Синтез антибиотического комплекса широкого спектра действия лактококком Lactococcus lactis subsp. lactis 194-K

Устюгова, Екатерина Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Синтез антибиотического комплекса широкого спектра действия лактококком Lactococcus lactis subsp. lactis 194-K
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Синтез антибиотического комплекса широкого спектра действия лактококком Lactococcus lactis subsp. lactis 194-K"

На правах рукописи

ООбОЬАил«

(і

Устюгова Екатерина Александровна

СИНТЕЗ АНТИБИОТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА ШИРОКОГО СПЕКТРА ДЕЙСТВИЯ ЛАКТОКОККОМ ЬАСТОСОССШ ЬАСПБ виВвР. ЬАСТ1Б 194-К

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 5 ОКТ 2012

Москва - 2012

005054026

Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета ФГБОУ ВПО Московского государстенного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор биологических наук

Стоянова Лидия Григорьевна

Научный консультант: доктор химических наук, профессор

Катруха Генрих Степанович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Ушакова Нина Александровна

Федеральное государственное учреждение науки институт проблем экологии и эволюции имени А.Н.Северцова РАН, зав. лабораторией инновационных технологий

кандидат биологических наук Загустииа Наталья Алексеевна Федеральное государственное учреждение науки институт Биохимии имени А.Н. Баха РАН, старший научный сотрудник

Ведущая организация: Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности РАСХН

Защита состоится 27 ноября 2012 г. в 15.30 на заседании диссертационного совета Д 501.001.21 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д.1, стр.12, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, биологический факультет, ауд. М-1.

Тел: 8 (495) 939-54-83, эл. почта: npiskunkova@rambler.ru

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «_» _2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, г

кандидат биологических наук Пискункова Н.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Молочнокислые бактерии (МКБ) уже более ста лет привлекают внимание исследователей. Исторически в ядро этой группы включены бактерии, относящиеся к родам Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Pediococcits и Leuconostoc (Albano et al., 2007). Род Lactococcus, тесно ассоциированный с пищевыми продуктами, является одним из самых значимых среди них (Holzapfel et al., 2001), а некоторые виды лактококков относятся к симбионтной микробиоте человека, в связи с чем были удостоены статуса «GRAS» (Generally Regarded As Safe).

Исследования последних десятилетий выявили способность МКБ образовывать антимикробные вещества различной природы, которые могут стать альтернативой существующим антибиотикам и консервантам. Наиболее изученной из них является группа антибактериальных пептидов - бактериоцинов, разнообразных по уровню активности, спектру и механизму действия (Cascales et al., 2007). Бактериоцины легко расщепляются ферментами пищеварительного тракта, и поэтому они могут заменить традиционные химические консерванты (Nes et al., 2007). Бактериоцин низин, образуемый Lactococcus lactis, с успехом используют для увеличения сроков годности продуктов питания в пищевой промышленности многих стран уже более 50 лет (Cleveland et al., 2001). Но применение низина, как и других бактериоцинов, ограничивается относительно узким спектром его антимикробного действия и появлением устойчивых к нему форм пищевых патогенов (Kaur et al., 2011).

Особую значимость молочнокислые бактерии приобрели после открытия способности к продукции фунгицидных веществ (Schntirer et al., 2005). Получение новых штаммов МКБ, обладающих антибактериальной и фунгицидной активностью, в перспективе может решить проблему не только порчи продуктов питания, но и лечения ряда инфекционных заболеваний (Marteau et al., 2003; Rouse et al., 2008). Хорошо изучены фунгицидные вещества, образуемыми бактериями рода Lactobacillus (Yang et al., 2010), тогда как наличие фунгицидной активности среди бактерий рода Lactococcus является очень редким и малоизученным свойством, а о природе фунгицидных веществ почти ничего неизвестно (Florianowicz et al., 2001; Стоянова и др., 2007). В этой связи выделение, изучение свойств и синтеза новых антибактериальных и фунгицидных антибиотиков, образуемых лактококками, а также исследование перспективы их применения имеет фундаментальный и практический интерес. Возросший спрос медицины и пищевой промышленности в новых безопасных

антимикробных препаратах с широким спектром действия обуславливает актуальность данного исследования.

В процессе поиска штаммов лактококков, обладающих широким спектром бактерицидного и фунгицидного действия, на кафедре микробиологии МГУ имени М.В. Ломоносова из коровьего молока Бурятии был выделен штамм Lactococcus 1actis subsp. lactis 194 (Стоянова и др., 2006). Однако химическая природа активных компонентов, продуцируемых!, lactis subsp. lactis 194, и особенности их синтеза не были изучены. Данная работа посвящена выделению и установлению химической природы антибиотических веществ, образуемых L. lactis subsp. lactis 194, изучению их синтеза, а также исследованию возможности их практического применения. Цель и задачи работы

Цель исследования: изучение синтеза антибиотического комплекса широкого антимикробного спектра действия, образуемого активным вариантом штамма Lactococcus lactis subsp. lactis 194-K.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить диссоциацию штамма Lactococcus lactis subsp. lactis 194 с целью выделения наиболее активного продуцента.

2. Разработать условия выделения и очистки антибиотических веществ, образуемых активным вариантом штамма L. lactis subsp. lactis 194-K.

3. Изучить физико-химические и биологические свойства индивидуальных антибиотиков, установить их химическую природу.

4. Изучить синтез антибиотического комплекса штаммом L. lactis subsp. lactis 194-К и подобрать оптимальную среду культивирования.

5. Испытать эффективность штамма 194-K in vivo на моделе спонтанного хронического дерматоза.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Получен активный вариант штамма Lactococcus lactis subsp. lactis 194-K, образующий сложный антибиотический комплекс широкого бактерицидного и фунгицидного спектра действия.

2. Разработаны способы выделения и очистки антибиотиков, образуемых активным вариантом 194-К.

3. Установлен состав антибиотического комплекса: наряду с известным бактериоцином низином А, обнаружен новый бактериоцин 194-D, а также два антибиотика гидрофобной природы (194-А и В), которые являются новыми биологически активными

веществами.

4. Эксперименты на мышах линии CBRB-Rb (8.17)llem показали эффективность штамма

194-К для лечения воспалительных заболеваний кожи. Научная новнзна и практическая значимость работы:

1. Изучена диссоциация штамма Lactococciis lactis subsp. ¡actis 194 и выделен активный вариант 194-К, продуцирующий антибиотический комплекс с широким спектром антибактериального и фунгицидного действия.

2. Разработана схема выделения и очистки антибиотического комплекса и его отдельных антибиотиков, относящихся к разным классам органических соединений.

3. Впервые показано, что штамм L. lactis subsp. lactis 194-К наряду с низином образует новый бактериоцин 194-D, а также два антибиотика гидрофобной природы (194-А и В), не имеющие аналогов в базе данных природных биологически активных веществ (BNPD).

4. Изучено влияние оптимизированных ферментационных сред различного состава на синтез фунгицидного антибиотика 194-А и нового бактериоцина 194-D. Подобрана оптимальная для их продукции среда.

5. Показана эффективность штамма 194-К для уменьшения степени выраженности симптомов хронического дерматоза у мышей линии CBRB-Rb (8.17) 1 lern.

Практическая значимость работы заключается в получении активного варианта штамма L. lactis subsp. lactis 194-К, разработке схемы выделения новых антибиотиков, перспективных для использования в пищевой промышленности и медицине. Доказана эффективность перорального применения штамма 194-К для лечения воспалительных заболеваний кожи. Апробация работы ч публикации

Результаты диссертационной работы были представлены на международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009», «Ломопосов-2012» (Россия, Москва 2009, 2012); симпозиуме «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Россия, Москва, 2009); III-й научно-практической конференции «Перспективы развития инноваций в биологии» (Россия, Москва, 2009); III -й Международной конференции «International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology» (Португалия, Лиссабон, 2009); VII-й Международной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Беларуссия, Минск, 2010); VI-м Московском международном конгрессе «Биотехнология, состояние и перспективам развития» (Россия, Москва, 2011); Международной научно-практической конференции «Фармацевтическая и медицинская

биотехнология» (Россия, Москва, 2012); ежегодном международном конгрессе «Инфекционные заболевания» (Россия, Москва, 2012).

Диссертация апробирована на заседании кафедры микробиологии Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, среди которых 6 статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации

Работа изложена на 130 страницах машинописного текста, содержит 17 таблиц и 32 рисунка. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 258 отечественных и зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ В обзоре литературы представлены сведения об антимикробных метаболитах молочнокислых бактерий. Особое внимание уделено рассмотрению многообразия бактериоцинов и фунгицидных веществ, их спектру и механизму антибактериального действия. В отдельных главах рассмотрены перспективы применения молочнокислых бактерий и их метаболитов в пищевой промышленности и медицине.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе использовали штамм Lactococcus ¡actis subsp. lactis 194, выделенный из коровьего молока Бурятии (Стоянова и др., 2006). Штамм был лиофилизирован и хранился в условиях бытового холодильника. Культуру восстанавливали в обрате в стационарных условиях при 28°С. Из обрата бактерии пересевали в посевную среду, приготовленную на водопроводной воде с дрожжевым экстрактом (20 г/л) и глюкозой (10 г/л), pH среды устанавливали 6,8-7,0. Затем посевной материал вносили в ферментационную среду, содержащую в (г/л): сахароза - 20,0; КН2РО4 - 20,0; NaCl - 2,0; MgSOi - 0,2; дрожжевой экстракт- 20,0; рН=6,8-7,0 (Стоянова и др., 2006). На данной ферментационной среде изучали диссоциацию штамма 194 с целью выделения активного варианта; антимикробный спектр действия выделенного варианта штамма 194-К, динамику его роста и накопления антибиотика. Разрабатывали схему выделения и очистки отдельных антибиотиков для изучения их биологических и физико-химических свойств. Изучали влияние ферментационных сред различного состава на синтез антибиотиков штаммом 194-К. Антибиотическую активность определяли методом диффузии в агар с измерением зоны подавления роста тест-культуры Bacillus coagulans в мм (Егоров, 2004).

Диссоциацию культуры L. lactis subsp. lactis 194 изучали на твердой ферментационной среде с добавлением 2% агара. Отбор наиболее активных по уровню антибиотической активности клонов лактококков проводили методом рассева бактериальной суспензии с последующим отбором колоний разной морфологии (Милько и др., 1991). Спектр антнмикробного действия L. lactis subsp. lactis 194-К на разные группы микроорганизмов определяли, используя в качестве стандартов низин, левомицетин и нистатин. В качестве тест-культур использовали микроорганизмы музея кафедры микробиологии ФГБУ ВОП МГУ имени М.В. Ломоносова и ФГБУ НИИ по изысканию новых антибиотиков имени Г.Ф. Гаузе РАМН.

Экстракцию антибиотиков из культуральной жидкости штамма 194-К и их фракционирование проводили по схеме, представленной на рис. 7. Культуральную жидкость обрабатывали смесью ацетон - уксусная кислота - культура (4:1:5) при 55°С в течение 1.5 ч (Стоянова и др., 2007). Полученный экстракт упаривали в вакууме, к оставшемуся водному концентрату добавляли избыток метанола для осаждения части антибиотиков (рис. 7). Осадок отделяли от маточного раствора и получали фракцию I (осадок, порошок-сырец) и фракцию II - водный остаток. Извлечение гидрофобных антибиотиков (194-А и В) из фракции II проводили экстракцией н-бутанолом. Разделение антибиотиков 194-А и В, содержащихся в бутанольном экстракте, проводили с помощью колоночной хроматографии на силикагеле («Мегск», Германия); элюцию осуществляли органическими растворителями в следующей последовательности: хлороформ, хлороформ-метанол (1:1), метанол.

Выделение антимикробных пептидов проводили из порошка-сырца (рис. 7) методом препаративного изоэлектрофокусирования (ИЭФ; Sova, 1990). Напряжение в приборе для ИЭФ изменяли следующим образом: 1 ч - 200 В, 4 ч - 400 В, следующие 19 ч - 250 В. По окончании процесса содержимое ячеек собирали и упаривали на роторном испарителе «Rotavapor-R BUchi» (Швейцария). Сухой остаток растворяли в 0.1 % растворе трифторуксусной кислоты (ТФУ).

Все фракции (спиртовые концентраты, маточники, осадок) на каждой стадии выделения анализировали на присутствие антибиотических веществ, используя тест-культуры Bacillus subtilis и Aspergillus niger, а также с помощью ТСХ и электрофореза с последующей биоавтографией. Очистку антибиотиков (194-А и 194-D) от примесей проводили с помощью ОФ-ВЭЖХ на микроколоночном хроматографе «Милихром А-02» (ЗАО «Эконова», Россия). Антибиотик 194-В был очищен с помощью картриджей Диапак-С8 (ЗАО «БиоХимМак СТ», Россия). Полученные индивидуальные антибиотики 194-А, 194-В,

194-D анализировали с помощью ИК-спектроскопии, масс-спектрометрии, а также устанавливали спектр их антимикробного действия.

Электрофорез проводили на бумаге Filtrak F-14 на V-образном приборе Durruma при 550 В в течение 150 мин в 30%-ой уксусной кислоте с pH 1,7.

ТСХ проводили на пластинках DC Alufoilien Kieselgel-60 ("Merck", Германия) размером 15x15 см в системе растворителей хлороформ-бензол-метанол (30:20:7).

Биоавтографию выделенных антибиотиков проводили по известной методике с использованием тест-организма В. subtilis АТСС 6633 (Haese, Keller, 1989). ОФ-ВЭЖХ анализ проводили на микроколоночном жидкостном хроматографе Милихром А-02 (ЗАО «Эконова», Россия), термостатируемом при 35"С, с колонками из нержавеющей стали размером 2.0x75.0 мм, заполненных сорбентом Prontosil 120-5C18AQ или Nucleosil 300-5С4 («Macherey-Nagel», Германия). В работе использовали линейный градиент подвижной фазы, создаваемый элюентом А (0.1%-ный раствор ТФУ в воде) и элюентом В (0.1%-ный раствор ТФУ в ацетонитриле) при скорости потока 100 мкл/мин. Реагенты готовили с применением воды высшей степени очистки (18.1 Мом/см), полученной на установке Milli-Q®Plus («Millipore», Франция). Детектирование разделяемых веществ осуществляли при нескольких длинах волн 214, 250 и 270 нм в градиенте концентрации элюента В (от 0 до 80-100%); время анализа составляло 20-25 мин для каждой пробы. Контрольным образцом был низин А, растворенный в 0.1%-ной ТФУ, с концентрацией 1 мг/мл. Объем вводимых проб составлял 10-15 мкл. Полученные в ходе ОФ-ВЭЖХ анализа фракции, соответствующие отдельным пикам, были собраны. Антибиотически активные фракции анализировали с помощью физико-химических и биологических методов. Спектр антимикробного действия веществ, содержащихся во фракциях, определяли дисковым методом.

UV-VIS-спектры снимали на спектрофотометре Shimadzu UV-1601 PC UV-Visible Spectrophotometer (Japan).

Масс-спектры антибиотиков были получены на приборе Ultraflex II MALDI ToF/ToF "Bruker Daltonics" (Германия), оснащенном УФ-лазером 355 нм (Nd) в режиме получения положительных ионов с использованием рефлектрона. Точность измеренных масс составляла 0.001 %.

ИК-спектры выделенных антибиотиков получали на приборе ИК-Фурье спектрометре Nicolet-iS10 (Thermo Fisher Scientific, США) с использованием детектора DTGS, светоделителя КВг, и приставки Smart Performer, оснащенной ZnSe кристаллом. Измерение

проводили при разрешении 4 см"1; зона спектра 3000-650 см"'. Спектры обрабатывали с использованием программы OMNIC -7.0.

Аминокислотный состав антимикробных пептидов, полученных в ходе ОФ-ВЭЖХ анализа, определяли методом ионно-обмеиной хроматографии на аминокислотном анализаторе «Hitachi L-8800» (Япония) после полного кислотного гидролиза при следующих условиях: НС1ко„ц.:ТФУ (2:1) с добавлением 0.01%-ного раствора ß-меркаптоэтанола в течение 1 ч при 155°С. Объем вводимой пробы на колонку - 95 мкл (Spackman et al., 1958). Изучение влияния Ферментационных сред на синтез антибиотического комплекса, образуемого штаммом L. lactis subsp. /actis 194-К, проводили с использованием сред различного состава (г/л): среда №1: глюкоза - 20,0; гидролизат казеина - 20,0; дрожжевой экстракт - 10,0; КН2Р04- 30; MgS04 - 0,2 (Tagg et al., 1976). №2: меласса - 20,0; дрожжевой экстракт - 20,0; NH4H2P04- 20,0; K2S04- 10,0 (Кудряшов и др., 1995). №3: меласса - 20,0; дрожжевой экстракт - 20,0; КН2Р04- 20,0 (Егоров и др., 1986). №4: пептон - 4,5; сахароза -10,0; дрожжевой экстракт - 10,0; КН2Р04 - 28,4; MgS04 - 0,2; NaCl - 2,0 (Li et al., 2002). №5: глюкоза - 25,0; пептон - 10,0; дрожжевой экстракт - 10,0; ацетат натрия - 15,0; цитрат Na - 15,0; К2НР04 - 5,0; Na2 S04 - 10,0 (Hirsh, 1981). №6: сахароза - 20,0; дрожжевой экстракт - 20,0; КН2Р04- 10,0; NaCl - 2,0; MgS04- 0,2 (Стоянова и др., 2006). №7: сахароза -20,0; гидролизат казеина - 10,0; дрожжевой экстракт - 5,0; К2НР04- 2,0; ацетат натрия - 5,0; MgS04 - 0,2; MnS04 - 0,5 (de Mann et al., 1960). №8: сахароза - 26,8; триптон -5,0; дрожжевой экстракт - 10,0; твин-80 - 3,0; MgS04- 0,2; NaCl - 8,1; К2НР04-1,91 (Zhou et al., 2008). Лактококки культивировали в стационарных условиях при 28°С. pH во всех средах устанавливался на уровне 6,5-6,8. Ферментационная среда №6 являлась контрольной.

Количественное содержание бактериоцина 194-D определяли с помощью ОФ-ВЭЖХ анализа по высоте соответствующего ему пика и выражали в оптических единицах в мл культуральной жидкости. Количественное содержание антибиотика 194-А определяли по фунгицидной активности в отношении A. niger в спиртовых концентратах бутанольных экстрактов и выражали в единицах активности по нистатину в мл культуральной жидкости. Изучение влияния штамма Lactococcus lactis subsp. Iactis 194-К на проявление симптомов дерматоза проводили на самцах мышей линии CBRB-Rb (8.17) llem (Моисеева и др., 2009) в возрасте 23,0±1,3 недели, являющихся адекватной моделью спонтанных хронических заболеваний кожи - дерматозов, типа импетиго, эктимы, синдрома ошпаренной кожи. Мыши содержались в стандартных условиях вивария (вне SPF-specific pathogen free барьера). Животных кормили полнорационными гранулированными кормами. В качестве стандартной подкормки использовали зерновые каши (5 г на мышь в день) с добавлением

подсолнечного масла и витаминов А, Е, D, F; воду предоставляли без ограничений. Самцам опытной группы (п=17) ежедневно в течение двух недель добавляли к подкормке культуру лактококка 194-К по 300 мкл на мышь в день. Оценку проявления симптомов дерматоза проводили двойным слепым методом один раз в неделю у всех мышей индивидуально. Регистрировали следующие параметры: 1) степень изъязвления кожи на спине по 7-ми бальной шкале; 2) степень проявления алопеции на спине по 7-бальной шкале; 3) площадь пораженного участка спины, мм2.

Статистическую обработку результатов исследований проводили с помощью программы Excel. Данные представляли как среднее ± стандартная ошибка среднего; статистическую значимость различий определяли по общепринятой методике с использованием t-критерия Стьюдента. Достоверность различий соответствовала р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Изучение диссоциации штамма Lactococcus lactis subsp. lactis 194 и отбор наиболее активного диесоцианта

При изучении диссоциации на твердой ферментационной среде было установлено, что штамм L. lactis subsp. lactis 194 диссоциировал на G (мелкие, прозрачные колонии) с активностью от 3600 до 4000 МЕ/мл (по низину) и S (крупные, белые колонии) с активностью от 2600 до 3600 МЕ/мл (по низину). Были отобраны несколько колоний с разным уровнем антибиотической активности (табл.1). Наиболее активным диссоциантом был вариант, полученный из колонии №14, далее обозначенный как штамм L. lactis subsp. lactis 194-К. Штамм 194-К обладал широким спектром антимикробного действия, эффективно подавлял рост грамположительных (Bacillus subtilis, В. coagulans, В. mycoides, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus), грамотрицательных бактерий (E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Comamonas terrigena) и обладал фунгицидной активностью в отношении грибов Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum и дрожжей Candida tropicales, Rhodotorula aurantiaca, что является редким и малоизвестным биологическим свойством для L. lactis subsp. lactis. Общая антибиотическая активность штамма 194-К в отношении грамположительных бактерий составляла 4100±132 МЕ/мл по низину, что было на 57% больше по сравнению с активностью диссоцианта колонии № 17 (рис. 1), активность в отношении грамотрицательных бактерий - 1630±115 ед/мл по левомицетину, а его фунгицидная активность составила 1751 ±93 ед/мл по нистатину.

Табл. 1

Рост и антибиотическая активность разных колоний штамма ЬасЮсоссиэ 1асИэ виЬвр. /ас<м 194 за 20 ч инкубирования (тест-организм В. coagulans)

Низашшн 10 и 20 мкг/мл

Колония№14 Рис- Зоны подавления роста Bacillus coagulans диссоциантами штамма L. lactis subsp. /actis 194, полученными из колоний Колония№17 №14 и 17.

№ колонии Морфология pH ОП540 Антибиотическая активность, МЕ/мл

10 короткие цепочки кокков (до четырех) 4,3 1,0 3000±180

14 отдельные клетки и цепочки кокков 4,5 1,15 4100±132

17 отдельные клетки и цепочки из 4-8 кокков 4,5 1,05 2600±155

18 короткие цепочки кокков и отдельные кокки 4,3 0,85 2700±137

19 отдельные кокки и цепочки из 6-10 клеток 4,6 0.89 3600Ü75

20 отдельные кокки и цепочки разной длины 4,2 0,83 3100±144

21 отдельные кокки и цепочки разной длины 4,4 1,0 3000±100

Выделение, очистка и идентификация антибиотических веществ, продуцируемых культурой Lactococcus lactis subsp. lactis 194-K

В процессе нашего исследования была разработана схема выделения антибиотического комплекса, а также разделения и очистки его отдельных компонентов (рис. 7). В связи с тем, что часть антибиотиков всегда связана с клетками продуцента (Hurst, 1981; Yang et al., 1992), мы провели обработку культуры ацетон-уксусной смесью, цель которой заключалась в десорбции антибиотиков из клеток. После осаждения метанолом с последующим отделением осадка культуральная жидкость штамма 194-К была разделена на две фракции.

Биологический анализ фракций I и II (рис. 2) показал, что обе фракции содержали вещества, активные в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, а фракция II обладала фунгицидной активностью. В результате хроматографического исследования полученных фракций было установлено, что фракция I содержала два полярных вещества, одно из которых мигрировало к аноду и имело пептидную природу (рис. 26). Фракция II включала два электронейтральных вещества, одно из них с ^=0,55-0,6 обладало выраженными гидрофобными свойствами (рис. 2а). Таким образом, в маточном растворе от осаждения (фракция II) были обнаружены гидрофобные антибиотики, а в осадке антибиотики пептидной природы (фракция I).

Основной компонет, RH),55-0,6 (194-А и В)

Минорный компонент, RH), 15-2,0 (194-Е)

Низин А

Линия старта

Фракция I (194-С и D)

Линия старта

Фракция II (194-А и В)

Фракция I Фракция II а

Рис. 2. Биоавтография компонентов антибиотического комплекса, образуемого L. lactis subsp. lactis 194-К (тест-организм В. subtilis). а) ТСХ в системе хлороформ-бензол-метанол 30:20:7; б) электрофорез.

Используя экстракцию н-бутанолом нам удалось избавиться от минорного компонента 194-Е фракции II с Rf=0,15-2,0. С помощью колоночной хроматографии на силикагеле основной компонент этой фракции с Rf=0,55-0,6 был разделен на два гидрофобных антибиотика 194-А и 194-В (рис. 3). Их выделение и очистка до индивидуальных веществ была проведена с помощью ОФ-ВЭЖХ, либо методом твердофазной экстракции.

Установлено, что антибиотик 194-А обладал фунгицидной активностью и слабой активностью в отношении грамположительных бактерий, а 194-В был активен в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий (табл. 2). Анализ фунгицидного антибиотика 194-А показал, что его молекулярная масса составила 290 Да. В ИК-спектре (рис. 4; табл. 2) присутствовали следующие характеристические полосы поглощения (Vmax, см"1): 3412 (альдегидная группа), 2958 (-СН3), 2923(-СН3), 2853 (-СН2-), 1738 (предельный алифатический альдегид), 1631 (альдегидная группа при двойной связи), 1466

(алкильный радикал в алкилбензоле), 1378 (метальная группа в алифатическом углеводороде), 1266 (альдегид), 1166 (-С(СН3)2), 1100 (СН-ОН), 1073 (-С-ОН), 949 (С-О-С), 721 (CHRi= CHR2). Наличие перечисленных характеристических полос указывало, что данное вещество относится к альдегид-содержащим органическим соединениям алкил-фенильного ряда. Минимальная ингибирующая концентрация антибиотика 194-А в водном растворе в отношении таких микроорганизмов, как A. niger, A. repens, P. chrysogenum, С. tropicales составляла 0,25 мг/мл (рис. 5а, б).

Рис. 3. Биоавтография антибиотиков, образуемых L. Iactis subsp. /actis 194-К, выделенных из фракции II

(ТСХ в системе хлороформ-бензол-метанол 30:20:7; Kieselgel-60; тест-организм B.subtilis).

Линия старта

Рис. 4. ИК-спектр фунгицидного антибиотика 194-А, образуемого L. Iactis subsp. ¡actis 194-К.

Антибиотик 194-В представлял собой более высокомолекулярное вещество с молекулярной массой 879 Да. В его инфракрасном спектре присутствововали характеристические полосы поглощения, указывающие на ароматическую природу и непредельный храктер этого соединения (рис. 6; табл. 2).

Рис. 5. Минимальная ингибирующая концентрация антибиотика 194-А в отношении микроскопических грибов: A. repetís (а), Р. chrysogenum (б).

3500 3000 2500 2000 1500 1000

Волновое число, (си-1)

Рис. 6. ИК-спектр антибиотика 194-В, образуемого L. lactis subsp. ¡actis 194-К.

Из литературы известно, что бактерии рода Lactococcus являются продуцентами практически важных антимикробных пептидов - бактериоцинов, имеющих относительно узкий спектр действия (Zendo et al., 2010). В немногочисленных работах, посвященных поиску штаммов лактококков, обладающих фунгицидной активностью (Batish et al., 1989; Florianowicz, 2001; Lertcanawanichakul, 2005), отсутствуют сведения о природе фунгицидных веществ. В нашей работе было показано, что природный штамм лактококка L. lactis subsp. lactis 194-К продуцирует два гидрофобных антибиотика, один из которых обладает фунгицидной активностью. Впервые с помощью ИК-спектроскопии была установлена природа фунгицидного антибиотика и показано, что он является альдегид-содержащим органическим соединениям алкил-фенильного ряда.

Выделение и изучение физико-химических свойств антимикробных пептидов (194-D и низина А), продуцируемых Lactococcus lactis subsp. lactis 194-К

Согласно литературным данным общие методы выделения бактериоцинов из

культуральной жидкости сводятся к их осаждению и нескольких этапов очистки с помощью

катионо-обменной, гель-проникающей, обращенно-фазовой хроматографии (Carolissen-

Mackay et al., 1997; Yamamoto et al., 2003; Yamazaki et al., 2005). Также могут использоваться различные стратегии для выделения бактериоцинов из сложных сред, основанные на использовании катионных характеристик (Venema et al., 1997; Cheigh et al., 2004).

Табл. 2

Физико-химические и биологичемские свойства антибиотиков 194-А и В, образуемых Lactococcus lactis subsp. ¡actis 194-K

Физико-химические свойства Компонент 194-А Компонент 194-В

UV спектр (ЕЮН), Х,т(, нм Нет 271

MALDI-MS (m/z) (М+Н)+ 290 879

ТСХ (Kieselgel-60), RfB системе хлороформ-бензол- метанол (30:20:7) 0,63 0,57

ИК-спектр ( Vmax, СМ"') 3412сл, 2958,2923,2853, 1738, 1631сл, 1466, 1378, 1266сл, 1166, 1100, 1073, 949сл,721сл 1667сл, 1454, 1143, 847сл, 801, 726, 669сл.

Антибактериальный спектр действия Грамположительные бактерии: В. subtilis Микроскопические грибы: A. niger, A. repens Р. chrysogenum С. tropicales Грамположительные бактерии: В. subtilis, В. coagulons M. luteus, S. aureus Грамотрицательные бактерии: Е. coli, С. terrigena

Растворимость растворим в хлороформе, ацето нитриле, этилацетате; не растворим в воде, водном этаноле растворим в н-бутаноле, этилацетате, водном ацето нитриле; не растворим в этаноле, воде

В нашем исследовании антибиотики пептидной природы, содержащиеся во фракции I (рис. 26), выделяли с помощью препаративного изоэлектрофокусирования (ИЭФ), в котором разделение основано на разнице в электрических зарядах пептидных молекул. Примененный метод позволил нам выделить два бактериоцина, поэтому его можно рекомендовать для выделения бактериоцинов из их смесей.

Культура Ьасіососсия Іасіїї эиЬэр. Іасгія 194-К

1) Экстракция смесью ацетон-СНзСООН (4:1) 55°С, 1.5 ч

2) Концентрирование в вакууме до водного остатка

Водный концентрат

1) Осаждение метанолом до образования осадка

2) Фильтрация осадка на стеклянном фильтре

Осадок

Высушивание

Фракция I (порошок - сырец)

ОФ-ВЭЖХ анализ

Антибиотик 194-Э (ИЭФ- 11) и низин А (ИЭФ-15)

Маточный раствор от осаждения

1) Концентрирование в вакууме

2) Промывка остатка 2%-м №НСОз

Препаративное изоэлектофокусирование.

Фракции ИЭФ-11 и ИЭФ-15

Фракция II Водный раствор

Экстракция н-бутанолом

Бутаиольиый экстракт

Концентрирование в вакууме досуха

Водно-спиртовый концентрат (Кб)

Колоночная хроматография на силикагеле

Концентраты К1 и К2

Очистка К1 с помощью ОФ-ВЭЖХ, К2 с помощью картриджа «Диапак С8»

Антибиотики 194-А (К1) и 194-В (К2)

Рис. 7. Схема выделения и очистки компонентов антибиотического комплекса, синтезируемого штаммом ЬаМоспссии /ас/и $иЬ$р. 194-К.

В ходе работы было установлено, что L. lactis subsp. ¡actis 194-К образует два биологически активных вещества пептидной природы. Одно из них по времени выхода на ОФ-ВЭЖХ (рис. 8а; 16.2 мин) и молекулярной массе (3353 Да) совпадало с аналогичными характеристиками (пик 1, рис. 86) бактериоцина низина А (Zendo et al., 2010), и поэтому это вещество было нами идентифицировано как известный бактериоцин низин А.

0.60.50.40.20.1 -

0.0-[

Рис. 8. Сравнительный ОФ-ВЭЖХ анализ антибиотика, образуемого Lactococcus lactis subsp. lactis 194-К, содержащегося во фракция I (а) и стандартного препарата низина А (б).

Другое антимикробное вещество, обозначенное как 194-D, содержалось в пике 2 (рис. 9а); его молекулярная масса составляла 2589 Да (рис. 96). Для подтверждения пептидной природы антибиотика, содержащегося в пике 2 (рис. 9а), был проведен аминокислотный анализ этого соединения, который показал, что в состав полипептида 194-D входят следующие аминокислоты: Асп, Тре, Сер, Глу, Про, Гли, Ала, Вал, Иле, Лей, Фен, Лиз, Трп в количественном соотношении 2:1:2:4:2:2:1:1:1:1:1:1:1. Отсутствие лантионина и относительно низкая молекулярная масса бактериоцина 194-D позволяет предположить, что он относится ко второму классу бактериоцинов.

Для идентификации выделенных антибиотиков по имеющимся физико-химическим характеристикам был проведен поиск аналогов по компьютерной базе данных (BNPD) природных биологически активных веществ (Berdy, 1994). По результатам анализа было сделано заключение, что компоненты 194-А, 194-В и D не имеют известных аналогов и являются новыми природными биологически активными веществами.

Полипептид 194-D в отличие от низина А, действующего только на грамположительные бактерии (Hurst, 1981), подавлял развитие как грамположительных (В. subtilis, В. coagulans, В. mycoides, Micrococcus Intens), так и грамотрицательных бактерий (Е. coli, Comamonas terrigena), что является редким и ценным свойством для антимикробных пептидов, синтезируемых бактериями подвида L. lactis subsp. lactis.

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Время, мин

Рис. 9. ОФ-ВЭЖХ анализ фракции, содержащей антимикробный полипептид 194-D (пик 2), образуемый Lactococcus ¡actis subsp. lactis 194-K (а); масс-спектр пептида 194-D (б).

Имеются данные (Morgan et al., 1995) о способности штаммом L. lactis subsp. lactis biovar diacetylactis DPC938 образовывать несколько близкородственных бактериоцинов -лакгококцинов А, В и М. В нашем исследовании впервые было показано, что штамм L. lactis subsp. lactis 194-К способен одновременно с лантибиотиком низином продуцировать еще другой тип бактериоцина. Благодаря продукции двух разных бактериоцинов и двух гидрофобных антибиотиков, один из которых обладал фунгицидной активностью, штамм L. lactis subsp. lactis 194-К является уникальным. В связи с возможностью практического применения фунгицидного антибиотика 194-А и бактериоцина 194-D в дальнейшем было проведено исследование по изучению влияния состава ферментационных сред на их синтез. Изучение влияния ферментационных сред на синтез фунгицидного антибиотика 194-А и бактериоцина 194-D. образуемых Lactococcus lactis subsp. lactis 194-К

Лактококки чрезвычайно требовательны к составу питательных сред, поэтому для их культивирования применяют комплексные среды, содержащие избыток белков и пептидов (De Mann et al., 1960; Tagg et al., 1976). Из литературы был отобран ряд оптимизированных сред, поддерживающих рост продуцента на оптимальном уровне и содержащих в качестве источника углерода либо очищенные сахара (сахароза, глюкоза), либо смесь Сахаров в виде мелассы, а в качестве источников аминного азота в разных средах присутствовал дрожжевой экстракт, гидролизат казеина, пептон, соли аммония.

Культивирование штамма L. lactis subsp. lactis 194-К показало, что на всех отобранных средах поддерживался высокий уровень роста продуцента и накопления антибиотиков. Этот факт говорит о том, что антибиотическая активность штамма поддерживается как при росте

на богатых средах №№ 1, 4, 6, 7, 8, содержащих комбинации дрожжевого экстракта с пептоном, триптоном либо гидролизатом казеина, так и на относительно бедных средах (среда №2, №3) с мелассой и дрожжевым экстрактом. Наибольшая общая антибиотическая активность к 23 ч роста культуры была зафиксирована на средах № 1, 2, 4, 7, 8 и составляла от 4375 до 4700 МЕ/мл по низину. Максимальная фунгицидная активность, которая составляла 2434 ед/мл, была зафиксирована на среде №1, содержащей глюкозу, дрожжевой экстракт, гидролизат казеина и фосфат калия (табл. 3).

В ходе исследования было установлено, что оптимальной для образования бактериоцина 194-D также являлась среда №1, на которой его количество в культуре штамма 194-К превышало содержание низина А в 1123 раза и составляло 1683 ОЕ/мл (табл. 3). Это говорит о том, что низин А является минорным компонентом в антибиотическом комплексе штамма 194-К. Было замечено, что оба бактериоцина в разном соотношении присутствовали на всех средах только в клеточных экстрактах (табл. 4). В нативном растворе культуральной жидкости был обнаружен только новый бактериоцин 194-D.

Содержание бактериоцина 194-D на среде №1 было больше в 3,7 раз, а фунгицидная активность была выше на 39% по сравнению с контрольной средой №6. Возможно этот факт объясняется присутствием гидролизата казеина, олигопептиды которого являются основным источником азота для лактококков (Juillard et al., 1995), а также повышенным содержанием фосфата калия, необходимого для многих внутриклеточных биосинтетических процессов.

Табл. 3

Влияние среды культивирования на фунгнцидную активность штамма Lactococcus lactis subsp. lactis 194-К (тест-организм Aspergillus niger)

Среда культивирования Рост, ОПяо Фунгицидная активность по нистатину, ед/мл

№1 1,39±0,23 2434±254

№2 1,12±0,08 90±12

№3 1,50±0,18 0

№4 1,43±0,12 1565±133

№5 1,10±0,13 667±85

№6 1,41±0,18 1751±93

№7 1,25±0,14 1845±55

№8 1,48±0,10 1190±99

Табл. 4

Влияние среды культивирования на количественное содержание бактериоцинов (194-0 и низина А) в культуральной жидкости Ьаси>соссю /ас/к киЬвр. /ас11.ч 194-К (в клетках и нативном растворе)

Среда культивирования Количественное содержание бактериоцинов, ОЕ/мл

Нативный раствор Клетки

194-D Низин А 194-D Низин А

№1 1683±117 - 2,2±0,05 1,5±0,05

№2 543±103 - 2,6±0,05 2,0±0,24

№3 465±49 - 1,2±0,14 1,90±0,09

№4 687±65 - 1,6±0,05 1,7±0,09

№5 813±75 - 2,1±0,19 1,2±0,05

№6 456 ±39 - - 1,2±0,03

№7 933±34 - 1,3 0,93±0,02

№8 758±19 - 2,4±0,09 1,2±0,09

Результаты исследований по культивированию штамма 194-К на оптимальной среде №1 в течение 30 ч показали, что синтез бактериоцина 194-Б осуществлялся параллельно росту штамма, а синтез фунгицидного антибиотика 194-А начинался после 3-х ч инкубирования. Максимальное накопление обоих антибиотиков достигалось к 20 ч роста культуры (рис. 10).

ОПяо 1.5 •

.............J.-f"M-4-.I ''

/П А т-ТГ-5

*------/ 1 ' ;<

-----'/

о *.....

О 5

ю 15 ;о :5 Время, ч

• - рост. ОПяо

■ - синтез бактериоцина 194-Е), ОЕ/мл ▲ - синтез фунгицидного антибиотика 194-А, ед/ют (по нистатину)

Рис. 10. Динамика образования бактериоцина 194-Э и фунгицидного антибиотика 194-А при росте ЬасЮсоссих 1ас1'к $иЬ$р. /ас/к 194-К на среде №1 с гидролизатом казеина, дрожжевым экстрактом и глюкозой.

Изучение влияния лактококка Lactococcus Iactis subsp. lactis 194-K на проявление симптомов спонтанного хронического дерматоза мышей

Возможным практическим применением штамма L. lactis subsp. lactis 194-K, образующего несколько новых антимикробных веществ, является создание на его основе метаболитного пробиотика - препарата, содержащего антимикробные вещества, образуемые симбионтными бактериями. Известно, что такие препараты положительно влияют как на физиологические функции, так и на биохимические процессы макроорганизма (Бондаренко, 2005). Значительное преимущество метаболитных пробиотиков заключается в возможности их применения вместе с антибактериальными препаратами у больных, нуждающихся в повторных курсах антибиотикотерапии. Действие метаболитных пробиотиков реализуется не только как восстанавливающее по отношению к нарушенному микробиоценозу, но и как профилактическое, препятствуя усиленному размножению условно-патогенных бактерий кишечника, которое наблюдается при наличии хронических заболеваний. В настоящее время лекарственные препараты, содержащие метаболиты и микробные фракции, используются для терапии и профилактики дисфункций пищеварительного тракта, при нарушении липидного обмена, болезнях кожи (Молохова и др., 2010). В связи с этим было проведено изучение свойств штамма 194-К в опытах in vivo.

В наших исследованиях в качестве экспериментальных животных были выбраны мыши линии CBRB-Rb (8.17) llem, являющиеся адекватной моделью хронических воспалительных заболеваний кожи - дерматозов (Моисеева и др., 2009). Дерматозы - это комплексные заболевания, в развитии которых участвуют генетические (чувствительность к аллергенам, дефектная функция кожного барьера, нарушение иммунологических реакций) и инфекционные факторы (Leung et al., 2004). Важным свойством данной модели мышей являлась ее наглядность, которая позволяла легко фиксировать изменения, происходящие с ними в процессе приема препарата. Мы предположили, что антимикробные вещества, входящие в состав культуры лактококка 194-К, могут привезти к улучшению состояния кожных покровов мышей за счет улучшения микроэкологического состояния кишечника.

В результате проведенных исследований было показано, что ежедневное употребление мышами культуры L. lactis subsp. lactis 194-К per os уже через одну неделю привело к улучшению состояния кожи спины: изъязвления у опытных животных были выражены в среднем на 80% меньше (рис. 11а; р=0,001); по сравнению с контрольными мышами улучшилось и состояние шерстного покрова (рис. 116, р=0,02); площадь пораженного участка спины в среднем была меньше, чем у контрольных животных на 24% (рис. 11в; р=0,01). Наименьшая степень проявления алопеции в опытной группе наблюдалась через две

недели применения культуры, когда уменьшение по сравнению с началом эксперимента составило 18% (рис. 116, р=0,04). Опираясь на полученные результаты мы можем говорить о том, что штамм 194-К может быть использован для лечения воспалительных заболеваний кожи.

Степень изъязвления, баллы

О 2 4 6 8 10 12 14 Время, дпп

Степень алопеции.

V. V- **

О 2 4 6 8 10 12 14 Время, дни

11а

116

Площадь,

мм2 800 --

700 600 500 400

^—:

—j

4 б 8 10 12 14 Время, ДНИ

Рис. 11. Изменение степени выраженности симптомов дерматоза у мышей линии СВЯВ,

■ - опыт, • - контроль;

а) степень изъязвления (баллы); б) степень алопеции (баллы); в) площадь поражения (мм2). Примечание: • . достоверное отличие значения показателя в опыте по сравнению с контролем; *** - р=0,001; ** - р=0,01; *- р=0,02.

11в

ВЫВОДЫ:

1. Изучена диссоциация штамма Lactococcus ¡actis subsp. ¡actis 194, выделен активный вариант 194-К, обладающий широким спектром антибактериального и фунгицидного действия с антибиотической активностью порядка 4000 ME/мл по низину и 1750 ед/мл по нистатину.

2. Разработана схема выделения и очистки двух бактериоцинов (низина А и 194-D) и антибиотиков гидрофобной природы (194-А и В), образуемых/,, ¡actis subsp. ¡actis 194-К; изучены их физико-химические и биологические свойства, позволяющие заключить, что антибиотики 194-А, В и D являются новыми и не имеют известных аналогов в компьютерной базе данных биологически активных веществ (BNPD).

3. Установлено, что активный вариант синтезирует новый бактериоцин 194-D (М= 2589 Да), который в отличие от низина А подавляет рост как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий.

4. Фунгицидный антибиотик 194-А является альдегид-содержащим органическим соединениям алкил-фенильного ряда с молекулярной массой 290 Да.

5. Антибиотик 194-В с молекулярной массой 879 Да активен в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий и по химической природе является ароматическим соединением, содержащим алкильные заместители непредельного ряда.

6. Показано, что оптимальной для образования фунгицидного антибиотика 194-А и нового бактериоцина 194-D является среда, содержащая гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, глюкозу и фосфат калия, которая способствует увеличению фунгицидной активности на 39%, а продукции нового бактериоцина 194-D в 3,7 раз.

7. Показана эффективность штамма L. lactis subsp. Iactis 194-K для лечения хронического дерматоза у мышей линии CBRB-Rb (8.17)llem.

Список работ, опубликованных в рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК РФ

1. Тренина М. А., Складнев Д. А., Бронников С. В., Стоянова Л. Г., Устюгова Е.А. 2009. Развитие популяций бактерий Lactococcus lactis ssp. lactis на агаризованных средах // Экология и промышленность России. №5. С. 42-46.

2. Stoyanova L.G., Ustvugova Е.А.. Sultimova T.D., Bilanenko E.N., Fedorova G.B., Katrukha G.S., Netrusov A.I. 2010. New antifungal bacteriocin-synthesizing strains of Lactococcus lactis ssp. lactis as the perspective biopreservatives for protection of raw smoked sausages // Am. J. Agricult. Biol. Sei. V. 5. No4. P. 477-485.

3. Устюгова E. А.. Федорова Г. Б., Катруха Г. С., Стоянова Л. Г. 2011. Изучение антибиотического комплекса, образуемого Lactococcus lactis subsp. lactis 194 вариант-K// Микробиология. T. 80. №5. С. 644-650.

4. Стоянова Л. Г., Устюгова Е. А.. Нетрусов А. И. 2012. Антимикробные метаболиты молочнокислых бактерий: разнообразие и свойства (обзор) // Прикл. Биохим. Микробиол. Т. 48. №3. С. 259-275.

5. Устюгова Е. А.. Тимофеева A.B., Стоянова Л.Г., Нетрусов А.И., Катруха Г.С. 2012. Характеристика и идентификация бактериоцинов, образуемых Lactococcus lactis subsp. lactis 194-K II Прикл. Биохим. Микробиол. T. 48. №6. С. 618-625.

6. Моисеева Е.В., Устюгова Е.А.. Семушина С.Г., Аронов Д.А., Стоянова Л.Г. 2012. Влияние культуры Lactococcus lactis subsp. lactis 194-K на проявление симптомов спонтанного хронического дерматоза // Фундаментальные исследования. №6. С. 333-337.

Тезисы докладов

1. Устюгова Е.А. Новый антибиотический комплекс, синтезируемый природным штаммом Lactococcus !actis ssp. ¡actis 194. Тезисы докладов международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009». Москва. 14-17 апреля 2009. С. 173.

2. Устюгова Е.А.. Федорова Г.Б., Катруха Г.С., Стоянова Л.Г. Lactococcus ¡actis ssp. ¡actis 194 - продуцент антибиотика широкого спектра действия. Тезисы докладов Всероссийского симпозиума «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов». Москва. 24-27 декабря 2009. С. 184.

3. Устюгова Е.А. Стоянова Л.Г. Новый фунгицидный биоконсервант, продуцируемый Lactococcus ¡actis ssp. ¡actis 194. Тезисы III научно-практической конференции «Перспективы развития инноваций в биологии». Москва. 11-13 ноября 2009. С. 164.

4. Stoyanova L.G., Ustvugova Е.А.. Sultimova T.D., Netrusov A.I. New antifungal bacteriocin synthesizing strains of Lactococcus ¡actis ssp. ¡actis as the perspective biopreservatives for protection of raw smoked sausages. Abstract of the «III Int. Conf. Environ, Indust. and Appl. Microbiol». Lisboan 2-4 dec. 2009. P. 326.

5. Устюгова E.A.. Федорова Г.Б., Катруха Г.С., Стоянова Л.Г. Синтез антибиотика широкого спектра действия Lactococcus ¡actis ssp. ¡actis. Тезисы VII международной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии». Минск. 31 мая - 4 июня 2010. С. 168-170.

6. Устюгова Е.А.. Федорова Г.Б., Стоянова Л.Г., Катруха Г.С., Сультимова Т.Д. Исследование наиболее перспективных для пищевой промышленности антибиотиков, образуемых природным штаммом Lactococcus ¡actis ssp. ¡actis 194. Материалы VI московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва. 21-25 марта 2011. С. 137.

7. Устюгова Е.А.. Тимофеева A.B., Стоянова Л.Г., Федорова Г.Б., Катруха Г.С. Бактериоцины, образуемые Lactococcus ¡actis ssp. ¡actis 194-K с широким спектром антимикробного действия. Материалы Московской международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии». Москва. 20-22 марта 2012. С. 147.

8. Моисеева Е.В., Устюгова Е.А.. Семушина С.Г., Аронов Д.А., Стоянова Л.Г. Влияние культуры Lactococcus ¡actis subsp. ¡actis 194-K на проявление симптомов хронического дерматита у самцов мышей линии CBRB. Материалы ежегодного Всероссийского конгресса по инфекционным болезням. Москва. 26-28 марта 2012. С. 61.

Устюгова Е.А. Идентификация бактериоцинов, образуемых штаммом ¿дс/ососсги /ас/;.? виЬвр. 1асИз 194-К. Тезисы докладов международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2012». Москва. 9-13 апреля 2012. С. 163.

Автор приносит благодарность ряду научных сотрудников за помощь в выделении и идентификации антибиотических веществ: к.б.н Федоровой Г.Б. (ФГБУ НИИ по изысканию новых антибиотиков имени Г.Ф. Гаузе РАМН), к.х.н Ксенофонтову A.JI. и Тимофеевой A.B. (ГУ НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова), Хряповой Е.В. (ФГБУ НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН), а также к.б.н Моисеевой Е.В. (ФГБУ науки Институт биоорганической химии имени Шемякина М.М. и Овчинникова Ю.А.) за помощь в проведение экспериментов с животными.

Заказ № 39-П/10/2012 Подписано в печать 10.10.2012 Тираж 80 экз. Усл. п.л.1,2

ГРьг

"Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.rii; е-таП:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Устюгова, Екатерина Александровна

Введение.

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общие свойства молочнокислых бактерий.

1.1.1 Характеристика рода Lactococcus.

1.2. Низкомолекулярные антимикробные метаболиты молочнокислых бактерий.

1.3.Фунгицидные вещества молочнокислых бактерий.

1.4. Бактериоцины молочнокислых бактерий: свойства и классификация

1.4.1. Биосинтез и формирование зрелых молекул лантибиотиков.

1.4.2. Механизм действия лантибиотиков.

1.4.3. Свойства и биосинтез бактериоцинов II класса.

1.4.4. Механизм действия бактериоцинов II класса.

1.4.5. Способы определения бактериоцинов.

I.5. Применение МКБ и их антимикробных метаболитов в пищевой промышленности и медицине.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Синтез антибиотического комплекса широкого спектра действия лактококком Lactococcus lactis subsp. lactis 194-K"

Молочнокислые бактерии (МКБ) уже более ста лет привлекают к себе внимание исследователей. Исторически в ядро этой группы включены бактерии, относящиеся к родам Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Pediococcus и Leuconostoc (Albano et al., 2007). Исследования последних десятилетий выявили способность МКБ образовывать антимикробные вещества различной природы, которые могут стать альтернативой существующим антибиотикам и консервантам. Поэтому интерес многих ученых к МКБ связан с двумя практически важными аспектами: консервацией пищевых продуктов, а также их влиянием на здоровье человека. В связи с тем, что молочнокислые бактерии относятся к нормальной микробиоте человека и животных они рассматриваются не только как источник антимикробных соединений, но также как фармацевтические средства, которые могут предотвратить или уменьшить выраженность симптомов некоторых заболеваний (Holzapfel et al., 2001). Эти свойства МКБ явились стимулом к детальному изучению их бактерицидных и пробиотических свойств (Soccol et al., 2010).

Пробиотики - это бактериальные препараты, либо метаболиты бактерий, которые помогают предотвратить или снять различные расстройства, такие как диарея, чувствительность к лактозе, воспаление кишечника и желчного пузыря, уменьшить симптомы пищевой аллергии. Показано, что некоторые штаммы МКБ обладают антиканцерогенной и антимутагенной активностью (Commane et al., 2005), способствуют снижению уровня сывороточного холестерина (Iannitti et al., 2010). Поэтому считается, что применение МКБ в составе пробиотических препаратов может облегчить и ускорить процесс выздоровления при ряде заболеваний.

Продление сроков хранения пищевых продуктов заботило человечество еще с древних времен. Наиболее часто в качестве консервантов использовали поваренную соль с добавлением уксусной кислоты. В последнее время в пищевой промышленности активно используются химические консерванты и антибиотики, обладающие бактерицидными и фунгицидными свойствами. Но таите консерванты вызывают опасения у потребителей вследствие своей токсичности и возможности подавления естественной микробиоты организма. Использование МКБ и их метаболитов, обладающих антимикробными свойствами, является одним из активно разрабатываемых альтернативных подходов к консервированию продуктов питания. Как известно МКБ тесно ассоциированы с пищевыми продуктами и имеют «GRAS» статус (Generally Recognized As Safe), что определяет их как абсолютно безопасные для здоровья человека и животных. Основными 4 антимикробными веществами МКБ, являются органические кислоты, образуемые в процессе сбраживания простых Сахаров, что приводит к быстрому закислешно среды обитания и предотвращению развития других групп микроорганизмов (Leroy et al., 2006). За последние десятилетия появилось много данных о продукции МКБ антимикробных веществ, относящихся к разным классам органических соединений, перспективных для практического применения (Trias et al., 2008).

Увеличивающийся спрос фармацевтической и пищевой промышленности в эффективных препаратах с широким спектром антибиотического действия обусловливает актуальность поиска новых антимикробных веществ, образуемых МКБ. На кафедре микробиологии МГУ имени М.В. Ломоносова из коровьего молока Бурятии был выделен дикий штамм, синтезирующий антибиотический комлекс широкого спектра андействия, который был идентифицирован как Lactococcus lactis subsp. lactis 194 (GenBank DQ 255954). Однако химическая природа активных компонентов, продуцируемых L. lactis subsp. lactis 194, и особенности их синтеза не были изучены. Данная работа посвящена выделению и установлению химической природы антибиотических веществ, образуемых L. lactis subsp. lactis 194, изучению их синтеза, а также исследованию возможности их практического применения.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить диссоциацию штамма Lactococcus lactis subsp. lactis 194 с целью выделения наиболее активного продуцента.

5. Испытать эффективность штамма 194-К in vivo на моделе спонтанного хронического дерматоза.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Получение активного варианта штамма Lactococcus lactis subsp. lactis 194-К, образующего сложный антибиотический комплекс широкого бактерицидного и 5 фунгицидного спектра действия.

2. Разработка способов выделения и очистки антибиотиков, образуемых активным вариантом 194-К.

3. Установление состава антибиотического комплекса: наряду с известным бактериоцином низином А, обнаружен новый бактериоцин 194-D, а также два антибиотика гидрофобной природы (194-А и В), которые являются новыми биологически активными веществами.

4. Оценка возможности применения штамма 194-К для лечения воспалительных заболеваний кожи у мышей линии CBRB-Rb (8.17) llem.

Научная новизна и практическая значимость работы:

1. Изучена диссоциация штамма Lactococcus lactis subsp. lactis 194 и выделен активный вариант 194-К, продуцирующий антибиотический комплекс с широким спектром антибактериального и фунгицидного действия.

3. Впервые показано, что штамм L. laclis subsp. lactis 194-К наряду с низином образует новый бактериоцин 194-D, а также два антибиотика гидрофобной природы (194-А и В), не имеющие аналогов в базе данных природных биологически активных веществ (BNPD).

5. Показана эффективность штамма 194-К для уменьшения степени выраженности симптомов хронического дерматоза у мышей линии CBRB-Rb (8.17) Нет.

Практическая значимость работы заключается в получении активного варианта штамма L lactis subsp. lactis 194-К, разработке схемы выделения новых антибиотиков, перспективных для использования в пищевой промышленности и медицине. Доказана эффективность перорального применения штамма 194-К для лечения воспалительных заболеваний кожи.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Устюгова, Екатерина Александровна

ВЫВОДЫ:

2. Разработана схема выделения и очистки двух бактериоцинов (низина А и 194-D) и антибиотиков гидрофобной природы (194-А и В), образуемых L. Iactis subsp. ¡actis 194-К; изучены их физико-химические и биологические свойства, позволяющие заключить, что антибиотики 194-А, В и D являются новыми и не имеют известных аналогов в компьютерной базе данных биологически активных веществ (BNPD).

3. Установлено, что активный вариант синтезирует новый бактериоцин 194-D (М=:2589 Да), который в отличие от низина А подавляет рост как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий.

7. Показана эффективность штамма L. ¡actis subsp. ¡actis 194-К для лечения хронического дерматоза у мышей линии CBRB-Rb (8.17) Нет.

Заключение

Молочнокислые бактерии тесно ассоциированы с пищевыми продуктами, встречаются на всем протяжении желудочно-кишечного тракта человека и относятся к его нормальной микробиоте, в связи с чем были удостоены статуса «GRAS» (Generally Regarded As Safe). В настоящее время МКБ рассматриваются как новый источник антимикробных веществ, которые могут стать альтернативой существующим антибиотикам. Из литературы известно, что бактерии рода Lactococcus являются продуцентами бактериоцинов, используемых в качестве консервантов продуктов питания и пищевого сырья (Nés et al., 2007; Zendo et al., 2010). Однако большинство бактериоцинов обладает узким спектром антимикробного действия, что ограничивает возможность их практического применения. В немногочисленных работах по скринингу штаммов лактококков, обладающих широким спектром антимикробного действия, отсутствовали данные о природе активных веществ (Florianowicz et al., 2001; Lertcanawanichakul, 2005; Стоянова и др., 2007).

В процессе поиска штаммов лактококков широкого спектра бактерицидного и фунгицидного действия на кафедре микробиологии МГУ имени М.В. Ломоносова из коровьего молока Бурятии был выделен штамм Lactococcus lactis subsp. lactis 194 (GenBank DQ 255954), перспективный в качестве биоконсерванта для мясных изделий (Стоянова и др., 2006; Дибирсулаев и др., 2009). Однако точная химическая природа активных компонентов, продуцируемых L. lactis subsp. lactis 194, и особенности их синтеза не были установлены. Кроме того не были изучены другие аспекты практического использования штамма 194, в частности, его влияние на живой организм.

Цель данной диссертационной работы состояла в изучении синтеза антибиотического комплекса широкого антимикробного спектра действия, образуемого активным вариантом штамма Lactococcus lactis subsp. lactis 194-K. Конкретные задачи работы заключались в отборе из популяции штамма активного продуцента, установление природы им образуемых антимикробных веществ, изучении условий их синтеза и возможности практического использования.

Первым этапом исследования являлось изучение диссоциации природного штамма L. lactis subsp. lactis 194 с целью выделения наиболее активного продуцента. При рассеве штамма из его популяции был отобран вариант 194-К, обладающий широким спектром антибактериального и фунгицидного действия, который далее был использован в наших исследованиях для выполнения поставленных задач.

102

В ходе проведенного нами исследования было показано, что широкий спектр антимикробного действия варианта 194-К обусловлен присутствием нескольких биологически активных веществ, в том числе двух бактериоцинов (194-D и низин А) и двух антибиотиков гидрофобной природы 194-А и В, один из которых обладал фунгицидной активностью. Поскольку продуцируемый антибиотический комплекс состоял из нескольких компонентов, то в процессе исследования была проведена работа по подбору эффективных способов выделения и очистки отдельных антибиотиков.

На первом этапе выделения при использовании метанола мы осадили часть антибиотиков в результате чего культуральная жидкость была разделена на две фракции (осадок и маточный раствор). В маточном растворе после осаждения содержались гидрофобные антибиотики, а в осадке антибиотики пептидной природы - бактериоцины. Для максимального извлечения гидрофобных антибиотиков был подобран наиболее эффективный экстрагент. Лучшее извлечение гидрофобных антибиотиков 194-А и 194-В удалось достичь экстракцией н-бутанолом, а их выделение из экстракта было проведено с помощью колоночной хроматографии. Бактериоцины 194-D и низин А были выделены из осадка с помощью препаративного изоэлектрофокусирования. На последнем этапе была проведена очистка индивидуальных антибиотиков с помощью ОФ-ВЭЖХ либо с помощью метода твердофазной экстракции.

Разработанная схема выделения индивидуальных веществ позволила впервые выделить и установить природу фунгицидного антибиотика 194-А. Показано, что антибиотик 194-А представляет собой гидрофобное вещество, принадлежащее к альдегид-содержащим органическим соединениям алкил-фенильного ряда с молекулярной массой 290 Да. Второй антибиотик гидрофобной природы 194-В являлся ароматическим соединением с непредельными заместителями и молекулярной массой 879 Да, который проявлял активность в отношении грамположительных, грамотрицательных бактерий.

Известно, что бактериоцины, образуемые бактериями рода Lactococcas, могут принадлежать к разным классам и отличаться по структуре, физико-химическим и биологическим свойствам (Morgan et al., 2005; Fujita et al., 2007; Martínez et al., 2008; de

Kwaadsteniet et al., 2008). Но продуцируемые одним штаммом лактококка бактериоцины, как правило, принадлежат к одному классу и являются близкородственными (Morgan et al.,

1995). В настоящей работе впервые было показано, что штамм L. lactis subsp. lactis 194-К образует два разных бактериоцина. Один из них по молекулярной массе (3353 Да) и ОФ

ВЭЖХ анализу был идентифицирован как низин А - известный и широко используемый в пищевой промышленности бактериоцин, относящийся к классу л антибиотиков. Другой юз бактериоцин 194-D имел молекулярную массу 2589 Да и состоял из 20 аминокислот среди которых не было лантионина. В отличие от низина А этот бактериоцин обладал способностью подавлять рост как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий, что не характерно для бактериоцинов, синтезируемых лактококками подвида L. lactis subsp. lactis (Cleveland et al., 2001; Zendo et al., 2006). Ранее описанные в литературе бактериоцины лактококков действуют в основном на грамположительные бактерии и неэффективны против грамотрицательных бактерий, часто вызывающих порчу продуктов питания и представляющих угрозу для здоровья (Cleveland et al., 2001; Garneau et al., 2002; Chen, Hoover, 2003). Поэтому новый бактериоцин 194-D, выделенный из L. lactis subsp. lactis 194-K, обладает редким и ценным свойством, что делает его перспективным для практического использования.

Идентификация выделенных антибиотиков 194-А, В и D по компьютерной базе данных природных биологически активных веществ (BNPD) показала, что они не имеют известных аналогов и являются новыми. Благодаря продукции двух разных бактериоцинов и двух гидрофобных антибиотиков, один из которых обладал фунгицидной активностью, штамм L. lactis subsp. lactis 194-К является уникальным. Изучены физиолого-биохимические свойства этого штамма и условия синтеза им новых антибиотиков.

Определяющим в синтезе антибиотиков является состав ферментационных сред (Баранова и др., 1974; Yang, Ray, 1994; Li et al., 2002; Стоянова и др., 2006). Проведенные исследования по влиянию разных сред, рекомендуемых для накопления антимикробных метаболитов лактококками, показали зависимость синтеза отдельных компонентов антибиотического комплекса, продуцируемых штаммом 194-К, от состава среды. Подобрана ферментационная среда, обеспечивающая максимальный уровень образования нового бактериоцина 194-D и фунгицидного антибиотика 194-А, которая содержала гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, глюкозу и фосфат калия. Динамика образования бактериоцина 194-D на оптимальной среде проходила параллельно росту продуцента, что характерно для синтеза известных бактериоцинов, а синтез фунгицидного антибиотика 194-А начинался после трех часов культивирования. Максимальный уровень накопления обоих антибиотиков наблюдался к 20 часам роста культуры.

Природное происхождение штамма 194-К и продукция им новых антибиотиков позволили предположить, что на его основе может быть создан комплексный препарат, обладающий антибактериальным и фунгицидным действием. Как видно из литературных данных основное внимание исследователей сосредоточено на изучении влияния бифидобактерий, лактобацилл и их метаболитов на здоровье человека и животных

104

Бондаренко и др., 2004; Вахитов и др., 2005; Молохова и др., 2010). Тогда как терапевтические возможности метаболитов лактококков не изучены. В связи с этим было проведено исследование по изучению возможности применения штамма 194-К in vivo. В заключительной части работы впервые антимикробные метаболиты лактококков в составе культуры штамама L.lactis subsp. /actis 194-К были испытаны в качестве добавки к корму мышей оригинальной линии CBRB-Rb (8.17) llem, воспроизводящих симптомы спонтанного хронического дерматоза. Важным свойством данной модели мышей являлась ее наглядность, которая позволяла легко фиксировать изменения, происходящие с животными в процессе приема препарата. Мы предположили, что антимикробные вещества, входящие в состав культуры лактококка 194-К, могут привезти к улучшению состояния кожных покровов мышей за счет улучшения микроэкологического состояния кишечника. Полученные результаты подтвердили эффективность штамма 194-К, а именно -через семь дней применения улучшились показатели ряда регистрируемых симптомов: степени изъязвления, степени алопеции и площади поврежденного участка кожи.

Таким образом, в данной работе представлены результаты, демонстрирующие ранее не изученное физиолого-биохимическое свойство бактерий вида Lactococcus lactis продуцировать два разных бактериоцина и фунгицидный антибиотик. Был изучен их синтез и подобрана оптимальная ферментационная среда, обеспечивающая максимальный уровень образования нового бактериоцина 194-D и фунгицидного антибиотика 194-А. Впервые на моделе мышей линии CBRB-Rb (8.17) Нет были проведены эксперименты, которые показали перспективность штамма L. lactis subsp. lactis 194-К для лечения хронических дерматозов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Устюгова, Екатерина Александровна, Москва

1. Баранова И.П., Егоров II.С., Стоянова Л.Г. 1997. Низин, условия образования и получения препарата // Антибиотики и химиотерапия. Т.42, С.37-44.

2. Баранова И.П., Егоров Н.С., Козлова Ю., Максимов В.Н. Оптимизация среды для биосинтеза низина культурой Streptococcus lactis методом математического планирования эксперимента // Научные доклады высшей школы. Биологические науки. 1974. №3. С.94-98.

3. Бондаренко В.М. Метаболитные пробиотики: механизмы терапевтического эффекта при микроэкологических нарушениях // Гастроэнтерология. 2005. Т.7. №6. С.78-87.

4. Бондаренко В.М., Чуприна Р.П., Алдышева Ж.И., Мацулевич. Пробиотики и механизмы их лечебного действия // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2004. №3. С.83-87.

5. Бондаренко Д.А., Скобцова Л.А., Скобцов Д.И., Семушина С.Г., Ивашев М.Н., Косякова Н.И. Мурашев А.Н. Моделирование патологических состояний кожи у крыс и мышей // Цитокины и воспаление. 2010. Т.9. №4. С.28-31.

6. Вахитов Т.Я., Петров Л.Н., Бондаренко В.М. Концепция пробиотического препарата, содержащего оригинальные микробные метаболиты // Журн. микробиол. 2005. №5. С.108-114.

7. Грушина В. А., 1984. Изучение Streptococcus lactis штамм МГУ в связи с биосинтезом низина. Автореферат кандид. диссертации. МГУ. Москва.

8. Дибирсулаев М.А., Большаков О.В., Стоянова Л.Г., Адылов A.B. Применение нового биоконсерванта для хранения охлажденного мяса // Мясная индустрия. 2009. №11. С. 21-24.

9. Егоров Н. С. 2004. Основы учения об антибиотиках. М.: Наука. С. 167-180.

10. Егоров Н.С., Баранова И.П., Козлова Ю.И., Максимов В.Н., Полин А.Н. Трехкомпонентная питательная среда для продукции низина Streptococcus lactis штамм МГУ//Антибиот. Мед. Биотехнология. 1986. Т.31. №5. С.337-341.

11. Егоров Н.С., Грушина В.А., Козлова Ю.И., Баранова И.П., Полин А.Н. Инактивация низина в культуре продуцента Streptococcus îactis штамм МГУ //Антибиотики. 1982. №10. С.872-874.

12. Казицына JI.A., Куплетская Н.Б. Применение УФ, ИК и ЯМР спектроскопии в органической химии. М.: МГУ им. М.В. Ломоносова, химический факультет, 1968. С. 170-280.

13. Котельникова Е.А., Гельфанд М.С. Выработка бактериоцинов грамположительными бактериями и механизмы транскрипционной регуляции // Генетика. 2002. Т.38. С.758-772.

14. Кудряшов В.Л., Сергеева И.Д., Стоянова Л.Г., Задорожная Т.И, Дурицкая Л.И. Синтез биоконсерванта низина на отходах и вторичном сырье ряда биотехнологических производств//Биотехнология. 1995. №12. С.25-28.

15. Ленгелер Й., Древе Г., Шлегель Г., 2005. Современная микробиология. Прокариоты. М.: Мир. Т.2. С.393.

16. Милько Е.С., Задояна С.Б., Ганина В.И., Егоров U.C. Диссоциация молочно-кислых стрептококков//Биологические науки. 1991. №4. С. 103-108.

17. Молохова Е.И., Сорокина Ю.В., Казьянин A.B. Лекарственные препараты на основе метаболитов микрорганизмов и фрагментов их клеток // Фармация. 2010. №6. С.52-55.

18. Москва В.В. Растворители в органической химии // Соросовский образовательный журнал. 1999. №4. С.46-47.

19. Стоянова Л.Г., Егоров Н.С. Сравнительная характеристика новых штаммов Lactococcus lactis subsp. Iactis, полученных методом слияния протопластов // Микробиология. 1999. Т.68. С.235-240.

20. Стоянова Л.Г. Авторефрат диссертации на соискание ученой степени доктора наук «Новые бактериоцины лактококков и их практическое использование», М.2008.

21. Стоянова Л.Г., Полин А. П., Егоров Н.С. Влияние некоторых аминокислот на рост молочнокислых стрептококков Streptococcus lactis и процесс их протопластирования // Известия академии наук СССР. 1998. Серия биологическая. Т.6. С.892-899.

22. Стоянова Л.Г., Сультимова Т.Д., Ботина С.Г., Нетрусов А.И. Выделение и идентификация бактериоцинпродуцирующих штаммов Lactococcus lactis subsp. lactis из свежего молока // Прикладная биохимия и микробиология. 2006. Т.42. С.560-568.

23. Стоянова Л.Г., Сультимова Т.Д., Нетрусов А.И. Влияние фосфата и углеводов на синтез низина Lactococcus lactis subsp. lactis штамм 194 // Вестник Московского Университета, сер. Биология. 2003. Т. 16. №4. С. 17-22.

24. Стоянова Л.Г., Федорова Г.Б., Егоров Н.С., Нетрусов А.И., Катруха Г.С. Сравнение свойств бактериоцинов некоторых штаммов Lactococcus lactis subsp. lactis II Прикл. биохим. и микробиол. 2007. Т.43. №6. С.677-684.

25. Шаповалова Е.Н., Пирогов А.В. Хроматографические методы анализа. Методическое пособие для специальногог курса. Под ред. Шпигуна О.А. МГУ им. М.В. Ломоносова, химический факультет. 2007. С.61.

26. Шталь Э. Хроматография в тонких слоях. М.: Мир, 1965. С.487.

27. Aasen I.M., Markussen S., Moretro Т., Katla Т., Axelsson L., Naterstad K. 2003. Interactions of the bacteriocins sakacin P and nisin with food constituents // Int. J. Food Microbiol. V.87. P.35-43.

28. Allison D., Montville T. Nisin resistans in Listeria monocytogenes ATTC 700302 is a complex phenotype //Appl. Environ. Microbiol. 1998. V.64. P.231-237.

29. Annuk H., Shchepetova J., Kullisaar Т., Songisepp E., Zilmer M., Mikelsaar M. Characterization of intestinal lactobacilli as putative probiotic candidates // J. Appl. Microbiol. 2003. V.94. P.403^12.

30. Batish V.K., Lai R., Grover S. Screening lactic acid starter cultures for antifungal activity // J. Cultur. Dairy Prod. 1989. V.24. P.21-25.

31. Blom H., Katla T., Hoick A., Sletten K., Axelsson L., Holo H. Characterization, production, and purification of leucocin H, a two-peptide bacteriocin from Leuconostoc MF215B // Curr. Microbiol. 1999. V.39. P.43-48.

32. Beasley S., Saris P. Nisin producting Lactococcus lactis strains isolated from human milk // Appl. Environ. Microbiol. 2004. V.70. №8. P.5051-5053.

33. Berdy J. Bioactive microbial metabolites: a personal view // J. Antibiot. 2005. V. 58. №1. P. 1-26.

34. Berdy J. BNPD, data base for microbial metabolite research. Int. Conf. Microbial Secondary Metabolism. Interlaken. Suisse. 1994. Abstr. 2.

35. Biswas S.R., Ray P., Johnson M.C., Ray B. Influence of growth conditions on the production of a bacteriocin pediocin AcH by Pediococcus acidilactici H // Appl. Environ. Microbiol. 1991. V.57. P.1265-1267.

36. Bonelli R., Schneider T., Sahl G., Wiedemann I. Insights into in vivo activities of lantibiotics from gallidermin and epidermin mode-of-action studies // Antimicrob. Agents. Chemother. 2006. V.50. P. 1449-1457.

37. Bonev B., Breurinr E., Swiezewska E., de Kruijff B., Watts A. Targeting extracellular pyrophosphates underpins the high selectivity of nisin. // FASEB J. 2004. V. 18. №15. P. 1862-1869.

38. Bostian M., McNitt K., Aszalos A., Berdy J. Antibiotic identification: a computerized data base system // J. Antibiot. 1977. V.30. №7. P.633-634.

39. Breukink E., van Craaij C., Demel R., Siezen R., Kuipers O., Kruijff B. The C-terminal region of nisin is responsible for the initial interaction of nisin with the target membrane // Biochemistry. 1997. V.36. № 23. P.6968-6976.

40. Breukink E., Wiedemann I., van Kraaij C., Kuippers O., Sahe II. Use of the cell wall precursor Lipid II by a pore forming peptide antibiotic // Science. 1999. V.286. P.2361-2363.

41. Broberg A., Jacobsson K., Strôm K., Schniirer J. Metabolite profiles of lactic acid bacteria in grass silage // Appl. Environ. Microbiol. 2007. V.73. №17. P.5547-5552.

42. Budin-Verneuil A., Maguin E., Auffray Y., Dusko S., Pichereau V. An essential role for arginine catabolism in the acid tolerance of Lactococcus lactis MG1363 // Lait. 2004. V.84. №1-2. P.61-68.

43. Carolissen-Mackay V., Arendse G., Hastings J.W. Purification of bacteriocins of lactic acid bacteria: problems and pointers // Int. J. Food Microbiol. 1997. V.34. P. 1-16.

44. Cascales E, Buchanan SK, Duché D, Kleanthous C, Lloubès R, Postle K, Riley M, Slatin S, Cavard D. Colicin biology//Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2007. V.71. №.1. P.158-229.

45. Chen H, Hoover D.G. Bacteriocins and their food applications // Comp. Rev. Food Sci. Safety. 2003. V.2. №3. P.82-100.

46. Christensen H.R, Frakier H., Pestka, J.J. Lactobacilli differentially modulate expression of cytokines and maturation surface markers in murine dendritic cells // J. Immunol. 2002. V.168. №.1. P.171-178.

47. Claisse, O., Lonvaud-Funel A. Assimilation of glycerol by a strain of Lactobacillus collinoides isolated from cider//Food Microbiol. 2000. V.17. №5. P.513-519.

48. Cleveland J., Montville T., Nes I., Chikindas M. Bacteriocins: safe, natural antimicrobials for food preservations // Int. J. Food Microbiol. 2001. V.71. P.l-20.

49. Coallier-Ascan J., Idziac E. Interaction between Streptococcus lactis and Aspergillus flavus on production of aflatoxin // Appl. Env. Microbiol. 1985. V.49. №1. P. 163-167.

50. Commane D., Hughes R., Shortt C., Rowland I. The potential mechanisms involved in the anti-carcinogenic action of probiotics// Mutat. Res. 2005. V.591. №1-2. P.276-289.

51. Courvalin P. Antibiotic resistance: the pros and cons of probiotics // Dig. Liver. Dis. 2006. V.38. №2. P.S261-S265.

52. Cuozzo S., Castellano P., Sesma F., Vignolo G., Raya R. Differential roles of the two-component peptides of lactocin 705 in antimicrobial activity // Curr. Microbiol. 2003. V.46. №3. P. 180-183.

53. Cutter C.N., Willett J.L., Siragusa G.R. Improved antimicrobial activity of nisin-incorporated polymer films by formulation change and addition of food grade chelator // Lett. Appl. Microbiol. 2001. V.33. №4. P.325-328.

54. Dalet K., Cenatiempo Y., Cossart P., Hechard Y. A sigma(54)-dependent PTS permease of the mannose family is responsible for sensitivity of Listeria monocytogenes to mesentericin Y105 // Microbiol. 2001. V.147. №.12. P.3263-3269.

55. Dalie D.K., Deschams A.M. Richard-Forget. Lactic acid bacteria potential for control of mould growth and mycotoxins: A review // Food Control. 2010. V.21. P.370-380.

56. Davey G.P., Richardson, B.C. Purification and some properties of diplococcin from Streptococcus cremoris 346 // Appl. Environ. Microbiol. V.1981. №41. P.84-89.

57. De Vuyst L., Leroy F. Bacterioeins from lactic acid bacteria: production, purification and food applications // J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2007. V.13. №4. P. 194-199.

58. Diep D.B., Havarstein L.S., Nes I.F.Haracterization of the locus responsible for the bacteriocin production in Lactobacillus plantarum Cll // J. Bacteriol. 1996. V.178. №15. P.4472-4483.

59. Diep D.B., Skaugen M., Salehian Z., Holo H., Nes I. Common mechanisms of target cell recognition and immunity for class II bacteriocins // PNAS. 2007. V.104. №7. P.2384-2389.

60. Draper, L.A., Ross, R.P., Hill, C. and Cotter, P.D. Lantibiotic immunity // Curr. Prot. Pept. Sci. 2008. V.9. №1. P.39^19.

61. Drider D, Fimland G., Héchard Y., McMullen M., Prévost H. The Continuing Story of Class Ha Bacteriocins // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2006. V.70. №2. P.564-582.

62. Drouault S., Corthier G., Dusko S. E, Renault P. Survival, physiology, and lysis of Lactococcus lactis in the Digestive Tract // Appl. Environ. Microbiol. 1999 V.65. №11. P.4881-4886.

63. Dufour A, Hindre T, Haras D, Le Pennec JP. The biology of lantibiotics from the lacticin 481 group is coming of age // FEMS Microbiol. Rev. 2007. V.31. №2. P. 134-167.

64. Ferchichi M., Fathallah M., Mansuelle P., Rochat H., Sabatier J., Mana M., Mabrouk K. Chemical synthesis, molecular modeling, and antimicrobial activity of a novel bacteriocin, MMFII // Biochem. Biophys. Res. Commua 2001. Y.289. №1. P.13-18.

65. Ferchichi M., Frère J., Mabrouk K., Manai M. Lactococcin MMFII, a novel class lia bacteriocin produced by Lactococcus lactis MMFII, isolated from a Tunisian dairy product // FEMS Microbiol. Lett. 2001. V.205. №1. P.49-55.

66. Fimland G., Eijsink J., Nissen-Meyer J. Comparative studies of immunity proteins of pediocin like bacteriocins // Microbiology. 2002. V.148. №11. P.3661-3670.

67. Florianowicz T. Antifungal activity of some microorganisms against Pénicillium expansum //Europ. Food Res.Technol. 2001. V.212. №3. P.282-286.

68. Franz C., van Belcum M., Holzapfel W., Abriouel II., Galvez A. Diversaty of enterococcal bacteriocins and their in a new classification scheme // FEMS Microbiol. Rev. 2007. V.31. №3. P.293-310.

69. Fritz J.S., P.J. Dumont, L.W. Schmidt. Methods and materials for solid-phase extraction // J. Chromât. 1995. V.691. P. 133-140.

70. Galvez A., Lopez R., Abriouel H., Valdivia E., Omar N. Application of bacteriocins in the control of foodborne pathogenic and spoilage bacteria // Crit. Rev. Biotechnol. 2008. V.28. №2. P. 125-52.

71. Ganesan B., Stuart MR., Weimer BC. Carbohydrate Starvation Causes a Metabolically Active but Nonculturable State in Lactococcus lactis II Appl. Environ. Microbiol. 2007. V. 73. №8. P.2498-2512.

72. Gânzle M. G., Weber S., Hammes W. P. Effect of ecological factors on the inhibitory spectrum and activity of bacteriocins // Int. J. Food Microbiol. 1999. V. 46. №3. P. 207-217.

73. Garneau S., Martin N., Vederas J. Two-peptide bacteriocins produced by lactic acid bacteria // Biochimie. 2002. V.84. №5-6. P.577-592.

74. Geier M.S., Butler R.N., Howarth G.S., Probiotics, prebiotics and synbiotics: A role in chemoprevention of colorectal cancer? // Cancer Biol. Ther. 2006. V.5. №10. P. 1265-1269.

75. Gérez C.G., Torino M. I., Rollan G., de Valdez G. Prevention of bread mould spoilage by using lactic acid bacteria with antifungal properties // Food Control. 2009. V.20. №2. P.144-148.

76. Gill H.S., Rutherfurd K.J., Prasad J, Gopal P.K. Enhancement of natural and acquired immunity by Lactobacillus rhamnosus (HN001), Lactobacillus acidophilus (HNO 17) and Bifidobacterium lactis (HNO 19) // Br. J. Nutr. 2000. V.83. № 2. P. 167-171.

77. Gillor 0., Etzion A., Riley M. The dual role of bacteriocins as anti- and probiotics // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2008. V.81. №4. P.591-606.

78. Gong H.S., Meng X.C., Wang II. Mode of action of plantaricin MG, a bacteriocin active against Salmonella typhimurium II J. Basic Microbiol. 2010. V.50. №1. P.S37-45.

79. Gourbeyre P., Denery S., Bodinier M. Probiotics, prebiotics, and synbiotics: impact on the gut immune system and allergic reactions // J. Leukocyte Biology. 2011. V.89. №5. P.685

80. Guerra N. P., Rua M. L., Pastrana L. Nutritional factors affecting the production of two bacteriocins from lactic acid bacteria on whey // Int. J. Food Microbiol. 2001. V.70. №3.

81. Guinane M., Cotter P., Lawton E., Hill C., Ross P. Insertional mutagenesis to generate lantibiotic resistance in Lactococcus lactis // Appl. Environ. Microbiol. 2007. V.73. №14. P.4677-4680.

82. Gupta P., H. Andrew B.S. Kirschner S. Guandalini. Is Lactobacillus GG helpful in children with Crohn's disease? Results of a preliminary, open-label study // J. Pediatr.Gastroenterol. Nutr. 2000. V.31. №4. P.453-457.

83. Gut I., Prouty A., Ballard J., van der Donk W., Blanke S. Inhibition of Bacillus anthracis spore outgrowth by nisin // Antimicrob. Agents Chemother. 2008. V.52. №12. P.4281-4288.

84. Haese A., Keller U. Genetics of actinomycin C production in Streptomyces chrysomallus II J. Bacteriol. 1988. V.170. №3. P.1360-1368.

85. Han K.S., Kim Y., Kim S.H., Oh S. Characterization and purification of acidocin IB, a bacteriocin produced by Lactobacillus acidophilus GP1B // J. Microbiol. Biotechnol. 2007. V.17. №5. P.774-83.

86. Hartke A., Boushe S., Gansel X., Boutibonnes P. Starvation- induced stress resistance in Lactococcus lactis subsp. lactis IL1403 // Appl. Environ. Microbiol. 1994. V.60. №9. P.3474-3478.

87. Hasper II.E., Kruijff B., Breukink E. Assembly and Stability of Nisin-Lipid II Pores // Biochemistry. 2004. V.43. №36. P. 11567-11575.

88. Hasper H.E, Kramer N.E, Smith J.L, Hillman J.D, Zachariah C, Kuipers O.P, de Kruijff B, Breukink E. An alternative bactericidal mechanism of acticy>-for lantibiotic peptides that target Lipid II // Scienc <¿7695.1. P.267-281.

89. Hastings, J., Sailer M., Johnson K., Roy K., Vederas J., Stiles M. Characterization of leucocin A-UAL 187 and cloning of the bacteriocin gene from Leuconostoc gelidum II J. Bacteriol. 1991. V.I73. № 23. P.7491-7500.

90. Hauge H., Mantzilas D., Eijsink V., Nissen-Meyer J. Membrane-Mimicking Entities Induce Structuring of the Two-Peptide Bacteriocins Plantaricin E/F and Plantaricin J/K // J. Bacteriology. 1998. V.181. №3. P.740-747.

91. Hechard Y., Berjeaud J.M., Cenatiempo Y. Characterization of the mesB gene and expression of bacteriocins by Leuconostoc mesenteroides Y105 // Curr. Microbiol. 1999. V.39. №5. P.265-269.

92. Hechard Y., Sahl H. Mode of action of modified and unmodified bacteriocins from Grampositive bacteria // Biochimie. 2002. V.84. №5-6. P.545-57.

93. Henderson J., Chopko A., Dick van Wassenaar P. Purification and primary structure of pediocin PA-1 produced by Pediococcus acidilactici PAC-1.0 // Arch. Biochem. Biophys. 1992. V.295. №1. P.5-12.

94. Hirsh A. Growth and nisin production of a strain of the Streptococcus lactis // J. Gen. Microbiol. 1951. V.5. P.208-221.

95. Hoick A., Xelssons L., Birkeland SE., Aukrust T., Blom H. Purification and amino acid sequence of sakacin A, a bacteriocin from Lactobacillus sake Lb706 // J. Gen. Microbiol. 1992. V.138. №12. P.2715-2720.

96. Holo H., Jeknic Z., Daeschel M., Stevanovic S., Nes I. Plantaricin W from Lactobacillus plantarum belongs to a new family of two-pcptide lantibiotics // Microbiology. 2001. V. 147. №3. P.643-651.

97. Holo H., Nielsscn O., Nes l.F. Lactococcin A, a new bacteriocin from Lactococcus lactis subsp. cremoris: isolation and characterization of the protein and its gene // J. Bacteriol. 1991. V.173.№12. P.3879-3887.

98. Ilolzapfel W.H., P. Habcrer P., Geisen R., Bjorkroth J., Schillinger U. Taxonomy and important features of probiotic microorganisms in food and nutrition // Am. J. Clin. Nutr. 2001. V.73. №2. P.365S-373S.

99. Hooper L.V., Wong M.H., Thelin A., Hansson L„ Falk P.G., Gordon J.I. Molecular analysis of commensal host-microbial relationships in the intestine // Science. 2001. V.291. №5505. P.881-884.

100. Hosono A., Satake N. Isolation and characterizationof superoxide dismutasc from Lactococcus lactis subsp. cremoris R-48 // Anim. Sci. Techno 1. 1993. V.64. №6. P.599-604.

101. Hiihne, K., Axelsson L., Hoick A., Krockel A. Analysis of the sakacin P gene cluster from Lactobacillus sake Lb674 and its expression in sakacin-negative Lb. sake strains // Microbiology. 1996. V.l42. №6. P.1437-1448.

102. Huot E., Barrena-Gonzalez C., Petitdemange H. Tween 80 effect on bacteriocin synthesis by Lactococcus lactis subsp. cremoris J46 // Lett. Appl. Microbiol. 1996. V.22. №4. P.307-310.

103. Hurst A. Nisin//Adv. Appl. Microbiol. 1981. V.27. P.85-123.

104. Iannitti T., Palmieri B. Therapeutical use of probiotic formulations in clinical practice // Clin. Nutr. 2010. Vol.29. №6. P.701-725.

105. Immonen N., Karp M. Bioluminescence-based bioassays for rapid detection of nisin in food // Biosens. Bioelectron. 2007. V.22. №9-10. P. 1982-1987.

106. Jack R., Tagg J., Ray B. Bacteriocins of gram-positive bacteria // Microbiol. Mol. Biol. Reviews. 1995. V.59. №2. P. 171-200.

107. Jay M., Loessner M., Golden D. Modern food microbiology. 7 Edt. Springer. Scicncc Business Media. Inc. 2005. P.336-339.

108. Ji G.E. Probiotics in primary prevention of atopic dermatitis // Forum Nutr. 2009. V.61. P. 117-128.

109. Joerger R. Alternatives to antibiotics: bacteriocins, antimicrobial peptides and bacteriophages // Poultry Sci. 2003. V.82. №4. P.640-647.

110. Juillard V., le Bars D., Kunji E., Konings W., Gripon J., Richard J. Oligopeptides are the main source of nitrogen for Lactococcus lactis during growth in milk // Appl. Environ. Microbiol. 1995. V.61. №8. P.3024-3030.

111. Kaktcham P.M., Zambou N.F., Tchouangucp F.M., El-Soda M., Choudhary M.I. Antimicrobial and Safety Properties of Lactobacilli Isolated from two Cameroonian Traditional Fermented Foods // Sci. Pharm. 2012. V.80№1. P. 189-203.

112. Kalliomaki M., Salminen S., Poussa T., Arvilommi H., lsolauri E. Probiotics and prevention of atopic disease: 4-year follow-up of a randomised placebo-controlled trial // Lancet. 2003. V.361. № 9372. P. 1869-1871.

113. Kaur G, Malik RK, Mishra SK, Singh TP, Bhardwaj A, Singroha G, Vij S, Kumar N. Nisin and class Ila bacteriocin resistance among Listeria and other foodborne pathogens and spoilage bactcria // Microb. Drug Resist. 2011. V. 17. №2. P. 197-205.

114. Kawai Y., Kemperman R., Kok J., Saito T. The Circular Bacteriocins Gassericin A and Circularin A // Cur. Prot. Pept. Sci. 2004. V.5. №5. P.393-398

115. Kimoto K., Nomura M., Kobayashi M., Mizumachi K., Okamoto T. Survival of lactococci during passage through mouse digestive tract // Canadian J. Microbiol. 2003. V.49. №11. P.707-711.

116. Kimoto-Nira II., Mizumachi K., Nomura M., Kobayashi M., Fujita Y., Okamoto T., Suzuki I., Tsuji N.M., Kurisaki JI., Ohmomo S. Lactococcus sp. as potential probiotic lactic acid bacteria // JARQ. 2007. V.41. №3. P. 181 -189.

117. Kjos M., Salehian Z., Nes I.F., Diep D.B. An extracellular loop of the mannose phosphotransferase system component IIC is responsible for specific targeting by class Ila bacteriocins // J. Bacteriol. 2010. V. 192. № 22. P.5906-5913.

118. Kleerebczem M., Quadri L., Kuipers O., de Vos W. Quorum sensing by peptide pheromones and two-component signal-transduction systems in Gram-positive bactcria // Mol. Microbiol. 1997. V.24. №5. P.895-904.

119. Konings WN, Kok J, Kuipers OP, Poolman B., 2000. Lactic acid bactcria: the bugs of the new millennium. // Curr. Opin. Microbiol. V.3. №3. P.276-282.

120. Koponen O., Tolonen M., Qiao M, Wahlstrom G., Helin J., Saris P. NisB is required for the dehydration and NisC for the lanthionine formation in the post-translational modification of nisin // Microbiol. 2002. V. 148. № 11. P.3561 -3568.

121. Kozak, W., Bardowski, J., Dobrzanski, W.T. Lactostrepcins-acid bacteriocins produced by lactic streptococci // J. Dairy Res. 1978. V.45. №2. P.247-257.

122. Kuipers O., Beerthuyzen M., de Ruyter B., Luesink E., de Vos M. Autoregulation of Nisin Biosynthesis in Lactococcus lactis by Signal Transduction // J. Biol. Chem. 1995. V.270. P.27299-27304.

123. Lavermicocca, P., Valerio, F., & Visconti, A. Antifungal Activity of Phenyllactic Acid against Molds Isolated from Bakery Products // Appl. Environ. Microbiol. 2003. V.69. №1. P.634-640.

124. Leroy F., De Vuyst L. The presence of salt and a curing agent reduces bacteriocin production by Lactobacillus sakei CTC 494, a potential starter culture for sausage fermentation// Appl. Environ. Microbiol. 1999. V.65. №12. P.5350-5356.

125. Leroy F., Verluyten J., De Vuyst L. Functional meat starter cultures for improved sausage fermentation // Int. J. Food Microbiol. 2006. V.106. №3. P.270-285.

126. Lertcanawanichakul M. Isolation and selection of Anti-Candida albicans producing lactic acid bacteria // Walailak J. Sci. Tech. 2005. V.2. №2. P. 179-187.

127. Leung D.Y., Boguniewicz M., Howell M.D. New insights into atopic dermatitis // J. Clin Invest. 2004; V.l 13. №5. P.651.

128. Li B., Paul J., von der Donk W., Nair S. Structure and mechanism of the lantibiotic cyclase involved in nisin biosynthesis // Science. 2006. V.311. №5766. P. 1464-1467.

129. Li B., van der Donk W. Identification of essential catalytic residues of cyclase NisC involved in biosynthesis of nisin //J. Biol. Chem. 2007. V.282 P. №29. P.21169-21175.

130. LiC, Bai J., Cai Z., Ouyang F. Optimization of a cultural medium for bacteriocin production by Lactococcus lactis using response surface methodology // J. Biotechnol. 2002. V.93. №1. P.27-34.

131. Li Y., Hugenholtz J., Abee T, Molenaar D. Glutathione protects Lactococcus lactis against oxidative stress // Appl. Environ. Microbiol. 2003. V.69. №10. P.5739-5745.

132. Liu X., Chung Y.K., Yang ST., Yousef A. Continuous nisin production in laboratory media and whey permeate by immobilized Laclococcus lactis // Process Biochem. 2005. V.40. №1. P. 13-24.

133. Lowe D., Arendt E. Lactic acid bacteria in malting and brewing with their relationships to antifungal activity, Micotoxins and Gushing: a review // J. Inst. Brew. 2004. V. 110. №3. P. 163-180.

134. Lozo J., Vukasinovic M., Strahinic I., Topisirovic L. Characterization and antimicrobial activity of bacteriocin 217 produced by natural isolate Lactobacillus paracasei subsp. paracasei BGBUK2-16 // J. Food Prot. 2004. V.67. №12. P.2727-34.

135. MacKay A., Taylor M., Kibbler C., Hamilton M. J. Lactobacillus endocarditis caused by a probiotic microorganism//Clin. Microbiol. Infect. 1999. V.5. №5. P.290-292.

136. Magnusson J. Antifungal activity of lactic acid bacteria. Ph.D. Thesis, Agraria 397, Swedish University of Agricultural Sciences, Uppsala, Sweden 2003.

137. Malago J.J., Tooten P.C.J., Koninkx J.F. Anti-inflammatory properties of probiotic bacteria on Salmonella-induced IL-8 synthesis in enterocyte-likc Caco-2 cells // Benef. Microbes. 2010. V. 1. №2. P. 121-130.

138. Maldonado A., Ruiz-Barba J., Jiménez-Díaz R. Purification and genctic characterization of plantaricin NC8, a novel coculture-inducible two-peptide bacteriocin from Lactobacillus plantarían NC8 //Appl. Env. Microbiol. 2003. V.69. №1. P.383-389.

139. Mantovani II., Russell J. 2001. Nisin resistans of Streptococcus bovis //Appl. Environ. Microbiol. 2001. V.67. №2. P.808-813.

140. Marciset O., Jeronimus-Stratingh M. C, Mollet B., Poolman B. Thcrmophilin 13, a nontypical antilisterial poration complex bacteriocin, that functions without a receptor // J. Biol. Chem. 1997. V.272. №22. P. 14277-14284.

141. Marteau P., Shanahan F. Basic aspects and pharmacology of probiotics: an overview of pharmacokinetics, mechanisms of action and side-effects // Best Pract. Res. Clin. Gastroenterol. 2003. V.17. №5. P.725-740.120

142. Martinez B., Bottiger T., Schneider T., Rodriguez A, Sahl H., Wiedemann I. Specific interaction of the unmodified bacteriocin Lactococcin 972 with the cell wall precursor lipid II //Appl. Environ. Microbiol. 2008. V.74. №15. P.4666-4670.

143. McAuliffe O., Ross R., Hill C. Lantibiotics: structure, biosynthesis and mode of action // FEMS Microbiol. Rev. 2000. V.25. №3. P.285-308.

144. Moll G., van den Akkcr E., Hauge H., Nissen-Meyer J., Nes I., Konings W., Driessen A. Complementary and overlapping selectivity of the two-peptide bacteriocins plantaricin EF and JK // J. Bacteriol. 1999. V. 181. № 16. P.4848-52.

145. Mondragon-Parada M. E., Najera-Martinez M., Juarez-Ramirez C., Galindez-Mayer J., Ruiz-Ordaz "N., Cristiani-Urbina, E. Lactic acid bacteria production from whey // Appl. Biochem. Biotech. 2006. V.134. № 3. P.223-232.

146. Montville T. J., Chen Y. Mechanistic action of pediocin and nisin: recent progress and unresolved questions // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1998. V.50. № 5. P.511-519.

147. Morgan S., Ross R.P., Hill C. Bacteriolytic activity caused by the presence of a novel lactococcal plasmid encoding lactococcins A, B, and M // Appl. Environ. Microbiol. 1995. V.61. №8. P.2995-3001.

148. Mota-Meira M., Lapointe G., Lacroix C., Lavoie M. MICs of mutacin B-Ny266, nisin A, vancomycin, and oxacillin against bacterial pathogens // Antimicrob. Agents Chemother. 2000. V.44. №1. P.24-29.

149. Motlagh A., Bhunia A., Szostek F., Hansen T.R., Johnson M.C., Ray B. Nucleotide and amino acid sequence of pap-gene (pediocin AcH production) in Pediococcus acidilactici II // Lett. Appl. Microbiol. 1992. V.15. №2. P.45-48.

150. Mulders J., Boerrigter I., Rollema H., Siezcn R., de Vos W. Identification and characterization of the lantibiotic nisin Z, a natural nisin variant // Eur. J. Biochem. 1991. V.201. №3. P.581-584.

151. Muriana P.M., Klaenhammer T.R. Purification and partial characterization of lactacin F, a bacteriocin produced by Lactobacillus acidophilus 11088. // Appl. Env. Microbiol. 1991. V.57. №1. P.l 14-121.

152. Nes I., Diep D., Havarstein L., Holo H. Biosynthesis of bacteriocins in lactic acid bacteria // Anthonie Van Leevwenhoek. 1996. V.70. №2-4. P.l 13-128.

153. Nes I.F, Yoon S-S., Diep D.B. Food Sci Biotechnol. Ribosomally Synthesiszed Antimicrobial Peptides (Bactcriocins) in Lactic Acid Bacteria: A Review // Food Sci. Biotechnol. 2007. V.16. №5. P.675-690.

154. Nicolosi R J., Rogers E.J., Kritschevsky D., Scimeca J.A., Huth, P.J. Dietary conjugated linoleic acid reduces plasma lipoproteins and early aortic atherosclerosis in hypercholestcrolemic hamsters // Artery. 1997. V.22. №5. P.266-277.

155. Nissen-Meyer J., Hob II., Hâvarstein L.S., Sletten K, Nes I.F. A novel lactococcal bacteriocin whose activity depends on the complementary action of two peptides // J. Bacteriol. 1992. V.174. №17. P.5686-5692.

156. Nomura T., Tsuchiya Y., Nashimoto A., Yabusaki H., Takii Y., Nakagawa S., Sato N., Kanbayashi C., Tanaka O. Probiotics reduce infectious complications after pancreaticoduodenectomy// Hepatogastroenterology. 2007. V.54. №75. P.661-663.

157. Oelschlaeger T.A. Mechanisms of probiotic actions A review // Int. J. Med. Microbiol. 2010. V.300. №l.P.57-62.

158. Oppegârd C., Rogne P., Emanuelsen L., Kristiansen E., Fimland G., Nissen-Meyer J. The two-peptide class II bacteriocins: structure, production, and mode of action // J. Mol. Microbiol. Biotcchnol. 2007. V.13. №4. P.210-219.

159. Opsata M., Nes I.F., Holo H. Class IIa bacteriocin resistance in Enterococcus faccalis V583: the mannose PTS operon mediates global transcriptional responses // BMC Microbiol. 2010. V.10. P.224.

160. Palacios J., Vignolo G., Farias M.E., de Ruis I lolgado A.R., Oliver G, Sesma F. Purification and amino acid sequence of lactocin 705, a bacteriocin produced by Lactobacillus casei CRL 705 // Microbiol. Res. 1999. V. 154. №2. P. 199-204.

161. Papagianni M., Anastasiadou S. Pediocins: The bacteriocins of Pediococci. Sources, production, properties and applications // Microb. Cell Fact. 2009. V.8. P.3-9.

162. Parente E., Brienza C., Ricciardi A., Addario G. Growth and bacteriocin production by Enterococcus faecium DPC1146 in batch and continuous culture // J. Ind. Microbiol. Biotcchnol. 1997. V.18. P.62-67.

163. Parente E., Ricciardi A., Addario G. Influence of pH on growth and bacteriocin production by Lactococcus lactis subsp. lactis 140NWC during batch fermentation // Appl. Microbiol. Biotechnology. 1994. V.41. №4. P.388-394.

164. Pessi T., Sütas Y., Hurme M., Isolauri E. Interleukin-IO generation in atopic children following oral Lactobacillus rhamnosus GG // Clin. Exp. Allergy. 2000. V.30. №12. P. 1804-1808.

165. Pongtharangkul T, Demirci A. Evaluation of agar diffusion bioassay for nisin quantification // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2004. V.65. №3. P.268-272.

166. Pongtharangkul T. Demirci A. Evaluation of Culture Medium for Nisin Production in a Repeated-Batch Biofilm Reactor// Biotechnol. Prog. 2006. V.22. №1. P.217-224.

167. Quadri L., Sailers M., Ron K.L., Vederass J.C., Stiles M. Chemical and genetic characterization of bacteriocins produced by Carnobacterium piscícola LV17B // J. Biol. Chem. 1994. V.269. №16. P. 12204-12211.

168. Rallu F., Gruss A., Ehrlich D. Maguin E. Acid- and multistress-resistant mutants of Lactococcus lactis : identifcation of intracellular stress signals // Mol. Microbiol. 2000. V.35.№3. P.517-528.

169. Rautio M., Jousimies-Somer H., Kauma H., Pietarinen I., Saxelin M., Tynkkynen S., Koskela M. Liver abscess due to a Lactobacillus rhamnosus strain indistinguishable from L. rhamnosus strain GC, // Clin. Infcct. Dis. 1999. V.28. №5. P. 1159-1160.

170. Reunanen J., Saris PE. Microplate bioassay for nisin in foods, based on nisin induced GFP-fl uorescence//Appl. Environ. Microbiol. 2007. V.69. №7. P.4214-4218.

171. Rose N.L., Sporns P., Dodd H.M., Gasson M.J., Mellon F.A., McMullen L.M. Involvement of dehydroalanine and dehydrobutyrine in the addition of glutathione to nisin // J. Agricult. Food Chem. 2003. V.51. № 10. P.3174-3178.

172. Ross R., Galvin M„ McAuliff 0., Morgan S., Ryan M., Twomey D., Meaney W., Hill C. Developing applications for lactococcal bacteriocins // Anthonie Van Leevwenhoek. 1999. V.76. №1-4. P.337-346.

173. Rouse S., Harnett D., Vaughan A., D. van Sinderen. Lactic acid bacteria with potential to eliminate fungal spoilage in foods //J. Appl. Microbiol. 2008. V.104. №3. P.915-923.

174. Roy U., Batish V., Grover S., Neelakantan S. Production of antifungal substancc by Lactococcus lactis subsp. lactis CHD-28.3 // Int. J. Food Microbiol. 1996. V.32. P.27-34.

175. Sakamoto I., Igarashi M., Kimura K., Takagi A., Miwa T., Koga Y. Suppressive effect of Lactobacillus gasseri OLL 271621 on Helicobacter pylori infection in humans // J. Antimicrob. Chemother. 2001. V.47. № 5. P.709-710.

176. Salcido N., Salccdo-Hernandez R., Alanis-Guzman M., Bidcshi D., Barbosa-Corona J. A new rapid fluorogenic method for measuring bacteriocin activity // J. Microbiol. Methods. 2007. V.70. №1. P. 196-199.

177. Salminen S. Lactic acid bacteria: microbiology and functional aspects. 2 Ed. New York. 1998. Marcel Dekker Inc. P. 14-22.

178. Salminen, S., Ouwehand A., Benno Y., Lee Y.K. Probiotics: how should they be defined? // Trends Food Sci. Technol. 1999. V.10. №3. P. 107-110.

179. Samarzija D., Antunac N., Havranek J. Taxonomy, physiology and growth of Lactococcus lactis: a review // Mljekarstvo. 2001. V.51. №1. P.35-48.

180. Sanders J., Vcnema G., Kok J. Environmental stress responses in Lactococcus lactis II FEMS Microbiol. Rev. 1999. V.23. P.483-501.

181. Sathe S., Nawani N., Dhakephalker P., Kapadnis B. Antifungal lactic acid bacteria with potential to prolong shelf-life of fresh vegetables // J. Appl. Microbiol. 2007. V. 103. №6. P.2622-2628.

182. Schmitz S., Hoffmann A., Szekat S., Rudd B., Bierbaum G. The lantibiotic mersacidin is an autoinducing peptide // Appl. Environ. Microbiol. 2006. V.72. №11. P.7270-7277.

183. Schnürer J., Magnusson J. Antifungal lactic acid bacteria as biopreservatives // Trends Food Sci. Technol. 2005. V.16. №1-3. P.70-78.

184. Shu Q„ Lin II., Rutherfurd K.J. Fenwick S.G., Prasad J., Gopal P.K., Gill U.S. Dietary Bifidobacterium lactis (HN019) enhances resistance to oral Salmonella typhimurium infection in mice// Microbiol. Immunol. 2000. V.44. №4. P.213-222.

185. Simon L., Fremaux C., Cenaliempo Y., Berjeaud J.M. Sakacin G, a new type of antilisterial bacteriocin // Appl. Environ . Microbiol. 2002. V.68. №12. P.6416-6420.

186. Sjogren J., Magnusson J., Broberg A., Schniirer A., Kenne L. Antifungal 3-Hydroxy Fatty Acids from Lactobacillus plantarum MiLAB 14 //Appl. Environ. Microbiol. 2003. V.69. №12. P.7554-7557.

187. Soccol C.R., de Souza Vandenberghe L.P., Spier M.R., Medeiros A.B., Dc Dea Lindner Y.J., Pandcy A., Thomaz-Soccol V. The Potential of Probiotics: A Review // Food Technol. Biotcchnol. 2010. V.48. №4. P.413-434.

188. Sova O. Separation of antibiotics by autofocusing // Electrophoresis. 1990. V. 11. №11. P.963-966.

189. Spackman D. H., Stein W. II., Moore S. Automatic recording apparatus for use in the chromatography of amino acids // Anual. chem. 1958. V.30. P.l 190-1196.

190. Stein, T., Heinzmann, S., Solovieva, I. and Entian, K.D. Function of Laclococcus laclis nisin immunity genes nisi and nisFEG after coordinated expression in the surrogate host Bacillus subtilis II J. Biol. Chem. 2003. V.278. №1. P.89-94.

191. Tagg J.R., Dajani A.S., Wannamaker L.W. Bacteriocins of gram-positive bacteria // Bacteriol. Rev. 1976. V.40. №3. P.722-756.

192. Takagi A., Matsuzaki T., Sato M., Nomoto K., Morotomi K., Yokokura T. Enhancement of natural killer cell cytotoxicity delayed murine carcinogenesis by a probiotic microorganism II Carcinogenesis. 2001. V.22. №4. P.599-605.

193. Tannock G. W. A Special Fondness for Lactobacilli // J. Appl. Environ. Mikrobiol. V.70. №6. P.3189-3194

194. Tichaczek P., Vogel R., I lammes W. Cloning and sequencing of curA encoding curvacin A, the bacteriocin produced by Lactobacillus curvatus LTHI174 // Arch. Microbiol. 1993. V. 160. №4. P.279-283.

195. Toh Z.Q., Anzcla A., Tang M.L., Licciardi P.V. Probiotic therapy as a novel approach for allergic disease// Front. Pharmacol. 2012. V.3. P. 1-14.

196. Topisirovic L., Kojic M., Fira D., Golic N., Strahinic I., Lozo J. Potential of lactic acid bacteria isolated from specific natural niches in food production and preservation // Int. J. Food Microbiol. 2006. V.l 12. №3. P.230-235.

197. Trias R., Bañeras L., Montesinos E., Badosa E. Lactic acid bacteria from fresh fruit and vegetables as biocontrol agents of phytopathogenic bacteria and fungi // Int. Microbiol. 2008. V.l l.№4. P.231-236.

198. Turovskiy E., Kashtanov D., Paskhover B., Chikindas M.L. Quorum sensing: fact, fiction, and everything in between // Adv. Appl. Microbiol. 2007. V.62. P. 191-234.

199. Van Reenen C., Dicks L., Chikindas M. Isolation, and purification and partial characterization of plantaricin 423, a bacteriocin produced by Lactobacillus plantarían II J. Appl. Microbiol. 1998. V.84. №6. P.l 131-1137.

200. Wahlstom G., Saris P.E.J. 1999. Nisin bioassay based on bioluminescence // Appl. Environ. Microbiol. 1999. V.65. №8. P.3742-3745.

201. Wang H.K., Yan Y.H., Wang J.M., Zhang H.P., Qi W. Production and Characterization of Antifungal Compounds Produced by Lactobacillus plcmtarum 1MAU10014 // PlosOne. 2012. V.7. №l.e29452.

202. Widemann I., Bottiger T., Bonelli R., Schneide T., Sahl H., Martínez B. Lipid II-based antimicrobial activity of the lantibiotic plantaricin C // Appl. Environ. Microbiol. 2006. V.72. №4. P.2809-2814.

203. Wiedemann I., Benz R., Sahl II. Lipid II-mediated pore formation by the peptide antibiotic nisin: a black lipid membrane study // J. Bacteriol. 2004. V.l 86. №10. P.3259-3261.

204. Wiedemann I., Breukink E., van Craaij C., Kuipers O., Bierbaum G., de KruijiTB., Sahl I I.

205. Specific binding of nisin to the peptidoglican precursor Lipid II combines pore formation127and ingnbition of cell wall biosynthesis for potent antibiotic activity // J. Biol. Chem. 2001. V.276. №3. P.l 772-1779.

206. Willey M., van der Donk W. Lantibiotics: Peptides of diverse structure and function // Ann. Rev. Microbiol. 2007. V.61. P.477-501.

207. Wiseman D.W., Marth E. H. Growth and aflatoxin production by Aspergillus parasiticus when in the presence of Streptococcus lactis II Mycopathologia. 1981. V.73. №1. P.49-56.

208. Wollowski I., Rechkemmer G., Pool-Zobel B.L. Protective role of probiotics and prebiotics in colon cancer//Am. J. Clin. Nutr. 2001. V.73. №2. P.451S-455S.

209. Xie L., Miller L.M., Chatterjee C., Averin O., Kelleher N„ van der Donk W. Lacticin 481 : in vitro reconstitution of lantibiotic synthetase activity // Science. 2004. V.303. №5658. P.679-681.

210. Yamamoto Y., Togawa Y., Shimosaka M., Okazaki M. Purification and characterization of a novel bacteriocin produced by Enterococcus faecalis strain RJ-11 // Appl. Environ. Microbiol. 2003. V.68. P.5746-5753.

211. Yamazaki K., Suzuki M., Kawai Y., Inoue N., Montville T.J. Purification and haracterization of a novel class 11a bacteriocin, piscicocin CS526, from Suriniassociated Carnobacteriumpiscicola CS526 // Appl. Environ. Microbiol. 2005. V.7I. P.554-557.

212. Yanagida F., Chen Y., Shinohara T. Searching for bacteriocin-produsing LAB in soil // J. Gen. Appl. Microbiol. 2005. V.52. №1. P.21-28.

213. Yang E.J., Chang H.C. Purification of a new antifungal compound produced by Lactobacillus plantarum AF1 isolated from kimchi // Int. J. Food Microbiol. 2010. V.139. №1-2. P.56-63.

214. Yang R., Ray B. Factors influencing production of bacteriocins by lactic acid bacteria // Food Microbiol. 1994. V.l 1. №4. P.281-291.

215. Yang Z. Academic dissertation. 2000. Department of Food Technology, University of Helsinki.

216. Zendo T., Koga S., Shigeri Y., Nakayama J., Sonomoto K. Lactococcin Q, a novel two-peptide bacteriocin produced by Lactococcus lactis QU 4 // Appl. Environ. Microbiol. 2006. V.72. №5. P.3383-3389.

217. Zendo T., Yoneyama F., Sonomoto K. Lactococcal membrane-permeabilizing antimicrobial peptides//Appl. Microbiol. Biotech. 2010. V.88. №1. P.l-9.

218. Zhou X., Pan Y-J., Wang Y.-B., Li W.-F. Optimization of medium composition for nisin fermentation with response surface methodology // J. Food Sci. 2008. V.73. №6. P.245-249.c7p- J à

Информация о работе

Устюгова, Екатерина Александровна
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.02.03

Диссертация

Синтез антибиотического комплекса широкого спектра действия лактококком Lactococcus lactis subsp. lactis 194-K - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы