. Красникова JI. В., Кострова Н. Е., 1989. Роль микрофлоры закваски в повышении качества молочных продуктов // М. ЦНИИТЭИмясомоллром, 36 с.

71. Кретович Ю.В., 1980. Биохимия растений. М. Изд. Высшая школа. 445с.

72. Кудлай Д.Г., Лиходед В.Г., 1966. Бактериоциногения. М. Медицина. С. 9-15. 17-23.

73. Кудряшов В.Л., Сергеева И.Д., Стоянова Л.Г., Задорожная Т.И, Дурицкая Л.И., 1995. Синтез биоконсерванта низина на отходах и вторичном сырье ряда биотехнологических производств // Биотехнология. №12. С.25 28.

74. Кудряшов Л.С., Лисицын А.Б., Полякова А.В., 2002 Биохимические изменения говядины с различным характером автолиза в процессе послеубойного хранения // Пища. Экология. Качество. Новосибирск. С.8-50.

75. Лапинска Е., 1981. Низин и его применение. В кн.: Антибиотики и антибиоз в сельском хозяйстве. М."Колос". С.105-134.

76. Лев Г.Б., 1979. Исследование и разработка технологических режимов производства курунги. // Автореф. Дисс. Канд. Техн. Наук. Ленинград. 21 с.

77. Ленгелер Й., Древе Г., Шлегель Г., 2005. Современная микробиология. Прокариоты. М.: Мир. Т.2. С.393.

78. Ленченко Е.М., Павлова И.Б., 1998. Электронно-микроскопическое исследование антагонизма бактерий // Ветеринария. № 7. С. 2-28.

79. Лисицын А.Б., Кудряшов Л.С., Алексахина В.А., Полякова А.В., 2002. Преимущества переработки парного мяса // Все о мясе. №2.

80. Литвинова М.Н., Силева Н.Н., 1976. Повышение способности к биосинтезу низина Streptococcus lactis II Труды ВНИИ, средств защиты растений и бактериальных препаратов. В.4. С.84-89

81. Лотарева О.В., Филиппов В.Д., 1992. Экологический ультрафиолет реальный мутагенный фактор для вегетативных клеток Bacillus subtilis // Генетика. Т.28. № 6. С.22-28.

82. Лукомская И,С., Городецкий.В.К, 1964. Применение отечественного препарата глюкозоксидазы (микроцида) для определения глюкозы в крови в норме при диабете. // Биохимия. Т. 26. № 3. С.477-479.

83. Лях С.В., Рыбальский С.П., 1990. Адаптация микроорганизмов к низким температурным режимам. М., Пищевая промышленность.

84. Максимова А.К., 1980. К вопросу изучения протеолитической активности молочнокислых стрептококков и палочек // М. Труды ВНИМИ. № 26. С. 52 55.

85. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж.,1984. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М. Мир.

86. Мечников И.И., 1911. Молочные микробы и их польза для здоровья. СПТ. Изд. Зворыкин. 30с.

87. Миллер Дж., 1976. Эксперименты в молекулярной генетике //Изд. «Мир». С. 53 58.

88. Милько Е.С., Задояна С.Б., Ганина В.И., Егоров Н.С., 1991. Диссоциация молочно-кислых стрептококков. // Биологические науки. №4. С. 103 — 108.

89. Милько Е.С. Егоров Н.С., 1992. Влияние физико-химических факторов среды на рост диссоциантов некоторых грамположительных бактерий. // Микробиология. № 5. С. 89-96.

90. Милько Е.С., Котова И.Б., Нетрусов А.И., 2007. Процесс диссоциации у бактерий. Изд. Макс Пресс. М. С. 14.

91. МУК 4.1/4/2.588-96. Методические указания. Методы контроля медицинских иммунологических препаратов, вводимых людям. Изд. Минздрав России. С.51.

92. Мюнх Г.Д., Заупе X., Шрайтер М., 1985. Микробиология продуктов животного происхождения. // Пер. с нем. Е.М. Токаря под редакцией Королевой Н.С., Билетовой Н.В., Корнегталовой Р.П. М. Агропромиздат. С. 592.

93. Нечаева А А, Суходолец В.В., 1996. Генетическое изучение производственных штаммов Lactococcus lactis: выявление трасмиссибельных плазмид по признаку сбраживания лактозы.// Генетика. Т.32. № 2. С. 218-227.

94. Носкова Г.Л., 1972. Микробиология мяса при холодильном хранении М. Изд. Пищевая промышленность. 96с.

95. Опарин Ю. Г., 1996. Повреждения и защита биоматериалов при замораживании и лиофилизации // Биотехнология. №7. С. 3 13.

96. Павлова И.Б., Ленченко Е.М., Банникова Д.А., 2007. Атлас морфологии популяций патогенных бактерий. Изд. Колос. С. 180.

97. Паткуль Г.М., Гончиков Г.Г., Лев Г.Б., 1977. Об антагонистической активности молочнокислой микрофлоры курунги по отношению к кишечной палочке // Биология микроорганизмов и их использование в народном хозяйстве. Иркутск. С.83-89.

98. Порошеко Г.Г., Абилев С.К., 1988. Антропогенные мутагены и природные антимутагены // ВИНИТИ. Итоги науки и техники. Общая генетика. Т. 12. С.5 —176.

99. Потехина Н.В., 2006. Тейхоевые кислоты актиномицетов и других грамположительных бактерий // Успехи биологической химии. Т. 46. С. 225-278.

100. Проспект фирмы «Ниро Атомайзер» Полный процесс переработки яиц.,1992:

101. Проспект фирмы «Ovopo» Порошкообразные яичные продукты. Польша, 2005.

102. Пятницына И.Н., 1968. Повышение протеолитической активности штаммов Str. lactis II Труды ВНИИмолочной промышленности. Изд. Пищевая промышленность. Т. 26. С. 37-52.

103. Пятницина И.Н., Банникова Л.Л., 1978. Получение мутантов Streptococcus lactis путем воздействия нитрозоэтилмочевиной // XIX Международный конгресс по молочному делу. М. С. 52.

104. Работнова И.Л. Баснакьян И.А., Боровкова В.М., Запорожцев Л.Н., 1982. Системы культивирования микроорганизмов. Изв. АН СССР. Серия биологическая. № 4. С.559-573.

105. Радионова И.И., Даниленко В.Н., 1987. Влияние протопластирования на антибиотическую активность штамма Streptomyces fradidia 165 продуцента тилозина // Антибиотики и медицинская биотехнология. Т.32. № 12. С. 883-887.

106. Рапопорт А.И., Беккер М.Е., 1983. Влияние сахарозы и лактозы на устойчивость дрожжей Saccharomyces cerevisiae к обезвоживанию. // Микробиология. Т. 52. №. 5. С. 719 — 722.

107. Рапопорт И. А., 1993. Открытие химического мутагенеза. М., Изд. Наука. С.105-240.

108. Рапопорт И.А., 1996. Гены. Эволюция гена. М. Изд. Наука. С. 110 123.

109. Ратникова И.А., Гаврилова Н.Н., Колокова Н.Н., 1995. Идентификация антибиотических веществ молочнокислых бактерий // Биотехнология. № 5-6. С. 19-20.

110. Романова Ю.М., Гинзбург А.Л., 1996. Генетический контроль индукции некультивируемого состояния у патогенных бактерий // Журн. Микробиол. №3. С. 16-18.

111. Румер М.М., Лившиц В.А., 1992. Ген предшественник антибиотика низина Streptococcus lactis АТСС 11454 локализуется на хромосоме // Биотехнология. ;№ 3. С.20-25.

112. СанПиН 2.3.2.1078-01. Санитарно-эпидемиологические правила и нормативы. Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов. Минздрав России, М., 2002

113. Саттон Д., Фотерпшл. М., 2001. Определитель патогенных и условно патогенных грибов. С.486

114. Семенихина В.Ф., Рожкова И.В., Гаврилова Л.Н., Серебренников В.М., Кисриева Ю.С., 2001. Биохимизм ароматообразования молочнокислыми стрептококками // Молочная промышленность. № 9. С. 14-18.

115. Семенова Е.В., 2005. Составление сред и культивирование микроорганизмов // Практикум по микробиологии / Под ред. А.И. Нетрусова. М.: Академия. С. 33.

116. Скурихин И.М., Тутельян B.JL, 2002. Химический состав Российских продуктов питания. Справочник. М. Делипринт. С.50

117. Стенько А.С., 1982. Слияние протопластов //Мол. биология. Киев. В. 32. С. 7-16

118. Степаненко П.П., 2006. Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии молока и молочных продуктов. М. Изд-во Лира.С. 653.

119. Стоянова Л.Г., Лобзов К.И., Воробьева Л.И., 1979. Физиолого-биохимические особенности пропионовых бактерий P.shermanii при росте их в яичном белке // Микробиология. Т. XI. № 6. С. 5-8

120. Стоянова Л.Г., Лобзов К.И., Воробьева Л.И., 1982. Улучшение пенообразующей способности яичного белка при использовании его в кондитерской промышленности // Хлебопекарная и кондитерская промышленность. №2. С.24-26.

121. Стоянова Л.Г., Лобзов К.И., Воробьева Л.И., 1982. Меланоидинообразование в сухом яичном белке. // Сб. Совершенствование технологических процессов переработки птицеводческого сырья. М. С.40-44

122. Суходолец В.В., 2004. Неравный кроссинговер путь адаптивной гомологичной рекомбинации между прямыми повторами ДНК в тандемных дубликациях у к Esherichia coliJf Генетика. Т. 40. № 8. С. 1046-1053.

123. Суходолец В.В., Ботина С.Г., Лысенко A.M., Тренина М.А., 2005. Молочнокислые энтерококки Enterococcus faecium и Enterococcus durans: разнообразие нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК. // Микробиология. Т. 74. № 6. С.810 815.

124. Таулов Ю.В., Миггелыптейн Т.М., Борткевич Л.Л., 1996. Влияние различных факторов на качественные и количественные показатели мясного сырья в процессе транспортировки и предубойной подготовки животных // Сб. научных трудов ВНИИМП. М. С.21-23.

125. ТУ 9213038-510-323-26-03. Сервелат сырокопченый «3ернистый».2003.136. ТУ 49

126. Туманов JI.Д., Бедняк Л.Е., Норенко М.П., 1966. Мутагенное действие N-нитрозоэтилмочевины. В книге «Супермутанты» под ред.И.А. Раппопорта//Наука.431с.

127. Тшика Т., 2004. Куриное яйцо: производство потребление и использование. Жиры и масла. № 1.С: 6-9.

128. Федорова И.В., Ковальцова СВ., Иванов Е.Л., 1992. Влияние мутаций hms повышающих спонтанную мутабильность, на индуцированный мутагенез и митотическую рекомбинацию у дрожжей Sacharomyces cerevisiae II Генетика. Т. 28. № 7. С.54-66.

129. Фильчакова Н.Н., Панкова Р.И., Королева Н.И., 1994. Патент №2007091 Россия МКП А23с 9.12: Смесь для производства замороженных кисломолочных продуктов / Опубл. 15.02. Бюл. №3.

130. Холлэнд И., 1969. Бактериоцины. В кн.: Механизмы действия антибиотиков. М.Изд. Мир. С. 646-649.

131. Хоулт Дж., 1997. Определитель бактерий Берги. М.: Мир. Т. 2. С. 538, 544, 549.

132. Хунданов Л.Е., 1975. Кисломолочные продукты, их приготовление и лечебно-диетическое назначение. Улан-Удэ, Бурятское книжное издательство. С 67.

133. Ценин А.Н., Каримов Г.А., Рыбчин В.Н., 1978. Рекомбинация при слиянии протопластов Escherichia coli К-12 // ДАН. Т.243. №.4. С.1066-1070

134. Ценин А.Н., Нестеренко А.В., Рыбчин В.Н., Потокин И.Л., Писаренко Ю.С., 1983. Эксперименты с протопластами Вас. thurengiensis. Получение протопластов и их реверсия в бациллярную форму // Генетика. Т.19. №.4. С.517-521

135. Шаблин П.Е., 2001. Лечебно-профилактический напиток «ЭМ-курунга» // Биотехнология-2001. Пущино. 25-27 сентября. С. 223 227.

136. Шапошников В.Н., 1955. Физиологическая сущность некоторых бактериальных брожений в связи с эволюцией функций // Известия АН СССР. Сер.биол. №3. С. 16-24.

137. Шигаева М.Х., Жубанова А.А., Шупшибаев К.К., Дощанова Б.К., Кунчич А.В. Кабидолданова Г.Ж., 1994. Способ получения молочной кислоты// Пат. 1426. № 940797.1. РК.

138. Штанников А.В., Лившиц В.А., Жданова Н.И., 1983. Слияние протопластов и генетическая рекомбинация у Corynobacterium glutamaticum и Brevibacterium flavum II Генетика. Т. 17. №8. С.1419-1428.

139. Ямамота Якихиро, Усами Хироко, 1982. Выделение L-форм стрептококков // Реф. Ж. Биол. Химия. № 144220. пат. 54-89313.

140. Abee T.N., Krockel Н.С., 1995. Bacteriocins: modes of action and potentials in food preservation and control of food poisoning // Int.J.Food Microbiol. 28. P. 169-185.

141. Alcantara-Diaz D, Brena-Valle M, Serment-Guerrero J., 2004. Divergent adaptation of Escherichia coli to cyclic ultraviolet light exposures.// Mutagenesis.V 19. N. 5. P. 349-354.

142. Anderson D. G, McKay L. L., 1983. Simple and rapid method for isolating large plasmid DNA from lactic streptococci.// Appl Environ Microbiol. Sep;46(3). P.549-552.

143. Andersen H., C.Solem, K.Hammer, P.R Jensen, 2001. Twofold reduction of phosphofructokinase activity i n L actococcus lactis r esult i n s trong d ecrease i n growth r ate a nd i n t he g lycolytic flux. J. Bacterol. V.183. P. 3458- 3467.

144. Aleksandrzak-Piekarezyk Т., Kok J., Renault P., and Bardowski J., 2005. Alternative lactose catabolic pathway in Lactococcus IL1403 // Appl. Environ. Microbiol. V. 71. N 10. P. 6060-6069

145. Anonymous, 1 995. L isteria с ontrol i n t he s ausage p roduction. В ioprotection о f sa usages w ith FloraCarn LC. // FloraCarn Bulletin № 3. EN-B3-FC-1195. Chr. Hansen A/S. Hoersholm. Denmark.

146. Aono Reakizo, Ito M., Horikoshi K. Regenaration of protoplasts prepared from Alkaliphilic strains of Bacillus spp.,1993 //Biosci. Biotech. Biochem. V.57. 9. P.1597- 1598.

147. Auffray Y., Gillot В., Lautier M., Thammovongs В., Boutibonnes P. Response of Lactococcus (iStreptococcus) lactis to N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine: absence of adaptive response // Mutagenesis. 1989. V. 4. N 4. P. 280 282

148. Aymes F., Monnet C, Corrieu G., 1999. Effect of alpha-acetolactate decarboxylase inactivation on alpha-acetolactate and diacetyl production by Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis // J Biosci Bioeng., V. 87. N. 1 P. 87-92.

149. Baker R.S., 1994. Innonative egg products and future trends. In book: Egg uses and processing technologies. New Developments. Ed. Sim J.S. and Nakai. Cab.International. UK. Wallingford. Chapter 7. P. 11-23.

150. Balcazar JL, Vendrell D, de Bias I, Ruiz-Zarzuela I, Girones O, Muzquiz JL, 2007. In vitro competitive adhesion and production of antagonistic compounds by lactic acid bacteria against fish pathogens // Vet. Microbiol. V.122. N. 3-4 P.373-80.

151. Bauer R., Dicks L.M.T., 2005. Mode of action of lipid П-targeting lantibiotics. Int. J. Food Microbiol. V. 101. P.201-216

152. Bernbom N, Licht Т., Brogren C., Jelle В., Johansen A., Badiola I., Vogensen F., N0rrung В., 2006. Effects of Lactococcus lactis on Composition of Intestinal Microbiota: Role of Nisin // Appl Environ Microbiol. V.72. P.239-244.

153. Berry E. D., Liewen M. В., Mandigo R. W., Hutkins R. W., 1990. Inhibition of Listeria monocytogenes by bacteriocin-producing Pediococcus during the manufature fermented simydry sausage//J. Food Prot.V. 53. 3. P. 194-197.

154. Biswas S.R., Ray P., Johnson M.C., Ray B. 1991. Influence of growth conditions on the production of a bacteriocin, pediocin AcH, by Pediococcus acidilactici H. // Appl. Environ. Microbiol. 57. P.1265-1267.

155. Bolotin A., Wincker P., Mouger S., Jaillon O., Malarme K., Weissenbach J., Ehrlich S.D., and Sorokin A. The complete genome sequence of the lactic acid bacterium Lactococcus lactis ssp. lactis IL1403 // Genome Res. 2001. V. 11. P. 731-753.

156. Boutibonnes P., Tranchard C., Hartke A., Thammovongs В., Auffray Y., 1992. Is thermotolerance correlated to heat-shock protein synthesis in Lactococcus lactis subsp. lactis? // J. Food Microbiol. V. 16. N 3. P. 227 36.

157. Breukink E., de Kruijff В., 1999. The lantibiotic nisin, a special case or not? // Biochimica et Biophysica Acta. 1462. P. 23-234.

158. Brotz H., Bierbaum G., Leopold K., Reynold P. E., Sahl H. G., 1998. The lantibiotic mersacidin inhibits peptidoglycan synthesis by targeting lipid П. // Antimicrob. Agents Chemother. V. 42. P. 154-160

159. Budde В. B, Rasch M. A., 2001. Comparative study on the use of flow cytometry and colony forming units for assessment of the antibacterial effect of bacteriocins // Int. J. Food Microbiol. V.63 (1-2). P.65-72.

160. Budin-Verneuil A, Pichereau V, Auffray Y, Ehrlich D, Maguin E., 2007. Proteome phenotyping of acid stress-resistant mutants of Lactococcus lactis MG1363. Proteomics. V. 7.N.2. P.2038-46

161. Calandra J., Band B.M., 1975. Lysis and protoplast formation of group N Streptococci by mutanolysin // Inf. and Immun. V.2. P.563-567. •

162. Cascales Eric, Susan K. Buchanan, Denis Duche, Coin Klanthous R. Lioubex, K. Postle, M. Relley, S. Statin, D. Cavard, 2007. Colicin biology//Microb. Biol. Reviews. March. P.l58-229.

163. Chan Weng C., Barrie W. Bycroft, Lu-Yun Lian and Gordon C.K. Roberts, 1989. Isolation and characterization of two degradation products derived from the peptide antibiotic nisin. //FEB V.252. № 1,2. P.29-36.

164. Chan Li, Fan Ouyang & Jinghua Bai., 2000. Extractive cultivation of Lactococcus lactis using a polyethylene glycol/ MgS04 7НгО aqeous two-phase system to produce nisin // Biotechnology Lett. V.22. P. 843 847.

165. Chan Li, Jinghua Bai, Zhaoling Caia and Fan Ouyanga., 2002. Optimization of a cultural medium for bacteriocin production by Lactococcus lactis using response surface methodology // J. Biotechnology. V. 93. Issue 1. P. 27-34.

166. Chandrapati S., O'Sullivan D. J. 1999. Nisin independent induction of the nisA promoter in Lactococcus lactis during growth in lactose or galactose // FEMS Microbiol. Letts. V. 170. P. 191-198.

167. Chandrapati S., O'Sullivan D. J., 2002. Characterization of the promoter regions involved in galactose and nisin mediated induction of the nisA gene in Lactococcus lactis ATCC 11454 // Mol. Microbiol. V. 46. P. 467-477.

168. Chassy B.M., 1976. Methods for the lysis of Gram-Positive asporogenes bacteria with lysozyme // Biochem. biophys. Res. Commun. // V. 9. P.153-158.

169. Cho H. Y., Yousef A. E., Yang S. Т., 1996. Continuous production of pediocin by immobilized Pediococcus acidilactici P02 in a packed-bed bioreactor // Appl. and Microbiol. Biotech. V.45. 5. P. 589-594.

170. Chen P., Qi F., Novak J., Krull R.E., Caufield P.W., 2001. Effect of amino acid substitutions in conserved residues in the leader peptide on biosynthesis of the lantibiotic mutacin П FEMS Microbiology Letters. V. 195. P.139-144.

171. Chung K.T., Dickson J.S., Crouse J.D., 1989. Effects of nisin growth of bacteria attached to meat //Appl. Environ. Microbiol. V. 55. P.1329-1333.

172. Cintas L.M., Casaus P., Fernandez M.F., and Hernandez P.E., 1998. Comparative antimicrobial activity of enterocin L50, pediocin PA-1, nisin A and lactocin S against spoilage and foodborne pathogenic bacteria. // Food Microbiol. 15. P.289-298

173. Cleveland J., Montville T.J., Nes I.F., and Chikindas M.L., 2001. Bacteriocins: safe, natural antimicrobials for food preservation // Int. J. Food Microbiol. V. 71. P. 1-20.

174. Cocaign-Bousquet, M., C. Garrigues, L. Novak, N.D. Lindley, P. Loubiere., 1995. Rational development of a simple synthetic medium for the sustained growth of Lactococcus lactis. // J. Appl. Bacterid. V.79. P.108-116.

175. Coleman S.E., 1970. Lysis of groupet Streptococci and ungroupet by lysozyme // Infection and Immunity. V.2. P.563-569.

176. Consentino S., Pisano M.B., Piras C., Cjrda A., 2003. Phenotipic, genotypic and technological characteristic of Lactococci isolated from tradional flora sardo cheese.// 1-th FEMS Congress. Slovenia. Lubljna. 29 June 2003. P. 107.

177. Cord В., Mc Kay L.L., Jurry P., 1974. Extrachromosal elements in group N Streptococci. Journal of Bacteriology. V.117. P.l 149-1152.

178. Cusick S.M., and O'Sullivan D.J., 2000. Use of a single, triplicate arbitrary primed (TAP)-PCR procedure for molecular fingerprinting lactic acid bacteria // Appl. Environ. Microbiol.V. 66. P. 22272231.

179. Cunmingham F.F., Proctor V.A., Goetsch S J., 1991. Egg white lysozyme as a food preservative: an overview // World Poultry Sci. V.47. No.2. P. 141-163.

180. Cutter C. N., Siragusa G. R., 1994. Decontaminationof beef carcass tissue with nisin using a pilot scale model carcass washer. // Food Microbiol., 11. P. 481-489.

181. De Hoog G.S., Guarro J., Gene J., Figueras M.J., 2000. Atlas of clinical fungi // 2nd edition. CBS/Univ. Rovira i Virgili.

182. De Ley J., 1962. Microbiol classification. // 12-th Sympos. Soc. Gen. Microbiology. Cambridge. P. 184.

183. Delgano A., Britto D., Fevereiro P.,Tenreiro R., Peres C., 2005. Bioactivity quantification of crude bacteriocin solutions // J/Microbiol. Methods. V.26. P.121-124.

184. Delves-Broughton J., 1990. Nisin and its application as a food preservative // J. Dairy Technol. V.43. P. 73-76.

185. Delves-Broughton J., Blackburn P., Evans R.J., Hugenholtz J., 1996. Application of the bacteriocin nizin // Int. J. General and Molecular. Microbiology. Feb. V.69. N.2. P.193-202.

186. Diep D.B., I.F. Nes., 2002. Ribosomally synthesized antibacterial peptides in Gram positive bacteria. // Curr. Drug Targets V. 3. P. 107-122.

187. Driessen A.J.M., van den Hooven H.W., KuiperW., van den Kamp M., Sahl H.-G., Konings R.N.H., Konings W.N., 1995. Mechanistic studies of lantibiotic-induced permeabilization of phospholipid vesicles. Biochemistry. V.34. P.1606-1614.

188. De Toit E.A., M. Rautenbach., 2000. A sensitive standardised micro-gel well diffusion assay for the determination of antimicrobial activity // J. Microbiol. Methods. V. 42. P. 159-165.

189. De Vuyst L., 1994. Nisin production variability between natural Lactococcus lactis subsp. lactis strains. // Biotechnol. Lett. V. 16. P. 287-292.

190. De Vuyst L., Vandamme E.J., 1994. Nisin, a lantibiotic produced by Lactococcus lactis subsp. lactis: properties, biosynthesis, fermentation and applications. Applied Microbiology and Biotechnology. V. 43. P. 151-221.

191. Dufour Alain, Thomas Hindre, Haras D.,Jean -Paul Le Pennes., 2007 The biology of lantibiotics frem the lacticin 481 group is coming of age // FEMS Microbiol. V.31. P. 134-167/

192. Duwat P., A. Cochu, S. D. Ehrlich, A. Gruss, 1997. Characterization of Lactococcus lactis Lactococcus lactis UV-sensitive mutants obtained by ISS1 transposition // J. Bacterid. V.179. P. 4473-4479.

193. Duwat P., Cesselin В., Sourice S., Gruss A., 2000. Lactococcus lactis, a bacteria model for stress response and survival I I J. Food Microbiol. V.55. P. 83-86.

194. Dykes G.A., Hasting J.W., 1997. Selection and fitness in bacteriocin-producing bacteria. // Proc. R. Lond. B. Biol. Sci. May.V. 22.264 1382 P.683-687

195. Eckburg P.B., Bik E.M., Bernstein C.N. et al. 2005. Diversity of the human intestinal microbial flora// Scince. V. 308. P.1635-1638.

196. Eddy A.A., Williamson D.N., 1959, Formation aberrant cell wall and spores by the growing yeast protoplasts. Nature. V. 183. N 4668. P.l 101-1104.

197. Edlund Т., Normark S. Recombination between short DNA homologies causes tandem duplications//Nature. 1981. V.292. P.269-271.

198. Eeijan breukink, Ben de Kruijff., 1999. The lantibiotic nisin,a special case or not?. Biochimica et Biophisica acta. V. 1462. P.223-234.

199. Eijsink V.G. H.M. Skeie, P.H. Middelhoven, M.B. Brurberg, I.F. Nes., 1998. Comparative studies of class Ha bacteriocins of lactic acid bacteria // Appl. Environ. Microbiol. V.64. P.3275-3281.

200. Elliker P.R., Anderson W., J. Hanneson, 1956, An agar culture medium for lactic acid Streptococci and lactobacilli, // Journal of Dairy Science, V. 39, P. 1064-1066.

201. Elkouhen R., Pages J.M., 1996. Dynamic aspects of colicin N translocation through the Escherichia coli outer membrane // Bacteriol. P. 5316-5319.

202. Emanuele J Jr., H. Jin, B.L. Jacobson, C.Y. Chang, H.M. Einspahr, J.J. Villafranca., 1996. Protein//Sci. V.5 .P.566-2574.

203. Ennahar S., Assobhei O., Hasselmann C., 1998. Inhibition of Listeria monocytogenes in smear-surface soft cheese by Lactobacillus plantarum WHE 92, a pediocin AcH // J. Food Prot. V.61. № 2 P. 186-191.

204. Ennahar S., T. Sashihara, K. Sonomoto, A. Ishizaki., 2000. Class Ha bacteriocins: biosynthesis, structure and activity // FEMS Microbiol. Rev. V. 24. P. 85-106.

205. European Parliament and Council. Regulation (EC) № 258/97 of the European Parliament and of the Council of 27 Jan. 1997 concerning novel foods and novel food ingredients. Official Journal 1997 L43, Feb. 14. P. 1-7.

206. Ferency L., Kevei, Sregedi M., 1975. High-frequency fusion of fungal protoplast // Experimentia. V. 31.P.1028-1030.

207. Fimland G., Eijsink V.G.H., Nissen-Meyer J., 2002. Comparative studies of immunity proteins of pediocin-like bacteriocins//Microbiology. V.148. P.3661-3670.

208. Fimland G., Eijsink V.G.H., Nissen-Meyer J., 2002. Mutational analysis of the role of tryptophan residues in the antimicrobial peptide sakacin P // Biochemistry. V. 41. P. 9508-9515.

209. Foder K., Alfredi L., 1979. Polyethilenglycol induced fusion of bacterial protoplasts // Molecular and General Genetics. V. 168. P.55-57.

210. Foury F., Cauffeau A., 1973. Combination of 2-deoxyglucose and snale gud enzyme treatments for preparing spheroplasts of Schizosaccharomycespombe // Microbiology. V. 75. № 1. P.227-229.

211. Franz C.M, Du Toit M, von Holy A, Schillinger U, Holzapfel W.H., 1997. Production of nisin-like bacteriocins by Lactococcus lactis strains isolated from vegetables // J Basic Microbiol. V.37. № 3. P.187-96.

212. Fremaux C., Ahn C., Klaenhammer T.R., 1993. Molecular analysis of the lactacin F operon // Appl. Environ. Microbiol. V. 59. P.3906-39015.

213. Ford K., Gregory M., Tompson S., 1963. Effect of gamma-radiation on vitamins and proteins of milk // ХУП Inter Congress of Dairy. Sci. V.2. P.9.

214. Gabor M., Hotchkiss R., 1979, Parametrs goverring bacterial regeneration and genetic recomdination after fusion of Bacilus subtilis protoplast // V.137. № 3. P.1340-1350.

215. Galvez A., Abriouel H., Lopez R., Omar N. 2007. Bacteriocin-based strategies for food biopreservation // J Food Microbiol. V.120. P.51-70

216. Gao S., D.-Broadbent J.R., Weimer M.E., Steele J.L., 1998. Aromatic amino acid catabolism by Lactococci // Lait. V.77. P/371-381.

217. Gasson Michaei J., 1980. Fusion of protoplasts of Streptococcus IIFEMS Microb. Letter. V.9 .№ 2. P. 99-103

218. Giacometti, О., Barchiesi F., Fortuna G., Scalise A. 1999. In-vitro activity of cationic peptides alone and in combination with clinically used antimicrobial agents against Pseudomonas aeruginosa// J.l of Antimicrobial Chemotherapy. V.44. P.641-645.

219. Gillot B, Auffray Y, Castillo-Sanchez X, Boutibonnes P.,1988. Mutagenesis in Streptococcus lactis exposed to UV irradiation and alkylating agents // Mutagenesis.V. 3. N. 3. P. 245-247.

220. Gratia A., 1925. Sur un remarquable emple d' antagonisme entre deux senches de coli bacile // C.R. Soc. Biol. V.93. P.1040-1041

221. Gratia A., Federicq P., 1946. Dewersite des souches antibiotiques de Escherihia coli et etendue varibile de leur champ d' action // C.R. Soc. Biol. V.140. P.1032-1033

222. Gross E., Morell J.L., 1971. The structure of nisin // J. Am. Chem. Soc. V.93. P.4634- 4635.

223. Guinane M., Cotter P., Lawton E., Hill C., Ross P. 2007. Insertional Mutagenesis To Generate Lantibiotic Resistance in Lactococcus lactis//Appl. Environ. Microbiol. 73, 4677-4680.

224. Gupta R.K., Prassad D.N., 1989. Nisin in the preservation of stirred yogurt under non-refrigerated storage // Microbiolic. aliments nutrition. V.7. N.2. P.123-129.

225. Gumpert J., 1979. Electron microscopic investigation of protoplast fusion in Streptomyces hydroscopicus II In Fifth Int. Protoplsts Symp. Szeged. 9-14. July. P.27.

226. Haese A., Keller U., 1988. Genetics of actinomycin С production in Streptomyces chrysomallus И J. Bacterid. V.170. P.1360-1368.

227. Hakozaki, Higashi-ku, Fukuoka, 2000. Class Ha bacteriocins: biosynthesis, structure and activity. // FEMS Microbiol. Rev. Jan. V. 24.№ 1. P. 85-106.

228. Hanlin M.B., N. Kalchayanand, P. Ray, B. Ray, 1993. Bacteriocins of lactic acid bacteria in combination have greater antibacterial activity// J. Food Prot. V. 56. P.252-255

229. Havarstein L.S., Diep D.B., Nes I.F., 1995. A family of bacteriocin ABC transporters carry out proteolytic processing of their substrates concomitant with export. V. 16 № 2: 229-240.

230. Hechard Y., H.G. Sahl, 2002. Mode of action of modified and unmodified bacteriocins from Gram-positive bacteria // Biochimie. V.84. P.545-557

231. Hester E. Hasper, Naomi E. Kramer, James A. Smith, J.D. Hillman, Cherian Zachariah, Oscar P. Kuipper, 2006. An Alternative Bactericidal Mechanism Of Action for lantibiotics peptides that target Lipid II// Science. V. 313 P. 1636-1637.

232. Hirst A., 1981. Nisin// Adv. Appl. Microbiol. V. 27. P.85-123.

233. Hopwood D.A., 1981. Genetic studies with bacterial protoplasts // Microbiology. V.35. P.257-272.

234. Hopwood D.A., Wright H.M., 1978. Bacterial protoplast fusion recombination in fussed protoplasts of Streptomyces coelicolor A3(2) // Mol. Gen. Gentic. V.162. N 2. P.307-309.

235. Hotchkiss R., Gabor M., 1979. Recombination segregation gene expression in bacterial protoplasts diploides created by protoplasts fusion // In Fifth Int. Protoplsts Symp. Szeged. 9-14. July. P.27.

236. Huang Hui-Ying, Huang Shih-Yi, Chen Pei-Yu, Fing An-Erl, Lin Y.P., Tsen J.H., 2007. Basic characteristica of Sporolactobacillus inilinus BCRC 14647 for potential probiotic properties // Current Microbiology. V.54. P.396-404.

237. Hutkins R.W., N.L. Nannen, 1993. pH homeostasis in lactic acid bacteria // J. Dairy Sci. V. 76. P.2354-2365.

238. Hostalek Z., Vorisek I., 1985. Environmental regulation of microbiol metabolism // Acad. Press. London. P. 15-28.

239. Ibrahim S.A., D.J. O'Sullivan, 2000. Use of chemical mutagenesis for the isolation of food grade P-galactosidase overproducing mutants of bifidobacteria, lactobacilli and Streptococcus salivarius ssp. thermophilu. И J. Dairy Sci. V. 83. P. 923-930

240. Ishizaki A., Ueda Т., 1995. Growth kinetics and product inhibition of Lactococcus lactis IO-l culture in xylose medium //J. Ferment. Bioeng. V.80. P.287-290.

241. Jack R. W., Tagg J. R., Ray В., 1995. Bacteriocins of Gram-positive bacteria // Microbiol. Rev. V. 59. P. 171-200.

242. Jacob F., Siminovitch L., Wollman E.L., 1953. Comparaison entre la biosynthese induite de la colicineet entre leurmode d'action//Ann. Inst. Pasteur. V. 84. P.313 318.

243. Janes M.E., Hettiarachy, Jonson M.L., 2001. Physical and chemical propertiesof edible films containing nisin and their action against Listeria monocytogenes II J. Food Sci. V. 66.

244. Janes M.E, Nannapaneni R., Johnson M.G., 1999. Identification and characterization of two bacteriocin-producing bacteria isolated from garlic and ginger root // J. Food Prot. Aug; V.62. № 8 P.899-904.

245. Jensen N.B.S., C.R. Melchiorsen, K.V. Jokumsen, J. Villadsen., 2001. Metabolic behavior of Lactococcus lactis MG1363 in microaerobic continuous cultivation at a low dilution rate II Appl. Environ. Microbiol. V. 67. P. 2677-2682.

246. Jensen P.R., K. Hamme, 1993. Minimal requirements for exponential growth of Lactococcus lactis II Appl. Environ. Microbiol. V. 59. P.4363-4366.

247. John R.P., Nanpoothin K.M., Pandey A., 2007. Polyurethane foam as an inert carrer for the production of L(+)-lactic acid by Lactobacillus casei under solid-state fermentation // Letters in Appl. Microbiology. V.44. P.582-587.

248. Jones D., 1978. Composition and differentiation of the genus Streptococcus II Streptococci. Eds. Skinner F. A., Quesnel L. B. L. Academic Press. P. 49.

249. Joosten H.M., M. Nunez, B. Devreese, J. Van Beeumen, J.D. Marugg., 1996. Purification and characterization of enterocin 4, a bacteriocin produced by Enterococcus faecalis INIA 4 // Appl. Environ. Microbiol. V.62. P.4220-4223.

250. Juillard V., Le Bars D., Kunji E.R.S., Konings W.N., Gripon J.C., Richard J., 1995. Oligopeptides are t he m ain s ource о f n itrogen for L actococcus Iactis d uring growth i n m ilk. A ppl. Environ. Microbiol. V. 61. N 8. P. 3024-3030

251. Kaneko H., Sakaguchi K., 1979. Fusion of protoplasts and genetic recombination of Brevibacterium flavum И Agricult. Boil. Chem. V. 31. P. 1028-1030.

252. Kao K.N., Michayluk M.R., 1974 A method for high-frequency intergenetic fusion of plant protoplasts // Planta. V. 115. № 2. P.355.

253. Keller U., Poschmnn S., Krendal U., Kleinkauf H., 1983. The study fusion of protoplasts in Streptomyces chrysomallus // J. Gen. Microbiol. V.129. N.6. P.1725-27.

254. Kim W.S., Hall R.J., Dunn N.W., 1997. The effect of nisin concentration and nutrient depletion on nisin production of Lactococcus lactis. Applied Microbiology and В iotechnology. V.48. P. 449453.

255. Kimoto-Nira H, Suzuki C, Kobayashi M, Sasaki K, Kurisaki JI, Mizumachi K., 2007. Anti-ageing effect of a lactococcal strain: analysis using senescence-accelerated mice // Br. J. Nutr. № 9; P. 1-9

256. Klaenhammer T.R., 1988. Bacteriocins of lactic acid bacteria. // Biochimie. V. 70. № 3. P. 337349.

257. Klaenhammer Т. R. 1993. Genetics of bacteriocins produced by lactic acid bacteria. // FEMS Microbiol Rev. Sep. V.12. № 1-3. P. 39-85.

258. Kok J., W. M. de Vos, 1994. The proteolitic system of lactic acid bacteria. In. M.J.Gasson and W.M. de Vos //Blackie Academic & Professionalal. Glasgow. UK. P.169-210.

259. Kondo J.K., Mc Kay L.L., 1985. Mytanolisin for improved lysis and rapid protoplast formation in dairy Streptococci// J. Dairy Scence. V. 65. P.1428-1431.

260. Kaneko H., Sakagnichi K., 1979. Fusion of protoplasts and genetic recombination of Brevibacterium flavum.ll V. 43. P. 1007.

261. Konings W.N, Kok J, Kuipers OP, Poolman В., 2000. Lactic acid bacteria: the bugs of the new millennium. // Curr. Opin. Microbiol. V.3 № 3. P. 276-282.

262. Kowalczyk M., J.Bardowsky, 2007. Regulation of sugar catobolism in Lactococcus lactis //Crutical Rev. in Microbiol. V. 33., P.l-13.

263. Lane H.E.D., Denhardt D.T., 1974. The rep Mutation // J. Bacterid. V.120. P.805-814.

264. Leblond-Bourget N. Philippe H., I Mangin, and В Decaris., 1996. 16S rRNA and 16S to 23S internal transcribed spacer sequence analyses reveal inter- and intraspecific Bifidobacterium phylogeny//Int. J. Syst. Bacterid. Jan.V. 46. P. 102 111.

265. Lee N.-K., Paik H.-D., 2001. Partial characteriszation of lacticin NK, a newly identifed baceriocin of Lactococcus lactis NK, isolated from Jeon-gal // Food Microbiol. V.18. P.17-24.

266. Lee, J-H., D.J. O'Sullivan., 2006. Sequence Analysis of Two Cryptic Plasmids from Bifidobacterium longum DJOIOA and Construction of a Shuttle Cloning Vector // Appl. Environ. Microbiol. V. 72. P.527-535

267. Lejeune R., Callewaert R., Crabbe K., De Vuyst L. 1998. Modelling the growth and bacteriocin production by Lactobacillus amylovorus DCE 471 in batch cultivation. // J. Appl. Bacterid. V. 84. P. 159-168.

268. Li H., D.J. O'Sullivan., 2002. Heterologous expression of nisin in a dairy Enterococcus strain // Appl. Environ. Microbiol. V. 68. P. 3392-3400.

269. Li Hong Jin Tao, 2005 . Study on the inhibition effect of nisin // J. Amer.Sci. V. l.№ 2. P.33-37.

270. Litchfild J.H., 1996. Microbiological production of lactic acid // Adv. Appl. Microbiol. V. 42. P.45-95

271. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Randal R.J., 1951. Protein measurement with the Foline phenol reagent. // J. Biol. Chem. V. 193. P. 265 275.

272. Mach F., 1980. Die fusion bacterieller protoplasten- ein nener gentrans for mechanisms bei procarioten. Biologishe Rundshan, V. 18, № 4, P. 209-220.

273. Maggio В., Ahong Q.F., Lucy J.A., 1976. Polyethylen glycol surface potenthial and coll fusion. Boochemical journal. V. 158, № 3, P. 647-650.

274. Marcrina F.L., Wood P.H., Jones K.R., 1980. Simple method for demonstrating small plasmid deoxyribonucleic acid molecules in oral Streptococci // Applied and Euvironment Microbiology, V. 39, P. 1070-1073.

275. Maren A., Klich., 2002. Identification of common Aspergillus species. CBS, The Netherlands. P. 116

276. Marmur L.J., 1961. A procedure for the isolation of deoxy-ribonucleic acid from microorganisms // J. Mol. Biol. V.3. P.208 218.

277. Martinez В., Suarez J.E., Rodriguez A., 1996. Lactococcin -972 A homodimeric lactococcal bacteriocin whose primary target is plasma membrane // Microbiology. P. 2393-2398.

278. Mattic A.T., Hirsch A., 1944. A powerful inhibitory substance produced by group N Streptococci //Nature. V.154P. 551.

279. Mayo В., 1993. The proteolytic system of lactic acid bacteria // Microbiologia. V.9. N.2. P.90-106.

280. Mercade, M., Lindley N. D., and Loubiere P. Metabolism of Lactococcus lactis subsp. cremoris MG 1363 in acid stress conditions // Int. J. Food Microbiol. 2000. V. 55. P. 161-165.

281. Montville T.J, Chen Y., 1998. Mechanistic action of pediocin and nisin: recent progress and unresolved questions. // Appl Microbiol Biotechnol. V. 50 № 5 P. 511-519.

282. Nes Ingolf F., Tagg John R., 1996. Novel lantibiotics and their pre-peptides. // Antonie van Leeuwenhok. V. 69. No. 2. P. 91-93.

283. Nes I.F., H. Holo., 2000. Class II antimicrobial peptides from lactic acid bacteria. // Biopolymers. V. 55. P. 50-61.

284. Nilson L.H., Huss H.H., Gram L., 1997. Inhibition of Listeria monocytogenes on cold-smoked salmon by nisin and carbon dioxide atmosphere// Int. J. Food Microbiol. V. 38. P. 217-227.

285. Nissen-Meyer J., I.F. Nes., 1997. Ribosomally synthesized antimicrobial peptides: their function, structure, biogenesis, and mechanism of action. // Arch. Biochem. Biophys. V. 167. P. 67-77.

286. Nomura M., Kobayashi M., Narita Т., Kimoto-Nira H., Okamoto Т., 2006. Phenotypic and molecular characterization of Lactococcus lactis from milk and plants // J. App.Microbiol. V.101. № 2. P. 396-405.

287. Norma de la Fuente Salcido, Ruben Salcedo-Hernandez, Ma. Guadolupe Alanis-Guzman, Denis K. Bideshi, J. Elezar Barbosa-Corona, 2007. A new rapid fluorogenic method for measuring bacteriocin activity. J. Microbiological Methods, V. 70: P. 196-199.

288. Novak L., M.Cocaign-Bousquet, N.D. Lindley, and P. Loubiere, 1997. Metabolism and enegetics of Lactococcus lactis during growth in various complex or synthetic media. //Appl. Environ. Microbiol. V. 63. P. 2665- 2670.

289. Novak L., P. Loubiere, 2000. The metabolic network of Lactococcus lactis: distribution of14 С — substates between catabolic and anaerobic pathways. J. Bacterid. V. 182. P. 1136-1143.

290. Nouaille S., Commisssaire J., Gratodoux J. J., Ravn P. et al., 2004. Influence of lipoteichoic acid d-alanylation on protein secretion in Lactococcus lactis as related random mutagenesis // Appl. Environ. Microbiol. V. 70. № 3 P. 1600- 1607.

291. Novitsky J.A., R.Y. Morita, 1976. Morphological characterization of small cells resulting from nutrient starvation in a psychrophilic marine vibrio. Appl. Environ. Microbiol. V. 32: P. 617-622

292. Oiao M., Omaetxebarria M.J., Ra R., Oruetxebarria ISaris P.E.J., 1997. Isolating of a Lactococcus lactis strain with high resistance to nisin and increased nisin production // Biotechnol. Lett. V. 19. P. 199-202.

293. Okamoto Т., Fujuta J.,R. Grir, 1983. Protoplast formation and regeneration of Streptococaes lactis cells, Agricaltural and Biological Chemistry,, V. 47, №2, P.259-263.

294. Okanishi M., Suruki K., Utezava H., 1974. Formation and revision of Streptomycete protoplasts a cultural condition and morphological stady, Journal of General Microbiology, V. 80, № 1, P.389-400.

295. Okuda K., Aso Y., Nagao J., Shioya K., Kanemasa Y., Nakayama J., Sonomoto K., 2005. Characterization of functional domains of lantibiotic-binding immunity protein, NukH, from Staphylococcus warneri ISK-1. FEMS Microbiology Letters. V. 250. P. 19-25

296. Olivia Mac Auliffe, R.Paul Ross, Colin Hill, 2001. Lantibiotic: structure, biosynthesis and mode of action//FEMS Microbiology Reviews. V. 25. P. 285-308.

297. Quiao M., Omaetxebarria M.J., Ra R, Oruetxebarria I., Saris P.E.J., 1997. Isolation of a Lactococcus lactis strain with high resistance to nisin and increased nisin production. Biotechnology Letters, V. 19. P. 199-202.

298. О'Sullivan D.J., 2000. Methods for analysis of the intestinal microflora. // Curr. Issues Intest. Microbiol. V. 1. P. 39-50

299. O'Sullivan D.J., 2001. Screening of intestinal microflora for effective probiotic bacteria. // J. Ag. Food Chem. V. 49. P. 1751-1760.

300. O'Sullivan L, Ross RP, Hill C., 2002. Potential of bacteriocin-producing lactic acid bacteria for improvements in food safety and quality // Biochimie. V. 84. № 5-6. P. 593-604.

301. Oxford A.E., 1945. Diplococci an antibacterial protein elaborated by certain milk streptococci. Biochem. V.38,№ 178. P.39.

302. Owen R.J., Hill L.R., Lapage S.P., 1969. Determination of DNA base compositions from melting profiles in dilute buffers // Biopolymers V. 7. P. 503-516.

303. Patnaik R, Louie S, Gavrilovic V, Perry K, Stemmer WP, Ryan CM, del Cardayre S., 2002. Genome shuffling of Lactobacillus for improved acid tolerance // Nat/ Biotechnol. V. 20. N. 7. P. 707712.

304. Parente E., Ricciardi A., 1999. Production, recovery, and purification of bacteriocins from lactic acid bacteria // Appl. Microbiol. Biotechnol V. 52. P. 628-638

305. Park S.H., Itoh K., Kikuchi E., Niwa H., Fujisawa Т., 2003. Identification and characteristics of nisin Z-producing Lactococcus lactis subsp. lactis isolated from Kimchi. // Curr Microbiol. V. 46. № 5. P. 385-8.

306. Phister T.G., O'Sullivan D.J., McKay L.L., 2004. Identification of bacilysin, chlorotetaine, and iturin A produced by Bacillus sp strain CS93 isolated from pozol, a Mexican fermented maize dough. //Appl. Environ. Microbiol. V. 70. P. 631-634.

307. Porgtharaqkui Т., Demirci A., 2006. Evalution of cultural medium for nisin production in a repeated-batch biofilm reactor // Biotchnol. Prog. V. 22. № 1. P. 217 224.

308. Power J.B., Cummins S.E., Cocking E.C., 1975. Experietia. V. 31. P. 1-28.

309. Powell I.I., Ward A.C, Hillier A.J., Davidson R.E., 1990. Simultaneous conjugal transfer in Lactacocats to genes involved in bacteriocin production and reduced susceptibility to bacteriophages // FEMS Microbiol. Lett. V. 72: P. 209-214.

310. Raper K.B., Fennell D.I., 1965. The genus Aspergillus. P. 302.

311. Ray В., Daeschnell M.A., 1992. Food biopreservatives microbial // Boca Raton CRC Press. P. 207-264.

312. Riley M.A, Wertz J.E., 2002. Bacteriocins: evolution, ecology, and application. // Annu Rev Microbiol. V.56. P.l 17-137.

313. Roberts R.F., Zottola E.A., 1993. Shelf-life ofpasteurizedprocess cheese spreads made from cheddar cheese manufactured with nisin-producing starter culture. // J. Dairy Sci. V.76. P. 1829-1836.

314. Rodriguez J.M., M.I. Martinez, N. Horn, H.M. Dodd, 2003. Heterologous production of bacteriocins by lactic acid bacteria // Int. J. Food Microbiol. V.80. P.l01-116.

315. Ross R.P., Galvin M., McAuliffe O., Morgan S.M., Ryan M.P., Twomey D.P., Meaney W.J., Hill C., 1999. Developing applications for lactococcal bacteriocins // Antonie van Leeuwenhoek. V.76. P.337-346.

316. Rossa P., S. Morgana, C. Hillb., 2002. Preservation and fermentation: past, present and future // Int. J. Food Microbiol. Issues 1-2,15 November 2002, V. 79. P. 3-16.

317. Rossland E., Andersen Borge GI, Langsrud T, Sorhaug Т., 2003. Inhibition of Bacillus cereus by strains of Lactobacillus and Lactococcus in milk. // Int J Food Microbiol. V.89. № 2-3. P.205-212.

318. Ryan M.P., R.W. Jack, M. Josten, H.G. Sahl, G. Jung, R.P. Ross, C. Hill., 1999. Extensive post-translational modification, including serine to d-alanine conversion, in the two-component lantibiotic, lacticin 3147. J. Biol. Chem. V.274. P.37544-37550.

319. Sailaja Chandrapati, Daniel J. O'Sullivan., 1999. Nisin independent induction of the nisA promoter in Lactococcus lactis during growth in lactose or galactose // FEMS Microbiology Letters Volume 170. Issue 1. January V.l. P. 191-198.

320. Sahl H.G., Kordel M., Benz R., 1987. Voltage-dependent depolarization of bacterial membranes and artificial lipid bilayers by the peptide antibiotic nisin // Archive Microbiology. V.149. P.120- 124.

321. Sahl H.G., BierbaumG., 1998. Lantibiotics: biosynthesis and biological activities of uniquely modified peptides from Grampositive bacteria // Annual Review of Microbiology. V.52. P.41—79.

322. Sancher Rivas Carmen, 1982, Direct selection of comlementing diploid from PEG- induced fusion of Вас. subtilis protoplasts //Molecular and General Genetic. V.l 82, P.322.

323. Sander M.E., Leonhard P.J., Sing V.V.D., Klaenhainmer T.R., 1986. Conjugal strategy for construction of fast acid-producing, bacteriophage-resistant lactic streptococci for use in dairy fermentations // Appl. Environ. Microbiol.V.52. P.1001-1007.

324. Stein Т., Heinzmann S., Dusterhus S., Borchert S., Entian K.D., 2005. Expression and functional analysis of the subtilin immunity genes spalFEG in the subtilin-sensitive host Bacillus subtilis MO 1099 // J. Bacteriology. V.187. P.822-828.

325. Stein Т., Heinzmann S., Solovieva I., Entian K.D., 2003. Function of Lactococcus lactis nisin immunity genes nisi and nisFEG after coordinated expression in the surrogate host Bacillus subtilis // J. Biological Chemistry. V.278. P.89-94.

326. Steimoen H., Teigen A., Havarstein L.S., 2003. Competence-induced cells of Streptococcus pneumoniae lyse competence-deficient cells of same strain during co-cultivation // J. Bacteriology. V.185. P.7176-7183.

327. Schleifer K.H., 1987. Recent changes in the taxonomy of lactic acid bacteria // FEMS Microbiol. Rev. V.46.P.201-203.

328. Schleifer K.H., Ludwig W., 1989. Phylogenetic relationships among bacteria. In: Fernholm В. Bremer. K., Jornwall H. (eds.) The hierarchy of life //Amsterdam. Elsevier. P. 103-117.

329. Sirisansaneeyakul S., Hopolito C.N., Kobaashi G., Lertsiri S., Luangpipuksa P.,.Varavinit S., Ishrizaki A., 1998. Kinitic modeling of. lactis acid fermentation from sago starch using Lactococcus lactis Ю-1 // Annu. Rep. ICBiotech. V. P. 504-524

330. Sirisansaneeyakul S., Luangpipipat T.,.Vanichsriratana W, Srinophakun Т., Henry Ho-Hsien Chen, Chisti Y., 2007. Optimization of lactis acid production by immobilized Lactococcus lactis IO-l //.J. Ind Microbiol Biotechnol, V. 34: P. 381-391

331. Stoyanova L.G., Baranova I.P., Egorov N.S., Kudriyschov V.L., 1995. Effect of aeration on Lactococcus lactis //Intern. Congress 'Food. Ecology. Human" Russia. Moscow. Dec. 1995. P. 41

332. Stuart M.R., L.S. Chou, B.C. Weimer, 1999. Influence of carbohydrate starvation and arginine on culturability and amino acid utilization of Lactococcus lactis subsp. lactis. Appl. Environ. Microbiol. V. 65. P.665-673.

333. Simon D., Chopin A., 1988. Construction of a vector piasmid family and its use for molecular cloning in Streptococcus lactis /Biochimie. V. 70: P.559-567.

334. Shehard S.K., 1978. The remove of glucose from egg white before the drying //Nahury. №1 P.3-9.

335. Smid E.J., Poolman В., Konings W.N., 1991. Casein utilization by lactococci // Appl. Environ. Microbiol. V.57. N 9. P. 2447-2452

336. Solem С, Koebmann В, Yang F, Jensen PR., 2007. The las enzymes control pyruvate metabolism in Lactococcus lactis during growth on maltose // J. Bacteriol. 2007 Jul 6;

337. Somers E.B., Sandine W.E. Aytes J.W., 1990. Antibotulinal effectiveness of nisin in pasteurized process cheese spreads // J. Food Prot., V. 50 № 10. P. 842-848.

338. Stackebrandt E., Teuber M., 1988. Molecular taxonomy and polygenetic position of lactic acid bacteria // Biochemie. V.70. P.317-324.

339. Stiles M.E., 1996. Biopreservation by lactic acid bacteria // Antonie van Leeuwenhoek, V. 70. P. 331-345.

340. Swearingen P.A., O'Sullivan D.J., Warthesen J.J., 2001. Isolation, characterization and influence of native nonstarter lactic acid bacteria in Cheddar cheese quality // J. Dairy Sci. V.84. P.50-59.

341. Szabo E.A., Cahill M.E., 1998. The combined affects of modified atmosphere, temperature, nisin and ALTA™2341 on the growth of Listeria monocytogenes II Int. J. Food Microbiol V. 43. P.21-31.

342. Tagg J.R., A.R. McGiven, 1971. Assay system for bacteriocins // Appl. Microbiol. V.21. P.943.

343. Tahara Т., Oshimura M., Kanatani K., 1996 Mode of action of acidocin 8912 // Lett. Appl. Microbiol. V.23. № 3. P.192-194.

344. Tanaka N., Traisman E., Plantinga P., Finn L., Flom W., Meske L., Guggisberg J., 1986. Evaluation of factors involved in antibotulinal properties of pasteurized process cheese spreads // J. Food Prot V.49 № 7. P.526-531.

345. Taylor S.L., Sombers E.B., 1985. Evaluation of the antibotulinal effectiveness of nisin in bacon // J. Food Prot. V.48. P.949-952.

346. Taylor S.L., Somers E.B., Krueger L.A., 1985 Antibotulinal effectiveness of nisin-nitrite combinations in culture medium and chicken frankfurter emulsions // J. Food Prot. V.48. P.234-239.

347. Tian Shaofang, Niu Zhongcxiang, Chang Weishan., 2003. Research of Lactic acid bacterial bacteriocin. // China J.Microbiology.V.23. № 6. P.47-49.

348. Todd I., Talarico, Dobrogosez Walter J., 1989. Chemical Characterization of an antimicrobal substance produced by Lactobacillus reuteri II Antimicrobal Agents and Chemotherapy. V.33.N.5. P.674-679.

349. Tugene F.J., Hirshmann D.J.,1944. Subtilin- an antibacterial product of Bacillus subtilis. Culturing couditions and properties // Archives of Biochemistry. V.4. P.297-309

350. Twomey D., Ross R.P., Ryan M., Meaney В., Hill C., 2002. Lantibiotics produced by lactic acid bacteria: structure, function and applications 11 Antonie van Leeuwenhoek. V. 82. P. 165-185.

351. Vademuthu E.B., Henderson J.T., Vandenbergh P.A., 1994. Multiple bacteriocin producing Lactococcus and composition.//Pat. US. № 5,348,881. C1.C12N 1/12,435/252.3. 435/252.4.

352. Vegarud G., Castherg H.B., and Langsrud T. Autolysis of group N streptococci. Effect of media composition modification and temperature 11 J. Dairy Sci. 1993. V. 66. P. 2294-2303.

353. Van Belkum M.J., Stiles M.E., 2000. Nonlantibiotic antibacterial peptides from lactic acid bacteria. Natural Product// Current Opinion in Biotechnology V. 17. P. 323-335

354. Van den Hooven H.W., Lagenwerf F.M., Herma W., 1996. The structure of lantibiotic lacticin 481 produced by Lactococcus lactis. Location of the thiother bridges // Antonie van Leeuwenhoek. V.69. P.317-321.

355. Venema K., Abee Т., Haandrikman A.J., Leenhouts K.J., Kok J., Konings W.N., Venema G., 1993. Mode of action of lactococcin B, a thiol-activated bacteriocin from Lactococcus lactis. Applied and Environmental Microbiology, V.59, P.1041-1048.

356. Wang S. Y., Dockerty T.R., Ledford R.A., Stouffer J.R., 1986. Shelf-life extension of vacuum packaged frankfurters made from beef inoculated with Streptococcus lactis II J. Food Prot. V.49. P.130-134.

357. WangH., Baldwin К. А., О'Sullivan D. J., McKay L.L., 2000. Identification of a genecluster encoding Krebs cycle oxidative enzymes linked to the pyruvate carboxylase gene in Lactococcus lactis ssp lactis C2 // J. Dairy Sci. V.83. P.1912-1918.

358. Wee Y.I., Kim J.N., Ryu H.W., 2006. Biotechnological production of lactic acid and its recent applications // Food Technol. Biotechol. V.44. P.l63-172.

359. Wessels S., 1993. Food-grade g enetic modification of dairy bacteria. PhD thesis // The Royal Veterinary and Agricultural University and The Danish Academy of Technical Sciences, Denmark.

360. Wessels S., Huss H.H., 1996. Suitability of Lactococcus lactis subsp lactis ATCC 11454 as a protective culture for lightly preserved fish products // Food Microbiol. V.13. P.323-332.

361. Widemann I., Bottiger Т., Bonelli R., Schneide Т., Sahl H., Martinez B. 2006. Lipid II-Based Antimicrobial Activity of the Lantibiotic Plantaricin C//Appl. Env. Microdiol. 72, 2809-2814.

362. Willey M., van der Donk W. 2007. Lantibiotics: Peptides of Diverse Structure and Function// Annu. Rev. Microbiol. 61, 477-501.

363. Woojin S. Kim, Ji Hyeon Park, Jun Ren, Ping Su, and Noel W. Dunn., 2001. Survival Response and Rearrangement of Plasmid DNA of Lactococcus lactis during Long-Term Starvation .// Appl. and Environ. Microbiol. V. 67. No. 10. P. 4594-4602.

364. Wouters J.A., Kamphuis H.H., Hugenholtz J., Kuipers O.P., de Vos W.M., Abee T. Changes in glycolytic activity of Lactococcus lactis induced by low temperature // Appl. Environ Microbiol. 2000. V. 66. N9. P. 3686-3691.

365. Yamauchi К. Biologically functional proteins of milk and peptides derived from milk proteins // Bulletin of the IDF. 1992. 272. P. 51-58.

366. Yang J., D J. O'Sullivan., 2006. Involvement of the LlaKR2I methylase in the expression of the AbiR bacteriophage defense system in Lactococcus lactis ssp. lactis biovar diacetylactis KR2 // J. Bacterid. V.188. P. 1920-1928.

367. Yeeh Y., Jo Y.B., Kwon Oh Chang, 1996. Protoplast fusion of Lactobacillus casei and Lactobacillus acidophilus II Biotech.Lett. V.18. №.7. P.805-808

368. Yildirim Z., Yildirim M., Johnson M.G., 2004. Mode of action of lactococcin R produced by Lactococcus lactis R. //Nahrung V.48. № 2. P. 145-148.

369. Yin J., Seo K.Y., Loechler E.L., 2004. A role for DNA polymerase V in G T muyatin from the major benzoa.pyrine N2-dG adduct when studied in a 5'-TGT sequence in E.coli // ELSEVIER. V.4. P.323-334.

370. Yother J., Trieu-Cuot P., Кlaenhammer T. R., D e V os W.M., 2 002. Genetics оfstreptococci, lactococci and enterococci: review of the sixth international conference I I J. Bacteriol. V.184. P.6085-6092.

371. Yu W.K., Gilles J.K.,Kondo J.R.,Broadbent McKay L.LI, 1996. Lost of plasmid mediated oligopeptide transport systemin lactococci anothereason for slow milk coagulation // Plasmid. V.35. P.145-155.

Информация о работе

Стоянова, Лидия Григорьевна
доктора биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.07

Диссертация

Новые бактериоцины лактококков и их практическое использование - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы