Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Использование маркера BoLA DRB3 для поддержания генетического биоразнообразия в популяции молочного скота

ВАК РФ 06.02.07, Разведение, селекция и генетика сельскохозяйственных животных

Автореферат диссертации по теме "Использование маркера BoLA DRB3 для поддержания генетического биоразнообразия в популяции молочного скота"

На правах рукописи

BOJI4EHKO Анастасия Евгеньевна

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МАРКЕРА BOLA DRB3 ДЛЯ ПОДДЕРЖАНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО БИОРАЗНООБРАЗИЯ В ПОПУЛЯЦИИ МОЛОЧНОГО СКОТА

06.02.07 - разведение, селекция и генетика сельскохозяйственных животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

005570009

Краснодар - 2015

1 о 1Г.СН 2015

005570009

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Северо-Кавказский научно-исследовательский институт животноводства» (ФГБНУ СКНИИЖ)

Научный руководитель:

доктор биологических наук, Ковалюк Наталья Викторовна Официальные оппоненты:

1. Сулимова Галина Ефимовна, доктор биологических наук, профессор, научный руководитель отдела генетики животных ФГБНУ «Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова»

2. Сулыга Наталья Владимировна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории скотоводства ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт овцеводства и козоводства»

Ведущая организация:

ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт племенного дела»

Защита состоится «17» июля 2015 года в « 9°°» часов на заседании диссертационного совета Д 006.078.01 при ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт овцеводства и козоводства» по адресу: 355017, г. Ставрополь, пер. Зоотехнический, 15, актовый зал.

тел. (факс) 8(8652) 71-70-33 e-mail: dissovetsniizhk@yandex.ru

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке и на официальном сайте ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт овцеводства и козоводства» http://www.vniiok.ru

Автореферат разослан < > мая 2015 года

Ученый секретарь диссертационного совета

Кононова Лидия Валентиновна

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность темы. Жесткая селекция на увеличение молочной продуктивности в сочетании с интенсивным использованием искусственного осеменения привели к резкому снижению изменчивости в популяции крупного рогатого скота. В настоящее время возникшее снижение генетического разнообразия начало негативно сказываться на жизненно важных показателях животных, подвергающихся антропогенным воздействиям (Ю.П. Алтухов, 2004). Таким образом, важной и актуальной научной задачей является разработка способов увеличения генетического разнообразия в популяции.

1.2. Степень разработанности темы. Полиморфизм гена BoLA DRB3 является объектом многочисленных исследований (R. Spooner et. al., 1978; J. Caldwell et. al., 1979; B. Amorena, W.H. Stone, 1978; S.A. Ledwidge et. al., 2001; A. F. da Mota et. al., 2001). Он рассматривается в аспектах резистентности к инфекционным заболеваниям и другим патологиям крупного рогатого скота: лейкозу (A. Xu et. al., 1993; Г.Е. Сулимова, 1995; JI.K. Эрнст и др.,

1997); тейлериозу (К.Т. Ballingall, 2004); маститу (S. Sharif et al., 1998;S.Sharif et al., 2000; S. Kulberg et. al., 2007; R. Rupp et. al., 2007; S. Takeshima et. al., 2008; Yoshida et. al., 2009); отслоению плаценты (S. Sharif et. al., 1998); склонностью к выкидышам (A.E. Schwab et. al., 2009); циститу(8. Sharif et. al.,

1998). Отмечается связь аллельного полиморфизма BoLA DRB3 с хозяйственно-ценными признаками: обильномолочностью (S. Sharif et. al., 1998; Rupp et. al., 2007); жирностью молока, содержанием в нем белка (S. Kulberg et. al., 2007; М. Pashmi et. al., 2007; В.Ф. Сацук и др., 2010).

Однако полиморфизм BoLA DRB3 прежде не использовался для регулирования уровня генетического разнообразия в стадах молочного скота.

1.3. Цель и задачи исследования. Научно обосновать и разработать метод повышения генетической гетерогенности животных в стаде с использованием генотипирования по локусу BoLA DRB3. Для этого были поставлены и решены следующие задачи:

1) выявить степень BoLA DRB3 полиморфизма в стадах крупного рогатого скота и у быков-производителей;

2) выявить зависимость BoLA DRB3 полиморфизма от породы, стада, поколения животных;

3) установить связь полиморфных вариантов локуса BoLA DRB3 с продолжительностью хозяйственного использования матерей быков-производителей;

4) разработать метод формирования выборки животных для BoLA DRB3 генотипирования;

5) разработать метод повышения гетерогенности животных стада.

1.4. Научная новизна исследовании. Впервые предложено использование маркера BoLA DRB3 для увеличения генетического разнообразия животных в стаде. Разработан метод подбора, заключающийся в BoLA DRB3 гено-типировании репрезентативной выборки и закреплении быков-производителей — носителей редко встречающихся в стаде аллелей.

1.5. Теоретическая и практическая значимость работы. В результате выполненных исследований установлено следующее:

- в популяциях крупного рогатого скота интенсивно идут процессы снижения генетического разнообразия;

- от ВоЬА ОЯВЗ генотипа быков-производителей зависит результат оценки дочерей по качеству потомства;

- быки-производители - потомки коров с длительным периодом хозяйственного использования чаще несут в своем генотипе устойчивые и реже — чувствительные аллели.

Разработан метод отбора животных в выборку для генотипирования по локусу ВоЬА ОЛВЗ, объективно отражающий частоты встречаемости аллелей ВоЬА ОКВЗ в генеральной совокупности.

Разработан метод повышения гетерогенности животных стада с использованием результатов ВоЬА ВШЗЗ генотипирования.

Проведенный подбор быков-производителей позволил снизить расход спермы на одно плодотворное осеменение и увеличить молочную продуктивность животных.

1.6. Методология и методы исследования. Исследования проводились в период с 2008 по 2015 г. в лаборатории биотехнологии СКНИШК. Генотипи-ровано 1508 голов крупного рогатого скота различных пород. Анализ полиморфизма гена ВоЬА БКВЗ проводили методом ПЦР-ПДРФ. Достоверность выводов подтверждена статистической обработкой полученных результатов.

1.7. Положения, выносимые на защиту:

- снижение генетического разнообразия в популяциях крупного рогатого скота;

- изменение частот встречаемости аллелей ВоЬА ОЯВЗ в разных поколениях быков-производителей;

- метод повышения гетерогенности животных стада;

- влияние метода повышения гетерогенности животных стада на оплодотворяющую способность и молочную продуктивность.

1.8. Степень достоверности и апробация результатов. Обоснованность научных положений и выводов базируется на полученном фактическом материале и его анализе с применением методов математической статистики. Выводы соответствуют содержанию диссертации.

Материалы исследований доложены и обсуждены на:

- V Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса» (Краснодар, 2012);

- Ш Международной конференции «Инновационные разработки молодых ученых - развитию агропромышленного комплекса» (Ставрополь, 2014.).

По материалам диссертационной работы опубликовано 10 печатных работ, в том числе 3 в рецензируемых научных изданиях, рекомендованных ВАК, в том числе 1 в издании, входящем в международную базу РиЬМес!.

1.9. Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 124 страницах компьютерного текста и состоит из: введения; обзора литературы,

материалов и методики исследований; результатов исследований и их обсуждения; выводов, предложений производству и списка литературы. Работа включает 27 таблиц, 24 рисунка. Список использованной литературы включает 145 источников, из них 85 - на иностранных языках.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проводились в лаборатории биотехнологии ФГБНУ СКНИИЖ в период с 2011 по 2014 гг. В ходе работы генотипированы 742 коровы и тёлки следующих пород: голштинская черно-пестрой и красно-пестрой масти, айрширская из 13 хозяйств Краснодарского края и Ростовской области, а также быки-производители (n=766) 11 пород (англерская, абер-дин-ангуская, айрширская, голштинская черно-пестрой и красно-пестрой масти, джерсейская, зебу, симментальская, холмогорская, черно-пестрая, швицкая).

Анализировались генотипы быков, принадлежащих ОАО «ГЦВ», ОАО «Московское» по племенной работе, ОАО «Краснодарское» по племенной работе, ГУПП PK «Карелиягосплем», ОАО «Невское» по племенной работе и ОАО «Племпредприятие «Череповецкое», в основной своей массе используемых и планируемых к использованию в системе искусственного осеменения Краснодарского края и рожденных во временном интервале 1982-2012 гг. Создана электронная база данных, которая содержит информацию о гено-типированных быках-производителях.

В качестве материала для выделения ДНК использовали кровь и семя. Образцы крови поступали в вакуумных шприцах S-Monovette, образцы семени -в пайеттах. Для выделения ДНК использовали наборы реагентов Diatom™ DNA Prep 100 ООО «Лаборатория Изоген» г. Москва.

После амплификации экзона 2 гена BoLA DRB3 (размер ПЦР-продукта составляет 284 пн) с использованием праймеров HLO 30 и HLO 32, проводили анализ рестрикционного полиморфизма этой области с помощью эндо-нуклеаз: Rsa I, Нае III, BstYI, Bst 2U I.

Источниками информации о происхождении и оценке быков-производителей служили их племенные свидетельства и данные каталогов племпреприятий. Исследования проведены по следующей схеме:

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МАРКЕРА BOLA DRB3 ДЛЯ ПОДДЕРЖАНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО БИОРАЗНООБРАЗИЯ В ПОПУЛЯЦИИ МОЛОЧНОГО

СКОТА

Генотипирование быков-производителей (п=766). Создание электронной базы дан-

ных

Анализ генетического разнообразия локуса BoLA DRB3

S

н

о О X

к

<и

ч g

cti Я

s о с

>я о я ч о

О О С

X га н и 1) с о а

СО

ч

>я

Я Я и Ч О И О С

3 я

<и

х

03

ё <и с

о

(Я

СО

\

Я н о о и в X

н и

о а, в

>я о и я и я о

я

со «

аз о О

S

Я

яЗ со ta

о СО

>я «

Q-

(U Я

о

ч

S

>я ш а, о н

(Я

н

(U

ч о и ч о ч

о -

о я со я н

и

>>

ч о а, я

X га н и

<D

я

о ч

ffl

ч

Разработка способа формирования репрезентативной выборки стада

Генотипирование репрезе нтати вныхвыборок 13 стад (п=742)

Анализ генетическою разнообразия BoLA DRB3

т

4

Разработка метода подбора быков производителей с использованием генотипирова-ния по ВоЬА ОЯВЗ

Подбор быков-производителей

Анализ генетического разнообразия дочернего стада по BoLA DRB3

ОЦЕНКА ЭКОНОМИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ МЕТОДА

Рисунок 1 - План-схема исследований

Первичная обработка данных осуществлялась программой на основе шаблона Microsoft Exel (BoLA-Статистика), разработанной в лаборатории биотехнологии СКНИИЖ. Программа позволяет сортировать животных по генотипам и определять достоверность числовых различий с использованием критерия Стьюдента. Достоверность разницы между выборками животных была оценена критерием yj -Пирсона.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. Полиморфизм локуса BoLA DRB3 у быков-производителей как маркер генетического разнообразия популяции

Полиморфность гена BoLA DRB3 эволюционно возникла в связи с необходимостью вариабельного строения клеточного рецептора по отношению к чужеродным белковым антигенам и, в связи с этим, имеет географическую и внутрипородную изменчивость. В выборке из 766 быков, принадлежащих к 11 породам (англерская, абердин-ангуская, айрширская, голштинская черно-пестрая и красно-пестрая, джерсейская, зебу, симментальская, холмогорская, черно-пестрая, швицкая); всего выявлено 33 BoLA DRB3 ПДРФ-типа. Такие аллели, как BoLA DRB3 *31, *39,*41, *48 *49, *54 встречаются крайне редко - 1-2 носителя в группе из 766 животных (их частоты встречаемости в таблице 1 не отражены, и в дальнейших расчетах не учитываются). Частоты встречаемости остальных (27 ПДРФ-типов) приведены в таблице 1.

В среднем по породам частота встречаемости BoLA DRB3 по пяти аллелям составляет менее 1%, и еще 12 аллелей (BoLA DRB3 *2, *6, *9,*13,*14,*15,*19,*20,*21,*25,*26,*29) встречаются с частотой менее 5%. Причем наибольшее разнообразие аллелей отмечается в группе «прочие породы». Генетические профили голштинской и айрширской пород различаются довольно заметно (достоверность различий подтверждается критерием Пирсона (Р<0,001)), что, вероятно, говорит о разнице в селекционных предпочтениях и ограниченном количестве животных - родоначальников пород (табл. 1).

Так, у быков-производителей айрширской породы (п=165) из 27 BoLA DRB3 ПДРФ-типов присутствует 22, из них 7 — с частотой менее 1%.

В исследованной выборке быков голштинской породы красно-пестрой масти (п=100) из 27 аллелей 11 не встречаются, 4 аллеля имеют показатели частоты встречаемости менее 1%, 7 аллелей - менее 5%, частота встречаемости аллелей BoLA DRB3 *8, *11 вдвое превышает таковые у представителей голштинской породы черно-пестрой масти (табл.1).

Таблица 1 - Разнообразие ВоЬА ОГ1ВЗ аллельных вариантов у быков-производителей

Частота встречаемости аллеля ВоЬА ОЯВЗ в группе быков-производителей, %

ВоЬА ВЯВЗ Айрширская порода (п=165) Голштинская порода черно-пестрой масти (п=457) Голштинская порода красно-пестрой масти (п=100) Прочие породы1 (п=44)

Аллель Статус р#т в.с.и ^т А,в рША.В.С

*1 Н 10,8 0,1 - 3,6

*2 Н 3,9 0,3 0,5 2,5

*з н 8,1 9,6 10,5 3,5

*5 н 0,3 - - -

*6 н - 0,1 - 1,3

*7 н 21,6 2,8 4,0 10,0

*8 ч 8,5 8,2 16,5 4,6

н 0,6 0,3 2,5 -

*10 н 0,3 2,0 2,0 5,5

*11 у 1,5 6,1 13,0 9,9

*12 н 5,1 0,9 3,0 6,6

♦13 н 0,3 0,1 - 1,2

*14 н - 0,2 - 1,2

*15 н - 0,4 0,5 3,4

*16 ч 1,5 14,4 8,5 8,7

*18 н 9,8 0,4 1,5 -

*19 н - - - 1,1

*20 н - - 0,5 1,1

*21 н 4,2 0,4 - з,з

*22 ч 3,6 19,5 11,5 13,0

*23 у 0,6 6,4 2,5 5,4

*24 ч 3,6 19,7 18,0 7,6

*25 н 0,3 0,1 0,0 1,1

*26 н 0,3 1,1 0,5 -

*27 н 8,6 5,7 3,0 1,1

*28 у 5,3 1,2 1,5 2,2

*29 н 1,2 - - 2,1

1 — прочие породы: англерская, абердин-ангуская, джерсейская, зебу, симментальская, холмогорская, швицкая; т-Р<0,001

Если рассматривать генетические профили по группам аллелей, то межпородные различия проявятся еще заметнее. Так, основу ВоЬА ВЯВЗ алле-лофонда айрширской породы составляют нейтральные аллели - их 75,5%, много меньше чувствительных — 16,4%, и очень редки устойчивые аллели — их всего 8,1% (табл. 2).

Таблица 2 - Частота встречаемости групп аллелей ВоЬА ОЯВЗу быков-

производителей

ВоЬА-ОЯВЗ Частота встречаемости групп аллелей ВоЬА ОЯВЗ у быков-производителей, %

айршир- ская порода (п=165) голштинская порода черно-пестрой масти (п=457) голштинская порода красно-пестрой масти (п=100) прочие породы1 (п=44) в среднем М±т (п=766)

Н 75,5 24,6 28,5 47,7 44,1 ±22,8

Ч 16,4 61,7 54,5 34,1 41,6±20,1

У 8,1 13,7 17,0 18,2 14,3±4,4

1 — прочие породы: англерская, абердин-ангуская, джерсейская, зебу, симментальская, холмогорская, черно-пестрая, швицкая

У быков-производителей голштинской породы черно-пестрой масти наибольшее количество аллелей - 61,7% приходится на группу чувствительных, а минимальное - на группу устойчивых аллелей (13,7%). Менее всего устойчивых аллелей у быков-производителей айрширской породы - всего 8,1%.

3.2. Волнообразное изменение частот встречаемости аллелей ВоЬА ОЯВЗ у быков-производителей в поколениях

Нами проанализирована динамика изменения частот встречаемости аллелей в поколениях быков-производителей голштинской породы черно-пестрой масти (п=490), оцененных как улучшатели по качеству потомства и рожденных в период с 1986 по 2009 гг. Быки были сгруппированы по дате рождения с шаговым интервалом в 4 года. В итоге весь изучаемый период представлен шестью временными промежутками (поколениями), в которых частота встречаемости различных аллелей варьировала от 0 до 30%.

На рисунке 2 отображена динамика изменения частот встречаемости аллелей ВоЬА ОЯВЗ в поколениях. Достоверность различий между значениями частот подтверждена критерием Пирсона (Р<0,001).

&

г; Т

5% 0%

1986-1989 1990-1993 1994-1997 1998-2001 2002-2005 2006-2009 п=13 п=13 п=29 п=77 п=105 11=41

временные отрезки

Рисунок 2 - Антагонистическая зависимость частот встречаемости аллелей ВоЬА ОКВЗ у оцененных быков-производителей голштинской породы черно-пестрой масти (8,11,16...27- номера ВоЬА ОЯВЗ ПДРФ-типов).

В разные временные периоды высокую оценку по качеству потомства получали быки - носители разных аллелей. Так, для аллеля ВоЬА ЭЯВЗ *8 частота встречаемости достигает пикового значения 20% в период 1986-89 гг., далее она резко снижается в период 2006-2009 гг. до 7%. Аналогичная картина имеет место для часто встречающегося аллеля ВоЬА ОЯВЗ *11 и некоторых других. Для аллеля ВоЬА ЭЯВЗ *16 наблюдается постоянное нарастание частоты встречаемости до максимума в 1994-1997 гг. с последующим снижением на протяжении двух четырехлетних циклов.

Наилучшим образом описанные выше закономерности видны при волнообразных сменах значений частот встречаемости чувствительных аллелей (Ч-аллелей). Так, в период с 1994-1997 гг. оценивались как улучшатели быки-носители ВоЬА ОЛВЗ *16 аллеля, однако спустя 8 лет носители *16 аллеля ВоЬА ЭЯВЗ исчезли из категории улучшателей. В тоже время носители ВоЬА ОЯВЗ *24 аллеля в период 1994-1997 гг. в выборку улучшателей практически не попадали, а в 1998-2001 - стали улучшателями. Для устойчивых аллелей выявленные закономерности аналогичны. Описанное явление волнообразной смены частот встречаемости аллелей ВоЬА ОЯВЗ в поколениях также отмечено у быков-производителей айрширской и голштинской породы красно-пёстрой масти.

Наблюдаемый нами эффект, вероятно, связан с одним из признаков ин-бредной депрессии (накоплением аллелей комплексного действия, снижающих жизнеспособность). Мы считаем, что вследствие жесткого отбора по конкретным хозяйственно-полезным признакам генофонд популяции становится однообразным, примерно так же как и при близкородственном скрещивании, что негативно сказывалось на различных показателях жизнеспособности. Поэтому быки-производители с отличающимися генотипами давали бо-

лее жизнеспособное (и, возможно, продуктивное) потомство и оценивались как улучшатели (генерировали новый «пик» частот встречаемости). Однако, помимо волнообразных изменений частот встречаемости аллелей, для некоторых аллелей прослеживаются и линейные тенденции. Эти аллели за промежуток времени равный 24 годам (или шести генеративным циклам) существенно изменили частоту встречаемости в рамках одной породы.

В целом, прослеживается тенденция конвергенция пород - генетический профиль айрширской породы приобретает черты голштинской, и наоборот. Кроме того, за последние 6 лет аллелофонд айрширской породы заметно обеднел (достоверность различий подтверждается критерием Пирсона, уровень значимости Р<0,01). Если ранее (до 2004 г.) из 27 аллелей ВоЬА ОЯВЗ отсутствовало 8, то теперь отсутствует 14 аллелей. То есть, за сравнительно небольшой временной промежуток, безвозвратно исчезло 6 аллелей, таких как ВоЬА 011ВЗ *5, *9, * 13, *23, *25, *26. При этом появился и распространился новый для айрширской породы аллель ВоЬА ЭГШЗ *24, частота встречаемости которого возросла с 0,5 до 6,8%.

3.3. Ассоциация ВоЬА ОЯВЗ аллелей с хозяйственно полезными

признаками и показателями здоровья

Многие исследователи выявляют связь разных аллельных вариантов гена ВоЬА ОЯВЗ с признаками молочной продуктивности и качества молока. Судя по всему, это связано с тесным физическим сцеплением гена ВоЬА БЯВЗ, гена пролактина и других генов, связанных с продуктивностью животных. Однако, согласно данным разных исследователей, одни и те же аллели могут обуславливать противоположные биологические эффекты. Нами проанализированы данные ОАО «Московское» по племенной работе, представленные в каталоге «Генетика будушего 2013-2015». Данные были обработаны следующим образом: все быки-производители, имеющие оценку (по качеству потомства или геномную), были распределены по группам улучшателей соответствующих признаков. Затем, в сформированных таким образом группах, определяли частоту встречаемости каждого из аллелей. В таблице 3 представлена связь частот встречаемости отдельных аллелей ВоЬА ЭЯВЗ и определённых хозяйственно-ценных признаков. Как видно из представленных цветных схем, часть наших данных совпадает с литературными: наличие ВоЬА БЯВЗ *3 характерно для быков-производителей - улучшателей молочного белка, ВоЬА БЯВЗ *8 — ухудшателей показателя соматических клеток. Другая же часть не совпадает: ВоЬА ОЯВЗ * 11 - по нашим данным, ухудшает удой, а по литературным- улучшает.

На наш взгляд, это не опровергает связи аллельных вариантов ВоЬА ОЯВЗ с признаками молочной продуктивности, а показывает, что она более сложна и складывается из нескольких закономерностей, наложенных одна на другую. В литературе так же описано, что данные разных исследователей говорят об ассоциациях одних и тех же аллелей с биологически противоположными эффектами.

Таблица 3 — Влияние наличия в генотипе определенных аллелей ВоЬЛ РЯВ 3 на хозяйственно-ценные признаки_

Генотип ВоЬА ОЯВЗ Частоты встречаемости аллелей ВоЬА ОКВЗ, % Улучшение хозяйственно - ценных признаков

Удой Жирномолочность Белковомолочность Строение конечностей Строение вымени Рост о к * J О 5 й * С Я 1 н с о и Корпус Воспроизводительные качества Продуктивное долголетие Легкость отелов

*3 Н 8,2

*7 Н 2,7

*8 ч 6,3 1

*9 н .

*10 н 2,0

*11 У 4,3

*16 ч 11,7

*22 ч 22,3

*23 У 7,0

*24 ч 19,9

*26 н 0,8

*27 н 10,5

*28 У 2,7

Всего 128

- улучшение показателя I I- улучшение показателя по литературным данным

П- ухудшение показателя [ | - ухудшение показателя по литературным данным

! - совпадение наших данных с литературными

Это еще раз подтверждает наши заключения о волнообразной смене частот встречаемости аллелей у быков-производителей в различных улучшающих группах. Мы связываем это с эффектом «насыщения», когда, несмотря на явную селекционную предпочтительность того или иного аллеля (например, ВоЬА ЭЯВЗ *24 у голштинов), эффект его присутствия нивелируется у дочерей высоким уровнем гомозиготности (появляется много гомозиготных животных). Вероятно, это негативно влияет на ряд показателей и приводит к снижению частоты встречаемости этого аллеля в следующем поколении.

Данные приведенные в таблице 3 (в ближайший четырёхлетний временной отрезок), можно использовать для маркер-зависимой селекции. Наиболее ценными, исходя из данных этой таблицы, являются быки-носители аллеля ВоЬА ОЯВЗ *28 (У). Этот устойчивый аллель является улучшающим по трём

позициям («содержание белка», «соматические клетки», «легкость отелов»)из двенадцати, и ни в одном случае не проявил себя как ухудшающий. Причем две позиции из трех улучшаемых являются показателями здоровья, что немаловажно в сложившейся ныне ситуации в стадах крупного рогатого скота. Использование быков-носителей ВоЬА ЭЯВЗ *28, кроме того, повысит генетическое биоразнообразие популяции, так как частота его встречаемости в данной выборке составляет 2,7% (табл. 1).

3.4. Связь маркера ВоЬА ОЯВЗ с периодом хозяйственного использования матерей быков-производителей

Выявление генетических предпосылок продуктивного долголетия -актуальный вопрос селекции молочного скота.

Таблица 4 - Частоты встречаемости ВоЬА ОЯВЗ аллелей у быков-производителей голштинской породы черно-пестрой масти с различным периодом продуктивного использования матерей

Аллель ВоЬА ЭЯВЗ Частоты встречаемости ВоЬА БЯВЗ аллелей у быков-производителей с периодом продуктивного использования матерей, %

3-4 лактации (п=48) 5-9 лактаций(п=36)

*3 Н 7,3 8,3

*6 н - 1,4

*7 н 3,2 5,6

*8 ч 12,6 11,2

*10 н 1,0 1,4

*11 У 3,2 9,7

*13 Н 1,0 -

*15 н - 1,4

*16 ч 9,4 9,7

*21 н - 1,4

*22 ч 24,0 22,2

*23 У 9,4 8,3

*24 ч 18,8 9,7

*25 н - 1,4

*26 Н 1,0 -

*27 Н 7,0 8,3

*28 У 2,1 -

Н 20,5 29,2

Ч 64,8 52,8

У 14,7 18,0

Мы попытались проанализировать взаимосвязь продолжительности жизни и количества лактации у матерей быков-производителей голштинской породы черно-пестрой масти с полиморфизмом локуса ВоЬА ОЯВЗ самих быков.

Данные о количестве лактаций матерей получены из племенных свидетельств быков-сыновей. Из массива данных мы сформировали две выборки со средним количеством лактаций (среди матерей) 3-4 и средним количеством лактаций 5-9, и определили частоту встречаемости аллелей у быков-сыновей для каждой выборки. Полученные результаты представлены в таблице 4. Разница генетических профилей у быков-производителей первой и второй групп подтверждается критерием Пирсона с уровнем значимости Р<0,05 и проявляется в различных частотах встречаемости ВоЬА ОЯВЗ *11 и *24 аллелей. ВоЬА ОЯВЗ *11 у быков, матери которых имели 3-4 лактации, встречался в 3 раза реже, чем у потомков коров с высоким количеством лактаций (5-9). При этом ВоЬА ОЯВЗ *24 в первой группе, напротив, встречался в 2 раза чаще, чем во второй. Если рассматривать аллели в условном подразделении на группы Н, Ч, У, то видны тенденции увеличения во второй группе (среди потомков коров-долгожительниц) частоты встречаемости устойчивых аллелей и снижение частоты встречаемости чувствительных аллелей.

3.5. Уровень ВоЬА ЭЯВЗ гомозиготности в популяциях крупного

рогатого скота айрширской и голштинской пород.

Ранее в лаборатории биотехнологии СКНИИЖ получены данные, свидетельствующие о высоком уровне гомозиготности крупного рогатого скота по полиморфному локусу ВоЬА ОЯВЗ. Уровень гомозиготности в изучаемой выборке быков-производителей для голштинской породы черно-пестрой масти составил 11,6%; для голштинской породы красно-пестрой масти -12,0%, у айрширской породы - 14,5% (табл. 5).

Таблица 5 — Уровень гомозиготности в выборке оцененных быков-производителей

Частота встречаемости гомозиготных генотипов ВоЬА ОЯВЗ в выборке оцененных быков-производителей, %

Голштинская порода черно-пестрой масти (п=457) Голштинская порода красно-пестрой масти (п=100) Айрширская порода (п=165)

11,6 12,0 14,5

Нами опубликованы результаты исследований (А.Е. Волченко и др., 2011), свидетельствующие о том, что среди быков-производителей голштинской породы безусловное лидерство в распространении принадлежит гомозиготному генотипу ВоЬА ОЯВЗ 24*24 (частота встречаемости генотипа

24*24 равна 10,4 % от общего количества гомозиготных генотипов). У быков айрширской породы мономорфизм ещё более выражен - частота встречаемости гомозигот ВоЬА ОИВЗ 7*7 составляет 20 % от общего количества гомозиготных генотипов.

Также нами генотипированы выборки (по 30-100 голов) коров и тёлок из 12 хозяйств Краснодарского края. У генотипированных животных, в зависимости от хозяйства, разброс уровня гомозиготности составил от 2,0 до 15,7% (табл. 6).

Таблица 6 - Уровень гомозиготности в стадах молочного скота

Хозяйство, количество животных в выборке Уровень гомозиготности по гену BoLA DRB3 в стадах, %

голштинская порода черно-пестрой масти, голштинская порода красно-пестрой масти айрширская порода,

ЗАО «Черноерковское», п=50 10,0 - -

КФХ «Сокольский», п=30 3,3 - -

ООО «СХП им Лукьяненко», п=54 14,4 - -

ООО «Южное молоко», п=100 11,0 - -

ООО «Предгорье Кавказа», п=50 14,0 - -

ОАО «ПЗ «Дружба» Калининский район, п=50 - - 14,0

ОАО «ПЗ «им.Чапаева», п=55 - - 9,0

ООО «Агрофирма «Приазовье», п=50 - 2,0 -

ЗАО «АФ Кухаривская», п=50 - 8,0 -

СПК им. Димитрова, п=50 - 6,7 -

ОАО «Лиманское», п=52 - 13,5 -

ОАО «Дружба» Каневской район, п=50 - 6,0 -

ОАО «им. Т.Г.Шевченко», п=51 - 15,7 -

М±гп 10,5±3,9 8,7±4,1 11,5±4,9

При этом средний показатель в 9,5% - оказался ниже, чем аналогичный у быков-производителей.

Расчеты показывают, что при таком высоком уровне гомозиготности среди быков-производителей и в стадах, теоретически возможно появление стад с высокой частотой встречаемости гомозиготных сочетаний.

Однако, среди всех генотипированных нами выборок животных из 13 стад, в которых подбор быков-производителей велся с применением стандартных методов с приоритетным направлением селекции на улучшение по-

казателей молочной продуктивности, нами ни разу не встречено таких высоких показателей гомозиготности. Это, видимо, объясняется существующими механизмами естественного поддержания генетического разнообразия в популяции и осуществляется на нескольких этапах онтогенеза:

1) аналогичные генотипы локусов, отвечающих за гистосовместимость, у потенциальных родителей ведут к снижению оплодотворяющей способности и к эмбриональной смертности, что массово подтверждается увеличением расхода семени на одно плодотворное осеменение;

2) бык-производитель не показывает себя как «улучшатель», если его генотип сходен с генотипом, наиболее распространённым в стаде, при этом бык получает низкий бал при оценке и как производитель не используется, следовательно, частота встречаемости его аллелей снижается. Тогда место улуч-шателя занимает бык-производитель с иным генотипом, и мы наблюдаем волнообразную динамику смен частот встречаемости аллелей у быков-производителей на протяжении определённого временного промежутка (ръ2)

Используя генотипирование по локусу ВоЬА ОЯВЗ и соответствующий подбор быков-производителей к стаду, можно уйти от проблем, связанных с гомозиготностью.

3.6. Метод подбора быков-производителей к стаду с использованием информации о ВоЬА ОЯВЗ генотипе

Для создания высокопродуктивного гетерогенного стада нами разработан метод подбора быков-производителей. Маркер ВоЬА ОЯВЗ можно использовать для этой цели как действенный инструмент контроля и регулирования уровня гомозиготности и привнесения в стадо хозяйственно-ценных признаков. Первоначально для реализации метода нами была поставлена и решена задача по установлению минимального размера выборки животных для гено-типирования по локусу ВоЬА ЭЯВЗ, позволяющая точно экстраполировать данные анализа на все стадо.

Экспериментально, путем генотипирования животных, принадлежащих ОАО «Агрообъединение «Кубань», нами доказано, что значения показателей частот встречаемости генотипов и аллельных вариантов ВоЬА ОЯВЗ, при изменении размера выборки с п = 50 до п = 192, изменяются в пределах 1-3%. При меньшем размере выборки (п=27) разброс аналогичных показателей превышает уровень 3%.

При формировании репрезентативной выборки из животных конкретного стада необходимо, по нашему мнению, учитывать фактор «бык-отец». Так, если в стаде присутствует 300 дочерей одного быка и 50 дочерей другого быка, то и в выборку для генотипирования они должны попадать в соотношении 6:1. Таким образом, нами разработана схема отбора животных в выборку для генотипирования по локусу ВоЬА ОЯВЗ, объективно отражающая частоты встречаемости ВоЬА ОЯВЗ аллелей в генеральной совокупности.

Для конкретного стада быков-производителей подбирали таким образом, чтобы они, во-первых, не имели общих предков с использованными

ранее быками-производителями, во-вторых, имели высокий потенциал продуктивности, в-третьих — несли в стадо редко встречающиеся в нём аллели. Подбор быков-производителей осуществлялся «тройками» со сменой быка после каждого перегула.

Гекетклировахие 6шо1. прою |»хкклей па ляк^у BoLA DRB3, ««шике >лек1р«ююк баш хиоа»а бык о» . производителей

Геколсгафоинне шборкк маетных сгш, в преде-леям частот встречаемости вкдо» аллеей

Подбор Быко s • прою («опелей с шгоккч мтекшшшм продукт»костм м с яефкшстмымм яш стада шивлям^ (жтискмыкх с мхоапеимо — iik-иынх лрюкаканн

Внплемие ровгпеюсш »юей jr отебриюп быков к жммтюп ггада, удаление из с тает к а быко», киеяших общхх предков с жхвотмымн стада

Составление окончательного списка ю трех быков-прою водителей

Омиемекме бымм № 1

Пере хул (охота m кратна циклу)

Перетул (охота кратко циклу)

Осештюе быкоя W2

Передул

(охота ме кратно к кхлу)

Рисунок 3 - Схема метода закрепления быков «тройками» Важно, чтобы каждый последующий бык в «тройке» нёс в своём генотипе отличные от предыдущего аллельные варианты гена ВоЬА ЭЛВЗ .Такое чередование быков в тройке — эффективный метод преодоления биологической несовместимости. Общая схема подбора представлена на рисунке 3.

Новое закрепление коренным образом меняет ВоЬА ОЛВЗ-профиль стада. В таблице 7 представлено распределение аллелей и групп аллелей в исходной

(материнской) группе и группе потомков, полученных при использовании метода закрепления «тройками».

Подбирая быков-производителей способом, описанным выше, мы можем добиться заданного результата и изменить частоты встречаемости определенных аллелей в стаде. Так, в ОАО «Племзавод «Дружба» после генотипиро-вания группы животных (п=50) дочернего стада не выявлено ни одной гомозиготной особи.

Таблица 7 - Результаты анализа генетического профиля стада ОАО «Племзавод «Дружба»

Разработанный метод подбора быков-производителей применен нами в

Аллель ВоЬА ОЯВЗ Статус аллеля Частота встречаемости аллеля, %

в генотипиро-ванной выборке (п=50) у потомков в результате закрепления (прогноз) у потомков в результате закрепления (факт) (п=50)

*1 Н 5 5 5

*2 Н 7 3 4

*3 Н 7 4 5

*5 Н 3 2 -

*7 Н 19 9 12

*8 Ч 2 15 15

*11 У - 15 17

*12 Н 4 5 5

*16 Ч 6 3 2

*18 Н 6 10 10

*21 н 4 2 -

*22 ч 2 8 7

*24 ч 15 8 6

*27 Н 13 7 6

*28 У 7 4 6

ИТОГО Н 68 47 47

ч 25 34 30

У 7 19 23

девяти хозяйствах. В этих хозяйствах были генотипированы репрезентативные выборки телок и коров, рассчитаны частоты встречаемости каждого ал-леля ВоЬА ОЯВЗ. В соответствии с принципами, описанными выше для каждого хозяйства, были подобраны тройки быков-производителей.

3.7. Производственные результаты, полученные в хозяйствах края, использующих закрепление с учетом ВоЬА ОГШЗ-профиля

С момента первых поставок спермопродукции в хозяйства по новой схеме подбора, мы начали проводить мониторинг его эффективности. Широкое производственное внедрение метода начато в хозяйствах края с 2011 года.

Положительный результат работы метода на сегодняшний день заключается в снижении расхода семени на одно плодотворное осеменение, полученный в хозяйствах, при прочих равных условиях, соблюдающих закрепление быков-производителей «тройками» (табл.8). В среднем в хозяйствах расход семени на одно плодотворное осеменение сократился на 9-10%. Очевидно, что пропорционально сокращается и количество перегулов. Установлено, что первотёлки, полученные от подбора с использованием генотипирования по локусу ВоЬА ОЯВЗ, обладают более высоким уровнем молочной продуктивности.

Таблица 8 - Влияние ВоЬА ОЯВЗ подбора на расход семени быков-производителей_

Годы Расход семени на плодотворное осеменение, доз

ЗАО «АФ» Кухаривская» (500 коров) ОАО «ПЗ им. Чапаева В.И» (2600 коров) ОАО «ПЗ «Дружба» (720 коров)

2009 2543 (100%) 14829(100%) 3769(100%)

2010 2502 (98%) 14675 (99%) 3760 (100%)

2011* 2328 (92%) 13385 (90%) 3500(93 %)

2012 2322 (91%) 13225 (89%) 3400 (90%)

*Год введения закрепления по ВоЬА БИВЗ

Удой первотёлок оказался выше по сравнению с показателями по первой лактации их матерей, на 120 - 823 кг (табл.9). Это подтверждает теорию о появлении гетерозиса при увеличении генетического разнообразия особей в стаде.

Таблица 9 — Сравнение молочной продуктивности матерей и их дочерей, полученных от подбора быков-производителей с использованием маркера ВоЬА ОЯВЗ

Показатели ОАО «ПЗ «им. Чапаева В.И.» ЗАО «АФ «Кухаривская» ОАО «ПЗ «Дружба»

продуктивность

Матерей (п=55) Дочерей (п=30) Матерей (п=50) Дочерей( п=22) Матерей(п =50) Дочерсй( п=25)

Удой первотелок (за 305 дней), кг 5620±67** 6013±117 4629±197* 5452±286 6174±94 6294±138

Жирномолочность, % 4,15±0,06 4,03±0,08 4,20±0,08 4,32±0,17 3,70±0,08* 4,01 ±0,10

Бслковомолоч-ность, % 3,46±0,05 3,54±0,07 3,26±0,07 3,16±0,07 3,18±0,05 3,22±0,07

*-Р<0,05 **-Р<0,01

3.8. Экономическая эффективность

Нами рассчитана экономическая эффективность нового метода подбора быков-производителей (табл. 10). Экономические расчёты, показывают, что затраты на генотипирование репрезентативной выборки окупаются только за счет экономии семени в течение 9 месяцев, если же учитывать увеличение молочной продуктивности (на 8%), затраты на исследования окупаются менее чем за три месяца. Таким образом, суммарный фактический экономический эффект от метода подбора быков-производителей с учетом маркера генетического биоразнообразия BoLA ЭЯВЗсоставит 4 222 300 рублей за 5 лет на стадо в 1000 голов.

Таблица 10 - Экономический расчёт эффективности использования маркера ВоЬА РЯВЗпри подборе быков-производителей за 5 лет _

Показатель Значение

количество коров в хозяйстве 1 000

количество тёлок в хозяйстве 300

количество доз семени на одно плодотворное осеменение (коровы) 3,9

количество доз семени на одно плодотворное осеменение (тёлки) 2,0

цена одной семядозы, руб. 150,0

итого, руб. 675 000,0

стоимость генетических анализов, руб. 50 000,0

снижение расхода семени на одно плодотворное осеменение, % 10,0

итого новые затраты на сперму в год, руб. 607500,0

экономия средств на сперму в год, руб. 67 500,0

окупаемость затрат на генетические исследования, мес. 9

Удой первотелок (кг/305дней) 5 474

удой нового поголовья (кг/корова за 305 дней) (+8%) 5 912

прибавка молока у нового поколения (кг/корова за 305 дней) 438

размер чистой прибыли (выручка-затраты), (руб./кг) 10

прибыль от прибавки молока (руб./корова, 5лет) 10512

прибыль от прибавки молока от всего стада (принимая, что от 1000 коров будет получено 40% первотёлок) 4 204 800

общая прибыль, руб. 4222 300

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

1. В проанализированной выборке, состоящей из 766 быков, принадлежащих к одиннадцати породам крупного рогатого скота, выявлено 33 ВоЬА БЯВЗ ПДРФ-типа. У быков-производителей айрширской породы из ЗЗВоЬА БЯВЗ ПДРФ-типов встречается 22, но лишь восемь из них - с частотой встречаемости более 5%. Лидируют по частоте встречаемости аллели ВоЬА БЬШЗ *1, *7, * 18, *27 - все они принадлежат к группе нейтральных. У быков-производителей голштинской породы из 33 аллелей (ПДРФ-типов) присутствует 23, из них восемь в количестве более 5%. Лидируют по частоте встречаемости аллели ВоЬА 1ЖВЗ *16, * 22, *24, принадлежащие к группе чувствительных.

2. Частоты встречаемости аллелей ВоЬА БИВЗ изменяются в поколениях быков-производителей. Это явление повторяется на всех исследованных породах.

3. За последние 8 лет аллелофонд ВоЬА БЯВЗ сузился для быков-производителей айрширской породы на шесть аллелей, для быков-производителей голштинской породы - на семь аллелей.

4. Генетические профили быков-производителей айрширской и голштинской пород имеют тенденцию к сближению.

5. Аллели ВоЬА ОЫВЗ ассоциированы с признаками молочной продуктивности, однако эта связь не является линейной, то есть присутствие определенного аллеля в генотипе не гарантирует проявление определённого признака.

6. Данные по влиянию наличия в генотипе определенных ВоЬА БИВЗ аллелей на хозяйственно-ценные признаки можно применять для маркер-зависимой селекции, но использовать их следует, подбирая быка в стадо.

7. Частота встречаемости гомозиготных ВоЬА БЯВЗ генотипов у быков-производителей голштинской породы (п=457) равна 11,6%; айрширской породы (п= 165) - 14,4%. Частота встречаемости гомозиготных ВоЬА И1ВЗ в 13 исследованных стадах варьирует от 2% (ООО «Агрофирма «Приазовье», п=50) до 15,7% (ОАО «им. Т.Г. Шевченко», п=51).

8. Разработан метод формирования репрезентативной выборки (п=50), позволяющий анализировать ВоЬА БИВЗ генетический профиль стад. Разработана схема подбора быков-производителей «тройками», со сменой быка после каждого перегула, позволяющая поддерживать генетическое биоразнообразие в стаде, а так же полностью решать проблему наличия гомозиготных сочетаний.

9. Первотёлки, полученные от подбора с использованием генотипиро-вания по локусу ВоЬА БКВЗ, по сравнению со своими матерями, обладают более высоким уровнем молочной продуктивности, по нашему мнению, за счет увеличения генетического полиморфизма в стаде. Удой первотёлок оказался выше, по сравнению с показателями по первой лактации их матерей (на

120-823 кг). Новая методика позволяет снизить расход семени на плодотворное осеменение (на 9-10%), улучшить показатели продуктивности животных (на 8%), что способствует повышению уровня рентабельности производства молока.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ

Товарным и племенным хозяйствам, разводящим молочный скот, а так же предприятиям, содержащим малочисленные аборигенные породы рекомендуется использовать маркер ВоЬА ОИВЗ в качестве дополнительного селекционного фактора при планирован™ и осуществлении индивидуального и группового подбора производителей к маточному поголовью.

ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ

Результаты дальнейших исследований могут быть интересны как в теоретическом, так и в практическом плане. Предстоит выяснить, какие из выявленных закономерностей характерны для редких пород скота, возможно ли сохранить положительную динамику изменения производственных показателей через поколение при новом подборе быков - производителей.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ:

1. Сацук, В.Ф. Способ повышения гетерогенности по локусу ВоЬА 011ВЗ в стадах крупного рогатого скота / В.Ф. Сацук, Н.В. Ковалюк, А.Е. Волченко // Проблемы биологии продуктивных животных.-2011,- № 4.-С.126-129.

2. Сацук, В., Важнейший фактор в селекции молочного скота /В. Сацук, И. Янчуков, А. Ермилов, Н. Ковалюк, А. Волченко // Молочное и мясное скотоводство.-2012.-№ 1 -С.9-11.

3. Ковалюк, Н.В. Изменчивость гена ВоЬА ОКВЗ у крупного рогатого скота молочного направления продуктивности и его влияние на параметры жизнеспособности / Н.В. Ковалюк, В.Ф. Сацук, А.Е. Волченко // Генетика,-2012.-Т.48.-№8.-С.962-965.

Публикации в других изданиях:

1. Ковалюк, Н.В. Использование полимеразной цепной реакции (ПЦР) для ранней диагностики лейкоза крупного рогатого скота / Н.В. Ковалюк, Е.В. Мачульская, А.Е. Волченко // Сборник научных трудов международной научно-практической конференции «Научные основы повышения продуктивности сельскохозяйственных животных».-Краснодар.-2008.-С.22-24.

2. Ковалюк, Н.В. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - фактор ранней диагностики лейкоза КРС / Н.В. Ковалюк, Е.В. Мачульская, А.Е. Волченко // Эффективное животноводство.-2009.-№1.-С.55.

3. Волченко, А.Е. Использование маркера ВоЬА-ОЯВЗ для увеличения гетерогенности стад крупного рогатого скота / А.Е. Волченко, Н.В. Кова-люк//Сборник научных трудов 4-ой международной научно-практической конференции «Научные основы повышения продуктивности сельскохозяйственных животных».-Краснодар.-2011.-С.4-5.

4. Сацук, В.Ф. Аллельные миры / В.Ф. Сацук, Н.В. Ковалюк, А.Е. Волченко // Агробизнес.-2011.-№5.-С.34-37.

5. Ковалюк, Н.В. Изучение генетической структуры стад Краснодарского края по локусу ВоЬА 3 / Н.В. Ковалюк, Е.В. Мачульская, А.Е. Волченко, В.Ф. Сацук// Сборник научных трудов 6-ой международной научно-практической конференции «Научные основы повышения продуктивности сельскохозяйственных животных».-Краснодар.-2013 .-С.9-15.

6. Мачульская, Е.В. Экспериментальное обоснование размера выборки животных для генотипирования по локусу ВоЬА БЯВЗ / Е.В. Мачульская, А.Е. Волченко, Л.И. Якушева, В.Ф. Сацук, Ф. Дениз, Н.В. Кова-люк//Материалы П международной конференции «Инновационные разработки молодых учёных - развитию агропромышленного комплекса». Сборник научных трудов ГНУ СКНИИЖК.-Ставрополь.-2013.-Т.З.- Вып.6.-476 с.

7. Волченко, А.Е. Гомозиготность гена ВоЬА Б1ШЗ как показатель генетического благополучия популяции крупного рогатого скота для голштин-ской породы черно-пестрой масти / А.Е. Волченко, Е.В. Мачульская, Ю.Ю. Шахназарова, Н.В. Ковалюк// Материалы IX Международной научно-практической конференции, посвященной 85-летнему юбилею факультета технологического менеджмента «Инновации и современные технологии в производстве и переработке сельскохозяйственной продукции»,-Ставрополь.-2014.-С. 13-16.

Автореферат ВОЛЧЕНКО Анастасия Евгеньевна

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МАРКЕРА ВОЬА 1ЖВЗ ДЛЯ ПОДДЕРЖАНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО БИОРАЗНООБРАЗИЯ В ПОПУЛЯЦИИ МОЛОЧНОГО СКОТА

Подписано в печать 12.05.2015 г. Формат 60х84!/1б. Бум. тип. № 1. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 120 экз. Заказ № 2233,2 Издательско-полиграфический центр Кубанского государственного университета 350040, г. Краснодар, ул. Ставропольская, 149.