Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение активных бактериоцинобразующих лактококков и их практическое использование

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Выделение активных бактериоцинобразующих лактококков и их практическое использование"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М. В. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГ ИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

СУЛЬТИМОВА Татьяна Доржиевна

ВЫДЕЛЕНИЕ АКТИВНЫХ БАКТЕРИОЦИНОБРАЗУЮЩИХ ЛАКТОКОККОВ И ИХ ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ

Специальность 03.00.07 - Микробиология 03.00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2006

Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Нетрусов Александр Иванович (03.00.23 -биотехнология)

кандидат биологических наук Стоянова Лидия Григорьевна (03.00.07 - микробиология) Официальные оппоненты:

доктор технических наук Нефедова Нина Васильевна кандидат биологических наук Загустина Наталья Алексеевна

Ведущее учреждение: ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности (ВНИМИ РАСХН).

Защита диссертации состоится 19 декабря 2006 г. в 15 ч 30 мин на заседании диссертационного совета Д 501.001.21 при Московском государственном университете им. М. В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва. Ленинские горы. МГУ, д. 1, корп. 12, Биологический факультет, аудитория ЗА.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан «17» ноября 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

Н. Ф. Пнскункова

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

В последние годы наблюдается возросший интерес к бактериоцинобразующим лактококкам Lactococcus lactis subsp, lactis, которые вследствие своей безопасности, высокой ферментативной и антимикробной активности являются объектом фундаментальных исследований по созданию новых активных пробиотиков и биологических консервантов. Одним из главных аспектов этого интереса является возросший спрос потребителей к качеству продуктов питания и их безопасности для здоровья, поскольку широко используемые химические консерванты, увеличивающие срок хранения продуктов питания, вызывают опасения (Ross et al., 1999; Konings et al., 2000; O'Sullivan, 2002). С точки зрения специалистов молочнокислые бактерии, называемые пробиотиками, участвуют во всех физиологических процессах организма. Сегодня использование пробиотических культур, способных восстанавливать микробиоту желудочно-кишечного тракта, может вытеснить потребление огромного количества химических лекарственных препаратов (Шаблин, 2001; Тешшгешап, 2003; Киркман, 2004; Бондаренко и др., 2006).

В настоящее время молочнокислые стрептококки по систематическому положению выделены из группы микроорганизмов рода Streptococcus, включающего и патогенные формы, и под новым названием Lactococcus отнесены к категории «GRAS», куда относятся микроорганизмы, не вызывающие инфекционных заболеваний человека и животных. Наряду с молочной кислотой установлена роль других метаболитов молочнокислых бактерий (МКБ), ингибирующих развитие бактерий: перекиси водорода, уксусной и бензойной кислот, ацетоина, диацетила. Однако ведущее место в объяснении явления антагонизма МКБ отводится специфическим антибиотическим веществам белковой природы - бактериоцинам (Jack et al., 1995; Parente, Ricciardi, 1999). Синтез бактериоципов штаммоспецифичен и зависит от активности продуцента й условий его культивирования (Biswas et al., 1991; De Vuyst, Vandamme, 1993; Leroy et al., 2001).

Бактериоцины, синтезируемые лактококками, отличаются по молекулярной массе, аминокислотному составу, биологическому действию на ряд микроорганизмов, включая патогенные формы: листерии, бациллы и стафилококки, развивающиеся в продуктах питания в процессе хранения и выделяющие токсины, что является причиной ряда заболеваний. Наиболее изученным и широко используемым в качестве биологического консерванта является бактериоцип низин, известный как полипептидный антибиотик низин <iNisaplin» (фирма "Aplin

& Barrett, Ltd", Англия). Его используют при приготовлении консервов и пресервов, поскольку при этом снижается длительность термообработки и, следовательно, сохраняются биологическая и пищевая ценности продуктов (Chang et al., 1989; Nés et al., 1996; Ross et al., 2002). Бактериоцинобразующие культуры находят широкое применение при изготовлении молочных продуктов, колбасных изделий и ряда ферментированных продуктов (O'Sullivan, 2002; Krockel, 2002).

Цель и задачи исследования.

Целью исследования являлось выделение, идентификация бактериоцинобразующих штаммов лактококков из молока и молочных продуктов, и практическое их использование в качестве биоконсервантов.

Для выполнения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

1. Выделение бактериоцинобразующих штаммов из коровьего молока и национального кисломолочного продукта курунги, их идентификация.

2. Изучение физиолого-бихимических свойств выделенных штаммов.

3. Регуляция синтеза бактериоцина компонентным составом ферментационной среды и рН-статированием.

4. Выделение бактериоцина из наиболее перспективного штамма лактококка и изучение его физико-химических свойств.

5. Применение бактериоцинобразующего лактококка в качестве биологического консерванта.

Научная новизна работы

1. Из молока разных территориальных зон России и кисломолочного продукта курунга выделены новые бактериоцинобразующие штаммы с активностью, значительно превышающей активность природных штаммов.

2. Штаммы идентифицированы с использованием классических микробиологических методов и генотипического метода, основанного на анализе сходства нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК, как Lactococcus lactis subsp. ¡actis. Нуклеотидиые последовательности генов 16S рРНК новых штаммов депонированы в базу данных GcnBank под следующими номерами: DQ255951 - DQ255954.

3. Выделен активный штамм 194, синтезирующий антибиотический комплекс широкого спектра антимикробного и фунгицидного действия, что является малоизвестным биологическим свойством для вида Lactococcus lactis. subsp. lactis.

4. Оптимизирована ферментационная среда по фосфору, азоту и углеводному компоненту, что позволило, наряду с рН-статированием, увеличить выход бактериоцина на 58,6% (6500 МЕ/мл).

5. Изучен компонентный состав антибиотического комплекса и установлено, что выделенные компоненты являются новыми природными соединениями и не имеют аналогов в компьютерной базе данных биологически-активных веществ проф. И. Верди.

6. Проведены исследования по использованию штамма 194 для обеззараживания поверхности сырокопченых колбас.

7. Проведена идентификация гриба Aspergillus repens de Вагу, выделенного с поверхности зараженных сырокопченых колбас.

Практическая значимость

Выделенные штаммы пополнили коллекцию активных бактериоцинобразующих культур. Изучена диссоциация продуцента, что облегчает его селекцию при использовании в промышленном производстве. Оптимизирован процесс биосинтеза бактериоцина. Разработан лабораторный регламент на синтез бактериоцина L. Iaclis subsp. ¡aclis штаммом 194.

Полученные • результаты подтверждают эффективность использования бактсриоцинобразующего штамма L, ¡actis subsp. ¡aclis 194 в качестве биоконсерванта фунгицидного действия для обеззараживания сырокопченых колбас и увеличения срока их хранения (Акт испытания от 16.06.2006 г.).

Апробация результатов

Результаты диссертационной работы были представлены и доложены на различных конференциях: на Международном конгрессе "Poverty Food & Health in Welfare" (Lisbon, 2003), XI международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2004" (Москва, 2004), 19-ом Международном симпозиуме 1CFMH - FOOD MICRO 2004 (Slovenia, 2004), Международной конференции «Сохранение генетических ресурсов» (Санкт-Петербург, 2004), Всероссийском симпозиуме с международным участием «Биотехнология микробов» (Москва, 2004), Молодежной школы-конференции «Актуальные проблемы современной микробиологии» (Москва, 2005), Всероссийском симпозиуме с международным участием "Автотрофные микроорганизмы" памяти академика РАН Е. Н. Кондратьевой (Москва, 2005), 10-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых (Пущино, 2006).

Положения, выносимые па защиту

1. Выделение и идентификация новых штаммов бактериоцинобразующих лактококков из разных территориальных зон России.

2. Оптимизация синтеза бактериоцина компонентным составом ферментационной среды и рН-статировапием.

3. Выделение и изучение компонентного состава нового бактериоцина.

4. Использование нового перспективного штамма L. laclis subsp. ¡actis 194 в качестве биологического консерванта при хранении колбасных изделий.

5. Идентификация грибной микрофлоры с поверхности зараженных колбасных изделий.

Публикации

По материалу диссертации было опубликовано 10 печатных работ.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, рзультатов, их обсуждения, выводов, списка литературы (212 наименований) и приложений, которые включают лабораторный регламент на процесс синтеза бактериоцина Lactococcus laclis subsp. lactis штаммом 194 и акт испытания бактериоцинобразующего штамма Lactococcus 1actis subsp. ¡actis 194 от 16.06.2006 г. Работа изложена на 168 страницах машинописного текста, включает 18 таблиц и 22 рисунка.

Содержание работы

Материалы п методы исследовании

Для выполнения поставленных цели и задач использовали следующие материалы: молоко из разных территориальных зон России (городов Москвы, Клина, Улан-Удэ) и бурятский национальный кисломолочный лечебно-профилактический напиток смешанного молочнокислого и спиртового брожения курунга (Хунданов, 1975; Шаблин, 2001).

Выделение активных бактериоцинобразующих штаммов из молока проводили поэтапно: сначала были выделены кислотообразующие мезофильные, а затем бактериоцинобразующие лактококки (Стоянова и др., 2006). При выделении лактококков из курунги проводили дифференциацию молочнокислых бактерий и дрожжей, составляющих микробиоту курунги: 5% испытуемого материала высевали в жидкую среду MPC следующего состава (%): гидролизаг казеина - 1,0; глюкоза - 2,0; К2НРО4 ЗН20 - 0,2; дрожжевый экстраг - 0,5; ацетат Na - 0,5; MgSC>4 Н2О - 0,02; MnS04 Н2О - 0,005 с добавлением 2,5 мл 0,7% раствора цистеина, 0,1 мл

0,1% сорбиновой кислоты, 0,1 мл Твин-80 и параллельно на среду Сабуро для выращивания дрожжей, содержащую (%): глюкоза - 4,0; пептон - 1,0; агар - 1,8 и 0,01 левомицетина.

Экстракцию бактсриоцииа из культуральиой жидкости проводили смесью ацетон:уксусная кислота:вода в соотношении 5:1:4 (Баранова и др. 1990).

Антибиотическую активность определяли методом диффузии в агар с измерением зоны подавления роста тест-культуры Bacillus coagulons в мм (Егоров, 2004).

Определение молочной кислоты в культуральиой жидкости проводили методом титрования (Степаненко, 2005).

Идентификацию молочнокислых микроорганизмов осуществляли на основании морфологических, культуральных, физиолого-биохимических признаков в соответствии с определителем Берджи (Хоулт и др., 1997) и с помощью генотипического метода, основанного на анализе сходства нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК.

Молекулярно-биологические методы идентификации.

Осаждение и промывание биомассы, а также выделение нативной хромосомной ДНК проводили, как описано ранее (Лысенко и др., 2001). Для экспериментов по гибридизации ДНК экстрагировали и очищали по методу Мармура (Marmur, 1961). Плазмидную ДНК выделяли по щелочной методике (Anderson, McKay, 1983). Нуклеотидный состав ДНК определяли методом термической денатурации (Owen et al., 1969). Уровень ДНК-ДНК гибридизации определяли методом оптической реассоциации (De Leu et al., 1970). Рестрикцию плазмидном и геномной ДНК проводили по общепринятым методикам (Маниатис и др., 1984) с использованием эндонуклеаз рестрикции Sma!, PstI, Hind фирмы "Fermentas", согласно рекомендациям производителя. Электрофорез плазмидной ДНК проводили в агарозном геле в ТБЕ-буфере с использованием агарозы фирм США "Sigma" и "Хеликон" (Маниатис и др., 1984) при напряжении электрического поля 15 В/см с использованием маркеров ДНК фирмы «Fermentas». Пульс-гель электрофорез геномной ДНК проводили в 1% агарозном геле "Sigma" при напряжении поля 6 В/см в 0,5 х TBE при 14°С в аппарате CHEF-DRIII фирмы "Bio-Rad". Выделение тотальной ДНК для полимеразно-цепной реакции проводили с помощью набора для выделения ДНК Wizard Genomic DNA Purification Kit фирмы «Promega», согласно рекомендациям производи геля. Полимеразную цепную реакцию проводили с использованием реактивов фирмы «Fermentas», праймеров, специально подобранных нами и синтезированных фирмой «Синтол», с использованием амплификатора "Perkin Elmer". Компьютерный анализ подбора праймеров проводили с использованием компьютерных программ: NSB1 Blast 2 -

определение гомологии при изучении сиквенсов с соответствующих праймеров, Oligo 6.31 -основной расчет параметров ПЦР, возможности образования праймерами дуплексов и вторичных структур, определение мест нсспецифического связывания на матрице, Oligonucleotide Properties Calculator-определение температуры отжига праймеров и содержания G + С (%). Электрофорез амплифицированных фрагментов ДНК проводили в агарозном геле в ТБЕ-буфере с использованием агарозы фирмы "Sigma", при напряжении электрического поля 15 В/см с использованием маркеров фпагментов ДНК фирмы «Fermentas». Выделение и очистку ДНК из агарозного геля проводили с использованием набора для очистки ДНК фирмы «Sigma», согласно рекомендациям фирмы-производителя. Сиквенированнс очищенных фрагментов генов 16S рРНК проводили по методу Сэнгера (Senger et al., 1977), используя автоматический сиквенатор Beckman Coulter. Определение частичной нуклеотидной последовательности участка гена 16S рРНК проводили с использованием праймера 1F.

Филогенетический анализ последовательностей генов 16S рРНК проводили, исходя из анализа результатов сиквенирования с помощью компьютерных программ Vector NTI: Contig Express, AlignX. Сравнительный анализ и поиск гомологичных последовательностей проводили по базе NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). Фенотипическое сходство нуклеотидных последовательностей (400 п.н.) генов 16S рРНК изучаемых штаммов лактококков 115, 229, 194, К-205, МГУ устанавливали в сравнении с участками генов 16S рРНК референтных штаммов L. laclis subsp. lactis АВ11S035, AB118037, AB118033, AB118034, AB100798, AB 100795, AY675242, !.. lactis subsp. cremoris AB100792, получеипых из базы данных NCBI (Stevens ctal., 1991).

Ферментативную активность в отношении потребления ряда углеводов, проводили в ферментационной среде с добавлением по 1% ряда углеводов и 0,001% индикатора бромкрезолпурпурного (Стоянова и др., 1988).

Потребность выделенных штаммов в ростовых компонентах определяли по методу Ладерберга. Изучали влияние 20 амииокислот, 5 витаминов, пуриновых и пиримидиновых оснований, в ходящих а разных сочетаниях в среде культивирования, а методом дробного исключения определяли потребность в отдельных ростовых компонентах, способных включаться в метаболизм лактококков и синтез бактериоцина (Стоянова и др., 1999).

Антимикробный спектр действия определяли на разные группы микроорганизмов и грибов, используя в качестве контроля стандартные растворы низина, левомицетина и нистатина. В качестве тест-культур использовали микроорганизмы музея кафедры микробиологии МГУ им. М. В. Ломоносова.

Чувствительность к антибиотикам определяли диффузионным методом с использованием дисков, пропитанных антибиотиком в концентрациях 10-30 мкг. (Галкина, 1990; Стоянова, Егоров, 1999).

Регуляцию синтеза бактерноцина изучали по влиянию компонентов ферментационной среды на биосинтез бактериоцина. Эксперимент проводили по схеме методом изменения количества или дробного исключения составных компонентов среды: уменьшения содержания фосфатов в виде КН2РО4 от 2,0 до 0,5%, увеличение содержания или замены углеводного компонента, исключения дрожжевого автолизата, являющегося источником аминного азота, витаминов и нуклеотидных оснований. Динамику роста выделенных штаммов и синтеза бактериоцинов в среде оптимизированного состава изучали в стационарных условиях в течение 30 ч. Биомассу определяли нефелометрически па приборе ФЭК-56 при длине волны 560 нм, рН -потенциометрически.

Влияние рН-статирования на синтез бактериоцина проводили в ферментере фирмы LK.B объемом 5 л. Контроль процесса ферментации проводили по измерению оптической плотности культуры и антибиотической активности.

Изучали влияиие левомицетина как ингибитора синтеза белка на рост культуры, образование бактериоцина и синтез белка. Левомицетин добавляли в среду культивирования в количестве 100 мв*мл (Hirst, 1981).

Определение белка проводили методом Лоури с помощью спектрофотометра или ФЭКа при длине волны 750 нм (Lowry et al., 1951).

Изучали диссоциацию штамма 194 на агаровой среде, приготовленной на основе оптимизированной ферментационной среды следующего состава (%): NaCl- 0,2; КН2Р04 - 0,5; MgS04 — 0,02; сахароза - 2,0; дрожжевой автолизат, содержащий 35-40 мг% азота аммония. Для этого проводили рассев бактериальной суспензии с последующим отбором колоний разной морфологии (Милько и др., 1991). Выделенные колонии подращивали в ферментационной среде и определяли их антибиотическую активность методом диффузии в агар с последующим пересчетом по стандартным растворам низина, левомицетина, нистатина. В качестве тсст-культур использовали: для низина - Bacillus coagulans, левомицетина - Escherichia coli, для нистатина — Aspergillus niger.

Лиофилнзация штаммов. Культуры молочнокислых бактерий, выращенные на жидкой среде до стационарной стадии роста, центрифугировали с целью отделения клеток,

ресуспендировали в защитной среде, содержащий (в г/л): желатины — 10, сахарозы — 100 и лиофилизировали на установке фирмы «Крист» марки Бетга А (Германия) под вакуумом при температуре - ЗО'С до остаточной влажности 2,5 - 4,0%. Лиофильпо высушенные штаммы хранили в ампулах в условиях бытового холодильника при -18"С. После лиофилизации культуры восстанавливали и изучали их физиолого-биохимические свойства в процессе хранения (Стоянова, Аркадьева, 2000).

Для выделения н очистки бактсриоцнна, образуемого штаммом Lactococcus ¡actis subsp. ¡actis применен ряд растворителей, такие как: ацегон, н-бутанол, метанол в различных сочетаниях и концентрациях в сравнении с известной смесыо для выделения низина, содержащую ацетон:уксусная кислота в соотношении 4:1 на 5 частей культуральной жидкости. Для отделения клеток проводили центрифугирование, затем проводили экстракцию надосадочной жидкости н.-бутанолом при исходном значении pH 4,2. Растворитель удаляли в вакууме и получали спиртовой концентрат (фракция А). Маточник от экстракции, содержащий фракцию Б, обрабатывали избытком метанола и получали обильный осадок, который отделяли на стеклянном фильтре при постоянном перемешивании и высушивали в вакуумтэксикаторе (фракция В) в течение суток (Cotter et al., 2006; Breukink, 2006).

Хроматографнческий анализ антибиотиков проводили методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) (Parente, Ricciardi, 1999) на пластинках "Silufol" (Чехия) в системе метапол:вода (96:4) (Воейков, 1992). В этих же условиях проводили препаративную ТСХ и колоночную хроматографии на Kieselgel 60 фирмы "Merck" для очистки индивидуальных компонентов фракций.

Аналитический и полупрепаративный электрофорез на бумаге Filtrak К-14 проводили на V-образном приборе Durruma в электролите: 2 н. АсОН (рП 2,4), 550 В в течение 2 ч.

Биоавтографию проводили по методике, предложенной Хасе и Келлером (Saavedra et al., 2004) с использованием в качестве тест-организмов Вас. coagulans 429, Bacillus subtilis АТСС 6633.

UV-VIS-спектры снимали на спектрофотометрах Shimadzu 1601С и Hitachi U-2000 (Japan);

Масс-спектры выделенных антибиотиков регистрировали на приборе VISION методом MALDI-TOF в режиме положительных ионов на матрице DHB (2,5-дигидрокси-бензойная кислота).

Для изучения возможности применения бактериоцинобразующего штамма 194 в качестве биоконсерванта были проведены испытания по увеличению сроков хранения

сырокопченых колбасных изделий: сервелат сырокопченый «Зернистый», колбаса сырокопченая «Свиная». Опытные образцы были обработаны культуральной жидкостью с активностью бактериоцина 4000 МЕ/мл, рН 4,2. Контрольные образцы (без обработки) вышеуказанных колбасных изделий и опытные были заложены на хранение при температуре 10°С на 2 месяца. Проведена идентификация грибной плесени с поверхности зараженных колбас с использованием классических микробиологических методов (Rapcr et al., 1965; Сатгон и др, 2001).

Результаты исследования были статистически обработаны по общепринятой методике с использованием критерия Стьюдента (Р<0,05) в программе SigmaPlot 3.02 (Jadel Corporation, США).

Результаты исследования.

Выделение и идентификация мезофильных бактериоцинобразующих лактококков.

Из молока разных территориальных зон России и национального бурятского кисломолочного напитка курунги были отобраны 62 штамма бактериоцинобразующих лактококков, из них 4 штамма обладали наибольшей антибиотической активностью по отношению к тест — культуре В. coagulans. Из молока молочных комбинатов г. Москвы выделен штамм 115 с активностью 2700 МЕ/мл, г. Клина - штамм 229 с активностью 2500 МЕ/мл, г. Улан-Удэ - штамм 194 с активностью 3600 МЕ/мл и из напитка курунга выделен штамм К-205 с активностью 2900 МЕ/мл. В качестве контроля был использован ранее изученный на кафедре микробиологии низинобразующий штамм МГУ с активностью 2000 МЕ/мл (Баранова, 1990).

Исследованы морфологические, культуральные и физиолого-биохимическне свойства новых штаммов (табл. 1). Изучение морфологии выделенных штаммов в фазово-контрастном микроскопе показало, что культура представлена кокками, собранными в пары и короткие цепочки разной длины (от 4-х до 7-ми кокков). Бактерии неподвижные, грамположительные. По морфологии и культуральным свойствам выделенные бактерии близки к мезофильным гомоферментативным лактококкам L. laclis subsp. lactis. На плотных агаровых средах с гидролизатом молока и синтетической среде с фосфатом и дрожжевым автолизатом колонии были круглые блестящие с ровными краями диаметром от 1,5 мм до 3 мм: мелкие колонии у штаммов 115 и 194, а наиболее крупные у 229 и К-205. При глубинном инкубировании лактококки образовывали колонии лодочкообразной формы.

Таблица 1

Дифференцирующие признаки штаммов Lactococcus lactis subsp. ¡actis

Признаки L. lactis subsp. lactis* штамм МГУ штамм 194 штамм 115 штамм 229 штамм К-205

Преимущественное расположение клеток наиболее типичное указано первым короткие цепочки диплококки короткие цепочки цепочки до 7 кокков диплококки цепочки до 7 кокков

1 (одвижность - - - - - -

Рост при 10°С + + + + + +

Рост при 45°С - - - - - -

рП 9.6 - - - - - -

Рост в присутствии 4%NaCI + + + + + +

Рост в присутствии 6,5%NaCl - - - - - -

Образование молочной кислоты из глюкозы. %: 90-98% 93% 95% 96% 91% 97%

Способность к потреблению углеводов

Фруктоза + + + + + +

Лактоза + + + + + +

Маннитол - - - - - +

Сахароза + + + + + +

Мальтоза + + + + + +

Рафипоза - - - - - -

Отношение к кислороду. факультативные анаэробы

* Определитель бактерий Берджи, 1997.

Примечание: знак «+» обозначает способность к потреблению углеводного субстрата,

«-» — отсутствие этой способности. Свойство потреблять различные углеводы, включая сахара, спирты и органические кислоты лежит в основе отличительных признаков при идентификации молочнокислых бактерий. В результате исследований было установлено, что все выделенные штаммы и штамм

МГУ утилизировали глюкозу, лактозу, фруктозу, сахарозу, маннозу, но не утилизировали манитол, за исключением штамма К-205 (табл. 1).

Результаты гснотипирования по 16S рРНК показали, что все штаммы обнаруживали высокую степень гомологии ДНК (на уровне 98,9 - 100,0%) по отношению к референтным штаммам L. lactis subsp. laclis. Уровень гомологии (в %) между штаммами лактококков по результатам сравнительного анализа последовательностей участка гена 16S рРНК представлен на рис. 1 и подтверждает принадлежность изучаемых бактерий к виду L. lactis subsp. lactis.

vi. luctls subsp. laclis AB 1 0079 g lactis subsp. lactis МГУ

' i . la ctis subsp. la ctis A J4 I 9 5 7 2

-L. lactis subsp. lactis 1 15

ii. lactis subsp. lactis А В I 1 8034 ^L. lactis subsp. lactis 219

—/. .laclis subsp. lactis 194 —£ . lactis subsp. lactis K-205 Ii .¡actis subsp. er f m о r/i А в i ooioi L . lactis subsp. er t in о rls abiodtmi

Рисунок 1. Дендрограмма генотигшческого сходства нуклеотидных последовательностей (400 п.н.) генов 16S рРНК изучаемых штаммов лактококков: 115, 229, 194, К-205, МГУ в сравнении с референтными штаммами Lactococcus lactis subsp. ¡actis и Lactococcus lactis subsp. cremoris.

Высокий уровень гомологии выявлен между штаммами, выделенными из продуктов Бурятии - 99,6%, а сходство их со штаммами, выделенными из молока московского региона, составило 98,9%. Уровень генетического родства всех изучаемых штаммов по отношению к близкородственному штамму L. lactis subsp. cremoris составил 95,4 - 96,6%.

Изучение физполого-биохимнческих свойств штаммов.

Определены потребности штаммов в отдельных факторах роста (табл. 3). Показано, что все изучаемые штаммы потребляли аргинин, что является таксономическим признаком для гомоферментативных лактококков L. lactis subsp. lactis, а также требовали для своего роста наличия в среде аспарагиновой кислоты и урацила. Тимин, как и аланин были необходимы для роста штаммов 194, 229 и К-205. Отсутствие глицина не оказывало влияния на рост штаммов, кроме штаммов 194 и МГУ. Штамм 115 отличался весьма ограниченной потребностью в ростовых компонентах, но пролин, аспарагин и урацил стимулировали его рост. В контроле (без ростовых компонентов) рост штаммов не обнаружен, что свидетельствовало об ауксотрофности

выделенных штаммов. ■

Таблица 2

Потребность в отдельных ростовых компонентах Lactococcus ¡aclis subsp. ¡actis штаммов 115,

194, 229 и МГУ.

Ростовые компоненты штамм 115 штамм 194 штамм 229 штамм К-205 штамм МГУ

Алании - + + + -

Аргинин + + + + +

Аспарагин + + - + -

Аспарагиновая кислота + + + + +

Валин - - + - +

Глицин - + - - ■ +

Глутамин - + - + +

Пролин + - - - +

Тимин - + + + -

Урацил + + + + +

Примечание: знак «+» обозначает потребность в ростовом компоненте (отсутствие роста), «-» - отсутствие этой потребности.

Изучен спектр антибиотического действия (табл. 3) выделенных лактококков. Установлено, что выделенные активные бактериоцинобразующие штаммы подавляли рост грамположительных бактерий, включая спорообразуютцие бациллы В. subtilis, В. coagulons, В. mycoides, микрококки Micrococcus luteus. Micrococcus flavum и Staphylococcus aureus, что характерно для низина А (Nisaplin) и низинобразующего лактококка штамм МГУ. Штамм 115 проявлял незначительную антибиотическую активность на грамотрицательпые микроорганизмы, а штамм 229 - только на Alcaligenes faecalis. Однако, штаммы 194 и К-205, выделенные из молока и лечебно-профилактического продукта курунга, обладали широким спектром антибактериального действия: эффективно подавляли рост как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий: Alcaligenes faecalis, Proleus vulgaris, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas ßuorescens. Эти штаммы проявляли и фунгицидное действие: подавляли рост: Aspergillus niger, Pénicillium chrysogenum, Fusarium oxysporum, Rhodotorula aurantiaca, Candida guilliermondii, что является редким малоизвестным

биологическим свойством бактериоцинов, синтезируемым бактериями ЬаЫососсия зиЬэр.

1асИз.

Таблица 3

Антимикробный спектр действия штаммов лактококков ЬасЮсассиз 1асЧз зиЬвр. разного происхождения и кисломолочного напитка курунга.

TecTKyjibTypa 115 229 194 K-20S МГУ Nisaplin Курунга

Диаметр зон подавления роста, мм

Bacillus mycoides 20,0 16,0 19,5 19,5 16.0 17,0 21,0

Bacillus subtilis 12,0 19,0 22,0 22,0 19,0 19,0 20,0

Bacillus coagulans 21,0 15,0 23,0 22,0 14,0 21,0 18,5

Bacillus cereus 18,5 20,0 21,0 21,0 16,0 18,0 17,0

Micrococcus luteus 21,5 22,0 22,5 19,5 19,0 21,5 21,0

Staphylococcus aureus 16,0 16,0 20,0 20,0 12,0 15,0 20,0

Alcaligenes faecalis 9,0 10,0 12,5 12,5 0,0 0,0 18,5

Escherichia coli 12,0 0,0 15,0 14,0 0,0 0,0 15,0

Proteus vulgaris 9,0 0,0 16,5 16,0 0,0 0,0 16,0

Pseudomonas aeruginosa 10,0 0,0 16,5 15,5 0,0 0,0 17,0

Pseudomonas fluorescens 9,0 0,0 18,0 16,0 0,0 0,0 14,0

Fusarium oxysporum 0,0 0,0 16,5 10,0 0,0 0,0 15,0

Penicillum chryzogenum 0,0 0,0 17,5 10,5 0,0 0,0 15,0

Aspergillus niger 0,0 0,0 21,0 10,0 0,0 0,0 16,0

Rhodotorula aurantiaca 0,0 0,0 19,5 10,0 0,0 0,0 13,0

Candida guellermondii 0,0 0,0 21,0 12,0 0,0 0,0 10,0

Следовательно, имеет место и штаммовая специфичность лактококков по синтезу бактериоцинов, отличающихся по биологическим свойствам. Этим объясняется актуальность данной работы по выделению природных штаммов - продуцентов бактериоцинов.

По результатам изучения чувствительности изучаемых штаммов к антибиотикам (табл. 4) выявлено, что штаммы чувствительны к антибактериальным антибиотикам широкого спектра действия, ингибирующим синтез белка: тетрациклину, доксициклину и левомицетину, в меньшей степени к аминогликозидным антибиотикам канамицину, сизомицину и стрептомицину, устойчивы, за исключением штамма 194, к неомицину. Все штаммы чувствительны к антибиотикам, ингибирующим синтез клеточной стснки у грамположительных бактерий: пенициллинам и цсфалоспоринам, но штамм 194 устойчив к бензилпенициллину и метициллину.

Таблица 4.

Чувствительность выделенных штаммов Ысюсоссиз 1асИя 5иЬвр. /ас//д- к антибиотикам.

Антибиотик Концентрация в диске, мкг Диаметр зон подавления роста, им

115 229 194 К-205 МГУ

Тетрациклин 30 36,5 33,6 28,5 30,4 35,5

Доксициклин 10 32,0 34,0 27,5 29,8 34,0

Левомицетин 30 25,2 32,0 25,5 23,6 26,0

Рифампицин 10 12,0 0,0 15,0 12,2 0,0

Олеандомицин 15 21,0 27,0 17,5 18,3 28,5

Неомицин 30 0,0 0,0 14,0 0,0 0,0

Стрептомицин 30 12,0 13,3 12,0 0,0 14,0

Канамицин А 30 14,5 14,0 0,0 11,3 15,0

Ристомицин А 30 19,5 17,6 13,8 14,4 19,5

Бензилпепициллин 10 22,6 27,0 0,0 18,5 26,5

Карбинициллин 10 32,0 29,5 12,0 21,1 30,5

Оксациллин 10 21,0 18,5 10,0 13,6 17,5

Цефалогин 30 30,5 30,5 27,0 26,8 31,0

Цефалексин 30 18,0 28,0 13,0 15,7 28,0

Сизомицин 10 19,0 16,5 10,0 14,2 17,5

Метициллин 10 22,0 28,5 0,0 0,0 16,0

Ампициллин 10 29,0 32,6 20,0 23,4 26,5

Чувствительность штаммов лактококков, выделенных из молока и молочных продуктов, к антибиотическим препаратам может быть следствием применения последних в сельскохозяйственной практике. В связи с этим, контроль по данному показателю является

необходимым, так как при использовании культур, резистентных к лекарственным препаратам, в пищевой и медицинской практике могут передаваться в макроорганизм плазмиды, несущие гены лекарственной устойчивости, что затрудняет лечение (Tammerman, 2003; Зигангирова и др., 2006).

Регуляция синтеза бактериоцина L. Iactis subsp. /actis штаммом 194

На примере перспективного штамма 194, как имеющего наибольшую активность и широкий спектр антимикробного действия, изучали влияние основных компонентов ферментационной среды на рост культуры и синтез бактериоцина.

Таблица 5.

Влияние различных компонентов ферментационной среды на рост и синтез бактериоцина

штаммом Lactococcus ¡actis subsp. ¡actis 194

Состав среды ОП540 (17ч.) pH Активность,МЕ/мл

Контроль (глюкоза + дрожжевой автолизат + 2,0% КН2Р04) 1,45 4,2 3600

с 1,0% КН2РО, 1,05 4,0 3150

с 0,5% К)}2Р04 0,80 3,9 3000

без КН2Р04 0,32 5,4 1000

без дрожжевого автолизата 0,18 6,6 0

Как видно из таблицы 5, при уменьшении количества фосфата в среде от 2,0% до 0,5% рост культуры и синтез бактериоцина снижался, а при исключении из среды дрожжевого автолизата как источника аминного азота, рост культуры и синтез бактериоцина приостанавливался.

Существует корреляция между концентрацией фосфора в среде с ассимиляцией углеводов из среды культивирования (Безбородов, 1991; De Vuyst, Vandamme, 1993; Chan et al., 2002, Стоянова, Левина, 2006).

Влияние разных углеводов на синтез бактериоцина штаммом L. lactis subsp. ¡aclis 194 представлено на рис.3* Показано, что в среде с сахарозой уровень антибиотической активности па 25%, с маннозой на 15%, с галактозой, рибозой, фруктозой на 10% выше по сравнению со средой, содержащей глюкозу. Итак, дисахарид сахароза - наиболее благоприятный углевод для

15

синтеза бакгериоцина, что согласуется с исследованиями ряда авторов, утверждающих, что синтез бактериоцина низина и способность к утилизации сахарозы кодируется одним геном (Пс Уиуз! Й а!., 1992; К1аепЬашшег, 1993).

Q 1 .рибоза Я 2.арабиноза

ШЗ.ксилоза ЕЭ4.рамноза

В 5.галактоза И блактоза

Q 7.глюкоза О 8.сахароза

И 9.мальтоза В Ю.рафиноза

И 11 .манноза О 12.фрукгоза

Щ 14.дульцитол ЕЗ 15.маннитол

П 16.и1юзитол □ 17.сорбит0л

И 18.декстрин □ контролЦбез углеводов)

Рис. £ Влияние углеводов на синтез бактериоцина штаммом Lactococcus ¡aclis svbsp. lactis 194.

Следующим этапом работы явилось изучение роста и развития штамма 194 в средах, с низким содержанием фосфатов (0,5% КН2РО4) в сочетании с удвоенным количеством сахарозы или глюкозы. Результаты этого эксперимента показали, что за 9 часов инкубирования в среде с 2,0% глюкозы уровень активности увеличился на 13,9% по сравнению с основной ферментационной средой, содержащей 2,0% КН2Р04 и 1,0% глюкозы. При замене глюкозы на сахарозу уровень антибиотической активности увеличился на 24,6% (табл. $).

Таблица 6

Рост Lactococcus 1actis subsp. 1actis 194 на средах, содержащих 0,5% КН2РО4 и 2,0% глюкозы или 2,0% сахарозы на рост и синтез бактериоцина.

Время культивирования, час Показатели роста культуры и активность бактерноцина

Глюкоза сахароза

pH ОП540 Активность, МЕ/мл pH ОП540 Активность, МЕ/мл

0 6,9 0,10 0 6,8 0,18 0

3 6,6 0,42 1700 6,6 0,80 2100

6 4,8 0,70 3200 4,8 1,60 3800

9 4,0 1,30 4100 4,2 1,82 5100

12 3,8 ■ 1,20 4100 4,0 1,80 5000

Как показали результаты изучения динамики роста и развития культуры в оптимизированной среде в стационарных условиях при периодическом культивировании, максимальное количество бактериоцина накапливалось в ферментационной срсдс за 9 ч инкубирования, что сопровождалось увеличением биомассы продуцента и снижением рП среды до значения 4,2 (рис.*!).

0 3 6 9 12 15 18 21 24 Время, ч

С О

Активность, ME/мл —■— ОП540 —pH

Рис .5. Динамика роста и развития Lactococcus 1actis subsp. Iactis 194 в оптимизированной среде, содержащей 0,5% К.1 ЬРСМ и 2,0% сахарозы.

Таким образом, оптимальной является среда, содержащая (%): КН2РО4 - 0,5; MgS04 -0,02; NaCl- 0,2; сахароза - 2,0; дрожжевой автолизат, содержащий 35-40 мг% азота аммония.

Влияние рН-статнрования на рост культуры и синтез бактериоцина.

Активная кислотность (pH) среды существенно влияет на развитие микроорганизмов, на характер их обмена и, следовательно, на процесс образования антибиотических веществ. Изменение pH среды заметно сказывается на диссоциации культур, активности ферментов микроорганизмов, состоянии промежуточных и конечных продуктов метаболизма микроорганизмов (Грушина, 1984; Смирнов и др., 1990; Matsusaki et а!., 1996). Стабилизация уровня pH в процессе ферментации в оптимизированной среде позволило повысить уровень антибиотической активности на 27,5% (табл. 8).

Итак, при оптимизации технологического процесса ферментации бактериоцинобразующая активность штамма повысилась на Р8,5% и составила 6500 МЕ/мл.

Таблица?-

Влияние рН-статирования ферментационной среды на рост культуры и синтез бактериоцина Lactococcus lactis subsp. lactis штаммом 194.

Время культивирования, час Показатели роста культуры и активность бактериоцина

pH OII540 Активность, МЕ/мл

3 5,9 0,40 1700

4 5,6 0,52 2400

5 6,0 0,80 3200

6 6,0 1,30 4200

7 5,9 1,50 4800

8 5,9 1,60 5800

9 6,0 1,60 6500

10 6,0 1,60 6400

На основании экспериментальных данных, полученных при изучении регуляции синтеза

бактериоцина новым перспективным штаммом L. ¡aclis subsp. laclis 194, разработан лабораторный регламент на технологический процесс синтеза бактериоцина. Изучение динамики роста и развития штамма 194 показало, что синтез бактериоцина идет параллельно росту продуцента, что согласуется с ранее полученными данными других исследователей (Hirst, 1983; Yother et al., 2002; Стоянова, Левина, 2006).

Для подтверждения белковой природы синтезируемого бактериоцина были проведены исследования по влиянию ингибитора синтеза белка левомицетина на рост продуцента, синтез бактериоцина и белка. На рис.$ показано, что внесение в среду культивирования левомицетина ингибировало рост и развитие культуры, о чем свидетельствовало снижение оптической плотности культуры, накопления микробного белка и антибиотической активности культуральной жидкости продуцента. При уменьшении биомассы на 32,3%, синтез белка снизился на 45,2%, а антибиотическая активность культуральной жидкости Fia 88,5%. При этом изменилась динамика синтеза белка и синтеза бактериоцина. Наблюдали отставание темпа синтеза бактериоцина и белка от роста культуры на 3 - 5 ч.

1.4

Я 0,8 о 0.6

0,4

о з

6

9

12 15 18 21 24 27 30 бремя, ч

а

о

9

12 IS 18

Вре мя, ч

21

27

ЭО

б

Рис.5?. Влияние левомицетина на рост Lactococcus lactis subsp. Iactis штамм 194 (а), синтез белка (б), синтеза бактериоцина (в). Примечания: 1 — в среде с добавлением левомицетина; 2 -контроль (без добавления).

Изучение диссоциации L. ¡actis subsp. lactis 194.

В микробиологических производствах причиной снижения активности продуцентов часто является спонтанная изменчивость штаммов по морфологическим и физиолого-биохимическим свойствам, Известно, что при множественных пассажах и неблагоприятных условиях культивирования производственные штаммы могут диссоциировать с преобладанием неактивных клонов. Установлено, что штамм 194 на агаровой оптимизированной среде диссоциировал на G (мелкие, прозрачные колонии) и S (крупные, белые колонии) варианты (рис. 3). Вариант G составлял 88,1%, а вариант S - 11,9% ог общего количества клеток популяции. По каждому типу колоний определены отличительные признаки (табл.&),

S-варианты

Рис. J? Диссоциация штамма Lactococcus lactis subsp. lactis 194 на G и S варианты.

20

Показано, что наибольшей антимикробной и фунгицидной активностью обладает С-вариант. Активность его по низину составила 4500 МЕ/мл, по левомицетину - 1630 ед/мл, а фунгицидная активность, рассчитанная по нистатину - 2200 ед/мл, что на 35,4, 21,8 и 48,5% (соответственно) выше но сравнению с активностью Э-вариантов.

Таблица

Характеристика диссоциантов Lactococcus lactis subsp. ¡aclis 194

Свойства G вариант S вариант

Морфология мелкие, прозрачные колонии размером 0,5 - 0,8 мм крупные, белые колонии размером 2,2 — 3,0 мм

Антибиотическая активность рассчитанная по: Низину (МЕ/мл) 4500 3360

Левомицетину (ед'мл) 1630 1160

Нистатину (ед/мл) 2200 ИЗО

Полученные данные позволят проводить селекцию продуцента по целевому признаку.

Лнофилизацня штамма 194 в защитной среде с криопротекторами обеспечивала сохранность физиолого-биохимических свойств штаммов и их стабильность в процессе хранения.

Выделение и очистка бактерноцина из штамма 194.

Бактериоцины накапливаются, в основном, в культуральной жидкости, но часть их связана с клеточной стенкой продуцента (Hurst, Drag, 1968; Грушина, 1984; Brotz ct al., 1998). Одним из важнейших условий эффективного извлечения бактериоцина из культуральной жидкости является правильный выбор экстрактанта - органического растворителя, который бы избирательно и полно извлекал его из культуральной жидкости, так и из клеточной стенки.

Для этого проведены исследования по выделению и очистке антибиотического комплекса, продуцируемого L. lactis subsp. lactis штамм 194.

Антибиотический комплекс был разделен на три основные биологически активные фракции, различающиеся между собой по величине Rf в ряде систем растворителей при ТСХ на силикагеле, а также по электрофоретической подвижности при электрофорезе на бумаге в различных электролитах. В системе метанол:вода (96:4), используя метод 'ГСХ, фракция 194-Б имела Rt=0,42. Компонент 194-В, совпадал rio элсктрофорстичсской подвижности со стандартным образцом низина: мигрировал к катоду, обладал основными свойствами, был эффективен только против грамположительных бактерий (табл. 9).

Таблица 9

Физико-химические и биологические свойства компонентов антибиотического комплекса, образуемого штаммом Lactococcus ¡aclis subsp. ¡actis 194 в сравнении с коммерческим

препаратом низина.

Свойства Компоненты

194-А 194-Б 194-В Ннзин А

Мол. масса, (М+Н)+, m/z, (MALDI-MS) 607,5 619,6 1995 3353

UV-VIS спектр, Xmax, нм, (растворитель) 206,8 (С2Н5ОН) 224,8 (С2Н5ОН) 257,0 (С2Н5ОН) 215,0 (Н20)

ТСХ (SiOj), Rf в системе: МеОН-Н20 (96:4) 0,6 0,42 0,0 0,0

Электрофорез на бумаге' в электролите: рН=2,4, 550 В, 2 час., см 0,0 0,0 7,6 9,5

Биологический спектр действия на грамположи-тельные, грамотрица-тельныебактер ии и грибы на грам положительные бактерии, включая термостойкую Bacillus coagulons Há грамположи- тельные бактерии, включая термостойкую Bacillus coagu¡ans. на грамположи- тельные бактерии, включая термостойкую Bacillus coagulans.

Примечания: / - представлено расстояние, пройденное веществом от стартовой линии к катоду, в см: «О см» (на линии старта)- электронейтральное вещество; «7,6 - 9,5 см» (миграция к катоду) - вещество основного характера.

Интерес представляла пизкомолекулярная фракция 194-А, которая обладала фунгицидным действием, что является редким свойством для бактерий этого вида. Анализ по изучению структуры всех фракции в компьютерной базе данных биологически активных веществ проф. Берди (Венгрия) показал, что данные вещества являются новыми не описанными ранее природными соединениями, не имеющие аналогов.

Использование активного бактерноцинобразующего штамма 194 как биологического консерванта.

Испытания но использованию активного бактерноцинобразующего штамма 194 для увеличения сроков хранения сыро-копченых колбасных изделий: сервелат сырокопченый «Зернистый» ТУ 9213038-510-323-26-03, колбаса сырокопченая «Свиная» ГОСТ 16131-86. показали (рис. 8), что в опытных образцах, обработанных культуральной жидкостью рост

22

плесени не обнаружен, колбаса по органолептическим показателям (внешний вид, запах, вкус) соответствовала требованиям вышеуказанных нормативных документов.

Рис. 8. Влияние обработки культуральпой жидкостью ¿астсосеиз 1асЧз БиЬ.чр. 1асИ.1; 194 на обсемененность колбасных изделий (1 - без обработки; 2-е обработкой).

Штамм £. 1с1сИя зиЬвр. /оегм 194 продуцировал бактериоцин, обладающий фунгицидным действием и может быть рекомендован для хранения колбасных изделий.

показала, что данный гриб относится к осмотолерантным аскомицетам рода Eurotium с конидиальной стадией, отнесенной к виду Aspergillus repens de Вагу. На агаризованной среде Чапека этот гриб образовывал характерные округлые, пушистые колонии с белым растущим краем и серо-зеленым центром, до 3 - 4 см в диаметре на 10-е сутки роста. Колонии состояли из большого количества конидиеносцев, образование плодовых тел было интенсивным. Головки конидиеносцев имели один ряд стеригм, радиалыю покрывающих всю поверхность вздутия; конидии эллиптической или шаровидной формы. На аскоспоре имелась характерная для этого вида слабовыраженная бороздка (рис. 9).

/

Из обсемененных колбасных изделий выделен плесневый гриб. Идентификация его

стериг

Рис. 9. Конидиеноссц и споры плесневого гриба Aspergillus repens de Вагу

Плесневые грибы распространены повсеместно. Особенно много их в почве и в местах с повышенной влажностью, встречаются они и на поверхности полимерных материалов (Горленко, 1987). Этим объясняется появление гриба на поверхности колбас в полимерной оболочке при их хранении в промышленных холодильных камерах в условиях повышенной влажности и недостаточной циркуляции воздуха и при созревании сырокопченых колбасных изделий.

На рис. 10 показаны зоны ингибирования роста гриба Aspergillus repens de Вагу штаммами L. lactis subsp. lactis 194, K-205, 115 и МГУ.

штамм 194 (S-вариант) раствор нистатина (2500ед/мл) штамм 115

Рис. 10. Зоны ингибирования штаммов L. lactis subsp. laclis 194, K-205, 115 и МГУ на чашке Петри с тест-организмом Aspergillus repens de Вагу, выделенным с поверхности зараженных колбасных изделий.

На основании полученных экспериментальных данных можно сделать следующие выводы:

Выводы:

1. Из свежего коровьего молока разных территориальных зон и национального бурятского кисломолочного продукта курунги выделены четыре активных бактериоцинобразующих штамма мезофилъных лактококков 115, 194, 229 и К-205 с уровнем активности от 2500 до 3600 ME/мл, что значительно превышает уровень активности известных природных штаммов лактококков.

2. С использованием классических микробиологических методов и генотипического

метода, основанного на анализе сходства нуклеотидных последовательностей участков гена 16S рРНК, штаммы идентифицированы как Laclococcus ¡aclis subsp. ¡aclis Нуклсотидныс последовательности генов 16S рРНК новых штаммов депонированы в базу данных GenBank под следующими номерами: DQ255951 - DQ255954.

3. На примере активного бактериоцинобразующего штамма 194 изучена регуляция синтеза бактериоцина. Оптимизирована ферментационная среда по фосфору, азоту и углеводному компоненту, что позволило, наряду с рН-статированием, увеличить выход бактериоцина на М,б% (6500 МЕ/мл).

4. Из активного штамма 194 выделен антибиотический комплекс, представляющий собой сложную смесь биологически активных компонентов, являющиеся новыми природными соединениями, которые не имеют аналогов в базе данных биологически активных веществ проф. Берди (Венгрия).

5. Показана возможность использования штамма 194, обладающего фунгицидным действием, в качестве консерванта для увеличения срока хранения сырокопченых колбас. Проведена идентификация плесневого гриба, вызывающего порчу сырокопченых колбас при хранении.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Стоянова Л.Г., Сультимова Т.Д., Нетрусов А.И. Влияние фосфата и углеводов на синтез низина Laclococcus ¡actis subsp. ¡aclis штамм 194 // Вестн. Моск. Ун-та, 2003, сср. 16, Биология, №4, С. 17-22.

2. Stoyanova L., Netrusov A., Egorov N.. Sultimova T. New bacteriocin of Laclococcus ¡aclis subsp. ¡actis for food safety. International Congress "Poverty Food & Health in Welfare", July 1-4, Lisbon, Portugal, 2003, p. 121.

3. Стоянова Л.Г., Сультимова Т.Д., Нетрусов А.И. Создание банка лиофильных бактериоцинпродуцирующих молочнокислых бактерий // Цитология, 2004, том 46, №10, с. 865866.

4. Сультимова Т.Д. Синтез бактериоцина Laclococcus ¡aclis subsp. ¡aclis штамм 194. Тезисы докладов XI международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2004", 12-15 апреля 2004, секция Биология // М., 2004, стр. 149.

5. Stoyanova L.G., Netrusov A.I., Sultimova Т.П., Dibirasulaev М.А., Dibirasulaev D.M. New bacteriocin from fusant strain of Laclococcus ¡actis for meat preservation. 19th International ICFMH Symposium - FOOD MICRO 2004. September 12-16, 2004, Slovenia, p.61.

6. Стоянова Л.Г., Сультимова Т.Д. Изучение физиолого-биохимических свойств бактериоцинпродуцирующего штамма 194 Lactococcus Iactis subsp. ¡aclis. Тезисы Всероссийсикого симпозиума с международным участием «Биотехнология микробов» 20-23 октября 2004 г. // М., Изд-во Макс-Пресс, 2004 г., стр. 87.

7. Сультимова Т.Д., Стоянова Л.Г., Ботина С.Г. Скрининг бактриоцинпродуцирующих штаммов Lactococcus lactis subsp. 1actis // Тезисы Молодежной школы-конференции «Актуальные проблемы современной микробиологии», ИНМИ, 1-3 ноября 2005 г. // М., Изд-во Макс-Пресс, 2005 г. стр. 107.

8. Сультимова Т Д., Стоянова Л.Г., Нетрусов А.И. Изучение антимикробного спектра действия национального молочнокислого напитка курунги // Тезисы из материалов Всероссийского симпозиума с международным участием "Автотрофные микроорганизмы" памяти академика РАН Е. Н. Кондратьевой, МГУ им. М. В. Ломоносова, биологический фак-т, 21-24 декабря 2005 г. // М., изд-во Макс-пресс,2005 г. стр. 45.

9. Сультимова Т.Д., Стоянова Л.Г., Нетрусов А.И. Изучение бактериоцинпродуцирующей активности у диссоциангов нового штамма 194 Lactococcus lactis subsp. lactis. И 10-я Пущинская школа-конференция молодых ученых. 17-21 апреля 2006 г. // Пущино, 2006 г., стр. 398.

Ю.Стоянова Л.Г., Сультимова Т.Д., Ботина С.Г., Нетрусов А.И. Выделение и идентификация бактериоцинпродуцирующих штаммов Lactococcus lactis subsp. lactis из свежего молока // Прикладная биохимия и микробиология, 2006, №5, С. 234-238.

Автор выражает благодарность к. б. н., ст. н. с. Федоровой Г. Б. ГНУ Научно-исследовательского института по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе РАМН за помощь в выделении и изучении физико-химических свойств компонентов антибиотического комплекса.

Отпечатано в копицентре «СТ ПРИНТ» Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус. www.stprint.ru e-mail: zaka?:@stprint.ru тел.: 939-33-38 Тираж 100 экз. Подписано в печать 15.11.2006 г.

Для заметок

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сультимова, Татьяна Доржиевна

Введение стр.

I. Обзор литературы стр.

1.1 Общие свойства молочнокислых бактерий стр.

1.2. Бактериоцины стр.

1.2.1. Свойства бактериоцинов стр.

1.2.2. Классификация бактериоцинов стр.

1.2.3. Регуляция синтеза бактериоцина стр.

1.2.4. Механизм действия бактериоцинов стр.

1.2.5. Методы определения и выделения бактериоцинов стр.

1.2.6. Применение молочнокислых бактерий и их бактериоцинов стр.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выделение активных бактериоцинобразующих лактококков и их практическое использование"

В настоящее время резко возрос интерес исследователей к бактериоцинобразующим лактококкам, которые вследствие своей безопасности, высокой ферментативной и бактериоцинобразующей активности являются объектом фундаментальных исследований по созданию новых активных пробиотиков и биологических консервантов (Riley, Wertz, 2002). Выделяют чистые культуры бактериоцинобразующих лактококков из молочных продуктов (Стоянова и др., 1988; Nes et al., 1996), а в последнее время появились публикации о выделении их с поверхности растений (Janes et al., 2001) и даже речной воды (Zendo et al., 2003). Активность природных штаммов была на уровне 3000 МЕ/мл, антимикробный спектр действия распространялся только на грамположительные бактерии (Lasango et al., 2002).

Сравнительное экологическое изучение штаммов лактококков, выделенных из различных эколого-географических зон, показало, что наблюдается определенная их адаптация к внешним факторам среды обитания. Необходимо отметить, что в природных субстратах по численности группы облигатных гомо- и гетероферментативных бактерий сравнительно малы, а группа факультативных гомоферментативных бактерий более значительна (Mathara et al., 2004). Определяющим свойством последних является их способность потреблять углеводный субстрат до молочной кислоты. Но в ряде случаев имеет место естественная и индуцированная селекцией вариабельность фенотипических свойств, лактококки могут перейти с гомоферментативного пути брожения на гетероферментативный с образованием побочных нейтральных продуктов: спирта, диацетила и ацетоина. Изменение характера конечных продуктов брожения молочнокислых бактерий в зависимости от ряда конкретных физико-химических факторов свидетельствует о невозможности резкого разграничения групп гомо- и гетероферментативных молочнокислых бактерий (Серебренников и др., 1998; Duwat et al., 2002). Молочнокислые кокки по морфологии являются типичными стрептококками серологической группы N, кроме Streptococcus thermophilus, относящихся к группе D. Ранее в род Streptococcus были отнесены все грамположительные, каталазоотрицательные кокки, образующие пары и цепочки, в том числе строго анаэробные формы (Schleifer, Ludwig, 1989). Однако стрептококки отличаются полиморфностью, они могут вытягиваться и напоминать палочковидные формы, образовывать стрептококкоподобные цепочки разной длины, что связано со снижением активности автолитических ферментов в процессе расхождения образующихся при делении клеток (Квасников, 1975).

Поэтому морфология и ферментативная активность не могут служить достоверными признаками при дифференциации выделенных культур. В настоящее время молочнокислые стрептококки по систематическому положению выделены из группы микроорганизмов рода Streptococcus, включающего и патогенные формы, и под новым названием Lactococcus отнесены к категории «GRAS», куда относятся микроорганизмы, не вызывающие инфекционных заболеваний человека и животных (Jones, 1978; Хоулт и др., 1997). В течение многих веков человек использует микроорганизмы для приготовления пищевых продуктов. Получение пищевых продуктов и напитков с помощью различных процессов брожения составляет важнейший сектор пищевой промышленности, основным из которых является молочнокислое брожение (Богданов и др., 1968; Consentino et al., 2003).

Ряд исследователей выделили из молока, молочной сыворотки и сыров домашнего приготовления множество штаммов молочнокислых бактерий -продуцентов бактериоцинов, обладающих ингибиторным действием на ряд патогенных микроорганизмов: листерии, бациллы и стафилококки, развивающиеся в продуктах питания в процессе хранения и выделяющие энтеротоксины, что является причиной желудочно-кишечных заболеваний (Бондаренко и др., 1995; Riley, Wertz, 2002; Жарикова, 2005). Вследствие этого, бактериоцины рассматриваются как пищевые консерванты.

Поиск активных продуцентов бактериоцинов является актуальной задачей.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Сультимова, Татьяна Доржиевна

Выводы

1. Из свежего коровьего молока разных территориальных зон и национального бурятского кисломолочного продукта курунги выделены четыре активных бактериоцинобразующих штамма мезофильных лактококков 115, 194, 229 и К-205 с уровнем активности от 2500 до 3600 МЕ/мл, что значительно превышает уровень активности известных природных штаммов лактококков.

2. С использованием классических микробиологических методов и генотипического метода, основанного на анализе сходства нуклеотидных последовательностей участков гена 16S рРНК, штаммы идентифицированы как Lactococcus lactis subsp. lactis Нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК новых штаммов депонированы в базу данных GenBank под следующими номерами: DQ255951 - DQ255954.

3. На примере активного бактериоцинобразующего штамма 194 изучена регуляция синтеза бактериоцина. Оптимизирована ферментационная среда по

140 фосфору, азоту и углеводному компоненту, что позволило, наряду с рН-статированием, увеличить выход бактериоцина на 80,5% (6500 МЕ/мл).

4. Из активного штамма 194 выделен антибиотический комплекс, представляющий собой сложную смесь биологически активных компонентов, являющиеся новыми природными соединениями, которые не имеют аналогов в базе данных биологически активных веществ проф. Берди (Венгрия).

5. Показана возможность использования штамма 194, обладающего фунгицидным действием, в качестве консерванта для увеличения срока хранения сырокопченых колбас. Проведена идентификация плесневого гриба, вызывающего порчу сырокопченых колбас при хранении.

Заключение

Итак, из свежего коровьего молока разных территориальных зон России и кисломолочного напитка курунга выделено 4 штамма с бактериоцинобразующей активностью от 255 до 3600 МЕ/мл, которые идентифицированы как Lactococcus lactis subsp. lactis. Изучены их отличительные признаки по утилизации углеводов, потребности в ростовых компонентах, чувствительности к антибиотикам, спектру антимикробного действия. На примере перспективного штамма 194 изучена регуляция синтеза нового трехкомпонентного бактериоцина.

Полученные штаммы пополнили коллекцию бактериоцинобразующих штаммов, представляют научный и практический интерес в плане расширения биологического разнообразия и возможного их применения в качестве пробиотиков и при составлении бактериальных заквасок, применяемых при изготовлении молочных продуктов, а также как биоконсервант продуктов питания и сырья.

На основании проведенных исследований можно сделать следующие выводы:

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сультимова, Татьяна Доржиевна, Москва

1. Абрамов Н.И., Мурашова А.О. Патент №2011352, Россия МКИ А23с 9/12: Способ получения кефира/ Опубл. 30.04.1994. Бюл. №8.

2. Аверина О. В., Лысенко А. М., Ермакова Л. М., Огай Д. К., Суходолец В.В. 1998. Сравнительное изучение гомологии ДНК у штаммов термофильных и мезофильных молочнокислых стрептококков различного происхождения // Микробиология. Т. 67. № 6. С.792 - 798.

3. Бавина Н.А., Королева Н.С, Хараш В.М. Патент №2001580, Россия МКИ А23с 9/12: Способ получения препарата молочнокислых культур/ Опубл. 30.10.1993. Бюл. №39-40.

4. Баранова И. П., Егоров Н. С., Козлова Ю. И., Максимов В. Н. 1974. Оптимизация среды для биосинтеза низина культурой Streptococcus lactis методом математического планирования эксперимента // Научные доклады высшей школы. Биологические науки. №3. 94-98.

5. Баранова И. П., Егоров Н. С., Стоянова Л. Г. 1997. Низин, условия образования и получение препарата. // Антибиотики и химиотерапия, Т.42. №.3. С. 37-44.

6. Баснакьян И. А. 1992. Культивирование микроорганизмов с заданными свойствами, М.: Медицина. 188 с.

7. Безбородов А. М 1991. Биотехнология продуктов микробного синтеза. М.: ВО "Агропромиздат". С. 214-218.

8. Безбородов A.M., Астапович Н. И. 1984. Секреция ферментов у микроорганизмов. М.: Изд. "Наука".

9. Беспалова И. А., Кошкина И. М., Пятницына И.Н., Банникова JI.A, Новикова Е. Г., Тихоненко А. С. 1987. Биологические свойства и ультраструктура молочнокислых стрептококков и их мутантов.// Микробиология. Т. 56. № 4. С. 656 660.

10. Богданов В. М. 1962. Микробиология молока и молочных продуктов. М.: Пищевая промышленность. 29 с.

11. Богданов В. М., Баширова Р. С, Кириллова К. А. 1968. Техническая микробиология пищевых продуктов. М.: Пищевая промышленность. 744 с.

12. Бондаренко В. Н., Учайкин В. Ф., Мурашова А.О., Абрамов Н.А. 1995. Дисбиоз. Современные возможности профилактики и лечения. М. 130 с.

13. Воейков В. Л., Решетов П. Д., Набиев И. Р. 1992. Физико-химичкские методы исследования биополимеров и низкомолекулярных биорегуляторов. М.: Наука. С. 63, 116, 125.

14. Воскресенский П. И. 1969. Техника лабораторных работ. М.: Изд. "Химия". С. 516-517.

15. Генич Г. 1987. Современные бактериальные закваски для ферментированныхмолочных продуктов. Киев. С. 110-113.

16. Гейс А., Ринг Е., Тойбер М. 1982. Бактериоцины молочнокислых бактерий. XXI Международный молочный конгресс. Краткие сообщения. М., т. 1. кн. 2. С. 222-223.

17. Горленко М. В. 1981. Курс низших растений. М.: Высш. Школа. С. 268-476.

18. Демина Н. С., Лысенко С. В. 1989. Влияние высушивания на содержание нуклеиновых кислот и мутационные изменения у микроорганизмов // Биол. Науки. №5. С. 87 95.

19. Герхард Ф. 1984. Методы общей бактериологии. М.: Мир, Т. 1.

20. ГОСТ 16131-86. Колбасы сырокопченые. Технические условия

21. Гриневич Н. Г. 1981. Молочнокислые бактерии. Селекция промышленных штаммов. Минск: Высшая школа. 164 с.

22. Громов Б.В. 1985. Строение бактерий. Л, С. 23-29.

23. Грушина В. А. 1984. Изучение Streptococcus lactis штамм МГУ, в свзи с биосинтезом низина. Автореферат кандид. диссертации. МГУ. Москва.

24. Егоров Н. С., Выборных С. Н., Лория Ж. К., Парыгин Е. И. 1983. Влияние аминокислот и белков на синтез бацитрацина экзопротеазы Bacillus licheniformis. II Микробиол. Т. 52. Вып. 5. С. 693-697.

25. Егоров Н. С. 1994. Основы учения об антибиотиках. М.: Изд. МГУ. С. 199-201,205,391-394.

26. Егоров Н. С., Баранова И. П. 1999. Бактериоцины. Образование, свойства, применение // Антибиотики и химиотерапия. Т. 44. №6. С. 33-40.

27. Егоров Н. С. 2004. Основы учения об антибиотиках. М.: Наука. С.

28. Жарикова Г. Г., Козьмина А. О. 2001. Микробиология, санитария и гигиена пищевых продуктов. М.: Изд. Гелан. С. 121.

29. Жарикова Г. Г. 2005. Микробиология продовольственных товаров. Санитария и гигиена. М.: Изд. АКАДЕМ А. С. 182-196.

30. Зигангирова Н. А., Токарская Е. А., Народицкий Б. С., Глинцбург A. JI., Тутельян В. А. 2006. Роль молочнокислых бактерий в распространении генов лекарственной устойчивости среди здоровых людей. // Журн. Микробиологии. №2. С. 106 109.

31. Инихов Г. С, Брио Н. П. 1971. Методы анализа молока и молочных продуктов. М.: Пищевая промышленность. 422с.

32. Карликанова С. Н., Кимова Э. Т., Виноградская С. Е. 1983. Антибиотически активные молочнокислые бактерии в производстве продуктов гарантированного качества. М.: ЦНИИТЭИмясомолпром. Обзорная информация. Серия: Цельномолочная промышленность. 51 с.

33. Квасников Е. И., Нестеренко О. А., 1975. Молочнокислые бактерии и их использование. М.: Наука. С. 23, 290-359.

34. Королева Н.С, Рожкова И.В., Семенихина В.Ф. Патент №2011351, Россия МКИ А23с 9/12: Способ получения кефира/ Опубл. 30.04.1994. Бюл. №8.

35. Красникова Я. В., Кострова Н. Е. 1989. Роль микрофлоры закваски в повышении качества молочных продуктов. М.: ЦНТЭИмясомолпром, 36 с.

36. Кудлай Д. Г., Лиходед В. Г. 1996. Бактериоциногения. М.: Медицина. С. 9-15, 17-23.

37. Кудряшов В. Л., Сергеева И. Д., Стоянова Л. Г., Задорожная Т. И, Дурицкая Л. И. 1995. Синтез биоконсерванта низина на отходах и вторичном сырье ряда биотехнологических производств. // Биотехнология. №12. С. 25 -28.

38. Лев Г. Б. 1979. Исследование и разработка технологических режимовпроизводства курунги. Автореф.Дисс. канд. техн. наук. Ленинград. 21с.

39. Лапинска Е. 1981. Низин и его применение. В кн.: Антибиотики и антибиоз в сельском хозяйстве. М.: "Колос". С. 105-134.

40. Лысенко А. М., Ботина С. Г., Ганина В. И., Суходолец В. В. 2001. Дивергенция по уровню гибридизации ДНК и образование видов-двойников у молочнокислых бактерий Streptococcus thermophilus II Микробиология. Т.70. № 1.С. 70-76.

41. Максимова А. К. 1980. К вопросу изучения протеолитической активности молочнокислых стрептококков и палочек. М.: Труды ВНИМИ. С. 52-55.

42. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. 1984. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир.

43. Милько Е. С., Задояна С. Б., Ганина В. И., Егоров Н. С. 1991. Диссоциация молочно-кислых стрептококков. // Биологические науки. №4. С. 103- 108.

44. Милько Е. С., Егоров Н. С. 1992. Влияние физико-химических факторов среды на рост диссоциантов некоторых грамположительных бактерий. // Микробиол. N 5. С. 89-96.

45. Мюнх Г. Д., Заупе X., Шрайтер М. 1985. Микробиология продуктов животного происхождения. /Пер. с нем. Е.М.Токаря под редакцией Королевой Н.С., Билетовой Н.В. Корнегталовой Р.П. М.: Агропромиздат. 592 с.

46. Опарин Ю. Г. Повреждения и защита биоматериалов при замораживании и лиофилизации // Биотехнология. 1996. №7. С. 3 13.1. KJ

47. Ленглера И., Древса Г., Шлегеля Г. 2005. Современная микробиология. Прокариоты. М.: Мир. Т.2, стр. 393.

48. Паткуль Г.М., Гончиков Г.Г., Лев Г.Б. 1977. Об антагонистической активности молочнокислой микрофлоры курунги по отношению к кишечной палочке // Биология микроорганизмов и их использование в народном хозяйстве. Иркутск. С.83-89.

49. Плешков Б. П. 1968. Практикум по биохимии растений. М.: Изд. Космос. С. 19-31.

50. Пятницына И. Н. 1968. Повышение протеолитической активности штаммов Str. lactis II Труды ВНИМИмолочной промышленности. Изд. Пищевая промышленность. Т. 26. с. 37 52.

51. Работнова И. JI. 1957. Роль физико-химических условий в жизни микроорганизмов. М. С. 104, 105, 235.

52. Раппопорт А. И., Беккер М. Е. 1983. Влияние сахарозы и лактозы на устойчивость дрожжей Saccharomyces cerevisiae к обезвоживанию // Микробиология, т. 52. Вып. 5. С. 719 722.

53. Ратникова И. А., Гаврилова Н.Н., Колокова Н.Н., 1995. Идентификация антибиотических веществ молочнокислых бактерий // Биотехнология, № 5-6. С. 19-20.

54. Саттон Д., Фотергилл М. 2001. Определитель патогенных и условно патогенных грибов. 486 с.

55. Семенихина В. Ф., Рожкова И.В., Гаврилова JI.H., Серебренников В.М., Кисриева Ю.Л. 2001. Биохимизм ароматообразования молочнокислыми стрептококками //Молочная промышленность, №9, с. 14-19.

56. Семенова Е. В. 2005. Составление сред и культивирование микроорганизмов // Практикум по микробиологии / Под ред. А. И. Нетрусова. М.: Академия. С. 33.

57. Серебренников В.М., Кисриев Ю.С., Загустин Н.А. 1998. Образование диацетила и ацетоина производственными штаммами лактококков в различных условиях выращивания. // Прикладная биохимия и микробиол. Т.34. N3. С. 276-280.

58. Скородумова A.M. 1963. Практическое руководство по технической микробиологии молока и молочных продуктов. М.: Пищепромиздат. 307 с.

59. Степаненко П. П. 2005. Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии молока и молочных продуктов. М.: Изд-во Лира. 653 с.

60. Стоянова Л. Г., Полин А. Н., Егоров Н. С. 1988. Использование метода слияния протопластов в селекции продуцента низина. // Антибиотики и химиотерапия. N3. С. 203-210.

61. Стоянова Л.Г., Полин А.Н., Егоров Н.С. 1988. Влияние некоторых аминокислот на рост молочнокислых стрептококков Streptococcus lactis и процесс их протопластирования. // Биолог. Серия. N 6. С. 892-899.

62. Стоянова Л. Г., Егоров Н. С. 1998. Получение низинпродуцирующих бактерий методом слияния протопластов двух родственных штаммов Lactococcus lactis. subsp. lactis, низкоактивных по синтезу низина// Микробиол. т. 67. N1. С. 47-54.

63. Стоянова Л.Г., Егоров Н.С. Сравнительная характеристика новых штаммов Lactococcus lactis subsp. lactis, полученных методом слияния протопластов // Микробиология, 1999. Т. 68. № 2. С.235-240.

64. Стоянова Л. Г., Аркадьева 3. А., 2000. Сравнение способов хранения молочнокислых бактерий // Микробиология, 69, № 1, с. 98-104.

65. Стоянова Л.Г., Т. Д. Сультимова, А. И. Нетрусов. 2003. Влияние фосфата и углеводов на синтез низина Lactococcus lactis subsp. lactis штамм 194.// Вестник Московского Университета, сер. Биология. Т. 16. №4. С. 17-22.

66. Стоянова JI. Г. 2005. Молочнокислые бактерии // Практикум по микробиологии / Под ред. А. И. Нетрусова. М.: Академия. С. 467 486.

67. Суходолец В.В., Ботина С.Г., Лысенко A.M., Тренина М.А. 2005. Молочнокислых энтерококки Entreococcus faecium и Entreococcus durans: разнообразие нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК. // Микробиология. Т. 74. № 6. С.810 815.

68. Фильчакова Н.Н., Панкова Р.И., Королева Н.И. Пагент №2007091, Россия МКП А23с 9.12: Смесь для производства замороженных кисломолочных продуктов / Опубл. 15.02.1994. Бюл. №3.

69. Фостер Э. М., Нельсон Ф. Ю. 1987. Микробиология молока: Пер. с англ. Богданова В. М. // М.: Пищепромиздат. 534 с.

70. Холлэнд И. 1969. Бактериоцины. В кн.: Механизмы действия антибиотиков. М.: Мир. С. 646-649.

71. Хоулт Дж. 1997. Определитель бактерий Берги. М.: Мир. Т. 2. С. 538, 544, 549.

72. Хунданов Л. Е. 1975. Кисломолочные продукты, их приготовление и лечебно-диетическое назначение. Улан-Удэ, Бурятское книжное издательство. 67 с.

73. Шаблин П. Е. 2001. Лечебно-профилактический напиток «ЭМ-курунга» // Биотехнология-2001. Пущино. 25 27 сентября. С. 223 - 227.

74. Шлегель Г. Общая микробиология. М.: Мир. 1987. 566 с.

75. Abee Т, Krockel L, Hill С. 1995. Bacteriocins: modes of action and potentials in food preservation and control of food poisoning. // Int J Food Microbiol. Dec;28(2). P. 169-85.

76. Abee T.N., Krockel H.C., 1995. Bacteriocins: modes of action and potentials in food preservation and control of food poisoning // Int.J.Food Microbiol. 28. P. 169-185.

77. Anderson D. G, McKay L. L. 1983. Simple and rapid method for isolating large plasmid DNA from lactic streptococci. // Appl Environ Microbiol. Sep;46(3). P. 549-552.

78. Anonymous. 1995. Listeria control in the sausage production. Bioprotection of sausages with FloraCarn LC. // FloraCarn Bulletin № 3. EN-B3-FC-1195. Chr. Hansen A/S, Hoersholm, Denmark.

79. Anonymous, 1997. ALC01, a patent antilisterial culture developed especially for soft cheese production. Product Information. // Wisby A/S, Tonder, Denmark.

80. Behal V. 1987. CRC Critical Reviews in Biotechnology. V.5. N4. P. 275-318.

81. Berry E. D., Liewen M. В., Mandigo R. W., Hutkins R. W. 1990. Inhibition of Listeria monocytogenes by bacteriocin -producing Pediococcusduring the manufature fermented simydry sausage.// J. Food Prot. 53(3). P. 194197.

82. Biswas S.R., Ray P., Johnson M.C., Ray B. 1991. Influence of growth conditions on the production of a bacteriocin, pediocin AcH, by Pediococcus acidilactici H. // Appl. Environ. Microbiol. 57. P. 1265-1267

83. Bouttefroy A., and Milliere J. B. 2000. Nisin-curvaticin 13 combinations for avoiding the regrowth of bacteriocin resistant cells of Listeria monocytogenes ATCC 15313. // Int. J. Food Microbiol. 62. P. 65-75.

84. Breukink E., de Kruijff B. 1999. The lantibiotic nisin, a special case or not? // Biochimica et Biophysica Acta. 1462. P. 23-234.

85. Brotz H., Bierbaum G., Leopold K., Reynold P. E., Sahl H. G. 1998. The lantibiotic mersacidin inhibits peptidoglycan synthesis by targeting lipid II. // Antimicrob Agents Chemother. 42. P. 154-160

86. Budde В. B, Rasch M. A. 2001. Comparative study on the use of flow cytometry and colony forming units for assessment of the antibacterial effect of bacteriocins. // Int J Food Microbiol. Jan 22. 63(1-2). P.65-72

87. Buyong, N., Kok J., and Luchansky J. B. 1998. Use of a genetically enhanced, pediocin-producing starter culture, Lactococcus lactis subsp. lactis MM217, to control Listeria monocytogenes in cheddar cheese. // Appl. Environ. Microbiol. 64. P. 4842-4845.

88. Chan Li, Jinghua Baib, Zhaoling Caia and Fan Ouyanga. 2002. Optimization of a cultural medium for bacteriocin production by Lactococcus lactis using response surface methodology // Journal of Biotechnology. Volume 93. Issue 1.31 January. P. 27-34.

89. Chandrapati S., O'Sullivan D. J. 1999. Nisin independent induction of the nisA promoter in Lactococcus lactis during growth in lactose or galactose. // FEMS Microbiol. Letts. 170. P. 191-198

90. Chandrapati S., O'Sullivan D. J. 2002. Characterization of the promoter regions involved in galactose and nisin mediated induction of the nisA gene in Lactococcus lactis ATCC 11454.// Mol. Microbiol. 46. P. 467-477.

91. Cho H. Y., Yousef A. E., Yang S. T. 1996. Continuous production of pediocin by immobilized Pediococcus acidilactici P02 in a packed-bed bioreactor // Appl. and Microbiol. Biotech. V.45 (5). P. 589-594.

92. Chung К. Т., Dickson J. S., Crouse J. D., 1989. Effects of nisin growth of bacteria attached to meat // Applied and Environmental Microbiology. 55. P. 1329-1333.

93. Cintas L. M., Casaus P., Fernandez M. F., and Hernandez P. E. 1998. Comparative antimicrobial activity of enterocin L50, pediocin PA-1, nisin A and lactocin S against spoilage and foodborne pathogenic bacteria. // Food Microbiol. 15. P. 289-298

94. Cleveland, J., Montville T. J., Nes I. F., and Chikindas M. L. 2001. Bacteriocins: safe, natural antimicrobials for food preservation. // Int. J. Food Microbiol. 71. P. 1-20.

95. Cocaign-Bousquet, M., C. Garrigues, L. Novak, N. D. Lindley, and P. Loubiere. 1995. Rational development of a simple synthetic medium for the sustained growth of Lactococcus lactis. // J. Appl. Bacteriol. 79. P. 108-116.

96. Consentino S., Pisano M. В., Piras C., Cjrda A. 2003. Phenotipic, genotypic and technological characteristic of Lactococci isolated from tradional flora sardo cheese.// 1-th FEMS Congress. Slovenia. Lubljna. 29 June 2003. P. 107.

97. Crandall A. D., and Montville T. J. 1998. Nisin resistance in Listeria monocytogenes ATCC 700302 is a complex phenotype. // Appl. Environ. Microbiol. 64. P. 231-237.

98. Cusick S. M., and O'Sullivan D. J. 2000 Use of a single, triplicate arbitrary primed (TAP)-PCR procedure for molecular fingerprinting lactic acid bacteria // Appl. Environ. Microbiol. 66. P. 2227-2231

99. Cutter C. N., Siragusa G. R. 1994. Decontaminationof beef carcass tissue with nisin using a pilot scale model carcass washer // Food Microbiol., 11. P. 481-489.

100. Davies E. A., Bevis H. E., Delves-Droughton J., 1997.// Let. Appl. Microbiol. 24. P. 343-346.

101. De Hoog G. S., Guarro J., Gene J., Figueras M. J. 2000. Atlas of clinical fungi. 2nd edition. CBS/Univ. Rovira i Virgili.

102. De Ley J. 1962. Microbiol classification. // 12-th Sympos. Soc. Gen. Microbiology. Cambridge. P. 184

103. De Man, J. C., Rogosa M., and Sharpe M. E. 1960. A medium for the cultivation of lactobacilli.//J. Appl. Bacteriol. 23. P. 130-135.

104. De Vuyst L. 1994. Nisin production variability between natural Lactococcus lactis subsp. lactis strains. // Biotechnol. Lett. 16. P. 287-292.

105. Delves-Broughton J., 1990. Nisin and its application as a food preservative. // J. Dairy Technol. 43. P. 73-76.

106. Delves-Broughton J., Blackburn P., Evans R.J., Hugenholtz J. 1996. Application of the bacteriocin nizin // International Journal of General and Molecular.Microbiology. No. 2. Feb. V. 69. P. 193-202.

107. Diep, D. В., and I. F. Nes. 2002. Ribosomally synthesized antibacterial peptides in Gram positive bacteria. // Curr. Drug Targets 3. P. 107122.

108. Duwat P., Cesselin В., Sourice S., Gruss A. 2000. Lactococcus lactis, a bacteria model for stress response and survival. // J. Food Microbiol. V.55. P. 83 -86.

109. Eckburg P.B., Bik E.M., Bernstein C.N. et al. 2005. Diversity of the human intestinal microbial flora. // Scince. V. 308. P. 1635-1638.

110. Eijsink, V. G. H., M. Skeie, P. H. Middelhoven, M. B. Brurberg, and I. F. Nes. 1998. Comparative studies of class Ha bacteriocins of lactic acid bacteria. // Appl. Environ. Microbiol. 64. P. 3275-3281.

111. Elkouhen R., Pages J.M. 1996. Dynamic aspects of colicin N translocation through the Escherichia coli outer membrane. // Journal of Bacteriol. P. 5316-5319.

112. Ennahar S., Aoude-Werner D., Sorokine 0., A. van Dorsselaer, Bringel F., Hubert J.-C., Hasselmann C. 1996. Production of pediocin AcH by Lactobacillus plantarum WHE 92, isolated from cheese. // Applied and Environmental Microbiology. 62. P. 4381-4387.

113. Ennahar S., Assobhei O., Hasselmann C., 1998. Inhibition of Listeria monocytogenes in smear-surface soft cheese by Lactobacillus plantarum WHE 92, a pediocin AcH.//J. Food Prot. 61(2). P. 186-191.

114. Ennahar S., T. Sashihara, K. Sonomoto, and A. Ishizaki. 2000. Class Ila bacteriocins: biosynthesis, structure and activity.// FEMS Microbiol. Rev. 24. P. 85-106.

115. European Commission, 1996. List of enzymes, micro-organisms and preparations of these in feedingstuffs that are ahhroved in the various Member States. OJ № 39, Sept. 11, 1996: 3-22.

116. European Parliament and Council directive no. 95/2/EC of 20 Feb. 1995 on food additives other than colours and sweeteners. OJ № L61, March 18. 1995. P. 1-40.

117. European Parliament and Council. Regulation (EC) № 258/97 of the European Parliament and of the Council of 27 Jan. 1997 concerning novel foods and novel food ingredients. Official Journal 1997/ L43, Feb. 14. P. 1-7.

118. Foegeeding P. M., Thomas А. В., Pilkington D. H., Klaenhammer T.R. 1992. Enhanced control of Listeria monocytogenes by in situ-produced pediocin during dry fermented sausage production. // Applied and Environmental Microbiology. 58(3). P. 884-890.

119. Franz С. M, Du Toit M, von Holy A, Schillinger U, Holzapfel WH. 1997. Production of nisin-like bacteriocins by Lactococcus lactis strains isolated from vegetables. //J Basic Microbiol. 37(3). P. 187-96.

120. Gasson Michaei J., 1996. Genetic transfer systems in lactis acid bacteria.// Antonie van Leeuwenhoek. 49(3). P. 275-282.

121. Gross E., Morell J. L. 1971. Hi. Am. Chem. Soc. 92. P. 2919-2920.

122. Gupta R. K., Passad D. N., 1989. Nisin in the preservation of stirred yogurt under non-refrigerated storage. // Microbiolic. Aliments Nutrition. 7(2). P. 123-129.

123. Haese A., Keller U. 1988. Genetics of actinomycin С production in Streptomyces chrysomallus. // J. Bacteriol. 170. P. 1360-1368.

124. Hakozaki, Higashi-ku, Fukuoka, Class Ila bacteriocins: biosynthesis, structure and activity. 2000.// FEMS Microbiol Rev. Jan. 24(1). P. 85-106.

125. Hanlin, M. В., N. Kalchayanand, P. Ray, and B. Ray. 1993. Bacteriocins of lactic acid bacteria in combination have greater antibacterial activity. //J. Food Prot. 56. P. 252-255

126. Hechard, Y., and H.-G. Sahl. 2002. Mode of action of modified and unmodified bacteriocins from Gram-positive bacteria. // Biochimie 84. P. 545-557

127. Hirst A. 1981. Nisin. // Adv. Appl. Microbiol. 27. P. 85-123.

128. Hostalek Z., Vorisek I. 1985. In: Proc. Environmental regulation of microbiol metabolism // Acad. Press. London. P. 15-28.

129. Ingolf F., Nes I. F. and John R. Tagg. 1996. Novel lantibiotics and their pre-peptides. // Antonie van Leeuwenhok. V. 69. No. 2. P. 91-93.

130. Jack R. W., Tagg J. R., Ray B. 1995. Bacteriocins of Gram-positive bacteria. // Microbiol. Rev. 59. P. 171-200.

131. Janes M. E., Hettiarachy, Jonson M. L., 2001. Physical and chemical propertiesof edible films containing nisin and their action against Listeria monocytogenes. II J. Food Sci. 66. P. 141.

132. Janes M. E, Nannapaneni R., Johnson M. G. 1999. Identification and characterization of two bacteriocin-producing bacteria isolated from garlic and ginger root. // J. Food Prot. Aug;62(8). P. 899-904.

133. Jensen N. B. S., C. R. Melchiorsen К. V. Jokumsen and J. Villadsen. 2001. Metabolic behavior of Lactococcus lactis MG1363 in microaerobic continuous cultivation at a low dilution rate. // Appl. Environ. Microbiol. 67. P. 2677-2682.

134. Jensen P. R., and K. Hammer. 1993. Minimal requirements for exponential growth of Lactococcus lactis. II Appl. Environ. Microbiol. 59. P. 4363-4366.

135. Jones D. 1978. Composition and differentiation of the genus Streptococcus II Strepococci. Eds. Skinner F. A., Quesnel L. B. L.: Academic Press. P. 1 -49.

136. Klaenhammer Т. R. 1988. Bacteriocins of lactic acid bacteria. // Biochimie. Mar;70(3). P. 337-49.

137. Klaenhammer T. R. 1993. Genetics of bacteriocins produced by lactic acid bacteria. // FEMS Microbiol Rev. Sep; 12(1-3). P. 39-85.

138. Konings W. N, Kok J., Kuipers 0. P., Poolman B. 2000. Lactic acid bacteria: the bugs of the new millennium. // Curr Opin Microbiol. Jun;3(3). P. 276282.

139. Lasagno M, Beoleito V, Sesma F, Raya R, Font D, Eraso A. 2002. Selection of bacteriocin producer strains of lactic acid bacteria from a dairy environment.// New Microbiol. Jan;25(l). P. 37-44.

140. Lee N. К., Paik H. D., 2001. Partial characterization of lacticin NK 24 a newly identified bacteriocin of Lactococcus lactis NK 24 isolated from Joot-gal. // Food Microbiol., 18. P. 17-24.

141. Lee J-H., and D. J. O'Sullivan. 2006. Sequence Analysis of Two Cryptic Plasmids from Bifidobacterium longum DJOIOA and Construction of a Shuttle Cloning Vector. // Appl. Environ. Microbiol. 72. P. 527-535

142. Lejeune R., Callewaert R., Crabbe K., De Vuyst L. 1998. Modelling the growth and bacteriocin production by Lactobacillus amylovorus DCE 471 in batch cultivation. //J. Appl. Bacteriol. 84. P. 159-168.

143. Leroy F., de Vuyst L. 2001. Growth of the bacteriocin-producing Lactobacillus sakei strain CTC 494 in MRS broth is strongly reduced due to nutrient depletion: model for the growth of lactic acid bacteria // Appl. Environ. Microbiol. 67. P. 4407-4413

144. Li H., and D. J. O'Sullivan. 2002. Heterologous expression of nisin in a dairy Enterococcus strain. // Appl. Environ. Microbiol. 68. P. 3392-3400.

145. Lowry О. H., Rosenbrough N. J., Randal R. J. 1951. Protein measurement with the Foline phenol reagent. // J. Biol. Chem. 193. P. 265 275.

146. Maren A. Klich. 2002/ Identification of common Aspergillus species. CBS, The Netherlands. 116 p.

147. Marmur L. J. 1961. A procedure for the isolation of deoxy-ribonucleic acid from microorganisms. // J. Mol. Biol. 3. P. 208 218.

148. Martinez В., Suarez J.E., Rodriguez A. 1996. Lactococcin- 972 -A homodimeric lactococcal bacteriocin whose primary target is plasma membrane. // Microbiology. Sep. P. 2393-2398.

149. Mayo B. 1993. The proteolytic system of lactic acid bacteria // Microbiologia. Dec;9(2). P.90-106.

150. Montville T. J, Chen Y. 1998. Mechanistic action of pediocin and nisin: recent progress and unresolved questions. // Appl Microbiol Biotechnol. Nov;50(5). P. 511-9.

151. Nes I. F., Diep D.B., Havarstein L.S., Holo H 1996. Biosynthesis of bacteriocins in lactic acid bacterae // Antonie van Leeuwenhoek., V. 70 (2-4). P.l 13-128.

152. Nes I. F., and H. Holo. 2000. Class II antimicrobial peptides from lactic acid bacteria. // Biopolymers 55. P. 50-61.

153. Nilson L. H., Huss H. H., Gram L., 1997. Inhibition of Listeria monocytogenes on cold-smoked salmon by nisin and carbon dioxide atmosphere// Int. J. Food Microbiol. 38. P. 217-227.

154. Nissen-Meyer J., and I. F. Nes. 1997. Ribosomally synthesized antimicrobial peptides: their function, structure, biogenesis, and mechanism of action. // Arch. Biochem. Biophys. 167. P. 67-77.

155. O'Sullivan D. J. 2000. Methods for analysis of the intestinal microflora. // Curr. Issues Intest. Microbiol. 1. P. 39-50

156. O'Sullivan D. J. 2001. Screening of intestinal microflora for effective probiotic bacteria. //J. Ag. Food Chem. 49. P. 1751-1760.

157. O'Sullivan L., Ross R. P., Hill C. 2002. Potential of bacteriocin-producing lactic acid bacteria for improvements in food safety and quality // Biochimie. May-Jun;84(5-6). P. 593-604.

158. Owen R. J., Hill L. R., Lapage S. P. 1969. Determination of DNA base compositions from melting profiles in dilute buffers. // Biopolymers 7. P. 503-516.

159. Parente E., Ricciardi A. 1999. Production, recovery, and purification of bacteriocins from lactic acid bacteria // Appl. Microbiol. Biotechnol. 52. P. 628638

160. Park S. H., Itoh K., Kikuchi E., Niwa H., Fujisawa T. 2003. Identification and characteristics of nisin Z-producing Lactococcus lactis subsp. lactis isolated from Kimchi. // Curr Microbiol. May;46(5). P. 385-8.

161. Paul Rossa, S. Morgana, C. Hillb. 2002. Preservation and fermentation: past, present and future International // Journal of Food Microbiology Volume 79, Issues 1-2 , 15 November 2002, P. 3-16.

162. Phister T. G., O'Sullivan, D. J. and McKay L. L. 2004. Identification of bacilysin, chlorotetaine, and iturin A produced by Bacillus sp strain CS93 isolated from pozol, a Mexican fermented maize dough. // Appl. Environ. Microbiol. 70. P. 631-634.

163. Raper К. В., Fennell D. I. 1965. The genus Aspergillus: 302.

164. Ray В., Daeschnell M. A. 1992. Food biopreservatives microbial // Boca Raton CRC Press. P. 207-264.

165. Riley M. A., Wertz J. E. 2002. Bacteriocins: evolution, ecology, and application. // Annu Rev Microbiol. 56. P. 117-37. Epub 2002.

166. Roberts R. F., Zottola E. A., 1993. Shelf-life of pasteurized process cheese spreads made from cheddar cheese manufactured with nisin-producing starter culture. // J. Dairy Sci. 76. P. 1829-1836.

167. Ross R. P., Galvin M., McAuliffe 0., Morgan S. M., Ryan M. P., Twomey D. P., Meaney W. J., Hill C. 1999. Developing applications for lactococcal bacteriocins // Antonie van Leeuwenhoek. 76. P. 337-346.

168. Rossland E, Andersen Borge GI, Langsrud T, Sorhaug T. 2003. Inhibition of Bacillus cereus by strains of Lactobacillus and Lactococcus in milk. // Int J Food Microbiol. Dec 31;89(2-3). P. 205-12.

169. Schleifer K.H. 1987. Recent changes in the taxonomy of lactic acid bacteria // FEMS Microbiol. Rev. V. 46. P. 201-203.

170. Schleifer K.H., Ludwig W. 1989. Phylogenetic relationships among bacteria. In: Fernholm В. Bremer. K., Jornwall H. (eds.) The hierarchy of life //Amsterdam .Elsevier. P. 103 117.

171. Schleifer K.H. 1987. Recent changes in the taxonomy of lactic acid bacteria //FEMS Microbiol. Rev. 46. P. 201-203.

172. Senger F., Nicklen S., Coulsen A. 1977. DNA sequencing with chain-terminating ingibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 84. P. 5453 5467

173. Smid E.J., Poolman В., Konings W.N. 1991. Casein utilization by lactococci // Appl.And Environ. Microbiol. V.57. N9. P. 2447-2452

174. Somers E. В., Sandine W. E., Aytes J. W. 1990. Antibotulinal effectiveness of nisin in pasteurized process cheese spreads// J. Food Prot.,50 (10). P. 842-848.

175. Stackebrandt E., Teuber M. 1988. Molecular taxonomy and polygenetic position of lactic acid bacteria // Biochemie. V.70, P. 317-324.

176. Stackebrandt E., Teuber M. 1988. Molecular taxonomy and polygenetic position of lactic acid bacteria//Biochemie. 70. P. 317-324.

177. Stiles M. E. 1996. Biopreservation by lactic acid bacteria // Antonie van Leeuwenhoek, 70. P. 331-345.

178. Stojanova L. G., Egorov N. S., Katrucha G. S., Fedorova G. B. 1994. Isolation and characterisation of new lantibiotics derived from fusant of Lactococcus lactis F-116. The 2-en Workship on Lantibiotics, Holland, Arnhem, 20- 23 November. P. 3.

179. Swearingen P. A., O'Sullivan D. J., Warthesen J. J. 2001. Isolation, characterization and influence of native nonstarter lactic acid bacteria in Cheddar cheese quality. // J. Dairy Sci. 84. P. 50-59.

180. Szabo E.A., Cahill M.E. 1998. The combined affects of modified atmosphere, temperature, noson and ALTA™2341 on the growth of Listeria monocytogenes II Int. J. Food Microbiol. 43. P. 21-31.

181. Tahara Т., Oshimura M., Kanatani K. 1996 Mode of action of acidocin 8912 // Lett. Appl. Microbiol, V. 23. № 3. P. 192-194.

182. Tanaka N., Traisman E., Plantinga P., Finn L., Flom W., Meske L., Guggisberg J. 1986. Evaluation of factors involved in antibotulinal properties of pasteurized process cheese spreads // J. Food Prot. 49 (7). P. 526-531.

183. Taylor L. Y., Cann D. D., Welch B. J. 1990 Antibotulinal properties of nisin in fresh fish packaged in an atmosphere of carbon dioxide // J. Food Prot. 53(11). P. 953-957.

184. Taylor S. L., Somers E. B. 1985. Evaluation of the antibotulinal effectiveness of nisin in bacon // J. Food Prot. 48. P. 949-952.

185. Taylor S. L., Somers E. В., Krueger L. A. 1985. Antibotulinal effectiveness of nisin-nitrite combinations in culture medium and chicken frankfurter emulsions // J. Food Prot. 48. P. 234-239.

186. Todd I., Talarico, Dobrogosz Walter J. 1989. Chemical Characterization of an antimicrobal substance produced by Lactobacillus reuteri II Antimicrobal Agents and Chemotherapy. 33(5). P. 674-679.

187. Twomey D., Ross R. P., Ryan M., Meaney В., Hill C. 2002. Lantibiotics produced by lactic acid bacteria: structure, function and applications. // Antonie van Leeuwenhoek 82. P. 165-185.

188. Wang S. Y., Dockerty T. R., Ledford R. A., Stouffer J. R. 1986. Shelf-life extension of vacuum packaged frankfurters made from beef inoculated with Streptococcus lactis II J. Food Prot. 49(2). P. 130-134.

189. Wessels S., Huss H. H. 1996 Suitability of Lactococcus lactis subsp lactis ATCC 11454 as a protective culture for lightly preserved fish products // Food Microbiol. 13. P. 323-332.

190. Yang J., and D. J., O'Sullivan. 2006. Involvement of the LlaKR2I Methylase in the Expression of the AbiR Bacteriophage Defense System in Lactococcus lactis ssp. lactis biovar diacetylactis KR2. // J. Bacteriol. 188. P. 1920-1928.

191. Yildirim Z., Yildirim M., Johnson M. G. 2004. Mode of action of lactococcin R produced by Lactococcus lactis R. // Nahrung V. 48. № 2. P. 145148.

192. Yother J., Trieu-Cuot P., Klaenhammer T. R., De Vos W. M. 2002. Genetics of streptococci, lactococci and enterococci: review of the sixth international conference // J. Bacteriol. 184. P. 6085-6092.