Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Дифференциация пород крупного рогатого скота по гену BoLa-DRB3 главного комплекса гистосовместимости и ISSR-маркерам

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Дифференциация пород крупного рогатого скота по гену BoLa-DRB3 главного комплекса гистосовместимости и ISSR-маркерам"

На правах рукописи

МОХАММАД АБАДИ МОХАММАДРЕЗА

ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ПОРОД КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ПО ГЕНУ ВоЬА-БКВЗ ГЛАВНОГО КОМПЛЕКСА ГИСТОСОВМЕСТИМОСТИ И

ЮвК-МАРКЕРАМ

Специальность 03.00.15 -генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 2005

Работа выполнена в лаборатории сравнительной генетики животных Института общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ

доктор биологических наук, профессор Сулимова Галина Ефимовна

ОФИЦАЛБНЫЕ ОППОНЕНТЫ

доктор биологических наук, профессор Янковский Николай Казимирович

доктор биологических наук Калашникова Любовь Александровна

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

Кафедра генетики Биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова

Защита состоится «_»_2005 г. в_часов на заседании Диссертационного

совета Д 002.214.01 в Институте общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН по адресу: 119991, ГСП-1, Москва, ул. Губкина, 3. Факс: (095) 132 89 62.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН.

Автореферат разослан «_»_2005 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

Полухина Галина Николаевна

1Ж-Ч

mm б

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Интенсивная селекция крупного рогатого скота (КРС) привела к созданию специализированных пород и к сокращению общего генетического разнообразия генофонда КРС. Обеднение генофонда КРС в будущем может привести к отрицательным непредсказуемым последствиям, поскольку невозможно предсказать возникновение новых требований к продуктивности и резистентности КРС к заболеваниям. Важно поддерживать максимально возможное разнообразие генофонда КРС. Необходимым условием для проведения таких работ является проведение генетического мониторинга пород КРС на молекулярном уровне.

За рубежом с использованием молекулярных методов анализа исследуется генетическая структура пород КРС, их происхождение; создана международная программа и база данных по картированию генома Bos taurus (http://www.ri.bbsrc.ac.uk/bovmap/bovmap.htm). Однако исследуются, в основном, европейские породы. Большая часть местных и аборигенных пород на молекулярно-генетическом уровне практически не исследована, что определило цель наших исследований, заключающуюся в изучении генетического разнообразия пород КРС с использованием ДНК-технологий.

В качестве тест-систем для изучения генетического разнообразия и дифференциации пород КРС нами был использован анализ полиморфизма гена BoLA-DRB3 главного комплекса гистосовместимости, участвующего в формировании иммунного ответа организма на вирусные и бактериальные инфекции, и мультилокусный межмикросателитный анализ (ISSR-фингерпринтинг), позволяющий оценивать уровень полиморфизма генома в целом.

Цель и задачи исследования. Целью данного исследования было изучение генетического разнообразия пород КРС и их дифференциация на основе ДНК-полиморфизма гена BoLA-DRB3 и ISSR-анализа. Для достижения указанной цели были поставлены следующие нижеперечисленные задачи:

I Провести сравнительный анализ аллельного разнообразия гена BoLA-DRB3 у четырех пород КРС: у ярославской, монгольской, немецкой черно-пестрой пород и у иранской породы Систани.

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА

2 Оценить характер распределения аллелей гена BoLA-DRB3, ассоциированных с болезнями, в исследованных породах КРС.

3. Провести сравнительный анализ спектров ISSR-полиморфизма у исследованных пород с использованием двух типов праймеров: (GA)9C и (AG)9C и охарактеризовать генетическое разнообразие исследованных пород на основе ISSR-маркеров.

4 Изучить возможность использования (GA)9C-ISSR- и (AGbC-ISSR-MapKepoB для дифференциации исследуемых пород.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые проведен сравнительный анализ аллельного разнообразия гена BoLA-DRB3 у четырех пород КРС (ярославской, монгольской, немецкой черно-пестрой и иранской породы Систани) и показано, что исследованные породы различаются как по спектру аллелей, так и по их частотам У российской ярославской (35 аллелей) и иранской породы Систани (33 аллеля) отмечено высокое разнообразие спектра аллелей по данному локусу.

Для ярославской породы отмечено также низкое содержание аллеля BoLA-DRB32*23, ассоциированного с высоким риском заболеваемости маститом, и высокое содержание BoLA-ОЯВЗ-аллелей, ассоциированных с устойчивостью к лейкозу, что указывает на генетическую устойчивость данной породы к указанным заболеваниям. Типирование BoLA-DRB3-anneneti устойчивости к лейкозу и маститу имеет практическую значимость, поскольку обеспечивает возможность отбора устойчивых к лейкозу и маститу племенных животных

Впервые в России метод ISSR-анализа использован для сравнительного анализа геномного полиморфизма пород КРС. При анализе 270 особей из четырех пород КРС с использованием (GA),C-ISSR- и (AG)9C-ISSR-MapKepoB идентифицировано 43 полиморфных ДНК-фрагмента. Исследованные породы различались как по наличию/отсутствию отдельных фрагментов в ISSR-спектрах, так и по их частотам.

Впервые на основе кластерного анализа и метода главных компонент показано, что GA- и AG-ISSR-маркеры имеют разный уровень разрешающей способности и должны использоваться для решения различных задач. Менее полиморфный GA-ISSR-MapKep(ll фрагментов) пригоден для дифференциации пород КРС, в то время как более полиморфный AG-ISSR-маркер информативен при изучении

внугрипородного полиморфизма и дифференциации отдельных стад, семейств, линий.

Апробация работы. Основные результаты диссертации представлены на 15 международных и Всероссийских конференциях, в том числе на следующих профильных конференциях: 29-й Международной конференции по генетике животных (Токио, Япония, 2004), третьем национальном конгрессе по биотехнологии (Машхад, Иран, 2003), Международной научной конференции по современному состоянию проблем достижений в области генетики и селекции (Алматы, Казахстан, 2003), III Международной конференции Вавиловского общества генетиков и селекционеров "Генетика в XXI веке" (Москва, Россия, 2004), Международных конференциях Иранских исследователей в Европе (Кембридж, Англия, 2003 и Манчестер, Англия, 2004), Международном конгрессе по животным (Тегеран, Иран, 2004), третьем конкурсе молодых ученых (Москва, 2003), Международной Ирано-Российской конференции "Сельское хозяйство и природные ресурсы" (Шахрекорд, Иран, 2004), Международной конференции по новым информационным технологиям в медицине, биологии, фармакологии и экологии (Крым, Украин, 2003), Конференции по современным проблемам генетики, биотехнологии и селекции (Харьков, Украина, 2003), третьем Московском международном конгрессе Биотехнологии- "Состояние и перспективы развития" (Москва, Россия, 2005) и других.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 20 печатных работ. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 193 наименований. Работа содержит 13 таблиц и 19 рисунков.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Дифференциация пород КРС по аллелям гена В01А-1ЖЪЗ. В данной работе аллельный полиморфизм гена ВоЬА-ОКВЗ, который в основном определяется вариабельностью экзона 2, использовали для анализа генетического разнообразия и

дифференциации пород КРС. Характер распределения аллелей гена изучали в ярославской (п = 120), монгольской (п = 53), немецкой черно-пестрой (п = 32) и иранской Систани (п=65) породах КРС. Типичные картины электрофоретического разделения продуктов рестрикции представлены на рис. 1

* - -тщтт тЩ &

- ЧЛЦрЛч.-*** - я* §

г гЛ - • а. ¿т >-' ъ**.-

ш:«'^ -- ДО/ИЬ Ь* М М50М1 %

- ¿Л . &Т « „ т?, *

Рис.1. Рестрикционный анализ продукта« амплификации ткзона 2 гена ВоЬЛФЯВЗ « 9%-ном полиакриламидном геле. Обработка рестриктазой Яга/ и ХНоП. В качестве маркеров молекулярного размера исполыовали М$р1-фрагменты плазмиды рВИ322 (М1) и М50. Размеры полученных /Ьа/ - и ХкоП - фрагментов указаны рядом с фрагментом. Внизу указаны варианты ДНК-паттернов.

Исследованные породы различались как по спектру аллелей гена ВоЬА-ОЯВЗ, так и по распределению их частот (табл. 1). Наиболее высокое разнобразие спектра аллелей гена ВоЬА-ОЯВЗ (35 аллелей) было показано для ярославской породы. У монгольской породы выявлено 17 аллелей, у черно-пестрой породы - 29 и у иранской породы Систани - 33 аллеля. Для ярославского скота отмечен неоднородный профиль частот аллелей: на долю пяти фЯВ3 2*12, */3, *15, *24 и *28) из 35 выявленных аллелей приходится 51.6%. Наиболее широко представлены аллели РЯВ3.2*24 и *28 (14.7% и 14,4% соответственно). Более наглядно распределение аллелей представлено на рис. 2.

Таблица 1.

Частоты встречаемости аллелей гена Во1А-ЬКВЗ в исследованных породах КРС

1 1 12 13 14

Аллели. лссопин|1у1бщнеся с чувстмтльиоетью к лейкозу

Р Р Р Р

3 2.53 0-76

8 0.94 2.53 - 21.37

16 4.37 8.86 1.37 1.53

22 2.18 3.80 1.37 О

24 14.68 8.86 1.37 2.29

Аллсли. ассоциирующиеся с устойчивостью к лейкозу

11 0.31 6.33 - 5.34

23 3.43 - _ 1.53

28 14.37 3.80 Ю.96 О

АллелпмивП1Р*львьк по отношению к лейкозу

1 - - 4.11 1.53

2 1.25 - - 0,76

4 - - - 0,76

5 - 1.26 - ..

6 0.63 2.53 - 0.76

7 - 2.53 Ю.96 0.7«

9 - 2.53 - 0.76

10 1.87 3.80 - 11,45

12 8.43 6.33 -

13 7.81 7.59 - -

14 3.43 1.26 - -

15 6.25 5.06 - 3,05

17 О.31 - - _

18 1.25 - 13.70 0,76

19 - - - О. 76

20 1.25 - ».5» 9.92

21 0.31 - 2.74 0.76

25 0.62 1.26 - 0,76

2« 1.25 1.26 5.48 1,53

27 0.62 - _ 0.76

29 - 1.26 9.59 4,58

30 _ - - -

31 4.37 _ 1.37 2.29

32 0.93 3.80 _

33 031 - _ -

34 - - 4.11 6.87

35 - - 1.53

36 1.25 - 4.11 0.76

37 О.62 - - -

38 - - - -

39 - - - 0.76

40 3.75 - _ 1,53

41 _ - _ -

42 2.81 2.53 - -

43 0-31 _ 5.48 -

44 3.125 2.53 _ 4,58

45 - - -

4« - - 6.85 2,29

47 - 1.26 - 0,7«

48 0.93 1.26 - 1.53

49 3.80 6.85 -

50 0.62 - - -

51 2.5 6.33 - 4,58

52 _ 2.53 - -

53 _ 1.26 - -

54 0.93 1.26 - -

Примечания: 1 - ярославская порода (п=120), 2 - черно-пестрая порода (п=32), 3 - монгольская порода (п=53) и 4 - иранская порода (п=65). Номенклатура аллелей гена ВоИ-ОКВЗ дана в соответствии с данными, приведенными на сайте кЩ>://уппу. рго!есЫ. го$Нп. ас. ик/Ьо1а/с1гЬЗрсг. Ыт1 Ошибка частот аллелей (Р) не превышала 5%. п - количество исследованных животных

Ирам екая.Си стяни (п ■ 120), Р<54

Мокгояьсхая (п-50), Р<5% 1

-20

Чарко41аори - 35), Р<5% -11

Яроснвспя (п - 120), Р<54

Рис. 2. Частоты аллелей ВоЬА-ОЯВЗ в ярославской, монгольской, черно-пестрой и иранской породе Систани КРС. Черным сектором обозначена доля аллелей, частота которых не превышала 5%.

В черно-пестрой породе наиболее распространены аллели Во1А-ОЯВЗ 2*11, *12, *13, */5, *1б, *24 и *51, частота которых составила 6.3%, 6.3%, 7.6%, 5.1%, 8.9%, 8.9% и 6.3% соответственно. На долю семи из 29 выявленных аллелей приходится 49.4%. Характер распределения частот аллелей более равномерный. Частота наиболее широко встречающихся аллелей не превышает 9% (рис.2).

Для монгольской породы отмечен обедненный спектр разнообразия аллелей (всего 17 аллелей), но при этом для этой породы характерен относительно равномерный профиль распределения частот аллелей (рис.2). С частотой выше 5% в этой породе представлены аллели ВоЬА-йНВЗ 2*7, *10, *20, "26, *28, *29, *43, *4б, и *49 с частотами 11%, 13.8%, 9.6%, 5.5%, 11%, 9.6%, 5.5%, 6.9% и 6.9% соответственно (сумма: 72.6%). Наиболее часто встречается аллель ВоЬА-ОЯВЗ 2*7 (~11%). Широко представленные в монгольской породе аллели (ВоЬА-ОЯВЗ 2*7, *!0, *20, и *29) относятся к редким аллелям или не отмечены в черно-пестрой и ярославской породах (табл 1). Напротив, самый распространенный у ярославской

б

породы аллель DRB3 2*24, у монгольской породы относится к редким аллелям (частота - 0,013). Остальные аллели выявлены с частотами ниже 5%.

Для иранского скота показан высокий уровень аллельного разнообразия (33 аллеля) и неоднородный профиль частот аллелей На долю восьми (DRB3 2*8, *10, *11, *20, *29, *34, *44 и *51) из 33 выявленных аллелей приходится 68.2%. При этом суммарная частота всего трех аллелей DRB3 2*8, *10 и *20 (21.2%, 11.4% и 9.9% соответственно) составила более 42%. Широко представленный в иранской породе (Bos indicus) аллель BoLA-DRB3.2*8 относится к редким аллелям или не отмечен в трех других исследованных нами породах

Достоверные различия (Р>95%) для всех исследованных нами пород отмечены по частотам следующих аллелей- BoLA-DRB3 2*7, *8, *10, *11, *12, *13, *15. *16, *20, *24, *2б, *28 *29, *34, *43, *44, *4б, *49, и *51. Доля редких аллелей (с частотой ниже 5%) в трех изученных породах составляет 50,6% у немецкой черно-пестрой породы, 48.4 у ярославской, 31.8 у иранского и 20.6% у монгольского скота. Высокое содержание редких аллелей свидетельствует о сохранении резерва изменчивости в черно-пестрой и ярославской породах, что способствует поддержанию полиморфизма по маркерам гистосовместимости, необходимого для сохранения способности популяции к адекватному иммунному ответу на чужеродные антигены.

Уровень гетерозиготности (Но) в черно-пестрой, иранской, ярославской и монгольской породах составил 0.77, 0.68, 0 66 и 0.64 соответственно. У черно-пестрой породы уровень гетерозиготности выше, чем в других породах (Но = 0.770), но во всех случаях наблюдаемый уровень гетерозиготности был существенно ниже ожидаемого (Не): 0,97 у черно-пестрой породы и 0,93 у остальных исследованных пород В изученных нами породах мы наблюдали недостаток гетерозигот

Учитывая литературные данные о породах и природных популяциях, полагаем, что для искусственно разводимых популяций следует поддерживать высокий уровень гетерозиготности и разнообразия по локусам гистосовместимости для повышения устойчивости популяций к заболеваниям, что важно также в свете проблем по сохранению генофондов аборигенных пород КРС К сожалению, в последнее время

количество аборигенных пород резко сократилось Около 50% пород домашних животных относятся к разряду исчезнувших или исчезающих Аборигенные породы являются достоянием культуры народа и нуждаются в охране и сохранении как для сохранения биоразнообразия, так и для поддержания гарантированных источников продовольственных ресурсов. Ранее было показано, что в природных популяциях происходит отбор в сторону избытка гетерозиготных животных по маркерам главного комплекса гистосовместимости, что обеспечивает распознавание более широкого спектра чужеродных антигенов (Hughes et al., 1989). Таким образом, можно предполагать, что коровы, гомозиготные по маркерам гистосовместимости, имеют больший риск к развитию персистентного лимфоцитоза и мастита, широко распространенных заболеваний КРС, за счет сужения спектра распознаваемых чужеродных антигенов.

Распределение аллелей гена BOLA-DRB3, ассоциированных с болезнями, в исследованных породах КРС. Аллели BoLA-DRB3 2*11, *23 и *28 ранее были выявлены как аллели, определяющие устойчивость КРС к лейкозу (Xu et а!, 1993). В монгольской породе аллели BoLA-DRB3 2*11 и *23 отсутствовали, но аллель BoLA-DRB3 2*28 встречался с высокой частотой 10.96%. У черно-пестрой породы BoLA-DRB3 2*23 отсутствовал, a BoLA-DRB3 2*28 встречался с низкой частотой 3.8% Аллель BoLA-DRB3.2*28 встречался у трех пород, но отсутствовал у иранской породы. Этот аллель является редким и в черно-пестрой породе (р = 0 038). Среди изученных пород самое высокое содержание аллелей, определяющих устойчивость к лейкозу, отмечено у ярославской породы. Суммарная частота аллелей устойчивости у этой породы составила 18,1%, что почти в 3 раза превышает их содержание у иранской породы Систани (6,9%) и более чем в 1,5 раза превышает их содержание у немецкой черно-пестрой (10.1%) и монгольской пород (11%). В литературе высокое содержание аллелей устойчивости к лейкозу ранее было показано для голштинского (21,9-29,7%) и канадского джерсейского скота (19,8%), а также у русской черно-пестрой породы (18,9%).

Аллели BoLA-DRB3 2*3, *8, *16, *22 и *24, ранее были выявлены как аллели, ассоциированные с чувствительностью к лейкозу (Xu et al., 1993; Удина и др, 1998).

Высокое содержание аллелей чувствительности к лейкозу было отмечено для немецкой черно-пестрой (26,6%) и иранской (26%) пород КРС. Несколько ниже содержание аллелей чувствительности к лейкозу у ярославского скота (22,2%) У монгольского скота аллели чувствительности к лейкозу встречались у единичных особей (4,11%). Такое низкое содержание аллелей чувствительности к лейкозу ранее было отмечено только у джерсейской породы (2,6 и 3,5% по разным источникам). Следует отметить, что в целом для исследованных нами пород характерно относительно невысокое содержание аллелей, ассоциированных с чувствительностью к лейкозу (табл. 1). Так, по литературным данным содержание аллелей чувствительности к лейкозу у голштинского скота в разных выборках варьировало от 47,0 до 67,4%. Голштинская и голштино-фризская породы относятся к породам с наиболее высокой молочной прордуктивностью и широко используются в селекции для повышения продуктивности местных пород КРС. Не удивительно, что использование в качестве производителей быков голштинской породы при направленной селекции на повышение молочной продуктивности параллельно с положительным процессом повышения молочной продуктивности приводит к накоплению аллелей гена BoLA-DRB3, ответственных за чувствительность к лейкозу, и соответственно, к распространению лейкоза в стадах КРС. Очевидно, что проведение такой селекции нуждается в постоянном контроле за накоплением «вредных» аллелей с использованием ДНК-маркеров и все быки-производители должны быть типированы по гену BoLA-DRB3

Все исследованные нами животные были предварительно тестированы на наличие вируса лейкоза КРС (BLV) с использованием реакции иммунодиффузии (РИД) и все они были РИД-отрицательными, те не являлись вирусоносителями. Однако этот метод выявляет вирусоносительство только, когда вирус активизируется, т.е. происходит синтез вирусных белков, но не выявляет провирусную ДНК. ПЦР-тестирование считается более чувствительным методом, поскольку позволяет выявлять провирусную ДНК.

Нами был проведен ПЦР-анализ на наличие провирусной ДНК с использованием двух пар праймеров: к гену gag BLV и гену pol BLV для повышения достоверности получаемых результатов. Среди исследованных животных

ярославской, монгольской и иранской пород вирусоносителей не было обнаружено. В выборке немецкой черно-пестрой породы оказалось около 14% вирусоносителей

В связи с этим уместно вспомнить, что в немецкой черно-пестрой породе нами было обнаружено самое высокое содержание BoLA-DRB3 аллелей, ассоциированных с чувствительностью к лейкозу (26,6%) Не исключено, что широкое распространение аллелей гена BoLA-DRB3, ассоциированных с чувствительностью к лейкозу, в черно-пестрой породе способствует распространению в ней и вирусоносительства.

Другой широко распространенной болезнью КРС является мастит. Выявлены аллели гена BoLA-DRB3, ассоциированные с низкой или высокой степенью риска заболеваемости маститом. Аллель BoLA-DRB3 2*16 ранее выявлен как аллель, ассоциированный с низкой степенью риска к маститу, а аллель BoLA-DRB3.2*23 выявлен как фактор высокого риска к маститу (Alizadeh et al, 2003, Maillard et al., 19%, Sharif et al., 1998, 2000, 2003). К сожалению, эти же аллели ассоциированы с развитием лейкоза, но с противоположной направленностью. Аллель BoLA-DRB3.2*16 является «благоприятным» при селекции на устойчивость КРС к маститу, но «неблагоприятным» при селекции на устойчивость к лейкозу Напротив, аллель BoLA-DRB3 2*23, ассоциированный с устойчивостью к лейкозу, является фактором высокого риска заболеваемости коров маститом.

Аллель BoLA-DRB3.2*16 встречается у всех чытырех пород, но у ярославской и черно-пестрой пород со средней частотой (4.4% и 8.9% соответственно), а у монгольской и иранской пород с низкой частотой (1.4% и 1.5%) Аллель BoLA-DRB3.2*23 в монгольской и черно-пестрой породах отсутствует, а в ярославской и иранской породах является редким (3.4% и 1.5% соответственно). Таким образом, все исследованные породы являются относительно благополучными в отношении мастита.

В заключение следует отметить, что поддержание высокого уровня гетерозиготности и разнообразия по локусам гистосовместимости, в особенности по частотам аллелей гена 5oL4-DRB3, ассоциированных с болезнями, необходимо не только для сохранения разнообразия генофондов пород КРС, но и для повышения их устойчивости к таким широко распространенным заболеваниям, как персистентный

лимфоцитоз (лейкоз), вызываемый вирусом лейкоза КРС, и различные формы мастита.

Дифференциация пород КРС с использованием молекулярного мультилокусного анализа (КвЯ-анализ). Для оценки межпородного и внугрипородного генетического разнообразия пород КРС и их дифференциации нами был использован анализ межмикросателлитного полиморфизма - ^Я-анализ (КЗИ-фингерпринтинг). Этот метод относится к методам молекулярного мультилокусного анализа, который позволяет одновременно оценивать полиморфизм десятков локусов (до 30 локусов и выше) и более информативен для оценки уровня генетического разнообразия генофондов, чем локус-специфические маркеры. 18811-маркеры относятся к мало изученным маркерам, особенно у сельскохозяйственных животных и, в частности, у КРС Поэтому в данной работе было не только изучено генетическое разнообразие исследуемых пород КРС по ^БЛ-маркерам, но и проведен сравнительный анализ информативности двух типов 188Я-маркеров, использованных в работе: ОА-18811-маркер, полученный на основе амплификации ДНК с праймером (вА^С, и АО- ^Я-маркер, полученный на основе амплификации ДНК с маркером (АО)дС. В силу того, что ¡ЗБЯ-маркеры согласно опубликованным ранее работам обладают высокой разрешающей способностью мы рассматривали отдельно две выборки ярославского скота, полученные из двух разных хозяйств: «Михайловское» (Яр1) и Горшиха (Яр2) Мы полагали, что сравнительный анализ двух выборок одной породы позволит оценить дифференцирующую способность используемых маркеров.

Спектры ВБК-полиморфизма у КРС. У всех исследованных пород спектры ампликонов, полученных с разными праймерами, резко отличались друг от друга (рис.3). Использование праймера (АО)9С позволяло получать более широкий спектр ампликонов по сравнению с праймером (ОА)9С.

Ярославская порода

Рис.3. Элеюпрофореграмма в 2%-ном агарозном геле продуктов амплификации образцов ДНК животных ярославской породы методом ISSR-ПЦР. М - маркер молекулярных масс (GeneRuler™ 100 bp DNA Ladder Plus, MBI Fermentas, Lithuania).

Спектры ампликонов у разных пород, полученных с использованием одного и того же праймера во многом имели сходный характер, что позволило провести сравнительный анализ разнообразия спектра полученных ампликонов и частот встречаемости отдельных фрагментов (локусов). Для GA-ISSR-маркера в исследованных породах всего было тестировано 11 фрагментов, рассматриваемых как отдельные локусы; AG-lSSR-маркер позволял тестировать 32 локуса (табл. 2).

По среднему числу фрагментов на особь для GA-ISSR-маркера черно-пестрая и ярославская породы не отличаются друг от друга. Достоверные различия (0,0<Р<0,02) по этому параметру были выявлены между азиатскими (монгольская и иранская) и европейскими (черно-пестрая и ярославская) породами. При этом монгольская и иранская породы не отличались друг от друга по среднему числу фрагментов на особь.

Таблица 2

Характеристика исследованных пород по GA-ISSR- и AG-lSSR-маркерам

ПорШ Пртймгр OSttttt числе фрЯГМСЯТМ BtdBfrpe Средам« tec* фрагяеатмм «eiw Дм» мламврф-Mui mestm Гмервш-rimm{i№ Stephe««) Котффншшгг •H.vipatjnn- ммгаешстм

Яр) 5 MM,17 M5S OJtt 0JS37

Яр! (САЬС 5 ■U?±0,I7 M5i 0,320 0320

Ч-П (GAfet: i 4.79Ш7 (¿36 0.398 0,725

Cut (GAfcC 9 3,60*0,14 0J18 0,329 6.786

Мм (САЦС 5 3,51*0,25 0<I55 0Д82 9,620

Son: 11

Яр1 (AG>£ 25 Щ741Д9 0,781 <MI3 04155

Яр2 |AC)»C 25 wi 0,781 0.548 W91

Ч-П (АСУС 23 mn>j6 9,719 0.492 ода

С« (ACУС 30 10*7*0,34 9.938 0.568 0..Ч1

Мм (ACfcC 24 9,7» 0429 M73

Внг№ 32

Примечания: Яр 1 - выборка ярославской породы КРС из хозяйства СПК ОПХ «Михайловское» Ярославской области (п=60); Яр 2 - выборка ярославской породы КРС из хозяйства «Горшиха» Ярославской области (п=60); Ч-П - немецкая черно-пестрая (п-32); Cue - иранская порода Систани (Bos indicus) (п=65); Мон - монгольский скот (п=53). Среднее число фрагментов на особь и гетерозиготность (по Stephens) рассчитывали с использованием пакета программ «STATIST1CA 6.0»

Высокие значения коэффициента внутригруппового сходства и низкий уровень гетерозиготности (табл.2) указывают на низкий уровень GA-ISSR-полиморфизма у всех исследованных пород, что, по-видимому, связано с высоким давлением искусственного отбора По этим показателям достоверно отличается от всех остальных пород только монгольский скот.

По локусам, тестируемым AG-ISSR-маркером, уровень гетерозиготности существенно выше, чем по GA-ISSR-маркеру, и у монгольского скота приближается к значениям, характерным для природных популяций (таб. 2) Значения коэффициентов группового сходства по этому маркеру также существенно ниже, чем аналогичные коэффициенты по маркеру GA-ISSR.

Дифференциация пород КРС по СА-ГввН-маркеру. Исследованные породы различались как по наличию/отсутствию отдельных фрагментов в ОА-КЗЯ-паттерне, так и по их частотам (табл. 3). Пять типов фрагментов (2, 4, 5, 7 и 8) присутствуют во всех исследованных породах и различаются только по частотам.

Таблица 3

Частоты встречаемости фрагментов для ^С^оС-И^Л в выборках крупного рогатого скота

№ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Япершы рхмсрм Фтгксти 30001700 16001400 13501»» 12401150 11401000 990800 640-53» 520-475 470400 350-235 230-170

Яр1 0,000 0,917* 0,036 ода 0Д50± 0,046 од?з± 0,048 0,000 II «,933± 0,032 0,000 0,000 0,000

Яр2 (МЮ0 ода± 0,042 0,000 0,850* 0,046 0,733± 0,057 0,000 0,950± 0,028 0,950± 0,028 0,000 0,000 0,000

Ч-П 0,536± 0,094 0,&21± 0,072 0,000 0,821± 0,072 0,750± 0,082 0,000 0,964± 0,035 0,857± 0,066 о,ш 0,035 0,000 0,000

Сис 0,000 0392± 0,039 0,015± 0,015 0339± 0,059 Оу339± 0,059 0,015± 0,015 0,969± 0,021 0,954± 0,026 «,000 «,062± 0,030 0,§15± 0,115

Мон 0№ 0,750± 0,060 0,000 0,615± 0,068 озоо± 0,069 0,000 0,865± 0,047 0,84б± 0,050 0,000 0,000 0,000

Примечания: как и для табл.2.

Остальные шесть фрагментов представлены только в одной из пород. Генофонд иранской породы Систани отличается от всех других пород - для этой породы выявлено четыре GA-ISSR-маркера (3, 6, 10 и 11), не встречающиеся в других исследованных нами породах. Иранская порода относится к другому виду -Bos indicus. Не исключено, что эти маркеры являются специфичными для зебувидного скота.

Профили частот фрагментов GA-ISSR-спектров у исследованных пород представлены на рис.4.

-чиЯр.1

Яр-2

-*- чцм-а - Сметам

о Монгол

1 2345$7в9 10 11

Рис. 4. Профили частот встречаемости фрагментов GA-lSSR-спектров у исследованных пород крупного рогатого скота. Яр.1 - выборка ярославской породы КРС из хозяйства СПК ОПХ «Михайловское» Ярославской области; Яр.2 - выборка ярославской породы КРС из хозяйства «Горшиха» Ярославской области; Черн.-П. - немецкая черно-пестрая; Систани - иранская порода Систани (Bos indicus); Монгол. - монгольский скот.

Близкий профиль частот фрагментов (за исключением фрагментов 1, 4 и 5) указывает на слабую подразделенность пород., что подтверждается и полученными нами низкими значениями Fst (менее 0,07).

Частоты GA-ISSR-фрагментов использованы для построения дендрограммы генетических расстояний исследованных пород КРС (рис. 5).

Две выборки ярославской породы КРС не различаются и кластеризуются с немецкой черно-пестрой породой. Азиатские породы (иранская и монгольская) образуют второй кластер. Азиатские породы проявляли сходство и по другим параметрам (табл. 2), что указывает на общие черты организации их генофондов, выявляемые GA-ISSR-маркером.

Чера-П

ЩЛ

Я|>2

до»

Ц

nm

Рис. 5. Дендрограмма генетических различий выборок пород КРС, построенная по частотам встречаемости GA-ISSR-фрагментов методом UPGMA на основе расстояний Нея (1978). Яр I - выборка ярославской породы КРС из хозяйства СПК ОПХ «Михайловское» Ярославской области (п=60); Яр 2 - выборка ярославской породы КРС из хозяйства «Горшиха» Ярославской области (п=60); Ч-П - немецкая черно-пестрая (п-32); Cue - иранская порода Систани (Bos indicus) (п*65); Мон- монгольский скот (п=53).

Дифференциация пород КРС по AG-ISSR-маркеру. Исследованные породы, как и в случае с GA-ISSR-маркером, различались по наличию/отсутствию отдельных фрагментов в AG-ISSR-паттерне и по частотам фрагментов (табл. 4) Основная часть фрагментов (21 фрагмент, более 65%) присутствуют во всех исследованных породах и различаются только по частотам. Фрагменты 1 и 32 присутствуют только у иранской породы Систани, фрагмент 3 представлен только у черно-пестрой породы, а фрагмент 4 - только у ярославской породы КРС.

Таблица 4

Частоты встречаемости фрагментов для (AG),C-ISSR в исследованных выборках КРС.

Ä 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Игтероли рпкрсв фраптпм 28103101 2710.2900 2619-2700 2510-2600 2310-2506 2210-2306 2110-2200 1910-2100 imo.i9oo 1710-1800

Яр1 мм 04№ 0,016 т im 0.028 •4M 0,1131 0,050 0,1171 0,041 «,2171 0,053 0.05Я 0,028 M5U 0,028

Яр2 мм «4M т О^ЗЬ 0,023 «4331 0,023 М671 0,032 «,15Ь 0,04« оде 0,052 04M «^171 0,016

Ч-П мм 0,9М M7I1 0,049 олм № т «,l«7* 0.058 «43fc 0,035 0,«3ii 0,035 «4M

CIK «4зи ода 0,0161 0,015 J w 0,000 М№ 0,015 0,016± 0,015 «462* 0,030 II ода 0,034 оля 0.052

Моя мм «4M мм «4M т ми Mlfe 0,018 М» 0,019 MM 0,3021 0.063

II 12 13 14 Ii 16 17 1t 19 2« 21

IUM7N ISIMM 1410-15Ю 13I0-1W 1210-1301 1110-11« 1950-1 IM 1019-1Ы9 910-100« ШЛИ «JV-IW ■пш

II» 0,041 «¿17* 0,064 «,l«fc 0,039 «,4»71 0,064 0,4331 0,064 0J171 0,060 IUI7* 0.060 II Ii im 0,060 Wh 0,062

«,«671 0,032 «,30fe 0,059 0,4171 0,064 Ii M171 0,0« 0J471 0,062 Ü «¿17* 0,063 (ЦЗЙ 0,061 Ii «¿171 0,063

0,1431 0,066 «¿211 0.088 0J5te 0,082 «,1431 0,066 8,4641 0,094 ijsh 0,082 «,«711 0.049 (1,7141 0,085 6,17» 0,072 9,4641 0.094 II

0J«3* 0,050 0J5«b 0,054 «,l!7i 0,049 «,1411 0.943 0J121 0,058 032b 0,059 || «3941 0,061 si Ii II

ii «,1131 0,043 0,2*31 0,062 II II II 0.34H 0,065 6,5851 IS Ш1 0,065 0,065

22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32

710-710 610-650 550400 500-540 45M90 390410 310-340 260-3M 220-250 100-210

0,000 «¿171 0,036 i| 9,ОД 0,039 1,009 0Л71 0,036 03171 0.060 «4M I4M «4671 0,032 «4M

0JM Wk 0,060 М5Ш 0,056 «¿171 0.050 9,9831 0,016 04331 0,048 «¿671 0,064 «4M Ii «¿831 0,063 «4M

0,03*1 0,035 «Л2И 0,072 14291 0,093 «¿431 0,091 14M 04571 0,066 «J57i 0,091 «4M «¿291 0,049 «,1791 0,072 «4M

tfm 0,062 0,7191 0.056 tm 0,062 US3i 0,026 II 0,7511 0,054 «*9l 0,062 0,2341 0,053 «¿37* 0,030 «¿941 0,061 «¿911 0.061

04571 0,032 «„ОД 0,069 ода 0,057 «¿301 0,052 Ц9241 0,036 0,6791 0,064 «¿21* 0,064 «j07l 0,056 «,774i 0,057 0,2971 0.056 «4M

Примечания: как и для табл.2.

Наиболее гетерогенными оказались фрагменты 10 (х*= 19,1), 14 (х2 = 14,5), 17 (х2 = 17,4), 22 (х2 = 61,4), 23 (х2 = 20,5), 25 (х2 = 15,0) и низкомолекулярные фрагменты 29-32 (значение х2 - от 23,6 до 50,6) Высокий полиморфизм маркера Ав-КвЯ позволяет различать между собой две выборки ярославского скота Они достоверно различаются по среднему числу фрагментов (Р=0,003) и среднему групповому сходству (Р=0,003).

Высокий уровень полиморфизма АС-^ЗЯ-марксра увеличивает его разрешающую способность и делает его пригодным для внутрипородного маркирования (дифференциация линий, семейств)

Характеристика (СА),С-^!*- и (АС^С-Н&И-маркеров и возможности их использования для дифференциации пород КРС. При проведении 18811-маркирования с использованием (ОА)9С- и (АО)9С-праймеров было получено 11 и 32 полиморфных фрагмента соответственно Каждый из фрагментов можно рассматривать как отдельный маркер, представляющий собой нуклеотидную последовательность, заключенную между двумя инвертированными микросателлитными повторами. Индивидуальные 188К-маркеры (представленные отдельными фрагментами 18811-спектра) могут быть локализованы в областях генома с разной функциональной нагрузкой, это могут быть гены или межгенные области. Неоднозначность функциональной нагрузки индивидуальных 18811-маркеров затрудняет их использование как генетических маркеров, осложняет статистическую обработку данных и трактовку полученных результатов.

Для оценки вклада индивидуальных полиморфных фрагментов в общую картину анализа геномного полиморфизма пород КРС мы использовали многомерный статистический анализ - метод главных компонент. Данный анализ проводился совместно с к.б.н. Лазебным О.В. для вА- и АО-188Я-маркеров. Проведена оценка вклада индивидуальных маркеров в каждую из главных компонент и получена проекция исследованных пород на плоскости главных компонент. Для ОА-188Я маркера выделены три главных компонента. Проекция наблюдений на плоскость главных компонент 1 и 2 представлена на рис 6. Обе выборки ярославской породы располагаются рядом.

-4-3-2-10 1 Главный компомнт 1:56.61%

Рис. 6. Расположение проекций наблюдений на плоскость первых двух главных компонент, основанных на GA-ISSR-анализе исследуемых пород КРС. Яр] - выборка ярославской породы КРС из хозяйства СПК ОПХ «Михайловское» Ярославской области; Яр2 - выборка ярославской породы КРС из хозяйства «Горшиха» Ярославской области; ЧП - немецкая черно-пестрая; Cue-иранская порода Систани (Bos indicus); Мон -монгольский скот.

Для Ав-^ЗЯ маркера выделены четыре главных компонента. Данный маркер хорошо дифференцирует две разных выборки ярославского скота (рис.7). Это свидетельствует о том, что АО-ГвЗЯ-маркер более пригоден для дифференциации внутрипородных, чем межпородных различий.

J Мон 0 г— ' > ....... 1 ' Ч ' ЧП О *

Оке О .......... Ill 1 . 1 1 1 ............................ ........ Г......,м.||...............-.................. 1 II.

-6

-2 0 2 4 Главный компонент 1:40.25%

Рис. 7. Расположение проекций наблюдений на плоскость первых двух главных компонент, основанных на AG-ISSR-аналте исследуемых пород КРС. Яр J - выборка ярославской породы КРС из хозяйства СПК ОПХ «Михайловское» Ярославской области; Яр2 - выборка ярославской породы КРС из хозяйства «Горшиха» Ярославской области; ЧП - немецкая черно-пестрая; Cue - иранская порода Систани (Bos indicus); Мон - монгольский скот.

Следует отметить, что нами впервые проведен сравнительный анализ дифференцирующей способности двух типов КБИ-маркеров. В исследованиях полиморфизма различных видов и сортов растений, где наиболее широко используется ГЭЗК-анализ, не предпринимались попытки сравнительной оценки конкретных маркеров. Как правило, авторы ограничивались оценкой числа

фрагментов в ISSR-спектрах, их размеров и доли полиморфных фрагментов (Храпалова и др., 2001; Кочиева и др., 2002, Gupta et а!., 1994, Neve et al., 2000, Zietkievicz et al., 1994). Работы no lSSR-маркированию KPC ограничены двумя публикациями (Глазко и др., 1999, Городная, Глазко, 2003) и в этих работах попытки анализа дифференцирующей способности ISSR-маркеров также не предпринимались Тем не менее, мы полагаем, что такой анализ необходим для получения адекватных результатов при анализе межвидового и внутривидового разнообразия и, в особенности, при оценке генетических расстояний между исследуемыми популяциями. Особенно существенно это для искусственно разводимых популяций, в частности, для КРС, поскольку разные типы генетических маркеров могут подвергаться сильному и, возможно, разнонаправленному давлению искусственного отбора, например, по маркерам генов молочной продуктивности, устойчивости к различным заболеваниям и т п.

Проведенный нами анализ позволяет сделать заключение, что использованные нами GA- и AG-ISSR-маркеры имеют разный уровень разрешающей способности и должны использоваться для решения различных задач Менее полиморфный GA-ISSR-маркер (11 фрагментов) пригоден для дифференциации пород КРС, в то время как более полиморфный AG-lSSR-маркер (32 фрагмента) информативен при изучении внутрипородного полиморфизма и дифференциации отдельных стад, семейств, линий.

ВЫВОДЫ

1. Сравнительный анализ аплельного разнообразия гена BoLA-DRB3 у четырех пород КРС (ярославской, монгольской, немецкой черно-пестрой и иранской породы Систани) показал, что исследованные породы различаются как по спектру аллелей, так и по их частотам. Высокое разнообразие спектра аллелей по данному локусу отмечено у российской ярославской (35 аллелей) и иранской породы Систани (33 аллеля) по сравнению с немецкой черно-пестрой (29 аллелей) и монгольской (17 аллелей) породами.

2 Показана генетическая устойчивость ярославской породы к лейкозу и маститу, обусловленная высоким содержанием ВоЬА-ОИВЗ-аллелей, ассоциированных с устойчивостью к лейкозу и низким содержанием аллеля ВоЬА-ПЯВЗ 2*23, ассоциированного с высоким риском заболеваемости маститом Суммарная частота аллелей устойчивости к лейзозу у ярославской породы (18,1%) в 3 раза выше, чем у иранской породы Систани (6,9%), и в 1,7 раза выше, чем у немецкого черно-пестрого (10,1%) и монгольского скота (11%).

3. Идентифицировано 43 полиморфных ДНК-фрагмента на основе 18811-анализа 270 особей четырех пород КРС с использованием маркеров (СА)9С-188Я и (АО)9С-

Сравнительный анализ геномного полиморфизма у четырех пород КРС показал, что исследованные породы различаются как по наличию/отсутствию отдельных фрагментов в 188Я-спектрах, так и по их частотам.

4. Отмечены высокие значения коэффициента внутригруппового сходства и низкий уровень гетерозиготности для всех исследованных пород (кроме монгольского скота). По уровню внутригруппового сходства достоверно отличается от всех остальных пород монгольский скот, приближающийся по этому показателю к природным популяциям (0,62 для СА-18811-маркера и 0,47 для АС-158Я-маркера).

5. Выявлены достоверные различия (0,0<Р<0,02) по среднему числу фрагментов на особь для ОА-188Я-маркера между азиатскими (монгольская и иранская) и европейскими (черно-пестрая и ярославская) породами, причем внутри групп породы не отличались друг от друга по этому параметру.

6. Впервые на основе кластерного анализа и метода главных компонент показано, что йА- и АО-188И-маркеры имеют разный уровень разрешающей способности и должны использоваться для решения различных задач Менее полиморфный 6А-^Я-маркер (11 фрагментов) пригоден для дифференциации пород КРС, в то время как более полиморфный АО-188Я-маркер (32 фрагмента) информативен при изучении внутрипородного полиморфизма и дифференциации отдельных стад, семейств, линий.

Публикации по материалам диссертации

1 Mohammad Abadi М. R, Shaikhaev G О, Obydur R, Mozafari M R, Sulimova G E Detection of Bovine Leukemia Vim1; proviral DNA in Yaroslavl, Mongolian and Black Pied Cattle by PCR//Cellular & Molecular Biology Letters. 2004 V 9 N 4A P 766-768

2 Nassiry M. R, Eftekhar Shahroodi F, Mosafer J., Mohammad) A, Manshad E, Ghazanfari S, Mohammad Abadi M.R., Sulimova G. E Analysis and frequency of bovine lymphocyte antigen (BoLA-DRB3) alleles in Iranian Holstein cattle // Russian Journal of Genetics 2005 V 41 N 5.

3 Сулимова Г E , Мохаммад Абади M. Р., Хатами С Р , Удина И Г Молекулярно-генетические основы устойчивости крупного рогатого скота к персистснтному лимфоцитозу // Международная научная конференция "Новые информационые технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии" Материалы конференции Крым, Ялта, Гурзуф, Украина, 2003 С.34-36

4 Mohammad Abadi М. R., Sulimova G Е Polymorphism of the BoLA-DRB3 gene distinguished by PCR-RFLP in Mongolian and Black Pied cattle // In- Proceedings of the 3rd National congress of Biotechnology Mashhad, Iran, 2003, V 4. P 497-499

5. Mohammad Abadi M. R., Sulimova G E Polymorphism of the second exon of the BoLA-DRB3 gene in Mongolian and Black Pied cattle and resistance to leukemia // In Proceedings of the New Information Technologies in Medicine, Biology, Pharmacology and Ecology (IT+ME) Krim, Yalta, Gwzuf, Ukraine, 2003 P 49-51

6 Mohammadabadi M. R., Sulimova G E Diversity of BoLA-DRB3 alleles in Russian Yaroslavl cattle // In Proceedings of the 1st Congress on Animal & Aquatic Sciences Faculties of Agricultural & Natural Resoures, University of Tehran, Iran, 2004 P 835-838

7 Mohammadabadi M. R, Rakhmanaliev I, Sulimova G E Kappa-casein polymorphism m Yaroslavl cattle // In Proceedings of die 4ft International Iran and Russia Conference "Agricultural and natural Resources". 2004. Shahrekord, Iran, P 218-220

8 Мохаммад Абади M. P., Сулимова Г Е ДНК-полиморфизм гена BoLA-DRB3 у монгольского и черно-пестрого скота // Материалы международной научной конференции "современное состояние проблем генетики и селекции" Алматы, Казахстан, 2003 С 179-180

9 Mohammad Abadi М. R, Sulimova G Е Diversity and gene frequencies of Bovine Lymphocyte Antigene DRB3 2 locus in Mongolian cattle // Cellular & Molecular Biology Letters 2004. V 9. Suppl 2. P 42

10 Mohammad Abadi M. R., Sulimova G E Gene frequencies of Bovine Lymphocyte Antigene DRB3 2 locus m Yaroslavl Russian cattle // In Proceedings of the 29th International Conference on Animal Genetics (ISAG 2004/Tokyo) Tokyo, Japan, 2004 P 101

11 Мохаммад Лбадн М. Р., Сулимова Г Е Полиморфизм гена BoLA-DRB3 у ярославской породы крупного рогатого скота II Материалы научной конференции "Современное состояние и перспективы развития" III ВОГиС им Н И Вавилова, Москва, Россия, 2004 С 53

12 Мохаммад Абади М. Р., Сулимова Г Е Изучение полиморфизма гена BOLA-DRB3 методом ПЦР-ПДРФ у монголского и черно-пестрого скота // Материалы научной конференции "Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции" Харьков, Украина, 2003 С. 66

13. Mohammadabadi М. R., Sheikhaev G, Sulimova G Е Detection of Bovine Leukemia Virus proviral DNA in Yaroslavl and Black-and-White cattle by PCR // In Proceedings of the 12th Iranian Researchers Conference in Europe (IRCE 2004) Molecular Biosciences, Biotechnology and Genetics Group Manchester, England, 2004 P 242

14 Mohammad Abadi M. R., Sulimova G E Distribution of BoLA-DRB3 alleles typing by PCR-RFLP in Mongolian and Black Pied cattle // In Proceedings of the 10th Iranian Researchers' Seminar in Europe (IRSE 2003) Molecular Sciences & Biotechnology Gonvile and Caius College University of Cambridge. Cambridge, England 2003 P 37

15 Mohammadabadi M. R., Sulimova G E Diversity and gene frequencies of Bovine Lymphocyte Antigene DRB3 2 locus m Yaroslavl cattle II In Proceedings of the 12th Iranian Researchers Conference in Europe (IRCE 2004) Biology Group Manchester, England, 2004 P 328

16 Mohammadabadi M. R., Shaikhaev G, Sulimova G E Detection of Bovine Leukemia Virus proviral DNA in Yaroslavl and Black-and-White cattle by PCR // In Proceedings of the 12th Iranian Researchers Conference in Europe (IRCE 2004) Pure Sciences Group Manchester, England, 2004 P 343.

17 Mohammadabadi M. R., Sulimova G E Frequency of Bovine Lymphocyte Antigene DRB3 2 alleles in Mongolian cattle // In Proceedings of the 12th Iranian Researchers Conference in Europe (IRCE 2004). Agricultural and Natural Resource Science Group Manchester, England, 2004. P 22

18 Mohammadabadi M. R., Rakhmanaliev I, Sulimova G. E Kappa-casein polymorphism in Yaroslavl cattle // In- Proceedings of the 4th International Iran and Russia Conference. "Agricultural and natural Resources". Shahrekord/Iran, 2004. P. 61-62

19 Mohammadabadi M. R., Kovalenko T A, Nassiri M R, Sulimova G E Inter-Simple-Sequence Repeat (ISSR)-PCR for the identification of polymorphism in some native cattle breeds // In Proceedings of the З"' Moscow international congress Biotechnology state of the art and prospects of development Moscow, Russia, 2005 V 1 P. 282

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 23.03.2005 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл 1,5. Тираж 100 экз. Заказ 130 Тел. 939-3890. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.

№-5248

РЫБ Русский фонд

2006-4 3456

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мохаммад Абади Мохаммадреза

1.В ведение

2. Обзор литературы 5 2.1 .Структура, функции и полиморфизм главного комплекса гистосовместимости (гкг)

2.1.1.Главный комплекс гистосовместимости: история вопроса, функция, номенклатура

2.1.2.Структура главного комплекса гистосовместимости В 2.1.3 .Главный комплекс гистосовместимости крупного рогатого скота (BoLA) 11 2.1.4.Методы изучения главного комплекса гистосовместимости и полиморфизм генов класса II

2.2.Полиморфизм гена BoLA-DRB3 и его ассоциации с различными заболеваниями крупного рогатого скота 22 2.2.1 .Полиморфизм гена BoLA-DRB

2.2.2.Ассоциации BoLA-DRB3 с заболеваниями

2.3.Дифференциация пород крупного рогатого скота по ДНК-маркерам

3.Материалы и методы исследования

4.Результаты и их обсуждение 51 4.1.Дифференциация пород крупного рогатого скота по аллелям гена BoLA-DRB

4. 2.Распределение аллелей гена BoLA-DRB3, ассоциированных с болезнями, в исследованных породах крупного рогатого скота 59 4.3 .Дифференциация пород крупного рогатого скота с использованием молекулярного мультилокусного анализа 66 4.3.1.Спектры ISSR-полиморфизма у крупного рогатого скота 67 4.3 ^.Дифференциация пород крупного рогатого скота по GA-ISSR-маркеру

4.3.3. Дифференциация пород крупного рогатого скота по AG-ISSR-маркеру

4.3.4.Характеристика (GA)9C-ISSR- и (AG)9C-ISSR-MapKepoB и возможности их использования для дифференциации пород крупного рогатого скота

5. Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Дифференциация пород крупного рогатого скота по гену BoLa-DRB3 главного комплекса гистосовместимости и ISSR-маркерам"

Интенсивная селекция крупного рогатого скота привела к созданию специализированных пород. Хотя селекция на создание высокопродуктивных молочных пород крупного рогатого скота была успешной, однако она привела к серьезным проблемам, связанным с резким преобладанием во всем мире одной породы - голштино-фризской. Результатом этого явилось значительное сокращение численности других пород, а, следовательно, и сокращение общего генетического разнообразия генофонда крупного рогатого скота. Например, Россия в первой половине XX века потеряла более 30 местных пород и отродий крупного рогатого скота. Из 66 пород крупного рогатого скота, разводившихся в 80-90 годах XX века в бывшем СССР, в 2001 году в Российской Федерации осталось 33 породы. Из 33-х оставшихся пород только 16 имеют достаточную численность для нормального воспроизводства (Алтухов и др., 2004). Обеднение генофонда крупного рогатого скота в будущем может привести к отрицательным непредсказуемым последствиям, поскольку невозможно предсказать возникновение новых требований к продуктивности и резистентности крупного рогатого скота к заболеваниям. Важно поддерживать максимально возможное разнообразие генофонда крупного рогатого скота. Необходимым условием для проведения таких работ является проведение генетического мониторинга пород крупного рогатого скота на молекулярном уровне.

За рубежом большое внимание уделяется проблемам изучения биоразнообразия крупного рогатого скота. Многие ведущие зарубежные институты разрабатывают долгосрочные проекты, посвященные генетическому мониторингу и, в частности, ДНК-мониторингу генофонда крупного рогатого скота (например, проект Roslin Institute (Edinburg) - "Genetic Diversity in Cattle"). С использованием молекулярных методов анализа исследуется генетическая структура пород крупного рогатого скота (MacHugh et al., 1998), их происхождение (Troy et al., 2001; Hanotte et al., 2002); создана международная программа и база данных по картированию генома Bos taurus (http://www.ri.bbsrc.ac.uk/bovmap/bovmap.htm). Однако исследуются, в основном, европейские породы. Большая часть местных и аборигенных пород на молекулярно-генетическом уровне практически не исследована, что определило цель наших исследований, заключающуюся в изучении генетического разнообразия пород к.р.с. с использованием ДНК-технологий.

В качестве тест-систем для изучения генетического разнообразия и дифференциации пород крупного рогатого скота нами был использован анализ полиморфизма гена BoLA-DRB3 главного комплекса гистосовместимости, участвующего в формировании иммунного ответа организма на вирусные и бактериальные инфекции, и ISSR-фингерпринтинг, позволяющий оценивать уровень полиморфизма генома в целом. Высокий уровень полиморфизма гена BoLA-DRB3 (секвенировано более 90 аллелей) позволяет использовать его как высоко информативный маркер для изучения генетического разнообразия пород крупного рогатого скота. При этом генетическая дифференциация популяций (в том числе и пород сельскохозяйственных животных) по главному комплексу гистосовместимости актуальна не только для рассмотрения проблем сохранения видов и биоразнообразия, но и для рассмотрения проблем устойчивости к заболеваниям. В генетико-селекционных исследованиях сельскохозяйственных животных большое значение имеет анализ популяции, изучение их гетерогенности, дифференциация и идентификация пород. Использование молекулярных маркеров значительно расширяет возможности генетического анализа популяций, позволяет установить меж- и внутри-породную вариабельность отдельных участков генома и составить представление о генетической структуре породы. Одним из наиболее эффективных направлений исследований в этом плане является анализ межмикросателлитного полиморфизма - ISSR-анализ или, как его еще иногда называют, — ISSR-фингерпринтинг. Этот метод относится к методам молекулярного мультилокусного анализа, он позволяет одновременно оценивать полиморфизм десятков локусов (до 30 локусов и выше). Данный подход широко применяется для дифференциации видов и сортов растений, однако, крайне мало используется в исследованиях генофондов сельскохозяйственных животных.

Целью данного исследования было изучение генетического разнообразия пород крупного рогатого скота и их дифференциация на основе ДНК-полиморфизма гена BoLA-DRB3 и ISSR-анализа. Для достижения указанной цели были поставлены следующие нижеперечисленные задачи:

1. Провести сравнительный анализ аллельного разнообразия гена BoLA-DRB3 у четырех пород крупного рогатого скота: у ярославской, монгольской, немецкой черно-пестрой пород и у иранской породы Систани.

2. Оценить характер распределения аллелей гена BoLA-DRB3, ассоциированных с болезнями, в исследованных породах крупного рогатого скота.

3. Провести сравнительный анализ спектров ISSR-полиморфизма у исследованных пород с использованием двух типов праймеров: (GA^C и (AG)9C.

4. Охарактеризовать генетическое разнообразие исследованных пород на основе ISSR-маркеров.

5. Изучить возможность использования (GA)9C-ISSR- и (AG^C-ISSR-MapKepoe для дифференциации исследуемых пород.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1. СТРУКТУРА, ФУНКЦИИ И ПОЛИМОРФИЗМ ГЛАВНОГО КОМПЛЕКСА

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Мохаммад Абади Мохаммадреза

5. ВЫВОДЫ

1. Сравнительный анализ аллельного разнообразия гена BoLA-DRB3 у четырех пород КРС (ярославской, монгольской, немецкой черно-пестрой и иранской породы Систани) показал, что исследованные породы различаются как по спектру аллелей, так и по их частотам. Высокое разнообразие спектра аллелей по данному локусу отмечено у российской ярославской (35 аллелей) и иранской породы Систани (33 аллеля) по сравнению с немецкой черно-пестрой (29 аллелей) и монгольской (17 аллелей) породами.

2. Показана генетическая устойчивость ярославской породы к лейкозу и маститу, обусловленная высоким содержанием BoLA-DRB3-anneneii, ассоциированных с устойчивостью к лейкозу и низким содержанием аллеля BoLA-DRB3.2*23, ассоциированного с высоким риском заболеваемости маститом. Суммарная частота аллелей устойчивости к лейзозу у ярославской породы (18,1%) в 3 раза выше, чем у иранской породы Систани (6,9%), ив 1,7 раза выше, чем у немецкого черно-пестрого (10,1%) и монгольского скота (11%).

3. Идентифицировано 43 полиморфных ДНК-фрагмента на основе ISSR-анализа 270 особей четырех пород КРС с использованием маркеров (GA)9C-ISSR и (AG)9C-ISSR. Сравнительный анализ геномного полиморфизма у четырех пород КРС показал, что исследованные породы различаются как по наличию/отсутствию отдельных фрагментов в ISSR-спектрах, так и по их частотам.

4. Отмечены высокие значения коэффициента внутригруппового сходства и низкий уровень гетерозиготности для всех исследованных пород (кроме монгольского скота). По уровню внутригруппового сходства достоверно отличается от всех остальных пород монгольский скот, приближающийся по этому показателю к природным популяциям (0,62 для GA-ISSR-маркера и 0,47 для AG-ISSR-маркера).

5. Выявлены достоверные различия (0,0<Р<0,02) по среднему числу фрагментов на особь для GA-ISSR-маркера между азиатскими (монгольская и иранская) и европейскими (черно-пестрая и ярославская) породами, причем внутри групп породы не отличались друг от друга по этому параметру.

6. Впервые на основе кластерного анализа и метода главных компонент показано, что GA- и AG-IS SR-маркеры имеют разный уровень разрешающей способности и должны использоваться для решения различных задач. Менее полиморфный GA-ISSR-маркер (11 фрагментов) пригоден для дифференциации пород КРС, в то время как более полиморфный AG-ISSR-маркер (32 фрагмента) информативен при изучении внутрипородного полиморфизма и дифференциации отдельных стад, семейств, линий.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мохаммад Абади Мохаммадреза, Москва

1. Алтухов Ю. П. Генетические процессы в популяциях. / М.: Наука. 1989.

2. Городная А. В., Глазко В. И. ISSR-PCR в дифференциации генофондов пород крупного рогатого скота // Цитология и генетика. 2003. N. 1. С. 61-67.

3. Глазко В. И. Генетика изоферментов сельскохозяйственных животных // М: ВИНИТИ, 1988. 212 С.

4. Глазко В. И., Дымань Т. Н., Тарасюк С. И., Дубин А. В. Полиморфизм белков, RAPD-PCR и ISSR-PCR маркеров у зубров, бизонов и крупного рогатого скота // Цитология и генетика. 1999. Т.ЗЗ N. С. 30-39.

5. Гостимский С.А., Кокаева З.Г., Боброва В.К. Использование молекулярных маркеров для анализа генома растений // Генетика. 1999. Т.35. №11. С.1538-1549.

6. Карамышева Е.Е. Молекулярно-генетический анализ классов I и II главного комплекса гистосовместимости в связи с устойчивостью и восприимчивостью к гемобластозам крупного рогатого скота айрширской породы. / Диссертация на звание канд.биол.наук. М. 1998.

7. Костюченко М.В., Удина И.Г., Зайцев A.M., Храброва JI.A., Сулимова Г.Е. Изучение генетического разнообразия пород лошадей отечественной селекции на основе RAPD-PCR и микросателлитных маркеров // Сельскохоз. биология. 2001. №6. С.29-34.

8. Ю.Рокицкий П.Ф. Основы вариационной стастистики для биологов // Минск. 1961. 220 С.

9. Сулимова Г.И. ДНК-маркеры в генетических исследованиях: типы маркеров, их свойства и области применения // Генетика. 1995. Т. 31. № 9. С.1294-1299.

10. Сулимова Г.И. ДНК-маркеры в генетических исследованиях: типы маркеров, их свойства и области применения // Успехи современной биологии. 2004. Т. 124. №3. С. 260-271.

11. Сулимова Г.И., Удина И.Г., Шайхаев Г.О., Захаров И.А. ДНК-полиморфизм гена BoLA-DRB3 у крупного рогатого скота в связи с устойчивостью и восприимчивостью к лейкозу//Генетика. 1995. Т. 31. № 9. С.1294-1299.

12. Удина И.Г. Гены главного комплекса гистосовместимости человека и животных // Успехи соврем, генетики 1994. Вып.19. С. 133 177.

13. Удина И.Г., Карамышева Е.Е., Сулимова Г.Е., Павленко С.П., Туркова С.О., Орлова А.Р., Эрнст Л .К. Сравнительный анализ айрширской и черно-пестрой пород крупного рогатого скота по маркерам гистосовместимости // Генетика.1998. Т.34. N12. С.1668-1674.

14. Удина И.Г., Сипко Т.П., Соколова С.С., Сулимова Г.Е. Сравнительная характеристика полимофизма ДНК локусов DQB и DRB главного комплекса гистосовместимости у представителей семейства Bovidae // Генетика. 1994. N3.T.30. С. 356-360.

15. Хатами С.Р., Лазебный О.Е., Максименко В.Ф., Сулимова Г.Е. ДНК-полиморфизм генов гормона роста и пролактина у ярославского и черно-пестрого скота в связи с молочной продуктивностью // Генетика . 2005. Т.41. №2.

16. Храпалова И. А., Рыжова Н. Н., Пухальский В. А., Кочиева Е. 3. Филогенетические отношения видов рода Lycopersicon (Tourn) Mill, и молекулярные данные RAPD- и ISSR-анализов // Генетические коллекции овощных растении. 2001. С. 244-251.

17. Alexander J.A., Bailey Е., Woodward J. Analysis of equine Iymphocyne antigen system by Southern blot hybridization // Immunogenetics.1987. V. 25 P. 47-54.

18. Alizadeh Z., Karrow N., Mallard B. N. Biological effect of varying peptide binding affinity to the BoLA-DRB3*2703 allele // Genet. Sel. Evol. 2003. V. 35. Suppl. 1. P. 51-65.

19. Amorena B. & Stone W.H. Serologically defined SD locus in cattle // Science. 1978.1. V.201. Р.159-160.

20. Andersson L. Organization of the bovine MHC class II region as revealed by genomic hibridizations // Animal Genetics. 1988a. Vol.19. P.32-34.

21. Andersson L. Genetic polymorphism of a bovine t-complex gene (TCP1) linkage to major histocompatibility genes//Journal of Heredity. 1988b. V.79, N1. P.l-5.

22. Andersson L., Bohme J., Rask L., Peterson P.A. Genomic hybridization of bovine class II major Histocompatibility genes: 1. Extensive polymorphism of DQa and DQb genes //Animal genetics. 1986a. V.17. P.95-112.

23. Andersson L., Bohme J., Peterson P.A. & Rask L. Genomic hybridization of bovine class II major histocompatibility genes: 2. Polymorphism of DR genes and linkage disequilibrium in the DQ-DR region // Animal Genetics. 1986b. V.l 17. P.295-304.

24. Andersson L., Lunden A., Sigurdottir S., Davies Ch.J. & Rask L. Linkage relationships in the bovine MHC region. High recombination frequency between class II subregions //Immunogenetics. 1988. V.27. P.273-280.

25. Andersson L. & Rask L. Characterization of the MHC Class II region in cattle. The number of DQ genes varies between haplotypes // Immunogenetics. 1988. V.27. P.l10-120.

26. Andersson L., Sigurdartottir S., Borsch C. & Gustafsson K. Evolution of MHC polymorphism: extensive sharing of polymorphic sequence motifs between human and bovine DRB alleles // Immunogenetics. 1991. V.33. P.l88-193.

27. Andersson M., Bohme J., Andersson G., MoIIer E. Thorsby E., Rask L. & Peterson P.A. Genomic hybridization with class II transplantation antigens cDNA probes as a complementary technique in tissue typing // Human immunology. 1984. V.l 1. P.57-67.

28. Auffray С., Strominger J.L. Molecular genetics of the human major histocompatibility complex // Adv. Hum. Genet. 1986. V. 15. P. 197-247.

29. Baker С. M. & Manwell C. Chemical classification of cattle. 1. Breed groups // Anim Blood Groups Biochem Genet. 1980. V. 11. N.3. P.127-50.

30. Bell J.I., Todd J.A., McDevitt H.O. The molecular basis of HLA-disease associations // In: Advances in human genetics (ed. by H. Harris, K. Hirschhorn). N.Y. and L: Plenum press. 1989. V. 18. Ch.l. P. 1-42.

31. Briles W.E., Briles R.W., Pollock D.L., Petrison M. Marker's disease resistance in chicken affected by complementation of В alloalleles in a cross of commercial parent stocks //Anim. Blood Grps. and Biochem. Genet. 1980. N. 11, Suppl.l. P. 14.

32. Brown J.H., Jardetzky Th.S., Gorga J.C., Stern L.J., Urban R.G., Strominger J.L. and Wiley D.C. Three-dimensional structure of the human class II histocompatibility antigen HLA-DR1 //Nature. 1993. V.364. P. 33 39.

33. Burke M.G., Stone R.T., Muggli-Cockett E. Nucleotide sequence and Nothern analysis of a bovine major histocompatibility class II DRB-like cDNA // Animal Genetics. 199la. Vol.22. P.343-352.

34. Burke M.G., Stone R.T. & Muggli-Cockett N.E. The nucleotide sequence of bovine major histocompatibility class II DRB cDNA and hybridization to lymphocyte RNA // Animal genetics. 1991b. Vol. 22. Suppl .1. P.49-50.

35. Burny A., Bruck C., Chantrenne H. et al. Bovine leukemia virus: molecular biologyand epidemiology // In: Viral Oncology (ed. by G. Klein). New York: Raven Press, 1980. P.89-231.

36. Burny A., Cleuter Y., Kettmann R. et al. Bovine leukemia: facts and hypotheses derived from the study of an infectious cancer // Vet. Microbiol. 1988. V.17. P.197-218.

37. Caetano-Anolles G., Bassam B.J., Gresshoff P.M. DNA amplification fingerprinting using very short arbitrary oligonucleotides // Biotechnology. 1991. V.9. N.6. P.553-557.

38. Caldwell J., Brayan C.F., Cumferland P.A., Weseli D.F. Serologically detected limphocyte antigens in Holstein cattle // Anim. Blood. Grps. Biochem. Genet. 1977. V. 8. P. 197-207.

39. Caldwell J., Cumferland P.A., Weseli D.F., Willians J.D. Breed differencies in frequency of BoLA specificities // Anim. Blood Grps. and Biochem. Genet. 1979. V. 10. P. 93-98.

40. Cameron.P.U., Tabarais H.A., Pulendran В., Robinson W., Dawkins R.L. Consirvation of central MHC genome: PFGE mapping and RFLP analysis of complement, HSP70, and TNF genes in the goat // Immunogenetics 1990. V.31. P. 253-264.

41. Carrol C.L., Sommer F.G., McNeal J.E., Stamey T.A. The abnormal prostate: MR imaging at 1.5 T with histopathologic correlation // Radiology. 1987. V. 163. P. 521525.

42. Coppin H.L., Garmichael P., Lombardi G.L. et al. Position 71 in the a helix of the DRp domain is predicted to influence peptide binding and plays a central role in allorecognition // Eur. J. Immunol. 1993. V.23. P.343-349.

43. Crew M.D., Filipowsky M.E., Neshat M.S., Smith G.S., Walford R.L. Transmembrane domain length variation in the evolution of major histocompatibility complex class I genes. // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1991. V. 88. P. 4666-4670.

44. Crittenden L.B. Natural and artificially induced genetic resistance to viral diseases in poultry // Animal Genetics. 1991. V.22. Suppl.l. P.2-7.

45. Davies C.J., Andersson L., Ellis S.A. et al. Nomenclature for factors of the BoLA system, 1996: report of the IS AG BoLA Nomenclature Committee // Animal Genetics. 1997. V.28. P.159-168.

46. Davies C.J., Joosten I., Bernoco D., Arriens M.A., Bester J., Ceriotti G., Ellis S., Hensen E.J., Hines H.C., Horin P., et al. Polymorphism of bovine MHC class I genes // Eur J Immunogenet. 1994 V. 21(4). P. 239-258.

47. Deverson E.V., Wright H., Watson S., Ballingall K., Huskisson N., Diamond A.G., Howard J.C. Class II major histocompatibility complex genes of the sheep // Animal Genetics. 1991. V.22. P. 211-227.

48. Dietz A., Detilleux J., Freemann A. et al. Genetic association of bovine lymphocyte antigen DRB3 alleles with immonological traits of Holstein cattle // Journal of Dairy Science. 1997a. V.80. P.400-405.

49. Dietz А. В., Cohen N.D., Timms L. & Kehrli M.E., Bovine lymphocyte antigen class II alleles as risk factors for high somatic cell counts in milk of lactating dairy cows // Journal of Dairy Science. 1997b. V.80. P.406-412.

50. Dodol G.J., Bernoco D., Stormont C. Serological analysis for linked BoLA loci // Anim. Blood Grps. and Biochem. Genet. 1980. V. 11, Suppl.l. P.28-29.

51. Dyer P.A., Martin S. Techniques used to define human MHC antigens: serology // Immunol Lett. 1991 V. 29(1-2) P. 15-21.

52. Esteban E., Thorn R., Ferrer J. Characterization of the blood lymphocyte, population in cattle infected with the bovine leukemia virus // Cancer Res. 1985. V.45. P.3225-3230.

53. Fang D.Q., Federici C.T., Roose M.L. A high-resolution linkage map of the citrus tristeza virus resistance gene region in Poncirus trifoliata (L.) Raf. // Genetics. 1998. V.150.N.2. P.883.

54. Ferrer J., Marshak R., Abt D. et al. Persistent lymphocytosis in cattle; nature and relation to lymphosarcoma. Ann. Rech. Vet. 1978. V.9. P.851-857.

55. Figueroa F., Gutknecht J., Tyichy H., Klein J. Class II MHC genes in rodent evolution // Immunological reviews. 1990. V. 113. P. 27-46.

56. FIajnik M.F., Pasquier L.D. The major histocompatibility complex of frogs // Immunological Reviews. 1990. N. 113. P. 47-64.

57. Fraga S., San-Fabian E., Thornton S., Singh Bh. Prediction of secondary structure and functional sites of major histocompatibility complex molecules // J. Mol. Recognition.1990. V.3.N.2. P. 65-73.

58. Fries R., Hedige R.R. & Strazinger G. Tentative chromosomal localization of the bovine major histocompatibility complex by in situ hybridization // Animal Genetics. 1986. V.17. P.287-294.

59. Germain R.N., Hendrix L.R. MHC class II structure, occupancy and surface expression determined by post-endoplasmic reticulum antigen binding. // Nature.1991. V. 12. N.6340. P. 134-139.

60. Gilliespie B.E., Jayarao B.M., Dowlen H.H. & Oliver S.P. Analysis and frequency of bovine lymphocyte antigen DRB3.2 alleles in Jersey cows // Journal of Dairy Science. 1999. V.82. P.2049-2053.

61. Giovambattista G., Golij ow C.D., Dulout F.N. & Lojo M.M. Gene frequencies of DRB3.2 locus of Argentine Creole cattle //Animal Genetics. 1996. V.27. P.55-56.

62. Giovambattista G, Ripoli MV, Peral-Garcia P, Bouzat JL. Indigenous domestic breeds as reservoirs of genetic diversity: the Argentinean Creole cattle // Anim Genet. 2001. V.32. N.5. P.240-247.

63. Gorer P.A. The detection of antigenetic differences in mouse eritrocytes by the employment of the immune sera//British. Exp. Pathol. 1936. Vol.17. P. 42-50.

64. Groenen M.A.M., van der Poel J.J., Dijkhof R.J.M. & Giphart M.J. Cloning of thebovine major histocompatibility comlex class II genes // Animal genetics. 1989. V.20. P.267-268.

65. Groenen M.A.M., van der Poel J.J., Dijkhof R.J.M. & Giphart M.J. The nucleotide sequence of bovine MHC class II DQB and DRB genes // Immunogenetics. 1990. V.31. P.37-44.

66. Grosclaude F., Mahe M.F., Voglino G.F. The beta E variant and the phosphorylation code of bovine caseins // FEBS Lett. 1974. V. 1.45. P. 3-5.

67. Gupta M., Chyi Y.S., Romero-Severson J., Owen J.L. Amplification of DNA markers from evolutionarily diverse genomes using single primers of simple-sequence repeats // Theoret. Appl. Genet. 1994. V.89. P.998-1006.

68. Hanotte O., Bradley D.G., Ochieng J.W., Verjee Y., Hill E.W., Rege J.E. African pastoralism: genetic imprints of origins and migrations // Science. 2002. V.12. N.296 (5566). P.336-9.

69. Hedrick Ph. W., Whittam Th.S. & Parham P. Heterozygosity at individual amino acid sites: extremely high levels for HLA-A and B-genes // Proceedings of the National academy of sciences USA. 1991. V.88. P.5897-5901.

70. Hines H.C., Bailey E. & Park C.A. Relationship of the bovine major histocompatibility complex with aspects of persistent lymphocytosis/leukaemia // Animal Genetics. 1991. V.22. Suppl.l. P.93.

71. Hirsch F., Sachs D., Gustafsson K.et al. Ch. Class II genes of miniature svine.III. Characterisation of an expressed pig class II gene homologous to HLA-DQA II Immunogenetics. 1990. V.31. P.52-56.

72. Horin P., Matiasovic J, Trtkova K, Pavlik I. BoLA DYA polymorphism in Czech cattle // Exp. Clin. Immunogenet. 1998. V.15. N.l. P.56-60.

73. Hughes A.L. and Nei M., Nucleotide substitutions at major histocompatibility complex class II loci: evidence for overdominant selection // Proc. Natl. Acad Sci. USA. 1989. V.86. P.958 -962.

74. Irzikovska L., Wolko В., Swi^cicki W.K. The genetic linkage map of pea (Pisum sativum L.) based on molecular, biochemical and morphological markers // Pisum Genetics. 2001. V.33. N.l. P. 13.

75. Joosten I., Hensen E.J., Sanders M.F. & Andersson L. Bovine MHC class II restriction fragment length polymorphism linked to expressed polymorphism // Immunogenetics. 1990. V. 31. P.123-126.

76. Joosten I., Oliver R.A., Spooner R.L., Willams J.L., Hepkema G., Sanders M.F., Hensen E.J. Characterisation of class I bovine lymphocyte antigens (BoLA) by one-dimensional isoelectric focussing // Animal Genetics. 1988. V.19. P.103-113.

77. Joosten I., Sanders M.F. & Hensen E. J. MHC class I compatibility between dam and calf increases the risk of bovine retained placenta//Animal genetics. 1991. V.22. Suppl.l. P.114.

78. Joosten I., Sanders M.F., van der Poel A., Williams J.L., Hepkema B.G. & Hensen E.J. Biochemically defined polymorphism of bovine MHC class II // Immunogenetics.1989. V.29. P.213-216.

79. Kaufman J., Skjoedt K., Salmonsen J. The MHC molecules of nonmammalian vertebrates//Immunological reviews. 1990. N113. P. 83-118;

80. Klein J., Bontrop R.E., Dawkins R.L., Erlich H.A.,Gyllensten U.B., Heise E.R., Jones P.P., Parham P., WakelandE., Watkins D.,I. Nomenclature for major histocompatibility complexes of different species: a proposal // Immunogenetics.1990. V.31.P.405-409.

81. Krieger J.I, Karr R.W., Grey H.M. et al. Single amino acid changes in DR and antigen define residues critical for peptide-МНС binding and T cell recognition // J. Immunol.1991. V.146. P.2331 2340.

82. Kroemer G., Bernot A., Behar G., Chausse A.M., Gastinel L.N., Guillemot F., Park I., Thorava 1.Р., Zoorob R., Auffray C. Molecular genetics of the chicken MHC: current status and evolutionary aspects. // Immunol. Review. 1990 V. 113. P. 119-145.

83. Lanchbury J.S. Techniques used to define human MHC antigens: monoclonals, class I and class II biochemistry. // Immunol. Lett. 1991 V. 29. P. 23-29.

84. Ledwidge S.A., Mallard B.A., Gibson J.P., Jansen G.B., Jiang Z.H. Multi-primer target PCR for rapid identification of bovine DRB3 alleles. Animal Genetics. 2001. V. 32. N.4. P.219-221.

85. Leveziel. J. Basedow's disease// Soins. 1983. V.404. P. 41-42.

86. Lewin H.A. Disease resistance and immune response genes in cattle: strategies for their detection and evidence of their existence// J. Dairy Sci. 1989. V.72. P.334-1338.

87. Lewin H., Bernoco D. Evidence for BoLA-linked resistance and susceptibility to subclinical progression of bovine leukaemia virus infection // Animal Genetics. 1986. V.17. P. 197-207.

88. Lewin H. A.; Russell G. C.; Glass E. J. Genomic Organisation Of The Mhc: Structure, Origin and Function // Immunol. Rev., V.167. 1999. P. 145-158.

89. Lewin H.A., Ming-Che Wu, Steawart J.A., Nolan T.J. Association between BoLA and subclinical bovine leukemia virus infection in a herd of Holstein-Friesian cows // Immunogenetics. 1988a. V.25. P.338-334.

90. Lewin H., Wu M., Nolan T. et al. Peripheral В lymphocyte percentage as an indicator of subclinical progression to bovine leukemia virus infection // J. Dairy Sci. 1988b. V.71. P. 2526-2534.

91. Lindberg P.G. & Andersson L. Close association between DNA polymorphism of bovine major histocompatibility complex class I genes and serological BoLA-A specificities // Animal Genetics. 1988. V.19. P.245-255.

92. Litt M. & Luty J. A. A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene // Am J Hum Genet. 1989 V. 44. N. 3. P. 397-401.

93. Lorenz R. Straub O. The epidemiology of enzootic bovine leukosis. / In: Enzootic Bovine Leukosis and Bovine Leukemia Virus. A. Burny and M. Mammerickx, eds. Martinus Nijhoff, Boston, 1987. P. 51-67.

94. Lunden A., Edfors-Lilja I., Simonsen M. & Liljedahl L.E.The influence of chicken major histocompatibility complex on production traits in egg-laying hens // Animal Genetics. 1991. V. 22. Suppl.l. P. 103-104.

95. MacHugh D.E, Loftus R.T., Cunningham P., Bradley D.G. Genetic structure of seven European cattle breeds assessed using 20 microsatellite markers // Anim Genet. 1998. V.29. N.5. P.333-40.

96. Maillard J.C., Renard C., Chardon P., Chantal I. & Bensaid A. Characterization of 18 new BoLA-DRB3 alleles // Animal Genetics. 1999. V. 30. P. 200-205.

97. Miltiadou D., Law A.S., Russell G. C. Establishment of a sequence-based typing system for BoLA-DRB3 exon 2 // Tissue Antigens 2003. V. 62. P. 55-65.

98. Mirsky M.L., Olmstead C.Da., Lewin H.A. Reduced bovine leukaemia virus proviral load in genetically resistant cattle // Animal Genetics. 1998. V.29. P.245-252.

99. Moazami-Goudarzi K., Laloe D., Furet J.P., Grosclaude F. Analysis of genetic relationships between 10 cattle breeds with 17 microsatellites // Anim. Genet.1997. N28. P. 338-345.

100. Mueller U.G., Wolfenbarger L. AFLP genotyping and fingerprinting // Trends Ecol. Evol. 1999. V.14.N.10. P.389.

101. Muggli-Cockett N.E. & Stone R.T. Identification of genetic variatrion in the bovine major histocompatibility complex DRb-like genes using sequenced bovine genomic probes // Animal Genetics. 1988. V.19. P.213-225.

102. Muggli-Cockett N.E. & Stone R.T. Partial nucleotide sequence of a bovine major histocompatibility class II DRb-like gene //Animal Genetics. 1989. V.20. P.361-370.

103. Muggli-Cockett N.E., Stone R.T. Restriction fragment length polymorphisms in bovine major histocompatibility complex class II b-chain genes using bovine exon-containing hybridization probes // Animal Genetics. 1991. V.22. P. 123-136.

104. Naqvi N1, Chattoo B.B. Development of a sequence characterized amplified region (SCAR) based indirect selection method for a dominant blast-resistance gene in rice // Genome. 1996. V.39. N.l. P.26.

105. Nei. M. Variation and covariation of gene frequences in subdivided populations // Evolution. 1965. V.19. №2. P.256-258.

106. Nei M., Miller J.C. A simple method for estimating average number of nucleotide substitutions within and between populations from restriction data // Genetics. 1990. V.125. P.873 879.

107. Nei M. & Tajima F. DNA polymorphism detectable by restriction endonucleases // Genetics. 1981. V.97. P.145 163.

108. Park C.A., Hines H.C. & Monke D.R. Association between the bovine major histocompatibility complex and posterior spinal paresis in Holstein bulls // Animal Genetics. 1991. V.22. Suppl.l. P.94-95.

109. Paterson S., Wilson K., Pemberton J.M. Major histocompatibility complex variation associated with juvenile survival and parasite resistance in a large unmanaged ungulate population // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V.95. N7. P.3714-3719.

110. Pelikan S., Rogstad S. GELSTATS version 2.6 // University of Cincinnati, Cincinnati, Ohio. 1996.

111. Perry M. D., Davey M.R., Power J.B., Love K.C., Bligh H.F.J., Roach P.S., Jones C. // Plant Molecular Biology Reporter. 1998. V. 16. N.l. P.49.

112. Rask L., Andersson L., Gustafsson K., Jonsson A.K. Parsimony analysis of mammalian class II histocompatibility genes // Immunol. Rev. 1990. V. 113. P. 187206.

113. Ripoli M. V., Liron J. P., De Luca J. C., Rojas F., Dulout F. N., Giovambattista G. Gene Frequency Distribution of the BoLA-DRB3 Locus in Saavedreno Creole Dairy Cattle // Biochemical Genetics 2004.Vol. 42, N. 7/8. P. 231-240.

114. Rothel J.S., Dufty J.H. & Wood P.R. Studies on the bovine major histocompatibility class I and class II antigens using homozygous typing cells and antigen-specific BoT4+ blast cells // Animal Genetics. 1990. V.21. P. 141-148.

115. Sagata N., Yasunaga Т., Tsuzuku Kawamura J. et al. Complete nucleotide sequenceof the genome of bovine leukemia virus: its evolutionary relationship to other retroviruses // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985. V.82. P.677-681.

116. Sarmiento U.M., DeRose S., Sarmiento J.I., Storb R. Allelic variation in the DQ subregion of the canine major histocompatibility complex: I. DQA. II Immunogenetics. 1992. V. 35(6). P. 416-20.

117. Sarmiento U.M., Sarmiento J.I., Storb R. Allelic variation in the DR subregion of the canine major histocompatibility complex.// Immunogenetics. 1990. V. 32. P. 1319.

118. Sarmiento U.M., Storb R. Nucleotide sequence of a dog class I cDNA clone. // Immunogenetics. 1990a. V. 31. P. 400-404.

119. Sarmiento U.M., Storb R. Nucleotide sequence of a dog DRB cDNA clone // Immunogenetics. 1990b. V. 31. P.396-399.

120. Scott P.C., Gogolin-Ewens KJ, Adams ТЕ, Brandon MR. Nucleotide sequence, polymorphism, and evolution of ovine MHC class II DQA genes // Immunogenetics. 1991a. V.34. P. 69-79.

121. Scott P.C., Madox J.F., Cogolin-Ewens K.J., Brandon M.R. The nucleotide sequence and evolution of ovine MHC class II В genes: DQB and DRB // Immunogenetics. 1991b. V. 34. P. 80-87.

122. Sell S., Hunt J.M., Knoll B.J., Dunsford H.A. Cellular events during hepatocarcinogenesis in rats and the question of premalignancy // Adv. Cancer Res. 1987. V. 48. P. 37-111.

123. Sher A., Gazzinelli R.T., Oswald LP. et al. Role of T-cell derived cytokines in the downregulation of immune responses in parasitic and retroviral infection // Immunological Reviews. 1992. V.127. P. 183-204.

124. Sigurdardottir S., Borsch C., Gustafsson K. & Andersson L. Cloning and sequence analysis of 14 DRB alleles of the bovine major histocompatibility complex by using the polymerase chain reaction // Animal Genetics. 1991a. V.22. P. 199-211.

125. Sigurdardottir S., Borsch C., Gustafsson K. & Andersson L. Conserved polymorphism at major histocompatibility DRB loci in man and cattle // Animal Genetics. 1991b. V.22. Suppl.l. P.59-60.

126. Sigurdardottir S., Lunden A. & Andersson L. Restriction fragment length polymorphism of DQ and DR class II genes of the bovine major histocompatibility complex // Animal Genetics. 1988. V.19. P.133-150.

127. Spies Т., Morton C.C., Nedospasov S.A., Fiers W., Pious D., Strominger J.L. Genesfor the tumor necrosis factors alpha and beta are linked to the human major histocompatibility complex. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. V. 83. P. 86998702.

128. Spooner R.L., Leveziel H., Grosclaude F., Oliver R.A., Vaiman M. Evidence for a possible major histocompatibility complex (BoLA) in cattle // Journal of Immunogenetics. 1978. V.5. P.335-346.

129. Stear M.J., Dimmock C.K., Newman M.J., Nicholas F.W. BoLA antigens are associated with increased frequency of persistent lymphocytosis in bovine leukaemia virus // Animal Genetics. 1988a. V.19. P.151-158.

130. Stear M.J., Рокоту T.S., Muggli N.E. & Stone R.T. Breed differences in the distribution of BoLA-A locus antigens in American cattle // Animal Genetics. 1988b. V.19. P.171-176.

131. Stern L.J., Brown J.H., Jardetzky T.S. et al. Crystal structure of the human class II MHC protein HLA-DR1 complexed with an influenza virus peptide// Nature. 1994. V.368. P.215-221.

132. Stone R.T. & Muggli-Cockett N. E. Partial nucleotide sequence of a novel bovinemajor histocompatibility complex class II b-Chain gene, BoLA-DIB // Animal Genetics.1990. V.21. P.353-360.

133. Strominger I.L. Human Major Histocompatibility Complex Genes: class I antigens and Tumor Necrosis Factor// Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 1986. V. 11. P. 63-66.

134. Sutton V.R., Knowles R.W. An aberrant DRBA null gene transcript is found that could encode a novel HLA-DR beta chain // Immunogenetics. 1990. V. 31. P. 112117.

135. Takeshima S., Nakai Y., Ohta M., Aida Y. Short communication: characterization of DRB3 alleles in the MHC of Japanese shorthorn cattle by polymerase chain reaction-sequence-based typing //J. Dairy Sci. 2002. V.85. N6. P. 1630-1632.

136. Tautz D. Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers //Nucleic Acids Res. 1989 V. 17. N. 16. P. 6463-71.

137. TeaIe A.J., Kaushal A.Q., MacHugh N., Toye P. & Bensaid A. Bovine MHC class I cDNA clones: evidence for expression of two loci // Animal Genetics. 1991. V.22. Suppl.l. P.59.

138. Teale A.J., Watnbugu J., Gwakisa P.S., Stranzinger G., Bradley D., Kemp S.J. A polymorphism in randomly amplified DNA that differentiates the Y chromosomes of Bos indicus and Bos taurus // Anim. Genet. 1995. V.26. N.4. P. 243-248.

139. Todd J.A., Acha-Orbea H., Bell J.I., Chao N., Fronek Zd., Jacob Ch.O., McDermott

140. M., Sinha А.А., Timmerman L., Steinman L., McDevitt H.O. A molecular basis for MHC class II associated autoimmunity // Science.1988. V.240. N4855. P.1003-1009.

141. Trowsdale J. Molecular organization of the MHC molecules // Immunological letters. 1991. V. 29. P. 178.

142. Troy C.S., MacHugh D.E., Bailey G.F. et al. Genetic evidence for Near Eastern origins of European cattle //Nature. 2001. V.410. P.1088-1091.

143. Usuki K., Nishizawa M., Matsuki K., Tokunaga K. et al. Association of a particular amino acid sequence of the HLA-DR pi chain with HTLV-I-associated myelopathy. Eur. J.Immunol. 1990. V.20. P. 1603 1608.

144. Vos P., Hogers R., Bleeker M., Rejans M., van de Lee Т., Homes M., Fritjers A., Pot J., Peleman J., Kuiper M., Zabeau M. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting // Nucl. Acids Res. 1995. V.23. N.21. P.4407-14.

145. Waugh R., Powell W. Using RAPD marker for crop improvement //Trends Biotechnol. 1992. V.10. P.186-191.

146. Weber J. L. & May P. E. Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using the polymerase chain reaction // Am J Hum Genet. 1989 V. 44. N. 3. P. 388-96.

147. Welsh J., McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers //Nucleic Acids Res. 1990. V.18.N.24. P.7213-7218.

148. Williams I., Kubelik A.R., Livak K.I., Rafalski I.A., Tongey S.N. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetics markers // Nucleic Acids Res. 1990. V. 18. N.22. P.6531-6535.

149. Williams J.L., Oliver R.A. & Spooner R.L. Variation in BoLA class I antigens on bovine lymphocytes following infection with Theileria annulata // Animal Genetics. 1991. V.22. Suppl.l. P.43.

150. Winkler Ch., Schults A., Cevario St., O'Brien St. Genetic characterisation of FLA the cat major histocompatibility complex // Proc.NatI Acad. Sci. USA. 1989. V.86. P.943-947.

151. Xu A. & Lewin H.A. Characterization of bovine major histocompatibility complex class II genes using the polymerase chain reaction //Animal Genetics. 1991. V.22. Suppl.l. P.61-62.

152. Xu A., Van Eijk M.J.T., Park Ch. and Lewin H.A. Polymorphism in BoLA-DRB3 Exon 2 Correlates with Resistance to Persistent Lymphocytosis Caused by Bovine1.ukemia Virus // J. Immunol. 1993. V.151. P.6977 6985.

153. Yuhki N., Heideeker G.F., O'Brien S.J. Characterization of MHC cDNA clones in the domestic cat. Diversity and evolution of class I genes.// J. Immunol. 1989. V. 15; 142. P. 3676-3682.

154. Yuhki N., O'Brien S.J. Molecular characterization and genetic mapping of class I and class II genes for the domestic cat // Immunogenetics. 1988. V. 27. P. 414-425.

155. Yuhki N., O'Brien S.J. DNA variation of the mammalian major histocompatibility complex reflects genomic diversity and population history. //Proc. Natl. Acad. Sci. U SA. 1990. V. 87. P. 836-40.

156. Zanotti M., Poli G., Poli W. et al. Association of the BoLA class II haplotypes with subclinical progression of bovine leukaemia virus infection in Holstein-Friesian cattle //Animal genetics. 1996. V.27. P.337-341.

157. Zhivotovsky LA, Underhill PA, Cinnioglu C, Kayser M, Morar B, Kivisild T, Scozzari R, Cruciani F, Destro-Bisol G, Spedini G, Chambers GK, Herrera RJ, Yong KK, Gresham D, Tournev I, Feldman MW, Kalaydjieva L. // Am. J. Hum. Genet. 2004. V.74.N.1.P.50.

158. Zoorob R., Behar G., Kroemer G., Auffray Ch. Polymorphism of class II MHC genes in the domestic fowl//Animal Genetics. 1991. V.22. S.l. P.62

159. Я благодарю О.Е. Лазебного за неоценимую помощь в статистической обработке результатов, Г.Н. Полухину за помощь и внимание в течение 3 лет аспирантуры.

160. Выражаю искреннюю благодарность своей супруге Ш. Мораднасаб за постоянное внимание, помощь и терпение.