Системная оценка состояния клеток врожденного иммунитета в организме с развивающейся опухолью

Авхачева, Надежда Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Системная оценка состояния клеток врожденного иммунитета в организме с развивающейся опухолью
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Системная оценка состояния клеток врожденного иммунитета в организме с развивающейся опухолью"

На правах рукописи АВХАЧЕВА НАДЕЖДА ВЛАДИМИРОВНА

Системная оценка состояния клеток врожденного иммунитета в организме с развивающейся опухолью

03.00.02 - Биофизика

Автореферат

диссертации на соискаиие ученой степени кандидата биологических наук

7 3 упяу -

Пущино - 2008

003452470

Работа выполнена в Институте биофизики клетки РАН

Научный руководитель

кандидат биологических наук Сафронова Валентина Григорьевна

Официальные оппоненты

доктор биологических наук Прохоренко Изабелла Рувимовна

кандидат биологических наук Глушкова Ольга Валентиновна

Ведущая организация

ФГУ ПИИ Физико-химической медицины РоеЗдрав, Москва

Защита состоится «27» ноября 2008 г. в 14 00 часов на заседании Диссертационного совета Д 002 038 01 при Институте биофизики клетки РАН по адресу. 142290, Московская область, г Пущино, ул Институтская, 3

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН, г Пущино

Автореферат разослан « .» . . . . 2008 г

Ученый секретарь '

диссертационного совета

кандидат биологических наук

Т.И Смолихина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Клетки врожденного иммунитета обеспечивают быструю защиту организма от вторгшихся микроорганизмов, собственных поврежденных и трансформированных клеток [Parham, 2003, O'Beirne and Harrison, 2004, Mocellin, 2005] Активированные полиморфноядерные и мононуклеарные фагоциты генерируют и высвобождают активные формы кислорода (АФК), которые вовлекаются в защитные механизмы [Segal, 2005; Dale et al, 2008] При избыточной продукции АФК являются повреждающим фактором для окружающих клеток [Trachootam et al, 2008] Очевидно, что активированные фагоциты контактируют непосредственно с собственными токсичными метаболитами, которые трансформируют их активность в аутокринной манере [Belardelli and Ferrantim, 2002] Действие эндогенно продуцируемых АФК на сами фагоциты изучено фрагментарно [Splettstoesser and Schuff-Werner, 2002, Fang, 2004, Halliwell, 2006]

Многие заболевания сопровождаются нарушениями регуляции генерации АФК, что способствует углублению патологического процесса Так, была показана повышенная продукция АФК клетками в крови пациентов с острыми воспалительными заболеваниями [Fruhwirth, 1998, Song, 1998, Сафронова и др, 2005], диабетом [Lopes et al., 2008] и ревматиодным артритом [Gelderman et al., 2007] Нами были обнаружены изменения в генерации АФК и ее регуляции у больных с заболеваниями репродуктивной и сердечнососудистой систем [Авхачева и др, 2002, Авхачева и др, 2003; Сафронова и др, 2003]. Функциональные характеристики фагоцитов, включая способность к продукции АФК, также изменяются в организме с развивающейся опухолью [Chasseinget al, 1993, Szuster-Ciesielska et al., 2004, Мальцева и др, 2006]

В настоящее время большое внимание уделяют взаимоотношениям между клетками врожденного иммунитета и опухолью [Ruegg, 2006] Считается, что воспалительный компонент является критическим в развитии солидных опухолей, так как зачастую опухоли возникают в местах инфицирования и воспаления [Mueller and Fusenig, 2004, Mantovani et al., 2008] Нешрофилы и макрофаги служат основными эффекторными клетками воспалительной реакции. Воспалительные клетки обильно инфильтрируют микроокружение опухоли [Di Carlo et al, 2001; Dedon, 2004, Ostrand-Rosenberg, 2008] Действие их токсических продуктов, в том числе АФК, носит про- или противоопухолевый характер в зависимости от стадии развития и локализации опухоли [Bingle et al, 2002; Coussens, 2008]. Активно развивающаяся опухоль продуцирует вещества (цитокины, хемокины, факторы роста), которые привлекают фагоциты и могут трансформировать их морфологически и функционально вплоть до репрограммирования, что показано в т vitro экспериментах [Araki et al., 2004]. Опухоль создает в организме специфический метаболический фон, влияющий на все клетки, особенно на наиболее мобильные, каковыми являются нейтрофилы и макрофаги. Остается не изученным влияние растущей опухоли на состояние клеток врожденного иммунитета периферических по отношению к опухоли, то есть находящихся в удаленных от опухоли органах

Цели и основные задачи исследования. Цель данной работы состояла в оценке изменений происходящих в периферических клетках врожденного иммунитета в системах

организма (кровеносное русло, брюшная полость, очаг острого воспаления в брюшной полоста) при развитии опухоли в организме

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи

1) на экспериментальной модели неиммуногенной солидной опухоли мыши оценить функциональную активность фагоцитов крови, резидентных фагоцитов брюшной полости и фагоцитов из очага острого воспаления, на разных стадиях развития опухоли,

2) определить распределение фагоцитов по фазам клеточного цикла, оценить связь распределения с оксидазной активностью клеток,

3) выявить уровень повреждения ДНК (одно- и двухцепочечные разрывы) и дать оценку состояния репарационной системы ДНК в перитонеальных фагоцитах при развитии опухоли, отдаленной от брюшной полости

Няучпая новизна. Впервые установлено, что стрессовое воздействие (механическое повреждение ткани) приводит к активации системы врожденного иммунитета на ранних сроках после воздействия (10-е сутки), и нормализует ее функции на поздних сроках (21-е сутки) Впервые показано, что развитие опухоли в организме животного сопровождается последовательными системными изменениями функциональной активности периферических по отношению к опухоли клеток врожденного иммунитета Получены однозначно новые данные, свидетельствующие о том, что на ранней стадии опухолевого роста происходит снижение продукции АФК и усиление апоптоза периферических фагоцитов. На поздней стадии, при интенсивном метастазировании, усиливается генерация АФК фагоцитами, увеличивается количество лейкоцитов с фрагментированной ДНК Впервые показано изменение спектра белков, включая синтезированные de novo, в клетках перитонеальной полости на разных сроках пост-инъекционного воздействия Результаты работы свидетельствуют о системной трансформации периферических иммунных клеток во время роста опухоли

Научно-практическая ценность. Исследование молекулярных механизмов, лежащих в основе модификации функциональной активности клеток иммунной системы, относится к фундаментальным проблемам биологии клетки и иммунологии. Полученные результаты расширяют представление о состоянии клеток врожденного иммунитета при стрессовых воздействиях, воспалительных реакциях и при растущей в организме опухоли Полученные в ходе данного исследования результаты помогают понять механизмы модификации клеток врожденного иммунитета и иайти новые терапевтические подходы к лечению онкологических заболеваний.

биофизиков России (Воронеж, 2004), Biophysical Society, 49"' Annual Meeting (Long Beach, CA, USA, 2005), Международный Конгресс «Иейропаука для медицины и психологии» (Судак, Украина, 2006), The EMBO/FEBS Advanced Lccture Course "Molecular mechanisms in signal transduction and cancer" (Греция, 2007), An AACR Special Conference "Chemical and Biological Aspects of Inflammation and Cancer" (USA, 2008)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 печатных работ, из них 5 статей и 1 статья в печати

Список сокращений: АФК - активные формы кислорода, LLC - карцинома Льюиса (Lewis Lung Carcinoma), BBS (Hanks balanced solution) - модифицированный раствор Хенкса, FITC - флуоресциин изотиоцианат, PE - фикоэритрин, %TDNA - процент ДНК в хвосте кометы, DHR 123 - дигидрородамил 123, МАРК - митоген-активируемая протеинкиназа; Ки86 - регуляторная субъединица ДНК-протеинкиназы (ДНК-ПК)

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена на клетках половозрелых мышей-самцов инбргдной линии C57BL/6, весом 20-25 г (N=100) Животные были приобретены в питомнике лабораторных животных «Пущино», имеющем полную аккредитацию Международной ассоциации по аттестации и аккредитации содержания лабораторных животных (г Пущино, Московская область) Перед использованием в экспериментах животных адаптировали к конвенциональным условиям.

Выделение резидентных клеток проводили согласно методике [Van Duke et al, 1986] с изменениями. Брюшную полость животных промывали 3 мл охлажденного раствора Хенкса. Экссудат центрифугировали 5 мин при 600 g Осадок ресуспендировали в среде Хенкса без добавления кальция до нужного объема так, чтобы плотность клеток составляла около 107 клеток/мл

Для создания очага острого воспаления в брюшную полость инъецировали 150 мкл суспензии зимозана (5 мг/мл). Через 5 ч мыши были подвергнуты процедуре, описанной выше Выживаемость клеток составляла не менее 98% Клетки использовали через 1 ч после выделения

Для определения популяционного состава клеток был использован проточный цитометр FACScan ("Becton Dickinson", США), оборудованный аргоновым лазером с длинной возбуждения 448 нм и спектрами излучения в области 515-545 нм для FITC и 565595 нм для РЕ Выделение «гейтов» клеток для анализа осуществляли по параметрам прямого и углового светорассеяния (FSC vs SSC) в смешанных линейно-логарифмических режимах (SSC vs FL1, FL2, FL3) или только с применением параметров флуоресценции с логарифмическим усилением сигнала (log/log) В каждом образце анализировали не менее 10 000 событий

Продукцию АФК оценивали по люминол-зависимой хемилюмипесценции при плотности 106 клеток/мл Физиологический раствор для измерений имел состав, мМ NaCl, 138, К.С1, 6, СаС12, 1; MgS04,l, NaHC03, 5, Na2HP04, 1, D-глюкоза, 5 5, HEPES, 10, люминол, 0 35, pH 7 4

Для идентификации и анализа морфологии клеток использовали флуоресцентную микроскопию

Распределение клеток по разньтм стадиям меточного цикла проводили с помощью ApoScreen Annexin V Apoptosis Kit, для определения фрагментации ДНК использовали краситель Hoechst 33258 в концентрации I мкг/мл

Повреждения ДНК в лейкоцитах крови и популяции перитонеальных клеток определяли методом щеючного кочета-теста

Состояние системы репарации ДНК оценивали с помощью метода иммуноферментного анализа

Клеточные белки экстрагировали по методике [Schreiber et al, 1989] Спектр белков в цитогшазматической и ядерной фракции, определяли методом хроматографии высокого разрешения (HPLC) Образцы крови и клеток животных разных групп брали в эксперимент параллельно

Статистический анализ результатов проводили с использованием /-критерия Стьюдента по указанному в каждом случае числу независимых измерений, каждое из которых было проведено на клетках отдельного животного На рисунках указан уровень статистической значимости отличий среднего значения параметра от контрольного значения.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Экспериментальная модель

Для выявления влияния растущей опухоли на периферические клетки врожденного иммунитета была проведена оценка функциональной активности лейкоцитов периферической крови на экспериментальной модели неиммунногенной солидной опухоли мыши Карцинома Льюиса (LLC) является сингенной, неиммунногенной в отношении мышей линии C57BL/6 При постановке модели экспериментальной опухоли мы подобрали оптимальное количество клеток карциномы Льюиса для формирования гетеротопической опухоли с устойчивым контролируемым ростом инъецировали 106 клеток в 150 цл модифицированного раствора Хенкса (HBS) в бедро задней лапы (группа LLC) [Мальцева, 2007] Модифицированный раствор Хенкса имел следующий состав, мМ NaCl, 138; KCl, 6, MgS04, 1; Na2HP04, 1, NaHCOj, 5, D-глюкоза, 5,5, HEPES, 10, pH 7 4 Негативным контролем для инъекции опухолевых клеток служила группа животных с инъекцией HBS такого же объема (группа HBS) Также была взята группа животных без каких-либо воздействий (контрольная группа) Животные 3-х групп содержались в условиях со стандартным режимом кормления, подачи воды и 12 часовым световым днем [Gabdoulkhakova et al, 2003]

В течение эксперимента, ни одна мышь не погибла после инъекции HBS Продолжительность жизни животных с LLC составляла 31±5 суток (п=20) На 28-е сутки наблюдали гибель 50 % животных. Динамику опухолевого роста оценивали по изменению размера бедра, метастазированию опухоли в легкие и продолжительности жизни животных Исследование проводили в период роста опухоли до 21-х суток

У животных с инъекцией опухолевых клеток объем бедра достоверно увеличивался к 10-м суткам, тогда как у животных с инъекцией HBS изменений не наблюдалось (Таблица. 1)

Масса легких у животных с LLC существенно увеличивалась и достоверно отличалась от контрольного параметра к 21-м суткам (Таблица 1), что характеризует стадию активного метаетазирования опухоли. Это было подтверждено гистологическими исследованиями [Мальцева, 2007].

Таблица 1. Изменения размера бедра и массы легких животных в зависимости от продолжительности пост-инъекционного периода

Измеряемый параметр Время, сутки

Контрольные животные Инъекция HBS (0.15 см3) Инъекция LLC (10' клеток в 0.15 см')

10 15 21 10 15 21

Размер лапы, ем3 0.37±0.05 0.39±0.06 0.37±0.03 0.39±0.04 2.8±0.54* 7.9±0 35* 11.5x0.9*

Масса легких, г 0.23±0.02 0.20±0.02 0.2Ш.01 0.17±0.02 0.23±0.02 0.26±0.02 0.44±0.03**

Примечания: объем рассчитывали как у=(1/6)яхс1|хс12*<)з, где с!], (Зг и (1з являются тремя взаимно перпендикулярными измерениями бедра задней ноги. *р<0.001\ **р<0.0/; п=30.

2. Оценка состояния лейкоцитов периферической крови

2.1. Продукция АФК У животных без воспаления наблюдалось

о,1б п Животные с воспалением

увеличение спонтанной продукции

| 0.12 и

1 о.оа г

г 0.06 е

| 0,04

S 0,02

0,00

Т.

Рис. 1. Спонтанная продукция АФК клетками цельной крови животных с острым воспалением. Далее на всех рисунках пунктиром обозначена величина

анализируемого параметра контрольных животных; *р<0,0011 п=20.

Время, сутки

АФК клетками цельной крови в период с 10-х суток по 15-е сутки, которое к 2!-м суткам оставалось на уровне лишь немного превышающем величину АФК, регистрируемую на 15-е сутки. У животных с острым воспалением изменение спонтанной продукции до 15-х суток имело сходную картину. Однако к 21-му дню в группе LLC уровень спонтанной продукции был существенно выше, чем в группе HBS, что указывает на их высокую оксидазную активность и активированное состояние (Рис. 1).

В группах животных без воспаления активированная опсонизированным зимозаном (03) продукция АФК в крови животных с инъекцией HBS на 10-е сутки была несколько

ниже, чем у контрольных животных и снижалась далее к 15-м суткам, не меняясь в дальнейшем (Рис. 2, А). В крови животных с инъекцией опухолевых клеток активированная

Время, сутки Время сутки

Рис. 2. Изменение продукции АФК оценено по люминол-зависимой хемилюминесценции клеток периферической крови животных без воспаления (А) и с воспалением (Б) при активации 0,25 мг/мл 03; *р<0,001\ п=20.

03 продукция АФК возрастала к 10-м и снижалась к 21-м суткам (Рис. 2, А). В группах животных с острым воспалением в брюшной полости активированная продукция АФК в крови животных с инъекцией HBS не изменялась на протяжении эксперимента (Рис. 2, Б). В то же время, у мышей с инъекцией опухолевых клеток наблюдалось значительное увеличение активированной продукции АФК с 10-х но 15-е сутки и ее небольшое снижение на 21-е сутки (Рис. 2 Б).

Изменения уровня продукции АФК у животных с инъекцией HBS и животных с инъекцией клеток LLC, свидетельствуют об активации стрессовой реакции в ответ на инъекцию (механическое повреждение ткани, введение иглы и довольно большого объема раствора в бедренную часть лапы животного). Сама по себе инъекция воспринималась организмом как стрессовое воздействие. Поэтому далее, мы рассматривали два принципиально разных воздействия на организм: 1) механическое повреждение ткани; 2) механическое повреждение ткани и введение опухолевых клеток. В качестве контрольной группы брали животных без инъекции в лапу.

Механический стресс (инъекция HBS или LLC) активирует систему клеточного ответа |Kultz, 2005; Wally et al, 2007]. Одной из главных особенностей стресса является активация продукции АФК и последующее повреждише макромолекул [Mikkelsen and Wadman, 2003]. На модели in vitro при воздействии экзогенной перекисью водорода показан значительный уровень повреждения ДНК в лейкоцитах крови человека [Giovanelli et al., 2003]. Мы предположили, что in vivo повышение уровня АФК в крови мышей также может приводить к повреждению ДНК. В связи с этим была проведена оценка степени повреждения ДНК в лейкоцитах крови методом щелочного комета-теста.

2.2. Повреждение ДНК в лейкоцитах крови

При обработке изображений, полученных при проведении комета-теста, были обнаружены три разновидности «комет»: 1) круглые кометы, характерные для неповрежденных клеток (Рис. 3, А, слева); 2) кометы с веероподобным хвостом, типичные для апоптотических клеток (Рис. 3, А, по середине); 3) кометы с относительно большой

головой и размазанным хвостом, полученные от некротических клеток (Рис. 3, А справа). Классификация изображений сделана согласно работе Tice et al., 2000.

Для определения уровня повреждения ДНК. включающего одно- и двухцепочечные разрывы, мы учитывали кометы с процентом ДНК в хвосте кометы (%TDNA) менее 50%, т.к. более высокий уровень %TDNA присущ клеткам в состоянии апоптоза.

В группах животных без воспаления наблюдалось увеличение повреждения ДНК в лейкоцитах крови по сравнению с контролем на 10-е и 21-е сутки после инъекции 11BS (Рис. 3, Б). Однако у животных с опухолью наблюдаемое повреждение ДНК значительно снижалось к 21-м суткам, и было даже ниже величины, регистрируемой у контрольных животных.

Уровень повреждения ДНК в лейкоцитах животных с воспалением в обеих моделях значительно увеличивался к 10-м суткам, и далее постепенно снижался к 21-м суткам и также становился ниже величины регистрируемой у контрольных животных (Рис. 3, В).

Животные без воспаления

■

Животные с воспалением

■ Контроль

Время, сутм Время. сут*й

Рис. 3. Повреждение ДНК в клетках крови. А - оригинальные изображения комет; Б - уровень повреждения ДНК в лейкоцитах в крови животных без воспаления и (В) с острой воспалительной реакцией; *р<0,001\ п=20.

Между спонтанной продукцией АФК и уровнем повреждения ДНК в лейкоцитах крови животных с инъекцией опухолевых клеток выявлена отрицательная корреляция (г=-0.65). Необходимо отметить, что при проведении комета-теста нами учитывались лишь те клетки, которые имели менее 50% разрывов ДНК, и не учитывались клетки, находящиеся в состоянии апоптоза. Таким образом, увеличение уровня спонтанной продукции АФК в крови привело к активации гибели лейкоцитов через апоптоз.

3. Оценка состояния клеток изолированных из перитонеальной полости

Эволюционно у млекопитающих были сформированы уникальные морфо-функциональные взаимоотношения между брюшной полостью и целостным организмом, кооперативное функционирование которых обеспечивает базовые клеточно-гуморальные

гомеостатические реакции. Выполнение любых манипуляций в брюшной полости отличается от вмешательства в другие органы и ткани из-за ее анатомических, гистологических, цитологических и физиологических особенностей [Соок й а1., 2003]. В первую очередь это отличие состоит в масштабности воздействия", возможность быстрого доступа ко всей площади брюшины, сальника и ко всем внутренним органам. Во-вторых, продукты клеточных реакций, вызванных вмешательством в перитонеальную полость, выбрасываются не только в межклеточный матрикс, кровеносное русло и лимфу, но и в просвет брюшной полости, откуда в последующем происходит их удаление. В-третьих, гетерогенность популяции клеток брюшной полости с преобладанием макрофагов позволяет оценивать изменения во всей системе мононуклеарных фагоцитов [Петров, 1987]. Следовательно, исследование клеток, изолированных из брюшной полости, дает наиболее адекватную оценку системных изменений, происходящих в клетках врожденного иммунитета. В связи с этим была проведена оценка функциональной активности резидентных фагоцитов в брюшной полости и фагоцитов в очаге острого воспаления на разных стадиях развития опухоли.

3.1. Фенотипический состав резидентных теток

Анализ популяции резидентных клеток, выделенных из перитонеальной полости животных, показал увеличение количества резидентных клеток в обеих моделях (НВ8 и

Популяция резидентных клеток

М Киярога ЕПП HBS

ас

130 -j Животные с инъекцией HESS

другие *пе;*и CD16*

Время, сутки Животные с инъекцией LLC

Другие uie-

CD16+ СОЗ+ CD1S*

"О □

Время, сутки

Рис. 4. Анализ популяции резидентных «р, клеток. Количество (А) и

популяционный состав клеток, I И выделенных из перитонеальной полости

| ¡¡Р животных с инъекцией HBS (Б) и

животных с солидной опухолью (В). 1 ■ *р<0,001; п=20.

| И Примечание: CD14+

I Н моноцит/макрофаг; CD15+ - зрелые

Шнейтрофилы; CD3+ - Т-лимфоциты; n ........ CD16+-NK-клетки.

Время, сутк/

LLC). Количество этих клеток продолжало увеличиваться на 15-е и 21-е сутки, причем на 21-е сутки увеличение резидентных клеток у животных с развивающейся опухолью было более чем в 2 раза выше, чем у животных инъецированных HBS (Рис. 4, А).

При анализе состава резидентных клеток было обнаружено, что у животных с инъекцией HBS популяция NK-клеток (CD 16) увеличивается к 10-м суткам, не меняясь в дальнейшем, популяция макрофагов (CD 14) уменьшается с 10-х суток, а популяция зрелых нейтрофилов (CD15) резко увеличивается на 21-е сутки, и на позднем пост-инъекционном сроке популяция нейтрофилов и макрофагов присутствуют в равных соотношениях (Рис. 4, Б). На позднем пост-инъекционном сроке у животных с растущей опухолью резидентные клетки представлены только макрофагами, тогда как у животных с HBS макрофаги, нейтрофилы и NK-клетки представлены в равных количествах.

На основании этих данным можно сделать вывод о том, что механическое повреждение тканей или опухолевый рост приводят к увеличению количества резидентных клеток в перитонеальной полости. Присутствие клеток адаптивного звена иммунитета (CD3+) в период до 15-х суток, говорит о завершении воспалительной реакции в организме. Возможно, что в случае LLC реакция на механическое повреждение завершается более быстро, чем в модели с введением HBS.

3.2. Фенотипический состав клеток в очаге острого воспаления

При исследовании клеток из очага острого воспаления было обнаружено, что

Популяция воспалительных клеток

Животные с инъекцией HBS

Время, сутки

Животные с инъекцией LLC

Другие клетки CD3*

а:

Рис. 5. Анализ популяции клеток из очага острого воспаления. Количество клеток (А) и популяционный состав клеток, выделенных из очага острого воспаления животных с инъекцией НВБ (Б) и животных с развивающейся солидной

опухолью (В). *р<0,001; п=20.

Время, сутки

количество клеток, выделяемых из очага острого воспаления, увеличивалось к 10-м суткам у животных, инъецированных НВЭ и затем практически не изменялось. У животных с солидной опухолью к 10-м суткам количество воспалительных клеток увеличивалось, и далее продолжало расти (Рис. 5, А).

Анализ профиля иммунных клеток воспалительного экссудата показал, что наблюдается увеличение популяции макрофагов у животных с инъекцией НВЭ и снижение популяции нейтрофилов. К 21-м суткам, соотношение популяций в резидентных клетках становится одинаковым. На 15-е сутки обнаруживается значительная популяция Т-лимфоцитов (Рис. 5, Б).

У животных с опухолью, популяция СЭЗ обнаруживается только на 21-е сутки, а популяция СО 16+ клеток, появляющаяся на 10-е сутки, практически исчезает на 15-е и 21-е сутки. В это время количество нейтрофилов намного превышает количество макрофагов (Рис. 5, В).

Эти данные говорят о том, что в группе НВЭ наблюдается тенденция к более быстрому завершению воспалительного процесса, а у животных с опухолью наблюдается пролонгирование острой воспалительной реакции. Увеличение количества мигрировавших в перитонеальную полость воспалительных клеток могло быть вызвано как увеличением общего числа нейтрофилов в крови, так и увеличением продолжительности жизни перитонеальных клеток.

4. Функциональные изменения в клетках перитонеальной полости

Функциональная активность клеток перитонеальной полости была оценена по их способности продуцировать АФК.

4.1. Продукция АФК в популяции резидентных клеток

В клетках животных с инъекцией НВ8 уровень спонтанной хемилюминесценции к

250 375 SCO 625 750 875

Спонтанная продукция АФК

I Контроль

: hbs

Активированная продукция АФК

I Контроль 3 HBS В LLC

Время, сутки

Рис. 6. Продукция АФК резидентными клетками. А - оригинальная запись ХЛ резидентных клеток животных с инъекцией HBS (/) и животных с инъекцией клеток LLC (2) на 21-е сутки. Показаны уровень спонтанной и активированной 0,25 мг/мл 03 продукции АФК. Уровень спонтанной (Б) и вызванной (В) продукции АФК в резидентных клетках мышей с инъекцией HBS или LLC. Измерения проводили при плотности 106 клеток/мл. *р<0,001; **р<0,01\ п=15.

10-м суткам увеличивался, а к 21-м суткам снижался до контрольного значения. Данный параметр в клетках животных с опухолью возрастал в течение всего времени наблюдения (Рис. 6, А и Б), что свидетельствует об их усиливающейся активации.

Аналогично спонтанной продукции АФК уровень активированной 03 продукции АФК у животных с инъекцией HBS увеличивался к 10-м суткам и затем постепенно снижался до контрольного уровня. В клетках мышей с инъекцией опухолевых клеток наблюдалось монотонное увеличение активированной продукции АФК к 21-м суткам (Рис 6, А и В). Эти результаты подтверждаются данными экспериментов по определению внутриклеточной продукции АФК красителем DHR 123.

Усиление спонтанной продукции АФК у животных с HBS на 10-е сутки и у мышей с LLC на 21-е сутки (Рис. 6, Б), говорит об активированном состоянии клеток, большая часть которых представлена макрофагами (Рис. 4, Б; 4, В). Повышенная спонтанная продукция АФК на 10-е сутки у животных с HBS и на 21-е сутки у мышей с LLC трансформирует активность клеток в аутокринной манере.

4.2. Продукция АФК воспалительными клетками

При оценке продукции АФК воспалительными клетками было обнаружено, что

Спонтанная продукция АФК MB Контроль Г-~Т HBS

Активированная продукция АФК

Время, сутки

Рис. 7. Продукция АФК клетками из очага острого воспаления. А — оригинальная запись XJ1 воспалительных клеток животных с инъекцией HBS (/) и животных с инъекцией клеток LLC (2) на 21-е сутки. Показаны уровень спонтанной и активированной 0,25 мг/мл 03 продукции АФК. Уровень спонтанной (Б) и вызванной (В) продукции АФК в резидентных клетках мышей с инъекцией HBS или LLC. Измерения проводили при плотности 106 клеток/мл. *р<0,001; п=15.

Время, сутки

уровень спонтанной продукции АФК увеличивался на 10-е сутки после инъекции HBS и снижался к 21-м суткам (Рис. 7, А и Б). Уровень спонтанной продукции АФК у животных с опухолью на 10-е сутки был близок к контролю и значительно увеличивался лишь к 15-м

суткам. В дальнейшем продукция АФК снижалась, но в отличие от HBS животных оставалась на 21-е сутки в 3 раза выше контроля.

Активированная 03 продукция АФК в обеих рассматриваемых моделях снижалась на 10-е сутки. Тогда как на 15-е и 21-е сутки продукция АФК значительно увеличивалась только у животных с опухолью (Рис. 7, В).

Данные по окраске клеток DHR 123 также свидетельствуют о высоком уровне внутриклеточных АФК в фагоцитах, выделенных из очага воспаления животных с LLC, что говорит об увеличении их цитотоксического потенциала.

Увеличение спонтанной продукции АФК в группе с инъекцией HBS указывает на активированное состояние нейтрофилов (Рис. 7, Б; Рис. 5, Б). АФК выступают в роли фактора аутокринной регуляции, которые влияют на редокс-чувствительные сигнальные каскады в клетке. Кроме того, высокий уровень АФК в клетке может нарушить функции фагоцитов, клеточный никл и привести к повреждению ДНК.

В связи с этим, следующим этапом работы было выявление влияния уровня продукции АФК на фазы клеточного цикла и на уровень повреждения ДНК в резидентных и воспалительных клетках животных с инъекцией HBS или LLC.

5. Оценка состояния клеточного цикла и развития апоптотических процессов

Развитие апоптотических процессов было оценено с использованием разных подходов для выявления стадий апоптоза: определение ранней стадии по экспонированию на поверхности клеток фосфатидилсерина (ФС); определение низкомолекулярных фрагментов ДНК, которые обнаруживаются на поздних стадиях. Было обнаружено, что относительное количество резидентных клеток, имеющих ФС на мембране, было значительно больше контроля в обеих группах инъецированных животных. Максимальный уровень наблюдался на 10-е сутки и далее снижался. В группе с инъекцией LLC уровень экспрессии ФС был ниже, чем у животных с HBS, в течение всего эксперимента (Рис. 8, А).

тПопуляция резидентных клеток . „

А m - Популяция клеток из очага воспаления Б

I •

! X и

Рис. 8. Определение относительного количества клеток, экспонировавших фосфатидилсерин, в популяциях резидентных (А) и воспалительных (Б) клеток в рассматриваемых моделях. *р<0.001, п=3.

При исследовании клеток из очага воспаления было обнаружено, что на 10-е сутки относительное количество клеток, имеющих ФС на своей поверхности, более чем в 2 раза

больше у животных с инъекциями I IBS и LLC. чем у контрольных животных. К 21-м суткам это отношение снижалось у животных с инъекцией HBS, тогда как уровень экспрессии ФС на поверхности воспалительных клеток животных-опухоленосителей немного снижался к 15-м суткам и оставался неизменным на 21-е сутки (Рис. 8, Б).

Оценка распределения клеток по фазам клеточного цикла показала появление клеток, находящихся в фазе «sub-Gi». К 10-м суткам в обеих рассматриваемых моделях в резидентных клетках проявлялось высокое содержание низкомолекулярных фрагментов ДНК (Рис. 9. Б). На 21-е сутки содержание низкомолекулярных фрагментов ДИК снижалось у животных с инъекцией HBS, тогда как у животных с инъекцией клеток LLC оставалось высоким. Сходная картина наблюдалась в клетках, выделенных из очага воспаления (Рис. 9, В).

1 Популяция резидентных клеток

■Ш Коктра-ь

60 , Популяция клеток из очага острого воспаления

¡в Контроль ~ H3S х 50 -) 5SS3S LLC

Рис. 9. Определение относительной фрагментации ДНК в популяциях перитонеальных клеток. А, Б - относительная фрагментация ДНК (%) в популяции резидентных или воспалительных клеток в динамике, соответственно. *р<0.001, п=10.

Нами были установлена корреляция между ранней (Рис. 8, А и Б) и поздней (Рис. 9, Б и В) стадиями апоптоза: для резидентных клеток животных с HBS (»=0,5); для резидентных клеток животных с LLC (/=0,84); для клеток из очага острого воспаления животных с инъекцией HBS (/=0,76) и для клеток из очага острого воспаления животных с инъекцией клеток LLC (/=0,99). Корреляция наблюдалась также между параметрами спонтанной продукции АФК и разньми стадиями апоптоза в воспалительных клетках животных с инъекцией HBS: /-=0,81 для ранней стадии и /=0,98 для поздней. Следовательно, на ранних пост-инъекциопных сроках инициируются апоптотические процессы в фагоцитах животных с инъекцией HBS, и на поздних сроках - в фагоцитах животных с LLC. Возможной причиной этого является усиление спонтанной продукции АФК клетками в рассматриваемых моделях.

7. Активация рЗо МАРК Известно, что р38 МАРК играет важную роль в активации NADPH оксидазы [Forsberg et al., 2001; Kyriakis, Avrich, 2001; Yamamori et al., 2002] и в регуляции апоптоза нейтрофилов [Aoshibaet al., 1999].

При иммуноблотте лизатов клеток, выделенных из очага воспаления, с антителами к

фосфо-р38

МАРК (Рис.

Лизаты целых клеток

10)

происходит

I ?

phospbo-p38 МАРК-

Рис. 10. Активация р38 МАРК в популяции клеток, выделенных из очага воспаления (106 клеток) интактных животных, животных с инъекцией HBS или LLC на 21-е сутки. Присутствие тотальной формы р38 МАРК и актина было определено после стриппинга мембраны.

увеличение количества фосфорилированной формы р38 МАРК в воспалительных клетках животных с инъекцией LLC на 21-е сутки. Количество фосфо-р38 МАРК в клетках контрольных животных и животных с инъекцией HBS не отличается. При анализе данных по уровню фрагментации ДНК (поздняя стадия апоптоза) (Рис. 9, Б) и усилению экспрессии фосфо-р38 МАРК (Рис. 10), можно сделать вывод об участии р38 МАРК в процессе апоптоза воспалительных клетках у животных с инъекцией LLC.

6. Оценка повреждений ДНК и состояния репарационной системы

Следующим шагом было выявление одноцепочечных и двухцепочечных разрывов ДНК в клетках с помощью метода комета-теста, который дает общую оценку генотоксических повреждений в клетке.

Популяция резидентных клеток

Kor.tponB т 7> hbs

П|

Популяция клеток из очага острого воспаления

.......i

Г J

Время, сутки Время, сутки

Рис. 10. Повреждение ДНК в клетках перитонеальной полости контрольных животных, животных с инъекциями HBS или LLC, оцененное с помощью комета-теста. Повреждение ДНК в резидентных клетках (А) и выделенных из очага воспаления (Б). *р<0.001, **р<0.01, п=30.

Значительное увеличение повреждения ДНК было выявлено на 10-е сутки в обеих популяциях клеток у животных с инъекциями HBS или LLC (Рис. 10, А, Б). В дальнейшем

уровень повреждения ДНК постепенно снижался и на 21-е сутки у животных с инъекцией LLC был на уровне контроля, а у животных, инъецированных HBS, - ниже величины, наблюдаемой в контроле. Такая тенденция наблюдалась и в популяции клеток из очага воспаления.

Таким образом, можно сделать вывод о том, что высокий уровень спонтанной продукции АФК в популяции резидентных и воспалительных клеток животных с опухолью приводит к значительным повреждениям ДНК и инициации процесса апоптоза (г=-0,69 для резидентных клеток, г=-0,5 для воспалительных клеток). В тоже время АФК вызывают одно- и двухцепочечные разрывы в молекуле ДНК в популяции воспалительных клеток животных с HBS (г=0,79).

Повреждение ДНК активирует комплекс сигнальных событий для осуществления репарации ДНК и задержке клеточного цикла.

Ранее считалось, что система репарации ДНК присутствует только в популяциях моноцитов, Т- и B-лимфоцитов [Eriksson et al., 2000]. Но в последнее время представление о репарационной системе гранулоцитов изменилось. Sallmyr и соавторы показали, что нейтрофилы также имеют систему репарации ДНК [Sallmyr et al, 2004]. Но из-за наличия в цитоплазме нейтрофилов большого количества гранул с протеолитическими ферментами, которые активируются в процессе выделения клеточных белков, зафиксировать ее присутствие, методически очень трудно.

Ки белок является регуляторной субъединицей ДНК зависимой протеиновой киназы (ДНК-ПК). Ки белок- гетеродимер, состоящий из двух субъединиц: Ки70 (70 кДа) и Ки86

s I а

Дорожка

Рис. 11. Присутствие Ки86 в пробах лизатов клеток, устойчивых к протеазам. На рисунке представлен эксперимент с лизатами популяции резидентных клеток (106 клеток) и популяции клеток, выделенных из очага воспаления (106 клеток) интактных животных, животных с инъекцией HBS или LLC на 10-е и 21-е сутки.

(также называемый Ки80) (86 кДа). Субъединицы тесно связаны друг с другом и не разделяются во время очистки белков [Dynan and Yoo, 1998]. Также известно, что ядерные протеазы могут вызывать физиологическую деградацию Ки86 (регуляторная субъединица),

их высокая активность приводит к артефактной деградации Ku86 [Sallmyr et al., 2004]. Поэтому для стабильности определяемого Ки86 в наших экспериментах был проведен электрофорез лизатов клеток, устойчивых к протеазам. Полученные данные свидетельствует о том, что полная форма Ки86 присутствует и активируется в резидентных и воспалительных клетках животных без инъекций и животных с инъекцией HBS или LLC на 10-е и 21-е сутки (Рис. 11).

Таким образом, в клетках врожденного иммунитета в ответ на разрывы ДНК на раннем пост-инъекционном сроке у животных с HBS происходит активация системы репарации. На позднем сроке, у животных, инъецированных HBS, повреждения ДНК и количество Ки86 снижаются. У животных с опухолевым ростом на 10-е сутки, при относительно высоком уровне повреждений ДНК, происходит деградация регуляторной субъединицы ДНК-ПК. На позднем сроке, уровень повреждений ДНК снижается, что вызвано активацией системы репарации.

7. Оценка количества и спектра белков клеток, изолированных из очага острого воспаления

В последнее время активно обсуждается вопрос об активации экспрессии генов вследствие увеличения АФК в клетках и тканях различных организмов [Allen and Tresini, 2000]. Мнение о том, что нейтрофилы являются короткоживущими, не способными к экспрессии генов широко распространено, и как установлено в последнее время является не верным [Zhang et al., 2004]. Ранее было показано, что нейтрофилы способны к транскрипционно-зависимому синтезу белков теплового шока [Eid et al., 1987], экспрессии мРНК, которая кодирует рецепторы фагоцитов [Jack and Fearon, 1988], изменению в синтезе РНК в ответ на обработку клеток лектином или глюкокортикоидами [Granelli-Piperno et al., 1979]. В нейтрофилах активируются гены, вовлеченные в продукцию АФК, такие как CYBB и CYBA, кодирующие субъединицы NADPH оксидазы gp9F'"'v и p22ph"!', соответственно [Newburger et al., 1991]. Показано, что в первые минуты после начала воспалительной реакции происходит усиление экспрессии белков нейтрофилов. Последние работы рассматривают изменение экспрессии генов в период до 48 ч [Kobayashi et al., 2002; Mönch et al., 2004; Kobayashi et al., 2005].

Рис. 12. Клетки, выделенные из очага воспаления. А - нейтрофилы контрольных мышей; Б, В - клетки мышей с солидной опухолью на 15-й и 21-й день после трансплантации клеток LLC, соответственно. Показаны ядра клеток (зеленый цвет) и зернистость цитоплазмы вокруг ядра (красный цвет). Краситель - акридиновый оранжевый, прижизненная окраска. Масштаб - 2,2 мкм.

Ранее нами было показано, что морфология нейтрофилов у животных с опухолью изменяется - они имеют больший размер, увеличенное ядро с повышенной сегментацией и более выраженную зернистость цитоплазмы (Рис. 12). Диаметр клеток возрастал от 7.4±0.6 мкм (контрольные животные) до 13,1±0,9 мкм на 21 сутки после инъекции опухолевых клеток (р<0,001; n=30) [Safronova el al., 2005].

Появление большого количества мРНК в цитоплазме (окрашивание цитоплазмы на фотографиях в красный цвет) свидетельствует об активации процессов синтеза в нейтрофилах. При анализе параметров размера нейтрофилов и их спонтанной продукции АФК было выявлено увеличение удельной активности па единицу площади поверхности клетки на 10-е и 15-е сутки после инъекции опухолевых клеток. Литературные данные и наши наблюдения дали основание предположить, что изменения морфо-функциональных характеристик клеток связаны с регуляцией синтеза белков.

Далее мы оценили количество и спектр белков в популяции клеток, выделенных из очага острого воспаления. Было обнаружено, что концентрация цитоплазматических белков увеличивалась после инъекций HBS или LLC (Рис. 13). Уже на 10-е сутки количество белка в цитоплазматической фракции клеток мышей с инъекцией HBS или LLC была выше, чем в контроле, и в дальнейшем продолжала увеличиваться, причем у животных с опухолью более значительно (Рис. 13, А).

фтоллазматическая (фракция белков Ядерная фракция белков

ки Время, сутки

Рис. 13. Изменение концентрации белка в цитоплазматической (А) и ядерной (Б) фракциях воспалительных клеток после инъекции HBS или клеток LLC. *р<0,00/; п=3.

Во фракции ядерных белков тоже наблюдалось увеличение концентрации белка с 10-х по 21-е сутки (Рис. 13, Б).

В период с 10-х по 21 -е сутки монотонно возрастала концентрация ядерных белков в клетках животных с инъекцией HBS. Концентрация ядерных белков у животных с инъекцией LLC увеличивалась к 10-м суткам, и далее оставалась на том же уровне (Рис. 13, Б). Таким образом, в отличие от цитоплазматической фракции большее увеличение наблюдалось в клетках животных с инъекцией HBS.

Цнтсплазматичсскаж фракция белков

Ядерная фракция 6ei

I 5 5 5 5 5 5

! И НИ

§ d

а 3 liiiiiiiiirti ' -

АКТИН -• ------" ----—~ -

10-е сутки 15-е сутки 21-е сутки 10-е сутки 15-е сутки 21-е сутки

HBS 90; 78; 32 кДа 85; 78; 75; 59; 33; 30; 16 кДа 73; 31; 31 кДа 29; 28; 26; 23; 20; 13 кДа 103; 39; 28; 22; 12 кДа 88; 54; 40; 22; 13; 12 кДа

LLC 89; 78; 33; 31 кДа 72; 31 кДа 70; 32; 16 кДа U8; 57; 50; 40; 28; 29 «Да 43; 39; 28; 23; 20; ]3 кДа 107; 59; 51; 39; 28; 22; 19, 12кДа

Рис. 14. Электрофореграммы фракций цитоплазматических (А) и ядерных (Б) белков воспалительных клеток животных с инъекциями HBS или LLC. Электорфорез в 12,5 % ПААГ в денатурирующих условиях. Окраска Кумасси R-250. На нижних панелях показаны результаты всстерн-блотта после инкубации мембраны с антителами к актину. В таблицах показано появление новых белков на 10-е, 15-е и 21-е сутки.

Далее был проведен анализ спектра ядерных и цитоплазматических белков клеток выделенных из очага воспаления (Рис. 14, А и Б) в различное время после инъекции HBS или LLC. Была выявлена динамика изменения спектров белков в клетках из очага острого воспаления и обнаружено появление новых фракций белков, отсутствующих в экстрактах клеток интактных животных. В настоящее время мы затрудняемся указать, экспрессия каких генов привела к усиленному синтезу белков, индивидуальный тип которых также предстоит определить. В литературе исследований такого рода па периферических иммунных клетках в настоящее время нет.

До сих пор остается не выясненным, какие изменения претерпевают клетки врожденного иммунитета при стрессовом воздействии или при опухолевом росте. Возможно, в клетках активируются процессы экспрессии генов и синтез белка. Известно, что de novo синтез цитокинов н хемокинов в нейтрофилах, которые необходимы для регуляции иммунного ответа и участия в привлечении эффекторных клеток в очаг повреждения, активирует механизмы защиты [Mönch et al., 2004]. Нами были проведены эксперименты с использованием циклогексимида (CHX), который является ингибитором синтеза цитоплазматических белков на 80 S рибосомах [Досон, 1991].

1200 ШЯ Контроль (-СНХ) Контроль (*СНХ) ЕЗй LLC (-CHXJ WOO ■ LLC МНХ|

Рис. 15. Действие 10

мкг/мл СНХ на изменение концентрации белков в цитоилазматической фракции воспалительных клеток

животных с опухолью; *р<0.001; п=3.

воспалительных

Время, сутки

Инкубация in vitro воспалительных клеток контрольных животных с СНХ приводила к снижению концентрации белка (Рис. 15). Вероятно, что увеличение количества белка при действии СНХ на нейтрофилы животных-опухоленосителей (Рис. 15) связано с активацией экспрессии протоонкогенов, которая подавлена в клетках контрольных животных. В частности в клетках животных с опухолью может изменяться синтез белков, вовлеченных в регуляцию респираторного взрыва, так как ранее было показано, что СНХ влияет на продукцию АФК нейтрофилами [Габдулхакова, 2000].

Таким образом, характер изменений состояния клеток врожденного иммунитета в системном ответе организма, вызванного растущей опухолью, формирует две стадии иммунного ответа. На ранней стадии опухолевого роста происходит подавление иммунного ответа клеток (снижение продукции АФК резидентными и воспалительными клетками), усиление апоптоза фагоцитов и снижение продукции АФК. На поздней стадии происходит усиление продукции АФК, увеличение количество клеток с фрагментированной ДНК, активация метастатического роста и гибель организма. В противоположность опухолевому росту, механическое повреждение тканей, которое организм расценивает как стрессовое воздействие [McNeil and Ito, 1990], приводит к мобилизации иммунной системы (усиление продукции АФК резидентными и воспалительными клетками на раннем сроке, и возвращение к контрольному уровню на позднем сроке; повышение количества клеток с поврежденной ДНК на раннем сроке и возвращение к контрольному уровню на позднем сроке; стабильность репарационной системы ДНК) и сопровождается полным выздоровлением организма.

Стресс часто рассматривают как иммуносупрессивное воздействие, однако гормоны, вырабатываемые при стрессе, могут влиять на иммунные ответы [ТгалсЫтоп! е! а1.. 2002]. Известно, что гормоны и ростовые факторы способствуют выживанию нейтрофилов и активируют процессы апоптоза эозинофилов и базофилов. Они вызывают остановку воспалительного процесса с помощью активации макрофагов и их привлечения в очаг воспаления. Наблюдаемый нами характер системных изменений клеток врожденного иммунитета включает в себя две стадии: фазу раннего ответа и фазу позднего ответа (Рис. 16).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Подавление иммунного ответа на раннем пост-инъекционном сроке (10-е сутки)

Поздний пост-инъекгрюннын срок (21-е с\ тки)

восеяшозпенне '.шыуяаого огсетз

| |фосфо-р38 МАРК

Рис. 16. Гипотетическая схема системных изменений при стрессовом воздействии (механическое повреждение тканей или опухолевый рост). Показаны возможные этапы модификации функционального состояния системы врожденного иммунитета на раннем и позднем пост-инъекционном сроках.

На ранней стадии опухолевого роста происходит подавление иммунного ответа клеток, усиление апоптоза фагоцитов и снижение продукции АФК. На финальной стадии происходит усиление продукции АФК, увеличение количество клеток с фрагментированной ДНК, активация метастатического роста и гибель организма. В противоположность опухолевому росту, механическое повреждение тканей, которое организм расценивает как стрессовое воздействие, приводит к мобилизации иммунной системы, что способствует полному выздоровлению организма. Изменение спектра белков в нейтрофилах на разных сроках после стрессового воздействия указывает- на глубину изменений, происходящих в клетках, и является перспективным направлением для дальнейшего исследования.

ВЫВОДЫ

1. Изменения уровня продукции АФК у животных с инъекциями модифицированного раствора Хенкса или суспенции клеток карциномы Льюиса свидетельствуют об активации воспалительной реакции в ответ на инъекцию (механическое повреждение ткани при введение иглы и большого объема раствора в бедренную часть лапы животного). Сама по себе инъекция воспринимается организмом животного как стрессовое воздействие.

2. Развитие опухоли в организме мыши приводит к увеличению спонтанной продукции АФК клетками крови, что вызывает повреждения ДНК и алоптотическую гибель лейкоцитов крови.

3. Усиление спонтанной продукции АФК в резидентных и воспалительных клетках брюшной полости животных с инъекциями модифицированного раствора Хенкса или

суспенции клеток карциномы Льюиса говорит об их активированном состоянии и трансформации активности клеток в аутокринной манере

4 Выявлена корреляция между уровнем гепотоксических повреждений (разрывы ДНК) и оксидазной активностью клеток врожденного иммунитета у животных с механическим стрессом

5 При росте опухоли в организме или механическом стрессе в клетках врожденного иммунитета (макрофагах и нейтрофилах) повреждение ДНК сопровождается активацией белка Ки86, регулягорной субъедишщы ДНК протеинкиназы

Список основных публикаций по теме диссертации:

Статьи:

1. Сафронова В Г, Матвеева Н К, Авхачева Н В . Сидельникова В М, Ванько J1В, Сухих Г Т Изменение в регуляции оксидазной активности гранулоцитов периферической крови у женщин с привычным невынашиванием беременности Бюлл Эксп Биол Мед 2003 136(9) 295-298

2. Сафронова В Г, Матвеева Н К , Мальцева В Н_, Касабулатов Н М , Авхачева Н В . Ванько Л В, Сухих Г Т Оценка продукции активных форм кислорода и ее регуляции в нейтрофилах периферической крови у женщин с послеродовым эндометритом Бюлл Эксп Биол Мед 2005 140.173-176

3. Мальцева В Н , Авхачева Н В . Санталов Б Ф , Сафронова В Г Наблюдение в динамике модификации функциональной активности периферических нейтрофилов и ее регуляции при росте опухоли in vivo Цитология 2006 48(12) 1000-1009

4. Авхачева НВ , Бредберг А , Сафронова В Г Внутриклеточные сигнальные каскады и система репарации ДНК лейкоцитов в качестве мишеней повреждающего действия активных форм кислорода Сборник трудов Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» 2007 С 163-165

5. Gabdoulkhakova А, Hennksson G, Avkhacheva N . Sofin А, Bredberg A High rate of mutation reporter gene inactivation during human T cell proliferation Immunogertettcs. 2007 59.135-43

Тезисы:

1. Авхачева H В . Миллер А В , Габдулхакова А Г , Сафронова В Г, Шехтман Д.Г. Регуляция респираторного взрыва нейтрофилов при сердечно-сосудистых заболеваниях VI всероссийский научный форум дни иммунологии в Санкт-Петербурге, Мед Иммунол 2002 4(2) С. 139.

2. Maltseva V N., Avkhacheva N V, Miller A.V., Gabdoulkhakova A G, Safronova V G Tumor process tangling signaling systems tn neutrophils from inflammatory center. FEBS Special Meeting on Signal Transduction Brussels, Belgium 2003. P.192 (PS01-0976)

3. Авхачева H В . Мальцева В H , Матвеева Н К, Сафронова В Г., Сухих Г Т Изучение продукции активных форм кислорода келтками крови женщин с нормальным и осложненным течением беременности XV зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва. 2003 С 54

4. Avkhacheva N V , Miller A V, Gabdoulkhakova A G, Safronova V G , Maltseva V.N, Matveeva N К, Sukhih G.T. Two-faced granulocytes defense or alarm under pathologies of reproductive system0 Physiological Society spring Workshop "Receptors and Cell Signalling in Oxidative Stress" Budapest, Hungary 2003. P. 20 P3.

5. Мальцева В H, Авхачева Н В , Сафронова В Г Дисбаланс в регуляции респираторного взрыва нейтрофилов из очага острого воспаления у животных-опухоленосителей VI всероссийский научный форум «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» Мед Иммунол. 2003 4(2) С.

6. Мальцева В.Н, Авхачева Н В., Миллер А В, Габдулхакова А.Г. Функциональная активность нейтрофилов мышей с экспериментальной опухолью Биология - наука 21-го века 7 Пущинская конференция молодых ученых. Пущино 2003. С 30

7. Мальцева В Н., Сафронова В.Г., Авхачева Н В . Садовников В Б. «Изменения функционального состояния и внутриклеточной сигнализации в периферических нейтрофилах при росте опухоли». III Съезд биофизиков России Воронеж 2004. С 251

8. Safronova V G, Maltseva V N, Lenoir А, Avkhacheva N Reorganization of insulin signaling in peripheral neutrophils during m vivo growth of Lewis lung carcinoma Biophysical Society, 49th Annual Meeting, Long Beach, CA, USA 2005 1253-Pos.

9. Мальцева В H , Авхачева Н В. Действие ингибитора р38 МАРК на продукцию активных форм кислорода периферическими иейтрофилами мыши на ранних стадиях роста карциномы Льюиса XI Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология -наука XXI века», Пущино 2005 С 85

10. Авхачева Н В . Сирота Н.П, Винокуров М Г, Мальцева В Н , Бредберг А, Софин А Д, Новоселов В И, Сафронова В Г Повреждение ДНК в иммунных клетках при стрессовых ситуациях: воспалительные реакции на фоне стресса Международный Конгресс «Нейронаука для медицины и психологии». Судак Украина 2006. С 31-33.

11. Maltseva V N , Avkhacheva N V. and Safronova V.G Cancer and immune cells modification of activity and signal transduction in peripheral neutrophils The EMBO/FEBS Advanced Lecture Course on the Island of Spetses Greece. 2007

12. Avkhacheva N V. Sirota N P, Gabdoulkhakova A G., Maltseva V.N , Sofin A.D, Bredberg A., Safronova V.G. Systemic depression of innate immunity at an early cancer stage in a mouse model An AACR special conference in cancer research "Chemical and biological aspects of inflammation and cancer". Oahu, Hawaii, USA 2008 A-ll.

Подписано в печать 23.10 2008 г

Печать трафаретная

Заказ № 1039 Тираж- 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , 36 (499) 788-78-56 \vwvv autorefcral.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Авхачева, Надежда Владимировна

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Иммунитет и иммунная система

1.1.1. Общая характеристика иммунитета и иммунной системы

1.1.2. Неспецифическое звено иммунитета

1.1.3. Полиморфноядерные гранулоциты и мононуклеарные фагоциты

1.1.4. Участия макрофагов и нейтрофшов в воспалительной реакции

1.2. Фагоцитоз - первая линия защиты организма

1.2.1. Кислороднезависимый фагоцитоз

1.2.2. Кислородзависимый фагоцитоз

1.2.2.1. ЫАОРН оксидаза фагоцитов

1.2.2.2. Активация ЫАИРН оксидазы

1.3. Активные формы кислорода

1.3.1. Общая характеристика активных форм кислорода

1.3.2. Система генерации и элиминации активных форм кислорода

1.3.3. Окислительный стресс и его последствия

1.3.4. Молекулярные мишени активных форм кислорода

1.4. Редокс-регуляция выживания или гибели клетки

1.4.1. Активация внутриклеточных процессов, способствующих 35 выживанию клетки

1.4.2. Активация внутриклеточных процессов, приводящих к гибели клетки

1.5. Роль клеток врожденного иммунитета при патологиях

1.6 Взаимосвязь между воспалением и развитием опухоли

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Материалы

2.2. Методы

2.2.1. Биологический объект

2.2.1.1. Забор крови

2.2.1.2. Изолирование резидентных клеток из перитонеалъной 61 полости

2.2.1.3. Изолирование клеток из очага острого воспаления

2.2.2. Создание экспериментальных моделей 61 2.2.2.1. Формирование солидной опухоли

2.2.3. Проточно-цитофлуориметрический анализ

2.2.4. Регистрация хемилюминесценции

2.2.4.1. Описание хемилюминиметра и программного обеспечения

2.2.4.2. Измерение хемилюминесценции образцов с цельной кровью

2.2.4.3. Измерение хемилюминесценции образцов с изолированными 65 клетками

2.2.5. Микроскопия клеток

2.2.6. Определение состояния клеточного цикла с помощью метода 66 проточной цитометрии

2.2.6.1. Определение уровня апоптоза с помощью Annexin V-FITC

2.2.6.2. Определение фрагментации ДНК с помощью красителя 67 Hoechst

2.2.7. Комета-тест

2.2.7.1. Приготовление проб из образцов цельной крови для комета- 68 теста

2.2.7.2. Приготовление проб из образцов изолированных клеток для 69 комета-т еста

2.2.7.3. Условия проведения комета-теста

2.2.8. Электрофорез и иммуноблоттинг

2.2.8.1. Приготовление лизатов целых клеток устойчивых к протеазам

2.2.8.2. Приготовление экстрактов цитоплазматических белков

2.2.8.3. Приготовление экстрактов ядерных белков

2.2.8.4. Условия проведения электрофореза и иммуноблоттинга

2.2.8.4.1. Стриппинг мембраны и вторичная покраска антителами

2.2.9. Оценка изменения спектра белков в цитоплазматической и 72 ядерной фракциях с помощью метода HPLC

2.2.10. Статистическая обработка результатов

Глава 3. Результаты 74 3.1. Создание экспериментальной модели

3.2 Оценка состояния лейкоцитов периферической крови

3.2.1. Продукция АФК

3.2.2. Повреждение ДНК в лейкоцитах крови

3.3 Оценка состояния клеток изолированных из перитонеальной 79 полости

3.3.1. Фенотипический состав резидентных клеток

3.3.2. Фенотипический состав клеток из очага острого воспаления 81 3.4. Функциональные изменения клеток перитонеальной полости

3.4.1. Продукция АФК резидентными клетками

3.4.2. Продукция АФК воспалительными клетками 84 З.З.Оценка состояния клеточного цикла и развития апоптотических 85 процессов

3.6. Активация р38 МАРК

3.7. Оценка повреждений ДНК и состояния репарационной системы 91 ДНК

3.8. Оценка количества и спектра белков клеток, изолированных из 92 очага острого воспаления

Глава 4. Обсуяедение результатов

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Системная оценка состояния клеток врожденного иммунитета в организме с развивающейся опухолью"

Актуальность проблемы. Клетки врожденного иммунитета обеспечивают быструю защиту организма от вторгшихся микроорганизмов, собственных поврежденных и трансформированных клеток [Parham, 2003; O'Beirne and Harrison, 2004; Mocellin, 2005]. Активированные полиморфноядерные и мононуклеарные фагоциты генерируют и высвобождают активные формы кислорода (АФК), которые вовлекаются в защитные механизмы [Segal, 2005; Dale et al., 2008]. При избыточной продукции АФК являются повреждающим фактором для окружающих клеток [Trachootam et al., 2008]. Очевидно, что активированные фагоциты контактируют непосредственно с собственными токсичными метаболитами, которые трансформируют их активность в аутокринной манере [Belardelli and Ferrantini, 2002]. Действие эндогенно продуцируемых АФК на сами фагоциты изучено фрагментарно [Splettstoesser and Schuff-Werner, 2002; Fang, 2004; Ilalliwell, 2006].

Многие заболевания сопровождаются нарушениями регуляции генерации АФК, что способствует углублению патологического процесса. Так, была показана повышенная продукция АФК клетками в крови пациентов с острыми воспалительными заболеваниями [Fruhwirth, 1998; Song, 1998; Сафронова и др., 2005], диабетом [Lopes et al., 2008] и ревматиодным артритом [Gelderman et al., 2007]. Нами были обнаружены изменения в генерации АФК и ее регуляции у больных с заболеваниями репродуктивной и сердечно-сосудистой систем [Авхачева и др., 2002; Авхачева и др., 2003; Сафронова и др., 2003]. Функциональные характеристики фагоцитов, включая способность к продукции АФК, также изменяются в организме с развивающейся опухолью [Chasseing et al., 1993; Szuster-Ciesielska et al., 2004; Мальцева и др., 2006].

В настоящее время большое внимание уделяют взаимоотношениям между клетками врожденного иммунитета и опухолью [Ruegg, 2006].

Считается, что воспалительный компонент является критическим в развитии солидных опухолей, так как зачастую опухоли возникают в местах инфицирования и воспаления [Mueller and Fusenig, 2004; Mantovani et al., 2008]. Нейтрофилы и макрофаги служат основными эффекторными клетками воспалительной реакции. Воспалительные клетки обильно инфильтрируют микроокружение опухоли [Di Carlo et al., 2001; Dedon, 2004; Ostrand-Rosenberg, 2008]. Действие их токсических продуктов, в том числе АФК, носит про- или противоопухолевый характер в зависимости от стадии развития и локализации опухоли [Bingle et al., 2002; Coussens, 2008]. Активно развивающаяся опухоль продуцирует вещества (цитокины, хемокины, факторы роста), которые привлекают фагоциты и могут трансформировать их морфологически и функционально вплоть до репрограммирования, что показано в in vitro экспериментах [Araki et al., 2004]. Опухоль создает в организме специфический метаболический фон, влияющий на все клетки, особенно на наиболее мобильные, каковыми являются нейтрофилы и макрофаги. Остается не изученным влияние растущей опухоли на состояние клеток врожденного иммуншета периферических по отношению к опухоли, то есть находящихся в удаленных от опухоли органах.

Цели и основные задачи исследования. Цель данной работы состояла в оценке изменений, происходящих в периферических клетках врожденного иммунитета в системах организма (кровеносное русло, брюшная полость, очаг острого воспаления в брюшной полости) при развитии опухоли в организме.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1) па экспериментальной модели неиммуногенной солидной опухоли мыши оценить функциональную активность фагоцитов крови, резидентных фагоцитов брюшной полости и фагоцитов из очага острого воспаления, на разных стадиях развития опухоли;

2) определить распределение. фагоцитов по фазам клеточного цикла, оценить связь распределения с оксидазной активностью клеток;

Научная новизна. Впервые установлено, что стрессовое воздействие (механическое повреждение ткани) приводит к активации системы врожденного иммунитета на ранних сроках после воздействия (10-е сутки) и нормализует ее функции на поздних сроках (21-е сутки). Впервые показано, что развитие опухоли в организме животного сопровождается последовательными системными изменениями функциональной активности периферических но отношению к опухоли клеток врожденного иммунитета. Получены однозначно новЕле данные, свидетельствующие о том, что на ранней стадии опухолевого роста происходит снижение продукции АФК и усиление апоптоза периферических фагоцитов. На поздней стадии, при интенсивном метастазировании, усиливается генерация АФК фагоцитами, увеличивается количество лейкоцитов с фрагмептированпой ДНК. Впервые показано изменение спектра белков, включая синтезированные de novo, в клетках перитонеалыюй полости на разных сроках постинъекционного воздействия. Результаты работы свидетельствуют о системной трансформации периферических иммунных клеток во время роста опухоли.

Научно-практическая ценность. Исследование молекулярных механизмов, лежащих в основе модификации функциональной активности клеток иммунной системы, относится к фундаментальным проблемам биологии клетки и иммунологии. Полученные результаты расширяют представление о состоянии клеток врожденного иммунитета при стрессовых воздействиях, воспалительных реакциях и при растущей в организме опухоли. Полученные в ходе данного исследования результаты помогают понять механизмы модификации клеток врожденного иммунитета и найти новые терапевтические подходы к лечению онкологических заболеваний.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях и школах: Всероссийский научный форум с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2002, 2003); Пущинская конференция молодых ученых (Пущино, 2003-2005); XV зимняя международная молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2003); FEBS Special Meeting on Signal Transduction (Бельгия, 2003); отчетная годичная научная конференция ИБК РАН (Пущино, 2003); Physiological Society Spring Workshop "Receptors and Cell Signalling in Oxidative Stress" (Венгрия, 2003); III Съезд биофизиков России (Воронеж, 2004); Biophysical Society, 49th Annual Meeting (Long Beach, CA, USA, 2005); Международный Конгресс «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Украина, 2006); The EMBO/FEBS Advanced Lecture Course "Molecular mechanisms in signal transduction and cancer" (Греция, 2007); An AACR Special Conference "Chemical and Biological Aspects of Inflammation and Cancer" (USA, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 печатных работ, из них 5 статей и 1 статья в печати.

Список сокращений:

АФК - активные формы кислорода; ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;

NADPH - никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный; МНС - главный комплекс гистосовместимости (major histocompatibility complex);

CD - кластер дифференциации (cluster of differentiation); NET - neutrophils extracellular traps; TLR - toll-like receptor; IL - интерлейкины;

TNF-a - фактор некроза опухолей-a (tumor necrosis factor-a), ITAM - immunoreceptor tyrosine-based activation motif; РМА-форбол 12-миристат 13-ацетат; PKC - протеинкиназа С; GTP - гуанозин трифосфат;

МАРК - митоген-активируемые протеинкиназы (mitogen-activated protein kinases);

PI3K - фосфатидилинозитол-3-киназа;

ERK- киназы, регулируемые внеклеточным сигналом (extracellular signalregulated kinases);

DNA-PKcs - ДНК-зависимая протеин киназа, каталитическая субъединица;

PARP-1 - поли(АОР-рибоза) полимераза-1 (Poly(ADP-ribose) polymerase

О;

HLA - human leukocytes antigen;

XJI - люминол-зависимая хемилюминесценция;

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Авхачева, Надежда Владимировна

выводы

2. Развитие опухоли в организме мыши приводит к увеличению спонтанной продукции АФК клетками, крови, что вызывает повреждения ДНК и апоптотическую гибель лейкоцитов крови.

3. Усиление спонтанной продукции АФК в резидентных и воспалительных клетках брюшной полости животных с инъекциями модифицированного раствора Хенкса или суспенции клеток карциномы Льюиса говорит об их активированном состоянии и трансформации активности клеток в аутокринной манере.

4. Выявлена корреляция между уровнем генотоксических повреждений (разрывы ДНК) и оксидазной активностью клеток врожденного иммунитета у животных с механическим стрессом.

5. При росте опухоли в организме или механическом стрессе в клетках врожденного иммунитета (макрофагах и нейтрофилах) повреждение ДНК сопровождается активацией белка Ки86, регуляторной субъединицы ДНК протеинкиназы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Авхачева, Надежда Владимировна, Пущино

1. Абелев Г.И. / Основы иммунитета // Сорос. Образ, журн. 1996. № 5. С. 4- 10.

2. Бодяжина В.И., Любимова А.И., Розовский И.С. Привычный выкидыш: М., 1973.

3. Василенко И.В., Кондратюк З.Б. / Паренхиматозно-стромальные взаимоотношения в опухолях и их особенности при раке желудка кишечного и диффузного типа // Онкология. 2006. Т.8. С. 7-12.

4. Владимиров Ю.А., Шерстнев М.П. / Хемилюминесценция клеток животных. // Итоги науки и техники. М: ВИНИТИ, 1989, т. 24, 176 с.

5. Владимиров Ю.А. / Свободные радикалы в биологических системах // Соросовский образовательный журнал. 2000. Т. 6, № 12. С. 13-19.

6. Габдулхакова А.Г. / Роль фосфорилировапия в активации и праймировании респираторного взрыва нейтрофилов. // Диссертация на соискание уч. степени к.б.н. Пущино. 2000. 110 с.

7. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. -М.: Мир, 1991.-232 с.

8. Кольман Я., Рем К.-Г. / Наглядная биохимия. // 2000. М. «Мир». 470 с.

9. Кудряшов Ю.Б. / Радиационная биофизика (ионизирующие излучения). // М.: ФИЗМАТЛИТ. 2004. 448 с.

10. Кулинекий В.И. / Активные формы кислорода и оксидативная модификация макромолекул: польза, вред и защита. // Соросовский образовательный журнал. 1999. Vol. 1. С. 2-7.

11. Мальцева В.Н. / Респираторный взрыв и особенности его регуляции в периферических нейтрофилах при росте опухоли in vivo. Диссертация на соискание уч. степени к.б.п. Пущино. 2007. 131 с.

12. Мерзляк М.Н. / Активированный кислород и жизнедеятельность растений // Соросовский образовательный журнал. 1999. № 9. С. 20-26.

13. Проскуряков С.Я., Габай В.Л., Коноплянников А.Г. Биохимия. 2002. / Некроз активная, управляемая форма программируемой клеточной гибели. // Vol. 67. Р. 467-491.

14. Сухих Г.Т., Сафронова В.Г., Ванько Л.В. / Современные представления о роли фагоцитов в патогенезе осложнений беременности. // Бюллетень эксп. биол. и мед. 2002. 134(8): 124-135.

15. Тотолян A.A. и Фрейдлин И.С. / Клетки иммунной системы. // Том I. СПб.: Наука. 2000. 231 с.

16. Турпаев К.Т. / Активные формы кислорода и регуляция экспрессии генов // Биохимия. 2002. Т. 67, № 3. С. 339-352.

17. Фильченков, A.A. / Каспазы: регуляторы апоптоза и других клеточных функций. // Биохимия. 2003. Vol. 68. Р. 453-466.

18. Хавинсон В.Х., Баринов В.А., Арутюнян A.B., Малинин В.В. / Свободнорадикальное окисление и старение. // Санкт-Петерберг: Наука, 2003. 327 с.

19. Чанакчи Ч., Чичек Я., Чанакчи В. / Активные формы кислорода и воспалительные процессы в зубах человека // Биохимия. 2005. Т. 70, № 6. С. 751-761.

20. Abe J., Kusuhara M., Uleviteh R.J., Berk B.C., Lee J-D. / Big mitogen-activated protein kinase 1 (BMK1) is a redox-sensitive kinase. //J. Biol. Chem. 1996. Vol. 271. P. 165886-16590.

21. Abraham M.C. and Shaham S. / Death without caspases, caspases without death. // TRENDS Cell Biol. 2004. Vol. 14. 184-193.

22. Adam J.K., Odhav B., Bhoola K.D. / Immune responses in cancer. // Pharmacol. Ther. 2003. Vol. 99. P. 113-132

23. Ado A.D. / Uber den Verlauf der oxydativen und glykolytischen Prozesse in der Leukocyten des entzündeten Gewebs wahrend der Phagocytise. //Z. Gen. Exp. Med. 1933. Vol. 87. P. 473-481.

24. Allen R.C., Loose L.D. / Phagocytic activation of a lumonol-dependent chemiluminescence in rabbit alveolar and peritoneal macrophages. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1976. Vol. 69. P. 245-252.

25. Allen R.G. and Tresini M. / Oxidative stress and gene regulation. // Free Rad. Biol. Med. 2000. Vol. 28. P. 463-499.

26. Altieri F., Grillo C., Maceroni M., Chichiarelli S. // DNA damage and repair: from molecular mechanisms to health implications. // Antiox. Redox. Signal. 2008. Vol. 10. P. 891-937.

27. Alvarado-Kristensson M., Melander F., Leandersson K., Ronnstrand L., Wernstedt C., Andersson T. /p38-MAPK signal survival by phosphorylation of caspase-8 and caspase-3 in human neutrophils. // J. Exp. Med. 2004. Vol. 199. P. 449-158.

28. Angel P. and Karin M. / The role of Jun, Fos and the AP-1 complex in cell-proliferation and transformation. // Biochim. Biophys. Acta. 1991. Vol. 1072. P. 129-157.

29. Aravind L. and Koonin E.V. / Prokaryotic homologs of the eukaryotic DNA-end-binding protein Ku, novel domains in the Ku protein and prediction of a prokaryotic double-strand break repair system. // Genom. Res. 2001. Vol. 11. P. 1365-1374.

30. Audebert M., Salles B., Calsou P. / Involvement of poly(ADP-ribose) polymerase-1 and XRCC1/DNA ligase III in an alternative route for DNA double-strand breaks rejoining. // J. Biol. Chem. 2004. Vol. 279. P. 55117— 55126.

31. Awasthi Y.C., Sharma R., Cheng J.Z., Yang Y., Sharma A., Singhal S.S., Awasthi S. / Role of 4-hydroxynonenal in stress-mediated apoptosis signaling. // Mol. Aspects Med. 2003. Vol. 24. P. 219-230.

32. Babior B.M. / NADPH oxidase. // Curr. Opin. Immunol. 2004. Vol. 16. P. 42-47.

33. Babior B.M. /NADPH oxidase: an update. // Blood. 1999. Vol. 93. P. 1464-1474.

34. Babior B.M. The leukocyte NADPH oxidase // Isr. Med. Assoc. J. 2002. Vol.4. P. 1023-1024.

35. Baron J.A., Sandler R.S. / Nonsteroidal anti-inflammatory drugs and cancer prevention. //Annu. Rev. Med. 2000. Vol. 51. P. 511-23.

36. Baylin S.B. / Tying it all together: epigenetics, genetics, cell cycle, and cancer. // Science. 1997. Vol. 277. P. 1948-1949.

37. Baylin S.B. and Herman J.G. / DNA hypermethylation in tumorigenesis: epigenetics joins genetics. // Trends Genet. 2000. Vol. 16. P. 168-174.

38. Beckman K.B. and Ames B.N. / Oxidative decay of DNA. // J. Biol. Chem. 1997. Vol. 272. P. 19633-19636.

39. Ben-Baruch A. / Inflammation-associated immune suppression in cancer: the roles played by cytokines, chemokines and additional mediators. // Sem. Cancer. Biol. 2006. Vol. 16. P. 38-52.

40. Bernardi P. / Mitochondrial transport of cations: Channels, exchangers, and permeability transition. // Physiol. Rev. 1999. Vol. 79. P. 1127-1155.

41. Bevan M. J. / Cross-priming for a secondary cytotoxic response to minor II antigens with H-congenic cells which do not cross-react in the cytotoxic assay. //J. Exp. Med. 1976. Vol. 143. P. 1283-1288.

42. Bhaskar P.T. and Hay N. // The two TORCs and Akt. // Dev. Cell. 2007. Vol. 12. P. 487-502.

43. Bhowmick N.A., Moses H.L. / Tumor-stroma interactions // Curr. Opin. Genet Dev. 2005. Vol. 15. P. 97-101.

44. Bindoli A., Fukuto J.M., Forman H.J. / Thiol chemistry in peroxidase catalysis and redox signaling. // Antiox. Redox. Signal. 2008. Vol. 10. P. 15491564.

45. Bokoch, G. M., Diebold, B. A. / Current molecular models for NADPH oxidase regulation by Rac GTPase. // Blood. 2002. Vol. 100. P. 2692-2696.

46. Bonatto D., Revers L.F., Brende M., Henriques J.A.P. / The eukaryotic Pso2/Snml/Artemis proteins and their function as genomic and cellular caretakers. // Brazil. J. Med. Biol. Res. 2005. Vol. 38. P. 321-334.

47. Bouchard V.J., Rouleau M., Poirier G.G. / PARP-1, a determinant of cell survival in response to DNA damage. // Exp. Hematol. 2003. Vol. 31. P. 446454.

48. Bourdon E. and Blache D. / The importance of proteins in defense against oxidation. //Antioxid. Redox. Signal. 2001. Vol. 3. P. 293-311.

49. Boveris A. and Chance B. (1973) Biochem. J. 134, 707-716.

50. Brandes R.P. and Kreuzer J. // Vascular NADPH oxidases: molecular mechanisms of activation. // Cardiovasc. Res. 2005. Vol. 65. P. 16-27.

51. Brigelius-Flohe R. / Glutatione peroxidases and redox-regulated transcription factors. //Biol. Chem. 2006. Vol. 387. P. 1329-1335.

52. Brinkmann V., Zychlinsky. A. / Beneficial suicide: why neutrophils die to makeNETs. //Nature Rev. Microbiol. 2007. Vol. 5. P. 577-592.

53. Brinkmann, V. et al. / Neutrophil extracellular traps kill bacteria. // Science. 2004. Vol. 303. P. 1532-1535.

54. Broekemeier, K.M., Dempsey, M.E., and Pfeiffer, D.R. / Cyclosporin A is a potent inhibitor of the inner membrane permeability transition in liver mitochondria. //J. Biol. Chem. 1989. Vol. 264. P. 7826-7830.

55. Burhans W.C. and Weinberger M. / DNA replication stress, genome instability and aging. // Nucl. Acid. Res. 2007. Vol. 5. P. 1-12.

56. Burhans W.C. and Weinberger M. / DNA replication stress, genome instability and aging. // Nucleic. Acids. Res. 2007. Vol. 35. P. 7545-7556.

57. Cavaillon J-M. and Duff G. / Cytokines and the cellular mechanism of inflammation. // In The cytokine network and immune functions. Oxford University Press, Oxford. 1999. P. 251-261.

58. Chae H. Z., Chung S. J., Rhee S. G. / Thioredoxin-dependent peroxide reductase from yeast. //J. Biol. Cheml. 1994. V. 269. P. 27670-27678.

59. Chasseing N.A., Baranao R.I,, Fernandez O., Bordenave H., Rumi L.S. / Chemiluminescence production by neutrophils and immune complex levels in cancer patients//Cancer Invest. 1993. Vol. 11. P. 517-522.

60. Chiarugi P. / PTPs versus PTKs: the redox side of the coin. // Free Radic. Res. 2005. Vol. 9. P. 353-364.

61. Clark P., Boswell F., Greer I.A. // Semin. Reprod. Endocrinol. 1998. 16:57-64.

62. Clark, R. A. / Activation of the neutrophil respiratory burst oxidase. // J. Infect. Dis. 1999. Vol. 179. P. S309-317.

63. Clark, S. R. et al. / Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteria in septic blood. // Nature Med. 2004. Vol. 13. P. 463-469.

64. Cocuzza М., Sikka S.C., Athayde K.S., Agarwal A. / Clinical relevance of oxidative stress and sperm chromatin damage in male infertility: an evidence based analysis. // Int. Braz. J. Urol. 2007. Vol. 33. P. 603-21.

65. Cohen G.M. / Caspases: the executioners of apoptosis. // Biochem. J. 1997. Vol. 326. P. 1-16.

66. Collins A.R., Cadet J., Moller L., Poulsen H.E., Vina J. / Are we sure we know how to measure 8-oxo-7,8-dihydroguanine in DNA from human cells? // Arch. Biochem. Biophys. 2004. Vol. 423. P. 57-65.

67. Commoner B, Townsend J, and Pake GE./ Free radicals in biologycal materials.//Nature 1954: 174:689-691.

68. Cook A.D., Braine E.L., Hamilton J.A. / The phenotype of inflammatory macrophages is stimulus dependent: implications for the nature of the inflammatory response. //J Immunol. 2003. Vol. 171. P. 4816-4823.

69. Counts J.L. and Goodman J.I. / Alterations in DNA methylation may play a variety of roles in cancerogenesis. // Cell. 1995. Vol. 83. P. 13-15.

70. Coussens L.M. and Werb Z. / Inflammation and cancer. // Nature. 2002. Vol. 420. P. 860-867.

71. Coussens L.M. and Werb Z. / Inflammatory cells and cancer: think different! //J.Exp. Med. 2001. Vol. 193. F23-F26.

72. Cowburn A. S., Deighton J., Walmsley S. R. and Chilvers E. R. / The survival effect of TNF-alpha in human neutrophils is mediated via NF-kappa B-dcpendent IL-8 release. // Eur. J. Immunol. 2004. Vol. 34. P. 1733-1743.

73. Crompton, M. / The mitochondrial permeability transition pore and its role in cell death .//Biochem. J. 1999. Vol. 341. P. 233-249.

74. Cross A. R. and James О. T. G. (1991) Biochim. Biophys. Acta 1057, 281-298.

75. Dale D.C., Boxer L., Liles W.C. / The phagocytes: neutrophils and monocytes. // Blood. 2008. Vol. 112. P. 935-944.

76. Deby C. and Goulter R. / New perspectives on the biochemistry of superoxide anion and the efficiency of superoxide dismutases. // Biochem. Pharmacol. 1990. Vol. 39. P. 399-405.

77. DeLeo, F. R., Quinn, M. T. / Assembly of the phagocyte NADPH oxidase: molecular interaction of oxidase proteins. // J. Leukoc. Biol. 1996. Vol 60. P. 677-691.

78. Deveraux, Q.L., Leo, E., Stennicke, H.R., Welsh, K., Salvesen, G.S., and Reed, J.C. (1999) EMBO J., 18, 5242-5251.

79. Deveraux, Q.L., Takahashi, R., Salvesen, G.S., and Reed, J.S. (1997) Nature, 388, 300-304.

80. Di Carlo E., Forni G., Lollini P. / The intriguing role of polymorphorphonucler neutrophils in antitumor reactions. // Rev. Am. Soc. Hematol. 2001. Vol. 97. P. 339-345.

81. Diebold, B. A. and Bokoch, G. M. / Molecular basis for Rac2 regulation of phagocyte NADPH oxidase. //Nat. Immunol. 2001. Vol. 2. P. 211-215.

82. Dillon R.L., White D.E., Muller W.J. / The phosphatidyl inositol 3-kinase signaling network: implications for human breast cancer. // Oncogene. 2007. Vol. 26. P. 1338-1345.

83. Doherty A.J. and Jackson S.P. / DNA repair: How Ku makes ands meet. // Curr. Biol. 2001. Vol. 11. P. 920-924.

84. Droge W. / Free radical in the physiological control of cell function. // Physiol. Rev. 2002. 82: 47-95.

85. Dusi, S., Donini, M., Rossi, F. / Mechanisms of NADPH oxidase activation: translocation of p40phox, Racl and Rac2 from the cytosol to the membranes in human neutrophils lacking p47phox or p67phox. // Biochem. J. 1996. Vol.314. P. 409-^12.

86. Dynan W. and Yoo S. / Interaction of ku protein and DNA-dependent protein kinase catalytic subunits with nucleic acids. // Nucl. Acid. Res. 1998. Vol.26. P. 1551-1559.

87. Edwards S. W., Derouet M., Howse M. and Moots R. J. / Regulation of neutrophil apoptosis by Mcl-1. // Biochem. Soc. Trans. 2004. Vol. 32. P. 489492.

88. Eid N.S., Kravath R.E., Lanks. K.W. / Heat-shpck protein synthesis by human polymorphonuclear cells. // J. Exp. Med. 1987. Vol. 140. P. 4286-4293.

89. El-Benna J., My-Chang Dang P., Gougerot-Pocidalo M.A., Elbim C. / Phagocyte NADPH oxidase: a multicomponent enzyme essential for host defenses. //Arch. Immunol. Ther. Exp. 2005. Vol. 53. P. 199-206.

90. Elenkov I.J. and Chrousos G.P. / Stress system organization, physiology and immunoregulation. // Neuroimmunomoodulation. 2006. Vol. 13. P. 257-267.

91. Ellis T. N. and Beaman B. L. / Interferon-gamma activation of polymorphonuclear neutrophil function. // Immunol. 2004. Vol. 112. P. 2-12.

92. Enari, M., Sakahira, H., Yokoyama, H., Okawa, K., Iwamatsu, A., Nagata, S. / A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis and its inhibitor ICAD. //Nature. 1998. Vol. 391. P. 43-50.

93. Eriksson A., Lewensohn R., Nilsson A. / Expression and activity of DNA-dependent protein kinase in normal human leukocytes. // Anticancer. Res. 2000. Vol. 20. P. 3051-3058.

94. Evans M.D., Dizdaroglu M., Cooke M.S. / Oxidative DNA damage and disease: induction, repair and significance. // Mutat. Res. 2004. Vol. 567P. 161.

95. Ezekowitz R.A. and Gordon S. / Alterations of surface properties by macrophage activation: expression of receptors for Fc and mannose-terminal glycoproteins and differentiation antigens. // Contemp. Top. Immunobiol. 1984. Vol. 13. P. 33-56.

96. Fagagna F.A. / Living on a break: cellular senescence as a DNA-damage response. //Nature. Rev. Cancer. 2008. Vol. 8. 512-522.

97. Faraci F.M. and Didion S.P. / Vascular protection: superoxide dismutase isoforms in the vessel wall. // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2004. Vol. 24. P. 1367-1373.

98. Federico A., Morgillo F., Tuccillo C., Ciardiello F., Loguercio C. / Chronic inflammation and oxidative stress in human carcinogenesis. // Int. J. Cancer. 2007. Vol. 121. P. 2381-2386.

99. Finkel T and Ilolbrook N.J. / Oxidants, oxidative stress and the biology of aging. // Nature. 2000. Vol. 408. P. 239-247.

100. Finkel T. / Redox-dependent signal transduction. // FEBS Lett. 2000. Vol. 476. P. 52-54.

101. Franchimont D., Kino T., Galon J., Meduri G.U., Chrousos G. / Glucocorticoids and inflammation revisited: the start of the art. // Neuroimmunomodul. 2002. Vol. 10. P. 247-260.

102. Freeman J.L., Lambeth J.D. NADPH oxidase activity is independent of p47phox in vitro //J Biol Chem. 1996. Vol. 271. P. 22578-82.

103. Fridovich I. / The biology of oxygen radicals. // Science. 1978. Vol. 201. P. 875-880.

104. Fu, J., Jin, Y., Arend, L.J. (2003) J. Biol. Chem., 278, 52660-52672.

105. Fuchs T.A., Abed U., Goosmann C., Ilurwitz R., Schulze L, Wahn, Weinrauch Y., Brinkmann V., Zychlinsky. A. / Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. // J. Cell Biol. 2007. Vol. 176. P. 231-241.

106. Fujino G., Noguchi T., Takeda K., Ichijo H. / Thioredoxin and protein kinases in redox signaling. // Sem. Cancer Biol. 2006. Vol. 16. P. 427-435.

107. Gabdoulkhakova A., Henriksson G., Avkhacheva N., Sofin A., Bredberg A. / High rate of mutation reporter gene inactivation during human T cell proliferation. // Immunogen. 2007. Vol. 59. P. 135-143.

108. Gabdoulkhakova A.G, Safronova V.G., Miller A.V., Sadovnikov V.B. Expression of genotypic and phenotypic features in animals during activationand priming of the neutrophil respiratory burst // Baltic J. Lab. Annim. Sci. -2003. Vol. 4. - P. 29-34.

109. Gabic T.G. / The C>2-forming oxidase responsible for the respiratory burst in human neutrophils. // J. Biol. Chem. 1979. Vol. 254. P. 9070-9074.

110. García-Rodríguez L.A., Huerta-Alvarez C. / Reduced risk of colorectal cancer among long-term users of aspirin and nonaspirin nonsteroidal antiinflammatory drugs. // Epidemiology. 2001. Vol.12. P.88-93.

111. Geiszt M. / NADPH oxidases: New kids of the block. // Cardiovasc. Res. 2006. Vol. 71. P. 289-299.

112. Gerber, J. S. and Mosser, D. M. / Reversing lipopolysaccharide toxicity by ligating the macrophage Fc gamma receptors. // J. Immunol. 2001. Vol. 166. P. 6861-6868.

113. Ghezzi P. / Oxidoreduction of protein thiols in redox regulation. // Biochem. Soc. Transac. 2005. Vol. 33. P. 1378-1381.

114. Gilmore TD. / Introduction to NF-kappaB: players, pathways, perspectives. // Oncogene. 2006. Vol. 25. P. 6680-6684.

115. Giulivi C., Traaseth N.J., Davies K.J.A. / Tyrosine oxidation products: analysis and biological relevance. // Amino Acids. 2003. Vol. 25. P. 227-232.

116. Giovanelli L., Pitozzi S.R., Dolara P. / Measurement of DNA breaks and oxidative damage in polymorphonuclear and mononuclear white blood cells: a novel approach using the comet assay. // Mutat. Res. 2003. Vol. 538. P. 7180.

117. Goerdt S., Politz. O., Schledzewiski K., Birk R., Gratchev A., Guillot P., Hakiy N., Klemke C.D., Dippel E., Kodelja V., Orfanos C.E. / Alternative versus classical activation of macrophages. // Pathobiology. 1999. Vol. 67. P. 222-226.

118. Goldsby R.A., Kindt T.J., Osborne B.A. / Leukocyte migration and inflammation. // In Immunology. WH Freeman and Company. 2001. New York. P. 371-393.

119. Goldsby R.A.A., Kuby J., Kindt Th. J. / Immunology. 4th Edition. // 2000. P. 670.

120. Granelli-Piperno A., Vassalli J.D., Reich E. / RNA and protein synthesis in human peripheral blood polymorphonuclear leukocytes. // J.Exp.Med. 1979. Vol. 149. P. 284-289.

121. Grant S.G., Das R., Cerceo C.M., Rubinstein W.S., Latimer J.J. / Elevated Levels of Somatic Mutation in a Manifesting BRCA1 Mutation Carrier. // Pathol. Oncol. Res. 2007. Vol. 13. P. 276-283.

122. Grembowicz K.P., Sprague D., McNeil P.L. / Temporary disruption of the plasma membrane is required for c-fos expression in response to mechanical stress. //Mol. Biol. Cell. 1999. Vol. 10. P. 1247-1257.

123. Groemping Y., Rittinger K. Activation and assembly of the NADPII oxidase: a structural perspective//Bio chem. J.-2005. Vol. 386. P. 401—416.

124. Guo J., Zhu T., Xiao Z-X.J., Chen C-Y. / Modulation of intracellular signaling pathways to induce apoptosis in prostate cancer cells. // J. Biol. Chem. 2007. Vol. 282. P. 24364-24372.

125. Ha H.C., and Snyder S.H. / Poly(ADP-ribose) polymerase is a mediator of necrotic cell death by ATP depletion. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. Vol. 96. P. 13978-13982.

126. Haley P.J. / Species differences in the structure and function of the immune system. // Toxicol. 2003. Vol. 188. P. 49.

127. Halliwell B. and Gutteridge J.M. / Cellular response to oxidative stress: adaptation, damage, repair, senescence and death in free radical in biology and medicine. // Oxford: Oxford University Press. 2007. P. 187-267.

128. Hampton M.B. and Orrenius S. / Dual regulation of caspase activity by hydrogen peroxide: implications for apoptosis.// FEBS Lett. 1997. Vol. 414. P. 552-556.

129. Hampton M.B., Kettle A.J., Winterbourn C.C. / Inside the neutrophil phagosome: oxidants, mieloperoxidase, and bacterial killing // Blood. 1998. Vol.92. P. 3007-3017.

130. Hanahan D.E. and Weinberg R.A. / The hallmarks of cancer. // Cell. 2000. Vol. 100. P. 57-70.

131. Hanayama R., Tanaka M., Miwa K., Shinohara A., Iwamatsu A., Nagata, S. / Identification of a factor that links apoptotic cells to phagocytes. // Nature. 2002. Vol.417. P. 182-187.

132. Harman D. / Aging: a theory based on free radical and radiation chemistry. //J Gerontol. 1956. Vol. 11. P. 298-300.

133. Harman D. / The aging process. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. Vol.78. P. 7124-7128.

134. Henriksson G. / Primary Sjogren's syndrome: Studies of DNAa damage responses and autoantibodies. // Doctoral dissertation. 2001. P. 122.

135. Herceg Z., and Wang Z.Q. / Failure of poly(ADP-ribose) polymerase cleavage by caspases leads to induction of necrosis and enhanced apoptosis. // Mol. Cell. Biol. 1999. Vol. 19. P. 5124-5133.

136. Hey worth P.G., Cross A.R., Curnutte J.T. / Chronic granulomatous disease. // Curr. Opin. Immunol. 2003. V. 15. P. 578-584.

137. Hu, S., and Yang, X. (2003) J. Biol. Chem., 278, 10055-10060.

138. Hua J. et al. / NADPII oxidase components during maturation of HL-60 to neutrophil lineage. // J. Leukoc. Biol. 2000. Vol. 68. P. 216-24.

139. Huang, Y., Park, Y.C., Rich, R.L., Segal, D., Myszka, D.G., and Wu, II. (2001) Cell, 104, 781-790.

140. Hume D.A., Ross I.L., Himes S.R., Sasmono R.T., Wells C.A. / The mononuclear phagocyte system revisited. // J. Leu. Biol. 2002. Vol. 72. P. 621627.

141. Hunter A.M., LaCasse E.C., Korneluk R.G. // The inhibitors of apoptosis (IAPs) as cancer targets. //Apoptosis. 2007. Vol.12. P. 1543-1568.

142. Ishikawa F. and Miyazaki S. / New biodefense strategies by neutrophils. //Arch. Immunol. Ther. Exp. 2005. Vol. 53. P. 226-233.

143. Jablonska E., Puzewska W., Marcinczyk M., Grabowska Z., Jablonski J. iNOS expression and NO production by neutrophils in cancer patients // Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). -2005. Vol. 53. - P. 175-179.

144. Jackson S.P. / Sensing and repairing DNA double-strand breaks. // Carcinogen. 2002. Vol. 23. P. 687-696.

145. Jack R.M. and Fearon D.T. / Selective synthesis of mRNA and proteins by human peripheral blood neutrophils. // J.Immunol. 1988. Vol. 140. P. 42864293.

146. Jakobisiak M., Lasek W., Golab J. / Nature mechanisms protecting against cancer. // Immunol. Let. 2003. Vol. 90. P. 103-122.

147. Jiang Y., Pjesivag-Grbovic J., Cantrell Ch., Fleyer P.J. / A multiscale model for avascular tumor growth // J. Biophysical. 2005. Vol. 89. P. 38843894.

148. Joazeiro, C.A., and Weissman, A.M. (2000) Cell, 102, 549-552.

149. Johansson M., DeNardo D.G., Coussens. L.M. / Polarized immune responses differentially regulate cancer development. // Immunol. Rev. 2008. Vol. 222. P. 145-154.

150. Johnson L. / Protein kinases and their therapeutic exploitation. // Biochem/ Soc. Trans. 2007. Vol. 35. P. 7-11.

151. Jones J.J., Gellert M., Yang W. / A Ku bridge over broken DNA. // Structure. 2001. Vol. 9. P. 881-884.

152. Jung C., Martins A.S., Niggli E., Shirokova N. / Dystrophic cardiomyopathy: amplification of cellular damage by Ca2+ signaling and reactive oxygen species-generating pathways. // Cardiovasc. Res. 2008. Vol. 77. P. 766-773.

153. Kadokura H. / Oxidative protein folding: many different ways to introduce disulfide bonds. //Antiox. Redox. Signal. 2006. Vol. 8. P. 731-733.

154. Kamata H. and Hirata H. / Redox regulation of cellular signaling. // Cell. Signal. 1999. Vol. 11. P. 1-14.

155. Kami, K., Takeya, R., Sumimoto, II., Kohda, D. / Diverse recognition of non-PxxP peptide ligands by the SH3 domains from p67phox, Grb2 and Pexl3p. // EMBO J. 2002. Vol. 21. P. 4268-4276.

156. Karin M. / The IkB kinase a bridge between infammation and cancer. // Cell Res. 2008. Vol. 18. P. 334-342.

157. Karin M. / The regulation of AP-1 activity by mitogen-activated protein kinases. // J. Biol. Chem. 1995. Vol. 270. P. 16483-16486.

158. Karin M. and Lin A. / NF-kappaB at the crossroads of life and death. // Nat. Immunol. 2002. Vol. 3. P. 221-227.

159. Kim A.H., Khursigara G., Sun X., Franke T.F., Chao M.V. / Akt phosphorylates and negatively regulates apoptosis signal-regulating kinase 1. // Mol. Cell. Biol. 2001. Vol. 21. P. 893-901.

160. Klaunig J.E. and Kamendulis L.M. / The role of oxidative stress in carcinogenesis. //Annu. Rev. Pharmacol. Toxical. 2004. Vol. 44. P. 239-267.

161. Klimp A.II., de Vries E.G.E., Scherphof G.L., Daemen T. / A potential role of macrophage activation in the treatment of cancer. // Clinic. Rev. Oncol./Hematol. 2002. Vol. 44. P. 143-161.

162. Kobayashi S.D., Voyich J.M., Whitney A.R., DeLeo F.R. / Spontaneous neutrophil apoptosis and regulation of cell survival by granulocyte macrophage-colony stimulating factor. // J. Leuk. Biol. 2005. Vol. 78. P. 14081418.

163. Koehler C.M., Beverly K.N., Leverich E.P. / Redox pathways of the mitochondrion. //Antiox. Redox. Signal. 2006. Vol. 8. P. 813-822.

164. Köhler, C., Orrenius, S., and Zhivotovsky, B. / Evaluation of caspase activity in apoptotic cells. // J. Immunol. Methods. 2002. Vol. 265. P. 97-110.

165. Kultz D. / Molecular and evolutionary basis of the cellular stress response. // Annu. Rev. Physiol. 2005. Vol. 67. P. 225-257.

166. Kunkel T.A. and Erie D.A. / DNA mismatch repair. // Annu. Rev. Bioche. 2005. Vol. 74. P. 681-710.

167. Kuper II., Adami H.O., Trichopoulos D. / Infections as a major preventable cause of human cancer. // J. Intern. Med. 2000. Vol. 248. P. 17183.

168. Kyriakis J.M. and Avruch J. / Mammalian mitogen-activated protein kinase signal transduction pathways activated by stress and inflammation. // Physiol. Rev. 2001. Vol. 81. P. 807-869.

169. Laird S.M., Tuckerman E.M., Cork B.A., Linjawi S.L., Blakemore A.I.F., Li T.C. / A review of immune cells and molecules in woman with recurrent miscarriage. // Hum. Reprod. Update. 2003. Vol. 9. P. 163-174.

170. Lapidus R.G. and Sokolove P.M. / The mitochondrial permeability transition. Interactions of spermine, ADP, and inorganic phosphate. // J. Biol. Chem. 1994. Vol. 269. P. 18931-18936.

171. Lapouge, K., Smith, S. J., Walker, P. A., Gamblin, S. J., Smerdon, S. J., Rittinger, K. / Structure of the TPR domain of p67phox in complex with Rac-GTP. // Mol. Cell. 2000. Vol. 6. P. 899-907.

172. Larsson A. / Histopathological findings in salivary glands of Sjogren's syndrome. // Hygiea. 1999. Vol. 108. P. 10-13.

173. Lawrencc M.C., Jivan A., Shao C., Duan L., Goad D., Zaganjor E., Osborne J., McGlynn K., Stippec S., Earnest S., Chen W., Cobb M.H. / The roles of MAPKs in disease. // Cell Res. 2008. Vol. 18. P. 436-442.

174. Leonaduzzi G., Arkan M.C., Basaga H., Chiarpotto E., Sevanian A., Poli G. / Lipid oxidation products in cell signaling. // Free Rad. Biol. Med. 2000. Vol. 28. P. 1370-1378.

175. Leslie NR. / The redox regulation of PI 3-kinase-dependent signaling. // Antioxid. Redox. Signal. 2006. Vol. 8. P. 1765-1774.

176. Leto, T. L., Adams, A. G., de Mendez, I. / Assembly of the phagocyte NADPH oxidase: binding of Src homology 3 domains to proline-rich targets. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. Vol. 91. P. 10650-10654.

177. Lipnick R.N„ Iliopoulos A., Salata K., Hershey J., Melnick D., Tsokos G.C. / Leukocyte adhesion deficiency: report of a case and review of the literature. // Clin. Exp. Rheumatol. 1996. Vol. 14. P. 95-98.

178. Loeb L.A. and Preston B.D. / Mutagenesis by apurunic/apyrimidinic sites. // Annu. Rev. Genet. 1986. Vol. 20. P. 201-230.

179. Lu B., Wang L., Stehlik C., Medan D., Huang C., IIu S., Chen F., Shi X., Rojanasakul Y. / Phosphatidylinositol 3-kinase/Akt positively regulates Fas (CD95)-mediated apoptosis in epidermal C141 cells. // J. Immunol. 2006. Vol. 176. P. 6785-6793.

180. Lu H., Ouyang W., Huang C. / Inflammation, a key event in cancer development. // Mol. Cancer. Res. 2006. Vol. 4. P. 221-233.

181. Luppi P. / How immune mechanisms are affected by pregnancy. // Vaccine. 2003. Vol. 21. P. 3352-3357.

182. Luppi P., Haluszczak C., Betters D., Trucco M., DeLoia J. / Monocytes are progressively activated in the circulation of pregnant woman. // J. Leuk. Biol. 2002. Vol. 72. P. 874-884.

183. Luppi P., Haluszczak C., Trucco M., DeLoia J. / Normal pregnancy is associated with leukocyte activation. // Am. J. Reprod. Immunol. 2002. Vol. 47. P. 72-81.

184. MacFarlane, M., Merrison, W., Bratton, S.B., and Cohen, G.M. (2002) J. Biol Chem., 277, 36611-36616.

185. Mansoor F., Ali R. / Characterization of chromatin modified with reactive oxygen species: recognition by autoantibodies in cancer. // Clin Biochem. 2007. Vol. 40. P. 928-35.

186. Mantovani A., Allevana P., Sica A., Balkwill F. / Cancer-related inflammation. // Nature. 2008. Vol. 454. P. 436-444.

187. Marnett L.J., Riggins J.N., West J.D. / Endogenous generation of reactive oxidants and electrophiles and their reactions with DNA and protein. // J. Clin. Invest. 2003. Vol. 111. P. 583-593.

188. Martindale J.L., Holbrook N.J. / Cellular response to oxidative stress: signaling for suicide and survival. // J. Cell. Physiol. 2002. Vol. 192. P. 1-15.

189. Matsuzawa A. and Ichijo H. / Stress-responsive protein kinases in redox-regulated apoptosis signaling. // Antioxid. Redox. Signal. 2005. Vol. 7. P.472-481.

190. Mayer-Sholl A., Averhoff P., Zychilinsky A. / How do neutrophils and pathogens interact? // Curr.Opin. Microbiol. 2004. Vol. 7. P. 62-66.

191. McCubrey J.A., Lallair M.M., Franklin R.A. / Reactive oxygen species-induced activation of the MAP kinase signaling pathways. // Antioxid. Redox. Signal. 2006. Vol. 8. P. 1775-1789.

192. McNeil P.L. and Ito S. / Molecular traffic through plasma membrane disruptions of cells in vivo. // J. Cell Sci. 1990. Vol. 96. P. 549-556.

193. McNeil P.L., Muthukrishnan L., Warder E., D'Amore P.A. / Growth factors are released by mechanically wounded endothelial cells. // J. Cell Biol. 1989. Vol. 109. P. 811-822.225. . McPhail L.C., Clayton C.C. / The NADPH oxidase of human

194. Metcalf D., Robb L., Dunn A.R., Mifsud S., Di Rago L. / Role of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in the development of an acute neutrophil inflammatory response in mice. // Blood. 1996. Vol. 88. P. 3755-3764.

195. Mikkelsen R. and Wadman P. / Biologycal chemistry of reactive oxygen and nitrogen and radiation-induced signal transduction mechanisms. // Oncogene. 2003. Vol. 22. P. 5734-5754.

196. Miller, L.K. (1999) Trends Cell. Biol., 9, 323-328.

197. Modolell, M., Corraliza, I. M., Link, F., Soler, G., Eichmann, K. / Reciprocal regulation of the nitric oxide synthase/arginase balance in mouse bone marrow-derived macrophages by TH1 and TH2 cytokines. // Eur. J. Immunol. 1995. Vol. 25. P. 1101-1104.

198. Monteiro II. / Signal transduction by protein tyrosine nitration: competition or cooperation with tyrosine phosphorylation-dependent signaling events? // Free Rad. Biol. Med. 2002. Vol. 33. 765-773.

199. Monteiro H. and Stern A. / Redox modulation of tyrosine phosphorylation-dependent signal transduction pathways. // Free Rad. Biol. Med. 1996. Vol. 21. P. 323-333.

200. Monteiro H., Arai R.J., Travassor L.R. / Protein tyrosine phosphorylation and protein tyrosine nitration in redox signaling. // Antiox. Redox. Signal. 2008. Vol. 10. P. 843-889.

201. Morgan M.J., Kim Y-S., Liu Z. / Lipid rafts and oxidative stress-induced cell death. //Antiox. Redox. Signal. 2007. Vol. 9. P. 1471-1483.

202. Morley J.I. and Kushner I. / Serum C-reactive protein levels in disease. // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1982. Vol. 389. P. 406-418.

203. Mosser D.M. / Many faces of macrophage activation. // J. Leukoc. Biol. 2003. Vol. 73. P. 209-212.

204. Moutsopoulos H.M., Tzioufas A.G and Youinou P. / Sjogren's syndrome. In: Oxford Textbook of Rheumatology (eds. P.J. Maddson, D.A. Isenberg, P. Woo and D.N. Class). Oxford University Press, Oxford, UK. 1993. P.829-841.

205. Mueller M.M. and Fusenig N.F. / Friends or foes bipolar effects of the tumor stroma in cancer // Nature Rev. Cancer. 2004. Vol. 4. P. 839-849.

206. Murata H., Ihara Y., Nakamura H., Yodoi J., Sumikawa K., Kondo T. / Glutaredoxin exerts an antiapoptotic effect by regulating the redox state of Akt.// J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278. P. 50226-50233.

207. Nauseef W.M. / Assembly of the neutrophil respuratory burst oxidase. // J.Biol. Chem. 1991. Vol. 266. P. 5911-5917.

208. Nauseef, W. M. / The NADPH-dependent oxidase of phagocytes. // Proc. Assoc. Am. Physicians. 1999. Vol. 111. P. 373-382.

209. Nelson D., Ganss R. / Tumor growth and regression: powered by inflammation. //J. Leukoc. Biol. 2006. Vol. 80. P. 685-690.

210. Nemoto S., DiDonato J.A., Lin A. / Coordinate regulation of IkappaB kinases by mitogen-activated protein kinase kinase kinase 1 and NF-kappaB-inducing kinase. // Mol. Cell. Biol. 1998. Vol. 18. P. 7336-7343.

211. Newburger P.E., Ezekowitz R.A.B., Whitney C., Wright J., Orkin S.I I. / Induction of phagocyte cytochrome b heavy chain gene expression by interferon gamma. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. Vol. 85. P. 5215-5219.

212. Nicholson, D.W. (2001) Nature, 410, 33-34.

213. Nisimoto, Y., Motalebi, S., Han, C. H., Lambeth, J. D. / The p67phox activation domain regulates electron flow from NADPII to flavin in flavocytochrome b558. // J. Biol. Chem. 1999. Vol. 274. 22999-23005.

214. Novgorodov S.A., Gudz T.I., Brierley G.P., Pfeiffer D.R. / Magnesium ion modulates the sensitivity of the mitochondrial permeability ransition pore to cyclosporin A and ADP. // Arch. Biochem. Biophys. 1994. Vol. 311. P. 21928.

215. Ortmeyer J., Mohsenin V. / Inhibition of phospholipase D and superoxide generation by glucose in diabetic neutrophils. // Life. Sci. 1996. Vol. 59. P. 255-62.

216. Ott, M., Robertson, J.D., Gogvadze V., Zhivotovsky, B. and Orrenius S. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 1259-1263.

217. Pantano C., Reynaert N.L., van der Vliet A., Janssen-IIeininger Y.M. / Redox-sensitive kinases of the nuclear factor-kappaB signaling pathway. // Antioxid. Redox. Signal. 2006. Vol. 8. P. 1791-1806.

218. Park H.S., Huh S.H., Kim M.S., Lee S.IL, Choi E.J. / Nitric oxide negatively regulates c-Jun N-terminal kinase/stress-activated protein kinase by means of S-nitrosylation. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. Vol. 97. P. 14382-14387.

219. Park J.-B. / Phagocytosis induces superoxide formation and apoptosis in macrophages. // Exper. Mol. Med. 2003. Vol. 35. P. 325-335.

220. Passos J.F., Saretzki G., von Zglinicki T. / DNA damage in telomeres and mitochondria during cellular senescence: is there a connection? // Nucl. Acids Res. 2007. Vol. 35. P. 7505-13.

221. Pechatnikov VA, Afanasyev VN, Korol' BA, Korneev VN, Rochev YuA, Umansky SR. / Flow cytometry analysis of DNA degradation inthymocytes of gamma-irradiated or hydrocortisone treated rats. // Gen. Physiol. Biophys. 1986. Vol. 3. P. 237-284.

222. Perwez H.S, Harris C.C. / Inflammation and cancer: an ancient link with novel potentials. //Int. J. Cancer. 2007. Vol. 121. P. 2373-2380.

223. Philip M., Rowley D.A., Shcreiber H. / Inflammation as a tumor promoter in cancer induction. // Semin. Cancer. Biol. 2004. Vol. 14. P. 433439.

224. Pinchuk I., Schnitzer E., Lichtenberg D. / Kinetic analysis of copper-induced peroxidation of LDL. // Biochim. Biophys. Acta. 1998. Vol. 1389. P. 155-172.

225. Pozzan, T. and Rizzuto R. / The renaissance of mitochondrial calcium transport.// Eur. J. Biochem. 2000. Vol. 267. P. 5269-5273.

226. Quinn M.T., Parkos C.A., Walker R., Orkin S.II., Dinauer M.C., Jesaitis

227. A.J. / Translation of Rac correlates with NADPII oxidase activation. Evidence for equimolar translocation of oxidase components. // J. Bio. Chem. 1993. Vol. 268. P. 20983-20987.

228. Ran Q., Liang H., Gu M., Qi W., Walter C.A., Roberts L.J. 2nd, Herman

229. B., Richardson A., Van Remmen H. / Transgenic mice overexpressing glutathione peroxidase 4 are protected against oxidative stress-induced apoptosis. //J. Biol. Chem. 2004. Vol. 279. P. 55137-55146.

230. Reed J.C. / Mechanisms of apoptosis. // Americ. J. Pathol.2000. Vol. 157. P. 1415-1430.

231. Reinstein E. and Ciechanover A. / Narrative review: protein degradation and human diseases: the ubiquitin connection. // Ann. Intern. Med. 2006. Vol. 145. P. 676-684.

232. Reynaert N.L., Cless K., Korn S.H., Vos N., Guala A.S., Wouters E.F., van der Vliet A., Janssen-Heininger Y.M. / Nitric oxide represses inhibitory kappaB kinase through S-nitrosylation. // Proc .Natl. Acad. Sci. USA. 2004. Vol. 101. P. 8945-8950.

233. Rhee S.G. / Redox signaling: hydrogen peroxide as intracellular messenger. // Exp. Mol. Med. 1999. Vol. 31. P. 53-59.

234. Richardson C. and Jasin M. / Coupled homologous and non-homologous repair of a double-strand break preserves genomic integrity in mammalian cells. // Mol. Cell. Biol. 2000. Vol. 20. P. 9068-9075.

235. Robinson J.P. / Oxygen and nitrogen reactive metabolites and phagocytic cells. //Phagocyte function. 1998. Vol. 9. P. 217-231.

236. Roitt I., Brostoff J. and Male D. Immunology. Mosby. London, 2001. -243 S.

237. Roos, D., de Boer, M., Kuribayashi, F., Meischl, C., Weening, R. S., Segal, A.W., Ahlin, A., Nemet, K., Hossle, J. P., Bernatowska-Matuszkiewicz, E., Middleton-Price, H. / Mutations in the X-linked and autosomal recessive forms of

238. Rotrosen, D. and Leto, T. L. / Phosphorylation of neutrophil 47-kDa cytosolic oxidase factor. Translocation to membrane is associated with distinct phosphorylation events. //J. Biol. Chem. 1990. Vol. 265. P. 19910-19915.

239. Riiegg C. / Leukocytes, inflammation, and angiogenesis in cancer: fatal attraction. // J. Leukoc. 2006. Vol. 80. P. 682-684.

240. Rytomaa, M., and Kinnunen, P. K. J. (1995) J. Biol. Chem., 270, 31973202.

241. Sacks G., Sargent I., Redman C. / An innate view of human pregnancy. //Immunol. Today. 1999. Vol. 114. P. 114-118.

242. Safronova V.G., Maltseva V.N., Lenoir A., Avkhacheva N. / Reorganization of insulin signaling in peripheral neutrophils during in vivo growth of Lewis lung carcinoma. // Biophysical Society, 49th Annual Meeting, Long Beach, CA, USA. 2005. 1253-Pos.

243. Sallmyr A. / DNA-dependent protein kinase in human cells. // Doctoral Dissert. Lund. Sweden. 2004. P. 120.

244. Sallmyr A., Miller A., Gabdoulkhakova A., Safronova V., Henriksson G., Bredberg A. / Expression of DNA-dependent protein kinase in human granulocytes. // Cell. Res. 2004. Vol. 14. P. 331-340.282. Sambrook et al., 1989

245. Sarbassov D.D., Guertin D.A., Ali S.M., Sabatini D.M. / Phosphorylation and regulation of Akt/PKB by the rictor-mTOR complex. // Science. 2005. Vol. 307. P. 1098-1101.

246. Segal. A.W. / How neutrophils kill microbes. // Annu. Rev. Immunol. 2005. Vol. 23. P. 197-223.

247. Schieke S.M., Briviba K., Klotz L.O., Sies H. / Activation pattern of mitogen-activated protein kinases elicited by peroxynitrite: attenuation by selenite supplementation.// FEBS Lett. 1999. Vol. 448. P. 301-303.

248. Schins R.P.F., Borm P.J.A. Van Schooten F.J. / Neutropihls and respiratory tract DNA damage and mutagenesis: a review. // Mutagenesis. 2006. Vol. 21. P. 225-236.

249. Schmielau J. and Finn J. O. / Activated granulocytes and granulocyte-derived hydrogen peroxide are the underlying mechanism of suppression of T-cell function in advanced // Cancer Res.2002. Vol. 61. P. 4756-4760.

250. Schmitz G. and Grandl M. / Role of redox regulation and lipid lafts in macrophages during Ox-LDL-mediated foam cell formation. // Antiox. Redox. Signal. 2007. Vol. 9. P. 1499-1518.

251. Shah S.V., Wallin J.D., Elien S.D. / Chemiluminescence and supreoxide production by leykocytes from diabetic patients. //J. Immunol. 1985. P. 20692073.

252. Shen H.M. and Liu Z.G. / JNK signaling pathway is a key modulator in cell death mediated by reactive oxygen and nitrogen species. // Free Radic. Biol. Med. 2006. Vol. 40. P. 928-939.

253. Shi Q., Gibson G.E. / Oxidative stress and transcriptional regulation in Alzheimer disease. // Alzheimer. Dis. Assoc. Disord. 2007. Vol. 21. P. 276-91.

254. Shrivastav M., De Haro L.P., Nickoloff J.A. / Regulation of DNA double-strand break repair pathway choice. // Cell Res. 2008. Vol. 18. P. 134147.

255. Shurtzz-Swirski R., Sela S., Herskovits A. et al. Relationship Between Electroneurographic Changes and Serum Ubiquitin Levels in Patients With Type 2 Diabetes. // Diabetes Care. 2001. Vol. 24. P. 104-110.

256. Sievers E.L. and Dale D.C. / Non-malignant neutropenia. // Blood Rev. 1996. Vol. 10. P. 95-100.

257. Skulachev, V.P. (2000) IUBMB Life, 49, 365-373.

258. Slund F, Zheng M, Beckwith J, Storz G. / Regylation of the OxyR transcription factor by hydrogen peroxide and the cellular thioldisulfate status. // Proc Natt Acad Sci USA. 1999. Vol. 91. P. 6161-6165.

259. Splettstoesser W.D. and Schuff-Werner P. / Oxidative stress in phagocytes "The enemy within". // Microscopy Research and Technique. 2002. Vol. 57. P. 441-455.

260. Squier T.C. / Redox modulation of cellular metabolism through targeted degradation of signaling proteins by the proteasome. // Antioxid. Redox. Signal. 2006. Vol. 8. P. 217-228.

261. Srinivasula, S.M., Hedge, R., Saleh, A., Datta, P., Shiozaki, E., Chal, J., Lee, R.-A., Robbins, P.D., Fernandes-Alnemri, T., Shi, Y., and Alnemri, E.S. (2001) Nature, 410, 112-116.

262. Stadtman E.R. / Role of oxidant species in aging. // Curr. Med. Chem. 2004. Vol. 11. P. 1105-1112.

263. Stein, M., Keshav, S., Harris, N., Gordon, S. / Interleukin 4 potently enhances murine macrophage mannose receptor activity: a marker of alternative immunologic macrophage activation. // J. Exp. Med. 1992. Vol. 176. P. 287-292.

264. Stock D., Groome P.A., Siemens D.R. / Inflammation and prostate cancer: a future target for prevention and therapy? // Urol. Clin. North. Am. 2008. Vol. 35. P. 117-130.

265. Sumbayev V.V. and Yasinska I.M. / Regulation of MAP kinase-dependent apoptotic pathway: implication of reactive oxygen and nitrogen species. //Arch. Biochem. Biophys. 2005. Vol. 436. P. 406^112.

266. Suzuki, Y., Imai, Y., Nakayama, H., Takahashi, K., Takio, K., and Takahashi, R. (2001) Mol. Cell, 8, 613-621.

267. Suzuki, Y., Kakabayashi, Y., and Takahashi, R. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 8662-8667.

268. Takeya R. and Sumimoto H. / Molecular mechanism for activation of superoxide-producing NADPH oxidases. // Mol. Cells. 2003. Vol. 16. P. 271277.

269. Thannickal V.J., Fanburg B.L. / Reactive oxygen species in cell signalling. // Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 2000. Vol. 279: P. 1005-1028.

270. Theilgaard-Monch K., Knudsen S., Follin P., Borregaard N. / The transcriptional activation program of human neutrophils in skin lesions supports their important role in wound healing. // J. Immunol. 2004. Vol. 172. P. 7684-7693.

271. Thrasher A.J., Keep N.H., Wientjes F., Segal A.W. / Chronic granulomatous disease. // Biochim. Biophys. Acta. 1994. Vol. 1227. P. 1-24.

272. Trachootam D., Lu W., Ogasawara M.A., Rivera-Del Valle N., Huang P. / Redox regulation of cell survival. // Antiox. Redox. Signal. 2008. Vol. 10. P. 1343-1374.

273. Trostchansky A. and Rubbo H. / Lipid nitration and formation of lipid-protein adducts: biological insights. //Amino Acids. 2007. Vol. 32. P. 517-522.

274. Tsukimori K., Maeda H., Ishida K., Nagata H., Koyanagi T., Nakano H. // Obstet. Gynecol. 1993. 81: 536-540.

275. Uren, A.G., Pakusch, M., Hawkins, C.J., Puis, K.L., and Vaux, D.L. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 4974-49789.

276. Valko M., Rhodes C.J., Moncol J., Izakovic M., Mazur M. / Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer. // Chem. Biol. Interact. 2006. Vol. 160. P. 1-40.

277. Vanhaesebroeck B. and Alessi D.R. / The PI3K-PDK1 connection: more than just a road to PKB. // Biochem. J. 2000. Vol. 346. P. 561-576.

278. Vignais P.V. / The superoxide-generating NADPH oxidase: structural aspects and activation mechanism. // Cell. Mol. Life Sci. 2002. Vol. 59. P. 1428-1459.

279. Vince G.S., Johnson P.M. // Biochem. Soc. Trans. 2000. 28:191-195.

280. Wally J.W., Coughlan S., Hudson M.E. Covington M.F., Kaspi R., Banu G. / Mechanical stress induces biotic and abiotic stress responses via a novel c/s-element. // PLoS Genetics. 2007. Vol. 3. P. 1800-1812.

281. Welch H.C., Coadwell W.J., Stephens L.R., Hawkins P.T. / Phosphoinositide 3-kinase-dependent activation of Rac. // FEBS Lett. 2003. Vol. 546. P. 93-97.

282. Werner E. GTPases and reactive oxygen species: switches for killing and signaling//J. Cell Science. 2004. Vol. 117. P. 143-153.

283. Wientjes. NADPH oxidase and the respiratory burst // Semin. Cell Biol. 1995. Vol.6. P. 357-65.

284. Wilkinson B. L., Landreth G.E. The microglial NADPH oxidase complex as a source of oxidative stress in Alzheimer's disease // Journal of Neuroinflammation. 2006. Vol. 3. P. 30-42.

285. Winterbourn C.C. and Kettle A.J. / Radica-radical reactions of superoxide: a potential route to toxicity. // Biochem. Biophys. Res. Com. 2003. Vol. 305. P. 729-736.

286. Wood Z.A., Schroder E., Robin Harris J., Poole L.B. / Structure, mechanism and regulation of peroxiredoxins // Trends. Biochem. Sci. 2003. Vol. 28. P. 32-40.

287. Wu Q.D., Wang J.H., Condron C., Bouchier-Hayes D., Redmond H.P. / Human neutrophils facilitate tumor cell transendothelial migration // Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 2001. Vol. 280. P. 814-822.

288. Xu Y. / DNA damage: a trigger of innate immunity but a requirement for adaptive immune homeostasis. // Nature. Rev. Immunol. 2006.Vol. 6.P. 261270.

289. Yamaguchi M., Saeki S., Yamane H., Okamura N., Ishibashi S. / Involvement of several protein kinases in the phosphorylation of p47-phox. // Biochem Biophys. Res. Commun. 1996. Vol. 220. P. 891-895.

290. Yamamoto K. / Pathogenesis of Sjogren's syndrome. // Autoimmun. Rev. 2003. Vol.2. P. 13-18.

291. Yang, Y., and Yu, X. (2003) FASEB J., 17, 790-799.

292. Yeaman G.R., Collins J.E. et. al.//J. Immunol. 1998. 160:5145-5153.

293. Yoshimura A. / Signal transduction of inflammatory cytokines and tumor development. // Cancer Sci. 2006. vol. 97. P. 439-447.

294. Yoshizumi M., Abe J., Haendeler J., Huang Q., Berk B.C., / Src and Cas mediate JNK activation but not ERK 1/2 and p38 kinase by reactive oxygen species.//J. Biol.Chem. 1996. Vol. 271. P. 16586-16590.

295. Young I.S. and McEney J. / Lipoprotein oxidation and atherosclerosis. // Biochem. Soc. Transac. 2001. Vol. 29. P. 358-362.

296. Zarubin T. and Han J. / Activation and signaling of the p38 MAP kinase pathway. // Cell.Res. 2005. Vol. 15. P. 11-18.

297. Zhang X., Kluger Y., Nakayama Y., Poddar R., Whitney C., DeTora A., Weissman S.M., Newburger P.E. / Gene expression in mature neutrophils: early responses to inflammation stimuli. // J. Leuk. Biol. 2004. Vol. 75. P. 358372.

298. Zhdanova N.S., Rubtsov N.B., Minina I.M. / Terminal regions of mammal chromosomes: plasticity and role in evolution. // Genetika. 2007. Vol. 43. P. 873-886.1. Благодарности

299. Выражаю искреннюю благодарность моему научному руководителю Валентине Григорьевне Сафроновой за чуткое руководство и внимание к моей работе, а также за ценные советы и рекомендации, сделанные в процессе подготовки диссертации.

Информация о работе

Авхачева, Надежда Владимировна
кандидата биологических наук
Пущино, 2008
ВАК 03.00.02

Диссертация

Системная оценка состояния клеток врожденного иммунитета в организме с развивающейся опухолью - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы