Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Скрининг аллелей BoLA-DRB3 в популяциях крупного рогатого скота различных пород

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Скрининг аллелей BoLA-DRB3 в популяциях крупного рогатого скота различных пород"

На ттрашх^ущуписи

БЫКОВА Александра Сергеевна

СКРИНИНГ АЛЛЕЛЕЙ ВОЬА-БЫВЗ В ПОПУЛЯЦИЯХ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА РАЗЛИЧНЫХ ПОРОД

03.02.07-Генетика

06.02.07 - Разведение, селекция, генетика сельскохозяйственных животных

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

-8 ДЕК 2011

Дубровицы-2011

005003960

Работа выполнена в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики животных Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук.

Научные руководители: доктор биологических наук,

профессор, член-корреспондент РАСХН Зиновьева Наталия Анатольевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Ведущая организация: ФГОУ ВПО Российский государственный аграрный университет-МСХА им. К.А. Тимирязева.

Защита состоится « » декабря 2011 г. в 10 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 006.013.03 при Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук.

Адрес института: 142132, Московская область, Подольский район, п. Дубровицы, ГНУ ВИЖ, тел./факс (4967) 65-11-01. www.vij.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии.

кандидат биологических наук, Гладырь Елена Александровна

Букаров Нурмагомед Гаджи кулиевич

доктор биологических наук, профессор Калашникова Любовь Александровна

Автореферат разослан » ноября 2011

г.

Ученый секретарь Совета Д 006.013.03

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Основными целями селекционной работы в молочном скотоводстве являются повышение уровня удоя и выхода молочного жира и белка (Красота В.Ф. и др., 2005; Никифорова Л.Н., 2009). Однако повышенная молочная продуктивность сопряжена со снижением устойчивости к различным заболеваниям, что негативно сказывается на процессе производства, существенно увеличивая стоимость выходной продукции (Тараторкин В.М., Петров Е.Б., 2009).

Развитие молекулярной генетики и совершенствование методов анализа генома животных привело к внедрению в практику животноводства маркерной селекции, основанной на анализе генетических маркеров -участков ДНК, связанных с проявлением определенных признаков (Сулимова Г.Е., 2004, Калашникова Л.А., 2000, Букаров Н.Г., 2004). Использование ДНК-маркеров, обуславливающих устойчивость или наоборот чувствительность к заболеваниям, является одним из приемов селекции животных, нацеленной на получение особей, обладающих повышенной резистентностью к заболеваниям (Эрнст JI.K., Зиновьева H.A., 2008). Использование такой стратегии является особо актуальным для инфекционных заболеваний, борьба с которыми только с использованием ветеринарных мероприятий не всегда эффективна.

Одним из широко распространенных на территории России заболеваний является лейкоз крупного рогатого скота (Петров Н. И., 2001). По данным Россельхознадзора в 2010 году было выявлено около 10% животных, инфицированных вирусом лейкоза (ВЛКРС), у которых наблюдались неопластические изменения и изменения лейкоформулы (www.fsvps.ru). В качестве потенциальных ДНК-маркеров устойчивости к лейкозу рассматриваются гены главного комплекса гистосовместимости локуса BoLA, в частности, ген DRB3 (Эрнст JI.K. и др.1998, Ковалюк Н.В., 2008). Вместе с тем, внедрение данного маркера в практику сдерживается, с одной стороны, отсутствием системы генотипирования животных на наличие «желательных» аллелей в режиме скрининга животных, с другой стороны, наличием лишь ограниченной информации о наличии и характере связи «желательных» аллелей с признаками молочной продуктивности коров.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлся скрининг гена BoLA-DRB3 на наличие аллелей, ассоциированных с устойчивостью к лейкозу, у крупного рогатого скота различных пород.

Для достижения цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Провести секвенирование и создать банк ДНК референтных образцов с различными генотипами по BoLA-DRB3.

2. Разработать систему выявления «желательных» аллелей *11, *23, *28=*7А BoLA-DRB3, ассоциированных с устойчивостью к лейкозу, пригодную для массового скрининга скота;

3. Изучить частоты встречаемости «желательных» генотипов и аллелей BoLA-DRB3 у различных пород крупного рогатого скота.

4. Изучить степень инфицированное™ коров вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) в зависимости от наличия в их генотипе «желательных» аллелей ВоЬА-ОМЗЗ.

5. Изучить влияние генотипа по ВоЬА-ОКВЗ и статуса по ВЛКРС на показатели молочной продуктивности коров.

Новизна работы. Впервые разработана тест-система, позволяющая в режиме массового скрининга выявлять животных-носителей «желательных» аллелей ВоЬА-Б1ФЗ (*11, *23, *28=*7А), ассоциированных с устойчивостью к лейкозу. Изучено распределение «желательных» аллелей ВоЬА-МШЗ в основных породах крупного рогатого скота, разводимых в России, а также у гибридов крупного рогатого скота и зебу. Проведен анализ влияния наличия в генотипе «желательных» аллелей ВоЬА-ОИВЗ на статус по ВЛКРС и уровень молочной продуктивности коров. Получен патент на изобретение «Способ диагностики устойчивости крупного рогатого скота к вирусу лейкоза», 1Ш 2428485 С1 от 10.09.2011. Приоритет от 09.03.2010 г.

Практическая значимость. С использованием разработанной тест-системы проведен массовый скрининг 1216 голов крупного рогатого скота 10 пород, разводимых на территории Российской Федерации, на наличие «желательных» аллелей ВоЬА-БКВЗ (*11, *23, *28=*7А), ассоциированных с устойчивостью к лейкозу. Установлено, что гомозиготные носители «желательных» аллелей ВоЬА-ОИЗЗ являются свободными от ВЛКРС. Показано достоверное превосходство коров черно-пестрой голштинизированной породы - носителей ВЛКРС над не носителями по уровню удоя, содержанию и выходу белка, а также по выходу молочного жира. Выявлено достоверное превосходство коров - не носителей ВЛКРС, имеющих гетерозиготный генотип по ВоЬА-БКВЗ, по содержанию жира в молоке у коров черно-пестрой голштинизированной породы, а так же по уровню удоя и выходу молочного жира у коров красной горбатовской породы.

Основные положения, выносимые на защиту:

• Система определения в режиме скрининга «желательных» аллелей ВоЬА-ОЯВЗ (*11, *23, *28=*7А), ассоциированных с устойчивостью к лейкозу.

• Распределение «желательных» аллелей и генотипов у крупного рогатого скота 10 пород и зебувидного скота.

• Отсутствие носителей провирусной формы ВЛКРС среди животных, гомозиготных по «желательным» аллелем ВоЬА-БНВЗ.

• Связи генотипов ВоЬА-ВЛВЗ с показателями молочной продуктивности коров.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены и обсуждены:

• на 7-й международной научной конференции «Современные достижения и проблемы генетики и биотехнологии сельскохозяйственных животных», БиоТехЖ-2008,2008 г., п. Дубровицы;

• на Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные проблемы сельскохозяйственной науки и практики в современных условиях и пути их решения» посвященной памяти Р.Г. Гареева, 25-27 февраля 2009 г., Казань;

• на V Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 16-20 марта 2009 г., Москва;

• на конференции «Достижения в генетике, селекции и воспроизводстве сельскохозяйственных животных», посвященной 100-летию со дня рождения основателя института, заслуженного деятеля науки профессора М.М. Лебедева, 3-5 июня 2009 г., Санкт-Петербург-Пушкин;

• на конференции «Ориентированные фундаментальные исследования и их реализация в АПК России», 28-30 октября 2009 г., Сергиев Посад;

• конференции Центра биотехнологии и молекулярной диагностики ГНУ ВИЖ 16 ноября 2011 года.

Структура и объем работы. Диссертация написана на 110 страницах, состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты и обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы. Диссертационная работа содержит 34 таблицы и 10 рисунков. Список литературы включает 148 источников, в том числе 82 источника на иностранном языке.

Публикации результатов исследований. Всего по теме диссертационной работы опубликовано 6 работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ («Зоотехния», 2009, №9; «Проблемы биологии продуктивных животных», 2011, № 1). Получен патент на изобретение.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проводили в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики животных ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук в период с 2007 по 2011 гг. по схеме, приведенной на рисунке 1.

Выборка была представлена 1216 головами 10 пород крупного рогатого скота, разводимых на территории Российской Федерации: черно-псстрая голштинизированная (п=417), симментальская (п=94), айрширская (п=53), ярославская (п=203), красная горбатовская (п=167), бестужевская (п=28), костромская (п=121), бурая швицкая (п=21), сычевская (п=29), холмогорская (п=83) и 19 гибридами зебу и крупного рогатого скота.

Материалом для молекулярно-генетических исследований являлись образцы ткани (ушные выщипы), крови или спермы. Выделение ДНК проводили по общепринятым методикам (Зиновьева H.A. и др., 1998) и с использованием колонок Nexttec GmbH (Германия), набора реагентов DIAtom™ DNA PreplOO (Россия).

Коллекцию референтных образцов с известными генотипами в позициях 70-71 BoLA-DRB3 получали с использованием метода

пиросеквенирования. Наличие «желательных» аллелей ВоЬА-ОЛВЗ (*11, *23, *28=*7А), ассоциированных с устойчивостью к лейкозу, определяли с использованием системы, разработанной в ходе выполнения диссертации.

Рис. 1. Схема проведенных исследований

Определение наличия провирусной формы ВЛКРС в крови животных проводили с использованием методики Гладырь Е.А. и др. (2006).

На основании данных анализа генотипа животных проводили оценку популяционно-генетических параметров исследованных пород. Были определены частоты встречаемости желательных аллелей и генотипов,

наблюдаемый (Но) и ожидаемый (Не) уровни гетерозиготности, рассчитаны индекс фиксации F и число эффективных аллелей (Ne), построены матрица генетических дистанций по методу Nei (Nei М., 1983) и дендрограмма генетических расстояний между исследованными породами.

Статистическую обработку данных лабораторных исследований и зоотехнического учета проводили методами дисперсионного и корреляционного анализа с использованием критериев Фишера и Стьюдента по методикам, описанным Животовским JI.A. (1991) и Крамаренко С.С. (2004), с помощью программ Статистика 6.0 и Excel.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. Разработка системы скрининга аллелей BoLA-DRB3, ассоциированных с устойчивостью к лейкозу Анализ нуклеотидных последовательностей и информации, содержащейся в электронной базе данных NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/. показал, что все аллели BoLA-DRB3 (*11, *23, *28 =*7А), ассоциированные с генетической устойчивостью к вирусу лейкоза, в отличие от других аллелей (нейтральных и чувствительных) содержат два нуклеотидных триплета gga и gag, соответствующих аминокислотам Glu и Arg в позициях 70 и 71 (аллели ER). В этой связи, теоретическое моделирование тест-системы было направлено на идентификацию животных-носителей аллелей ER BoLA-DRB3.

На первом этапе выполнения работы нами была создана коллекция ДНК с известными генотипами в позициях 70 и 71 BoLA-DRB3.

Смоделированная нами система скрининга животных по BoLA-DRB3 предусматривала проведение аллелеспецифической ПЦР с целью идентификации образцов, содержащих аллели ER, с последующим пиросеквенированием таких образцов с целью определения зиготности (гомозиготный или гетерозиготный генотип по ER). Экспериментальная апробация системы на референтных образцах показала 100% совпадение результатов анализа.

3.2. Определение частот встречаемости «желательных» аллелей и генотипов BoLA-DRB3 Результаты генотипирования скота с использованием разработанной системы приведены в таблице 1 и на рисунке 2.

Как следует из данных таблицы 1, наибольшее число «желательных» гомозиготных генотипов выявлено в симментальской (12,77%) и костромской породах (9,09%). Относительно высокие частоты встречаемости «желательных» генотипов выявлены в холмогорской (8,43%) и айрширской (7,55%) породах. Оценка достоверности наблюдаемых различий показала, что симментальская порода по частоте встречаемости гомозигот достоверно (р<0,05) превосходит все остальные породы, кроме холмогорской и костромской. Бурая швицкая и сычевская породы уступают по частоте встречаемости гомозиготных генотипов другим исследованным породам

(р<0,05). Гетерозиготные генотипы достоверно чаще по сравнению с остальными популяциями встречались у зебувидного скота (р<0,05'), достоверно реже - в бестужевской и красной горбатовской породах (р<0,05). Табл. 1. Распределение частот встречаемости генотипов ВоЬА-БКВЗ у

Группа животных Частоты генотипов, М±т

ЕЯ/ЕЯ, % ЕКУ % -/- *, %

Черно-пестрая голштинизированная порода 4,08±0,97 16,07±1,80 79,86±1,96

Симментальская порода 12,77±3,05 28,72±4,84 58,51±5,23

Айрширская порода 7,55±3,63 16,98±5,16 75,47±5,91

Ярославская порода 5,42±1,59 16,75±2,62 77,83±2,92

Красная горбатовская 3,59±1,44 2,99±1,32 93,41±1,92

Бестужевская порода 3,57±3,51 7,14±4,87 89,29±5,85

Костромская порода 9,09±2,61 21,49±3,73 69,42±4,19

Бурая швицкая порода 0 14,29±7,64 85,71±7,64

Сычевская порода 0 13,79±6,40 86,21±6,40

Холмогорская порода 8,43±3,44 26,51 ±4,6 7 65306±5,08

Зебувидный скот 5,26±5Д2 36,84±11,07 57,89±11,33

В среднем 5,67±0,66 16,68±1,06 77,65±1,19

Примечание: * - нейтральные или чувствительные аллели

Примечание: ось X - породы скота; под осью X показаны значения частот встречаемости «желательных» аллелей ЕЯ, %; слева от оси У -частоты аллелей, %; справа от оси У- ошибка частот аллелей, %.

Рис. 2. Распределение частот встречаемости аллелей ВоЬА-ОЯВЗ у крупного рогатого скота различных пород

Частоты встречаемости желательных аллелей ER варьировали от 5,09% в красной горбатовской породе до 27,13% в симментальской породе. Относительно высокие значения частот встречаемости «желательных» аллелей отмечены так же у холмогорской, костромской и айрширской пород (21,69,19,83 и 16,04%, соответственно).

Популяционно-генетические параметры исследованных пород скота, рассчитанные на основании их генотипов по BoLA-DRB3 по Peakall R. и Smouse P.E. (2006) обобщены в таблице 2.

Табл. 2. Показатели генетического разнообразия крупного рогатого

скота различных пород по гену BoLA-DRB3

Группа животных N Ne Но Не F

Черно-пестрая голштинизированная 417 1,27 0,16 0,21 0,25***

Холмогорская 83 1,51 0,27 0,34 0,22*

Айрширская 53 1,37 0,17 0,27 0,37**

Ярославская 203 1,31 0,17 0,24 0,30***

Красная горбатовская 167 1,И 0,03 0,10 0,69***

Бестужевская 28 1,15 0,07 0,13 0,46*

Костромская 121 1,47 0,21 0,32 0,32***

Бурая швицкая 21 1,15 0,14 0,13 -0,08"*

Сычевская 29 1,15 0,14 0,13 -0,07ns

Симментальская 94 1,67 0,30 0,40 0,26*

Зебувидный скот 19 1,57 0,37 0,36 -0,02ns

Примечание: Но — наблюдаемая гетерозиготность; Не - ожидаемая гетерозиготностъ; F - индекс фиксации, Ne - число эффективных аллелей; ns- не достоверно/not significant, *р<0,05, **p<0,0J, ***р<0,001 Наибольшее число эффективных аллелей (1,67) было обнаружено у симментальской породы, что говорит о большем генетическом разнообразии в данной породе по сравнению с другими. Положительные значения индекса фиксации F указывают на недостаток гетерозигот. Исключение составили бурая швицкая, сычевская породы и зебувидный скот, где было отмечено отрицательное значение этого показателя, что свидетельствует об избытке гетерозигот. Анализ генного равновесия по Харди-Вайнбергу показал, что отклонения наблюдаемых частот аллелей от ожидаемых в бурой швицкой, сычевской породах и у зебувидного скота носят случайный характер, в то время как в остальных популяциях эти различия обусловлены определенными факторами, в частности, ведением селекционной работы с использованием ограниченного числа производителей, разведения по линиям, что в целом ведет к нарастанию инбридинга.

Расчеты значения F коэффициента Фишера при заданном числе степеней свободы и уровне значимости, а также силы влияния фактора г|2 показали, что межпопуляционная изменчивость, обусловленная влиянием фактора породы, достоверно превосходит изменчивость по гену BoLA-DRB3

внутри популяций. При этом сила влияния данного фактора составляла всего 4,2% (р<0,001). Это говорит о том, что факт принадлежности животного к определенной породе не гарантирует у него наличия в генотипе устойчивых к лейкозу аллелей, хотя и несколько повышает вероятность их обнаружения. Существенную роль (95,6%) играют другие неучтенные факторы.

Расчеты генетических дистанций по методу М. (1983) показали, что наиболее существенные различия по локусу ВоЬА-ОШЗЗ выявлены между симментальской и красной горбатовской, бурой швицкой, сычевской и бестужевской породами (от 0,026 до 0,049).

Как показано на рисунке 3, молочные породы (айрширская, ярославская, черно-пестрая голштинизированная, холмогорская, костромская) образовывали на дендрограмме отдельный кластер, который, в свою очередь, был разделен еще на два кластера. Зебувидный скот был отнесен к этому кластеру, поскольку при его выведении использовались животные черно-пестрой породы. Другой крупный кластер был образован породами комбинированного направления продуктивности - бестужевской, сычевской, бурой швицкой и красной горбатовской, относительно недалеко отстоящей от молочных пород. Симментальская порода, отличавшаяся наибольшей частотой желательных аллелей, образовала отдельный кластер.

Таким образом, анализ показал, что симментальская порода с наибольшей частотой встречаемости желательных аллелей может быть использована в качестве перспективной породы при создании стада генетически устойчивого к лейкозу.

пге---, I

0Д4

ё ода

<в

Q а> О)

я

| 0Л2

0,01

ОрО --1 . I—i---III!__

Simm Sych BSw Best KrG Zebu Kost Holm Air Yar Ch-P

Рис. 3. Дендрограмма генетических дистанций

3.3. Анализ распределения носителей ВЛКРС в зависимости от генотипа по ВоЬА-БЛВЗ

Исследование влияния присутствия в генотипе «желательных» аллелей ВоЬА-БКВЗ на заболеваемостью лейкозом проводилось на животных черно-пестрой голштинизированной, красной горбатовской пород и зебувидного скота (табл. 3).

Табл. 3. Распределение носителей провируса ВЛКРС в зависимости

от наличия «желательных» аллелей ВоЬА-БКВЗ

Группа животных Генотип по ВоЬА-011ВЗ ВЛКРС «+»* ВЛКРС «-»*

гол. % гол. %

Черно-пестрая голштинизирован ная порода ЕЯ/ЕЯ 0 0,00 16 100,0

ЕШ- 13 78,33 47 21,67

-/- 72 76,16 230 23,84

Красная горбатовская порода ЕЯ/ЕЛ шш 0,00 Ш-ШШг 100,0

ЕЫ/- 2 60,00 3 40,0

-/- 23 85,26 133 14,74

Зебувидный скот ЕИ/ЕЯ Ш'ШШ 0,00 100,0

ЕК/- 0 0,00 7 100,0

-/- 0 0,00 11 100,0

Всего ЕЯ/ЕЯ 0 0,00 23 100,0

ЕЯУ- 15 79,17 57 20,83

-/- 95 79,74 374 20,26

Примечание: ВЛКРС «+» - носители ВЛКРС, ВЛКРС «-» - не

носители ВЛКРС. Как следует из данных таблицы 3, наибольшее количество вирусоносителей в черно-пестрой голштинизированной породе наблюдалось среди животных, не имевших в своем генотипе «желательных» аллелей ВоЕА-ВЯВЗ. Зебувидный скот вне зависимости от генотипа по ВоЬА-ОЮЗЗ был свободен от провируса лейкоза. Ни у одного из животных, имеющих в своем генотипе «желательные» аллели в гомозиготном состоянии, провирус лейкоза обнаружен не был. У коров черно-пестрой голштинизированной породы заметных различий в степени инфицированное™ ВЛКРС между гетерозиготными носителями «желательных» аллелей ВоЬА-ОКВЗ и не носителями выявлено не было (21,67 и 21,84%, соответственно), в то время как в красной горбатовской породе эта показатели составили, соответственно, 40,00 и 14,74%. С использованием дисперсионного анализа установлено, что наличие в генотипе животных «желательных» аллелей по ВоЬА-БИВЗ с вероятностью ошибки 5,5% способствует снижению их инфицированности ВЛКРС.

3.4. Анализ уровня молочной продуктивности коров в зависимости от

статуса по ВЛКРС и генотипа по ВоЬА-БИВЗ 3.4.1. Влияние статуса по ВЛКРС на уровень молочной продуктивности Результаты анализа молочной продуктивности в группах коров с различным статусом по ВЛКРС (носители ВЛКРС и свободные от ВЛКРС) приведены в таблице 4.

Табл. 4. Показатели продуктивности коров с различным статусом по

ВЛКРС

Показатель Порода

Черно-пестрая голштинизированная Красная горбато вская

ВЛКРС «+» ВЛКРС «-» ВЛКРС «+» ВЛКРС«-»

N. голов 78 189 23 110

Удой, кг 6553±113* 5965±72 3362±199 3165±75

Жир, % 3,98±0,04* 3,84±0,03 4,16±0,04 4,19±0,02

Выход жира, кг 249,4±5,6** 230,1±3,6 140,1±8,43 132,1±3,01

Белок, % 3,09±0,02 3,08±0,01 -

Выход белка, кг 193,2±3,6* 184,0±2,3 - -

Примечание: *р<0,05, **р<0,01, ***р<0,001

Как следует из данных таблицы 4, коровы - носители ВЛКРС обеих исследованных пород отличались большей молочной продуктивностью по сравнению с не носителями. В черно-пестрой голштинизированной породе носители ВЛКРС превосходили здоровых животных по удою на 588 кг, содержанию жира - на 0,14% абс. и выходу белка на - на 9,2 кг (р<0,05), а также по выходу молочного жира на 19,3 кг (р<0,01). В красной горбатовской породе была установлена аналогичная тенденция по уровню удоя и выходу молочного жира, однако различия между группами были не достоверны.

3.4.2. Влияние генотипа по гену ВоЬА-ОКВЗ на уровень молочной продуктивности коров Результаты анализа молочной продуктивности коров в зависимости от генотипа по ВоЬА-1ЖВЗ обобщены в таблице 5.

Табл. 5. Молочная продуктивность коров в зависимости __от генотипа по ВоЬА-БЛВЗ

Показатель Генотип по ВоЬА-ОЬШЗ

Черно-пестрая голштинизированная порода Красная горбатовская порода

ЕК/ЕЯ ЕЯ/- -/-* ЕК/ЕИ ЕН/- -/-*

п, гол. 7 44 216 5 5 123

Удой, кг 5892±491 6172±154 6030±68 2863±136 3546±538 3199±74*

Жир, % 3,98±0,06 3,98±0,05* 3,86±0,03 4,27±0,08 3,98±0,08** 4,19±0,02

Выход жира, кг 235,1±21,7 247,3±8,2 233,4±3,4 121,9±4,5 141,5±22,3 133,6±3,0*

Белок, % 3,08±0,06 3,08±0,03 3,09±0,01 - - -

Выход белка, кг 180,7±13,0 190,1±4,9 186,2±2,2 - - -

Примечание: -/-* - чувствительные и нейтральные аллели, * - р<0,05;

**-р<0,01; ***-р< 0,001 Максимальный удой отмечен в группах коров, несущих гетерозиготный генотип по ВоЬА-ВЛВЗ, минимальный - у коров, гомозиготных по аллелям ЕЯ.

Таким образом, гетерозиготные генотипы по ВоЬА-БЫВЗ являются наиболее предпочтительными, исходя из уровня молочной продуктивности.

12

3.4.3. Комплексное влияние генотипа по гену ВоЬА-Б1ШЗ и статуса по ВЛКРС на уровень молочной продуктивности коров

Результаты анализа уровня молочной продуктивности в группах коров с различными генотипами по ВоЬА-БКВЗ в зависимости от статуса по ВЛКРС приведены в таблице 6.

Табл. 6. Уровень молочной продуктивности коров - носителей и не носителей ВЛКРС с разными генотипами по гену ВоЬА-РЯВЗ

Показатель Статус по ВЛКРС* Генотип по ВоЬА-БЯВЗ

Черно-пестрая голштинизированная Красная горбатовская

ЕЯ/ЕЯ ЕЯ/- Е1Ш1 ЕЙУ- -/-*

N. гол. + 0 10 68 0 2 21

- 7 34 148 5 3 102

Удой, кг + 0 6290±355 о248±120 0 3600±1700 3339±183

- 5892±491 6138±172 5930±80 2863±136 3511±12 3170±80

Жир, % + 0 4,02±0,08 3,98±0,05 0 3,97±0,08 4,18±0,04

- 3,98±0,06 3,97±0,06 3,80±0,03 4,27±0,08 3,98±0,14 4,19±0,02

Выход жира, кг + 0 252,6±15,0 249,0±6,1 0 144,0±70,1 139,7±7,9

- 235,1±21,7 245,7±9,7 226,2±3,9 121,9±4,5 139,8±4,5 132,4±3,2

Белок, % + 0 3,11±0,04 3,09±0,02 - - -

- 3,08±0,06 3,07±0,03 В,09±0,01 - - -

Выход белка, кг + 0 532,0±11,4 541,3±4,5 - - -

- 543,9±10,1 538,7±7,4 542,1±3,3 - - -

Примечание: *-«+»- носители ВЛКРС, «-»- не носители ВЛКРС, **

нейтральные и чувствительные аллели Анализ уровня молочной продуктивности в группах коров, гетерозиготных по «желательным» аллелям ВоЬА-ОКВЗ и не имеющих «желательных» аллелей показал, что носители ВЛКРС превосходили коров -не носителей по всем показателям молочной продуктивности вне зависимости от породной принадлежности.

3.5. Оценка влияния линейной принадлежности коров на распределение аллелей ВоЬА-БКВЗ и статус по ВЛКРС Исследования влияния линейной принадлежности и происхождения коров на формирование «желательного» генотипа по ВоЬА-ВИВЗ, молочную продуктивность и заболеваемость лейкозом, были выполнены на коровах черно-пестрой голштинизированной породы, содержащихся в ФГУП э/х «Кленово-Чегодаево». Выборка коров была представлена генеалогическими линиями Вис Бэк Айдиала (ВБА), Монтвик Чифтейна (МЧ), Рефлекшн Соверинга (РС), Силинг Трайджун Рокита (СТР) и Файн Телекс Грейлинд (ФТГ). Кровность по голштинской черно-пестрой породе в среднем была на уровне 70-80%. Средние показатели молочной продуктивности по первой лактации составили 6043±68 кг по удою, 3,88±0,03% - по содержанию жира в молоке и 3,09±0,01% - по содержанию белка в молоке.

Частота встречаемости особей, гомозиготных по «желательным» аллелям ВоЬА-БЛВЗК, составляла 4,17%, гетерозиготных - 16,39% и животных, не несущих «желательных» аллелей - 79,44%.

3.5.1. Полиморфизм гена ВоЬА-РИВЗ у коров черно-пестрой голштинизированной породы различных генеалогических линий Частоты встречаемости генотипов и аллелей ВоЬА-БКВЗ у коров разных линий представлены в таблице 7.

Табл. 7. Распределение генотипов и аллелей ВоЬА-ВИВЗ у коров черно-

Генеалогическая линия Число голов Частота генотипов, % Частота аллелей, %

ЕИ/ЕЖ. ЕИ/- -/-* ЕЙ -/-*

ВБА 112 2,68 14,29 83,04 9,82±1,98 90,18±1,98

МЧ 76 2,63 14,47 82,89 9,87±2,42 90,13±2,42

РС 86 4,65 22,09 73,26 15,70±2,77 84,30±2,77

СТР 13 0,00 7,69 92,31 3,85±3,77 96,15±3,77

ФТГ 5 20,00 40,00 40,00 40,00±15,49 60,00± 15,49

Другие линии 68 7,35 14,71 77,94 14,71±3,04 85,29±3,04

Примечание: *«-» - нейтральные и чувствительные аллели

Максимальная частота аллеля ЕЯ наблюдалась в линии ФТГ (40,00±15,49%), однако значительная ошибка показателя не позволяет считать его достоверным. Таким образом, наибольшая частота встречаемости «желательных» аллелей наблюдалась в линии РС (15,70%), причем как в гомозиготном (4,65%), так и в гетерозиготном (22,09%) состояниях, минимальная - в линии СТР (3,85%). Проведенные расчеты показали достоверные различия в частотах встречаемости гомозиготных генотипов у коров линий СТР и РС ф<0,05). Значимых различий в частотах встречаемости «желательных» аллелей между линиями выявлено не было.

3.5.2. Связь линейной принадлежности коров со статусом по ВЛКРС Результаты инфицированности коров различных генеалогических линий ВЛКРС представлены в таблице 8.

Табл. 8. Распределение коров - носителей ВЛКРС в зависимости от

Генеалогическая линия Статус по ВЛКРС Всего животных

носители не носители

п % п %

ВБА 31 27,68 81 72,32 112

МЧ 16 21,05 60 78,94 76

РС 28 32,56 58 67,44 86

СТР 4 30,77 9 69,23 13

ФТГ 2 40,00 3 60,00 5

Другие линии 4 12,90 27 87,10 31

Итого 85 236 323

Как следует из данных таблицы 8, среди коров, принадлежащих к линии РС, было выявлено значительное количество носителей провируса лейкоза, хотя в этой же линии, как показано выше, наиболее велика доля желательных аллелей. Максимальная доля вирусоносителей обнаружена в линии ФТГ. Результаты оценки влияния фактора линейной принадлежности на распределение вирусоносителей показали отсутствие значимых различий в вероятности инфицированности ВЛКРС коров, принадлежащих различным генеалогическим линиям.

3.5.3. Распределение генотипов и аллелей ВоЬА-ОКВЗ у дочерей

различных быков-производителей Результаты анализа частот встречаемости генотипов и аллелей ВоЬА-ОЯВЗ в потомстве отдельных быков-производителей даны в таблице 9.

Табл. 9. Частоты встречаемости генотипов и аллелей ВоЬА-ОШЗЗ у коров черно-пестрой голштинизированной породы в зависимости от __ происхождения _

Линия Бык- производитель Частота аллелей, % Частота генотипов, %

ЕЙ -/-* ЕК/ ЕЯ Ш- -/-*

Вис Бэк Айдиал Бук 22,22±9.79 77,78±9.79 0,00 44,44 55,56

Вираж 7,14±4.87 92,8б±4.87 0,00 14,29 85,71

Самсунг 5,92±1.91 94,08±1.91 1,32 9,21 89,47

Фрейланд 10,00±9.49 90,00±9.49 0,00 20,00 80,00

Монтвик Чифтейн Абрикос 0,0 100,0 0,00 0,00 100,00

Анилин 6,25±6.05 93,75±6.05 0,00 12,50 87,50

Гвидон 10,71±2.92 89,29±2.92 3,57 14,29 82,14

Свет 20,00± 12.65 80,00±12.65 0,00 40,00 60,00

Рефлекшн Соверинг Вереск 21,43±10.97 78,57±10.97 0,00 42,86 57,14

Раундап 4,35±3.01 95,65±3.01 0,00 8,70 91,30

Тирбах 40,63±8.68 59,38±8.68 12,50 56,25 31,25

Эгли 1,56±1.55 98,44±1.55 0,00 3,13 96,88

Силинг Трай-джунРокит Эльвио 3,85±3.77 96,15±3.77 0,00 7,69 92,31

Файн Телекс Грейлинд Андрос 40,00±15.49 60,00±15.49 20,00 40,00 40,00

Другие быки 41,18±3.04 58,82±3.04 23,53 35,29 41,18

Другие линии 14,71±8.44 85,29±8.44 7,35 14,71 77,94

Примечание: *«-» - нейтральные и чувствительные аллели.

Наибольшая частота «желательных» аллелей (40,63%) обнаружена у дочерей Тирбаха, которые значимо (р<0,05) превосходили дочерей других быков за исключением Андроса. В целом, наибольшие частоты встречаемости «желательных» аллелей ВоЬА-БКВЗ выявлены у дочерей линий РС (Тирбах, Вереск) и ФТГ (Андрос). Исследование статуса дочерей отдельных быков-производителей по ВЛКРС не выявило достоверных различий, то есть дочери этих быков имеют примерно равную степень

вероятности заболеть лейкозом, если не принимать во внимание другие факторы (например, генотип), оказывающие значимое влияние.

3.6. Анализ взаимосвязей между исследованными факторами и

показателями молочной продуктивности коров Результаты анализа корреляционных связей между показателями продуктивности, генотипом и инфицированностью ВЛКРС на выборке коров черно-пестрой голштинизированной (п=267) и красной горбатовской пород (п=133) приведены в таблице 10.

Табл. 10. Коэффициенты корреляции между исследованными факторами

и показателями молочной продуктивности коров

Исследованные факторы Черно-пестрая голштинизированная

порода

§9 = о и ¡С «Г о о4 & »я 5 5 * § & о а н о л § и я о ¡^

и да >> * 2 я о к х сп

о- ^ Генотип по ВоЬА-ОКВЗ 1.00 -0.03 0.12*** 0.08** -0.12***

£ й « « о 3 Удой, кг -0.04 1.00 0.24*** 0.89*** 0.13*

2 » о Я 2 о Жир, % -0.02 -0.25** 1.00 0.64*** 0.17**

ей ев с а. ю Молочный жир, кг -0.04 0.98*** -0.07 1.00 0.18**

Носительство ВЛКРС -0.03 0.09 -0.06 0.09 1.00

Примечание: значения над диагональю: голштинизированная черно-пестрая порода; значения под диагональю: красная горбатовская порода; *р<0.05; **р<0,01; ***р<0,001

Как следует из данных таблицы 10, у коров черно-пестрой голштинизированной породы между наличием в генотипе «желательных» аллелей по ВоЬА-ВИВЗ отмечена слабая положительная корреляция с содержанием жира (+0,12, р<0,001), количеством молочного жира (+0,08 р<0,01) и слабая отрицательная корреляция — со статусом по ВЛКРС (-0,12, р<Р,001), в то время как у коров красной горбатовской породы достоверные корреляции между этими показателями не выявлялись.

Инфицированность коров черно-пестрой голштинизированной породы ВЛКРС характеризовалось положительной корреляцией с уровнем удоя (+0,13, р<Р,05), процентным содержанием и количеством молочного жира (+0,17 и +0,18, соответственно, р<Р,01). У коров красной горбатовской породы достоверные корреляции между этими показателями не выявлялись.

4. ВЫВОДЫ

1. Разработана система генотипирования аллелей ВоЬА-БКВЗ в режиме быстрого скрининга. Система основана на проведении аллелеспецифической ПЦР с целью идентификации образцов ДНК

животных-носителей «желательных» аллелей (*11, *23, *28 =*7А), ассоциированных с генетической устойчивостью к вирусу лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС), с последующим пиросеквенированием таких образцов с целью определения гомо- или гетерозиготности.

2. Проведенная апробация разработанной системы на 1216 головах крупного рогатого скота 10 пород (черно-пестрая голштинизированная (п=417), симментальская (п=94), айрширская (п=53), ярославская (п=203), красная горбатовская (п=167), бестужевская (п=28), костромская (п=121), бурая швицкая (п=21), сычевская (п=29), холмогорская (п=83)) и 19 головах зебувидного скота показала, что частоты встречаемости «желательных» аллелей ВоЬА-ВКВЗ варьировали от 5,09±1,20% в красной горбатовской породе до 27,13±3,24% в симментальской породе и в среднем составили 14,01±0,70%.

3. Установлено, что исследованные породы достоверно различаются по частотам встречаемости «желательных» генотипов ВоЛА-БРШЗ. Наибольшая частота встречаемости гомозиготных генотипов (12,77±3,05%°'°5) отмечалась в симментальской породе. В бурой швицкой и сычевской породах гомозиготные генотипы обнаружены не были. Гетерозиготные генотипы достоверно чаще встречались у зебувидного скота (36,84±11,07%°'°5) и реже - в бестужевской и красной горбатовской породах (7,14±4,87%0'05 и 2,99±1,32%0'05, соответственно).

4. Оценка генетического разнообразия по локусу ВоЬА-011ВЗ показала значительный недостаток гетерозигот в красной горбатовской породе (Р=0,69). Выявлено, что отклонение от равновесия Харди-Вайнберга по частотам наблюдаемых и ожидаемых аллелей в бурой швицкой, сычевской породах и у зебувидного скота носит случайный характер, в то время как в остальных породах эти различия обусловлены фактором породной принадлежности.

5. Исследование коров черно-пестрой голштинизированной и красной горбатовской пород показало отсутствие носителей ВЛКРС среди животных, гомозиготных по «желательным» аллелям ВоЬА-БИВЗ. Распределение носителей ВЛКРС среди животных, несущих «желательные» аллели по ВоЬА-ЕЖВЗ в гетерозиготном состоянии, и не имеющих «желательных» аллелей составило, соответственно, 21,67 и 23,84% в черно-пестрой породе и 40,00 и 14,74 - в красной горбатовской породе.

6. Выполнен анализ влияния генотипа по ВоЬА-ВЛВЗ, породной и линейной принадлежности, статуса по ВЛКРС на признаки молочной продуктивности.

а) Установлено достоверное превосходство коров черно-пестрой голштинизированной породы - носителей ВЛКРС над не носителями по уровню удоя (на 588 кг0,5), содержанию жира (на 0,14%0,05) и выходу белка (на 9,2 кг0,05), а также по выходу молочного жира (на 19,3 кг0,01).

б) Установлены достоверные различия по показателям молочной продуктивности коров - не носителей ВЛКРС с различными генотипами по

BoLA-DRB3. Коровы черно-пестрой голштинизированной породы, гомозиготные и гетерозиготные по «желательным» аллелям BoLA-DRB3, превосходили коров - не носителей по содержанию жира в молоке на 0,17%°'01 и 0,16%-05, соответственно. Коровы красной горбатовской породы, гетерозиготные по «желательным» аллелям, превосходили гомозиготных носителей «желательных» аллелей по уровню удоя (на 647 кг0,01) и выходу молочного жира (на 17,9 кг0,05), а также коров, не имевших в генотипе «желательных» аллелей - по удою (на 340 кг0,001). Среди носителей BJIKPC не найдено достоверной разницы между генотипами по BoLA-DRB3 и показателями молочной продуктивности.

7. Установлено достоверное влияние генеалогической линии коров черно-пестрой голштинизированной породы э/х «Кленово-Чегодаево» на некоторые показатели молочной продуктивности: линия Рефлекшн Соверинга превосходит линии Вис Бэк Айдиала (по удою на 353,7кг0,05, по содержанию жира в молоке на 0,13%0,05, по выходу молочного жира и белка на 22,4кг0,05 и 12,1кг0,05 соответственно) и Монтвик Чифтейна (по удою на 640,8кг0'001, по выходу молочного жира и белка на 32кг0'001 и 18,9кг0'001 соответственно).

8. Не выявлено достоверного влияния линейной принадлежности и происхождения (о-ща) коров на частоту встречаемости «желательных» аллелей BoLA-DRB3 и статус по ВЛКРС.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Лабораториям молекулярно-генетической экспертизы для генотипирования крупного рогатого скота рекомендуем использование разработанной нами тест-системы скрининга аллелей BoLA-DRB3, ассоциированных с генетической устойчивостью к вирусу лейкоза.

Сельскохозяйственным предприятиям при проведении подборов родительских пар с целью повышения в стаде частоты встречаемости «желательных» аллелей, ассоциированных с генетической устойчивостью к вирусу лейкоза, и поддержания уровня гетерозиготности рекомендуем производить учет генотипа по BoLA-DRB3.

Список опубликованных работ по теме диссертации

Статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

1. Гладырь, Е.А. Молекулярные методы в диагностике заболеваний и наследственных дефектов сельскохозяйственных животных / Гладырь Е.А., Зиновьева H.A., Эрнст Л.К., Костюнина О.В., Быкова A.C., Банникова А.Д., Кудина Е.П., Брем Г. // Зоотехния. - № 8. - 2009. - С.26-28.

2. Быкова, A.C. Экспресс-диагностика аллелей BOLA-DRB3, ассоциированных с устойчивостью крупного рогатого скота к лейкозу / Быкова A.C., Зиновьева H.A., Гладырь Е.А. // «Проблемы биологии продуктивных животных», Т. 1,2011, - с.12-15.

Патент.

3. Гладырь, Е.А., Способ диагностики устойчивости крупного рогатого скота к вирусу лейкоза / Гладырь Е.А., Зиновьева H.A., Быкова A.C., Эрнст Л.К. // Патент RU 2428485 С1 от 10.09.2011. Приоритет от 09.03.2010.

Статьи в других изданиях.

4. Гладырь, Е.А. Моделирование системы скрининга Bos Tauius по генетической устойчивости к ВЛКРС / Гладырь Е.А., Быкова A.C., Зиновьева H.A. // Сборник трудов 7-й Международной научной конференции-школы: «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных: роль нанотехнологий в реализации приоритетных задач биотехнологии», «БиоТехЖ-2008», 23-24 октября 2008.-С. 33-40.

5. Быкова, A.C. Разработка системы детекции аллельных вариантов гена BoLA DRB3.2, способствующих устойчивости к лейкозу крупного рогатого скота / Быкова A.C., Гладырь Е.А., Зиновьева H.A.// Материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные проблемы сельскохозяйственной науки и практики в современных условиях и пути их решения» посвященной памяти Р.Г. Гареева (25-27 февраля 2009 года) Казань, 2009. -С. 345-349.

6. Гладырь, Е.А. Моделирование системы скринига Bos taurus генетической устойчивости к лейкозу как элемента ДНК-технологии повышения устойчивости к заболеваниям крупного рогатого скота (Проект РФФИ №08-04-13736) / Гладырь Е.А., Зиновьева H.A., Быкова A.C., Эрнст Л.К. // Материалы конференции «Ориентированные фундаментальные исследования и их реализация в АПК России», 28-30 октября 2009 г., Сергиев Посад, - С.145-149.

7. Быкова, A.C. Создание системы скрининга аллелей гена BoLA-DRB3.2, обуславливающего потенциальную устойчивость крупного рогатого скота к вирусу лейкоза / Быкова A.C., Гладырь Е.А., Зиновьева H.A. // «ЕС -Россия: 7-я Рамочная программа в области биотехнологии, сельского, лесного, рыбного хозяйства и пищи», 29 сентября - 5 октября 2010 г, БашГАУ, Уфа, - С. 72-74.

Издательство ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии Тел. (8-4967)65-13-18 (8-4967) 65-15-97

Сдано в набор 23. И .2011. Подписано в печать 24.11.2011 _Заказ № 54. Печ. л. 1,0. Тираж 100 экз._

Отпечатано в типографии ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии 19

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Быкова, Александра Сергеевна

Краткий словарь.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Лейкоз крупного рогатого скота.

1.1.1. Основные симптомы. Развитие и течение заболевания.

1.1.2. Бессимптомное вирусоносительство.

1.2. Вирус лейкоза КРС.

1.2.1. Характеристика возбудителя лейкоза.

1.2.2. Передача вируса, пути заражения.

1.2.3. Опасность ВЛКРС для человека.

1.3. Методы определения лейкоза.

1.3.1. РИД. Достоинства и недостатки.

1.3.2. ИФА. Достоинства и недостатки.

1.3.3. ПНР. Достоинства и недостатки.

1.4. Главный комплекс гистосовместимости.

1.4.1. Структура ГКГ.

1.4.2. Ген Bola-DRB3. Его связь с лейкозом и другими заболеваниями.

1.5. Методы детекции аллелей Bola-DRB3.

1.5.1 .ПЦР-ПДРФ по van Eijk.Г.

1.5.2.Модификации метода ПЦР-ПДРФ.

1.5.3.Метод аллельспецифичной ПЦР для определения аллеля ER.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1 Материалы исследований.

2.2. Методы исследований.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Характеристика исследованной выборки животных.

3.2. Разработка системы скрининга аллелей гена BoLA-DRB3, способствующих устойчивости к лейкозу КРС.

3.2.1. Исследование фрагмента гена BoLA-DRB3.

3.2.2. Разработка системы генотипирования на основе пиросеквенирования и создание банка референтных образцов.

3.2.3. Разработка системы генотипирования в режиме скрининга на основе аллель-специфичной ПЦР.

3.3. Определение частот встречаемости «желательных» аллелей и генотипов BoLA-DRB3.

3.4. Анализ распределения носителей ВЛКРС в зависимоти от генотипа по ВоЬА-БКВЗ.

3.5. Анализ уровня молочной продуктивности коров в зависимости от статуса по ВЛКРС и генотипа по ВоЬА-БЬШЗ.

3.5.1. Влияние статуса по ВЛКРС на уровень. молочной продуктивности коров.

3.5.2. Влияние генотипа по гену ВоЬА-ОБШЗ на уровень молочной продуктивности коров.

3.5.3. Комплексное влияние генотипа по гену ВоЬА-БКВЗ и статуса по ВЛКРС на уровень молочной продуктивности коров.

3.6. Оценка влияния линейной принадлежности коров на распределение аллелей ВоЬА-БКВЗ и статус по ВЛКРС.

3.6.1. Анализ молочной продуктивности коров различных генеалогических линий и происхождения.

3.6.2. Полиморфизм гена ВоЬА-1ЖВЗ у коров черно-пестрой породы различных генеалогических линий.

3.6.3. Связь линейной принадлежности коров со статусом по ВЛКРС.

3.6.4. Распределение генотипов и аллелей ВоЬА-БКВЗ у дочерей различных быков-производителей.

3.6.5. Оценка влияния фактора быка на количество носителей ВЛКРС среди дочерей.

3.7. Анализ взаимосвязей между исследованными факторами и показателями молочной продуктивности коров.

3.6.1. Анализ взаимосвязей исследованных факторов во всей выборке.

3.7.2. Анализ связей исследованных факторов у коров черно-пестрой и красной горбатовской породы.

ВЫВОДЫ.

ПРАКТИЧЕСЬСИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Скрининг аллелей BoLA-DRB3 в популяциях крупного рогатого скота различных пород"

Скотоводство является отраслью животноводства, которая в наибольшей степени обеспечивает потребность населения в белках животного происхождения. Причем удовлетворение этой потребности происходит в основном за счет продукции молочного скотоводства (www.fao.org). На протяжении долгого времени селекция животных велась на повышение удоя и качества молока (Сударев Н. и др, 2009, Красота В.Ф. и др., 2005; Никифорова Л.Н., 2009). Однако это привело к тому, что более продуктивные животные стали обладать меньшей (по сравнению с менее продуктивными особями) устойчивостью к различного рода инфекциям и инвазиям, чаще страдать незаразными заболеваниями. Все это негативно сказывается на процессе производства, существенно увеличивая стоимость выходной продукции (Тараторкин В.М., Петров Е.Б., 2009).

Развитие биотехнологии и совершенствование методов анализа генома животных привело к тому, что все больше в практику животноводства в дополнение к, классической селекции внедряется так называемая маркерная селекция, позволяющая получить информацию о генотипе животного в значительно более короткие сроки, что существенно повышает эффективность селекции. Маркерная селекция основана на анализе генетических маркеров - участков ДНК, связанных с проявлением определенных признаков, т.е. стало возможно работать непосредственно с генетическим материалом клетки (Сулимова Г.Е., 2004, Калашникова Л.А., 2000, Букаров Н.Г., 2004).).

Одним из приемов селекции животных, нацеленной на получение особей, обладающих повышенной резистентностью к заболеваниям, является использование ДНК-маркеров, обуславливающих устойчивость или наоборот чувствительность к заболеваниям. Использование такой стратегии является особо актуальным для инфекционных заболеваний, борьба с которыми только с использованием ветеринарных мероприятий не всегда эффективна. Одним из таких широко распространенных на территории России заболеваний является лейкоз крупного рогатого скота. По данным статистики Россельхознадзора за 2010 год было выявлено около 10% животных, у которых наблюдались уже неопластические изменения и изменение лейкоформулы. При этом выбраковано было около 5% таких животных. То есть фактически в хозяйствах остаются не только вирусоносители, но и животные с сублиническими и клиническими признаками заболевания. Поэтому до сих пор ветеринарное состояние по лейкозу КРС на территории РФ является неблагополучным (www.fsvps.ru).

Ранее во многих странах наиболее эффективным способом борьбы с лейкозом считался забой серопозитивных животных. Так, в Европе лейкоз был практически вытеснен после нескольких лет систематического забоя зараженных стад. Однако такие дорогостоящие программы искоренения возможны только в регионах, где распространенность вируса относительно низкая (Schwartz I, Levy D., 1994; N. Gillet et al, 2007). Этот метод не применим в условиях России, поскольку болезнь зарегистрирована практически во всех субъектах РФ (Н. И. Петров, 2001).

На сегодняшний день стратегия борьбы с данным заболеванием предусматривает как можно более раннее выявление носителей вируса (посредством РИД, ИФА или ПЦР) и их изоляцию от здоровых животных (Гринишин Д., 2005). Однако методы диагностики ВЛЕСРС позволяют лишь констатировать наличие или отсутствие в организме животного BJIKPC и не позволяют прогнозировать, перейдет ли заболевание у животного-носителя вируса в клиническую форму.

В качестве потенциальных маркеров устойчивости к лейкозу рассматриваются гены главного комплекса гистосовместимости локуса BoLA, в частности, ген DRB3 (Эрнст Л.К., Сулимова Г.Е., и др. 1998). Было 5 показано, что некоторые аллели данного гена (ОКВ3.2*11, *23, *28) обуславливают устойчивость животных к ВЛКРС, в то время как другие аллели (011133.2* 16, *22, *24), наоборот, связаны с повышенной чувствительностью к лейкозу (Эрнст Л.К., Сулимова Г.Е., и др. 1997). Вместе с тем, внедрение данного маркера в практику сдерживается, с одной стороны, отсутствием системы быстрого скрининга животных на наличие потенциально устойчивых аллелей, с другой стороны, отсутствием информации о наличии и характере связи «желательных» аллелей с признаками молочной продуктивности коров.

Цели и задачи исследования.

Целью работы являлся скрининг гена ВоЬАЛЖВЗ на наличие аллелей, ассоциированных с устойчивостью к лейкозу, у крупного рогатого скота различных пород.

Для достижения цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Провести секвенирование и создать банк ДНК референтных образцов с различными генотипами по ВоЪА-БКВЗ.

2. Разработать систему выявления «желательных» аллелей *11, *23, *28=*7А ВоЬА-БКВЗ, ассоциированных с устойчивостью к лейкозу, пригодную для массового скрининга скота;

3. Изучить частоты встречаемости «желательных» генотипов и аллелей ВоЬА-БКВЗ у различных пород крупного рогатого скота.

4. Изучить степень инфицированности коров вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) в зависимости от наличия в их генотипе «желательных» аллелей ВоЬА-БКВЗ.

5. Изучить влияние генотипа по ВоЬА4ЖВЗ и статуса по ВЛКРС на показатели молочной продуктивности коров.

Новизна работы.

Впервые разработана тест-система, позволяющая в режиме массового скрининга выявлять животных-носителей «желательных» аллелей ВоЬА-БИВЗ (*11, *23, *28=*7А), ассоциированных с устойчивостью к лейкозу. Изучено распределение «желательных» аллелей ВоЬА-ОІШЗ в основных породах крупного рогатого скота, разводимых в России, а также у гибридов крупного рогатого скота и зебу. Проведен анализ влияния наличия в генотипе «желательных» аллелей ВоЬА-ОЛВЗ на статус по ВЛКРС и уровень молочной продуктивности коров. Получен патент на изобретение «Способ диагностики устойчивости крупного рогатого скота к вирусу лейкоза», ІШ 2428485 С1 от 10.09.2011. Приоритет от 09.03.2010 г.

Практическая значимость.

С использованием разработанной тест-системы проведен массовый скрининг 1216 голов крупного рогатого скота 10 пород, разводимых на территории Российской Федерации, на наличие «желательных» аллелей ВоЬА-ОІШЗ (*11, *23, *28=*7А), ассоциированных с устойчивостью к лейкозу. Установлено, что гомозиготные носители «желательных» аллелей ВоЬА-ОИВЗ являются свободными от ВЛКРС. Показано достоверное превосходство коров голштинизированной черно-пестрой породы -носителей ВЛКРС над не носителями по уровню удоя, содержанию и выходу бежа, а также по выходу молочного жира. Выявлено достоверное превосходство коров - не носителей ВЛКРС, имеющих гетерозиготный генотип по ВоЬА-ОЇШЗ, по содержанию жира в молоке у коров голштинизированной черно-пестрой породы, а так же по уровню удоя и выходу молочного жира у коров красной горбатовской породы.

Апробация работы.

Результаты исследований были доложены и обсуждены:

• на 7-й международной научной конференции «Современные достижения и проблемы генетики и биотехнологии сельскохозяйственных животных», БиоТехЖ-2008, 2008 г., п. Дубровицы;

• на Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные проблемы сельскохозяйственной науки и практики в современных условиях и пути их решения» посвященной памяти Р.Г. Гареева, 25-27 февраля 2009 г., Казань;

• на V Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 16-20 марта 2009 г., Москва;

• на конференции «Достижения в генетике, селекции и воспроизводстве сельскохозяйственных животных», посвященной 100-летию со дня рождения основателя института, заслуженного деятеля науки профессора М.М. Лебедева, 3-5 июня 2009 г., Санкт-Петербург-Пушкин;

• на конференции «Ориентированные фундаментальные исследования и их реализация в АПК России», 28-30 октября 2009 г., Сергиев Посад;

• конференции Центра биотехнологии и молекулярной диагностики ГНУ ВИЖ 16 ноября 2011 года.

Основные положения, выносимые на защиту:

• Система определения в режиме скрининга «желательных» аллелей ВоЬА-БКВЗ (*11, *23, *28=*7А), ассоциированных с устойчивостью к лейкозу.

• Распределение «желательных» аллелей и генотипов у крупного рогатого скота 10 пород и зебувидного скота.

• Отсутствие носителей провирусной формы ВЛКРС среди животных, гомозиготных по «желательным» аллелем ВоЬА-БКВЗ.

• Связи генотипов ВоЬА-БКВЗ с показателями молочной продуктивности коров.

Публикации результатов исследований.

Всего по теме диссертационной работы опубликовано 6 работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ («Зоотехния», «Проблемы биологии продуктивных животных»). Получен патент на изобретение.

Структура и объем работы.

Диссертация написана на 110 страницах, состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты и обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы. Диссертационная работа содержит 34 таблицы и 10 рисунков. Список литературы включает 148 источников, в том числе 82 источника на иностранном языке.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Быкова, Александра Сергеевна

выводы

1. Разработана система генотипирования аллелей ВоЬА-БИВЗ в режиме быстрого скрининга. Система основана на проведении аллелеспецифической ПЦР с целью идентификации образцов ДНК животных-носителей «желательных» аллелей (*11, *23, *28 =*7А), ассоциированных с генетической устойчивостью к вирусу лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС), с последующим пиросеквенированием таких образцов с целью определения гомо- или гетерозиготносте.

2. Проведенная апробация разработанной системы на 1216 головах крупного рогатого скота 10 пород (черно-пестрая голштинизированная (п=417), симментальская (п=94), айрширская (п=53), ярославская (п=203), красная горбатовская (п=167), бестужевская (п=28), костромская (п=121), бурая швицкая (п=21), сычевская (п=29), холмогорская (п=83)) и 19 головах зебувидного скота показала, что частоты встречаемости «желательных» аллелей ВоЬА-ОКВЗ варьировали от 5,09±1,20% в красной горбатовской породе до 27,13±3,24% в симментальской породе и в среднем составили 14,01±0,70%.

3. Установлено, что исследованные породы достоверно различаются по частотам встречаемости «желательных» генотипов ВоЬА-БКВЗ. Наибольшая частота встречаемости гомозиготных генотипов (12,77±3,05%°'°5) отмечалась в симментальской породе. В бурой швицкой и сычевской породах гомозиготные генотипы обнаружены не были. Гетерозиготные генотипы достоверно чаще встречались у зебувидного скота (36,84±11,07%0,05) и реже - в бестужевской и красной горбатовской породах (7,14±4,87%0'05 и 2,99±1,32%0'05, соответственно).

4. Оценка генетического разнообразия по локусу ВоЬА-ОКВЗ показала значительный недостаток гетерозигот в красной горбатовской породе (Т=0,69). Выявлено, что отклонение от равновесия Харди-Вайнберга по частотам наблюдаемых и ожидаемых аллелей в бурой швицкой, сычевской породах и у зебувидного скота носит случайный характер, в то время как в остальных породах эти различия обусловлены фактором породной принадлежности.

5. Исследование коров черно-пестрой голштинизированной и красной горбатовской пород показало отсутствие носителей ВЛКРС среди животных, гомозиготных по «желательным» аллелям ВоЬА-ОКВЗ. Распределение носителей ВЛКРС среди животных, несущих «желательные» аллели по ВоЪА-БКВЗ в гетерозиготном состоянии, и не имеющих «желательных» аллелей составило, соответственно, 21,67 и 23,84% в черно-пестрой породе и 40,00 и 14,74 - в красной горбатовской породе.

6. Выполнен анализ влияния генотипа по ВоЬА-ОКВЗ, породной и линейной принадлежности, статуса по ВЛКРС на признаки молочной продуктивности. а) Установлено достоверное превосходство коров черно-пестрой голштинизированной породы - носителей ВЛКРС над не носителями по уровню удоя (на 588 кг0'05), содержанию жира (на 0,14%0'05) и выходу белка (на 9,2 кг0'05), а также по выходу молочного жира (на 19,3 кг0'01). б) Установлены достоверные различия по показателям молочной продуктивности коров - не носителей ВЛКРС с различными генотипами по ВоЪА-БКВЗ. Коровы черно-пестрой голштинизированной породы, гомозиготные и гетерозиготные по «желательным» аллелям ВоЬА-ЕЖВЗ, превосходили коров - не носителей по содержанию жира в молоке на ОД7%0'01 и 0,16%0'05, соответственно. Коровы красной горбатовской породы, гетерозиготные по «желательным» аллелям, превосходили гомозиготных носителей «желательных» аллелей по уровню удоя (на 647 кг0'01) и выходу молочного жира (на 17,9 кг0'05), а также коров, не имевших в генотипе «желательных» аллелей — по удою (на 340 кг0'001). Среди носителей ВЛКРС не найдено достоверной разницы между генотипами по ВоЬА-ОКВЗ и показателями молочной продуктивности.

7. Установлено достоверное влияние генеалогической линии коров черно-пестрой голштинизированной породы э/х «Кленово-Чегодаево» на некоторые показатели молочной продуктивности: линия Рефлекшн Соверинга превосходит линии Вис Бэк Айдиала (по удою на 353,7кг0'05, по содержанию жира в молоке на 0,13%°'05, по выходу молочного жира и белка на 22,4кг0'05 и 12,1кг0'05 соответственно) и Монтвик Чифтейна (по удою на 640,8кг0'001, по выходу молочного жира и белка на 32кг0'001 и 18,9кг0'001 соответственно).

8. Не выявлено достоверного влияния линейной принадлежности и происхождения (отца) коров на частоту встречаемости «желательных» аллелей ВоЬА-ОЕВЗ и статус по ВЛКРС.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Лабораториям молекулярно-генетической экспертизы для генотипироваиия крупного рогатого скота рекомендуем использование разработанной нами тест-системы скрининга аллелей ВоЬА-ОКВЗ, ассоциированных с генетической устойчивостью к вирусу лейкоза.

Сельскохозяйственным предприятиям при проведении подборов родительских пар с целью повышения в стаде частоты встречаемости «желательных» аллелей, ассоциированных с генетической устойчивостью к вирусу лейкоза, и поддержания уровня гетерозиготности рекомендуем производить учет генотипа по ВоЬА-БКВЗ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Быкова, Александра Сергеевна, Дубровицы

1. Апалькин, В.А. Лейкоз крупного рогатого скота / Апалысин В.А., Гулюкин М.И., Петров Н.И. //Библиотечка «Практик». Петролазер. — СПб, 2005. 106 с.

2. Архипов Н.И., Бакулов И.А., Соковых Л.И. Медленные инфекции животных. -М.: Агропромиздат, 1987.

3. Берзяк, А.Г. Опыт ускоренного оздоровления племенного хозяйства от лейкоза / Берзяк А.Г., Ковалючко B.C., Гротевич B.C., Киричук Л.И.//Ветеринария-№12. 1990. С. 13-15.

4. Будулов Н.Р. Респираторные болезни крупного рогатого скота в Дагестане : автореф. дис. . докт. вет. наук : 16.00.03. М, 2009.

5. Валихов, А.Ф., Шишков, В.П. Иммунология лейкозов / В.П. Шишков, Валихов А.Ф. // Лейкозы и злокачественные опухоли животных. М., 1988. С. 78-95.

6. Гладырь Е.А., Зиновьева H.A., Ермилов A.A., Виноградов В.Н., Эрнст Л.К. Создание и экспериментальная апробация высокочувствительной тест-системы диагностики вируса лейкоза крупного рогатого скота// Вет.патология-№3.2006. С. 87-89.

7. Гриншпин, Д. Оздоровление стад от лейкоза крупного рогатого скота // Главный зоотехник. 2005. - № 4. - С. 66 - 68

8. Гулюкин, М.И. Лейкоз крупного рогатого скота одна из важнейших проблем ветеринарии / М.И. Гулюкин, Н.В. Замараева, Г.Ф. Коромыслов // Ветеринарная газета № 5. 2001. - С. 1-2.

9. Деринов, А.Н. Псевдоаллергические реакции на туберкулин при лейкозе КРС / Деринов А.Н., Овдиенко Н.П., Найманов А.Х.// Ветеринария -№11.2006.-С.20-23

10. Джунина, С. И. Контроль эпизоотического процесса. Джунина С. И.: Новосибирск. 1994. 162 с.

11. Дробот, Е.В. Результаты изучения генотипического разнообразия вируса лейкоза крупного рогатого скота и особенности эпизоотологического и гематологического проявления: автореф. дис. канд. биол. наук. Новосибирск, 2007.-18 с.

12. Дубинина И. П. Использование метода ПЦР в клинико-диагностических лабораториях. //Лаборатория №4.1996 - с. 4-6.

13. Пономарёв А. Б. Совершенствование лабораторно-диагностической работы в России.//Ветеринария №-3.1998. - с. 3-5.

14. Ефимов А. М. Применение молекулярных методов в зооиндустрии: ПЦР-технология // Зооиндустрия — №11. 2004

15. Животовский Л.А. Популяционная биометрия / Л.А. Животовский. -М.: Наука, 1991.-271 с.

16. Иванова, Л. А. Опыт применения иммуноферментного анализа для выявления антител к вирусу лейкоза на заключительном этапе оздоровления / Иванова Л. А.//Бюл. ВИЭВ. -1999. т. 72. С. 202-209

17. Калашникова JLA., Дунин И.М., Глазко В.И. Селекция XXI века: использование ДНК-технологий // Московская обл., Лесные поляны, ВНИИплем. 2000. С. 31.

18. Катмаков П.С., Кузьмина Н.М. Результаты возвратного скрещивания голштинских помесей с быками бестужевской и черно-пестрой пород. // Зоотехния № 11. 2007. С. 2-3

19. Климов, Н.М. Метаболизм триптофана в организме крупного рогатого скота при лейкозе / Н.М. Климов, Г.Л. Коромыслова // Бюл. ВИЭВ. 1974. -Вып. 17.-С. 50-51.

20. Ковалкж, Н. В. Молекулярно-генетические аспекты в селекции и ранней диагностике лейкоза крупного скота: диссертация . доктора биологических наук: 03.00.23. Дубровицы, 2008.- 149 с.

21. Ковалкж Н.В., Ковалкж A.A., Сивогривов Д.Е. Патент РФ на изобретение RU 2287587 С2 от 20.11.06.

22. Ковалкж Н.В., Сацук В.Ф., Методические рекомендации по использованию маркера BoLA-DRB3 в селекционно-племенной работе с крупным рогатым скотом. Краснодар: 2010. 25 с.

23. Костенко, Т.С. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии. Костенко Т.С. и др.: М.: Агропромиздат, 1989. 272 с.

24. Крамаренко С.С., Дисперсионный анализ качественных признаков (ANOQVA) в популяционно-фенетических исследованиях. Вып.1. 2004. http://www.ievbras.ru/ecostat/Kiril/Articlelist.htm.

25. Крамаренко С.С., Аналіз структури популяцій. Миколаів: МДАУ: 2008.-240с.

26. Красота, В.Ф. Разведение сельскохозяйственных животных Текст. / В.Ф. Красота, Т.Г. Джапаридзе, Н.М. Костомахин. 5-е изд., перераб. и доп. -M.: Колосс, 2005.-424 е.,

27. Крикун, В.А. Лейкоз крупного рогатого скота и иммунологическая толлерантность / В.А. Крикун // Ветеринария. № 6. 2002 С. 7-9.

28. Кудрявцева, Т.П. Лейкоз животных / Т. П. Кудрявцева. М.: Россель-хозиздат, 1980. 158 с.

29. Кузнецова А.П., Смирнов В.П., Проблемы лейкоза сельскохозяйственных животных. Ветеринария. №3 — 1998 -С.32-33.

30. Лакин Г.Ф. Биометрия. М. Высшая школа. - 1990. - 352 с.

31. Лиманская О.Ю. Разработка молекулярно-генетических тест-систем для ранней детекции вируса лейкоза крупного рогатого скота и определения пола преимплантационных эмбрионов: диссертация. кандидата биологических наук :03.00.20. Киев. 2001

32. Магер С.Н. Биологическая характеристика потомства здоровых и больных лейкозом коров, и ассоциативное развитие лейкоза и туберкулеза у животных: автореферат дисс.доктора биол. наук. Новосибирск, 2006.

33. Мадисон, В. Лейкоз: пустые страшилки или общегосударственная проблема?/ Мадисон В., Мадисон Л.// Животноводство России. №9. 2006 С -28

34. Макаров, В.В. Избранные вопросы общей эпизоотологии и инфектоло-гии. Макаров В.В.: М., 1999. 224 с.

35. Мальцева H.A., Баранов В.И., Олийник Е.И. Лейкоз крупногорогатого скота пути решения проблемы // Электронный журнал92

36. Исследовано в России", 1-4, 1376-1380, 2000. http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2000/102.pdf

37. Методические указания по диагностике лейкоза крупного рогатого скота (утв. Минсельхозом РФ 23.08.2000 п 13-7-2/2130)

38. Петров Н. И., Лейкоз КРС. Насколько он опасен? // Зооиндустрия. №3. 2001. С.15-17

39. Петров Н.И., ВЛКРС главный этиологический фактор лейкоза крупного рогатого скота // Зооиндустрия, № 8. 2001.

40. Нефедова Л.Н., Ким A.M., Журнал общей биологии, том 68, №6, 2007. С.459-467;

41. Никифорова Л. Н. Сохранение генетического разнообразия и повышение эффективности селекции молочного скота с использованием быков голпггинской породы, автореферат диссертации. доктора с-х наук, Брянск. 2009.

42. Новое в клонировании ДНК / Под ред. Д.Гловера//М: Мир.- 1989.367 С.

43. Орлянкин, Б.Г. Классификация и номенклатура РНК содержащих вирусов позвоночных / Орлянкин Б.Г. // Сельскохозяйственная биология. -1996.-№2.-С. 3-24

44. Плохинский H.A. Алгоритмы биометрии /под ред. акад. АН УССР Б. В. Гнеденко. М.: Изд-во Моск. гос. ун-та, 1980. - 150 с.

45. Раушенбах М.О. Роль эндогенных факторов в развитии лейкозов/ М.О. Раушенбах. -М.: Медицина, 1974. 123 с.

46. Сацук В. Ф. Использование маркера ВОЬА-БКВЗ в селекционно-племенной работе с крупным рогатым скотом : дис. . канд.биол.наук : 06.02.01 : Ставрополь. 2009 118 с.

47. Сенченко Б.С. Руководство по ветеринарно-санитарной экспертизе продуктов животного и растительного происхождения,- Сенченко Б.С., Тро-шин А.Н., Кавунник Я.М.: 1998,-г. Краснодар. Советская Кубань - 672 с.

48. Сивков Г.С., Глазунов Ю.В., Подшивалов Д.А., Степанов А.Г., Донник И.М., Татарчук А.Т Изучение роли иксодовых клещей в передаче вируса лейкоза крупного рогатого скота.//Ветеринария. №12. 2009. С. 14-17

49. Сулимова Г.Е. ДНК-маркеры в генетических исследованиях: типы маркеров, их свойства и области применения. // Успехи соврем, биологии — Т 124. №3. 2004.-е. 260

50. Сюрин, В.Н. Ветеринарная вирусология / Сюрин В. Н. , Белоусова Р.В., Фомина Н. В.: М.: Агропромиздат 1991. 431с.

51. Тараторкин В.М., Петров Е.Б. Ресурсосберегающие технологии в молочном животноводстве и кормопроизводстве.- М.: Колос, 2009.- 376 с.

52. Туркова С. О. Полиморфизм генов Во1а-ЕЖВЗ, пролактина и гормона роста у крупного рогатого скота в связи с устойчивостью к лейкозу и молочной продуктивностью : Дис. . канд. биол. наук : 03.00.15 : Москва, 2003 105 с. РГБ ОД, 61:04-3/307-7,

53. Фадеева Н. Б. «Современная энциклопедия фельдшера». Изд. «Современный литератор», Минск, 2000 г.

54. Федотов, В.П. Лейкоз крупного рогатого скота в Ивановской области / Федотов В.П., Иванов О.В., Иванова О.Ю.// Ветеринария. № 5. 2007 С.23-25

55. Хусаинов Р. Ф. Колостральный иммунитет и внутриутробное инфицирование телят вирусом лейкоза от коров-матерей с различной степенью выраженности инфекционного процесса, автореф. кандидата биол. наук, Уфа. 2009

56. Шкроб М.А., Когда б вы знали, из какого сора. «Химия и жизнь» №10, 2009

57. Эрнст Л.К., Дмитриев Н.Г., Паронян И.А., Генетические ресурсы сельскохозяйственных животных в России и сопредельных странах, составители ВНИИГРЖ, СПб, 1994

58. Эрнст Л.Н. Особенности распространения антигенов BoLA-DRB3 у черно-пестрого скота в связи с ассоциацией с лейкозом / Эрнст Л.Н., Сулимова Г.Е., Орлова А.Р., Удина И.Г., Павленко С.П. // Генетика. 1997. Т.ЗЗ. №1. С.87-95.

59. Ammer Н, Schwaiger FW, Kammerbauer С, Gomolka М, Arriens А, Lazary S, Epplen JT. Exonic polymorphism vs intronic simple repeat hypervariability in MHC-DRB genes. Immunogenetics. 1992;35(5):332-40.

60. Andersson L., Lunden A., Sigurdardottir S., Davies CJ., Rask L., 1988 Linkage relationships in the bovine MHC region. High recombination frequency between class II subregions. Immunogenetics 27, 273-280.

61. Andersson L., Rask L., 1988 Characterisation of the MHC class II region in cattle. The number of DQ genes varies between haplotypes. Immunogenetics 27,110-120.

62. Apanius V., Penn D., Slev P. R., Ruff L.R., Potts W. K., 1997 The nature of selection on the major histocompatibility complex. Critical Review in Immunology 17, 179-224.

63. Band M.R., Larson J.H., Rebeiz M., Green C.A., Heyen D.W., Donovan J., Windish R., Steining C., Mahyuddin P., Womack J.E., Lewin H. A., 2000 An ordered comparative map of the cattle and human genomes. Genome Research 10, 1359-1368.

64. Band M.R., Larson J.H., Womack J.E., Lewin H.A., 1998 A radiation hybrid map of BTA23: identification of a chromosomal rearrangement leading to separation of the cattle MHC class II subregions. Genomics 53, 269-275.

65. Batra TR, Lee AJ, Gavora JS, Stear MJ. Class I alleles of the bovine major histocompatibility system and their association with economic traits. J Dairy Sei. 1989 Aug;72(8):2115-24.

66. Baxter R, Hastings N, Law A, Glass EJ A rapid and robust sequence-based genotyping method for BoLA-DRB3 alleles in large numbers of heterozygous cattle. Anim Genet. 2008 Oct;39(5):561-3. Epub 2008 Jul 15.

67. Burny A, Bruck C, Cleuter Y, Couez D, Deschamps J, Gregoire D, Ghysdael J, Kettmann R, Mammerickx M, Marbaix G, et al. Bovine leukaemiavirus and enzootic bovine leukosis. Onderstepoort J Vet Res. 1985 Sep;52(3):133-44.

68. Carli KT, Batmaz H, Sen A, Minbay A. Comparison of serum, milk and urine as samples in an enzyme immunoassay for bovine leukaemia virus infection. Res Vet Sei. 1993 Nov;55(3):394-5.

69. Carli KT, Sen A, Batmaz H, Kennerman E. Detection of IgG antibody to bovine leukaemia virus in urine and serum by two enzyme immunoassays. Lett Appl Microbiol. 1999 Jun;28(6):416-8.

70. Crystal R.G. Transfer of Genes to Humans: Early Lessons and Obstacles to Success Science, 270, 404 410,1995

71. Dietz AB, Detilleux JC, Freeman AE, Kelley DH, Stabel JR, Kehrli ME Jr.; Genetic association of bovine lymphocyte antigen DRB3 alleles with immunological traits of Holstein cattle. J Dairy Sei. 1997 Feb;80(2):400-5.

72. Dietz AB, Detilleux JC, Freeman AE, Kelley DH, Stabel JR, Kehrli ME Jr. Genetic association of bovine lymphocyte antigen DRB3 alleles with immunological traits of Holstein cattle J Dairy Sei. 1997 Feb;80(2):400-5.

73. Dutcher RM, Larkin EP, Tumilowicz JJ, Nazerian K, Eusebio CP, Stock ND, Guest GB, Marshak RR. Evidence in support of a virus etiology for bovine leukemia. Cancer. 1967May;20(5):851-6.

74. Ellis SA, Codner G. The impact of MHC diversity on cattle T cell responses. Vet Immunol Immunopathol. 2011 Mar 12.

75. Fauquet, С. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U. & Ball, L. A. 2005. Virus Taxonomy, VHIth Report of the ICTV. London: Elsevier/Academic Press.

76. Hassan Momtaz African Journal of Microbiology Research Vol. 4 (3), pp. 218-221, 4 February, 2010

77. Hediger R, Ansari HA, Stranzinger GF. Chromosome banding and gene localizations support extensive conservation- of chromosome structure between cattle and sheep. Cytogenet Cell Genet. 1991;57(2-3): 127-34.

78. Hedrick P.W., Kim T.J., 2000 Genetics of complex polymorphisms: parasites and maintenance of MHC variation. In: Evolutionary Genetics: From Molecules to Morphology (R. Singh and C. Krimbas, Eds.). Harvard University Press, Cambridge, 204- 234.

79. Hill A.V., 1998 The immunogenetics of human infectious diseases. Annual Review of Immunology 16, 593-617.

80. Hill A.V., 2001 The genomics and genetics of human infectious disease susceptibility. Annual Review of Genomics and Human Genetics 2, 373400.

81. Ikawa Y, Obata M, Sagata N, Amanuma H. Modified env gene in Friend spleen focus forming virus—structure, origin, and its role in leukemogenesis. Gan To Kagaku Ryoho. 1985 Mar;12(3 Pt 2):622-32.

82. IP Touw, SJ Erkeland Retroviral insertion mutagenesis in mice as a comparative oncogenomics tool to Identify Disease Genes in Human Leukemia, Molecular Therapy (2007) 15, 13-19;

83. J Gen Virol. 2009 Nov;90(Pt 11):2788-97. Epub 2009 Jul 8.

84. John H. Kirk, Bovine Leukemia, UC Davis Veterinary Medicine Extension, 2000

85. Kappes D., Strominger J.L., 1988 Human class II major histocompatibility complex genes and proteins. Annual Review of Biochemistry 57, 991-1028.

86. Karima Galal Abdel Hameed, Grazyna Senderl, Michael Mayntz. Major histocompatibility complex polymorphism and mastitis resistance a review. Animal Science Papers and Reports vol. 24 (2006) no. 1, 11-25

87. Klein J, O'huigin C., 1995 Class IIB MHC motifs in an evolutionary perspective. In: Origin of major histocompatibility complex diversity. Immunological Review 143, 89-112.,

88. Klein J., 1986 Natural History of the Major Histocompatibility Complex. John Wiley and Sons, New York.

89. Krauss J.C. Hematopoietic stem cell gene replacement therapy Biochim. Biophys.Chem.Acta, 1114, 193 -207, 1992;

90. Lewin H.A., Russel G.C., Glass E.J. Comparative organization and function of the major histicompatibility complex of domesticated cattle // Immunol. Rev. 1999. V. 167. P. 145-158.

91. Lewin HA. Disease resistance and immune response genes in cattle: strategies for their detection and evidence of their existence, j Dairy sci. 1989 May;72(5): 1334-48.

92. Meas S, Seto J, Sugimoto C, Bakhsh M, Riaz M, Sato T, Naeem K, Ohashi K, Onuma M: Infection of bovine immunodeficiency virus and bovine leukemia virus in water buffalo and cattle populations in Pakistan. J Vet Med Sci2000, 62:329-331;

93. Meas S, Usui T, Ohashi K, Sugimoto C, Onuma M. Vertical transmission of bovine leukemia virus and bovine immunodeficiency virus in dairy cattle herds. Vet Microbiol. 2002 Jan 23;84(3):275-82.

94. Mikko S., Andersson L., 1995 Extensive MHC class II DRB3 diversity in African and European cattle Immunogenetics 42, 408-413.

95. Mikko S., Spencer M., Morris B., Stabile S., Basu T., Stormont C., Andrsson L., 1997 A comparative analysis of MHC DRB3 polymorphism in the American Bison (Bison bison) Journal of Heredity 88, 499-503.

96. Miltiadou D, Law AS, Russell GC. Establishment of a sequence-based typing system for BoLA-DRB3 exon 2. Tissue Antigens. 2003 Jul;62(l):55-65.

97. Mirsky, M. L., Olmstead, C. A., Da, Y. & Lewin, H. A. (1996). The prevalence of proviral bovine leukemia virus in peripheral blood mononuclear cells at two subclinical stages of infection. J Virol 70, 2178-2183.

98. Molteni, E., Agresti, A., Meneveri, R., Marozzi, A., Malcovati, M., Bonizzi, L., Poli, G. & Ginelli, E. (1996). Molecular characterization of a variant of proviral bovine leukaemia virus (BLV). Zentralbl Veterinarmed B 43, 201-211

99. Nei M5 Chesser RK.; Estimation of fixation indices and gene diversities.; Ann Hum Genet. 1983 Jul;47(Pt 3):253-9.

100. Nei M. Analysis of gene diversity in subdivided populations // PNAS USA. 1973. -V. 70. - P. 3321-3323;

101. Nei M. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number individuals // Genetics. 1978. - V. 89. - P. 583-590

102. O'huigin C., 1995 Quantifying the degree of convergence in primate MHC-DRB genes. Immunological Review 143, 123-140

103. Olson C, Miller JM, Miller LD, Gillette KG, Demonstration of C-type virus and nuclear projections in lymphocyte cultures of bovine leukemia, Dtsch Tierarztl Wochenschr. 1970 Jul l;77(13):297-9.

104. Peakall, R., Smouse, P.E., 2006. GENALEX 6: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research. Molecular Ecology Notes 6, 288-295.

105. Powers MA, Radke K. Activation of bovine leukemia virus transcription in lymphocytes from infected sheep: rapid transition through early to late gene expression. J Virol. 1992 Aug;66(8):4769-77.

106. Rodriguez SM, Golemba MD, Campos RH, Trono K, Jones LR. Bovine leukemia virus can be classified into seven genotypes: evidence for the existence of two novel clades. J Gen Virol. 2009 Nov;90(Pt ll):2788-97. Epub 2009 Jul 8.

107. Rodriguez SM, Golemba MD, Campos RH, Trono K, Jones LR.Bovine leukemia virus can be classified into seven genotypes: evidence for the existence of two novel clades. Source Instituto de Virología, CNIA, INTA-Castelar, Argentina.

108. Roemer K and Friedmann T. Concepts and strategies for human gene therapy Eur. J.Biochem., 268, 211- 225, 1992;

109. Rupp R, Hernandez A, Mallard BA. Association of bovine leukocyte antigen (BoLA) DRB3.2 with immune response, mastitis, and production and type traits in Canadian Holsteins. J Dairy Sci. 2007 Feb;90(2): 1029-38.

110. S. Kulberg, B. Heringstad, O.A. Guttersrud, I. Olsaker, 2007 Study on the association of BoLA-DRB3.2 alleles with clinical mastitis in Norwegian Red cows Journal of Animal Breeding and Genetics, Volume 124, Number 4, August 2007, pp. 201-207(7)

111. S. Sharif, The bovine major histocompatibility complex immunogenetic study of the BoLA-DRB3 locus and disease associations Dissertation Abstracts International. 2000. T. 60. № 10. C. 5001.

112. SagataN, YasuagaT, Tsuzuku-Kawamura J, OhishK, Ogawa Y, Ikawa Y (1985). Complete nucleotide sequence of the genome of bovine leukemia virus: Its evolutionary relationship to other retroviruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 677-681.;

113. Sagata, N., Yasunaga, T., Tsuzuku-Kawamura, J., Ohishi, K., Ogawa, Y. & Ikawa, Y. (1985). Complete nucleotide sequence of the genome of bovine leukemia virus: its evolutionary relationship to other retroviruses. Proc Natl Acad Sci US A 82, 677-681

114. Schwartz I, Lévy D. Pathobiology of bovine leukemia virus. Vet Res. 1994;25(6):521-36.

115. Singh CM, Singh B, Parihar NS: Pulmonary involvement in lymphosarcoma of Indian buffaloes. BiblHaematol 1973, 39:220-22

116. Sulimova GE, Udina IG, Shaïkhaev GO, Zakharov IA DNA polymorphism of the BoLA-DRB3 gene in cattle in connection with resistance and susceptibility to leukemia Genetika. 1995 Sep;31(9): 1294-9. .

117. Tajima S, Aida Y. Induction of expression of bovine leukemia virus (BLV) in blood taken from BLV-infected cows without removal of plasma. Microbes Infect. 2005 Aug-Sep;7(l 1-12): 1211-6.

118. Varmus H Retroviruses Science, 240, 1427 1435, 1988;

119. Wu, X, Luke, BT and Burgess, SM (2006). Redefining the common insertion site. Virology 344: 292-295.

120. Xu A, van Eijk MJ, Park C, Lewin HA. Polymorphism in BoLA-DRB3 exon 2 correlates with resistance to persistent lymphocytosis caused by bovine leukemia virus. J Immunol. 1993 Dec 15;151(12):6977-85.

121. Zhao, X. & Buehring, G. C. (2007). Natural genetic variations in bovine leukemia virus envelope gene: possible effects of selection and escape. Virology 366,150-165

122. ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ ЭЛЕКТРОННЫЕ РЕСУРСЫ

123. WWW.fao.orghttp://faostat.fao.org/site/339/default.aspxwww.fsvps.ruwww.humbio.ruwww.ncbi.comwww.elibrarv.ruhttp://www.ncbi.nlm.nih. еоу/еепЬапк/.