Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Патогенетические механизмы иммунной дисфункции у новорожденных с респираторными нарушениями.
ВАК РФ 03.03.03, Иммунология
Автореферат диссертации по теме "Патогенетические механизмы иммунной дисфункции у новорожденных с респираторными нарушениями."
На правах рукописи
ДУДАРЕВА МАРИЯ ВАСИЛЬЕВНА
ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ИММУННОЙ ДИСФУНКЦИИ У НОВОРОЖДЕННЫХ С РЕСПИРАТОРНЫМИ НАРУШЕНИЯМИ
«03.03.03 - иммунология»
005049261
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
( ФЬВ ?_№
Ростов - на - Дону 2012
005049261
Диссертация выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Ростовский научно-исследовательский институт акушерства и педиатрии» Минздравсоцразвития России
Научный консультант: Сизякина Людмила Петровна
доктор медицинских наук, профессор.
Официальные оппоненты: Пинегин Борис Владимирович
доктор медицинских наук, профессор, зав. Отделом иммунодиагностики и иммунокоррекции ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России.
Кадагидзе Заира Григорьевна доктор медицинских наук, профессор, рук. Централизованного клинико-лабораторного отдела РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН.
Сапожников Александр Михайлович доктор биологических наук, профессор, рук. Лаборатории клеточных взаимодействий Институт биорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.
Ведущая организация: НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН.
Защита диссертации состоится 27 февраля 2013 г. в 14 часов на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.017.01 в ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24, корп. 2.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России.
Автореферат разослан « Д/»l^j HÜ^dX
ь*
2013 года.
Ученый секретарь Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций доктор медицинских наук
Сеславина Лия Сергеевна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Иммунная система является одной из трех интегративных систем организма, которая вместе с нервной и эндокринной системами обеспечивает поддержание гомеостаза в условиях постоянного изменения характера влияний факторов внешней и внутренней среды. Благодаря фундаментальным исследованиям отечественных и зарубежных иммунологов были получены убедительные данные о роли иммунной системы в изменении иммунного статуса у новорожденных с респираторными нарушениями.
Синдром дыхательных расстройств является одной из основных причин заболеваемости и смертности как недоношенных, так и доношенных новорожденных не только в нашей стране, но и за рубежом (Дементьева Г.М. и соавт., 2001, 2002; Рюмина И.И., 2002; Байбарина E.H. и соавт., 2006; Сидельникова В.М. и соавт., 2006; Володин H.H., 2006, 2007; William D. Fraser et al., 2005; Carrie К. et al., 2008).
В течение нескольких десятилетий изучению данной патологии уделяется большое внимание (Гребенников В.А. и соавт., 1995; Шаламов В.Ю, 2000; Антонов А.Г., Володин H.H., Гребенников В.А. и соавт., 2002; Перепелица С.А., Голубев A.M., Мороз В.В., 2007; Avery М.Е. et al., 1991; Carbine D.N., 2008).
Частота развития инфекционных осложнений при неотложных состояниях у новорожденных с дыхательными расстройствами остается одной из самых актуальных проблем современной медицины в силу неуклонной тенденции к росту заболеваемости и стабильно высокой летальности и составляет 30-50%, занимая одно из ведущих мест в структуре детской смертности (Вермель А.Е., 2003; Володин И.И., Антонов А.Г., Байбарина E.H., 2003; Самсыгина Г.А., 2003; Антонов А.Г., Байбарина E.H., Соколовская Ю.В., 2005; Мархулия Х.М. и соавт., 2005; Баранов A.A., 2007; Володин H.H. и соавт., 2007; Яцык Г.В., 2007; Голубев A.M. и соавт., 2008; Khemani Е. et al., 2007; Olaciregui I. et al., 2009; Ramirez К. et al., 2010).
В настоящее время ведутся интенсивные поиски универсальных клинико-лабораторных маркеров присоединения бактериальных инфекций у новорожденных с респираторными нарушениями, находящихся на искусственной вентиляции легких (Эстрин В.В. и соавт., 2006, 2007; Бирюкова Т.В. и соавт., 2007; Дегтярева М.В., 2008). Вместе с тем, иммунопатологические механизмы, определяющие исход и клиническое течение заболевания, развитие бактериальных осложнений у новорожденных, получающих респираторную поддержку, остаются мало изученными.
Анализируя в целом характер изменений иммунологических показателей при дыхательных расстройствах у новорожденных, находившихся на ИВЛ, следует отметить, что большинство научных исследований относится к оценке адаптивного иммунитета, тогда как данные о функционировании врожденного иммунитета практически отсутствуют. Между тем именно состояние иммуно-компетентных клеток, обеспечивающих врожденный иммунитет, является ос-
новополагающим фактором защиты от присоединения бактериальных осложнений и формирования иммунной дисфункции.
У новорожденных с респираторной патологией реперфузионные процессы, связанные с респираторной поддержкой, приводят к апоптозу тканей и стимуляции клеток иммунной системы, выходу больших количеств провоспали-тельных цитокинов и медиаторов воспаления, которые в свою очередь являются мощными апоптогенными факторами и, одновременно факторами способными генерировать свободнорадикальные реакции, индуцирующие апоптоз (Белобородова Н.В., Бачинская Е.Н, 2000). Таким процессам в большей степени подвержены клетки иммунной системы, что приводит к глубокому иммуноде-фицитному состоянию новорожденного и высокому риску присоединения но-зокомиальной инфекции, появлению тяжелых гнойно-септических осложнений. Вместе с тем, эти иммунопатологические механизмы у новорожденных с респираторной патологией остаются практически не изученными. Детальное исследование механизмов клеточной альтерации иммунокомпетентных клеток у новорожденных открывает новые подходы к профилактированию инфекционных осложнений.
Кроме того, все еще недостаточно освещены вопросы динамики восстановления функциональной активности адаптивного и врожденного иммунитета у доношенных новорожденных с дыхательными расстройствами.
Согласно современным представлениям нарушения иммунной системы лежат в основе патогенеза респираторных нарушений. Однако конкретные патогенетические механизмы иммунных нарушений, способствующих манифестации и прогрессированию бактериальных осложнений при дыхательных расстройствах у новорожденных детей, на сегодняшний день не исследованы.
Учитывая вышеизложенное, приоритетным направлением является изучение патогенеза респираторных нарушений с позиций определения роли врожденного и адаптивного иммунитета, а также особенностей взаимодействия между ними, разработка ранней диагностики нарушений иммунологической адаптации и бактериальных осложнений у новорожденных с респираторной патологией. Полученные данные позволят расширить существующие представления об иммунных процессах, которые имеют не только теоретическое, но и отчетливое прикладное значение.
Таким образом, необходимость изучения и решения вышеуказанных проблем, обеспечивают актуальность настоящей темы, приоритетность ее целей и задач.
Цель исследования
Выявить патогенетические механизмы повреждения иммунной системы у новорожденных с респираторными нарушениями и разработать ранние критерии диагностики, прогноза течения и возникновения бактериальных осложнений при респираторных нарушениях.
Задачи исследования:
1. Исследовать уровень экспрессии маркеров позитивной активации CD25+, CD69+, CD71+, HLADR+ клеток иммунной системы у новорожденных детей с респираторными нарушениями, обусловленными мекониальной аспирацией и респираторным дистресс-синдромом.
2. Оценить влияние негативной активации клеток иммунной системы (экспрессия CD95+, AnnexinV+, AnnexinV+PI+) на клиническое течение заболевания и развитие бактериальных осложнений у новорожденных с респираторными нарушениями.
3. Изучить эффекторные функции иммунной системы, включая секрецию основных провоспалительных цитокинов IL-ip, IL-6, IL-8, TNF-a, а также включая секрецию IFN-a, IFN-y, TGF-0 и оксида азота в сыворотке крови и бронхоальвеолярном лаваже у новорожденных детей с респираторными нарушениями.
4. Выявить особенности продукции хемокина RANTES и GM-CSF у новорожденных детей с респираторными нарушениями.
5. Определить роль параметров врожденного иммунитета TLR-2 (CD282 ), TLR-4 (CD284+) и CD 14^, как возможных маркеров реализации бактериальных осложнений у новорожденных с респираторными нарушениями.
6. Исследовать экспрессию молекул адгезии ICAM-1 (CD54+), CDlip+, CDllc+, а также уровень экспрессии к Fc фрагментам IgG, и к С1 и СЗ компонентам комплемента (CD64+, CD35+) у новорожденных детей с респираторными нарушениями.
7. Исследовать функции фагоцитов у новорожденных детей с респираторными нарушениями.
8. Провести анализ динамики показателей врожденного и адаптивного иммунитета у новорожденных с респираторной патологией.
9. Разработать иммунологические тесты, позволяющие прогнозировать исход заболевания и бактериальные осложнения у новорожденных детей с респираторными нарушениями, обусловленными мекониальной аспирацией и респираторным дистресс-синдромом.
Научная новизна работы
Впервые установлено, что у доношенных новорожденных с MAC и РДС развивается иммунологический дистресс-синдром, обусловленный усилением процессов апоптоза клеток иммунной системы, снижением концентрации GM-CSF, угнетением адаптивного иммунитета с одновременным угнетением цито-токсических реакций, вызванных естественными киллерами и цитотоксически-ми лимфоцитами.
Впервые получены данные о значительном снижении уровня фактора хемотаксиса RANTES в сыворотке крови, что отражает особенности течения респираторных нарушений у новорожденных.
Выявлена ведущая роль альтерации клеток иммунной системы в исходах критических состояний у доношенных новорожденных.
Впервые получены новые данные о дефектах в системе То11-подобных рецепторов у новорожденных с респираторными нарушениями. Показаны различия в экспрессии С014++, ТЫ1-2 (СЭ282+) и ТЬЯ-4 (С0284+) на моноцитах периферической крови здоровых новорожденных и новорожденных с респираторными нарушениями.
Установлено, что увеличение количества СБ95+ -лимфоцитов и моноцитов у новорожденных с респираторными нарушениями может указывать на пролонгированное течение патологического процесса.
Установлено, что развитие респираторной патологии ассоциируется с активацией периферических лимфоцитов и моноцитов новорожденных.
Установлено, что при респираторной патологии нарушаются процессы распознавания и презентации антигена (АГ) периферическими моноцитами новорожденного.
Установлено, что иммунные механизмы участвуют в патогенезе респираторных нарушений, проявляясь на системном уровне в виде дисбаланса реакций врожденного и адаптивного иммунитета.
Впервые установлено, что иммунная депрессия врожденного и адаптивного иммунитета у новорожденных с респираторными нарушениями сохраняется и в исходе заболевания, являясь основой для формирования иммуноопо-средованной патологии.
Впервые разработан способ раннего прогнозирования септических осложнений у новорожденных с респираторной патологией, на основании повышенной экспрессией АппехтУ+ на моноцитах (Патент на изобретение №2414706 от 20 марта 2011 г.).
Впервые разработан способ ранней диагностики развития неонатального сепсиса у новорожденных с синдромом дыхательных расстройств и гипоксиче-ским поражением ЦНС, на основании сниженной экспрессией на мо-
ноцитах периферической крови (Патент на изобретение №2374646 от 27 ноября 2009 г.).
Теоретическая и практическая значимость
1. Расширены представления о патогенетической роли изменений врожденного и адаптивного иммунитета при респираторных нарушениях у новорожденных, обусловленных нарушением процессов активации, дифференци-ровки, апоптоза и эффекторных функций иммунокомпетентных клеток и сопровождающихся нарушением экспрессии То11-подобных рецепторов, как физиологических регуляторов врожденного и адаптивного иммунитета.
2. Практическая значимость работы заключается в разработке иммунологических критериев ранней диагностики присоединения вентилятор-ассоциированных инфекционно-воспалительных осложнений бактериальной природы у новорожденных с респираторной патологией, основанных на определении экспрессии АппехтУ+ на моноцитах (Патент на изобретение №2414706 от 20 марта 2011 г.) и экспрессии НЬА-ОЯ+ на моноцитах периферической крови (Патент на изобретение №2374646 от 27 ноября 2009 г.).
3. На основании собственных исследований установлены наиболее информативные показатели содержания цитокинов в бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ) при респираторной патологии. Предложено использовать уровень 1И, 1Ь-6, 1Ь-8 в БАЛ в качестве маркеров активности воспалительного процесса в бронхолегочной системе при респираторных нарушениях у доношенных новорожденных.
Положения, выносимые на защиту.
1. Иммунные нарушения играют важную роль в патогенезе респираторных расстройств и проявляются дисбалансом реакций врожденного и адаптивного иммунитета.
2. Наиболее выраженные изменения врожденного и адаптивного иммунитета регистрируются при респираторных нарушениях на 3-5-е сутки наблюдения.
3. Иммунная депрессия врожденного и адаптивного иммунитета при респираторных нарушениях сохраняется и на 20-е сутки, являясь основой для формирования иммуноопосредованной патологии.
4. Развитию бактериальных осложнений при респираторных нарушениях способствует нарушение презентации антигена и увеличение апоптоза лимфоцитов и моноцитов.
5. Ранняя диагностика иммунных дисфункций врожденного и адаптивного иммунитета позволит уменьшить количество бактериальных осложнений, а так же снизить раннюю неонатальную смертность.
Внедрение результатов работы в практику
Количественное определение уровней факторов как местного, так и системного иммунитета, молекул межклеточной адгезии и хемокинов в сыворотке крови и в бронхоальвеолярном лаваже у новорожденных с респираторной патологией внедрено в практическую деятельность отделения реанимации ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский институт акушерства и педиатрии» Министерства здравоохранения и социального развития, используется в лекционных курсах на семинарах врачей ЮФО, на кафедре клинической иммунологии и аллергологии ФПК и ППС ГБОУ ВПО РостГМУ Минздравсоцразвития России.
Апробация работы
Основные положения работы представлены:
- на Всероссийской междисциплинарной научно-практической конференции «Внутриутробные инфекции плода и новорожденного», Саратов, 2000 г.; на 4-ом Конгрессе Ассоциации Аллергологов и Клинических Иммунологов «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», Москва, 2001 г.; на международном конгрессе «Иммунитет и болезни - от теории к терапии», Москва, 2005 г.; на Всероссийском форуме «Мать и дитя», Москва, 2007, 2009, 2010г.г.; на национальной конференции «Аллергология и клиническая иммунология-междисциплинарные проблемы», Москва, 2008 г.; на
I Всероссийском конгрессе «Анестезия и реанимация в акушерстве и неонато-логии», Москва, 2008 г.; на X международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», Казань, 2009 г.; на XVI съезде педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии», Москва, 2009 г.; на IV ежегодном конгрессе специалистов перинатальной медицины «Современная перинатология: организация, технологии и качество», Москва, 2009 г.; на XIV международном конгрессе по реабилитации в медицине и им-мунореабилитации, Израиль, 2009 г.; на XIV международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации, Дубай, 2009 г.; на V Российском конгрессе «Педиатрическая анестезиология и интенсивная терапия», Москва, 2009 г.; на VII съезде союза аллергологов и иммунологов СНГ и Всемирном форуме по астме и респираторной аллергии, Санкт-Петербург, 2009 г; на Национальной конференции «Аллергология и клиническая иммунология -практическому здравоохранению», Москва, 2010 г.; на Межрегиональном форуме «Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии — междисциплинарные проблемы», Санкт-Петербург, 2010 г.; на XV международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации, Дубай, 2010 г.; на IX Российском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии», Москва, 2010 г.; на V ежегодном конгрессе специалистов перинатальной медицины «Современная перинатология: организация, технологии и качество», Москва, 2010 г.; на XV конгрессе педиатров России с международным участием «Актуальные проблемы педиатрии», Москва, 2011 г.; на XI международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», Москва, 2011 г.; на I международном конгрессе по перинатальной медицине, Москва, 2011 г.; на XVI международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации, Париж, 2011 г.; на IV Всероссийском образовательном конгрессе "Анестезия и реанимация в акушерстве и неонатоло-гии", Москва, 2011 г.; на международном форуме "Сепсис 2011, Пекин", Китай, Пекин, 2011г.; на Национальной конференции «Клиническая иммунология и аллергология - практическому здравоохранению», Москва, 2012 г.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 67 печатных работ, из них, в изданиях, рекомендованных перечнем ВАК РФ для публикации материалов докторских и кандидатских диссертаций - 16 публикаций, получено 5 патентов на изобретение, 46 публикаций в материалах отечественных и международных конференций и конгрессов.
Объем и структура работы
Диссертация изложена на 311 страницах машинописного текста, содержит 107 таблиц, 29 рисунков, 2 схемы. Диссертация включает главы: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследований и их обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Практические рекомендации», «Список литературы».
Библиографический указатель включает 305 работ, из них 158 отечественных и 147 иностранных источников литературы.
Материалы и методы исследования
Дизайн исследования
Иммунологическое обследование детей проводили в объединенной клинико-диагностической лаборатории Ростовского научно-исследовательского института акушерства и педиатрии с использованием стандартных тестов в соответствии с разработанной там же схемой иммунологического обследования, рекомендованной ВОЗ. Исследование было одобрено локальным этическим комитетом института.
Материалом для исследования послужили образцы крови и бронхоаль-веолярного лаважа новорожденных детей, полученных сотрудниками анесте-зиолого-реанимационного и родильного отделений РНИИАП в процессе лечебного процесса и планового обследования.
Для решения поставленных задач было проведено первичное, комплексное иммунологическое обследование 479 доношенных новорожденных детей. Основную группу (441 ребенок) составили новорожденные, у которых в раннем периоде адаптации отмечались дыхательные расстройства, обусловленные ме-кониальной аспирацией и респираторным дистресс-синдромом, поступившие из родильных домов г. Ростова-на-Дону и Ростовской области, в отделение реанимации новорожденных Института акушерства и педиатрии г. Ростова-на-Дону за период с 2005 по 2009 гг.
Группу сравнения составили 38 условно-здоровых новорожденных ребенка, у которых отмечалось физиологическое течение раннего периода адаптации.
В процессе выполнения работы у новорожденных из основной группы проводилось 3-х кратное иммунологическое обследование в динамике катам-нестического наблюдения. У детей группы сравнения обследование проводилось один раз сразу после рождения. Исследовались иммунологические показатели пуповинной крови.
Критерии включения новорожденных в исследование:
- имели респираторную патологию и перинатальное поражение ЦНС;
- гестационный возраст 38-41 неделя;
- вес при рождении не менее 2500 грамм;
- поступали в отделение реанимации на ИВЛ не позднее 7-х суток;
- при поступлении не имели клинических признаков внутриутробной инфекции, в том числе врожденной пневмонии.
Критерии исключения новорожденных в исследование:
- генетического нарушения гемопоэза;
- синдрома Дауна;
Наличие у детей острой дыхательной недостаточности (ОДН) в сочетании с данными прямой ларингоскопии, обнаружившей меконий ниже голосовых связок, позволили поставить диагноз мекониально аспирационный синдром (MAC) у 186 новорожденных (42,2%). У остальных 255 новорожденных (57,8%), вошедших в исследование, имели место вторичные ателектазы легких, причиной которых в 2% случаев стал геморрагический синдром, а в 98% - пе-
ринатальное сочетанное поражение центральной нервной системы (ЦНС)- у них был диагностирован респираторный дистресс-синдром.
В процессе терапии течение основного заболевания новорожденных детей осложнялось развитием сепсиса (7,48%).
Ретроспективно все дети с MAC и РДС были разделены на 4 группы. В первых группах (MAC, п=155; РДС, п=212) заболевание закончилось благоприятно. Эти дети в дальнейшем, после стабилизации жизненно важных функций, для продолжения лечения были переведены в отделение патологии новорожденных. У новорожденных, составивших вторую группу (MAC, п=12; РДС, п=11), основное заболевание осложнилось присоединением септической инфекции и закончилось благоприятно с переводом в отделение патологии новорожденных. Третью группу (MAC, п=2; РДС, п=8) составили новорожденные с присоединившейся септической инфекцией и летальным исходом. У новорожденных, составивших четвертую группу (MAC, п=17; РДС, п=24), основное заболевание закончилось летально.
Методы исследования
Исследование параметров иммунной системы проводилось на основе патогенетического принципа оценки иммунного статуса, разработанного в 1990 и дополненного в 1997 годах А.Н. Чередеевым и JI.B. Ковальчуком. В основу было положено изучение основных этапов функционирования клеток иммунной системы в процессе развития иммунного ответа, таких как распознавание, активация, пролиферация, дифференцировка и регуляция.
Исследование иммунного статуса проводилось сразу после поступления детей в отделение реанимации и в динамике (на 3-5-е сутки и исходе заболевания (20-е сутки)). Большинство новорожденных поступало в первые 48 часов жизни, поэтому результаты этих исследований отражали исходное состояние иммунной системы.
Определяли количественные и функциональные показатели клеточного и гуморального иммунитета, иммунорегуляторного звена, системы фагоцитов, уровня апоптоза. При оценке клеточного звена иммунитета определяли попу-ляционный и субпопуляционный состав лимфоцитов и моноцитов периферической крови (CD3+CD19", CD3"CD19+, CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD14+CD16+), уровень экспрессии маркеров активации лимфоцитов и моноцитов (CD3+CD25+, CD4+CD25\ CD16+CD25+, CD3+CD69+, CD3+CD71+, CD3+HLA-DR+, CD3+CD95\ CD14+CD69+, CD14+CD71+, CD14+HLA-DR+, CD14+CD95+), молекул адгезии (CD14+CDllb+, CD14+CDllc+, CD14+CD54+), TLR- рецепторов (CD 14^, CD14+CD282+, CD14+CD284+), а также CD3'CD16+56+, CD3+CD16+56+, CD16+CDllb+, CD14+CD64+, CD14+CD35+, CD45-FITC/CD14-PE методом одно-и двухпараметрического фенотипирования, используя комбинации монокло-нальных антител к дифференцировочным и активационным маркерам фирмы IQProducts (Нидерланды), Caltag (США), Immunotex (Франция), HyCultbiotechnology (Нидерланды): FITC (изотиоцианат флуоресцеина) и РЕ (фикоэритрин)- меченые.
Клетки метили аити-С045 и анти-CDM МАТ для наложения оптимального окна дискриминации (гейта) для лимфоцитов и моноцитов/макрофагов на точечном графике прямого и бокового светорассеяния. При анализе лимфоци-тарный гейт включал не менее 95-98% клеток с фенотипом CD45+CD14", моно-цитарно-макрофагальный гейт включал не менее 93-96% клеток с фенотипом CD45+CD14+. В каждом образце анализировали не менее 104 клеток.
Количество лимфоцитов и моноцитов, вступивших в апоптоз, выявляли с использованием диагностического набора, включающего Аннексин-У+, меченый FITC и пропидиум йодид (Р1+), меченый РЕ (Caltag, США).
Для удаления эритроцитов пробоподготовку проводили с использованием лизирующего раствора OptiLise С фирмы Immunotex (Франция) по прилагаемому протоколу.
Результаты учитывали на проточном цитофлюориметре BECKMAN COULTER EPICS XL-II (США), используя стандартные протоколы.
Определение количества лейкоцитов и дифференциальный подсчет лейкоцитов проводили на автоматическом гематологическом анализаторе МЕК 8222 (Япония). Исследовали периферическую кровь в режиме цельной крови. В анализаторе лейкоциты дифференцировались на популяции: лимфоциты, гра-нулоциты, моноциты, эозинофилы и базофилы.
Количественное содержание иммуноглобулинов в сыворотке крови определяли методом радиальной иммунодиффузии в геле (Manchini et al., 1965).
Спонтанный и индуцированный уровень продукции активных форм кислорода оценивали в НСТ-тесте по Пинегину Б.В. и соавт. (1989) методом спек-трофотометрии.
Фагоцитарную активность нейтрофилов и моноцитов крови определяли с использование стандартизированных по размеру частиц монодисперсного латекса с диаметром 1,3-1,5 мкм (Тотолян A.A., Фрейдлин И.С., 2000).
Количественное определение содержания цитокинов в сыворотке крови и бронхоальвеолярном лаваже проводилось методом твердофазного иммунофер-ментного анализа (ИФА = ELISA) с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента. Реакцию проводили согласно рекомендациям фирмы
- производителя. Определяли IL-lß, IL-6, IL-8, TNF-a, IFN-y, IFN-a, TGF-ßl, RANTES, GM-CSF, NO с использованием тест-систем фирмы Biosource (США), Bender Medsistems (Австрия), R&D Systems (США).
Учет реакции проводили на многофункциональном программируемом счетчике для иммунологических исследований с компьютером и программным обеспечением Multilabel Counter Victor - 2 1420 (Финляндия).
Количественную оценку результатов проводили методом построения калибровочной кривой, на которой отражена зависимость оптической плотности (ОП) от концентрации исследуемого цитокина. Результаты выражали в пг/мл и ммоль/л - оксид азота (NO).
Выделение альвеолярных макрофагов (AM) проводили в пробах брон-хоальвеолярного лаважа (БАЛ), полученного у новорождённых, находящихся на ИВЛ. Идентификацию клеток производили после окраски по Романовскому
- Гимза на светооптическом микроскопе.
Статистическая обработка данных
При статистическом анализе полученных результатов: При анализе различных несвязанных групп применялся критерий Манна-Уитни, а для связанных - критерий Вилкоксона. В расчет принимались случаи при максимальном уровне ошибки первого рода р<0,05. Показатели описательной статистики были представлены в виде выборочной средней и доверительного интервала.
При предварительном анализе данных для оценки тесноты связей отдельных показателей использовался коэффициент корреляции по Спирмену. Для оценки связей значимых признаков применялся метод «деревьев решений», который позволил провести деление по категориальным предикторам. Оценка точности, специфичности и чувствительности полученных методов разделения групп проводилась на основе контрольных выборок, которые не использовались при предварительном статистическом анализе.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
Известно, что наличие иммунной недостаточности у человека обуславливает различную дискоординацию иммунного реагирования на различные антигены (вирусы, микробы, грибы и т.д.). От эффективности защитно-приспособительных реакций зависит тяжесть и длительность заболевания, сроки выздоровления, хронизация воспалительных процессов, эффективность проводимой терапии.
Нами был проведен сравнительный анализ среднестатистических параметров иммунного статуса при первичном иммунологическом обследовании новорожденных с мекониально-аспирационным синдромом (MAC) и здоровых новорожденных.
В результате анализа полученных данных нами было установлено, что у новорожденных с синдромом мекониальной аспирации, по сравнению со здоровыми новорожденными имелись следующие статистически обоснованные различия параметров иммунного статуса.
Результаты фенотипирования лейкоцитов методом проточной цитомет-рии показали, что у новорожденных с мекониальной аспирацией было достоверно снижено процентное и абсолютное содержание количества CD3+CD19" (58,44±2,16% и 78,47±0,36%, 1,41±0,15 -109/л и 2,63±0,06-109/л, соответственно), CD3+CD4+ (42,76±1,73% и 56,31±0,33%, 1,03±0,11-107л и 1,89±0,04-ю7л, соответственно), CD3+CD8+ (13,16±0,62% и 22,21±0,3%, 0,32±0,04-109/л и 0,74±0,01-109/л, соответственно), увеличение иммунорегуляторного индекса CD4/CD8 (3,53±0,22 и 2,54±0,04 у здоровых новорожденных) вследствие количественного дефицита CD3+CD8+ лимфоцитов, который является одним из основных показателей, характеризующий гармоничность функционирования иммунной системы (р<0,05). При этом особо значимым было снижение процент-
ного и абсолютного количества CD3"CD19+ лимфоцитов у новорожденных с MAC по сравнению со здоровыми новорожденными (2,98±0,9% и 11,39±0,38%, 0,0б±0,01-109/л и 0,38±0,01-109/л, соответственно) (р<0,05). Спектр гуморальной защиты новорожденных с MAC оказался существенно ограничен за счет сниженной концентрации IgG (6,62±0,67 г/л, против 11,49±0,3 г/л) (р<0,05). Такой низкий уровень IgG у новорожденных рассматривается как свидетельство низкого уровня пассивного иммунитета, увеличивающего риск инфекционных осложнений в постнатальном периоде.
Причем, отклонения иммунного статуса такого рода у обследованных новорожденных с MAC составляли от 40 и до 79% от уровня нормальных показателей, что можно трактовать как иммунную недостаточность.
У новорожденных с MAC на 3-5 сутки динамического наблюдения достоверно снижалось абсолютное и относительное содержание CD3+CD19" относительно 1-х суток (53,27±1,98% и 58,44±2,16%, соответственно, 1,33±0,15-10% и 1,41±0Д5-109/л, соответственно), относительное содержание CD3+CD4+ (40,33±1,65% и 42,7б±1,73%, соответственно), абсолютного и относительного содержания CD3+CD8+ (9,17±0,4%- и 13,16±0,62%, соответственно, 0,22±0,2-109/л и 0,32±0,04-10%, соответственно), наблюдалось увеличение им-мунорегуляторного индекса (4,67±0,24 и 3,53±0,22, соответственно) (р<0,05).
Анализ функционального состояния клеток иммунной системы показал, что у новорожденных с MAC по сравнению со здоровыми новорожденными достоверно повышалось абсолютное и относительное содержание лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности маркеры ранней активации CD3+CD25+ и CD3+CD69+ (табл. 1).
Установлено достоверное снижение CD4+CD25+ и CD16+CD25+. Такое снижение регуляторных Т- клеток CD4+CD25+ приводит к осложненному течению воспалительного процесса инфекционной природы.
Известно, что лимфоциты в интактном состоянии не экспрессируют CD69+, но появляются после активации в течение 1-2 часов (Смолина Т.П., Запорожец Т.С., Горшкова Р.П. и соавт., 2009). По нашим данным у новорожденных с MAC уровень экспрессии CD3+CD69+ достигал значений, многократно (в 17 раз) превышающий уровни здоровых новорожденных.
Процентное содержание пролиферирующих клеток, несущих на своей поверхности трансферриновые рецепторы CD71+, имело достоверно высокий уровень у новорожденных детей с MAC. Аналогичные данные получены и по содержанию HLA-DR+, характеризующих поздние этапы активации лимфоцитов.
Как показали наши исследования, на 3-5 сутки у новорожденных с MAC регистрировалась достоверно повышенная, по сравнению с 1-ми сутками, абсолютная и относительная экспрессия молекул активации CD3+CD25+, CD3+CD69+, CD3+CD71+, CD3+HLA-DR+.
Таблица 1
Показатели функциональной активности лимфоцитов у новорожденных детей с MAC и здоровых новорожденных в динамике наблюдения
Показатель 1-е сутки 3-5-е сутки 20-е сутки (исход заболевания) Здоровые
n=155 n=155 11=155 n=38
CD3+CD25+ % 3,96±0,23* 4,9±0,18** 4,84±0,14*** 1,37±0,12
CD3+CD25+ io'/л 0,09±0,01* 0,12±0,01** 0,14±0,01*** 0,05±0,004
CD4+CD25+ % 1,1±0,12* - - 2,76±0,08
CD16+CD25+% 0,51±0,1* - - 1,57±0,09
CD16+CD25+ ю'/л 0,01±0,002* - - 0,02±0,001
CD3+CD69+ % 2,48±0,41* 5,63±0,33** 4,12±0,23*** 0,14±0,02
CD3+CD69+ io% 0,05±0,01* 0,14±0,02** 0,12±0,01*** 0,005±0,001
CD3+CD71+ % 3,34±0,57* 7,07±0,43** 4,78±0,24*** 0,22±0,02
CD3+CD71+ ю'/л 0,01±0,003* 0,004±0,001** 0,01±0,001 0,18±0,03
CD3+CDHLA-DR+% 9,54±0,7* 17,46±0,87** 13,86±0,58*** 3,4±0,18
CD3+HLA-DR+io'in 0,23±0,03* 0,44±0,05** 0,41±0,03*** 0,11±0,01
Примечание: * - различия показателей новорожденных с MAC на 1-е сутки наблюдения по сравнению со здоровыми статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Маниа-Уитни). ** - различия показателей новорожденных с MAC на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 3-5-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Вилкоксона). *** - различия показателей новорожденных с MAC на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 20-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Вилкоксона).
Однако, и на 20-ые сутки заболевания, по сравнению с первыми сутками, активация лимфоцитов периферической крови оставалась статистически обоснованно высокой.
Учитывая важное значение процессов апоптоза в поддержании гомеоста-за, нами было проанализировано содержание лимфоцитов, экспрессирующих Fas рецептор CD95+, как маркер поздней активации, характеризующий готовность клеток к апоптозу (табл. 2).
Оказалось, что как абсолютное, так и относительное содержание CD3+CD95+ - клеток было повышено у новорожденных с MAC. У новорожденных с MAC на 3-5 сутки по сравнению с 1-ми сутками, отмечалось достоверное усиление экспрессии Fas-антигена как в абсолютном, так и относительном содержании. На 20-е сутки заболевания по сравнению с 1-ми сутками достоверных различий обнаружено не было.
При исследовании реализации программированной клеточной гибели лимфоцитов в аннексиновом тесте у новорожденных нами было установлено, что у новорожденных с MAC по сравнению с контролем статистически достоверно увеличено содержание лимфоцитов периферической крови, находящихся в состоянии раннего Annexin V+ и позднего Annexin V+PI+ апоптоза.
Как показали наши исследования, на 3-5 сутки происходило достоверное повышение лимфоцитов, находящихся на ранней и поздней стадии апоптоза.
Таблица 2
Показатели аиоитоза лимфоцитов у новорожденных детей с MAC и здоровых новорожденных в динамике наблюдения
Показатель 1-е сутки 3-5-e сутки 20-c сутки ■ (исход заболевания) Здоровые
n=155 n=155 n=155 n=38
CD3+CD95+ % 8,2±0,6* 12,38±0,75** 7,97±0,45 2,27±0,18
CD3+CD95+ ю'/л 0,2±0,02* 0,31±0,04** 0,23±0,02 0,08±0,01
Annexin V+% 12,71±1,16* 17,48±1,17** 9,12±0,46*** 3,87±0,13
Annexin V+PI+ % 1,23±0,21* 1,79±0,23** 0,79±0,07*** 0,15±0,01
Примечание: * - различия показателей новоронодепных с MAC на 1-е сутки наблюдения по сравнению со здоровыми статистически обоснованы с ошибкой первого родя р<0,05 (критерий Манпа-Уитни). ** - различия показателей новорожденных с MAC на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 3-5-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода ¡><0,0? (критерий Вилкоксона). *** - различия показателей новорожденных с MAC на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 20-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Вилкоксона).
Следует заключить, что на 20- сутки динамического наблюдения количество лимфоцитов в раннем и позднем апоптозе достоверно снижалось, но, не достигая нормальных значений, что делало новорожденных уязвимыми в плане инфекционных осложнений.
Важным информативным показателем состояния иммунной системы новорожденного в периоде адаптации является уровень продукции цитокинов, которые, являясь связующим звеном между иммунной системой, гемостазом, ге-мопоэзом и ангиогенезом, выступают в роли регуляторов всех основных этапов жизнедеятельности (Кузник Б.И., 2004; Александрова Ю. Н., 2007). Баланс про - и противовоспалительных цитокинов может быть ключевым моментом, обусловливающим клиническое состояние ребенка (Володин Н.Н., 2004).
При анализе профиля цитокинов нами было установлено, что содержание IL-ip, IL-6, IL-8, TNF-a у здоровых новорожденных при физиологическом течении родов низкое (табл. 3). Полученные данные свидетельствуют о повышении продукции IL-ip, IL-б, IL-8, TNF-a у новорожденных с MAC и в большей степени изменения касались уровней IL-6, IL-8. Уровень IL-6, IL-8 в плазме крови коррелировал с тяжестью состояния новорожденного ребенка с MAC.
Выявленные нарушения свидетельствуют о существенном вкладе про-воспалительных цитокинов в патогенез мекониальной аспирации.
Изучение содержания IFN-y и IFN-a у новорожденных с MAC выявило разнонаправленный характер изменений - содержание IFN-y в сыворотке крови достоверно превышало показатели, характерные для группы здоровых новорожденных, в то время как содержание IFN-a было достоверно ниже по сравнению со здоровыми.
Обнаруженный низкий уровень IFN-a у новорожденных с MAC, по-видимому, свидетельствует о неполноценности этого защитного механизма и служит одной из причин частого возникновения тяжелого течения перинаталь-
ных инфекций, что свидетельствует в свою очередь о необходимости сочетания проводимого лечения с коррекцией функционирования системы интерферонов.
Таблица 3
Содержание провоспалительных цитокинов у новорожденных детей с MAC и здоровых новорожденных в динамике наблюдения
Показатель 1-е сутки 3-5-е сутки 20-е сутки (исход заболевания) Здоровые
п=155 п-155 11=155 п=38
IL-ip пг/мл 4,62±1,04* 9,24±1,4** 8,09±1,1*** 1,79±0,46
IL-6 пг/мл 126,13±13,01* 169,77±15,54** 56,95±6,19*** 5,26±0,95
IL-8 пг/мл 384,44±59,32* 458,02±65,76** 157,67±66,9*** 14,07±2,12
TNF-a пг/мл 18,25±5,66* 46,62±8,8** 28,49±3,42*** 8,98±1,17
IFN- а пг/мл 4,35±1,02* 5,16±0,73 5,43±0,75 11,28±0,4
IFN- у пг/мл 27,26±7,05* 11,82±2,44** 8,75±1,48*** 3,95±1,21
Примечание: * - различия показателей новороаденных с MAC на 1-е сутки наблюдения по сравнению со здоровыми статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Манна-Уитни). ** - различия показателей новорожденных с MAC на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 3-5-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Вилкоксона). *** - различия показателей новорожденных с MAC на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 20-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Вилкоксона).
В процессе динамического наблюдения за новорожденными с MAC, установлено, что сывороточные уровни провоспалительных цитокинов IL-ip, IL-6, IL-8, TNF-a достоверно повышались к 3-5 суткам, а к 20-м суткам заболевания происходило достоверное снижение IL-6, IL-8, TNF-a по сравнению с 1-ми сутками. Примечательно, что содержание IL-ip не снижалось к 20-ым суткам заболевания, а оставалось на достоверно высоком уровне по сравнению с 1-ми сутками наблюдения.
Как показали наши исследования, концентрация IFN- у достоверно снижалась в динамике наблюдения.
Таким образом, сохраняющаяся высокая концентрация провоспалительных цитокинов является неблагоприятным фактором, отражающим активность и тяжесть патологического процесса.
Нами было установлено, что TGF-р был достоверно повышен в группе новорожденных с MAC по сравнению с аналогичным показателем группы контроля, который в противовес провоспалительным цитокинам, супрессирует иммунный ответ путём деактивации моноцитов (табл. 4). В динамике наблюдения отмечено его достоверное снижение.
Нами впервые обнаружено достоверное снижение хемокина RANTES у новорожденных с MAC по сравнению со здоровыми новорожденными, что свидетельствует о его низкой активности при респираторной патологии, обусловленной MAC. Сниженная секреция RANTES, возможно отражает дисфункцию эндотелиальных клеток. Вместе с тем, у этих детей отмечено достоверное повышение данного хемокина во все сроки динамического наблюдения.
Таблица 4
Содержание TGF-p, RANTES, GM-CSF, NO у новорожденных детей с MAC и здоровых новорожденных в динамике наблюдения
Показатель 1-е сутки 3-5-е сутки 20-е сутки (исход Заболевания) < Здоровые
п=155 п=155 п=155 п=38
TGF-P пг/мл 11526,34±1174,23 * 8116±816 ** 5522,57±368,17 *** 2754,21±161,33
RANTES пг/мл 12326,37*1418,95 * 16440±1402,11 ** 22054,28±1586,79 *** 35486±2045,85
GM-CSF пг/мл 0,06±0,03 * 0,04±0,02 ** 1±0,08 *** 2,23±0,16
NO ммоль/л 8,81±0,82 * 5,33±0,46 ** 13,54±0,59 *** 18,52±0,68
Примечание: * - различия показателей новорожденных с MAC на 1-е сутки наблюдения по сравнению со здоровыми статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Манна-Уитни). ** - различия показателей новорожденных с MAC на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 3-5-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Вилкоксона). *** - различия показателей новорожденных с MAC на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 20-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Вилкоксона).
Анализ содержания ростового GM-CSF показал, что у новорожденных с MAC отмечалось достоверное снижение данного ростового фактора по сравнению с группой здоровых новорожденных. Значительное снижение содержания GM-CSF в сыворотке крови у новорожденных с MAC коррелирует с высокими значениями апоптоза лимфоцитов (rs= 0,64, р=0,03).
Анализируя содержание оксида азота (NO), нам удалось установить, что у новорожденных с MAC по сравнению с группой здоровых новорожденных выявлено достоверное снижение NO в сыворотке крови. По-видимому, в условиях системного воспаления без присоединения инфекционного процесса, не происходит повышение синтеза индуцибельной NO-синтазы, и соответственно не возрастает уровень NO в крови.
В динамике наблюдения отмечается достоверное снижение GM-CSF и N0 на 3-5 сутки и достоверное повышение на 20-ые сутки наблюдения относительно первых суток.
В настоящее время изучение механизмов врожденного иммунитета стало одной из главных задач клинической иммунологии (Хаитов P.M., Игнатьева Г.А. Сидорович И.Г., 2002; Lewis D.B., 2001). К системе врожденного иммунитета относят рецепторы семейства TLR (Taylor М.Е. et al., 1990; Меджидов Р., Джаневей Ч., 2004). Экспрессируемые фагоцитами рецепторы семейства TLR способствуют вовлечению в процесс элиминации инфекции приобретенного звена иммунитета (Малиновская В.В., Дмитриева Е.В., Паршина О.И. и соавт., 2009). Паттерны, распознаваемые TLR, описаны у многих грамположительных и грамотрицательных бактерий, ряда оболочечных вирусов, некоторых грибов и отдельных простейших (Хаитов P.M., Игнатьева Г.А. Сидорович И.Г., 2002; Байракова А.Л., Воропаева Е.А., Афанасьев С.С. и соавт., 2008).
У новорожденных с MAC выявляется статистически обоснованное снижение экспрессии CDM^, TLR-2 (CD14+CD282+) и TLR-4 (CD14+CD284+) в сравнении со здоровыми новорожденными, а также на 3-5-е и 20-е сутки динамического наблюдения (табл. 5).
Следствием снижения уровня экспрессии на моноцитах рецепторов, распознающих патоген, может стать отсутствие адекватной реакции на проникновение чужеродных агентов, персистенция инфекции и хронизация процесса.
Таким образом, снижение экспрессии и функции TLR у новорожденных с MAC способствует усугублению иммунной дисфункции, на фоне которой могут, присоединятся инфекционно-воспалительными заболеваниями (Sabroe I., Read R.C., Whyte М.К.В. et al., 2003).
В нашем исследовании у новорожденных с MAC отмечалось достоверно значимое снижение абсолютного и относительного содержания натуральных киллеров - NK(CD3"CD16+56+) (в 3,7 раза) и T-NK(CD3+CD16+56+) (в 4,1 раза) по сравнению с таковыми в группе здоровых новорожденных, а также на 3-5-е сутки по сравнению с первыми сутками.
Таблица 5
Показатели врожденного иммунитета у новорожденных детей с MAC и здоровых новорожденных в динамике наблюдения
Показатель 1-е сутки 3-5-е сутки 20-е сутки (исход заболевание) ; Здоровые
n-155 n=155 . n-155 n=38
CD14++ % 74,35±1,89* 65,53±1,46** 65,51±1,43*** 89,55±0,45
CD14+CD282+% 54,98±0,78* 53,58±0,69** 53,3±0,83*** 78±0,67
CD14+CD282+ ю'/л 0,53±0,1* 0,36±0,06** 0,56±0,1 0,78±0,03
CD14+CD284+ % 44,11±0,98* 43,1±0,8** 42,89±0,7*** 65,05±0,7
CD14+CD284+ ю'/л 0,42±0,07* 0,29±0,04** 0,45±0,08 0,65±0,02
CD3"CD16+56+ % 1,98±0,22* 1,48±0,14** 2,09±0,14 7,44±0,31
CD3CD16+56* ю'/л 0,05±0,01* 0,04±0,01 0,06±0,01 0,25±0,01
CD3*CD16+56+ % 0,61±0,04* 0,37±0,03** 0,54±0,06 2,52±0,06
CD3+CD16+56+io% 0,014±0,002* 0,01±0,001 0,02±0,002 0,08±0,002
Примечание: * - различия показателей новорожденных с MAC па 1-е сутки наблюдения по сравнению со здоровыми статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Манна-Уитни). ** - различия показателей новорожденных с MAC на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 3-5-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Вилкоксона). *** - различия показателей новорожденных с MAC на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 20-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Вилкоксона).
В целом, дефицит натуральных киллеров свидетельствует об участии этих клеток в иммунопатологических процессах у новорожденных с MAC, низкой резистентности иммунной системы новорожденного к инфекции, в первую очередь вирусной.
Важнейшими рецепторами поверхностной мембраны моноцитов являются Fc- рецепторы, способные связывать иммунные комплексы и тем самым об-
легчать фагоцитоз патогенных агентов, которые соединились со специфическими антителами против их антигенов.
Анализ экспрессии CD14+CD64+ и CD14+CD35+ показал, что у новорожденных с MAC отмечалось достоверное снижение абсолютного и относительного содержания данных рецепторов, CD14+CD35+ в 2,9 раза, a CD14+CD64+ в 1,4 раза, что свидетельствует о неэффективном хемотаксисе и фагоцитозе (табл. 6).
Важную роль в иммунной регуляции играют молекулы межклеточного взаимодействия - молекулы адгезии, обеспечивающие клеткам способность к миграции, что способствует более эффективному взаимодействию с клетками-мишенями.
Таблица б
Показатели функциональной активности моноцитов у новорожденных детей с MAC и здоровых новорожденных в динамике наблюдения
Показатель 1-е сутки 3-5-е сутки 20-c сутки ( и с « од ta бол« ад н и в) Здоровые
n=155 n=155 п=155 п=38
CD14+CDllb+% 17,48±0,96* 13,81±0,77** 14,39±0,97 42,44±1,11
CD14+CDllb+ ю'/л 0,1±0,02* 0,07±0,01 0,09±0,01 0,42±0,02
CD14+CDllc+ % 16,95±0,94* 13,76±1,04** 14,69±0,86 30,15±0,55
CD14+CDllc+ ю'/л 0,1±0,02* 0,07±0,01 0,09±0,01 0,3±0,01
CD14+CD54+ % 8,58±1,14* 8,36±0,82 9,49±0,8 32,63±0,87
CD14+CD54+ ю'/л 0,05±0,01* 0,05±0,01 0,06±0,01 0,32±0,01
CD14+CD64+ % 29,36±1,99* 25,91±1,24 26,86±1,49 41,81±0,82
CD14+CD64+IO7j. 0,15±0,03* 0,13±0,03 0,18±0,04 0,42±0,02
CD14+CD35+ % 12,35±1,47* 11,59±0,98 12,67±1,32 36,63±0,61
CD14+CD35+io% 0,07±0,01* 0,05±0,01 0,08±0,02 0,36±0,01
CD14+CD69+ % 22,43±0,64* 29±0,67** 24,12±0,63 15,47±0,66
CD14+CD69+io7i 0,13±0,02* 0,16±0,03** 0,16±0,02 0Д5±0,01
CD14+CD71+% 23,55±0,83* 30,01±0,94** 24,52±0,98 17,47±0Г37
CD14+CD71+io% 0,14±0,02* 0,17±0,03 0,16±0,02 0,18±0,01
CD14+HLA-DR+ % 64,68±0,82* 46,35±1,36** 51,67±0,78*** 86,07±0,92
CD14+CD16+% 7,24±0,17* 11,05±0,33** 11,84±0,31** 5,51±0,15
CD14+CD16+ ю'/л 0,06±0,01 0,07±0,01 0,09±0,01 0,06±0,003
CD16+CDllb+ % 1,82±0,19* - - 4,41±0,08
CD16+CDUb+ 109/л 0,02±0,01* - - 0,04±0,002
Примечание: * - различия показателей новорожденных с MAC на 1-е сутки наблюдения по сравнению со здоровыми статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Манна-Уитни). ** - различия показателей новорожденных с MAC на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 3-5-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Вилкоксона). *** - различия показателей новорожденных с MAC на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 20-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерии Вилкоксона).
Анализируя полученные данные, нами было установлено, что у новорожденных с MAC в периферической крови достоверно снижено содержание моноцитов, экспрессирующих маркеры адгезии CD14+CDllb+, CD14+CDllc+, CD14+CD54+, в том числе и на естественных киллерах CD16+CDllb+ по сравнению с группой контроля.
К 3-5-м суткам было достоверно снижено содержание CD14+CDllb+, CD14+CDllc+ по сравнению с 1-ми сутками наблюдения. Снижение адгезионных свойств моноцитов связано со снижением их функциональной активности.
У новорожденных с MAC по сравнению со здоровыми новорожденными, была достоверно снижена экспрессия HLA-DR на моноцитах, а также на 3-5-е и 20-е сутки по сравнению с 1-ми сутками наблюдения, что свидетельствовало о дезактивации моноцитов.
При снижении экспрессии CD14+HLA-DR+ увеличивается риск развития и хронизации инфекционно-воспалительных процессов.
Изучая экспрессию CD14+CD95+, мы наблюдали достоверное повышение относительного количества моноцитов, экспрессирующих этот рецептор по сравнению с группой здоровых детей (табл. 7). Так, на 3-5-е сутки динамического наблюдения по сравнению с 1-ми сутками, было выявлено достоверное увеличение экспрессии CD14+CD95+, что свидетельствовало о высокой готовности моноцитов к апоптозу.
Кроме того, по результатам аннексинового теста повышалось количество моноцитов вступивших в ранний и поздний апоптоз (Annexin V+ и Annexin V+PI+) по сравнению с группой контроля, а также на 3-5-е сутки динамического наблюдения.
Таблица 7
Показатели апоптоза моноцитов у новорожденных детей с MAC и здоровых новорожденных в динамике наблюдения
Показатель 1-е сутки 3-5-e сутки 20-е сутки (нсхол sit боле виня«) Здоровые
n=155 n=155 n=15S n=38
CD14+CD95+% 26,56±0,8* 40,86±0,89** 28,78±0,71 17,5±0,44
CD14+CD95+ ю'/л 0,21±0,02 0,23±0,02 0,23±0,02 0,18±0,01
Annexin V+ % 21,45±0,71* 30,92±0,91** 19,39±0,42 13,24±0,27
Annexin V* PI+ % 2,34±0,11* 3,9±0,17** 2,02±0,05 0,97±0,06
Примечание: * - различия показателей новорожденных с MAC на 3-е сутки наблюдения по сравнению со здоровыми статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Манна-Уитни). ** - различия показателей новорожденных с MAC на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 3-5-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Вилкоксона). * * * - различия показателей новорожденных с MAC на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 20-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Вилкоксона).
Таким образом, выраженная гибель циркулирующих моноцитов у новорожденных с синдромом мекониальной аспирации может являться лабораторным критерием развития количественных и функциональных нарушений в системе иммунитета.
Для новорожденных с MAC оказалось характерным достоверное снижение фагоцитарной активности нейтрофилов и моноцитов по показателям фагоцитарного индекса (Фи) (43,71±1,05% против 79,65±0,69% и 24,23±1,81% против 70,05±0,92%) и фагоцитарного числа (Фч) (4,6±0,16% против 10,6±0,22% и 3,12±0,27% против 10,01±0,19%), которое сочеталось со снижением кислород-зависимого (НСТ-тест) механизма микробицидности (р<0,05).
При анализе динамики показателей иммунной системы нами было установлено, что у новорожденных с MAC в динамике наблюдения не происходит нормализации большинства параметров врожденного и адаптивного иммунитета. Специфические изменения в дыхательной системе сочетаются с дисфункцией иммунной системы. Обнаруженная диссоциация иммунного ответа, по-видимому, отражает функциональную незрелость самой иммунной системы, но, с другой стороны, диктует новый подход при решении вопроса о целесообразности проведения и выбора средств иммунотропной терапии.
Нами были проведены исследования иммунного статуса у 12-ти новорожденных с MAC, основное заболевание которых осложнилось бактериальным сепсисом и закончилось благоприятно с переводом в отделение патологии новорожденных.
Общеизвестно, что одним из важных механизмов регулирования иммунной системы является апоптоз. Ассоциированный с мембраной клетки Fas-рецептор (CD95) является ключевой молекулой, опосредующей апоптоз, а Fas-опосредованный апоптоз лимфоцитов является важнейшим механизмом регуляции иммунного гомеостаза (Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В., 2002). Выявленное нами достоверное увеличение содержания CD95+ - лимфоцитов и моноцитов периферической крови иллюстрировало повышенную готовность CD3+CD95+ и CD14+CD95+ к апоптозу у новорожденных с MAC, осложненных сепсисом (табл. 8).
Число клеток, экспрессирующих CD95 , достоверно увеличивалось по мере утяжеления процесса на 3-5-е сутки наблюдения.
Нами установлено, что у новорожденных с MAC по сравнению с группой здоровых новорожденных, достоверно увеличено содержание лимфоцитов и моноцитов периферической крови, находящихся в состоянии раннего Annexin V+ и позднего Annexin V+PI+ апоптоза. Высокий уровень экспрессии Annexin V+ и Annexin V+PI+ на лимфоцитах и моноцитах коррелировал с низким содержанием GM-CSF (rs=0,52, р=0,04).
Таким образом, в условиях чрезмерной гибели лимфоцитов и моноцитов, иммунная система не может выполнять свою главную функцию осуществления иммунологического надзора, что приводит к развитию гнойно-септических осложнений и усугубляет синдром полиорганной недостаточности.
Обнаруженная закономерность позволила нам предложить для клинической практики новый способ ранней диагностики развития неонатального сепсиса у новорожденных детей с MAC, основанный на определении уровня экспрессии Annexin V+ на моноцитах в периферической крови. (Патент на изобретение «Способ ранней диагностики развития неонатального сепсиса у новорожденных с синдромом дыхательных расстройств и гипоксическим
поражением ЦНС» №2374646 от 27.11. 2009 г). Уровень экспрессии Annexin V+ на моноцитах равный 17,4% или более позволяет диагностировать у новорожденных с респираторными нарушениями септическое осложнение с чувствительностью 90,91% и специфичностью 89,55%.
Таблица 8
Показатели апоптоза лимфоцитов и моноцитов у новорожденных детей с MAC, осложненных бактериальным сепсисом без летального исхода и здоровых новорожденных в динамике наблюдения
Показатель 1-е сутки ; 3-5-е сутки 20-е сутки (исход заболевания): Y: Здоровые
ii=12 n-12 n=12 n=38
CD3+CD95+ % 6,55±1,69* 12,82±2,15** 11,4±2,9*** 2,27±0,18
CD3+CD95+ 109/л 0,22±0,12* 0,36±0,16 0,35±0,12 0,08±0,01
CD14+CD95+ % 24,72±2,93* 47,07±3,17** 28,37±1,99 17,5±0,44
CD14+CD95+ 109/л 0,25±0,07 0,42±0,21 0,38±0,14 0,18±0,01
Annexin V+ % (лф) 10,13±2* 20,33±3,29** 14,66±4,85*** 3,87±0,13
Annexin V+PI+ % (лф) 0,73±0,33* 2,09±0,69** 1,44±0,76*** 0,15±0,01
Annexin V+ % (mii) 24,13±2,35* 40,9±3,19** 19,97±1,33*" 13,24±0,27
Annexin V+PI+ % (mii) 2,26±0,27* 5,1±0,74** 2,1±0,18 0,97±0,06
Примечание: * - различия показателей новорожденных с MAC на 1-е сутки наблюдения по сравнению со здоровыми статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Манна-Уитни). ** - различия показателей новорожденных с MAC на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 3-5-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Вилкоксона). *** - различия показателей новорожденных с MAC на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 20-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Вилкоксона).
Основная задача системы врожденного иммунитета - обнаружение инфекционного агента с помощью патогенраспознающих рецепторов. Анализируя содержание TLR нам удалось установить, у новорожденных с MAC осложненных бактериальным сепсисом выявлено достоверное снижение экспрессии TLR-2 (CD282+) и CD14++ на моноцитах периферической крови по сравнению со здоровыми новорожденными (табл. 9).
В процессе динамического наблюдения на 3-5-е сутки происходило достоверное увеличение экспрессии TLR-2 (CD282+) по сравнению с 1-ми сутками, но при этом происходило достоверное снижение экспрессии CD14+t. На 20-е сутки заболевания наблюдалось незначительное снижение экспрессии TLR-2 (CD282+) по сравнению с 3-5-ми сутками и увеличение экспрессии CD14+f по сравнению с 3-5-ми сутками. Интересно отметить, что по TLR-4 (CD284+) значимых отличий между 1-ми, 3-5-ми сутками и 20-ми сутками не получено, уровень экспрессии соответствовал возрастной норме.
Таким образом, при сепсисе у новорожденных существенное и быстрое увеличение экспрессии TLR-2 (CD282+) на моноцитах прослеживается уже при первоначальных признаках воспаления и измерение экспрессии CD14+CD282+ может служить ранним маркером развития бактериального осложнения.
Таблица 9
Показатели врожденного иммунитета у новорожденных детей с MAC, осложненных бактериальным сепсисом без летального исхода и здоровых новорожденных в динамике наблюдения
Показатель 1 -e сутки 3-5-е сутки 20-е сутки (исход заболевание): Здоровые
n=12 n=12 n=12 n=38
С014~ % 63,43±2,29* 47,45±2,13** 58,47±3,42 89,55±0,45
CD14+CD282+ % 71,33±1,27* 81,69±1,38** 79,7± 1,21 78±0,67
CD14+CD282+ Ю'/л 0,73±0,22 0,72±0,33 1,15±0,53 0,78±0,03
CD14+CD284+ % 62,89±1,43 66,7± 1,01 66,79±0,98 65,05±0,7
CD14+CD284+ 109/л 0,65±0,21 0,59±0,27 0,95±0,43 0,65±0,02
CB3"CD16+56+ % 2,19±0,84* 1,1±0,27** 1,82±0,26 7,44±0,31
CD3CD16+56+ 109/л 0,05±0,02* 0,03±0,01** 0,05±0,01 0,25±0,01
CD3+CD16+56+ % 0,6±0,2* 0,2±0,07** 0,34±0,18*** 2,52±0,06
CD3+CD16+56+10'/л 0,02±0,01* 0,009±0,001** 0,02±0,002 0,08±0,002
Примечание: * - различия показателей новорожденных с MAC на 1-е сутки наблюдения по сравнению со здоровыми статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Манна-Уитни). ** - различия показателей новорожденных с MAC на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 3-5-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Вилкоксона). *** - различия показателей новорожденных с MAC 11а 1-е сутки наблюдения по сравнению с 20-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Вилкоксона).
У новорожденных с MAC осложненных сепсисом, отмечалось достоверно значимое снижение абсолютного и относительного содержания натуральных киллеров - NK(CD3"CD 16+56+) и T-NK(CD3+CD16+56+) по сравнению с таковыми в группе здоровых новорожденных (табл. 9). В процессе динамического наблюдения происходило дальнейшее достоверное снижение NK(CD3" CD16 56 ) и T-NK(CD3 CD16 56 ) во все сроки наблюдения, что свидетельствовало о крайне низкой резистентности иммунной системы новорожденного к инфекции.
Сравнительная оценка содержания CD14+HLA-DR+ у новорожденных с MAC осложненных сепсисом и здоровых новорожденных показала, что у детей
с MAC достоверно резко снижена экспрессия HLA-DR+ на моноцитах (65,8±1,9% против 86,07±0,92 %) (р<0,05).
К 3-5-м суткам динамического наблюдения происходило достоверное снижение CD14+HLA-DR+ по сравнению с первыми сутками (42,3±3,94% против 65,8±1,9%) и хотя к 20-м суткам заболевания уровень экспрессии CD14+HLA-DR+ составил 53,14±4,65%, нормализации данного параметра не наблюдалось (р<0,05).
Таким образом, нашими исследованиями впервые было установлено, что моноциты новорожденных с септическими осложнениями в значительно меньшей степени экспрессируют HLA-DR+, чем моноциты новорожденных без таковых, что может быть причиной дефекта антигенпрезентирующей функции. Мониторинговое определение относительного содержания HLA-DR+ на моноцитах позволяет с высокой степенью вероятности диагностировать развитие неонатального сепсиса у новорожденных детей на доклинической стадии. (Патент на изобретение «Способ ранней диагностики развития неонатального сепсиса у новорожденных с синдромом дыхательных расстройств и гипоксическим поражением ЦНС» №2374646 от 27.11. 2009 г). Способ обладает высокой чувствительностью (85,7%) и специфичностью (82%).
Резюмируя представленные результаты исследования, можно констатировать, что наиболее информативными тестами диагностики иммунодепрессии при септических осложнениях является оценка уровня экспрессии CD14+HLA-DR+, CD14+CD282+ и уровня AnnexinV+ на лимфоцитах и моноцитах. Сниженная экспрессия CD14+HLA-DR+, CD14+CD282+ и высокий уровень AnnexinV+ на лимфоцитах и моноцитах может выступать предиктором присоединения септической инфекции у доношенных новорожденных с синдромом мекони-альной аспирации.
Итак, иммунные расстройства, наблюдаемые в динамике течения сепсиса, являются основанием для рассмотрения дисфункции иммунной системы, что требует адекватной тактики медикаментозной профилактики и терапии.
Решая поставленные задачи, нами был проведен сравнительный анализ среднестатистических параметров врожденного и адаптивного иммунитета как при первичном иммунологическом обследовании доношенных новорожденных с респираторным дистресс-синдромом и здоровых новорожденных, так и в динамике наблюдения.
У новорожденных с РДС была нарушена субпопуляционная структура Т-клеточного звена за счет снижения относительного и абсолютного количества CD3+CD8+ лимфоцитов (15,28±0,58% и 22,21±0,3%; 0,36±0,05-109/л и 0,74±0,01Т09/л, соответственно) (р<0,05). Сравнение средних значений CD3" CD19+ у новорожденных с РДС выявило статистически достоверное снижение как процентного, так и абсолютного содержания по сравнению с группой контроля (3,19±0,33% и 11,39±0,38%; 0,07±0,0М0% и 0,38±0,01-109/л, соответственно) (р<0,05). При этом содержание сывороточного иммуноглобулина IgG было в 1,8 раза меньше уровня нормальных возрастных значений (6,48±0,57 г/л и 11,49±0,3 г/л) (р<0,05).
При исследовании функциональной активности лимфоцитов периферической крови нами было установлено, что у новорожденных с РДС по сравнению с группой контроля достоверно повышалось содержание лимфоцитов, экспрес-сирующих на своей мембране маркеры активации СОЗ+СЭ25+, СБЗ+СОб9+, СОЗ+СБ71+ и СОЗ+НЬА-БЯ+ (табл. 10).
Между тем, и к 3-5-м и 20-м суткам заболевания уровень экспрессии СЭЗ+С025+, СОЗ+СЭ69\ СЭЗ+С07Г, СОЗ+НЬА-ОЛ+ оставался достоверно высоким относительно первых суток, что свидетельствовало о выраженной функциональной активности лимфоцитов у этой категории новорожденных.
Таблица 10
Показатели функциональной активности лимфоцитов у доношенных новорожденных детей с РДС и здоровых новорожденных в динамике
наблюдения
Показатель 1-е сутки 3-5-е сутки 20-е сутки : (исход заболевания) Здоровые
п=212 п=212 п=212 п=38
СОЗ+СП25+ % 2,79±0,19* 3,75±0,15** 3,89±0,13*** 1,37±0,12
С03+С025+ 107л 0,07±0,01 0,09±0,01 0,11±0,01*** 0,05±0,004
СП4+С025+ % 0,97±0,12* - - 2,76±0,08
СШ6+С1)25+ % 0,43±0,08* - - 1,57±0,09
С016+С025+ Ю'/л 0,003±0,001* - - 0,02±0,001
СПЗ+СП69+ % 2,32±0,24* 4,94±0,23** 3,72±0,18*** 0,14±0,02
С03+С069+ 109/л 0,06±0,01* 0,13±0,01** 0,1±0,01*** 0,005±0,001
ст*съп* % 3,01±0,45* 7,47±0,45** 5,29±0,32*** 0,22±0,02
С03+С071+ 107л 0,02±0,003* 0,04±0,0004** 0,03±0,001 0,18±0,03
СГ>3+Ш.Л-1Ж+ % 9,95±0,61* 17,39±0,7** 13,76±0,44*** 3,4±0,18
сг>з"нь\-гт+1о7л 0,24±0,04* 0,45±0,04** 0,38±0,03*** 0,11±0,01
Примечание: * - различия показателей новорожденных с РДС на 1-е сутки наблюдения по сравнению со Здоровыми статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Манна-Уитни). ** - различия показателей новорожденных с РДС на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 3-5-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Вилкоксона). * * * - различия показателей новорожденных с РДС на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 20-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Вилкоксона).
Нами было установлено, что у новорожденных с РДС по сравнению с группой контроля было достоверно повышенным содержание лимфоцитов, экспрессирующих на своей мембране СВЗ+СЭ95+. Необходимо отметить, что у новорожденных с РДС к 3-5 суткам динамического наблюдения происходило достоверное увеличение экспрессии СБЗ+СЭ95+ (табл. 11). Выявленное увеличение содержания СБЗ+С095+ иллюстрировало сохраняющуюся повышенную готовность лимфоцитов периферической крови к апоптозу у новорожденных детей с респираторным дистресс-синдромом.
Так, при исследовании реализации программированной клеточной гибели лимфоцитов в аннексиновом тесте нами было установлено, что у новорожденных с РДС по сравнению с группой контроля, достоверно повышенным оказалось содержание АппехтУ+ и АппехтУ+Р1+, маркеров раннего и позднего апоптоза.
В динамике наблюдения к 3-5 суткам происходило достоверное повышение содержания АппехтУ+ и АппехтУ+Р1+. На 20-е сутки заболевания уровень экспрессии Аппех1пУ+ и АппехшУ+Р1+ составил 8,06±0,47% и 0,65±0,06%, что свидетельствовало о сохраняющихся высоких уровнях раннего и позднего апоптоза у новорожденных с РДС.
Таблица 11
Показатели апоптоза лимфоцитов у доношенных новорожденных детей с РДС и здоровых новорожденных в динамике наблюдения
Показатель 1-е сутки 3-5-е сутки 20-е сутки (исход заболевать) Здоровые
п=212 п=212 п=212 п=38
СОЗ+СИ95+ % 6,8±0,7* 9,46±0,64** 6,96±0,31 2,27±0,18
СШ+СБ95+ м'/л 0,17±0,03* 0,23±0,02 0,19±0,01 0,08±0,01
Аппехш У+ % 11,38±1,0б* 14,04±0,8** 8,06±0,47*** 3,87±0,13
Аппехш УРГ % 0,96±0,14* 1,37±0,13** 0,65±0,06*** 0,15±0,01
Примечание: * - различия показателей новорожденных с РДС на 1-е сутки наблюдения по сравнению со здоровыми статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Манна-Уитни). ** - различия показателей новорожденных с РДС на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 3-5-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Вилкоксона). **♦ - различия показателей новорожденных с РДС на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 20-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Вилкоксона).
По результатам проведенных исследований нами было установлено (табл. 12), что у новорожденных с РДС, по сравнению со здоровыми новорожденными, в периферической крови имел место достоверно высокий уровень 1Ь-1р, 1Ь-6,1Ь-8, Т№-а, №N-7, свидетельствующий об активации макрофагального звена иммунной системы (табл. 12).
Таблица 12
Содержание провоспалительных цитокинов и интерферонов у доношенных новорожденных детей с РДС и здоровых новорожденных в динамике
наблюдения
Показатель 1-е сутки 3-5-е сутки 20-е сутки (исход заболевания) Здоровые
п=212 п=212 п=212 п=38
1Ь-1[) пг/мл 4,79±1,19* 6,45±1,24** 6,73±1,14*** 1,79±0,46
1Ь-6 пг/мл 93,37±21,1* 115,97±20,95** 36,29±5,1*** 5,26±0,95
1Ь-8 пг/мл 126,57±23,75* 148,99±23,07** 64,27±6,62*** 14,07±2,12
Т№-а пг/мл 16,16±2,89* 42,91±6,37** 27,25±2,55*** 8,98±1,17
IFN- а пг/мл 4,25±0,66* 5,11±0,58** 5,14±0,45*** 11,28±0,4
№14- у пг/мл 21,28±5,94* 10,45±2,01** 7,77±0,91*** 3,95±1,21
Примечание: * - различия показателей новорожденных с РДС на 1-е сутки наблюдения по сравнению со здоровыми статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Манна-Уитни). ** - различия показателей новорожденных с РДС на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 3-5-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Вилкоксона). *** - различия показателей новорожденных с РДС на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 20-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Вилкоксона).
Сравнительное изучение содержания провоспалительных цитокинов у новорожденных с РДС выявило, что в сыворотке крови на 20-е сутки заболевания происходило достоверное снижение 1Ь-6,1Ь-8 и ТИР-а.
Однако уровень 1РМ-у достоверно снижался на 3-5 сутки и к 20-м суткам заболевания. Напротив, уровень 1РМ-а хотя и не столь значительно, но достоверно повышался во всем периоде динамического наблюдения, однако уровня контрольных значений не достигал.
Нами установлено, что у новорожденных с РДС уровень ТвР-р был достоверно повышен по сравнению с аналогичным показателем группы контроля (табл. 13).
Следует отметить, что у новорожденных с РДС отмечено достоверное снижение содержания ТСР-р в сыворотке крови в динамике наблюдения.
Таблица 13
Содержание ТСР- р, Г$Л!\ТТЕ8, вМ-СБР, N0 у доношенных новорожденных детей с РДС и здоровых новорожденных в динамике наблюдения.
Показатель 1-есутки 3-5-с сутки 20-е сутки (исход заболевании) Здоровые
п=212 п=212 п=212 п=38
КЛ -Р пг/мл 11290,51±1522,74 * 7967,94±824,77 ** 5609,97±426,51 *** 2754,21±161,33
1ШЧТЕ8 пг/мл 12669,1±1132,73 * 16463,58±1270,5 *♦ 21610,76±1546,8 *** 35486±2045,85
ОМ-С^Г пг/мл 0,11 ±0,05 * 0,06±0,04 ** 0,89±0,11 *»* 2,23±0Д6
N0 ммоль/л 8,54±0,75 * 6,17±1,31 ** 12,92±0,54 *** 18,52±0,68
Примечание: * - различия показателей новорожденных с РДС на 1-е сутки наблюдения по сравнению со здоровыми статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Манна-Уитни). ** - различия показателей новорожденных с РДС па 1-е сутки наблюдения по сравнению с 3-5-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Вилкоксона). *** - различия показателей новорожденных с РДС на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 20-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Вилкоксона).
Содержание хемокина ЫАМТЕ8 и ростового вМ-СЗР было достоверно сниженным по сравнению с группой контроля, но содержание ЯАМТЕ8 повышалось во все сроки динамического наблюдения. Содержание ОМ-С8Р достоверно снижалось на 3-5 сутки и повышалось к 20-м суткам заболевания по сравнению с первыми сутками.
У новорожденных с РДС по сравнению со здоровыми новорожденными, имело место достоверное снижение уровня N0. Полученные нами данные свидетельствовали об отсутствии системного воспаления без присоединения инфекционного процесса.
Так, проведенные нами исследования иллюстрируют, что у новорожденных с РДС количество моноцитов, экспрессирующих С014+СЭ282+, С014+С0284+, С014++ оказалось достоверно сниженным как в относительных, так и абсолютных значениях в сравнении с группой контроля (табл. 14).
Следует отметить, что у анализируемой группы новорожденных детей было достоверно снижено как абсолютное, так и относительное содержание ЫК(СОЗ"С1Э1б+5б+) и Т-ЫК(СОЗ+СВ16+56+) по сравнению с таковыми в группе здоровых новорожденных.
На 3-5-е сутки динамического наблюдения и к 20-м суткам заболевания не наблюдалось увеличения содержания в периферической крови ЫК(СОЗ" СШ6+56+) и Т-МК(С03+С016+56+).
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о выраженной супрессии клеток, обладающих киллерной активностью.
Таблица 14
Показатели врожденного иммунитета у доношенных новорожденных детей с РДС и здоровых новорожденных в динамике наблюдения
Показатель 1-е сутки 3-5-е сутки 20-е сутки (исход эяиолевянии) Здоровые
п=212 п=212 п=212 п=38
С014++% 70г31±4,04* 64,71±2,69** 65±2,5 89,55±0,45
С014+С0282+ % 55,59±1,02* 54,35±0,96 54,57±0,91 78±0,67
С014ЧЛШ2+ ю% 0,45±0,1* 0,32±0,06 0,43±0,08 0,78±0,03
С014+С0284+ % 43,73±0,93* 43,08±0,83 42,64±0,73 65,05±0,7
С014+С0284+ ю'/л 0,34±0,07* 0,25±0,05 0,33±0,06 0,65±0,02
СБЗ-СШ6+56+ % 2,15±0,22* 1,66±0,15 2,2±0,15 7,44±0,31
СПЗС1)16+56+ ю'/л 0,05±0,01 * 0,04±0,01 0,06±0,01 0,25±0,01
СПЗ+СШ6+56+ % 0,76±0,05* 0,52±0,04 0,78±0,08 2,52±0,06
СОЗ+СШб+56+ю'/л 0,02±0,004* 0,01±0,002 0,02±0,003 0,08±0,002
Примечание: * - различия показателей новорожденных с РДС на 1-е сутки наблюдения по сравнению со здоровыми статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Манна-Уитни). ** - различия показателей новорожденных с РДС на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 3-5-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Вилкоксона). *** - различия показателей новорожденных с РДС на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 20-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Вилкоксона).
Анализ экспрессии молекул адгезии на моноцитах выявил, что у новорожденных с РДС по сравнению с контрольной группой, было достоверно снижено содержание С014+СБ11Ь+, С014+С011с+, С014+С054+. Указанный феномен был выражен не только в относительных, но и в абсолютных величинах и в динамике наблюдения (табл. 15).
Таблица 15
Показатели функциональной активности моноцитов у доношенных новорожденных детей с РДС и здоровых новорожденных в динамике
наблюдения
Показатель 1 -е сутки 3-5-е сутки 20-е сутки (исход заболевания) ^ Здоровые
п=212 п=212 п=212 п=38
СШ4+СОПЬ+ % 18,2±0,86* Х4,72±0,71** 14,55±0,84*** 42,44±1,11
СШ4+С011Ь + Ю'/л 0,1±0,01* 0,08±0,01 0,07±0,01 0,42±0,02
СШ4+СШ1с+ % 16,46±0,89* 13,9±0,86** 14,1±0,77*** 30,15±0,55
СШ4+С011с+ 109/л 0,09±0,01* 0,08±0,01 0,07±0,01 0,3±0,01
С014+СП54+ % 9,32±1* 8,21±0,74** 9,73±0,8 32,63±0,87
С014+СЭ54+ 109/л 0,06±0,01* 0,04±0,01 0,05±0,01 0,32±0,01
С014+С064* % 26,33±1,28* 24,13±1,24** 24,68±1,48*** 41,81±0,82
С014*С064+10'/л 0,Х4±0,02* 0ДЗ±0,02 0,13±0,02 0,42±0,02
СШ4+С1)35+% 12,77±1,71* 10,84±1,17** 12,03±1,05 36,63±0,61
С014+С035+109/л 0,07±0,01* 0,06±0,01 0,06±0,01 0,36±0,01
С1)14+СЛ)69+ % 22,44±0,57* 29,51±0,54** 24,89±0,71 15,47±0,66
С014+С069+10"/л 0,13±0,01* 0,16±0,02 0,13±0,02 0,15±0,01
СГЛ4+СИ71+ % 23,06±0,6* 29,54±0,67** 24,36±0,79 17,47±0,37
СИ14*С071+ 105/л 0,13±0,01* 0,16±0,02 0,13±0,02 0,18±0,01
С1)14+С1)ШЛ-1Ж*% 64,16±0,62* 48,22±1,03** 51,44±0,63*** 86,07±0,92
СП14+С1)16+ % 7,63±0,24* 11,18±0,25** 11,95±0,23*** 5,51±0,15
СБ14+СШ6+ 109/л 0,05±0,005* 0,06±0,01** 0,07±0,01*** 0,0б±0,003
Примечание: * - различия показателей новорожденных с РДС на 1-е сутки наблюдения по сравнению со здоровыми статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Манна-Уитни). *ф - различия показателей новороэвденных с РДС на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 3-5-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Вилкоксона). *** - различия показателей новорожденных с РД на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 20-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Вилкоксона).
Таким образом, у новорожденных с РДС была нарушена способность моноцитов к миграции для осуществления основной функции иммунного надзора.
При изучении активационных маркеров CD69+, CD71+ на моноцитах оказалось, что у новорожденных с РДС было статистически достоверно увеличено содержание CD14+CD69+, CD14+CD71+ по сравнению с группой контроля и на 3-5 сутки наблюдения по сравнению с первыми сутками.
В рамках исследования нами было установлено, что количество моноцитов, экспрессирующих Fq?RI (CD64) и CRI (CD35) у новорожденных с РДС было статистически достоверно сниженным относительно группы контроля во все сроки динамического наблюдения.
Установленное нами существенное снижение числа моноцитов, экспрессирующих HLA-DR (CD14+HLA-DR+), свидетельствует о выраженной редукции функциональной активности моноцитов у новорожденных с РДС.
Указанный феномен отчетливо прослеживается на всем периоде динамического наблюдения. В силу этого можно предположить, что у новорожденных с РДС нарушены процессы распознавания и презентации антигенов.
Анализируя содержание параметров апоптоза AnnexinV+ и AnnexinV+PI+ на моноцитах, было установлено их достоверное повышение относительно группы здоровых новорожденных и сохраняющихся в динамике наблюдения (табл. 16).
Таблица 16
Показатели апоптоза моноцитов у доношенных новорожденных детей с РДС и здоровых новорожденных в динамике наблюдения
Показатель 1-е сутки 3-5-e сутки 20-е сутки (исход заболевания) Здоровые
n=212 n=212 n=212 n=38
CD14+CD95+ % 27,62±0,67* 41,29±0,79** 29,11±0,59 17,5±0,44
CD14+CD95+ io'/л 0,18±0,01 0,24±0,02** 0,18±0,01 0,18±0,01
Annexin V+ % 20,66±0,43* 29,86±0,8** 19,01±0,33 13,24±0,27
Annexin V+PI+ % 2,27±0,08* 3,63±0,12** 1,95±0,04 0,97±0,06
Примечание: * - различия показателей новорожденных с РДС на 1-е сутки наблюдения по сравнению со здоровыми статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Манна-Уитни). ** - различия показателей новорожденных с РДС на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 3-5-мн сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Вилкоксона). *** - различия показателей новорожденных с РДС на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 20-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Вилкоксона).
Нами установлено, что у новорожденных с РДС, наблюдалось выраженное статистически достоверное угнетение спонтанной и индуцированной НСТ-
активности нейтрофилов и моноцитов при одновременном снижении фагоцитарного индекса (ФИ) и фагоцитарного числа (ФЧ) (табл. 17).
Таблица 17
Показатели фагоцитарной активности нейтрофилов и моноцитов у доношенных новорожденных детей с РДС и здоровых новорожденных
Показатель 1-е сутки Здоровые
11=155 п=38
НСТ (нейтрофилов) споит., у.е. 47,45±5,67* 78,44±0,77
НСТ (нейтрофилов) стим., у.е. 67,68±5,75* 149,13±0,71
К стим. (нейтрофилов), у.е. 1,47±0,16* 1,87±0,01
НСТ (моноцитов) споит., у.е. 28,45±1,87* 49,73±0,29
НСТ (моноцитов) стим., у.е. 49,54±4,51* 89,68±0,44
К стим. (моноцитов), у.е. 1,73±0,15 1,79±0,01
ФИ (нейтрофилов) % 43,54±1,2* 79,65±0,69
ФЧ (нейтрофилов) % 4,6±0,12* 10,6±0,22
ФИ (моноцитов) % 25,22±1,68* 70,05±0,92
ФЧ (моноцитов) % 3,1±0,27* 10,01±0,19
Примечание: * - различия показателей новорожденных с РДС на 1-е сутки наблюдения по сравнению со здоровыми статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Мання-Уитни).
Так, снижение показателей стимулированного НСТ-теста свидетельствует о негативном кондиционировании нейтрофилов и моноцитов и их неспособности развить адекватный ответ на антигенную стимуляцию.
Нами были проведены исследования иммунного статуса у 11-ти новорожденных с РДС, основное заболевание которых осложнилось бактериальным сепсисом и закончилось благоприятно с переводом в отделение патологии новорожденных.
Несравненно большую информацию для установления отличительных признаков состояния иммунной системы при РДС документированным сепсисом дали тесты углубленной оценки маркеров врожденного иммунитета. У новорожденных с РДС и документированным сепсисом имело место достоверное снижение экспрессии ТЫ1-2 (С0282+) и СБ14+Ь на моноцитах периферической крови по сравнению со здоровыми новорожденными. При этом уровень экс-
прессии TLR-4 (CD284+) соответствовал возрастной норме. Так, в процессе динамического наблюдения на 3-5 сутки происходило достоверное снижение CD 14++ и достоверное повышение TLR-2 (CD282+) относительно первых суток наблюдения (табл. 18).
Таким образом, при сепсисе у новорожденных с MAC достоверное увеличение экспрессии TLR-2 (CD282+) на моноцитах прослеживается при первоначальных признаках воспаления. Измерение количества CD14+CD282+ моноцитов может служить ранним маркером развития бактериального осложнения.
Не исключено, что такой высокий уровень экспрессии TLR-2 индуцирует выработку цитокинов, вызывает опосредованный цитокинами апоптоз иммуно-компетентных клеток и различные осложнения.
Таблица 18
Показатели врожденного иммунитета у доношенных новорожденных детей с РДС, осложненных бактериальным сепсисом без летального исхода и здоровых новорожденных в динамике наблюдения
Показатель 1-е сутки 3-5-е сутки 20-c сутки (исход заболевании) Здоровые
n=U n=ll n=ll n=38
CD14++ % 64,6±3,47* 51,76±4,47** 61±3,54 89,55±0,45
CD14+CD282+ % 70,57±1,45* 80,62±1,98** 75,79±3,66 78±0,67
CD14+CD282+ ю'/л 0,57±0,27 0,61±0,31 0,51±0,25 0,78±0,03
CD14+CD284+ % 64,52±0,97 67,66±1,17 67,91±1,24 65,05±0,7
CD14+CD284+ io'/л 0,52±0,24 0,52±0,27 0,46±0,21 0,65±0,02
CD3"CD16+56+ % 1,9±1,02* 0,74±0,38** 1,78±0,54 7,44±0,31
CD3CD16+56+ 10% 0,07±0,04* 0,03±0,02** 0,05±0,02 0,25±0,01
CD3+CD16+56+ % 0,56±0,25* 0,37±0,21** 0,42±0,19 2,52±0,06
CD3+CD16+56+io'ta 0,02±0,01* 0,01±0,01 0,01±0,01 0,08±0,002
Примечание: * - различия показателей новорожденных с РДС на 1-е сутки наблюдения по сравнению со здоровыми статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Манна-Уитни). ** - различия показателей новорожденных с РДС на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 3-5-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Внлкоксона). *** - различия показателей новорожденных с РДС на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 20-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Вилкоксона).
У новорожденных с РДС и документированным сепсисом отмечалось достоверно значимое снижение абсолютного и относительного содержания натуральных киллеров - ЫК(СОЗ"СО!б+56+) и Т-ЫК(СОЗ+СО!6+56+) по сравнению с
таковыми в группе здоровых новорожденных (табл. 18). В процессе динамического наблюдения продолжалось достоверное снижение МК(СВЗТХ>16+56+) и Т-ЫК(С03+С016+56+) во все сроки наблюдения.
Резюмируя вышеизложенное можно заключить, что эта особенность эф-фекторного звена иммунного реагирования, по-видимому, свидетельствует о напряжении защитной функции натуральных киллеров на фоне бактериальной инфекции и может лежать в основе сниженной резистентности новорожденных детей к инфекционным агентам.
Анализ относительного количества ПЬА-ОЯ+ на моноцитах периферической крови, отражающих состояние презентации антигена Т-лимфоцитам, выявил достоверное снижение данного параметра у новорожденных с РДС и документированным сепсисом по сравнению со здоровыми новорожденными (65,07±1,51% и 86,07±0,92%). К 3-5 суткам динамического наблюдения наблюдалось достоверное снижение С014+НЬА-011+ по сравнению с первыми сутками (38,78±1,59% и 65,07±1,51%, соответственно) (р<0,05). К 20-м суткам заболевания уровень экспрессии НЬА-ОЯ+ моноцитами периферической крови составил 50,47±2,57%, однако нормализации указанного параметра не происходило.
Таким образом, достоверно сниженная экспрессия С014+НЬА-ВЯ+ на мембранах моноцитов у данной когорты новорожденных с высокой определенностью указывает на фактор риска развития бактериальных осложнений.
Таблица 19
Показатели апоптоза лимфоцитов и моноцитов у доношенных новорожденных детей с РДС, осложненных бактериальным сепсисом без летального исхода и здоровых новорожденных в динамике наблюдения
Показатель 1 -е сутки 3-5-е сутки 20-е сутки (ислод заболевании) Здоровые
п=11 п=11 11=11 п=38
С014+СБ95+ % 27,73±3,07* 49,03±4,73** 32,25±2,33*** 17,5±0,44
С014+С095+107л 0,21±0,09 0,41±0,24** 0,21±0,09 0,18±0,01
С1)3+С095+ % 6,55±1,69* 12,82±2,15** 11,4±2,9*** 2,27±0,18
С03+С095+ Ю'/л 0,22±0Д2* 0,36±0,16 0,35±0,12 0,08±0,01
Аппехт \'+ % (мн) 24,86±3,65* 59,23±6,19** 25,65±3,23 13,24±0,27
Аппехт У+Р1+ % (мн) 2,48±032* 6,87±1,29** 2,51±0,42 0,97±0,06
Аппехт \'+ % (лф) 10,13±2* 20,33±3,29** 14,66±4,85*** 3,87±0,13
АппехтУ+Р1+ % (лф) 0,73±0,33* 2,09±0,69** 1,44±0,76*** 0,15±0,01
Примечание: * - различия показателей новороязденных с РДС на 1-е сутки наблюдения по сравнению со здоровыми статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Манна-Уитни). ** - различия показателей новорожденных с РДС на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 3-5-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Вилкоксона). *** - различия показателей новорожденных с РДС на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 20-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Вилкоксона).
Как показали результаты проведенных нами исследований, у новорожденных с РДС и документированным сепсисом отмечалась чрезмерная гибель
пула клеток (лимфоцитов и моноцитов), а воспалительные процессы у этих новорожденных развивались на фоне интенсивного апоптоза иммунокомпетент-ных клеток (табл. 19).
Таким образом, развившийся сепсис у новорожденных с MAC и РДС имеет однотипные изменения иммунной системы, вне зависимости от того, на каком фоне он развился.
Развитие воспалительного процесса в легких и реализация механизмов защиты легочной ткани от повреждения также во многом определяются функциональной активностью альвеолярных макрофагов.
Макрофаги легкого активно участвуют в формировании специфического иммунитета путем синтеза цитокинов и медиаторов, играющих роль регуляторов иммунного ответа. Известно, что альвеолярные макрофаги играют основную роль в легочной защите и элиминации бактерий из легких.
Нашими исследованиями установлено, что доля альвеолярных макрофагов в БАЛ оказалась достоверно ниже у новорожденных с MAC и РДС относительно здоровых новорожденных (61,81±1,23% и 62,05±0,86% против 81,83±2,51%, соответственно) (р<0,05).
При этом необходимо отметить, что на первые сутки наблюдения достоверных различий между новорожденными с MAC и РДС по содержанию альвеолярных макрофагов не выявлялось. Однако к 3-5 суткам наблюдения происходило заметное снижение содержания альвеолярных макрофагов у новорожденных с MAC и РДС, при этом у новорожденных с MAC верифицировался достоверно более низкий уровень содержания альвеолярных макрофагов (36,18±1,9% и 45,75±1,39%, соответственно) (р<0,05).
Как показали результаты в динамике проведенных нами исследований, у новорожденных с MAC и РДС к 20-м суткам заболевания отмечался незначительный прирост содержания альвеолярных макрофагов, который носил не достоверный характер и не достигал нормативных значений (43,62±1,23% и 53,5±0,88% против 81,83±2,51%, соответственно). К 20-м суткам заболевания у новорожденных с MAC содержание альвеолярных макрофагов было достоверно ниже относительно группы с РДС (43,62±1,23% и 53,5±0,88%, соответственно) (р<0,05).
У новорожденных с MAC и РДС были выражены воспалительные изменения в трахеобронхиальном дереве, что подтверждалось высоким содержанием провоспалительных цитокинов (табл. 20).
Сравнительная характеристика цитокинов в БАЛ выявила, что у доношенных новорожденных с РДС содержание IL-ip в бронхоальвеолярном лава-же, аспирированном после поступления новорожденных в отделение реанимации, оказалось достоверно выше по сравнению с новорожденными с MAC (табл. 20). Небезинтересно, что к 3-5 суткам происходило увеличение продукции этого цитокина у новорожденных с РДС и MAC, однако при этом уровень IL-ip оставался достоверно выше у новорожденных с РДС и коррелировал с высокой концентрацией IL-6 в сыворотке крови (rs=0,47, р=0,04). Следует отметить, что к 20-м суткам заболевания регистрировалось снижение продукции
IL-lp в обеих группах, однако у доношенных новорожденных с РДС уровень IL-ip достоверно отличался от уровня новорожденных с MAC.
Таблица 20
Содержание цитокинов и хемокинов у новорожденных детей с MAC и РДС в броихоальвеолярном лаваже в динамике наблюдения
Показатель ; i
п=16 п=20
1-е сутки 1-е сутки
IL-ip иг/мл 6,54±0,74* 13,02±0,76
IL-6 пг/мл 132,28±9,2* 180,9±7,98
IL-8 пг/мл 271,7±16,42* 334,96±11,51
TNF-a пг/мл 22,76±2,02 22,21±1,75
TGF-P пг/мл 1457,31±253,28* 2031,15±161,89
RANTES пг/мл 273,5±16,78* 123,85±9,32
~ 3-5-е: сутки . :;:-й.(г!"':3-5-ё сутки
IL-ip пг/мл 18,87±1,56** 23±1,25
IL-6 пг/мл 296,09±10,45** 276,16±10,22
IL-8 пг/мл 379,25±19,45** 460,05±15,21
TNF-a пг/мл 37,62±2,27 36,57±1,39
TGF-P пг/мл 2201,87±201,66** 2526,3±156,32
RANTES пг/мл 451,12±35,14** 180,8±9,23
20-е сутки 20-е сутки
IL-ip пг/мл 6,42±0,59*** 15,39±0,88
IL-6 пг/мл 90,15±18,17 79,22±9,84
IL-8 пг/мл 68,56±7,99*** 121,35±11,63
TNF-a пг/мл 14,37±1,05*** 21,06±1,92
TGF-P пг/мл 803,06±77,35*** 587,4±66,79
RANTES пг/мл 668,75±35,15*** 337,95±26,35
Примечание: * - различия показателей новорожденных с MAC на 1-е сутки наблюдения по сравнению с новорожденными с РДС на 1-е сутки наблюдения статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Манна-Уитни).
*' - различия показателей новорожденных с MAC на 3-5-е сутки наблюдения по сравнению с новорожденными с РДС на 3-5-е сутки наблюдения статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Манна-Уитни).
*** - различия показателей новорожденных с MAC на 20-е сутки наблюдения по сравнению с новорожденными с РДС на 20-е сутки наблюдения статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Манна-Уитни).
Продукция IL-6 - мультифакториального протеина, продуцируемого активированными альвеолярными макрофагами, у новорожденных с РДС была достоверно выше по сравнению с новорожденными с MAC на 1-е сутки наблюдения. На 3-5 сутки у новорожденных с РДС и MAC отмечалось увеличение содержания IL-6, причем различия между группами носили достоверный характер. При этом высокий уровень IL-6 у новорожденных с РДС на 3-5-е сутки динамического наблюдения коррелировал с высокой концентрацией IL-8 в сыво-
ротке крови (rs=0,44, р=0,04) и сниженной продукцией хемокина RANTES (rs=0,46, р=0,04). Необходимо отметить, что у новорожденных с MAC высокое содержание IL-6 в БАЛ имело корреляционную зависимость с высокой концентрацией IL-6 в сыворотке крови (rs=0,58, р=0,02) и корреляционную зависимость с низким уровнем RANTES в сыворотке крови (rs=0,5, р=0,02).
Примечательно, что к 20-м суткам заболевания имело место снижение продукции IL-6, как маркера активности воспаления, в обеих группах и достоверных различий между ними не наблюдалось, хотя концентрация данного ци-токина оставалась на высоком уровне у новорожденных с MAC и РДС. В этих группах также отмечена положительная клиническая динамика: дыхательная недостаточность разрешилась, и новорожденные были экстубированы.
Наиболее высокие показатели IL-8 отмечены на 3-5 сутки наблюдения у новорожденных с РДС и MAC. К 20-м суткам заболевания регистрировалось напротив снижение содержания в БАЛ IL-8 в обеих группах, однако у новорожденных с РДС содержание IL-8 было все же достоверно выше относительно группы новорожденных с MAC.
Динамика содержания TNF-a в БАЛ у новорожденных с MAC и РДС была следующей: нами не отмечено достоверных отличий содержания TNF-a в БАЛ у новорожденных с MAC и РДС на момент поступления новорожденных в отделение реанимации. При этом обнаружена корреляционная связь между TNF-a в БАЛ у новорожденных с РДС и TGF-p в сыворотке крови на первые сутки наблюдения (rs=0,47, р=0,03).
На 3-5 сутки динамического наблюдения высокий уровень TNF-a в БАЛ у новорожденных с MAC коррелировал с высоким содержанием IL-6 в сыворотке крови (rs=0,5, р=0,05).
Высокий уровень TGF-p в БАЛ у новорожденных с РДС на первые сутки наблюдения коррелировал с высоким содержанием TNF-a в сыворотке крови (rs=0,46, р=0,04). К 3-5 суткам динамического наблюдения наблюдалось увеличение продукции TGF-p в БАЛ в обеих группах новорожденных. Следует отметить, что к 20-м суткам заболевания уровень TGF-P снижался в обеих группах, оставаясь у новорожденных с MAC достоверно выше относительно группы с РДС.
Нами было установлено, что у новорожденных с РДС имело место достоверное снижение содержания RANTES в БАЛ относительно группы с MAC во все сроки динамического наблюдения. Такое низкое содержание RANTES в БАЛ может свидетельствовать о нарушении физиологического процесса экспансии активированных клонов лимфоцитов в ткани легкого при РДС.
Следует особо подчеркнуть, что у новорожденных с MAC выявлена корреляционная зависимость между содержанием в БАЛ RANTES на первые сутки наблюдения и TNF-a в сыворотке крови (rs=0,52, р=0,04), корреляционная зависимость между содержанием в БАЛ RANTES на 3-5 сутки наблюдения и TNF-a в сыворотке крови (rs=0,55, р=0,03), обратная корреляционная зависимость между содержанием в БАЛ RANTES на 3-5 сутки наблюдения и TGF-p в сыворотке крови (г,= -0,52, р=0,02).
Таким образом, резюмируя представленные результаты исследования, необходимо заключить, что при аспирации ферменты, соли желчных кислот и жиров в меконии новорожденных являются индуктором серьёзного химического воспаления лёгких, которое сопровождается повышением продукции IL-ip, IL-6, IL-8, TNF-a, RANTES и снижением количества альвеолярных макрофагов. Полученные нами данные согласуются с работами СауаЬуаЬ R.G. et а1., (2007) и Okazaki К et al., (2008), которые утверждают, что меконий вызывает химическую пневмонию сходную с бактериальной.
Оценка продукции цитокинов в БАЛ у новорожденных с MAC и РДС выявила различные варианты цитокиновой регуляции.
Выявленные нарушения свидетельствуют в большей степени о важной роли провоспалительных цитокинов и хемокинов в патогенезе дыхательных расстройств у новорожденных, обусловленных мекониальной аспирацией и респираторным дистресс-синдромом.
Используя полученные данные, можно контролировать степень выраженности и течение воспалительного процесса в легких.
Для клинического использования нами предложены новые способы и разработаны алгоритмы прогнозирования развития и исхода септических осложнений у новорожденных с MAC и РДС (рис. 1 и рис. 2).
Сложность патогенеза, глубина иммунных повреждений указывают на невозможность быстрого восстановления нарушенных функций иммунной системы.
На основании изложенного выше материала можно сделать вывод, что расшифровка тонких механизмов патогенеза повреждений иммунной системы у новорожденных с респираторными нарушениями открывает перспективу разработки новых методов профилактики бактериальных осложнений.
Новорожденные с респираторными нарушениями
Измерение уровня экспрессии С014+Ни-0К+, AnnexlnV+ на моноцитах, С014+СР282+
Периферическая кровь
С014+НЬА-0К+ СиЮ» ве Эр
42,3% 85,7% 82%
АппехтЛ/+ на моноцитах 17,4% 90,9% 89,55%
СШ4+С0282+ 80,6% 84,3% 81,7%
Сочетание тестов
Снижение уровня или стабильно низкий уровень
Повышение уровня показателей или стабильно высокий уровень
т
Высокий риск развития септических осложнений
Схема 1. Алгоритм раннего прогнозирования септических осложнений у новорожденных с респираторными нарушениями.
Новорожденные с респираторными нарушениями
Измерение уровня экспрессии С014+Н1_А-0Н+, Аппех1п\/+ на моноцитах, уровня СМ-СБР, ЛАИТЕБ ,|Ир
Ж
Периферическая кровь, сыворотка крови
Ж.
СигО« Бе Эр
С014+Н1.А-01г+ .19,26°/« 84,7%
БМ-СвР 0,001 пг/мл 91,4% 90,3%
НАНТЕЭ 1728,6 пг/мп! 88,4% 91,3%
1ир 0,08 пг/мл 87,4%
Аппех1п\/+ на моноцитах 35,5% 89,9% 89,4%
Снижение уровня показателей
или их стабильно низкий уровень
Повышение уровня или стабильно высокий уровень
УЫ В/
Высокий риск летального исхода
Схема 2. Алгоритм прогнозирования исхода септических осложнений у новорожденных с респираторными нарушениями.
ВЫВОДЫ:
1. Выявлены патогенетически значимые изменения в иммунном статусе у новорожденных с респираторными расстройствами, обусловленными MAC и РДС, проявляющиеся иммуносупрессией клеточного и гуморального звеньев иммунной системы (снижение количества CD3+CD19", CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD3'CD19+, концентрации IgG) с одновременным угнетением цитотоксических реакций, маркируемых CD3"CD16+56+ и CD3+CD16+56+, наиболее выраженные у новорожденных с MAC.
2. Реакция адаптивного иммунитета в образцах крови новорожденных с респираторными нарушениями характеризуется усилением экспрессии маркеров активации CD25+, CD69+, CD71+, CD-HLA-DR+, CD95+ в общей популяции лимфоцитов и моноцитов и снижением экспрессии CD4+CD25+ и CD16+CD25+, а также усилением процессов раннего (Annexin V+) и позднего апоптоза (Ап-nexin V+PI+) лимфоцитов и моноцитов периферической крови, наиболее выраженная в образцах крови новорожденных с MAC.
3. При респираторных нарушениях, обусловленных MAC и РДС, выявлены высокие уровни IL-ip, IL-6, IL-8, TNF-a в сыворотке крови и бронхоаль-веолярном лаваже, при сниженном уровне NO и разнонаправленное содержание IFN-y и IFN-a.
4. В периферической крови новорожденных с респираторными нарушениями выявлены низкие уровни хемокина RANTES и GM-CSF наряду со снижением экспрессии CD14+\ TLR-2 (CD14+CD282+) и TLR-4 (CD14+CD284+).
5. Неэффективный хемотаксис и фагоцитоз в крови новорожденных с респираторными нарушениями верифицировался снижением CD14+CDllb+, CD14+CD11с+, CD14+CD54+, а также CD14+CD64+ и CD14+CD35+ и сочетался со снижением кислородзависимого механизма микробицидности.
6. Выявлено снижение содержания CD14+HLA-DR+ в периферической крови, что является одним из прогностических критериев неблагоприятной динамики респираторных нарушений у новорожденных, как с MAC, так и РДС.
7. Установлено, что на фоне низкого уровня IgG, сниженной экспрессии CD 14+HLA-DR+, CD14++, CD14+CD282+, CD14+CD284+, повышенной экспрессии CD3+CD95+, CD14+CD95+, усиленной экспрессии Annexin V+ и Annexin V+PI+ на лимфоцитах и моноцитах периферической крови верифицируется высокий риск развития септических осложнений у новорожденных с респираторными нарушениями, обусловленными MAC и РДС.
8. У новорожденных с респираторными нарушениями, обусловленными MAC и РДС, на фоне выраженных воспалительных изменений в трахеобронхи-альном дереве, имело место высокое содержание провоспалительных цитоки-нов с тенденцией снижения альвеолярных макрофагов, наиболее выраженные у новорожденных с MAC.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:
1. Для прогноза септических осложнений у новорожденных с респираторными нарушениями рекомендуется определять содержание CD14+HLA-DR+, уровень экспрессии Annexin V+ моноцитами периферической крови на 1-е сутки поступления новорожденного в отделение реанимации. Количество CD14+HLA-DR+ равное 42,3% или менее позволяет диагностировать у новорожденных с респираторными нарушениями септическое осложнение с чувствительностью 85,7% и специфичностью 82%. Уровень экспрессии Annexin V+ на моноцитах равный 17,4% или более позволяет диагностировать у новорожденных с респираторными нарушениями осложнение сепсисом с чувствительностью 90,91% и специфичностью 89,55%.
2. Предиктором неблагоприятного исхода при сепсисе является снижение экспрессии CD14+HLA-DR+ менее 19,26%, снижение содержания GM-CSF в сыворотке крови менее 0,001 пг/мл, снижение содержания IL-ip менее 0,08 пг/мл, снижение содержания RANTES менее 1728,6 пг/мл и повышении экспрессии Annexin V+ на моноцитах более 35,5%.
3. Для прогноза неблагоприятной динамики респираторных нарушений к исходу заболевания новорожденного рекомендуется определять уровень экспрессии Annexin V+ лимфоцитами и моноцитами периферической крови. Уровень экспрессии Annexin V+ на моноцитах 50,57% или более и уровень экспрессии Annexin V+ на лимфоцитах 29,27% или более в периферической крови доношенных новорожденных позволяет прогнозировать неблагоприятную динамику.
4. Используя динамику содержания IL-ip, IL-6, IL-8 в БАЛ, можно контролировать течение воспалительного процесса в легких на 1 -е сутки наблюдения с точностью - 91,67%, чувствительностью - 95,00%, специфичностью -87,50%;
с MAC- IL-ip- 6,54±0,74 пг/мл, IL-6- 132,28±9,2 пг/мл, IL-8- 271,7±16,42 пг/мл; с РДС- IL-ip- 13,02±0,76 пг/мл, IL-6- 180,9±7,98 пг/мл, IL-8-334,96±l 1,51 пг/мл;
на 3-5-е сутки наблюдения с точностью - 89,47%, чувствительностью -90,00%, специфичностью - 88,89%;
с MAC- IL-ip- 18,87±1,56 пг/мл, IL-6- 296,09±10,45 пг/мл, IL-8-379,25± 19,45 пг/мл; с РДС- IL-ip- 23±1,25 пг/мл, IL-6- 276,16±10,22 пг/мл, IL-8-460,05±15,21 пг/мл;
на 20-е сутки наблюдения с точностью - 89,47%, чувствительностью -95,00%, специфичностью — 83,33%;
с MAC- IL-lp- 6,42±0,59 пг/мл, IL-6- 90,15±18,17 пг/мл, IL-8- 68,56±7,99 пг/мл; с РДС- IL-ip- 15,39±0,88 пг/мл, IL-6- 79,22±9,84 пг/мл, IL-8-121,35±ll,63 пг/мл.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:
1. Орлов В.И., Ефанова Е.А., Левкович М.А., Дударева М.В., Рыжков С.В. Экспрессия активациоиных молекул на лимфоцитах крови новорожденных от матерей с неблагоприятным течением беременности // Всероссийская междисциплинарная научно-практическая конференция «Внутриутробные инфекции плода и новорожденного». - Саратов, 29-31 мая 2000. - С. 116-117.
2. Левкович М.А., Логинова И.Г., Лазарева Т.Н., Дударева М.В. Изменение содержания эмбриотропных антител в прогнозе поражения нервной системы плода // Актуальные проблемы здоровья семьи, общественного здоровья и здравоохранения. Иваново, 2001. С. 243-244.
3. Ефанова Е.А., Левкович М.А., Дударева М.В. Особенности активации лимфоцитов новорожденных от матерей с неблагоприятным течением беременности // 4-й Конгресс Российской Ассоциации Аллергологов и Клинических Иммунологов (РААКИ) «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии». - Москва, 29-31 мая 2001,- Т. 2. - С.59.
4. Дударева М.В. Роль оксида азота в регуляции гемодинамики новорожденных, перенесших гипоксию // Известия высших учебных заведений. Северо-Кавказский регион. Естественные науки. -2006. - №2. - С.116-119.
5. Дударева М.В. Современные представления об мононуклеарных фагоцитах // Известия высших учебных заведений. Северо-Кавказский регион. Естественные науки. -2006. - №3. - С. 23-25.
6. Дударева М.В., Левкович М.А. Современные лабораторные технологии в пери- и неонатологии // Актуальные проблемы педиатрии: материалы XI конгресса педиатров России.- 2007.- С. 220.
7. Дударева М.В., Левкович М.А. Роль проточной цитометрии при изучении поверхностных антигенов клеток крови у новорожденных в критических состояниях. // Мать и Дитя: материалы IX Всероссийского научного форума 2007. - С.599.
8. Дударева М.В. Сепсис - современная проблема клинической медицины // Российский аллергологический журнал. 2008. - №1. - С. 99 — 101.
9. Дударева М.В., Эстрин В.В., Левкович М.А. Функциональная активность моноцитов у новорожденных с синдромом дыхательный расстройств // Аллергология и иммунология. -2008.- Т. 9, №1. - С. 143.
10. Дударева М.В., Эстрин В.В. Состояние иммунитета у новорожденных детей с респираторной патологией // Аллергология и иммунология. -2008. — Т. 9, №3. - С. 349-350.
11. Эстрин В.В., Дударева М.В. Диагностика бактериальной инфекции у новорожденных // I Всероссийский конгресс «Анестезия и реанимация в акушерстве и неонатологии». - Москва, 2-5 декабря 2008. - С. 48-49.
12. Дударева М.В. Сравнительная оценка цитокинового баланса крови у новорожденных с дыхательными расстройствами // Аллергология и иммунология.-2009. - Т. 10, №1,-С. 51.
13. Дударева М.В., Эстрин В.В. Особенности субпопуляционной архитектоники периферической крови новорожденных с синдромом дыхательных расстройств //Аллергология и иммунология. -2009. - Т.10, №2. - С. 277.
14. Дударева М.В. Анализ цитокинового баланса крови у доношенных новорожденных с дыхательными расстройствами // Российский аллергологиче-ский журнал. - 2009. - №3, выпуск 1. - С. 48.
15. Дударева М.В., Эстрин В.В., Пухтинская М.Г., Лелик М.П. Экспрессия НЬА-БЯ на моноцитах у новорожденных с синдромом дыхательных расстройств // XVI съезд педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии». Москва, 16-19 февраля 2009.-С. 126- 127.
16. Дударева М.В. Иммунный статус новорожденных детей с дыхательными расстройствами // Вопросы практической педиатрии. - 2009. - Т.4, прил. №1. — С.18.
17. Дударева М.В. Прогностическое значение маркеров апоптоза у новорожденных с дыхательными расстройствами // Международный журнал по им-мунореабилитации. - 2009. -Т.11, №1. - С.118.
18. Дударева М.В. Особенности активации моноцитов периферической крови у новорожденных с дыхательными расстройствами // Мать и Дитя: материалы X юбилейного Всероссийского Научного Форума. - Москва, 29 сентября^ октября 2009. - С.458-459.
19. Дударева М.В. Изменения цитокинового статуса и экспрессии НЬА-011 антигенов на моноцитах у детей с дыхательными расстройствами // Пятый Российский конгресс «Педиатрическая анестезиология и интенсивная терапия».
- Москва, 19-22 октября 2009. - С. 103 - 104.
20. Пухтинская М.Г., Эстрин В.В., Дударева М.В. Диагностика и профилактика инфекционных осложнений у новорожденных с респираторным дистресс-синдромом, находящихся на искусственной вентиляции легких // Пятый Российский конгресс «Педиатрическая анестезиология и интенсивная терапия».
- Москва, 19-22 октября 2009. - С. 173 - 174.
21. Дударева М.В., Эстрин В.В. Особенности цитокинового баланса крови у новорожденных с дыхательными расстройствами // V Научная сессия Ростовского государственного медицинского университета, посвященная 95-летию высшего медицинского образования на Дону и 80-летию РостГМУ, Том 1.-2010.-С. 294-296.
22. Дударева М.В., Эстрин В.В. Диагностическая роль системы цитоки-нов у новорожденных с дыхательными расстройствами // Российский аллерго-логический журнал. - 2010. - №1, вып.1. - С.63-64.
23. Дударева М.В. Маркеры активации и апоптоз иммунокомпетентных клеток у новорожденных с синдромом дыхательных расстройств // Международный журнал по иммунореабилитации. - 2010. - Т.12. - №2. - С.198.
24. Дударева М.В., Эстрин В.В., Пухтинская М.Г. Особенности иммунного ответа у новорожденных с дыхательными расстройствами и перинатальным поражением ЦНС // IV Региональный научный форум «Мать и дитя». 2010. -С. 106.
25. Дударева М.В., Эстрин В.В. Состояние цитокинового баланса крови у новорожденных с дыхательными расстройствами // Цитокины и воспаление. 2010. -Т.9, № 4 . - С. 79-81.
26. Дударева М.В. Некоторые показатели иммунитета у новорожденных с дыхательными расстройствами // Российский аллергологический журнал. -2010. - №5 , вып. 1 . - С.105-106.
27. Дударева М.В. Анализ секреции цитокинов и хемокинов при меко-ниальной аспирации у новорожденных // Вопросы практической педиатрии. -
2010.-Том 5. прил. № 1. - С. 20.
28. Дударева М.В. Экспрессия СВ14+СБ16+ и СО]4+НЬА-ОЯ+ моноцитов у новорожденных с респираторным дистресс-синдромом // Вопросы практической педиатрии. - 2010.- Том 5. прил. № 1. - С. 21.
29. Дударева М.В. Апоптоз моноцитов у новорожденных с мекониаль-ной аспирацией // Вопросы практической педиатрии.- 2010. - Том 5. прил. № 1. -С. 21.
30. Пухтинская М.Г., Дударева М.В., Эстрин В.В. Диагностическое значение факторов апоптоза в развитии бактериальных осложнений у новорожденных с мекониальной аспирацией // XV Конгресс педиатров России с международным участием "Актуальные проблемы педиатрии". Москва, 14-17 февраля
2011.-С. 712.
31. Дударева М.В. Экспрессия СОЗ"СБ(16+56)+ (ЫК) , СОЗ+СБ(16+56)+ (Т-МК), СБЗ"С08+ и СВ14+НЬА-ВЯ+у новорожденных с мекониальной аспирацией // Аллергология и иммунология. - 2011. - Т. 12., №. 1- С. 136 .
32. Дударева М.В., Эстрин В.В. Экспрессия функциональных молекул у новорожденных в критических состояниях // I Международный Конгресс по перинатальной медицине, посвященный 85-летию академика РАМН В.А. Та-болина и VI Ежегодного Конгресса специалистов перинатальной медицины. Москва, 16-18 июня 2011 г. - С. 78-79.
33. Дударева М.В., Эстрин В.В., Пухтинская М.Г., Лелик М.П., Кравченко Л.В. Фагоцитарная активность моноцитов у новорожденных с синдромом дыхательных расстройств // I Международный Конгресс по перинатальной медицине, посвященный 85-летию академика РАМН В.А. Таболина и VI Ежегодного Конгресса специалистов перинатальной медицины. Москва, 16-18 июня 2011 г.-С. 79.
34. Дударева М.В., Пухтинская М.Г. Состояние врожденного иммунитета у новорожденных с дыхательными расстройствами // Российский аллергологический журнал. -2011. - №4 , вып. 1 . - С. 117-118.
35. Дударева М.В., Пухтинская М.Г. Ранняя активация лимфоцитов и моноцитов периферической крови у новорожденных с дыхательными расстройствами // Российский аллергологический журнал. - 2011.- №4. - С. 118-120.
36. Дударева М.В., Пухтинская М.Г. Экспрессия СБ14+С016+ у новорожденных с синдромом мекониальной аспирации // Российский аллергологический журнал. - 2011. - №4. - С. 120-122.
37. Пухтинская М.Г., Дударева M.B. Иммунологические аспекты развития нейтропении у новорожденных с респираторной патологией // Российский аллергологическийжурнал.-2011. -№4 , вып. 1.-С. 301-302.
38. Пухтинская М.Г., Дударева М.В. Клинико-диагностическое значение апоптоза лимфоцитов у новорожденных с респираторной патологией // Российский аллергологический журнал.-2011. - №4 , вып. 1. - С. 303-304.
39. Пухтинская М.Г., Дударева М.В. Клиническое значение коррекции апоптоза лимфоцитов человеческим рекомбинантным гранулоцитарным коло-ниестимулирующим фактором у новорожденных в критических состояниях // Российский аллергологический журнал. -2011. -№4 , вып. 1. - С. 305-306.
40. Дударева М.В. Патогенетическая значимость CD3+CD95+, CD14+CD95+, AnnexinV+, AnnexinV^PT у доношенных новорожденных с респираторным дистресс-синдромом // Аллергология и иммунология. - 2011. -Т.12 . - №.3 - С. 312-313.
41. Кравченко JI.B., Афонин A.A., Дударева М.В. Иммунологические механизмы формирования цитомегаловирусной инфекции у детей раннего возраста // Инфектология. Том 3. - №3. - 2011. - С. 62.
42. Dudareva М., Estrín V.V., Pukhtínskaya M.G., Lelik М.Р. The expression of HLA-DR at newborns monocytes with septic complications // The international Sepsis Forum "Sepsis 2011 Beijing". - China, Beijing, 2011 - Abst. S26.
43. Дударева M.B., Пухтинская М.Г., Эстрин B.B., Лелик М.П. Особенности состояния врожденного иммунитета у новорожденных с респираторными нарушениями // IV Всероссийский образовательный конгресс "Анестезия и реанимация в акушерстве и неонатологии". Москва, 22-25 ноября 2011 г. - С. 140142.
44. Дударева М.В., Пухтинская М.Г., Эстрин В.В., Лелик М.П. Особенности активации лимфоцитов и моноцитов периферической крови у новорожденных с респираторными нарушениями и гипоксическими повреждениями ЦНС // IV Всероссийский образовательный конгресс "Анестезия и реанимация в акушерстве и неонатологии". Москва, 22-25 ноября 2011 г. — С. 142-144.
45. Дударева М.В., Пухтинская М.Г., Эстрин В.В., Лелик М.П. Особенности экспрессии CD14+CD16+ у новорожденных с респираторными нарушениями IV Всероссийский образовательный конгресс "Анестезия и реанимация в акушерстве и неонатологии". Москва, 22-25 ноября 2011 г. - С. 145-146.
46. Пухтинская М.Г., Дударева М.В., Эстрин В.В., Гулова Е.С. Коррекция апоптоза лимфоцитов человеческим рекомбинантным гранулоцитарным колониестимулирующим фактором в профилактике сепсиса у новорожденных в критических состояниях // IV Всероссийский образовательный конгресс "Анестезия и реанимация в акушерстве и неонатологии". Москва, 22-25 ноября 2011 г.-С. 185-187.
47. Эстрин В.В., Пухтинская М.Г., Дударева М.В., Лелик М.П. Коррекция иммунных нарушений ингаляционным оксидом азота у новорожденных с респираторным дистресс-синдромом, находящихся на искусственной вентиляции легких // IV Всероссийский образовательный конгресс "Анестезия и ре-
анимация в акушерстве и неонатологии". Москва, 22-25 ноября 2011 г. - С. 207209.
48. Ефанова Е.А., Яковенко Е.П., Эстрин В.В., Пухтинская М.Г., Дуда-рева М.В., Поляк С.Ш. Способ прогнозирования исхода бактериальной инфекции у новорожденных детей // Патент на изобретение №2246729 от 20.02.2005.
49. Ефанова Е.А., Эстрин В.В., Пухтинская М.Г., Дударева М.В. Способ прогнозирования исхода респираторного дистресс-синдрома у новорожденных в критическом состоянии // Патент на изобретение № 2318445 от 10.03.2008.
50. Дударева М.В., Лелик М.П., Пухтинская М.Г. Способ ранней диагностики развития неонатального сепсиса у новорожденных с синдромом дыхательных расстройств и гипоксическим поражением ЦНС // Патент на изобретение №2374646 от 27.11.2009.
51. Дударева М.В., Эстрин В.В., Пухтинская М.Г., Лелик М.П. Способ раннего прогнозирования септических осложнений у новорожденных с респираторной патологией // Патент на изобретение №2414706 от 20.03.2011.
52. Пухтинская М.Г., Эстрин В.В., Дударева М.В., Гулова Е.С. Способ терапии респираторного дистресс-синдрома у новорожденных, находящихся на искусственной вентиляции легких // Патент на изобретение № 2434653 от 27.11.2011.
53. Дударева М.В., Пухтинская М.Г., Эстрин В.В. Способ ранней диагностики развития неонатального сепсиса у новорожденных с синдромом дыхательных расстройств и гипоксическим поражением ЦНС: Медицинская технология . - Ростов-на-Дону, 2010. - 10 с.
54. Пухтинская М.Г., Дударева М.В., Эстрин В.В., Гулова Е.С. Прогнозирование исхода респираторного дистресс-синдрома у новорожденных в критических состояниях: Медицинская технология. - Ростов-на-Дону, 2011. - 11 с.
55. Дударева М.В., Сизякина Л.П. Функциональная активность цитоток-сических лимфоцитов у доношенных новорожденных с респираторным дистресс-синдромом // Цитокины и воспаление. 2011. - Т.10, № 4 . - С. 101-104.
56. Дударева М.В., Пухтинская М.Г. Иммунофенотипическая и субпопу-ляционная характеристика моноцитов периферической крови у новорожденных с дыхательными расстройствами // Российский аллергологический журнал. — 2012. -№1.- С. 105-107.
57. Дударева М.В., Пухтинская М.Г. Нарушения местного иммунитета у новорожденных с дыхательными расстройствами // Российский аллергологический журнал.-2012. - №1. - С. 110-112.
58. Дударева М.В., Пухтинская М.Г. Особенности нарушений иммунной системы у доношенных новорожденных с респираторным дистресс-синдромом // Российский аллергологический журнал. - 2012. - №1. — С. 112-114.
59. Дударева М.В., Сизякина Л.П., Дударев И.В. Оценка экспрессии ТОЬЬ-подобных рецепторов у новорожденных с неонатальным сепсисом // Российский аллергологический журнал. — 2012. - №1. - С. 119-121.
60. Дударева М.В., Сизякина Л.П., Дударев И.В. Роль медиаторов воспаления у доношенных новорожденных с дыхательными расстройствами, находящихся на искусственной вентиляции легких // Цитокины и воспаление. -2012. - Т.11,- № 1 . - С. 77-79.
61. Дударева М.В., Эстрин В.В., Дударев И.В., Сизякина Л.П. Клинико-диагностическое значение апоптоза в патогенезе бактериальных осложнений у новорожденных с дыхательными расстройствами, находящихся на искусственной вентиляции легких // Российский аллергологический журнал. - 2012. -№1. - С. 123-125.
62. Дударева М.В., Сизякина Л.П. Особенности врожденного иммунитета у новорожденных с дыхательными расстройствами, находящихся на искусственной вентиляции легких // Иммунология. - 2012. - №3.- Том 33. - С.142-144.
63. Дударева М.В., Сизякина Л.П. Клиническое значение определения медиаторов воспаления у доношенных новорожденных с дыхательными расстройствами, находящихся на искусственной вентиляции легких // Российский иммунологический журнал. -2012. - №2 (1).- Том 6(14).- С.56-58.
64. Дударева М.В., Сизякина Л.П., Дударев И.В. Роль молекул адгезии у доношенных новорожденных с респираторным дистресс-синдромом // Российский аллергологический журнал. -2012. - №3. - С.79-81.
65. Дударева М.В., Эстрин В.В. МКТ-лимфоциты: клинико-диагностическое значение при респираторном дистресс-синдроме у доношенных новорожденных детей // Мать и Дитя: материалы VI Регионального Научного Форума. - Ростов-на-Дону, 26-28 июня 2012.- С.189-191.
66. Дударева М.В., Эстрин В.В., Пухтинская М.Г. Динамика провоспа-лительных и противовоспалительных цитокинов у доношенных новорожденных с респираторным дистресс-синдромом // Мать и Дитя: материалы VI Регионального Научного Форума. - Ростов-на-Дону, 26-28 июня 2012,- С.191-192.
67. Пухтинская М.Г., Дударева М.В. Диагностика и профилактика бактериальных осложнений у новорожденных с респираторной патологией, находящихся на искусственной вентиляции легких // Мать и Дитя: материалы VI Регионального Научного Форума. - Ростов-на-Дону, 26-28 июня 2012,- С.212-213.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СО Кластеры дифференцировки
Интерлейкин
тт-а Фактор некроза опухоли а
Интерферон у
твг-р Трансформирующий фактор роста р
СМ-СвР Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий
фактор
ТЬК Толл-подобные рецепторы
МАС Мекониально-аспирационным синдром
РДС Респираторный-дистресс синдром
АРО Анестезиолого-реанимационное отделение
ТЪ Т- хелперы
1ЧК Натуральные киллеры
Ч Иммуноглобулины
ивл Искусственная вентиляция легких
АГ Антиген
БАЛ Бронхоальвеолярный лаваж
СН Сепсис новорожденных
еттс Изотиоцианат флуоресцеина
РЕ Фикоэритрин
ИФА Иммуноферментный анализ
АМ Альвеолярный макрофаг
ОАК Общий анализ крови
N0 Оксид азота
СВРО Системная воспалительная реакция организма
ИКК Иммунокомпетентные клетки
Печать цифровая. Бумага офсетная. Гарнитура «Тайме». Формат 60x84/16. Объем 1,0 уч.-изд.-л. Заказ № 2884. Тираж 100 экз. Отпечатано в КМЦ «КОПИЦЕНТР» 344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Суворова, 19, тел. 247-34-88
Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Дударева, Мария Васильевна, Москва
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «РОСТОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ
АКУШЕРСТВА И ПЕДИАТРИИ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО
РАЗВИТИЯ
05 201350 430 На правахрукописи
ДУДАРЕВА МАРИЯ ВАСИЛЬЕВНА
ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ИММУННОЙ ДИСФУНКЦИИ У НОВОРОЖДЕННЫХ С РЕСПИРАТОРНЫМИ НАРУШЕНИЯМИ
«03.03.03 - иммунология»
ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук
Научный консультант: д.м.н., профессор Л.П.Сизякина
г. Ростов-на-Дону 2012
ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ............................................................................................. 2
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ........................................................................ 4
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.............................................. 5
ГЛАВА I. Современные представления об иммунопатогенезе респираторной патологии у новорожденных детей (обзор литературы)........................................................................ 16
1.1. Респираторная патология в структуре детской заболеваемости и смертности.................................................... 16
1.2. Особенности иммунной системы новорожденных и ее постнатальная адаптация........................................................... 21
1.3. Особенности становления моноцитарно-макрофагальной
системы................................................................................. 40
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.............. 51
2.1. Общая характеристика обследованных больных................. 51
2.2. Методы исследования.................................................. 58
2.3 Математические методы анализа данных и статистическая
обработка результатов............................................................... 64
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
Иммунологическая характеристика новорожденных детей с
синдромом мекониальной аспирации........................................... 66
ГЛАВА IV. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
Иммунологическая характеристика доношенных новорожденных ^ детей с респираторным дистресс-синдромом........................................
ГЛАВА V. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
Сравнительная иммунологическая характеристика доношенных новорожденных детей с синдромом мекониальной аспирации и
респираторным дистресс-синдромом..................................................... 210
ЗАКЛЮЧЕНИЕ........................................................................................... 256
ВЫВОДЫ...................................................................................................... 275
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.................................................. 277
УКАЗАТЕЛЬ ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................. 279
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СБ Кластеры дифференцировки
ІЬ Интерлейкин
ТОТ-а Фактор некроза опухоли а
Интерферон у
тєр-р Трансформирующий фактор роста Р
СМ-С8Р Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий
фактор
ТЫ1 Толл-рецепторы
МАС Мекониально-аспирационным синдром
РДС Респираторный-дистресс синдром
АРО Анестезиолого-реанимационное отделение
тъ Т- хелперы
NK Натуральные киллеры
Иммуноглобулины
ФПН Фетоплацентарная недостаточность
ивл Искусственная вентиляция легких
АГ Антиген
БАЛ Бронхоальвеолярный лаваж
СИ Сепсис новорожденных
РІТС Изотиоцианат флуоресцеина
РЕ Фикоэритрин
ИФА Иммуноферментный анализ
АМ Альвеолярный макрофаг
ОАК Общий анализ крови
N0 Оксид азота
СВРО Системная воспалительная реакция организма
ИКК Иммунокомпетентные клетки
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Иммунная система является одной из трех интегративных систем организма, которая вместе с нервной и эндокринной системами обеспечивает поддержание гомеостаза в условиях постоянного изменения характера влияний факторов внешней и внутренней среды. Благодаря фундаментальным исследованиям отечественных и зарубежных иммунологов были получены убедительные данные о роли иммунной системы в изменении иммунного статуса у новорожденных с респираторными нарушениями.
Синдром дыхательных расстройств является одной из основных причин заболеваемости и смертности как недоношенных, так и доношенных новорожденных не только в нашей стране, но и за рубежом (Дементьева Г.М. и соавт., 2001, 2002; Рюмина И.И., 2002; Байбарина E.H. и соавт., 2006; Сидельникова В.М. и соавт., 2006; Володин H.H., 2006, 2007; William D. Fraser et al., 2005; Carrie К. et al., 2008).
Наиболее частыми причинами развития критических состояний у доношенных новорожденных являются респираторный дистресс-синдром и синдром мекониальной аспирации. Респираторные состояния в перинатальном периоде в России являются причиной смерти в 16,9% случаев. На сегодняшний день нет никаких оснований полагать, что частота этой патологии будет уменьшаться. Это объясняется увеличением удельного веса патологически протекающих родов (Дементьева Г.М., Рюмина И.И., Кушнарева М.В., 2001; Серов В.Н. и соавт., 2002).
В течение нескольких десятилетий изучению данной патологии уделяется большое внимание (Гребенников В.А. и соавт., 1995; Шаламов В.Ю, 2000; Антонов А.Г., Володин H.H., Гребенников В.А. и соавт., 2002; Перепелица С.А., Голубев A.M., Мороз В.В., 2007; Avery М.Е. et al., 1991; Carbine D.N., 2008).
Частота развития инфекционных осложнений при неотложных состояниях у новорожденных с дыхательными расстройствами остается одной из самых актуальных проблем современной медицины в силу неуклонной тенденции к росту заболеваемости и стабильно высокой летальности и составляет 30-50%, занимая одно из ведущих мест в структуре детской смертности (Вермель А.Е., 2003; Володин И.И., Антонов А.Г., Байбарина Е.Н., 2003; Самсыгина Г.А., 2003; Антонов А.Г., Байбарина Е.Н., Соколовская Ю.В., 2005; Мархулия Х.М. и соавт., 2005; Баранов А.А., 2007; Володин Н.Н. и соавт., 2007; Яцык Г.В., 2007; Голубев A.M. и соавт., 2008; Khemani Е. et al., 2007; Olaciregui I. et al., 2009; Ramirez K. et al., 2010).
В настоящее время ведутся интенсивные поиски универсальных клинико-лабораторных маркеров присоединения бактериальных инфекций у новорожденных с респираторными нарушениями, находящихся на искусственной вентиляции легких (Эстрин В.В. и соавт., 2006, 2007; Бирюкова Т.В. и соавт., 2007; Дегтярева М.В., 2008). Вместе с тем, иммунопатологические механизмы, определяющие исход и клиническое течение заболевания, развитие бактериальных осложнений у новорожденных, получающих респираторную поддержку, остаются мало изученными.
Анализируя в целом характер изменений иммунологических показателей при дыхательных расстройствах у новорожденных, находившихся на ИВЛ, следует отметить, что большинство научных исследований относится к оценке адаптивного иммунитета, тогда как данные о функционировании врожденного иммунитета практически отсутствуют. Между тем именно состояние иммунокомпетентных клеток, обеспечивающих врожденный иммунитет, является основополагающим фактором защиты от присоединения бактериальных осложнений и формирования иммунной дисфункции.
У новорожденных с респираторной патологией реперфузионные процессы, связанные с респираторной поддержкой, приводят к апоптозу тканей и стимуляции клеток иммунной системы, выходу больших количеств провоспалительных цитокинов и медиаторов воспаления, которые в свою очередь являются мощными апоптогенными факторами и, одновременно факторами способными генерировать свободнорадикальные реакции, индуцирующие апоптоз (Белобородова Н.В., Бачинская Е.Н, 2000). Таким процессам в большей степени подвержены клетки иммунной системы, что приводит к глубокому иммунодефицитному состоянию новорожденного и высокому риску присоединения нозокомиальной инфекции, появлению тяжелых гнойно-септических осложнений. Вместе с тем, эти иммунопатологические механизмы у новорожденных с респираторной патологией остаются практически не изученными. Детальное исследование механизмов клеточной альтерации иммунокомпетентных клеток у новорожденных открывает новые подходы к профилактированию инфекционных осложнений.
Кроме того, все еще недостаточно освещены вопросы динамики восстановления функциональной активности адаптивного и врожденного иммунитета у доношенных новорожденных с дыхательными расстройствами.
Согласно современным представлениям нарушения иммунной системы лежат в основе патогенеза респираторных нарушений. Однако конкретные патогенетические механизмы иммунных нарушений, способствующих манифестации и прогрессированию бактериальных осложнений при дыхательных расстройствах у новорожденных детей, на сегодняшний день не исследованы.
Учитывая вышеизложенное, приоритетным направлением является изучение патогенеза респираторных нарушений с позиций определения роли врожденного и адаптивного иммунитета, а также особенностей взаимодействия между ними, разработка ранней диагностики нарушений
иммунологической адаптации и бактериальных осложнений у новорожденных с респираторной патологией. Полученные данные позволят расширить существующие представления об иммунных процессах, которые имеют не только теоретическое, но и отчетливое прикладное значение.
Таким образом, необходимость изучения и решения вышеуказанных проблем, обеспечивают актуальность настоящей темы, приоритетность ее целей и задач.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ
Выявить патогенетические механизмы повреждения иммунной системы у новорожденных с респираторными нарушениями и разработать ранние критерии диагностики, прогноза течения и возникновения бактериальных осложнений при респираторных нарушениях.
ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Исследовать уровень экспрессии маркеров позитивной активации СБ25+, СБ69+, СТ>1\+, НЬАБЯ+ клеток иммунной системы у новорожденных детей с респираторными нарушениями, обусловленными мекониальной аспирацией и респираторным дистресс-синдромом.
2. Оценить влияние негативной активации клеток иммунной системы (экспрессия С095+, АппехтУ+, АппехтУ+Р1+) на клиническое течение заболевания и развитие бактериальных осложнений у новорожденных с респираторными нарушениями.
3. Изучить эффекторные функции иммунной системы, включая секрецию основных провоспалительных цитокинов 1Ь-1|3,1Ь-6,1Ь-8, ТОТ-а, а также включая секрецию ШЫ-а, ШГЧ-у, ТвБ-р и оксида азота в сыворотке крови и бронхоальвеолярном лаваже у новорожденных детей с респираторными нарушениями.
4. Выявить особенности продукции хемокина КАИТЕБ и вМ-СБР у новорожденных детей с респираторными нарушениями.
5. Определить роль параметров врожденного иммунитета ТЬЯ-2 (СБ282+), ТЫ1-4 (СБ284+) и СО 14++, как возможных маркеров реализации бактериальных осложнений у новорожденных с респираторными нарушениями.
6. Исследовать экспрессию молекул адгезии ІСАМ-1 (СБ54+), СОЇ ір+, СЭ11с+, а также уровень экспрессии к Бс фрагментам и к С1 и СЗ компонентам комплемента (СБ64+, СБ35+) у новорожденных детей с респираторными нарушениями.
7. Исследовать функции фагоцитов у новорожденных детей с респираторными нарушениями.
8. Провести анализ динамики показателей врожденного и адаптивного иммунитета у новорожденных с респираторной патологией.
9. Разработать иммунологические тесты, позволяющие прогнозировать исход заболевания и бактериальные осложнения у новорожденных детей с респираторными нарушениями, обусловленными мекониальной аспирацией и респираторным дистресс-синдромом.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА
- Впервые установлено, что у доношенных новорожденных с МАС и РДС развивается иммунологический дистресс-синдром, обусловленный усилением процессов апоптоза клеток иммунной системы, снижением концентрации вМ-СБР, угнетением адаптивного иммунитета с одновременным угнетением цитотоксических реакций, вызванных естественными киллерами и цитотоксическими лимфоцитами.
- Впервые получены данные о значительном снижении уровня фактора хемотаксиса ИАКТЕБ в сыворотке крови, что отражает особенности течения респираторных нарушений у новорожденных.
- Выявлена ведущая роль альтерации клеток иммунной системы в исходах критических состояний у доношенных новорожденных.
- Впервые получены новые данные о дефектах в системе То11-подобных рецепторов у новорожденных с респираторными нарушениями. Показаны различия в экспрессии СБ 14++, ТЬЯ-2 (С0282+) и ТОМ (СБ284+) на моноцитах периферической крови здоровых новорожденных и новорожденных с респираторными нарушениями. Полученные данные позволяют оценить состояние рецепторов врожденного иммунитета у здоровых новорожденных и у новорожденных с респираторными нарушениями.
- Установлено, что количество клеток СБ95+ у новорожденных с респираторными нарушениями достоверно увеличено, что, возможно, указывает на пролонгированное течение патологического процесса с признаками апоптоза.
- Установлено, что развитие респираторной патологии ассоциируется с активацией периферических лимфоцитов и моноцитов новорожденных.
-Установлено, что при респираторной патологии нарушаются процессы распознавания и презентации антигена (АГ) периферическими моноцитами новорожденного.
- Установлено, что иммунные механизмы участвуют в патогенезе респираторных нарушений, проявляясь на системном уровне в виде дисбаланса реакций врожденного и адаптивного иммунитета.
- Впервые установлено, что иммунная депрессия врожденного и адаптивного иммунитета у новорожденных с респираторными нарушениями сохраняется и в исходе заболевания, являясь основой для формирования иммуноопосредованной патологии.
- Впервые разработан способ раннего прогнозирования септических осложнений у новорожденных с респираторной патологией, на основании повышенной экспрессией АппехтУ+ на моноцитах (Патент на изобретение №2414706 от 20 марта 2011 г.).
Впервые разработан способ ранней диагностики развития неонатального сепсиса у новорожденных с синдромом дыхательных расстройств и гипоксическим поражением ЦНС, на основании сниженной экспрессией ША-БЯ на моноцитах периферической крови (Патент на изобретение №2374646 от 27 ноября 2009 г.).
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.
1. Расширены представления о патогенетической роли изменений врожденного и адаптивного иммунитета при респираторных нарушениях у новорожденных, обусловленных нарушением процессов активации, дифференцировки, апоптоза и эффекторных функций иммунокомпетентных клеток и сопровождающихся нарушением экспрессии То11-подобных рецепторов, как физиологических регуляторов врожденного и адаптивного иммунитета.
2. Практическая значимость работы заключается в разработке иммунологических критериев ранней диагностики присоединения вентилятор-ассоциированных инфекционно-воспалительных осложнений бактериальной природы у новорожденных с респираторной патологией, основанных на определении экспрессии АппехтУ+ на моноцитах (Патент на изобретение №2414706 от 20 марта 2011 г.) и экспрессии НЬА-БЯ на моноцитах периферической крови (Патент на изобретение №2374646 от 27 ноября 2009 г.).
3. На основании собственных исследований установлены наиболее информативные показатели содержания цитокинов в бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ) при респираторной патологии. Предложено использовать уровень 1Ь-1, 1Ь-6, 1Ь-8 в БАЛ в качестве маркеров активности воспалительного процесса в бронхолегочной системе при респираторных нарушениях у доношенных новорожденных.
ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ
1. Иммунные нарушения играют важную роль в патогенезе респираторных расстройств и проявляются дисбалансом реакций врожденного и адаптивного иммунитета.
2. Наиболее выраженные изменения врожденного и адаптивного иммунитета регистрируются при респираторных нарушениях на 3-5-е сутки наблюдения.
3. Иммунная депрессия врожденного и адаптивного иммунитета при респираторных нарушениях сохраняется и на 20-е сутки, являясь основой для формирования иммуноопосредованной патологии.
4. Развитию бактериальных осложнений при респираторных нарушениях способствует нарушение презентации антигена и увеличение апоптоза лимфоцитов и моноцитов.
5. Ранняя диагностика иммунных дисфункций врожденного и адаптивного иммунитета позволит уменьшить количество бактериальных осложнений, а так же снизить раннюю неонатальную смертность.
ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ В ПРАКТИКУ:
Количественное определение уровней факторов как местного, так и системного иммунитета, молекул межклеточной адгезии и хемокинов в сыворотке крови и в бронхоальвеолярном лаваже у новорожденных с респираторной патологией внедрено в практическую деятельность отделения реанимации ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский институт акушерства и педиатрии» Министерства здравоохранения и социального развития, используется в лекционных курсах на семинарах врачей ЮФО, на кафедре клинической иммунологии и аллергологии ФПК и 1111С ГБОУ ВПО РостГМУ Минздравсоцразвития России.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ И ЛИЧНОЕ УЧАСТИЕ АВТОРА:
Основные положения работы представлены:
на Всероссийской междисциплинарной научно-практической конференции «Внутриутробные инфекции плода и новорожденного», Саратов, 2000 г.;
- на 4-ом Конгрессе Ассоциации Аллергологов и Клинических Иммунологов «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», Москва, 2001 г.;
- на международно
-
Дударева, Мария Васильевна
-
доктора биологических наук
-
Москва, 2013
-
ВАК 03.03.03
- Коррекция общего адаптационного синдрома у новорожденных телят с функциональной диспепсией бионормализатором из плаценты
- Физиологические особенности тромбоцитарного гемостаза у новорожденных телят в норме и при функциональных нарушениях пищеварения
- Физиологическое становление тромбоцитарного гемостаза у продуктивных животных в постнатальном онтогенезе
- Морфофункциональные и иммунологические показатели у животных при применении Полисорбина
- Состояние тромбоцитарных функций у новорожденных телят в норме и на фоне анемии
