Система обеспечения безопасности продукции животноводства при использовании анаболических стероидов, производных стильбена и β-адреностимуляторов

Комаров, Александр Анатольевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Система обеспечения безопасности продукции животноводства при использовании анаболических стероидов, производных стильбена и β-адреностимуляторов
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Система обеспечения безопасности продукции животноводства при использовании анаболических стероидов, производных стильбена и β-адреностимуляторов"

На правах рукописи

Комаров Александр Анатольевич

СИСТЕМА ОБЕСПЕЧЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ ПРОДУКЦИИ ЖИВОТНОВОДСТВА ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ АНАБОЛИЧЕСКИХ СТЕРОИДОВ, ПРОИЗВОДНЫХ СТИЛЬБЕНА И р-АДРЕНОСТИМУЛЯТОРОВ

03.00.23 - биотехнология 16.00.04 — ветеринарная фармакология с токсикологией

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва-2006

Работа выполнена в отделе безопасности кормов и пищевых продуктов Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов»

(ФГУ «ВГНКИ»)

Научный консультант доктор ветеринарных наук, профессор,

академик Россельхозакадемии Панин Александр Николаевич

Официальные оппоненты доктор ветеринарных наук, профессор,

Заслуженный деятель науки РФ Таланов Герман Александрович (ГНУ ВНИИВСГЭ Россельхозакадемии)

доктор биологических наук, профессор Токарик Элеонора Федоровна (ГНУ ВНИиТИБП Россельхозакадемии)

доктор биологических наук, профессор, Заслуженный деятель науки РФ Бузлама Виталий Соломонович (ГНУ ВНИВИПФиТ Россельхозакадемии)

Ведущая организация Московский государственный университет

прикладной биотехнологии

Защита диссертации состоится « 19 » октября 2006 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 220.011.01 при ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» Адрес: Россия, 123022, г. Москва, Звенигородское шоссе, д. 5, ФГУ «ВГНКИ»

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «ВГНКИ» Автореферат разослан « июля 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук, доцент, Заслуженный ветеринарный врач РФ

в Ю.А.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В качестве веществ, обладающих анаболическим действием, наиболее широко применяются стероидные гормоны, производные стильбена и ß-адреностимуляторы (ß-агонисты). Использование анаболических стимуляторов в животноводстве обусловлено экономическими факторами, но главная опасность заключается в риске воздействия на здоровье человека остаточных количеств этих веществ в продукции животного происхождения. За последние 30 лет описано более 10 ООО случаев аномального полового развития у детей, вызванного присутствием в продовольствии остаточных количеств анаболических веществ (Fara G.M. et al., 1979; Pasquino A.M. et al., 1982; Loizzo A. et al., 1984; Perez-Comas A., 1988; Joffe M. et al., 2001). Действие экзогенных гормонов может нарушить эндокринное равновесие в организме, что выражается непредсказуемыми отдаленными последствиями случайного воздействия стероидов в препубертатном возрасте на репродуктивную функцию посредством механизма, названного «гормональный импринтинг» ( Mena М.А. et al., 1992; Hahn B.N., 1998; SCVPH, 1999,2002).

Синтетические гормоны медленнее метаболизируются по сравнению с природными аналогами, позволяют добиться значительного повышения продуктивности в животноводстве и снизить себестоимость продукции, что вызвало всплеск их использования в последние годы. В то же время, токсикологическое действие и метаболизм синтетических анаболиков недостаточно изучены, что существенно усложняет оценку риска, связанную с их применением (SCVPH, 2002).

Экспрессия ферментов, метаболизирующих лекарственные препараты, регулируется гормонами, поэтому анаболические стероиды могут продлевать сроки выведения из организма различных лекарственных средств и повышать их остаточное содержание в животноводческой продукции (Miert van Asjpan et al., 1988; Witkamp R.F. et al., 1991; Van't Klooster G. et al., 1993; Montessissa С. et al., 1996).

Хотя ß-адреностимуляторы не являются стероидными гормонами, по фармакологическим свойствам их можно сравнить со стероидами. Они вызывают ингиби-рование процессов катаболизма мышечных белков и липогенеза в тканях, что способствует получению постного мяса, пользующегося большим спросом на рынке. В разных странах имели место многочисленные случаи отравления людей мясной продукцией, содержавшей остаточные количества ß-адреностимуляторов, сопровождающиеся такими симптомами, как: тахикардия, мышечный тремор, гипокалие-мия, тахифилаксия, возбуждение, головные боли, мышечные спазмы, повышение артериального давления, тошнота ( Martinez-Navarro J.F., 1990; Pulce С. et al., 1991; Maistro S. et al., 1995; Salleras L. et al., 1995; Bilbao-Garay J. et al„ 1997; Brambilla G.

et., 1997; Sporano V. Et al., 1998). Особую опасность представляет потребление такой продукции людьми с сердечно-сосудистыми заболеваниями.

Имеющиеся на сегодняшний день данные не позволяют в полной мере оценить риск, связанный с применением анаболических стимуляторов роста в животноводстве, поэтому для этих веществ не может быть установлен безопасный уровень суточного потребления.

В связи с вышеизложенным, использование анаболиков в животноводстве запрещено в странах Европейского Союза (ЕС) и Российской Федерации (Council Directive 96/22/ЕС; Directive 2003/74/ЕС; Указание Главного госветинспектора РФ № 137-1/900 от 04.10.99г).

В ряде стран (США, Канаде и др.) некоторые природные и синтетические гормональные стимуляторы роста сельскохозяйственных животных официально разрешены, а также широко распространено нелегальное использование анаболиков, поэтому необходимо контролировать применение этих веществ при выращивании животных и определять их остаточное содержание в животноводческой продукции. В странах ЕС такой контроль уже систематически осуществляется в соответствии с Директивой 96/23/ЕС, а введение его в Российской Федерации сдерживает отсутствие методической и законодательной базы.

Анализ имеющихся данных об отрицательном влиянии анаболических агентов на здоровье человека, а также экспорт в Россию пищевых продуктов из стран, где законодательно разрешено применение этих опасных ксенобиотиков, делают актуальными разработку национальной системы контроля безопасности продукции животноводства при их использовании.

В соответствии с рекомендациями Codex Alimentarius (1993), такая система должна быть построена на многоуровневом контроле, сочетающем преимущества использования экспрессных технологий для скрининга большого массива образцов на начальном этапе исследований с обязательным подтверждением положительных результатов современными физико-химическими методами, позволяющими проводить надежную идентификацию определяемых веществ. Скрининговые методы должны обладать высокой чувствительностью, специфичностью, простотой, экс-прессностью и относительно низкой себестоимостью. Всем этим требованиям наиболее полно отвечают иммунохимические методы, в частности ИФА.

Подтверждающие методы должны обеспечивать надежную идентификацию определяемых веществ. Идеальным подтверждающим методом для определения анаболических агентов в биосубстратах является хроматомасс-спектрометрия (ГХ-МС), сочетающая высокую эффективность разделения веществ капиллярной газовой хроматографией с селективным масс-спектрометрическим детектированием.

Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы заключалась в создании двухуровневой системы аналитического контроля за использованием анаболических стимуляторов роста сельскохозяйственных животных и определения остаточного содержания анаболиков в продукции животноводства.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: - синтезировать гаптены низкомолекулярных анаболических агентов с функциональными карбоксильными группами, получить иммуногены путем конъюги-

рования их с белками и специфичные антитела для определения анаболиков им-мунохимическим методом;

— оптимизировать условия экспрессного определения анаболических агентов в биосубстратах методом ИФА, оценить чувствительность и специфичность метода;

— разработать нормативную документацию и организовать производство ИФА-наборов для экспрессного определения анаболических агентов в объектах ветеринарно-санитарного надзора;

— разработать подтверждающие (арбитражные) хроматомасс-спектрометри-ческие методики определения анаболических веществ в организме сельскохозяйственных животных, кормах и продукции животноводства;

— создать оригинальную библиотеку масс-спектров производных анаболиков для идентификации их на масс-спектрометрах типа «ионная ловушка»;

— провести метрологическую аттестацию арбитражных методик определения анаболических агентов в биосубстратах, оценить правильность получаемых результатов с использованием международных аттестованных стандартных образцов.

Научная новизна работы. Впервые разработаны оригинальные способы синтеза ряда гаптенов низкомолекулярных анаболических агентов с функциональными карбоксильными группами для конъюгирования с белками-носителями: диэтилстильбэ-строл-о-карбоксиметила (патент РФ № 2192408), 3-о-карбоксиметилэтинилэстра-диола (патент РФ № 2214995), тренболон-17-гемисукцината и 19-нортестостерон-17-гемисукцината (патент РФ № 2193566). Карбоксипроизводные диэтилстильбэ-строла - 4-[1-этил-2(4-гидроксифенил)-1-бутенил]феноксиуксусная кислота и эти-нилэстрадиола - 0-[19-нор-17а-этинил-17(3-гидрокси-прегна-1,3,5(10)-триен-3-ил] гликолевая кислота синтезированы впервые. Путем конъюгирования синтезированных гаптенов с белками созданы оригинальные иммуногены (патенты РФ № 2218351 и №2218352).

ного происхождения методом ГХ-МС на масс-спектрометрах типа «ионная ловушка». Разработана методика, обеспечивающая одновременное хроматомасс-спектрометрическое определение в биосубстратах р-адреностимуляторов различных типов путем очистки гидролизованных образцов оптимизированным способом твердофазной экстракции на картриджах с комбинированным обращеннофазовым и ионообменным сорбентом. Оптимизированы способы предварительной деривати-зации и хроматографического разделения анаболических агентов, обеспечившие проведение их надежной идентификации и количественного анализа методом ГХ-МС с соблюдением международных требований. Создана оригинальная библиотека масс-спектров производных анаболических агентов и их дейтерированных аналогов для идентификации этих соединений на масс-спектрометрах типа «ионная ловушка» с внутренним источником ионизации.

Практическая значимость работы. Впервые в Российской Федерации создана двухуровневая система контроля безопасности продукции животноводства при использовании анаболических стимуляторов роста животных. Для экспрессного определения основных представителей синтетических эстрогенов (диэтилстильбэстрола, этинилэстрадиола), андрогенов (19-нортестостерона, тренболона, 17-метилтесто-стерона) и р-адреностимуляторов (кленбутерола) в кормах, организме животных и продукции животного происхождения разработаны и зарегистрированы Россель-хознадзором тест-системы ИФА. Чувствительность большинства разработанных тест-систем не уступает, а в ряде случаев (для кленбутерола в 10 раз, а 19-нортестостерона в 16 раз) превосходит показатели зарубежных аналогов. Разработаны простые и экономичные способы извлечения анаболиков из биосубстратов для определения методом ИФА, исключающие использование дорогостоящего метода твердофазной экстракции. На тест-системы подготовлена, согласована и утверждена нормативная документация и организовано их серийное производство в России. Для подтверждающего анализа анаболиков в подозрительных образцах, показавших положительные результаты в ИФА, разработаны, утверждены Управлением ветеринарии Федерального агентства по сельскому хозяйству и аттестованы Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии арбитражные методики определения массовых долей анаболических стероидов, производных стильбена и р-адреностимуляторов методом ГХ-МС в объектах ветеринарно-санитарного надзора. Использование относительно недорогих и простых в эксплуатации масс-спектрометров типа «ионная ловушка» позволило обеспечить невысокую стоимость анализа при достижении высокой чувствительности и селективности определения за счет возможности работы на анализаторах этого типа в режимах тандемной масс-спектрометрии и селективного удерживания ионов. С целью гармонизации отечественных и международных подходов к оценке качества результатов измерений при метрологической аттестации методик впервые оценена расширенная неопределенность измерения. Материалы диссертационной работы вошли в методическое пособие «Контроль за содержанием ветеринарных препаратов в кормах и продукции животноводства» (издательство «Пищепромиздат», 2003), использованы в лекциях и семинарах на курсах повышения квалификации специалистов государственной ветеринарной службы и предприятий агропромышленного комплекса.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на IX Международном конгрессе Европейской ассоциации ветеринарной фармакологии и токсикологии (Лиссабон, 2003), Международном форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2003), XI Московском международном ветеринарном конгрессе (Москва, 2003), II Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2003), VII Всероссийском конгрессе «Здоровое питание населения России» (Москва, 2003), II Международной научно-практической конференции «Научно-технический прогресс в животноводстве России - ресурсосберегающие технологии производства экологически безопасной продукции животноводства» (Дубовицы, 2003), Международной научной конференции «Медико-биологические проблемы экологической безопасности агропромышленного комплекса» (Сергиев Посад, 2003), III Международной конференции «Птицеводство — мировой и отечественный опыт» (Москва, 2004), Всероссийском ветеринарном конгрессе и XII Международном Московском конгрессе по болезням мелких домашних животных (Москва, 2004), NATO Advanced Research Workshop «Food Safety and Security» (Issyk-Kul, 2004), II Съезде Общества биотехнологов России (Москва, 2004), V Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины, ветеринарно-санитарного контроля и биологической безопасности сельскохозяйственной продукции» (Москва, 2004), III Международном симпозиуме «Современные проблемы ветеринарной диетологии и нутри-циологии» (Санкт-Петербург, 2005), научно-практической конференции «Продовольственная безопасность России» (Москва, 2005), III Международной конференции «Экстракция органических соединений» (Воронеж, 2005), Всероссийской конференции «Лекарственные средства для животных и корма. Современное состояние и перспективы» (Москва, 2006), Всероссийском ветеринарном конгрессе и XIV Международном Московском конгрессе по болезням мелких домашних животных (Москва, 2006), V Международном симпозиуме по анализу остаточных количеств гормонов и ветеринарных препаратов (Антверпен, 2006), Международном конгрессе по аналитической химии (Москва, 2006), заседаниях Ученого совета ФГУ «ВГНКИ» в 2000-2005 гг., заседаниях научно-методической комиссии по химиоте-рапевтическим лекарственным средствам для животных ФГУ «ВГНКИ» в 2004-2005 гг., межлабораторном совещании сотрудников ФГУ «ВГНКИ» в 2006 г.

Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 65 статей и тезисов докладов, одно методическое пособие (3 п. л.), 2 методических указания, получено 5 патентов РФ на изобретения.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Технология создания тест-систем для экспрессного иммунохимического определения анаболических агентов в организме животных и продукции животного происхождения.

2. Разработка подтверждающих (арбитражных) методик определения анаболических стероидов, производных стильбена и ß-адреностимулятров в объектах ветеринарно-санитарного надзора с помощью ГХ-МС.

3. Современные подходы к метрологической аттестации разработанных методик: алгоритм оценивания неопределенности измерения и контроль правильности

результатов измерения содержания анаболиков в биосубстратах с использованием международных аттестованных стандартных образцов.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 390 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка литературы, включающего 581 источник, 27 из которых опубликованы в отечественных и 554 — в зарубежных изданиях и приложений. Работа иллюстрирована 57 таблицами и 104 рисунками.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы Синтез гаптенов низкомолекулярных анаболических агентов с функциональными карбоксильными группами, степень экстракции и чистоту синтезированных продуктов контролировали методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинах с силикагелем марки «Силуфол» ИУ-254. Подтверждение строения синтезированных гаптенов проводили по данным УФ-, ИК-спектроскопии и протонного магнитного резонанса (ПМР) на приборе «Bruker-ЗОО» (в дейтерированном диме-тилсульфоксиде - ДМСО-с16).

Синтезированные гаптены (карбоксипроизводные) синтетических анаболических стероидов и диэтилстильбэстрола (ДЭС) конъюгировали с молекулами белков (бычьим сывороточным альбумином (БСА), желатиной (Ж) пептидными связями методом смешанных ангидридов (Erlanger B.F. et al., 1957, 1959) и карбодиимидным методом (Carraway К.К., Kosland D.E., 1972). Кленбутерол конъюгировали с белками без предварительной модификации молекулы методом диазотирования (Tsui Р.Т. et al., 1974). Количество молекул гаптена, связанных с молем белка в конъюгате, контролировали методом УФ-спектроскопии. Концентрацию белка определяли методом Lowry (1951).

Поликлональные антитела к синтезированным иммуногенам (конъюгатам гаптенов анаболиков с белками) получали путем подкожной иммунизации кроликов 100 мкл конъюгата с концентрацией белка 1 мг/мл, предварительно разведенного в 1,5 мл стерильного физиологического раствора и эмульгированного с 1,5 мл полного адъюванта Фрейнда (ПАФ). Через каждые 4 недели животных реиммунизировали водными растворами конъюгатов без адъюванта. Активность и специфичность полученных сывороток контролировали методом ИФА.

Оптимизацию способов подготовки проб биосубстратов для скрининг-определения анаболических агентов методом непрямого конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа (НКТ ИФА) проводили с использованием контрольных образцов субстратов, не содержащих анаболики и образцов с внесенными добавками определяемых веществ. Анаболики в моче, желчи, печени и почках животных определяли после предварительного гидролиза конъюгатов с глюкуроновой и серной кислотами ферментами пищеварительного сока моллюска Helix pomatia. Для оптимизации условий эффективного гидролиза сульфатированных форм стероидов использовали мочу лошадей, получавших препарат Laurabolin® (Intervet), содержащий в своем составе в качестве действующего вещества лаурат 17р-19-нортестостерона.

При разработке методик экспрессного иммуноанализа стероидов, производных стильбена и ß-адреностимуляторов в кормах, физиологических жидкостях, органах и тканях животных, изучали влияние твердофазной экстракции (ТФЭ) на картриджах с различными сорбентами и жидкостной экстракции различными органическими растворителями (метанолом, дихлорметаном, трихлорметаном, диэтиловым эфиром, трет-бутилметиловым эфиром (ТБМЭ), гексаном, бутанолом, этилацетатом, изопропанолом) на степень извлечения анаболиков из биосубстратов и уровень неспецифического фона в контроле при постановке ИФА.

Подбор условий извлечения кленбутерола из шерсти и сетчатой оболочки глаза животных выполняли на образцах с искусственной добавкой препарата, а также шерсти и сетчатке глаза животных (кроликов и бычков), получавших препарат с кормом. Кленбутерол экстрагировали из шерсти животных после предварительного щелочного гидролиза образцов при 95°С.

Разработку способов извлечения и очистки анаболиков из биосубстратов для подтверждающего (арбитражного) определения остаточного содержания методом ГХ-МС осуществляли на образцах с внесенными добавками стандартных образцов аналитов и их дейтерированных аналогов для исключения ошибки количественного определения, обусловленной неполным извлечением определяемых веществ из матрицы. С целью увеличения степени извлечения анаболиков из мышечной ткани белки матрицы предварительно гидролизовали субтилизином А в течение 3 часов при температуре 55°С и pH 9,5.

Для подтверждающего определения остаточного содержания анаболических стероидов и производных стильбена в биосубстратах методом ГХ-МС после жидкостно-жидкостной экстракции аналитов различными органическими растворителями экстракты очищали методом ТФЭ на картриджах «BondElut» фирмы «Varían» (США) с обращеннофазовым сорбентом «Bondesil С)8» и ВЭЖХ на колонке «Inertsil ODS 3» («Varían», США). В качестве подвижной фазы использовали деионизованную воду (А) и метанол (Б). Условия хроматографии - А/Б- 30/70, градиент до 100% Б за 10 мин, 10-15 мин - 100% Б, 15-23 мин А/Б - 30/70. Вместо петли инжектора устанавливали предколонку «MetaGuard Inertsil ODS 3» («Varían», США). В положении «Load» инжектора пропускали через предколонку 0,5 мл деи-онизованной воды, а затем водный остаток пробы после ТФЭ очистки. Затем переводили инжектор в положение «Inject» и собирали фракцию, соответствующую временам удерживания анализируемых веществ. Порядок элюирования стероидов и стильбенов был следующий (х=254нм): 17р-тренболон (8 мин), 17ß-19-нортестостерон, 17а-этинилэстрадиол, транс-диэтилстильбэстрол, гексэстрол, дие-нэстрол, эстрадиол, тестостерон, 17а-метилтестостерон, цис-диэтилстильбэстрол, прогестерон (11,5 мин).

Для подтверждающего определении ß-адреностимуляторов в биосубстратах методом ГХ-МС пробы очищали ТФЭ на картриджах «BondElut» («Varían», США) с комбинированным сорбентом «Bondesil CERTIFY».

При определении анаболиков методом ГХ-МС проводили их предварительную дериватизацию несколькими способами: ацилирование гептафтормасляным (ГФМА) и пентофторпропионовым ангидридами (ПФПА); получение триметилси-

лильных (ТМС) эфиров с использованием N-метил-М-триметилсилил трифтораце-тамида (МСТФА)/ иодистого аммония (NH4J)/ дитиоэритритола (ДТЭ) (1000/4/2), МСТФА/ триметилйодсилана (ТМИС)/ДТЭ (1000/5/5) или N.N-бис-триметилсилилтрифторацетамида (БСТФА) с 1% триметилхлорсилана (ТМХС); де-риватизацию кето-стероидов с образованием метилоксим/ТМС производных; использовали комбинированный способ дериватизации ß-адреностимуляторов с получением на первом этапе циклических метилборатных (МБ) производных путем реакции конденсации с метилборной кислотой (МБК) или триметилбороксином и силилированием молекул на следующем этапе смесью БСТФА/ТМХС (1000/10).

Дериваты анаболических агентов анализировали методом ГХ-МС на газовом хроматографе модели «3380» с масс-спектрометрическим анализатором типа «ионная ловушка» «Saturn 2000» («Varian», США). При ГХ-МС анализе использовали метод ионизации электронным ударом (ЭУ) с автоматическим определением времени ионизации в режимах полного ионного тока, селективного удерживания ионов или тандемной масс-спектрометрии (МС/МС) с резонансной и нерезонансной активацией ионов. Анаболики идентифицировали с соблюдением международных критериев в соответствии с Решением Комиссии ЕС 2002/657/ЕС от 12 августа 2002 года. Количественное определение осуществляли методом внутреннего стандарта по площади пиков идентифицированных соединений относительно градуиро-вочного графика, полученного при анализе в аналогичных условиях стандартных растворов идентифицированных веществ. В качестве внутреннего стандарта использовали дейтерированные производные определяемых соединений.

Метрологическую аттестацию разработанных методик выполняли по результатам их метрологической экспертизы, проведенной Московским институтом экспертизы и испытаний Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии и расчетно-экспериментального оценивания неопределенности измерения на основе определения основных показателей, характеризующих эффективность методик, в соответствии с руководством ЕВРАХИМ/СИТАК «Количественное описание неопределенности в аналитических измерениях» (2002).

Контроль правильности результатов измерения содержания анаболиков в биосубстратах с использованием разработанных методик демонстрировали путем анализа международных аттестованных стандартных образцов: BCR 475 - лиофили-зированной печени теленка с аттестованным содержанием а-тренболона, CRM 389 — лиофилизированной мочи теленка с аттестованным содержанием ДЭС, BCR 649 -лиофилизированной печени теленка с аттестованным содержанием кленбутерола, BCR 504 - лиофилизированной мочи теленка с аттестованным содержанием кленбутерола и сапьбутамола.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.2.1. Получение иммуногенов для определения анаболических агентов имму-нохимическими методами

2.2.1.1. Синтез гаптепов анаболиков с функциональными карбоксильными группами

Наиболее ответственным этапом разработки иммунохимического метода является получение специфических иммунореагентов, определяющих чувствительность

и специфичность анализа. Главные трудности на этом этапе обусловлены низкой иммуногенностью низкомолекулярных органических веществ, в т.ч. анаболиков, которые ковалентной связью присоединяли к макромолекулам белков для получения специфических антител (АТ).

С целью реализации этой стратегии были синтезированы гаптены (Гп) низкомолекулярных анаболических агентов с функциональными карбоксильными группами для конъюгирования с белками-носителями. Чем меньше изменений происходит в трехмерной пространственной конформации Гп в результате такого связывания, тем выше шансы получения высокоаффинных и специфичных АТ, поэтому места для связывания Гп с молекулами белков выбирали максимально удаленно от участков распознавания АТ. В ряде случаев разработаны оригинальные способы синтеза Гп, новизна которых подтверждена патентами РФ на изобретение.

Для определения ДЭС методом ИФА разработан оригинальный одностадийный способ синтеза его карбоксипроизводного — диэтилстильбэстрол-о-карбоксиметила (ДЭС-КМ) (рис.1) путем алкилирования ДЭС этиловым эфиром бромуксусной кислоты в присутствии этилата натрия. Предложенный способ позволил избежать ряда недостатков, свойственных ранее известному двухстадийному способу получения замещенных феноксиуксусных кислот (Ка1гепе11епЬо§еп ^А. е1 а1., 1973): образования трудноразделимой смеси исходного фенольного производного стильбена, его моноэфира и диэфира с галлоидуксусной кислотой, необходимости проведения дополнительной стадии омыления моноэфира, что снижает выход целевого продукта.

Рис. 1. Структура синтезированного карбоксипроизводного ДЭС—ДЭС-КМ

Получено 0,27г 4-[1-этил-2(4-гидроксифенил)-1-бутенил]феноксиуксусной кислоты (ДЭС-КМ) (выход- 41%) с температурой плавления (Т. пл.) 153 - 154°С (в бензоле). 1^= 0,45 при ТСХ в системе хлороформ-метанол (90:10). ПМР-спектр 5 (м.д.): 0,7т (6Н), 2,08м (4Н), 4,65с (2Н), 6,8-7,4м (8Н), 7,36с (1Н).

В качестве Гп для определения 17а-этинилэстрадиола (ЭТЭ) синтезирован З-о-карбоксиметилэтинилэстрадиол (КМ-ЭТЭ) (рис. 2).

Рис. 2. Структура синтезированного карбоксипроизводного ЭТЭ - КМ-ЭТЭ

Это производное ЭТЭ синтезировано впервые. В отличие от описанного в литературе аналогичного производного эстрадиола-17р (Кипс1и N. е! а1., 1977), при получении которого использовали сильные щелочные агенты в присутствии протонных растворителей (спиртов), оксиацетиленовая группировка ЭТЭ в этих условиях неустойчива и испытывает ряд превращений: легко гидролизуется в водных растворах оснований, а в присутствии спиртов - присоединяет их по тройной связи. Нами разработан оригинальный способ синтеза КМ-ЭТ путем конденсации ЭТЭ с эфиром галлоидуксусной кислоты в присутствии основания и последующем омылении образующегося в процессе реакции эфира о-арилгликолевой кислоты эквивалентым количеством водного раствора щелочи при 10-30°С в среде апротонного биполярного растворителя (диметилсульфоксида), позволяющий сохранить структуру лабильной оксиацетиленовой группировки. Получено 297 мг КМ-ЭТЭ (выход 84%) с Т. пл. 180-181°С. ИК-спектр (КВг), см-': 1736с, 1215с (СООН), 1610ср(Аг), 1500ср, ПбОср, 3280 с (ОН, С=СН). ПМР-спектр (СБСЬ3), м.д.: 0,88 (ЗН, СН3), 2,62с (1Н, С=СН), 2,86с (2Н, СН2), 4,65с (2Н, ОСН2), 6,67с (1Н, Аг), 6,72д (1Н, Аг), 7,28м (1Н,Аг).

При попадании в организм животного ацетат тренболона (ТБ) быстро гидролизуется с преимущественным накоплением в мышечной ткани 17Р-эпимера, а в экскретах и печени животных — 17а-ТБ (.кнкцаеу А. е! а1., 1983). Учитывая особенности метаболизма этого анаболика, использование в качестве Гп тренболон-17-гемисукцината (ТБ-ГС) (рис.3, I) позволило получить иммунореагенты, обнаруживающие одновременно два основных метаболита ТБ.

Рис. 3. Структура синтезированных карбоксипроизводных ТБ — ТБ-ГС (I) и 17/3-ТБ-КМО (II)

Учитывая вышеизложенное, был разработан оригинальный способ получения ТБ-ГС путем ацилирования ТБ с янтарным ангидридом в среде апротонного биполярного растворителя (диметилацетамида) при 20-110°С в присутствии каталитического количества или избытка основания. Органические основания (триэтиламин) лучше применять в качестве катализатора при более низких температурах проведения реакции (20-60°С), неорганические (прокаленный поташ) — повышенных температурах (60-110°С). Разработанный метод синтеза выгодно отличается от ранее известного способа ацилирования 17-оксистероидов в жестких условиях (в течение 3 часов при 75°С) в среде высокотоксичного пиридина (Jondorf W.R., 1978). При выделении целевого продукта, в случае использования пиридина, возникает необходимость нейтрализации его сильной минеральной кислотой, а степень выхода готового продукта не превышает 57%. Выход целевого продукта в нашем случае составил 92%. Было

получено 170 мг ТБ-ГС с Т. пл. после перекристаллизации из метанола 155-156°С, 0,23 при ТСХ в системе хлороформ-ацетон (10:1), А^и 350нм (е 20 500). Предложенный способ ацилирования ТБ имеет общий характер и был использован также для ацилирования другого 17-оксистероида— 17р-19-нортестостерона (19-НТ) при получении 19-нортестостерон-17-гемисукцината (19-НТ-ГС) (рис. 4, I). Выход целевого продукта составил 90%. Хтах239нм (16500). ИК-спектр: 1728 (С=0-ОЯ), 1645 (-СОСН=С), 1605 (С=С).

Рис. 4. Структура синтезированных карбоксипроизводных 19-НТ — 19-НТ-ГС (I) и 17Р-19-НТ-КМО (II)

Использование в качестве Гп 19-НТ-ГС обусловлено не только выбором места связывания с белком, максимально удаленного от участка распознавания AT (СЮ положение в циклопентанпергидрофенантреновом ядре), но и возможностью получения AT, обнаруживающих свободный 17Р-19-НТ, его главный метаболит, выделяющийся с желчью и мочой — 17а-19-НТ и любой из сложных эфиров 19-НТ с жирными кислотами. Широкое применение 19-НТ в форме сложных эфиров с различными жирными кислотами в 17 положении обусловлено тем, что с увеличением длины кислотного радикала, увеличивается период полувыведения нандролона из организма и усиливается анаболический эффект (Van der Vies J., 1985; McEvoy J.D.G. et al., 1998).

Для специфического определения 17Р-ТБ — главного метаболита ацетата ТБ, накапливающегося в мышечной ткани в качестве Гп был синтезирован 17р-тренболон-3(о-карбоксиметил)оксим (17р-ТБ-КМО) (рис. 3, II). Подобные производные ранее синтезировали путем конденсации кетостероидов с аминоуксусной кислотой при слабом нагревании в пиридине в слабощелочной среде (рН 8,0) с последующим доведением рН до 2,0-4,0 (Tsuji A. et al., 1974; Fahmy D. et al., 1975). Однако в результате собственных исследований установлено, что проведение реакции не в щелочной, а в слабокислой среде (рН 6,0) при 20°С увеличивает выход целевого продукта. Получено 20 мг 17Р-ТБ-КМО. Хтах(спирт) 323 нм (s 24000).

В последние годы установлено, что некоторые экзогенные (синтетические) стероиды могут в определенных условиях образовываться в организме животных. Главный метаболит 17р-19-НТ - 17а-19-НТ был обнаружен в организме стельных коров и новорожденных телят (De Brabander H.F. et al., 1994; Le Bizec B. et al., 2003). Учитывая эти факты, путем конденсации 17Р-19-НТ с карбоксиметоксилами-ном в среде пиридина был синтезирован 17р-нортестостерон-3(0-

карбоксиметил)оксим (17Р-19-НТ-КМО) (рис.4, II), использование которого в качестве Гп позволило проводить специфическое распознавание 17|3-19-НТ. Наличие в продукте синтеза карбоксильной группы подтверждено ТСХ (по бромфеноловому индикатору). Т.пл. 184-187°С. УФ (в спирте): Хт ах 250нм (16000). ИК (в вазелиновом масле): 1730 (СООН), 1646 (С=Ю и 3440 (ОН).

Специфичность распознавания 17а-метилтестостерона (МТ) АТ обусловлена наличием метальной группировки в 17-ом положении, поэтому карбоксипроизводное МТ - 17-метилтестостерон-3-(0-карбоксиметил)оксим (МТ-КМО) (рис. 5) синтезировали в 3-ем положении, с учетом максимального удаления места связывания гап-тена с молекулой белка от участка распознавания АТ.

Рис. 5. Структура синтезированного карбоксипроизводного МТ-МТ-КМО

МТ-КМО синтезировали путем конденсации МТ с аминоуксусной кислотой при кипячении в среде 95% этилового спирта. После двух перекристаллизаций из смеси бензола с гексаном получено 0,26г МТ-КМО с Т.пл. 179-180°С и Rf=0,4 при ТСХ в системе хлористый метилен-метанол (95:5).УФ (в спирте): 250нм (15500). ИК (в вазелиновом масле): 1730 (СООН), 1640 (C=N) и 3440 (ОН).

2.2.1.2. Конъюгироеание карбоксипроизводных гаптенов анаболических агентов с белками-носителями

Синтезированные Гп (карбоксипроизводные анаболических агентов) конъюгиро-вали с молекулами белков-носителей пептидными связями методом смешанных ангидридов (МСА) и карбодиимидным методом (КДМ). Следует отметить, что конденсация Гп с белками идет в водной среде при рН 8-9. Нужные значения рН поддерживаются с помощью водных растворов сильных оснований, что не исключает создания более высоких значений рН при их передозировке. Этот фактор не важен при конъюгировании Гп, производных уксусной и аминоуксусной кислот. Однако при конъюгировании лабильных гемисукцинатов это может играть определяющее значение. Тем не менее, при работе в мягких условиях (рН 7-7,2, Т=4-5°С) конъюгат был получен нами даже из такого наиболее лабильного соединения, как 17а-этинилэстрадиол-3-гемисукцинат.

При проведении конъюгирования, в зависимости от количества взятого в реакцию Гп, были получены конъюгаты с различной эпитопной плотностью (содержащие различное количество молекул Гп на моль белка) (табл. 1). Использование МСА, как правило, позволяло получать конъюгаты с большей эпитопной плотно-

стью по сравнению с КДМ (табл. 1), что дает преимущества при иммунизации животных. По-видимому, это обусловлено тем, что смешанные ангидриды обладают большей реакционной способностью, чем активированные эфиры, используемые в КДМ.

Важно отметить, что оба способа получения конъюгатов практически исключали возможность олигомеризации в ходе конъюгирования, что нередко наблюдается при использовании для этих целей глутарового и других альдегидов.

Таблица 1

Физико-химические свойства конъюгатов карбоксипроизводных ДЭС и

анаболических стероидов с БСА

Молярное соотноше- Метод Хмакс, Кол-во молекул

Гаптен ние белка/гаптена синтеза нм гаптена на моль

при синтезе белка в конъюгате

1/10 2

ДЭС-КМ 1/25 КДМ 281 8

1/50 11

ДЭС-КМ 1/60 МСА 281 23

1/10 3

ЭТЭ-ГС 1/25 КДМ 268 7

1/50 12

КМ-ЭТЭ 1/20 МСА 282 9

1/60 21

ТБ-ГС 1/50 КДМ 350 4

ТБ-ГС 1/60 МСА 350 22

17ß-TB-KMO 1/50 КДМ 323 9

17ß-TB-KMO 1/60 МСА 323 24

НТ-ГС 1/60 МСА 242 23

17ß-19-HT-KMO 1/50 КДМ 250 17

МТ-КМО 1/75 КДМ 250 14

2.2.1.3. Конъюгировапие кленбутерола с белками-носителями

Кленбутерол (КБ) (рис. 6) конъюгировали с белками без предварительной модификации молекулы методом диазотирования.

(СН3)3СШСН2СН-\-N112 (АгКН2)

НО -(1)

Рис. 6. Структура кленбутерола

Синтез конъюгата основан на диазотировании исходного ароматического амина (I) путем обработки его соляной кислотой и нитритом натрия с получением промежуточного диазосоединения (рис. 7, II).

1) ArNH2 + HCL + NaN02~ (I)

ArN =N • (П) ■

+CL" + NaCL

ArN=N (II) •

+CL" + HO

(III)

^NHCO -Ьц^

HO-

AtN==N

\ .✓

NHCO CH2CH ^Белок

Белок ■

CONH'

(IV)

Рис. 7. Схема коньюгирования кленбутерола с белками методом диазотирования

На втором этапе водный раствор белка (III) обрабатывали диазосоединением (II) и получали коиъюгат КБ с белком (рис. 7, IV). Метод основан на конденсации диа-зосоединения с остатками тирозина в молекуле белка. В меньшей степени возможно образование конъюгатов КБ по аминогруппам гистидина.

2.2.2. Оптимизация условий экспрессного определения анаболических агентов иммунохимическими методами

2.2.2.1. Скрининг активности и специфичности иммунных сывороток

На синтезированные иммуногены (конъюгаты Гп анаболиков с белками) были получены специфичные поликлональные AT путем многократной иммунизации кроликов по схеме, приведенной в разделе 2.1.

Активность полученных сывороток контролировали методом непрямого твердофазного ИФА. Сыворотки титровали с двойным шагом разведения. Рабочим считали разведение сыворотки, при котором показатель оптической плотности при длине волны 492 нм (ОП492) находился в пределах 1,0 ± 0,2.

Специфичность сывороток проверяли в НКТ ИФА. Показателем специфичности сыворотки в НКТ ИФА является % связывания AT с твердофазным антигеном. Показатель процента связывания AT рассчитывали путем определения отношения оптических плотностей растворов сыворотки (контроль) и сыворотки с добавлением для конкурентного связывания AT растворов анаболика с различными концентрациями (опыт), выраженного в %. Среди тестированных сывороток выбирали те, которые имели наибольшую специфичность наряду с достаточно высокой активностью.

В таблице 2 приведены данные НКТ ИФА для наиболее специфичных сывороток, полученных от кроликов, иммунизированных конъюгатами Гп анаболиков с БСА, при использовании для конкурентного связывания растворов анаболиков с концентрацией 10 нг/мл. Для большинства иммуногенов сыворотки с высокой активностью получали уже через 3-4 месяца после иммунизации, но их специфичность возрастала на протяжении 8-12 месяцев иммунизации. Однако для конъюгата ДЭС-БСА, наиболее высокие активность и специфичность были достигнуты только через 1,5 года после начала иммунизации.

Таблица 2

Активность и специфичность сывороток, полученных при иммунизации кроликов коиъюгатами гаптенов анаболиков с ЕСА_

Конъюгат № сыворотки* Разведение сыворотки ОП492 % связывания АТ

19-НТ-БСА 7/9 16000 1,0 19,0

7/10 8000 0,8 20,0

КБ-БСА 12/12 8000 0,9 26,1

12/11 800 1,3 12,0

ДЭС-БСА 2/18 8000 1,3 20,7

2/20 4000 1,1 18,0

МТ-БСА 15/5 4000 0,8 30,0

15/9 4000 1,1 47,9

ЭТЭ-БСА 23/4 4000 1,2 30,0

23/6 3200 1,1 50,0

48/8 6400 1,1 30,0

ТБ-КМО-БСА 39/3" 6000 1,0 30,0

39/8" 3200 0,9 41,0

ТБ-ГС-БСА 49/9'" 800 1,2 50,0

44/11"* 800 1,0 48,0

52/12*** 3200 1,2 12,0

числитель — порядковый номер кролика, знаменатель — количество введений антигена; сыворотка специфична к (5-ТБ; сыворотка реагировала с а-ТБ и Р-ТБ.

2.2.2.2. Выбор твердофазного антигена и оптимизация условий его иммобилизации на носителе

Одним из определяющих факторов, обеспечивающих успешное проведение конкурентного твердофазного гетерогенного ИФА, является иммобилизация твердофазного антигена (ТФА) на носителе — полистироле. На эффективность сенсибилизации ячеек полистироловых планшетов антигеном оказывает влияние множество факторов, главными из которых являются: концентрация и природа сенсибилизирующего ТФА, условия инкубации и качество самого полистирола.

В качестве ТФА для сенсибилизации ячеек планшетов использовали конъюгаты Гп анаболиков с бычьим сывороточным альбумином (БСА) и желатиной (Ж). При синтезе ТФА использовался гомологичный тип связывания Гп с макромолекулами белков, т.е. тот же подход к конъюгированию (через активацию карбоксильной группы Гп гормонов или аминогруппы КБ), как и при получении иммуногенов. Использование различных белков (соответственно БСА и Ж) при синтезе иммуногенов и ТФА позволило увеличить чувствительность определения всех анаболиков (табл. 3). Максимальная чувствительность анализа была достигнута при концентрации ТФА 0,05 мкг/мл, сенсибилизированного на полистироловом планшете в течение 1 часа при 37°С и инкубации иммунной сыворотки с ТФА в этих же условиях.

Таблица 3

Зависимость чувствительности определения анаболиков методом НКТ ИФА

от выбора ТФА

ТФА Концентрация Разведение ОП490 % связывания

ТФА, м кг/мл сыворотки AT

Ж-19-НТ 0,05 16000 1,2 9,4

БСА-19-НТ 0,05 16000 0,9 49,0

ж-дэс 0,05 8000 1,4 22,2

БСА-ДЭС 0,05 8000 1,3 40,7

Ж-МТ 0,05 4000 1,1 10,2

БСА-МТ 0,05 4000 0,4 47,9

Ж-КБ 0,05 8000 1,3 10,0

БСА-КБ 0,05 8000 0,9 26,1

Ж-ЭТЭ 0,05 6400 1,0 21,0

БСА-ЭТЭ 0,05 6400 0,9 29,0

Ж-ТБ 0,05 3200 1,2 12,0

БСА-ТБ 0,05 3200 1,0 77,0

Проведение ИФА на планшетах разного производства (фирм «Costar» (США), «Dynatech» (Германия) и «ВНИИ медполимер (Россия)) выявило преимущество использования планшетов фирмы «Costar», обеспечивающих максимальный уровень окраски конечного продукта реакции (ОП492) при минимальных значениях коэффициента вариации (менее 3%).

2.2.2.3. Проверка чувствительности и специфичности ИФА тест-систем

Проверку чувствительности ИФА тест-систем проводили в условиях проведения реакции (концентрация ТФА и способ его иммобилизации на носителе, условия инкубации иммунной сыворотки с ТФА, производитель планшетов для ИФА), оптимизированных на предыдущем этапе исследований. Результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4

Чувствительность определения анаболических агентов методом НКТ ИФА

Анаболик Разведение сыворотки Чувствительность метода, нг/л

ДЭС 8000 12,5

19-НТ 16000 12,5

мт 4000 100,0

КБ 8000 10,0

ТБ 3200 100,0

ЭТЭ 6400 50,0

Чувствительность большинства разработанных тест-систем практически не уступала, а в ряде случаев (для КБ и 19-НТ) существенно превосходила (соответственно в 10 и 16 раз) аналогичные показатели тест-систем компании «R-Biopharm GmbH»

(Германия), зарегистрированных на территории ЕС под торговой маркой ЯГОАЯ-СБШЕИ®.

Специфичность тест-систем выражали в относительных процентах связывания перекрестно реагирующего вещества, по сравнению с основным веществом (анаболиком, для определения которого предназначена тест-система) в точке, обеспечивающей 50% уровень связывания АТ. Полученные данные суммированы в таблице 5.

Таблица 5

Специфичность определения анаболиков методом НКТ ИФА_

Назначение Реагирующее вещество Относительный

тест-системы % связывания

диэтилстильбэстрол 100

Определение ДЭС гексэстрол 56

диенэстрол 7

эстрадиол-17р 0,5

17р-19-нортестостерон 100

17р-тренболон 1,6

Определение 19-НТ тестостерон 1,3

эстрадиол-17р 0,1

17а-метилтестостерон <0,001

17а-метилтестостерон 100

17р-19-нортестостерон 1,5

Определение МТ тестостерон 1,0

эстрадиол-17р 0,7

17р-тренболон 0,6

кленбутерол 100

Определение КБ сальбутамол 20

тербуталин 15

адреналин 0,3

17Р-тренболон 100

17а-тренболон 124

Определение ТБ 17р-19-нортестостерон 1,6

тестостерон 0,01

эстрадиол-17р 0,006

17а-этинилэстрадиол 100

эстрадиол-17р 0,35

Определение ЭТЭ 17Р-тренболон 0,2

17а-метилтестостерон <0,01

тестостерон <0,0001

прогестерон <0,0001

17Р-19-нортестостерон <0,0001

диэтилстильбэстрол <0,0001

Разработанные тест-системы обладали высокой специфичностью. Наряду с этим, тест-система для определения ДЭС позволяла обнаруживать и другие запрещенные производные стильбена — гэксэстрол, перекрестная реактивность с которым составила 56% и диенэстрол - 7%, а тест-система для определение кленбутерола - Р-адреностимуляторы фенольного — сальбутамол (перекрестная реактивность 20%) и резорцинового - тербуталин (15%) типа.

2.2.2.4. Разработка способов подготовки проб биосубстратов для экспрессного определения анаболиков методом ИФА

Для того чтобы воспользоваться всеми преимуществами, которые представляет проведение скринингового анализа, необходимо разработать простые и экономичные способы подготовки образцов. При этом нужно учитывать фундаментальные отличия между методами иммуноанализа и традиционными химическими методами, обусловленные необходимостью обеспечения оптимальных условий для нормального функционирования антител.

Большинство анаболических соединений плохо растворяются в воде, поэтому после экстрагирования аналитов органическими растворителями, их необходимо перевести в растворитель, отрицательное влияние которого на функционирование антител минимально. Наиболее хорошо для этих целей подходит метанол. Учитывая эти факторы, были разработаны оптимальные способы извлечения и очистки анаболических веществ (ДЭС, 19-НТ, МТ, ТБ, ЭТЭ и КБ) из биологических жидкостей, органов, тканей животных и кормов для последующего определения методом НКТ ИФА.

Для контроля за использованием анаболических стимуляторов роста в процессе выращивания животных наиболее рационально определять эти вещества в моче, так как концентрация и сроки обнаружения анаболиков в моче, как правило, существенно превосходят аналогичные показатели для крови. При этом необходимо учитывать, что экскреции анаболиков из организма животного с мочой предшествует метаболическая конъюгация с образованием водорастворимых эфиров с глюкуроно-вой и серной кислотами. Исходя из этого, на первом этапе были оптимизированы условия предварительного гидролиза конъюгированных форм анаболических стероидов и производных стильбена в моче, учитывая особенности метаболизма у различных видов животных. У лошадей большая часть анаболических стероидов и стильбенов метаболизируется с мочой в форме конъюгатов с серной кислотой, а у жвачных животных, свиней и человека - с глюкуроновой. Для гидролиза конъюгированных форм стероидов и стильбенов в моче животных использовали пищеварительный сок моллюска Helix pomatia, обладающий глюкуронидазной и сульфатаз-ной активностями. Учитывая, что глюкуронидаза сохраняет высокую активность в широком диапазоне температур (4-80°С) и рН (от 4 до 7), а сульфатаза очень чувствительна к изменению этих параметров, были подобраны условия (продолжительность гидролиза - 15 часов при Т=52°С и рН 5,0±0,2), обеспечивающие эффективный гидролиз конъюгатов анаболиков как с глюкуроновой, так и серной кислотами. Высокая эффективность гидролиза сульфатированных форм стероидов в предложенных условиях показана на примере определения свободного 19-НТ в моче ло-

шадей после экспериментального применения препарата ЬаигаЬоНп®, содержащего в своем составе в качестве действующего вещества лаурат 19-НТ.

Следующий этап исследований был посвящен разработке оптимальных способов извлечения и очистки стероидов и производных стильбена из мочи животных после ферментативного гидролиза конъюгатов. Для решения этой задачи провели сравнительное изучение влияния ТФЭ и жидкостно-жидкостной экстракции различными органическими растворителями (метанолом, дихлорметаном, ТБМЭ, гекса-ном, бутанолом, трихлорметаном) на степень извлечения анаболиков из проб мочи и уровень неспецифического фона в контроле. Хотя использование ТФЭ для дополнительной очистки образцов позволяло получать хорошие результаты, эта стадия существенно увеличивает стоимость анализа и создает дополнительные трудности для практических ветеринарных лабораторий при недостаточной квалификации персонала. Учитывая это, были предложены простые и экономичные способы экстракции анаболических стероидов и стильбенов из гидролизованной мочи, основанные на традиционной жидкостной экстракции растворителями без использования ТФЭ для дополнительной очистки проб. Для большинства гормонов и ДЭС наилучшие результаты получены при последовательной экстракции их смесью гек-сан/бутанол (4/1) и 75% метанолом, а для ЭТЭ - трихлорметаном после доведения рН гидролизованной мочи до 7,0. Степень извлечения из мочи ДЭС, МТ и 19-НТ составила более 70%, ЭТЭ - 80%, ТБ - 90%.

Правильность результатов, получаемых с использованием разработанных способов пробоподготовки, продемонстрирована при сравнительном определении 19-НТ экспресс-методом ИФА и подтверждающим методом ГХ-МС в образцах мочи лошадей после экспериментального применения препарата ЬаигаЬоНп® (табл.6).

Таблица 6

Определение содержания 19-НТ в моче лошадей методами ИФА и ГХ-МС

после экспериментального применения препарата Laurabolin®

Время после инъекции препарата, сут. Содержание 19-нортестостерона, мкг/л

Жеребец «Быстрый» Мерин «Эльбион»

ИФА ГХ-МС ИФА ГХ-МС

контроль 3,7 3,4 0 0

2 15,3 14,8 5,0 Н/о

4 33,2 30,7 14,2 14,0

6 18,3 20,2 13,4 19,4

14 2,2 Н/о* 0,14 Н/о

28 2,0 Н/о 0 Н/о

* - не определяли.

Результаты определения 19-НТ с помощью разрабатываемой тест-системы в образцах мочи животных с добавками анаболика были ближе к истинному содержанию гормона в моче, чем полученные при использовании коммерческой тест-системы RIDASCREEN®19-Nortestosteron фирмы «R-Biopharm GmbH» (Германия),

в которой для подготовки проб мочи использовался метод ТФЭ на картриджах с ок-тадецилсиланом (табл. 7).

Определение КБ в моче животных проводили без предварительного гидролиза конъюгатов, т. к. для р-адреностимуляторов анилинового типа вероятность образования конъюгатов относительно низка.

Таблица 7

Правильность определения 19-НТ в моче животных методом ИФА

Вид животного Добавлено, мкг/л Оп ределено, мкг/л

Разрабатываемая ИФА тест-система Тест-система «КЮАЗСКЕЕИ® 19-Nortestosteron»

Лошадь 1,6 1,8±0,5 3,8+0,8

Бычок 1,6 1,1 ±0,2 3,9+0,5

Телка 1,6 1,7+0,3 4,1+0.6

КБ экстрагировали смесью этилацетат/изопропанол (3:2) после доведения рН мочи щелочным 0,1М трис-буфером до значений выше показателя константы ионизации (рКа) КБ (>9), что позволяло депротонировать аминогруппу КБ перед экстракцией органическими растворителями. Предложенный способ обеспечивал извлечение из мочи животных более 70% КБ. Для проверки правильности результатов, получаемых с использованием этого способа пробоподготовки, определяли содержание КБ методами ИФА и ГХ-МС в моче бычков, получавших препарат с кормом и стандартном образце ЕС — лиофилизированной моче теленка с аттестованным содержанием КБ. Разработанный способ пробоподготовки обеспечивал хорошую сходимость результатов определения КБ в моче бычков экспресс-методом ИФА и подтверждающим методом ГХ-МС, соответственно, 3,01±1,10 мкг/л и 2,60±0,72 мкг/л. Результат количественного определения КБ в стандартном образце находился в пределах аттестованного диапазона, что подтверждает правильность результатов определения КБ в моче методом ИФА с использованием этого способа пробоподготовки (табл. 8).

Таблица 8

Определение КБ в аттестованном стандартном образце ЕС - ВСЯ 504 (лиофи-

лизированной моче теленка) методом ИФА

Характеристика Содержание КБ в стандартном образце, мкг/л Аттестованный диапазон, (Р=0,90, п=17)

Нижний предел, мкг/л Верхний предел, мкг/л

Паспортные данные 6,01 5,50 6,63

Определено методом ИФА 5,7 ± 0,5

Оптимизацию условий извлечения синтетических анаболических стероидов и ДЭС из мышечных тканей животных проводили, сравнивая 7 различных способов экстракции и предварительной очистки экстрактов. В результате проведенных исследований был разработан эффективный и экономичный способ подготовки мышечной ткани для определения остаточного содержания 19-НТ, МТ, ТБ и ДЭС

методом НКТ ИФА, заключающийся в гомогенизации образца в 0,067М фосфатном буфере с нейтральным рН, жидкостной экстракции анаболиков метанолом на УЗ-бане, обезжиривании экстрактов гексаном и последующей экстракции определяемых веществ ТБМЭ. Этот способ обеспечил максимальную степень извлечения анаболиков из мышечной ткани (70-91%) при минимальном уровне фона в контроле при постановке ИФА.

При определении ЭТЭ большое влияние на степень извлечения гормона оказывала величина рН. Наилучшие результаты получены при гомогенизации образца мышечной ткани в 0,1М ацетатном буфере с рН 5,2 и экстракции ЭТЭ трихлормета-ном (табл. 9).

Таблица 9

Влияние рН на степень извлечения ЭТЭ из мышечной ткани трихлорметаном

Субстрат рН Разведение экстракта % связывания AT в контроле Степень извлечения ЭТЭ, %

Мышечная 1,0 1/10 100 39

ткань 5,2 1/16 93 72

7,0 1/10 100 31

В печени животных анаболические стероиды и производные стильбена определяли методом ИФА после ферментативного гидролиза коньюгированных форм пищеварительным соком моллюска Helix pomatia в условиях (14-16 часов при Т=52°С и рН 5,0±0,2), ранее оптимизированных для мочи и экстракции аналитов из гидро-лизатов способами, разработанными для мышечной ткани.

Учитывая, что производные стильбена могут применяться с кормами, был предложен простой и экономичный способ определения ДЭС в кормах методом ИФА после предварительной экстракции пробы 75% метанолом, обеспечивающий извлечение 95% определяемого вещества.

При определении остаточных количеств КБ в мышечной ткани, печени и сетчатке глаза животных, образцы тканей гомогенизировали в 0,2М ацетатном буфере (рН 5,2) с добавлением 0,1М хлорной кислоты для осаждения балластных белков матрицы. КБ экстрагировали смесью этилацетат/изопропанол (3:2) после доведения рН щелочью до значения (9,8) выше показателя константы ионизации (рКа) р-агониста. Предложенный способ позволял экстрагировать более 95% КБ из органов и тканей животных.

Учитывая особенности метаболизма КБ, способность накапливаться и длительно удерживаться в тканях, содержащих меланин, эффективный мониторинг за использованием этого анаболика в животноводстве может осуществляться по определению его остаточного содержания в шерсти и сетчатой оболочке глаза животных. При этом шерсть следует использовать для прижизненного контроля за применением КБ в животноводстве. После убоя предпочтение необходимо отдавать определению р-адреностимуляторов в сетчатке глаза, так как в отличие от шерсти, глаз не может быть контаминирован этими препаратами извне. Оптимизацию условий извлечения КБ из этих матриц проводили на образцах с добавками препарата, а также шерсти и сетчатке глаза животных, получавших КБ с кормом.

Результаты определения остаточного содержания КБ в сетчатке глаза бычков, получавших препарат с кормом, экспресс-методом ИФА (9,97 ± 0,77 мкг/кг) были сопоставимы с данными, полученными арбитражным методом ГХ-МС (10,30 ± 1,53 мкг/кг).

Определение остаточного содержания КБ в шерсти животных проводили после предварительного гидролиза образцов 5н ЫаОН при температуре 95°С с последующей экстракцией аналита смесью этилацетат/изопропанол (3:2). В результате проведенных исследований оптимизированы условия проведения щелочного гидролиза шерсти (масса образца — 0,1 г, количество щелочи — 2,5 мл, продолжительность гидролиза - 10 минут), позволившие обеспечить эффективную экстракцию КБ из матрицы (степень извлечения « 80%) и минимизировать неспецифический фон в контроле при проведении ИФА. Установлено, что эффективность экстракции КБ из гидролизата шерсти смесью этилацетат/изопропанол (3:2) существенно выше, чем ТБМЭ. Правильность результатов, получаемых с применением этого способа про-боподготовки, подтверждена арбитражным методом — ГХ-МС (табл. 10).

Таблица 10

Определение содержания кленбутерола методами ИФА и ГХ-МС в шерсти _экспериментальных животных, получавших препарат с кормом_

Условия эксперимента Концентрация КБ, мкг/кг

ИФА ГХ-МС

0,1 г шерсти кролика + 2,5мл 5н ИаОН, гидролиз 10 мин при 95°С + экстракция смесью этилацетат/изопропанол (3:2) 5,6 + 1,3 5,9 ±1,1

0,1 г шерсти кролика + 2,5мл 5н КаОН, гидролиз 10 мин при 95°С + экстракция ТБМЭ 3,3 ±1,6

0,1 г шерсти бычка + 2,5мл 5н №ОН, гидролиз 10 мин при 95°С + экстракция смесью этилацетат/изопропанол (3:2) 34,9 ± 4,6 34,0 ± 3,2

Экспериментально установлено, что эффективное определение КБ в кормах с помощью разработанной тест-системы может осуществляться после экстракции его водой (степень извлечения > 95%) и не требует дополнительной очистки экстракта перед проведением ИФА.

2.2.3. Разработка подтверждающих (арбитражных) методик определения анаболических агентов в биосубстратах с помощью ГХ-МС

2.2.3.1. Извлечение и очистка стероидов, производных стильбена из биосубстратов для определения методом ГХ-МС

Большинство исследований по подтверждению наличия анаболиков в биосубстратах выполнены на магнитных секторных масс-спектрометрах высокого разрешения или квадрупольных анализаторах. Главными недостатками магнитных секторных масс-спектрометров является их дороговизна и сложность в эксплуатации, а

масс-спектрометры, оснащенные одинарным квадрупольным анализатором, часто не позволяют получить достаточное количество идентифицирующих критериев (>4) для надежной идентификации анаболических веществ.

Учитывая вышеизложенное, для разработки арбитражных методик определения анаболических агентов в наших исследованиях использовался хроматомасс-спектрометр типа «ионная ловушка», отличающийся доступной ценой, простотой в эксплуатации и обеспечивающий получение достаточного количества идентифицирующих критериев для подтверждающего анализа за счет возможности работы в режиме тандемной масс-спектрометрии (МС/МС). Использование режима МС/МС на масс-анализаторах этого типа позволяет существенно повысить чувствительность и надежность определения анаболиков, а значит и обеспечить их обнаружение в течение значительно более длительного периода после применения. Однако необходимо учитывать, что получение хорошо воспроизводимых результатов на таких масс-спектрометрах может быть обеспечено только при соблюдении повышенных требований к чистоте проб, позволяющих максимально снизить влияние так называемых «матричных эффектов», характерных для «ионных ловушек» (Лебедев А.Т., 2003). Для достижения необходимой степени очистки экстрактов использовали метод ВЭЖХ, обеспечивший надежную идентификацию и количественное определение гормонов методом ГХ-МС.

Оптимизацию способов извлечения и очистки анаболиков из биосубстратов проводили на образцах с внесенными добавками стандартных образцов аналитов и их дейтерированных аналогов для исключения ошибки количественного определения, обусловленной неполным извлечением определяемых веществ из матрицы.

Проведено сравнительное изучение эффективности 6-ти способов экстракции стероидов и производных стильбена из мышечной ткани животных для дальнейшего определения арбитражным методом ГХ-МС. Целью исследований на этом этапе был подбор растворителя и условий экстракции, обеспечивающих количественное извлечение определяемых веществ из матрицы, разрушение связей между аналитами и белками матрицы, а также минимально возможное извлечение сопутствующих примесей из биосубстратов.

Использование при экстракции гормонов из мышечной ткани тепловой обработки пробы для удаления балластных белков матрицы приводило к частичной потере определяемых веществ с осадком денатурированных белков. Замена этой стадии протеолизом мышечной ткани субтилизином А (3 ч при pH 9,5 и Т= 55°С) с последующей экстракцией стероидов и производных стильбена из подкисленного гидро-лизата ТБМЭ обеспечила увеличение степени извлечения определяемых веществ до 87-93%.

Арбитражное определение стероидов и производных стильбена в печени, почках, моче и желчи животных проводили после предварительного гидролиза конъюгиро-ванных форм анаболиков с глюкуроновой и серной кислотами. В моче и желчи животных эти соединения определяли методом ГХ-МС после ферментативного гидролиза конъюгатов ферментами пищеварительного сока моллюска Helix pomatia в условиях, ранее оптимизированных для экспресс-метода ИФА (Т=52°С, pH 5,2 и t= 15 часов), извлечения и очистки анаболиков из гидролизатов методами ТФЭ и ВЭЖХ. Применение этого способа подготовки проб обеспечивало извлечение более 90%

стероидов и производных стильбена из мочи и 80% из желчи животных и приемлемую степень очистки экстрактов для ГХ-МС. Однако использование этих же режимов для гидролиза конъюгированных форм анаболиков в печени и почках животных приводило к уменьшению степени извлечения гормонов до 40-55%, а 17а-ТБ — 35%. Снижение температуры гидролиза с 52°С до 37°С позволило увеличить степень извлечения этих соединений из печени и почек животных до 80-90%. Этот феномен отмечали только при гидролизе конъюгатов анаболиков в печени и почках, но не в моче животных. Экстракцию и очистку свободных форм стероидов и производных стильбена из гидролизатов проводили способом, оптимизированным для мышечной ткани.

На следующем этапе была разработана методика подтверждающего определения стероидов и производных стильбена в жировых тканях, включающая экстракцию определяемых веществ ацетонитрилом, упаривание экстракта, перерастворение его в метаноле, обезжиривание экстракта гексаном, очистку методами ТФЭ, ВЭЖХ и количественное определение стимуляторов методом ГХ-МС. Степень извлечения стероидов из жировой ткани этим способом составила 83 ± 15%, производных стильбена - 85 ±11%.

Экспериментально установлено, что определение стероидов и производных стильбена в кормах методом ГХ-МС может проводиться после экстракции анали-тов 80% метанолом с последующим обезжириванием экстракта гексаном и очисткой методами ТФЭ и ВЭЖХ (степень извлечения стероидов - 93 ± 6%, производных стильбена - 91 ± 8%).

Дополнительную очистку экстрактов перед ГХ-МС проводили методами ТФЭ и ВЭЖХ на обращеннофазном сорбенте (октадецилсилане). На стадии ТФЭ потери аналитов не превышали 10%. Для элюирования свободных форм анаболических стероидов и производных стильбена при ТФЭ использовали 80% водный раствор метанола. Необходимо учитывать, что коньюгированные формы анаболических стероидов и стильбенов элюируются с сорбента при концентрации метанола 20-40%, что может приводить к их частичной потере на стадии промывки картриджа для ТФЭ в случае недостаточно эффективного предварительного гидролиза конъюгатов. Из анализируемых соединений первым элюировался тренболон, а последним -прогестерон. Потери тренболона при проведении ТФЭ могут быть индикатором неоптимальных условий промывки твердофазного сорбента, а потери прогестерона указывают на недостаточный объем элюента или низкую концентрацию в нем метанола. Эти параметры особенно важно учитывать при тестировании новой партии сорбента для ТФЭ.

Использование ВЭЖХ для дополнительной очистки экстрактов увеличивало чувствительность и надежность определения анаболиков, что очень важно для подтверждающего анализа. Во всех опубликованных работах, посвященных использованию ВЭЖХ для очистки проб перед ГХ-МС анализом, ввод проб в ВЭЖХ систему осуществлялся посредством традиционных петлевых инжекторов, существенно ограничивающих объем вводимых образцов (Clouet A. et al., 1997; Daeseleire Е. et al., 1998; Prévost S. et al., 2001). Необходимость упаривания пробы требовала использования неводных элюентов при ТФЭ, что значительно усложняло процесс очи-

стки. В наших исследованиях, вместо петли, в инжектор устанавливали предколон-ку «MetaGuard Intersil ODS 3» с обращеннофазовым сорбентом (Cis), что позволило концентрировать на ней водный экстракт (перед переключением инжектора в систему), полученный непосредственно после ТФЭ пробы. Подобный подход сделал некритичным объем водного экстракта образца, получаемый на стадии ТФЭ, привел к значительному упрощению процедуры очистки и увеличению чувствительности определения за счет возможности концентрирования экстрактов.

2.2.3.2. Разработка способов извлечения и очистки P-адреностимуляторов из биосубстратов для определения методом ГХ-МС

При разработке арбитражного мультиметода одновременного определения в образце p-адреностимуляторов анилинового, фенольного и резорцинового типа возникают объективные трудности, обусловленные большими различиями в полярности и особенностями метаболизма этих соединений. Кленбутерол, мапентерол, цимбу-терол и другие Р-агонисты анилинового типа практически не образуют конъюгиро-ванных форм с глюкуроновой и серной кислотами, а для соединений фенольного (сальбутамол) и резорцинового (тербутапин) типа характерно образование полярных глюкуронидов и сульфатов во второй фазе метаболизма (Boyd D. et al., 1996). Учитывая эти факторы, были предприняты попытки разработать методику, применимую для экстракции из органов, тканей и биологических жидкостей всех типов Р-адреностимуляторов. Высокая степень извлечения p-адреностимуляторов анилинового (85-89%), фенольного и резорцинового (75-95%) типа из органов, тканей и биологических жидкостей животных была достигнута путем очистки фильтрованных гидролизатов методом ТФЭ на картриджах с комбинированным сорбентом «Bonde-sil CERTIFY» после протеолиза мышечной ткани щелочной протеазой и осаждения балластных белков 50% хлорной кислотой или ферментативного гидролиза конью-гированных форм P-адреностимуляторов в печени, почках, моче и сетчатке глаза животных пищеварительным соком Helix pomatia. Наилучшие результаты обеспечивало проведение ферментативного гидролиза коньюгированных форм р-адреностимуляторов ферментами Helix pomatia в течение 14-16 часов при рН 4,85,2 и температуре 37-40°С. Увеличение температуры гидролиза до 50-52°С приводило к снижению степени извлечения определяемых веществ из матрицы и увеличению количества примесей в экстрактах.

Для арбитражного определения остаточного содержания p-адреностимуляторов в шерсти животных методом ГХ-МС была предложена методика пробоподготовки, заключающаяся в предварительном щелочном гидролизе шерсти при 85°С, экстракции р-агонистов анилинового типа ТБМЭ, фенольного и резорцинового типа — смесью этилацетат/изопропанол (3:2) и очистки экстрактов методом ТФЭ.

Подтверждающее определение p-адреностимуляторов в кормах методом ГХ-МС можно проводить после экстракции аналитов 0,01М соляной кислотой на УЗ-бане, обезжиривания экстракта гексаном и очистки методом ТФЭ.

Для дополнительной очистки экстрактов p-адреностимуляторов методом ТФЭ использовали картриджи «BondElut» фирмы «Varían» (США) с комбинированным сорбентом «Bondesil CERTIFY». Эффективность этого сорбента при одновременном

определении в одной пробе ß-адреностимуляторов анилинового, фенольного и резорцинового типа, сильно отличающихся между собой по полярности, объясняется входящими в его состав обращеннофазовым (октилсилан) и ионообменным (бензол-сульфонилпропилсилан) компонентами, позволяющими одновременно использовать два механизма разделения определяемых веществ — гидрофобное взаимодействие и ионный обмен. В результате проведенных исследований были оптимизированы факторы, оказывающие определяющее влияние на эффективность ТФЭ ß-агонистов.

На первом этапе доведение pH образца до 6,0 перед нанесением на картридж приводило к уменьшению примесей, которые экстрагировались вместе с аналитами за счет неполярных взаимодействий. Несмотря на то, что при pH 6,0 все ß-агонисты находятся в ионной форме, октилсилан способен задерживать их за счет взаимодействий с третбутильными группировками на алифатическом конце молекулы. При этом октилсилан обеспечивал лучшую селективность по сравнению с более широко используемым октадецилсиланом (Qs) при концентрировании молекул со средней полярностью. Более высокая полярность октальных радикалов по сравнению с октадецильными позволяла многим загрязняющим примесям, которые оставались бы на Cis сорбенте, проходить через Cg сорбент.

Промывание сорбента раствором уксусной кислоты обеспечивало хорошую селективность процесса, так как в этих условиях положительно заряженные молекулы ß-агонистов взаимодействовали с отрицательно заряженными группами бензол-сульфонилпропилсилана. Последующая промывка сорбента метанолом приводила к удалению нейтральных примесей. На этой стадии определяющим является объем метанола. Экспериментальным путем установлено, что если при промывке картриджа 1,5 мл метанола не наблюдалось потерь аналитов, увеличение объема метанола до 3 мл приводило к потере 20% , а до 5 мл — более 50% ß-агонистов анилинового типа.

Оптимизация условий элюирования аналитов показала, что для ß-агонистов анилинового типа было достаточно 5 мл элюирующего раствора, а стимуляторы фенольного и резорцинового типа смывались с сорбента при объеме элюента 15мл с концентрацией аммиака не менее 3%. Введение в элюат аммиака приводило к нейтрализации аминогрупп ß-адреностимуляторов, разрушению ионных связей и гидрофобных взаимодействий, что обеспечивало вымывание аналитов из картриджа. Наилучшие результаты получены при использовании в качестве элюента изопропа-нола с 3% аммиака.

2.2.3.3. Оптимизация способов дериватизации и условий хроматографического разделения анаболиков для определения методом ГХ-МС

При определении анаболических агентов подтверждающим методом ГХ-МС проводили дериватизацию (химическую модификацию) полярных (окси-, кето-, ами-но-) групп в молекулах стимуляторов перед анализом, что позволяло улучшить эффективность хроматографического разделения определяемых веществ, повысить из летучесть и термостабильность. Различные способы дериватизации неодинаково влияли на интенсивность фрагментации дериватов при масс-спектрометрии в режимах ионизации ЭУ и МС/МС, что имеет принципиальное значение для обеспечения

высокой чувствительности количественного определения и идентификации определяемых веществ.

Одним из часто применяемых способов дериватизации молекул анаболических стероидов и производных стильбена, является ацилирование ГФМА. Однако в связи с тем, что молекулярные ионы дигептофтормасляных производных большинства анализируемых соединений (m/z: ДЭС - 660, гексэсторола — 662, диенэстрола - 658, 17Р-эстрадиола - 664, 19-НТ - 666, 17р-тестостерона - 680, ТБ - 664) находятся за пределами диапазона сканирования (< 650 а.е.м.) используемого в работе масс-спектрометра («Saturn 2000»), вместо ГФМА мы применяли ПФПА. При этом 17ß-тестостерон, 17ß-19-нортестостерон, диенэстрол, ДЭС и 17Р-эстрадиол были получены в виде дипроизводных, а 17а-метилтестостерон, прогестерон, гексэстрол, 17а-этинилэстрадиол, ацетат болденона и ацетат мегестрола — монопроизводных ПФПА (табл. 11).

Таблица 11

Сравнительная оценка способов дериватизации стероидов и _ производных стильбена__

ГФМ ПФП тмс МО/ТМС

Соединение произвоные производные проиводные производные

Моно Ди Моно Ди Моно Ди Моно Ди

17 ß-Тестостерон + + + + 60/40

17 ß-19-Нортестостерон + + + + 60/40

17а-Мети лтестостерон + + + + 60/40

Прогестерон + + + к 60/40

17р-Эстадиол + +

17а-Этинилэстрадиол + + +

Болденона ацетат + + +

Мегестрола ацетат + + +

Диэтилстильбэстрол + + +

Диенэстрол + + +

Гексэстрол + + +

Тренболон - - - - - - + 60/40

«+» - оптимальные условия дериватизации с преобладанием в конечной реакционной смеси ди-или монозамещенного производного;

«-« - условия дериватизации, не приводящие к образованию преобладающего производного; «60/40» - соотношение 5уп- и ап^-изомеров МО/ТМС производных .

Этот способ прост в исполнении, а масс-спектры пентафторпропионовых (ПФП) производных стероидов и производных стильбена в режиме ионизации ЭУ хорошо фрагментированы, что в большинстве случаев позволяет получать достаточное число идентифицирующих критериев (> 4) для подтверждающего анализа. Достаточно низкая энергия диссоциации молекулярных ионов ПФП производных обеспечивает получение необходимого количества дочерних ионов при тандемной масс-спектрометрии в режиме ионизации ЭУ.

Силилирование наиболее широко используется для дериватизации молекул анаболиков перед ГХ-МС анализом. Наряду с очевидными недостатками этого способа дериватизации по сравнению с ацилированием: сложность, трудоемкость, минимальная фрагментация ТМС производных в режиме ионизации ЭУ, не позволяющая получать необходимое число диагностических критериев для подтверждающего анализа, он обладает одним существенным преимуществом — позволяет существенно увеличить чувствительность определения за счет высокой интенсивности в масс-спектрах ионов с большой массой (с m/z > 400). При этом в качестве базовых пиков в масс-спектрах ЭУ ТМС производных стероидов и стильбенов обычно выступают молекулярные, [М-Ме]+ и [М-ТМСОН]+ ионы. Исключением является масс-спектр ЭУ ТМС производного гексэстрола, в котором максимальной абсолютной интенсивностью обладает ион с m/z 207, образующийся в результате расщепления центральной С-С связи в молекуле.

При силилировании принципиальное значение имеет способ получения ТМС производных. Так, если для получения ТМС эфиров анаболиков, содержащих фе-нольные или спиртовые группы (производные стильбена, эстрадиол) можно использовать МСТФА, то ТМС эфиры кетостероидов и соединений, содержащих пространственно ограниченные оксигруппы (МТ), получали с применением в качестве катализаторов ТМИС или йодистого аммония. В составе ТМИС кремний играет роль сильной кислоты, а йод - мягкого основания. Этот реагент легко вступает в реакцию с органическими веществами, содержащими кислород, образуя устойчивую Si-O связь. На следующем этапе йод играет роль сильного нуклеофильного агента (донора электронов), разрушая С-О связи.

MO/TMS syn-^enbc 1 one /MO/TMS ant i —t ren bolone ~ / Б Ii !

L—

Рис.8. Хроматограммы ТМС производных (А) и МО/ТМС производных (Б) ТБ

Наиболее проблемным соединением является ТБ. При силилировании ТБ из-за наличия трех сопряженных двойных связей в молекуле образуется ряд ТМС производных, затрудняющих количественное определение этого гормона (рис. 8, А)

Дериватизация ТБ с получением метилоксим/триметилсилилового (МО/ТМС) производного позволила решить эту проблему. При этом проводили блокирование А-кольца ТБ образованием оксима по кетогруппе в 3-ем положении с последующим силилированием оксигруппы в 17-положении >1,Н-бис-триметилсилилтрифторацета-мидом (БСТФА) (рис. 9, Б).

240

266

340

371

' J........4...... ■ ■ а.......*...... *....... *

СНз/ОН

МЬОСНз 60 °С 60 мин

qi3/ou

IIjC—о—

п3с—о—

БСГФА 60ftC 30 мин

аьо—si(ci(j)3

Рис.9. Масс-спектр ЭУ(А) и схема дериватизации (Б) МО/ТМС производного ТБ

При этом способе дериватизации МО/ТМС производные ТБ получены в виде соотношения 60/40 хроматографически однородных syn- и anti- изомеров (рис. 8, Б)

Масс-спектр ЭУ МО/ТМС производного ТБ содержит 4 диагостических иона: молекулярный ион с m/z 371 и 3 наиболее интенсивных иона с m/z: 340, 266 и 240, что достаточно для подтверждающего определения анаболических соединений в соответствии с международными требованиями (Решение Комиссии ЕС 2002/657) (рис.9, А).

Масс-спектры ЭУ МО/ТМС производных кетостероидов сильно фрагментиро-ваны, что позволяет использовать этот способ дериватизации для идентификации тех стероидов, которые не дают достаточного количества характерных ионов в масс-спектрах ТМС производных (17р-тестостерон, 19-НТ, прогестерон), (табл.12). Благодаря более низкой энергии диссоциации по сравнению с ТМС производными, МО/ТМС производные кетостероидов хорошо подходят для тандем ной масс-спектрометрии.

Диагностические ионы масс-спектров ЭУ различных дериватов анаболических стероидов и производных стильбена приведены в таблице 12.

Таблица 12

Диагностические ионы масс-спектров ЭУ дериватов стероидов и стильбенов

Соединение Способ дериватизации

ТМС, м/г МО/ТМС, м/г ПФП, м/г

17Р-тестостерон 209/417/432 268/358/374/389 401/417/565/580

17Р-тестостерон/с12 419/434 270/360/376/391 403/419/567/582

17Р-19-нортестостерон 418/400 254/285/344/375 256/402/566

17Р-19-нортестостерон/с1з 421 257/288/347/378 256/405/569

17а-метилтестостерон 301/341/356/446 305/319/415/430

17а-метилтестостерон/ <1з 301/344/359/449

Прогестерон 458 273/286/341/372 375/427/445/460

17Р-эстрадиол 285/326/416 285/326/416 237/359/401/564

Этинилэстрадиол 285/425/440 285/425/440 381/396/409/424

Болденона ацетат 206/325/386/400 317/386/414/474

Диэтилстильбэстрол 217/383/397/412 217/383/397/412 291/397/531/560

Диэтилстильбэстрол <1б 220/386/400/418 220/386/400/418 294/403/534/566

Диенэстрол 381/395/410 381/395/410 395/530/543/558

Диенэстрол сЬ 382/397/412 382/397/412 397/530/545/560

Гексэстрол 207/399 207/399 225/253/281

Тренболон 240/266/340/371

Для количественного определения р-адреностимуляторов методом ГХ-МС использовали силилирование МСТФА/ТМИС/ДТЭ (1000/5/5) и БСТФА/ТМХС (1000/10). Если применение смеси БСТФА/ТМХС приводило к образованию моно-ТМС производных р-агонистов анилинового типа по оксигруппе, то силилирование с применением катализатора (ТМИС) - ди-ТМС производных этих веществ за счет модификации и первичной аминогруппы в бензольном кольце.

Основные диагностические ионы масс-спектров ЭУ ТМС производных р-адреностимуляторов приведены в табл. 13. Главным недостатком этого способа де-риватизации является то, что молекулярные ионы ТМС производных Р-адреностимуляторов нестабильны при ионизации ЭУ и отсутствуют в масс-спектрах. Учитывая это, для повышения надежности идентификации р~ адреностимуляторов использовали тандемную масс-спектрометрию и комбинированный способ дериватизации, заключающийся в получении на первом этапе циклических метилборатных (МБ) производных анализируемых соединений путем проведения реакции конденсации с метилборной кислотой (МБК) или триметилборок-сином (ТМБ) и силилировании молекул на следующем этапе смесью БСТФА/ТМХС. Дериватизация КБ ТМБ протекала с циклизацией этаноламинового радикала, а сальбутамол дополнительно образовывал цикл с участием ароматического кольца. МБ производные фенотерола и тербуталина не могли быть проанализированы методом ГХ-МС из-за присутствия дополнительных гидроксильных групп в фенольном кольце в мета-положении, пространственное расположение которых не позволяло протекать процессу циклизации (рис. 10).

Таблица 13

Диагностические ионы масс-спектров ЭУ ТМС производных ß-агонистов

Соединение Кол-во ТМС Мол. масса ТМС Диагностические ионы,

групп в мол. производного m/z

Кленбутерол 1 348 86/243/262/333

Кпенбутерол de 1 354 92/246/262/339

Кленбутерол 2 420 86/300/335/405

Кленбутерол d6 2 426 92/300/335/411

Сальбутамол 3 455 86/294/369/440

Сальбутамол de 3 461 92/295/369/446

Тербуталин 3 442 86/356/371/426

Мапентерол 1 396 100/277/291/296

Мапентерол 2 469 100/364/369/453

Цимбутерол 1 305 86/200/219/234

Цимбутерол d9 1 314 95/206/219/234

Цимбутерол 2 377 86/272/291/362

Цимбутерол de, 2 386 95/278/291/371

Дериватизация ß-адреностимуляторов МБК наряду с очевидным преимуществом — большей стабильностью циклических МБ производных, приводящей к доминированию в спектрах ионов с высоким значением m/z, имеет и ряд недостатков: невозможность анализа соединений, содержащих в фенольной части молекулы ок-сигруппы в метаположении (фенотерол, тербуталин), зависимость протекания реакции от параметров работы инжектора и условий ввода пробы, плохая форма хрома-тографических пиков МБ производных ß-агонистов, что снижает чувствительность анализа.

Рис. 10. Схема синтеза циклических МБ производных ß-агонистов

34 Основные диагностические ионы масс-спектров ЭУ МБ производных ß-

адреностимуляторов приведены в табл. 14. Таблица14

Диагностические ионы масс-спектров ЭУ МБ производных ß-агонистов

Соединение Кол-во МБ Мол. масса МБ Диагностические ио-

групп в молекуле производного ны, m/z

Кленбутерол 1 300 243/245/285/287

Кленбутерол d6 1 306 246/248/288/290

Сальбутамол 2 287 229/230/271/272

Сальбутамол d6 2 293 232/233/274/275

Мапентерол 1 348 277/279/291/319

Цимбутерол 1 257 158/200/241/242

Цимбутерол d9 1 266 159/206/247/248

Использование анализатора типа «ионная ловушка» в режиме тандемной масс-спектрометрии обеспечивало максимальную чувствительность анализа и получение необходимого количества диагностических ионов силилированных производных ß-агонистов для их надежной идентификации. Например, для КБ наилучшее результаты были получены в MC3 эксперименте при нерезонансной активации иона с m/z 300 (полученного в результате диссоциации кластера ионов ди-ТМС производного КБ с m/z 334-337), приводящее к образованию трех ионов следующего поколения с m/z: 210, 226 и 284 (рис. 11). Наличие 3-х дочерних ионов в МС/МС эксперименте соответствует 1,5 х 3 = 4,5 идентифицирующим критериям, что достаточно для подтверждающего определения анаболических веществ в соответствии с международными требованиями (Решение Комиссии ЕС 2002/657)

Рис. 11. МС3 масс-спектр ЭУ ди-ТМС производного КБ при нерезонансной активации иона с т/г 300 (А) и схема фрагментации ди-ТМС производного КБ в МС, МС2, МС3, МС" экспериментах (Б)

Оптимизация условий хроматографического разделения анаболиков показала, что для анаболических стероидов и производных стильбена наилучшая селективность была достигнута на более полярной капилярной кварцевой колонке «CP-Sil 24 СВ low bleed/MC» («Varían», США) с фактором полярности 24, по сравнению с колонкой «CP-Sil 8 СВ low bleed/MC» («Varían», США), в то время, как при анализе (3-адреностимуляторов, ни одна из вышеприведенных колонок не давала принципиальных преимуществ.

Таким образом, на этом этапе исследований были оптимизированы условия дери-ватизации и хроматографического разделения анаболических агентов, позволяющие проводить их надежную идентификацию и количественный анализ методом ГХ-МС.

2.2.4. Метрологическая аттестация арбитражных масс-спектрометрических методик определения анаболических агентов в биосубстратах 2.2.4.1. Оценивание неопределенности измерения

В соответствии со статьей 13 Закона РФ «Об обеспечении единства измерений» сфера распространения государственного метрологического контроля и надзора включает ветеринарию и здравоохранение, а в соответствии со статьей 9 этого закона все измерения должны выполняться с применением аттестованных методик. В ГОСТ Р 8.563 аттестация методик выполнения измерений (МВИ) определена как процедура установления и подтверждения соответствия МВИ предъявляемым к ней метрологическим требованиям. Основная цель проведения аттестации МВИ - подтверждение возможности выполнения измерений в соответствии с процедурой, регламентируемой в методике с характеристиками погрешности (неопределенности) измерений, не превышающими указанных в документе на МВИ. С целью гармонизации отечественных и международных подходов к оценке качества результатов измерений при проведении аттестации разработанных арбитражных методик определения анаболических веществ в биосубстратах результаты выполнения измерений характеризовали неопределенностью измерения.

Неопределенность измерения — это параметр, связанный с результатом измерения и характеризующий разброс значений, которые с достаточным основанием могут быть приписаны измеряемой величине. В аналитической химии обычно используют расширенную неопределенность — величину, определяющую интервал вокруг результата измерения, в пределах которого, с определенным уровнем достоверности, содержится большая часть значений, которые могут быть приписаны измеряемой величине.

Метрологическая аттестация разработанных методик масс-спектрометрического определения анаболических стероидов, производных стильбена и р-адреностимуляторов в биосубстратах была проведена по результатам их метрологической экспертизы, выполненной Московским институтом экспертизы и испытаний Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии и расчетно-экспериментального оценивания неопределенности измерения на основе определения основных показателей, характеризующих эффективность методик (прецизионность, сходимость, воспроизводимость, смещение) в соответствии с Руководством

Европейского общества по аналитической химии (ЕВРАХИМ) и Международной организации по сотрудничеству в области прослеживаемости измерений в аналитической химии (СИТАК): «Количественное описание неопределенности в аналитических измерениях».

В результате метрологической аттестации разработанных методик были получены формулы для расчета расширенной неопределенности измерения массовой доли X (мкг/кг) анаболических стероидов и производных стильбена в биосубстратах методом ГХ-МС:

V = 0,15-Х0,76 (мкг/кг),

а также расширенной неопределенности измерения массовой доли X (мкг/кг) р-адреностимуляторов:

V = 0,12-Х0'71 (мкг/кг).

Предел обнаружения массовой доли индивидуальных анаболических веществ в различных биосубстратах составил 0,1 — 0,5 мкг/кг. Разработанные методики обеспечивают выполнение измерений массовой доли анаболиков с коэффициентом вариации 10 — 25% в зависимости от содержания определяемого вещества в исследуемом объекте ( табл. 15).

Таблица 15

Метрологические характеристики хроматомасс-спектрометрических методик

определения анаболических агентов в биосубстратах

Массовая доля анаболика, мкг/кг Коэффициент вариации, %

от 0,10 до 1,00 включительно 25

свыше 1,00 до 10,00 включительно 15

свыше 10,00 10

Параметры эффективности разработанных методик превышали показатели, рекомендованные Codex Alimentarius для аналитических методов, используемых в программах ФАО ООН (табл. 16).

Таблица 16

Параметры эффективности аналитических методов, используемых в _программах ФАО ООН (Codex Alimentarius,1993)_

Концентрация, мкг/кг Коэффициент вариации, % Степень извлечения, %

< 1 35 не регламентируется

> 1 ¿10 30 от 60 до 120

>10<100 20 от 70 до 110

> 100 15 от 80 до 110

2.2.4.2. Контроль правильности результатов измерения содержания анаболиков в биосубстратах с использованием международных аттестованных стандартных образцов

Для подтверждения правильности результатов измерений, получаемых с использованием разработанных методик, проводили контроль смещения (степени близости

полученных результатов к истинному (аттестованному) значению) результатов количественного химического анализа с использованием аттестованных стандартных образцов ЕС (BCR 475 — лиофилизированной печени теленка с аттестованным содержанием а-тренболона, CRM 389 - лиофилизированной мочи теленка с аттестованным содержанием ДЭС, BCR 649 — лиофилизированной печени теленка с аттестованным содержанием кленбутерола, BCR 504 — лиофилизированной мочи теленка с аттестованным содержанием кленбутерола и сапьбутамола) в соответствии с алгоритмом расчета, приведенным в Руководстве ЕВРАХИМ/СИТАК. Результаты количественных измерений признавали удовлетворительными при условии выполнения неравенства:

|х*,с-х*,а| * Pl+ul (1Ь

где:^

Х*,с — массовая доля к -го соединения в анализируемой пробе;

Хка - аттестованное содержание к -го соединения в стандартном образце;

икс — расширенная неопределенность с коэффициентом охвата 2 результата количественного анализа к -го соединения, полученного при соблюдении требований аттестованных методик (икс = 0,15хХ*,с°'76- для стероидов и производных стильбена, = 0,12хХ*,с°'71-для р-адреностимуляторов); ика — расширенная неопределенность с коэффициентом охвата 2 аттестованного значения к -го соединения в стандартном образце.

Идентификацию аналитов в стандартных образцах проводили с соблюдением всех международных требований, регламентируемых Решением Комиссии ЕС 2002/657. Для идентификации каждого из анаболических веществ, необходимо обеспечить наличие минимум 4-х идентифицирующих критериев. Количество диагностических ионов, необходимое для получения 4-х идентифицирующих критериев в различных масс-спектрометрических методах можно рассчитать исходя из данных, приведенных в табл. 17.

Таблица 17

Соотношение между количеством диагностических ионов, полученных различными масс-спектрометрическими методами и числом идентифицирующих критериев (Решение Комиссии ЕС 2002/657)

Масс-спектрометрический метод Число идентифицирующих крите-

риев, получаемых на 1 ион

Масс-спектрометрия низкого разрешения 1,0

Тандемная масс-спектрометрия (МС/МС):

ион предшественник 1,0

дочернин ион 1,5

Относительные интенсивности диагностических ионов анализируемой пробы (в % от интенсивности максимального иона в спектре) должны отличаться от таковых для калибровочного стандарта в пределах допустимых отклонений, приведенных в табл. 18.

Таблица 18

Допустимые отклонения относительных интенсивностей дагностических

ионов пробы и калибровочного стандарта (Решение Комиссии ЕС 2002/657)

Относительная интенсивность диагностического иона, % Допустимые отклонения относительных ионных интенсивностей

ГХ-МС (ЭУ) ГХ-МС"

> 50 % ± 10% ± 20 %

>20% до 50% ± 15 % ± 25 %

> 10 % до 20 % ± 20 % ± 30 %

<10% ± 50 % ± 50 %

Идентификацию а-тренболона (а-ТБ) в аттестованном стандартном образце ЕС BCR 476 (лиофилизированной печени теленка) проводили методом тандемной хро-матомасс-спектрометрии с нерезонансной диссоциацией молекулярного иона МО/ТМС производного а-ТБ с m/z 371. В результате было получено 6 дочерних ионов с m/z: 340, 281, 266, 249, 240 и 209 (рис. 12). Идентифицирующие критерии получены на 3-х наиболее интенсивных дочерних ионах с m/z: 340, 281, 240 (1,5 • 3 = 4,5 идентифицирующих критерия в соответствии с табл. 17).

281

240 249

3D sis

m/z 281

CjHjpSi

Б _ CH, OSi(CHj),

m/z 266 f

(m - 90)

m/z 371 си, о si(CHj),

гr*> m,z 340

(M-31)

C„H„N02Si

i (m-131) ch.o s,(chs)1

m/2 249 ^н3о31(сн3ь 4 mlz 240 CjH^osi

HsC-OH C,H,NO

m/z209r^i'"\

CHjO , "

HjC-oI-N^syok^J

:nH,sNO CHjO Si|CH,)s

Рис. 12. MC/MC масс-спектр ЭУ (А) и схема фрагментации (Б) МО/ТМС производного тренболона при нерезонансной активации молекулярного иона с m/z 371

Расчеты относительных ионных интенсивностей диагностических ионов МО/ТМС производного а-ТБ в калибровочном растворе и аттестованном стандартном образце ВСК 476 (в % от интенсивности максимального иона в спектре) показали, что они находились в допустимых пределах (табл. 19).

Таблица 19

Относительные интенсивности диагностических ионов МО/ТМС производного а-ТБ в стандартном образце ВСК 475 и калибровочном растворе

при МС/МС масс-спектрометрии

Показатель Диагностические ионы, m/z

240 281 371 340

Относительная интенсивность диагностических ионов в масс-спектре стандартного образца, % 26 48 67 100

Относительная интенсивность диагностических ионов в масс-спектре калибровочного раствора, % 28 50 68 100

Отклонения ионных интенсивностей, % -7 -4 -1,5 0

Допустимые отклонения ионных интенсивностей, % ±25 ±25 ±20 -

Таким образом, в аттестованном стандартном образце BCR 476 был идентифицирован а-ТБ.

Количественное определение а-ТБ в аттестованном стандартном образце проводили методом ЭУ в режиме селективного удерживания ионов с изоляцией ионов с m/z: 371 (молекулярный ион), 340, 266 и 240. Количественные расчеты осуществляли по сумме площадей пиков син- и анти-изомеров МО/ТМС производных а-ТБ. Аттестованное содержание а-ТБ в стандартном образце 7,6 мкг/кг при расширенной неопределенности измерения 2,2 мкг/кг. Степень извлечения а-ТБ из стандартного образца составила 86 ± 4%. С учетом извлечения, найденная концентрация а-ТБ -8,7 мкг/кг. Результаты определения а-ТБ в стандартном образце согласуются с неравенством (I):

8,7 -7,6<; л/2,22 + 0,15 х 8,70,76 , 1,1 <2,37

Таким образом, результаты количественного определения а-ТБ в стандартном образце можно признать удовлетворительными.

Аналогичная методология была использована при идентификации и количественном определении анаболических агентов в других стандартных образцах. Идентификация всех аналитов в стандартных образцах была проведена с соблюдением международных требований. Результаты количественного определения анаболиков в стандартных образцах находились в пределах аттестованных диапазонов, что подтверждает правильность результатов измерений, получаемых с использованием разработанных методик.

ВЫВОДЫ

1. Создана система обеспечения безопасности продукции животноводства при использовании анаболических стимуляторов роста животных, включающая экспресс-определение основных представителей синтетических эстрогенов (диэтил-стильбэстрола, этинилэстрадиола), андрогенов (19-нортестостерона, тренболона, 17-метилтестостерона) и (З-адреностимуляторов (кленбутерола) в кормах, организме животных и продукции животного происхождения методом иммуноферментного анализа и подтверждающий анализ анаболиков в подозрительных образцах, показавших положительные результаты в ИФА, арбитражным методом хроматомасс-спектрометрии.

2. Разработаны новые способы синтеза гаптенов низкомолекулярных анаболических агентов с функциональными карбоксильными группами, позволившие получить иммуногены путем конъюгирования их с белками методами, исключающими возможность олигомеризации в процессе синтеза. Впервые синтезированы карбок-сипроизводные диэтилстильбэстрола - 4-[1-этил-2(4-гидроксифенил)-1-бутенил]фе-ноксиуксусная кислота и этинилэстрадиола - 0-[19-нор-17а-этинил-17р-гидрокси-прегна-1,3,5(10)-триен-3-ил]гликолевая кислота и на их основе созданы оригинальные иммуногены.

3. Получены поликлональные антитела, специфичные как для избирательного определения индивидуальных синтетических стероидов (19-нортестостерона, 17-метилтестостерона, 17-этинилэстрадиола, тренболона), так и группового анализа близких по структуре анаболиков: производных стильбена и Р-адреностимуляторов.

4. Оптимизированы показатели: структура иммуногенов, титр иммунных сывороток, концентрация и природа твердофазных антигенов, условия сенсибилизации носителя твердофазным антигеном и инкубации с ним антител, обеспечивающие высокую чувствительность и специфичность определения анаболиков методом непрямого конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа. Чувствительность большинства разработанных тест-систем практически не уступала, а в ряде случаев (для кленбутерола — в 10 раз, а 19-нортестостерона — в 16 раз) превосходила показатели зарубежных аналогов.

5. Для экспрессного определения анаболических агентов методом иммуноферментного анализа разработаны простые и экономичные способы их извлечения из биологических жидкостей, органов, тканей животных, кормов и оптимизированы условия ферментативного гидролиза коньюгированных форм этих соединений с серной и глюкуроновой кислотами. Правильность получаемых результатов показана на образцах биосубстратов с внесенными добавками определяемых веществ и путем определения остаточного содержания стимуляторов в биологических жидкостях, органах, тканях экспериментальных животных, получавших анаболики.

6. Предложены эффективные методики экстракции анаболических стероидов, производных стильбена из биосубстратов, очистки и концентрирования экстрактов методом ВЭЖХ, дающие возможность проводить их надежную идентификацию и количественное определение в организме животных и продукции животного происхождения методом ГХ-МС на масс-спектрометрах типа «ионная ловушка» с пределом обнаружения 0,1- 0,5 мкг/кг.

7. Разработана методика, обеспечивающая одновременное хроматомасс-спектрометрическое определение в биосубстратах p-адреностимуляторов анилинового, фенольного и резорцинового типов путем очистки образцов оптимизированным способом твердофазной экстракции на картриджах с комбинированным обра-щеннофазовым и ионообменным сорбентом после протеолиза мышечной ткани субтилизином А или ферментативного гидролиза коньюгированных форм анаболиков в печени, почках, моче и сетчатке глаза животных пищеварительным соком Helix pomatia.

8. Оптимизированы способы дериватизации и условия хроматографического разделения анаболических агентов, позволяющие проводить их надежную идентификацию и количественный анализ методом ГХ-МС в режимах полного ионного тока, селективного удерживания ионов и тандемной масс-спектрометрии.

9. Создана оригинальная библиотека масс-спектров электронной ионизации дериватов анаболических стероидов, производных стильбена, p-адреностимуляторов и их дейтерированных аналогов, которая может быть использована для идентификации этих веществ на масс-спектрометрах типа «ионная ловушка» с внутренним источником ионизации.

10. С целью гармонизации отечественных и международных подходов к оценке качества результатов количественного химического анализа впервые оценена расширенная неопределенность измерения массовой доли анаболических стероидов, производных стильбена и p-адреностимуляторов в биосубстратах методом хрома-томасс-спектрометрии. Проведена метрологическая аттестация хроматомасс-спектрометрических методик подтверждающего определения анаболических агентов в биосубстратах. Правильность результатов измерения, получаемых с использованием аттестованных методик, продемонстрирована путем идентификации и количественного определения анаболиков в международных аттестованных стандартных образцах.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

В рамках созданной системы контроля за применением анаболических стимуляторов роста в животноводстве и определения их остаточного содержания в животноводческой продукции разработаны и зарегистрированы Россельхознадзором ИФА тест-системы для экспрессного определения этих ксенобиотиков в биосубстратах. Тест-системы успешно прошли комиссионные испытания и организовано их серийное производство в Российской Федерации. На тест-системы составлена, согласована и утверждена в установленном порядке нормативная документация:

1. Технические условия на тест-систему «Диэтилстильбэстрол-ИФА» (ТУ 9398031-11361534-2005).

2. Инструкция по применению тест-системы, «Диэтилстильбэстрол-ИФА», утверждена Россельхознадзором 30.11.2005 г., per. № ПВР-1-1.5/01467.

3. Технические условия на тест-систему «19-Нортестостерон-ИФА» (ТУ 9398032-11361534-2005).

4. Инструкция по применению тест-системы, «19-Нортестостерон-ИФА», утверждена Россельхознадзором 30.11.2005 г., per. № ПВР-1-1.5/01470.

5. Технические условия на тест-систему «Тренболон-ИФА» (ТУ 9398-03311361534-2005).

6. Инструкция по применению тест-системы, «Тренболон-ИФА», утверждена Россельхознадзором 30.11.2005 г., per. № ПВР-1-1.5/01469.

7. Технические условия на тест-систему «Метилтестостерон-ИФА» (ТУ 9398034-11361534-2005).

8. Инструкция по применению тест-системы, «Метилтестостерон-ИФА», утверждена Россельхознадзором 30.11.2005 г., per. № ПВР-1-1.5/01468.

9. Технические условия на тест-систему «Этинилэстрадиол-ИФА» (ТУ 9398-03511361534-2005).

10. Инструкция по применению тест-системы, «Этинилэстрадиол-ИФА», утверждена Россельхознадзором 06.12.2005 г., per. № ПВР-1-1.5/01486.

11 .Технические условия на опытную партию на тест-систему «Кленбутерол-ИФА» (ТУ 9398-001-00494189-2004).

12.Временное наставление по применению тест-системы «Кленбутерол-ИФА» для количественного определения кленбутерола методом иммуноферментного анализа, утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхоза России 07.05.2004 г., № 13-5-02/1060.

13.Технические условия на тест-систему «Кленбутерол-ИФА» (ТУ 9398-03011361534-2005).

14.Инструкция по применению тест-системы «Кленбутерол-ИФА», утверждена Россельхознадзором 30.11.2005 г., per. № ПВР-1-1.5/01471.

Для подтверждающего определения анаболических агентов в «подозрительных» образцах, показавших положительные результаты в ИФА, разработаны, утверждены Управлением ветеринарии Федерального агентства по сельскому хозяйству и аттестованы Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии арбитражные методики определения массовых долей анаболических стероидов, производных стильбена и Р-адреностимуляторов методом ГХ-МС:

1. «Методические указания по определению массовой доли анаболических стероидов и стильбенов в кормах, физиологических жидкостях, органах и тканях животных методом газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектором», утверждены Управлением ветеринарии Федерального агентства по сельскому хозяйству 10.10.2005 г., № 5-1-14/987, Свидетельство об аттестации МВИ № 3-2005 от 25.01.2005 г.

2. «Методические указания по определению массовой доли р-агонистов в кормах, физиологических жидкостях, органах и тканях животных методом газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектором», утверждены Управлением ветеринарии Федерального агентства по сельскому хозяйству 10.10.2005 г., № 5-114/991, Свидетельство об аттестации МВИ № 4-2005 от 25.01.2005 г.

Для профессиональной переподготовки специалистов государственной ветеринарной службы и предприятий агропромышленного комплекса издано методическое пособие: «Контроль за содержанием ветеринарных препаратов в кормах и продукции животноводства». — М.: Пищепромиздат, 2003. — 76 с.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Комаров, А.А. Методы оценки качества и безопасности кормов и кормовых добавок /Комаров А.А. //Ветеринария. -2001. - № 1. - С. 51-56.

2. Комаров, А.А. Использование р-агонистов в животноводстве в качестве стимуляторов роста / Комаров А.А. // Сельскохозяйственная биология-2002,- № 4-С.12-20.

3. Комаров, А.А. Определение ветеринарных препаратов в животноводческой продукции / Комаров А.А., Панин А.Н. // Ветеринария. - 2002. - № 11. - С. 40-43.

4. Патент РФ № 2192408 Способ получения замещенной арилоксиуксусной кислоты / Комаров А.А., Панин А.Н., Писков В.Б. // Приоритет от 12.05.2000. Опубликован 10.11.2002 Бюл. № 31.

5. Патент РФ № 2193566 Способ получения моноэфира янтарной кислоты из 17-оксистероида и янтарного ангидрида / Комаров А.А., Панин А.Н., Писков В.Б. // Приоритет от 12.03.2001. Опубликован 27.11.2002 Бюл. № 33.

6. Патент РФ № 2214995 Способ получения о-арилгликолевых кислот/ Комаров А.А., Панин А.Н., Писков В.Б. // Приоритет от 19.06.2002. Опубликован 27.10.2003 Бюл. № 30.

7. Патент РФ № 2218351 Конъюгат [19-нор-17а-этинил-17р-гидрокси-прегна-1,3,5(10)триен-3-ил]оксиуксусной кислоты с бычьим сывороточным альбумином для иммунохимического способа определения этинилэстрадиола / Комаров А.А., Панин А.Н. // Приоритет от 19.06.2002. Опубликован 10.12.2003 Бюл. № 34.

8. Патент РФ № 2218352 Конъюгат 4-[1-этил-2(4-гидроксифенил)-бутен-1-ил]феноксиуксусной кислоты с бычьим сывороточным альбумином для иммунохимического способа определения диэтилстильбэстрола / Комаров А.А., Панин А.Н., Буркин А.А. // Приоритет от 19.06.2002. Опубликован 10.12.2003 Бюл. № 34.

9. Комаров, А.А. Контроль за содержанием ветеринарных препаратов в кормах и продукции животноводства: Методическое пособие для профессиональной переподготовки работников предприятий АПК / А.А. Комаров. — М.: Пищепромиздат, 2003. - 76 с.

10. Комаров, А.А. Анаболические гормоны в животноводстве: метаболизм и методы определения / Комаров А.А. // Сельскохозяйственная биология.- 2003. - №4 — С.З - 20.

11. Сравнительная оценка способов дериватизации анаболических агентов при определении их методом хроматомасс-спектрометрии / Комаров А.А., Крапивкин Б.А., Благодатских C.B., Панин А.Н. // Доклады РАСХН. - 2003.- № 4. - С.41-44.

12. Komarov A. Protein conjugates for screening determination of stilbenes and some anabolic steroids by enzyme linked immunosorbent assay / Komarov A., Vylegzanina Y., Panin A. // Proceedings of the 9th International Congress of The European Association for Veterinary Pharmacology and Toxicology: Journal of Veterinary Pharmacology and Therapeutics. - 2003. - V.26, suppl. 1. - P. 298 - 299.

13. Komarov A. Screening method for determination of p2-agonist residues in feeding stuffs and livestock production / Komarov A., Vylegzanina Y., Panin A. // Proceedings of the 9th International Congress of The European Association for Veterinary Pharmacology

and Toxicology: Journal of Veterinary Pharmacology and Therapeutics. - 2003. — V.26, suppl. l.-P. 299.

14. Комаров, A.A. Масс-спектрометрические и скрининг-методы определения остатков лекарственных препаратов в продукции животноводства / Комаров А.А. // Международный Форум «Аналитика и аналитики»: Каталог рефератов и статей. — Воронеж. - 2003. - Т. 2. - С. 382.

15. Комаров, А.А. Определение и идентификация нортестостерона и его метаболитов в моче лошадей методом газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием / Комаров А,А., Крапивкин Б.А. // Материалы 11-го Московского международного ветеринарного конгресса - М - 2003.- С. 289-290.

16. Комаров, А.А. Синтез гаптенов для иммуноферментного метода определения стильбенов в животноводческой продукции / Комаров А.А. // Материалы 11-го Московского международного ветеринарного конгресса — М.-2003.-С. 314 - 315.

17. Комаров, А.А. Дериватизация анаболических стероидов, стильбенов и бета-агонистов при анализе их газовой хроматографией — масс-спектрометрией / Комаров А.А., Крапивкин Б.А., Благодатских С.В. // Материалы 11-го Московского международного ветеринарного конгресса,- М.-2003.-С. 315-316.

18. Комаров, А.А. Получение иммуногена для определения 17-метилтестостерона в животноводческой продукции методом ИФА I Комаров А.А. // Материалы 11-го Московского международного ветеринарного конгресса — М.—2003.—С. 316.

19. Комаров, А.А. Получение иммуногенов для определения анаболических 17-оксистероидов в животноводческой продукции иммунохимическими методами / Комаров А.А. // Материалы 11-го Московского международного ветеринарного конгресса,-М.-2003.-С. 316-317.

20. Отработка условий ИФА для определения остаточных количеств р2-агонистов в кормах и животноводческой продукции / Комаров А.А., Вылегжанина Е.С., Край-нюченко Т.В., Латышев О.Е. // Материалы 11-го Московского международного ветеринарного конгресса.— М—2003.-С. 317 — 318.

21. Получение иммунореагентов для определения остаточных количеств стильбенов и некоторых анаболических стероидов с помощью ИФА / Комаров А.А., Вылегжанина Е.С., Крайнюченко Т.В., Латышев О.Е. // Материалы 11-го Московского международного ветеринарного конгресса.—М.-2003-С. 318 - 319.

22. Комаров, А.А. Скрининг- метод определения остаточных количеств анаболиков / Комаров А.А., Вылегжанина Е.С., Панин А.Н. // Материалы II Московского международного конгресса: «Биотехнология: состояние и перспективы развития». — М.: ЗАО «ПИК «Максима», РТХУ им. Д.И. Менделеева. - 2003. - 4.1. - С. 246.

23. Комаров, А.А. Методы контроля анаболиков в продукции животноводства / Комаров А.А., Вылегжанина Е.С., Панин А.Н. // Материалы 7-го Всероссийского конгресса: «Здоровое питание населения России». - М. — 2003. - С.251.

24.Комаров, А.А. Отработка скрининг-метода для количественного определения анаболических стильбенов в продукции животноводства / Комаров А.А., Вылегжанина Е.С., Буркин А.А. // Материалы 7-го Всероссийского конгресса: «Здоровое питание населения России». - М. - 2003. — С.252.

25. Комаров, А.А. Безопасные корма — первое звено в обеспечении безопасности продовольствия / Комаров А.А., Панин А.Н., Вылегжанина Е.С. // Материалы 7-го

Всероссийского конгресса: «Здоровое питание населения России». - М. - 2003. -С.395.

26. Комаров, A.A. Новые направления в нелегальном использовании анаболических агентов в животноводстве и пути их контроля / Комаров A.A., Вылегжанина Е.С., Панин А.Н. // Материалы II международной науч. конф.: «Научно-технический прогресс в животноводстве России - ресурсосберегающие технологии производства экологически безопасной продукции животноводства» / ВНИИ животноводства, РУЭЦ. - Дубовицы. - 2003. - Ч. 1. - С. 291.

27. Комаров, A.A. Контроль содержания анаболиков в продукции животноводства / Комаров A.A., Вылегжанина Е.С. // Сб. науч. тр. ВГНКИ / Под ред. академика РАСХН А.Н. Панина - М.: Компания Спутник +. - 2003. - Т.64. - С. 276 - 287.

28. Комаров, A.A. Иммунохимический метод определения стильбенов, анаболических синтетических стероидов и р2-агонистов в продукции животноводства / Комаров A.A., Вылегжанина Е.С. // Сб. науч. тр. ВГНКИ. / Под ред. академика РАСХН А.Н. Панина - М.: Компания Спутник +. - 2003. - Т.64. - С. 287 - 295.

29. Комаров, A.A. Промотеры роста в животноводстве: механизмы отрицательного воздействия на человека и методы определения остатков / Комаров A.A., Вылегжанина Е.С., Панин А.Н. // Материалы международной науч. конф.: «Медико-биологические проблемы экологической безопасности агропромышленного комплекса. - Сергиев Посад. - 2003. - С. 37-38.

30. Панин, А.Н. Приоритетные задачи в обеспечении безопасности продовольствия / Панин А.Н., Комаров A.A. // Комбикорма. - 2004. - № 1. - С. 47 - 48.

31. Панин, А.Н. Качество и безопасность кормов — основа рационального кормления в птицеводстве / Панин А.Н., Комаров A.A. // Материалы 3-ей международной конф.: «Птицеводство — мировой и отечественный опыт». — М., Международная промышленная академия. - 2004. — С. 20 - 26.

32. Панин, А.Н. Приоритетные направления в обеспечении безопасности кормов и продукции животноводства / Панин А.Н., Комаров A.A., Вылегжанина Е.С. // Сб. науч. тр. МПА: Вып. I / Под ред. В.А. Бутковского. - М.: ГИОРД. - 2003. - С. 298 -315.

33. Определение 19-нортестостерона в моче лошадей двумя методами — ИФА и ГХ-МС / Комаров A.A., Вылегжанина Е.С., Крапивкин Б. А., Латышев O.E. И Материалы Всероссийского ветеринарного конгресса и XII Международного Московского конгресса по болезням мелких домашних животных. - М. - 2004. - С. 214.

34. Сравнительный анализ содержания диэтилстильбэстрола в образцах мяса, полученных с использованием нескольких способов пробоподготовки / Комаров A.A., Вылегжанина Е.С., Крапивкин Б.А., Латышев O.E. // Материалы Всероссийского ветеринарного конгресса и XII Международного Московского конгресса по болезням мелких домашних животных. — М. — 2004. - С. 231.

35. Panin A.N. Ensuring of veterinary-sanitary safety of feeds - basis of foodstuffs safety / Panin A.N., Komarov A.A. // Book of Abstracts NATO Advanced Research Work-shop «Food Safety and Security».- Lake Issyk-Kul, Kyrgyzstan.-2004,-P. 19-20.

36. Панин, А.Н. Обеспечение безопасности кормов - основа безопасности продовольствия / Панин А.Н., Комаров A.A. // Ветеринария и кормление. — 2004. - № сигнальный. — С. 8 -10.

37. Применение иммуноферментного анализа для обнаружения кленбутерола в кормах / Панин А.Н., Комаров A.A., Вылегжанина Е.С., Латышев O.E. И Материалы Второго съезда Общества биотехнологов России / Под ред. Р.Г. Василова. — М.: МАКС Пресс,-2004.-С.118- 119.

38. Комаров, A.A. Способы дериватизации бета-агонистов при анализе их методом газовой хроматографии/масс-спектрометрии / Комаров A.A., Крапивкин Б.А. // Материалы 5-ой международной науч. конф.: «Актуальные проблемы ветеринарной медицины, ветеринарно-санитарного контроля и биологической безопасности сельскохозяйственной продукции». - М.: МГУПБ. - 2004. — С. 108 - 110.

39. Комаров, A.A. Определение анаболических стероидов и стильбенов в органах и тканях животных при анализе их методом газовой хроматографии/масс-спектрометрии / Комаров A.A., Панин А.Н., Крапивкин Б.А. // Материалы 5-ой международной науч. конф.: «Актуальные проблемы ветеринарной медицины, ветери-нарно-санитарного контроля и биологической безопасности сельскохозяйственной продукции». - М.: МГУПБ. - 2004. - С. 110 - 112.

40. Тест-система ИФА для определения кленбутерола / Комаров A.A., Вылегжанина Е.С., Латышев O.E., Крапивкин Б.А. // Ветеринария. — 2004. - № 12. — С. 49 — 51.

41. Комаров, A.A. Сравнительная оценка способов дериватизации ß-агонистов при анализе их газовой хроматографией/масс-спектрометрией / Комаров A.A., Крапивкин Б.А., Панин А.Н.// Доклады РАСХН. - 2004. - № 6. - С. 45 - 48.

42. Комаров, A.A. Скрининг-метод ИФА для обнаружения кленбутерола и ди-этилстильбэстрола в кормах / Комаров A.A., Вылегжанина Е.С., Латышев O.E. // Сб. науч. тр. ВГНКИ / Под ред. академика РАСХН Панина А.Н.. - М.: ВГНКИ. - 2005. -Т. 65.-С. 225-232.

43. Панин, А.Н. Проблемы аналитического контроля безопасности кормов и продукции животноводства / Панин А.Н., Комаров A.A. // Российский химический журнал. - 2005. - Т. XLIX. - № 3. - С. 71 - 82.

44. Комаров, A.A. Разработка метода ИФА для мониторинга продукции животноводства и кормов с целью обнаружения в них некоторых синтетических анаболиков / Комаров A.A., Вылегжанина Е.С., Латышев O.E. // Материалы третьего международного симпозиума: «Современные проблемы ветеринарной диетологии и нут-рициологии». — Санкт-Петербург. - 2005. — С. 233 - 234.

45. Панин, А.Н. Безопасность кормов — основа безопасности продовольствия / Панин А.Н., Комаров A.A. // Сб. материалов науч. конф.: «Продовольственная безопасность России» . — М.: Издательский Дом НП. — 2005. — 127 — 134.

46. Обнаружение кленбутерола и диэтилстильбэстрола в кормах с помощью скрининг-метода ИФА / Комаров A.A., Вылегжанина Е.С., Латышев O.E., Панин А.Н. // Доклады РАСХН. - 2005. - № 2. - С. 45 - 46.

47. Комаров, A.A. Экстракция анаболических синтетических стероидов из органов и тканей животных для определения методом ИФА / Комаров A.A., Вылегжанина Е.С., Латышев O.E. // III международная конф.: «Экстракция органических соединений». Каталог докладов. — Воронеж. — 2005. — С. 207.

48. Комаров, A.A. Экстракция кленбутерола и диэтилстильбэстрола из кормов для определения методом ИФА / Комаров A.A., Вылегжанина Е.С., Латышев O.E. //

III международная конф.: «Экстракция органических соединений». Каталог докладов. - Воронеж. - 2005. - С. 345.

49. Комаров, A.A. Современная методология аналитического контроля безопасности кормов и продукции животноводства / Комаров A.A. // Сб. науч. тр. ФГУ «ВГНКИ» / Под ред. академика РАСХН Панина А.Н.. - М.: ВГНКИ. - 2006. - Т. 67. - С. 58 - 78.

50. Комаров, A.A. Определение синтетических анаболических стероидов и стильбенов в органах и тканях животных методом ИФА / Комаров A.A.// Сб. науч. тр. ФГУ «ВГНКИ» / Под ред. академика РАСХН Панина А.Н.. - М.: ВГНКИ. - 2006. -Т. 67.-С. 78-93.

51. Комаров, A.A. Определение синтетических анаболических стероидов в моче животных методом ИФА / Комаров A.A., Вылегжанина Е.С. // Сб. науч. тр. ФГУ «ВГНКИ» / Под ред. академика РАСХН Панина А.Н.. - М.: ВГНКИ. - 2006. - Т. 67. -С. 93-107.

52. Комаров, A.A. Определение анаболических стероидов и стильбенов в органах и тканях животных методом хроматомасс-спектрометрии / Комаров A.A., Крапив-кин Б.А. // Сб. науч. тр. ФГУ «ВГНКИ» / Под ред. академика РАСХН Панина А.Н.. -М.: ВГНКИ.-2006.-Т. 67.-С. 107- 122.

53. Комаров, A.A. Определение бета-адреномиметиков в органах и тканях животных методом хроматомасс-спектрометрии / Комаров A.A., Крапивкин Б.А. // Сб. науч. тр. ФГУ «ВГНКИ» / Под ред. академика РАСХН Панина А.Н.. - М.: ВГНКИ. -2006.-Т. 67.-С. 122-141.

54. Комаров, A.A. Скрининг-метод ИФА для обнаружения кленбутерола в шерсти и сетчатке глаза животных / Комаров A.A., Латышев O.E. // Сб. науч. тр. ФГУ «ВГНКИ» / Под ред. академика РАСХН Панина А.Н.. - М.: ВГНКИ. - 2006. - Т. 67. -С. 141-149.

55. Комаров, A.A. Мониторинг безопасности кормов и продукции животного происхождения / Комаров A.A. // Тезисы докладов Всероссийской конф.: «Лекарственные средства для животных и корма. Современное состояние и перспективы». -М.: ФГУ «ВГНКИ». - 2005. - С. 107 - 109.

56. Комаров, A.A. Применение тандемной масс-спектрометрии для определения анаболических стероидов и стильбенов в органах и тканях животных / Комаров A.A., Крапивкин Б.А. // Тезисы докладов Всероссийской конф.: «Лекарственные средства для животных и корма. Современное состояние и перспективы». - М.: ФГУ «ВГНКИ».-2005.-С. 120- 122.

57. Комаров, A.A. Подтверждающее определения бета-адреномиметиков в органах и тканях животных методом тандемной масс-спектрометрии / Комаров A.A., Крапивкин Б.А. // Тезисы докладов Всероссийской конф.: «Лекарственные средства для животных и корма. Современное состояние и перспективы». - М.: ФГУ «ВГНКИ». - 2005. - С. 122 - 125.

58. Комаров, A.A. Экстракция синтетических анаболических стероидов из мочи животных для определения методом ИФА / Комаров A.A., Вылегжанина Е.С. // Тезисы докладов Всероссийской конф.: «Лекарственные средства для животных и корма. Современное состояние и перспективы». — М.: ФГУ «ВГНКИ». — 2005. — С. 125 - 126.

59. Комаров, А.А. Обнаружение остаточных количеств кленбутерола в шерсти и сетчатке животных скрининг-методом ИФА/ Комаров А.А., Латышев О.Е. // Тезисы докладов Всероссийской конф.: «Лекарственные средства для животных и корма. Современное состояние и перспективы». — М.: ФГУ «ВГНКИ». — 2005. — С. 131 — 132.

60. Комаров, А.А. Извлечение синтетических анаболических стероидов и стиль-бенов из органов и тканей продуктивных животных для определения скрининг-методом ИФА / Комаров А.А. И Тезисы докладов Всероссийской конф.: «Лекарственные средства для животных и корма. Современное состояние и перспективы». — М.: ФГУ «ВГНКИ».-2005.-С. 132- 133.

61. Комаров, А.А. Скрининг и подтверждающие методы определения остаточных количеств синтетических анаболиков в продукции животноводства / Комаров А.А., Вылегжанина Е.С., Крапивкин Б.А. // Материалы Всероссийского ветеринарного конгресса и XIV Международного Московского конгресса по болезням мелких домашних животных. - М. - 2006. - С. 179-180.

62. Комаров, А.А. Скрининг-определение кленбутерола в сетчатке животных методом иммуноферментного анализа /Комаров А.А., Вылегжанина Е.С., Латышев О.Е. // Материалы Всероссийского ветеринарного конгресса и XIV Международного Московского конгресса по болезням мелких домашних животных. — М. — 2006. — С. 181-182.

63. Komarov A. Obtaining of the immunogens for developing EL1SA to determine some anabolic residues in livestock products / Komarov A., Vylegzhanina E., Panin A., Latyschev O., Vylegzhanina A. // 5 International Symposium On Hormone And Veterinary Drug Residue Analysis held at the Province of Antwerp House Antwerp, Belgium May 16-19,2006. Abstract Book.- Universiteit Gent. - 2006. - P. 138.

64. Komarov A. Some applications of gas chromatography — ion trap mass spectrometry for analysis of anabolic substances in products of animal origin / Komarov A., Krapivkin В., Panin A. // 5 th International Symposium On Hormone And Veterinary Drug Residue Analysis held at the Province of Antwerp House Antwerp, Belgium May 16-19, 2006. Abstract Book.- Universiteit Gent. - 2006. - P. 141.

65. Komarov A. Determination of clenbuterol in animal hair by ELISA / Komarov A.A., Vylegzanina E.S., Latyshey O.E., Krapivkin B.A. // International Congress on Analytical Sciences ICAS-2006 25-30 June, Moscow, Russia. Book of Abstracts. — Vol. 1. — 2006.- P. 134-135.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

AT - антитела

БСА - бычий сывороточный альбумин

БСТФА - 1М,М-бис-триметилсилилтрифторацетамид

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ГМ - гемисукцинат

Гп - гаптен

ГФМ - гептафтормасляный

ГФМА - гептафтормасляный ангидрид

ГХ-МС - хроматомасс-спектрометрия

ДТЭ - дитиоэритритол

ДЭС - диэтилстильбэстрол

Ж - желатина

ИК - инфракрасный

ИФА - иммуноферментный анализ

КБ - кленбутерол

КДМ - карбодиимидный метод

КМО - карбоксиметил оксим

МБ - метилборатный

МБК - метилборная кислота

МО - метилоксим

МС/МС - тандемная масс-спектрометрия

МСА - метод смешанных ангидридов

МСТФА - Ы-метил-Ы-тиметилсилилтрифторацетамид

МТ - 17а-метилтестостерон

НКТ ИФА - непрямой конкурентный твердофазный ИФА

19-НТ - 17р-19-нортестостерон

ПМР - протонный магнитный резонанс

ПФП - пентафторпропионовый

ПФПА - пентафторпропионовый ангидрид

ТБ - 17р-тренболон

а-ТБ - 17а-тренболон

ТБМЭ - трет-бутилметиловый эфир

ТМБ - триметилбороксин

ТМИС - триметилйодсилан

ТМС - триметилсилильный

ТМХС - триметилхлорсилан

ТСХ - тонкослойная хроматография

ТФА - твердофазный антиген

ТФЭ - твердофазная экстракция

УФ - ультрафиолетовый

ЭТЭ - 17а-этинилэстрадиол

ЭУ - электронный удар

Для заметок

Заказ № 278/06/06 Подписано в печать 30.06.2006 Тираж 150 экз. Усл. п.л. 2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 www.cfr.ru; e-mail:info@cfr.ru

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Комаров, Александр Анатольевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Международно-правовые аспекты применения анаболических агентов в животноводстве

1.2. Стероидные гормоны и производные стильбена: общая характеристика, метаболизм, фармакокинентика и токсикологическая оценка

1.3. Общая характеристика, метаболизм и фармакокинетика (3-адреностимуляторов

1.4. Методы определения анаболических агентов

Введение Диссертация по биологии, на тему "Система обеспечения безопасности продукции животноводства при использовании анаболических стероидов, производных стильбена и β-адреностимуляторов"

Актуальность темы. В качестве веществ, обладающих анаболическим действием, наиболее широко применяются стероидные гормоны, производные стильбена и Р-адреностимуляторы (Р-агонисты). Использование анаболических стимуляторов в животноводстве обусловлено экономическими факторами, но главная опасность заключается в риске воздействия на здоровье человека остаточных количеств этих веществ в животноводческой продукции. За последние 30 лет описано более 10 ООО случаев аномального полового развития у детей, вызванного присутствием в продовольствии остаточных количеств анаболических веществ [191, 284, 337, 407, 409]. Полученная в последние годы информация об уязвимости эндокринного равновесия на разных этапах жизни, обусловливает необходимость дифференцированного подхода к людям различного пола и возраста, особенно детям, при оценке гормонального воздействия. Действие экзогенных гормонов может нарушить это тонкое равновесие в организме, что подтверждается непредсказуемыми отдаленными последствиями случайного воздействия стероидов в препубертатном возрасте на репродуктивную функцию посредством механизма, названного «гормональный импринтинг» [55, 226, 363,436].

Убедительные доказательства канцерогенности природных и синтетических стероидных эстрогенов и производных стильбена позволили Международному агентству по изучению рака (IARC) отнести их к группе признанных канцерогенов для людей [273]. Андрогенные анаболические стероиды классифицированы агентством в качестве вероятных канцерогенов для человека [270]. Установлено, что катехоловые и оксиметаболиты эстрогенов обладают мутагенностью и генотоксичностью, проявляющимися независимо от гормональных рецепторов [559]. Если в прошлом оценка риска для гормонов была основана на предположении об исключительной связи их канцерогенного потенциала с гормональной активностью, принимая во внимание последние данные о гено-токсичности метаболитов, допустимый уровень для этих веществ в продовольствии не может быть установлен.

Синтетические гормоны медленнее метаболизируются по сравнению с природными аналогами, позволяют добиться значительного повышения продуктивности в животноводстве и снизить себестоимость продукции, что вызвало всплеск их использования в последние годы. В то же время, токсикологическое действие и метаболизм синтетических анаболиков до настоящего времени недостаточно изучены, что существенно усложняет оценку риска, связанную с их применением [436].

Хотя Р-адреностимуляторы не являются стероидными гормонами, по фармакологическим свойствам их можно сравнить со стероидами. Они вызывают ингибирование процессов катаболизма мышечных белков и липогенеза в тканях, что способствует получению постного мяса, пользующегося большим спросом на рынке. В разных странах имели место многочисленные случаи отравления людей мясной продукцией, содержавшей остаточные количества адреностимуляторов, сопровождающиеся такими симптомами, как: тахикардия, мышечный тремор, гипокалиемия, тахифилаксия, возбуждение, головные боли, усиленная потливость, сонливость, мышечные спазмы, повышение артериального давления, тошнота [77, 96, 344, 349, 424, 452, 501]. Особую опасность представляет потребление такой продукции людьми с сердечно-сосудистыми заболеваниями.

В связи с вышеизложенным, использование анаболиков в животноводстве запрещено в странах Европейского Союза и Российской Федерации [25, 125, 158].

В ряде стран (США, Канаде и др.) некоторые природные и синтетические гормональные стимуляторы роста сельскохозяйственных животных официально разрешены, а также широко распространено нелегальное использование анаболических препаратов, поэтому необходимо систематически контролировать применение этих веществ при выращивании животных и определять их остаточное содержание в животноводческой продукции. В странах ЕС такой контроль уже систематически осуществляется в соответствии с директивой 96/23/ЕС [126], а введение его в Российской Федерации сдерживает отсутствие методической и законодательной базы.

В соответствии с рекомендациями Codeх Alimentarius, такая система должна быть построена на многоуровневом контроле, сочетающем преимущества использования экспрессных технологий для скрининга большого массива образцов на начальном этапе исследований с обязательным подтверждением положительных результатов современными физико-химическими методами, позволяющими проводить надежную идентификацию определяемых веществ [118]. Скрининговые методы должны обладать высокой чувствительностью, специфичностью, простотой, экспрессностью и относительно низкой себестоимостью. Всем этим требованиям наиболее полно отвечают иммунохимические методы, в частности ИФА.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• синтезировать гаптены низкомолекулярных анаболических агентов с функциональными карбоксильными группами, получить иммуногены путем конъюгирования их с белками и специфические антитела для определения анаболиков иммунохимическим методом;

• оптимизировать условия эспрессного определения анаболических агентов методом ИФА, оценить чувствительность и специфичность метода;

• разработать нормативную документацию и организовать производство ИФА-наборов для экспрессного определения анаболических агентов в объектах ветеринарно-санитарного надзора;

• разработать подтверждающие (арбитражные) хроматомасс-спектрометрические методики определения анаболических веществ в организме сельскохозяйственных животных, в кормах и продукции животноводства;

• создать оригинальную библиотеку масс-спектров производных анаболиков для идентификации их на масс-спектрометрах типа «ионная ловушка»;

• провести метрологическую аттестацию арбитражных методик определения анаболических агентов в биосубстратах, оценить правильность получаемых результатов с использованием международных аттестованных стандартных образцов.

3-о-карбоксиметилэтинилэстрадиола (патент РФ № 2214995), тренболон-17-гемисукцината и 19-нортестостерон-17-гемисукцината (патент РФ № 2193566) [14-16]. Карбоксипроизводные диэтилстильбэстрола - 4-[1-этил-2(4-гидроксифенил)-1-бутенил] феноксиуксусная кислота и этинилэстрадиола - 0-[19-нор-17а-этинил-17(3-гидрокси-прегна-1,3,5(10)-триен-3-ил]гликолевая кислота синтезированы впервые. Путем конъюгирования синтезированных гапте-нов с белками созданы оригинальные иммуногены (патенты РФ № 2218351 и № 2218352) [17, 18].

Синтезированные иммуногены позволили получить антитела, специфичные для определения индивидуальных анаболиков (19-нортестостерона, этинилэстрадиола, тренболона и 17-метилтестостерона), а так же целого класса близких по структуре соединений: производных стильбена и (З-адреностимуляторов. Подобраны условия: структура иммуногенов (строение гаптенов, эпитопная плотность конъюгатов), природа и концентрация твердофазных антигенов, условий сенсибилизации носителя твердофазным антигеном и инкубации с ним антител, обеспечившие высокую чувствительность и специфичность определения анаболиков методом ИФА. Для экспрессного определения анаболиков методом ИФА разработаны простые и экономичные способы их извлечения из биологических жидкостей, органов, тканей животных, кормов и оптимизированы условия ферментативного гидролиза конъюгированных форм этих соединений с серной и глюкуроновой кислотами. Предложены эффективные методики экстракции анаболических стероидов, производных стильбена из биосубстратов, очистки и концентрирования экстрактов методом ВЭЖХ, позволившие проводить надежную идентификацию и количественное определение этих соединений в организме сельскохозяйственных животных и продукции животного происхождения методом ГХ-МС на масс-спектрометрах типа «ионная ловушка». Разработана методика, обеспечивающая одновременное хроматомасс-спектрометрическое определение в биосубстратах p-адреностимуляторов различных типов путем очистки гидролизованных образцов оптимизированным способом твердофазной экстракции на картриджах с комбинированным обращеннофазовым и ионообменным сорбентом. Оптимизированы способы предварительной дериватизации и хроматографического разделения анаболических агентов, обеспечившие проведение их надежной идентификации и количественного анализа методом ГХ-МС с соблюдением международных требований. Создана оригинальная библиотека масс-спектров производных анаболических агентов и их дейтерированных аналогов для идентификации этих соединений на масс-спектрометрах типа «ионная ловушка» с внутренним источником ионизации.

Практическая значимость работы. Впервые в Российской Федерации создана двухуровневая система контроля безопасности продукции животноводства при использовании анаболических стимуляторов роста животных. Для экспрессного определения основных представителей синтетических эстрогенов (диэтилстильбэстрола, этинилэстрадиола), андрогенов (19-нортестостерона, тренболона, 17-метилтестостерона) и Р-адреностимуляторов (кленбутерола) в кормах, организме животных и продукции животного происхождения разработаны и зарегистрированы Россельхознадзором тест-системы ИФА. Чувствительность большинства разработанных тест-систем не уступает, а в ряде случаев (для кленбутерола в 10 раз, а 19-нортестостерона в 16 раз) превосходит показатели зарубежных аналогов. Разработаны простые и экономичные способы извлечения анаболиков из биосубстратов для определения методом ИФА, исключающие использование дорогостоящего метода твердофазной экстракции. На тест-системы подготовлена, согласована и утверждена нормативная документация и организовано их серийное производство в России. Для подтверждающего анализа анаболиков в подозрительных образцах, показавших положительные результаты в ИФА, разработаны, утверждены Управлением ветеринарии Федерального агентства по сельскому хозяйству и аттестованы Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии арбитражные методики определения массовых долей анаболических стероидов, производных стильбе-на и p-адреностимуляторов методом ГХ-МС в объектах ветеринарно-санитарного надзора. Использование относительно недорогих и простых в эксплуатации масс-спектрометров типа «ионная ловушка» позволило обеспечить невысокую стоимость анализа при достижении высокой чувствительности и селективности определения за счет возможности работы на анализаторах этого типа в режимах тандемной масс-спектрометрии и селективного удерживания ионов. С целью гармонизации отечественных и международных подходов к оценке качества результатов измерений при метрологической аттестации методик впервые оценена расширенная неопределенность измерения. Материалы диссертационной работы вошли в методическое пособие «Контроль за содержанием ветеринарных препаратов в кормах и продукции животноводства» ( издательство «Пищепромиздат», 2003), использованы в лекциях и семинарах на курсах повышения квалификации специалистов государственной ветеринарной службы и предприятий агропромышленного комплекса.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на IX Международном конгрессе Европейской ассоциации ветеринарной фармакологии и токсикологии (Лиссабон, 2003), Международном форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2003), XI Московском международном ветеринарном конгрессе (Москва, 2003), II Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2003), VII Всероссийском конгрессе «Здоровое питание населения России» (Москва, 2003), II Международной научно-практической конференции «Научно-технический прогресс в животноводстве России - ресурсосберегающие технологии производства экологически безопасной продукции животноводства» (Дубовицы, 2003), Международной научной конференции «Медико-биологические проблемы экологической безопасности агропромышленного комплекса» (Сергиев Посад, 2003), III Международной конференции «Птицеводство - мировой и отечественный опыт» (Москва, 2004), Всероссийском ветеринарном конгрессе и XII Международном Московском конгрессе по болезням мелких домашних животных (Москва, 2004), NATO Advanced Research Workshop «Food Safety and Security» (Issyk-Kul, 2004), II Съезде Общества биотехнологов России (Москва, 2004), V Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины, ветеринарно-санитарного контроля и биологической безопасности сельскохозяйственной продукции» (Москва, 2004), III Международном симпозиуме «Современные проблемы ветеринарной диетологии и нутрициологии» (Санкт-Петербург, 2005), научно-практической конференции «Продовольственная безопасность России» (Москва, 2005), III Международной конференции «Экстракция органических соединений» (Воронеж, 2005), Всероссийской конференции «Лекарственные средства для животных и корма. Современное состояние и перспективы» (Москва, 2006), Всероссийском ветеринарном конгрессе и XIV Международном Московском конгрессе по болезням мелких домашних животных (Москва, 2006), V Международном симпозиуме по анализу остаточных количеств гормонов и ветеринарных препаратов (Антверпен, 2006), Международном конгрессе по аналитической химии (Москва, 2006), заседаниях Ученого совета ФГУ «ВГНКИ» в 2000-2005 гг., заседаниях научно-методической комиссии по химиотерапевтическим лекарственным средствам для животных ФГУ «ВГНКИ» в 2004-2005 гг., межлабораторном совещании сотрудников ФГУ «ВГНКИ» в 2006 г.

Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 65 статей и тезисов докладов в отечественных и зарубежных изданиях, одно методическое пособие (3 п. л.), 2 методических указания, получено 5 патентов РФ на изобретение.

Основные положения, выносимые на защиту.

2. Разработка подтверждающих (арбитражных) методик определения анаболических стероидов, производных стильбена и Р-адреностимуляторов в объектах ветеринарно-санитарного надзора с помощью ГХ-МС.

3. Современные подходы к метрологической аттестации разработанных методик: алгоритм оценивания неопределенности измерения и контроль правильности разультатов измерения содержания анаболиков в биосубстратах с использованием международных аттестованных стандартных образцов.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 390 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка литературы, включающего 581 источник, 27 из которых опубликованы в отечественных и 554 - в зарубежных изданиях и приложений. Работа иллюстрирована 57 таблицами и 104 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Комаров, Александр Анатольевич

4. ВЫВОДЫ

1. Создана система обеспечения безопасности продукции животноводства при использовании анаболических стимуляторов роста животных, включающая экспресс-определение основных представителей синтетических эстрогенов (диэтилстильбэстрола, этинилэстрадиола), андрогенов (19-нортестостерона, тренболона, 17-метилтестостерона) и адреностимуляторов (кленбутерола) в кормах, организме животных и продукции животного происхождения методом иммуноферментного анализа и подтверждающий анализ анаболиков в подозрительных образцах, показавших положительные результаты в ИФА, арбитражным методом хроматомасс-спектрометрии.

2. Разработаны новые способы синтеза гаптенов низкомолекулярных анаболических агентов с функциональными карбоксильными группами, позволившие получить иммуногены путем конъюгирования их с белками методами, исключающими возможность олигомеризации в процессе синтеза. Впервые синтезированы карбоксипроизводные диэтилстильбэстрола - 4-[1-этил-2(4-гидроксифенил)-1-бутенил]феноксиуксусная кислота и этинилэстрадиола - 0-[ 19-нор-17а-этинил-17р-гидрокси-прегна-1,3,5(10)-триен-3-ил]гликолевая кислота и на их основе созданы оригинальные иммуногены.

4. Оптимизированы показатели: структура иммуногенов, титр иммунных сывороток, концентрация и природа твердофазных антигенов, условия сенсибилизации носителя твердофазным антигеном и инкубации с ним антител, обеспечивающие высокую чувствительность и специфичность определения анаболиков методом непрямого конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа. Чувствительность большинства разработанных тест-систем практически не уступала, а в ряде случаев (для кленбутерола - в 10 раз, а 19-нортестостерона - в 16 раз) превосходила показатели зарубежных аналогов.

5. Для экспрессного определения анаболических агентов методом иммуноферментного анализа разработаны простые и экономичные способы их извлечения из биологических жидкостей, органов, тканей животных, кормов и оптимизированы условия ферментативного гидролиза конъю-гированных форм этих соединений с серной и глюкуроновой кислотами. Правильность получаемых результатов показана на образцах биосубстратов с внесенными добавками определяемых веществ и путем определения остаточного содержания стимуляторов в биологических жидкостях, органах и тканях экспериментальных животных, получавших анаболики.

7. Разработана методика, обеспечивающая одновременное хроматомасс-спектрометрическое определение в биосубстратах р-адреностимуляторов анилинового, фенольного и резорцинового типов путем очистки образцов оптимизированным способом твердофазной экстракции на картриджах с комбинированным обращеннофазовым и ионообменным сорбентом после протеолиза мышечной ткани субтилизином А или ферментативного гидролиза конъюгированных форм анаболиков в печени, почках, моче и сетчатке глаза животных пищеварительным соком Helix pomatia.

8. Оптимизированы способы дериватизации и условия хроматографическо-го разделения анаболических агентов, позволяющие проводить их надежную идентификацию и количественный анализ методом ГХ-МС в режимах полного ионного тока, селективного удерживания ионов и тандемной масс-спектрометрии.

9. Создана оригинальная библиотека масс-спектров электронной ионизации дериватов анаболических стероидов, производных стильбена, Р-адреностимуляторов и их дейтерированных аналогов, которая может быть использована для идентификации этих веществ на масс-спектрометрах типа «ионная ловушка» с внутренним источником ионизации.

10. С целью гармонизации отечественных и международных подходов к оценке качества результатов количественного химического анализа впервые оценена расширенная неопределенность измерения массовой доли анаболических стероидов, производных стильбена и р-адреностимуляторов в биосубстратах. Проведена метрологическая аттестация хроматомасс-спектрометрических методик подтверждающего определения анаболических агентов в биосубстратах. Правильность результатов измерения, получаемых с использованием аттестованных методик, продемонстрирована путем идентификации и количественного определения анаболиков в международных аттестованных стандартных образцах.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

В рамках созданной системы контроля за применением анаболических стимуляторов роста в животноводстве и определения их остаточного содержания в животноводческой продукции разработаны и зарегистрированы Россельхоз-надзором ИФА тест-системы для экспрессного определения этих ксенобиотиков в биосубстратах. Тест-системы успешно прошли комиссионные испытания и организовано их серийное производство в Российской Федерации. На тест-системы составлена, согласована и утверждена в установленном порядке нормативная документация:

1. Технические условия на тест-систему «Диэтилстильбэстрол-ИФА» (ТУ 9398-031-11361534-2005).

3. Технические условия на тест-систему «19-Нортестостерон-ИФА» (ТУ 9398-032-11361534-2005).

5. Технические условия на тест-систему «Тренболон-ИФА» (ТУ 9398-03311361534-2005).

7. Технические условия на тест-систему «Метилтестостерон-ИФА» (ТУ 9398-034-11361534-2005).

9. Технические условия на тест-систему «Этинилэстрадиол-ИФА» (ТУ 9398-035-11361534-2005).

11 .Технические условия на опытную партию на тест-систему «Кленбутерол-ИФА» (ТУ 9398-001-00494189-2004).

12.Временное наставление по применению тест-системы «Кленбутерол-ИФА» для количественного определения кленбутерола методом иммунофер-ментного анализа, утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхоза России 07.05.2004 г., № 13-5-02/1060.

13.Технические условия на тест-систему «Кленбутерол-ИФА» (ТУ 9398-03011361534-2005).

2. «Методические указания по определению массовой доли Р-агонистов в кормах, физиологических жидкостях, органах и тканях животных методом газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектором», утверждены Управлением ветеринарии Федерального агентства по сельскому хозяйству 10.10.2005 г., № 5-1-14/991, Свидетельство об аттестации МВИ № 4-2005 от 25.01.2005 г.

1.5. Заключение

Широкое использование ряда природных и синтетических анаболических гормонов в США и других странах в качестве промоторов роста продуктивных животных способствовало всестороннену изучению побочных эффектов, связанных с остаточным содержанием их в животноводческой продукции.

Имеющиеся на сегодняшний день данные не позволяют количественно оценить риск, связанный с применением анаболических стимуляторов роста в животноводстве, поэтому для этих веществ нельзя установить пороговый уровень воздействия и, следовательно, допустимое суточное потребление.

С целью снижения риска для потребителя, необходимо организовать постоянный надзор за использованием анаболических стимуляторов роста в животноводстве, что требует разработки адекватных программ контроля на стадии выращивания животных и определения остаточного содержания анаболиков в животноводческой продукции.

Современная стратегия контроля остаточного содержания анаболических стероидов, производных стильбена и р-агонистов на стадии выращивания животных и в продукции животноводства должна включать двухуровневую систему с использованим скрининговых и подтверждающих методов анализа.

На первом этапе для скрининга анаболиков в биосубстратах наиболее перспективно использовать экспресс-методы на основе ИФА. Подозрительные образцы, показавшие положительные результаты в ИФА, должны быть проанализированы подтверждающими методами. Самым перспективным подтверждающим методом анализа на сегодняшний день является хроматомасс-спектрометрия, позволяющая проводить прямую идентификацию аналита.

Учитывая вышеизложенное, для обеспечения безопасности продукции животноводства в стране, особую актуальность приобретает разработка двухуровневой системы контроля за применением анаболических стимуляторов роста продуктивных животных.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы

Работа выполнена в отделе безопасности кормов и пищевых продуктов Всероссийского государственного Центра качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ФГУ «ВГНКИ») и опытном хозяйстве центра «Манихино».

2.1.1. Получение иммунореагентов для определения анаболических агентов иммунохимическими методами

2.1.1.1. Синтез карбоксипроизводного ДЭС - диэтилстильбэстрола-о-карбоксиметила (ДЭС-КМ)

Ход синтеза гаптена, степень экстракции и чистоту синтезированного продукта контролировали методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинах с силикагелем марки «Силуфол» ИУ-254. В качестве подвижной фазы при ТСХ на стадии проведения синтеза использовали смесь хлороформ/ эфир (97:3), при контроле выхода и чистоты синтезированного продукта - смесь хлороформ/ метанол (90:10). Пластины просматривали под источником УФ-лучей марки ВИО-1 с длиной волны 253 нм или опрыскивали 0,1% спиртовым раствором бромфенолового синего.

Структуру синтезированого карбоксипроизводного ДЭС - ДЭС-КМ подтверждали методом протонного магнитного резонанса (ПМР) на приборе «Bruker-ЗОО» (растворитель - дейтерированный диметилсульфоксид - ДМСО-ёб, стандарт - тетраметилсилан) в лаборатории ядерного магнитного резонанса Института элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН.

Для синтеза использовали ДЭС фирмы «Sigma» (США) с чистотой 99% . ДЭС-КМ синтезировали следующим способом. Раствор 0,536 г (2 ммоля) ДЭС в 24 см абсолютного этилового спирта обрабатывали 1,7 см 2н раствора эти-лата натрия, смешивали с 1,0 г (6 ммоль) этилового эфира бромуксусной кисло

Л л 1 ты, выдерживали 1 час при 20 С и далее разбавляли 30 см эфира и 30 см воды. Полученную реакционную смесь подкисляли концентрированной соляной кислотой до рН 1,0, встряхивали и отделяли верхний эфирный слой. Эфирную вытяжку промывали тремя порциями воды по 5 см3 каждая и экстрагировали 3% раствором едкого калия до тех пор, пока экстракт не переставал мутнеть при подкислении.

Щелочные вытяжки объединяли, выдерживали 8-12 часов при 20°С в атмосфере азота и доводили рН до 6-8. Выпавший осадок исходного фенола (ДЭС) отделяли фильтрованием. Фильтрат подкисляли концентрированной соляной кислотой до рН 1. Выпавший осадок 4-[1-этил-2(4-гидроксифенил)-1-бутенил]феноксиуксусной кислоты (ДЭС-КМ) трижды промывали водой на фильтре и сушили на воздухе.

2.1.1.2. Синтез карбоксипроизводных 17а-этинилэстрадиола (ЭТЭ)- 17 а-этинилэстрадиола-3-гемисукцината (ЭТЭ-ГС) и 3-(о-карбоксиметил)этинил-эстрадиола (КМ-ЭТЭ)

Ход синтеза ЭТЭ-ГС и чистоту синтезированного продукта контролировали методом ТСХ на пластинах с силикагелем марки «Силуфол» ИУ-254. В качестве подвижной фазы использовали смесь хлороформ/ этилацетат/ вода в (17:13:0,02). Пластины опрыскивали 0,25% водным раствором перманганата калия или спиртово-водным раствором метиленовой сини и просматривали в УФ-свете с длиной волны 253нм.

Структуру синтезированных карбоксипроизводных подтверждали методами УФ- ИК- и ПМР-спектроскопии.

Для синтеза использовали ЭТЭ фирмы «Sigma» (США) с чистотой 99%, Т пл. 182-183°С. Пиридин сушили над едким кали в течение недели и перегоняли при атмосферном давлении. Уксусный ангидрид применяли свежеперегнанный.

А 1 О

При перегонке отбирали фракцию с Т. кип. 137- 140 С, nD 13920.

Янтарный ангидрид получали путем нагревания янтарной кислоты с уксусным ангидридом. Для этого в двугорлую колбу, снабженную капельной воронкой и дефлегматорной колонкой помещали 15 г янтарной кислоты, 30 г (24мл) уксусного ангидрида и 0,1 мл фосфорной кислоты. Смесь кипятили в течение 30 минут и медленно перегоняли с такой скоростью, чтобы температура вверху колонки не превышала 120°С. После отгонки 10 мл уксусной кислоты прибавляли еще 10 мл уксусного ангидрида и перегонку возобновляли. Процесс повторяли дважды. В заключение заменяли дефлегматорную колонку нисходящим холодильником и отгоняли непрореагировавший уксусный ангидрид. Остаток растирали эфиром. Образовавшийся осадок отделяли фильтрованием. Сырой янтарный ангидрид перекристаллизовывали из 12 мл уксусного ангидрида, отфильтровывали, промывали небольшим количеством абсолютного эфира и сушили при 40°С. В дальнейшей работе использовали полученный янтарный ангидрид с Т.пл. 119-120°С.

ЭТЭ-ГС синтезирорвали следующим способом. Смесь 200 мг ЭТЭ, 250 мг янтарного ангидрида и 1,5мл пиридина нагревали при 90-95°С на глицериновой бане в течение 8 часов. После этого реакционную смесь выливали, при сильном перемешивании, в 30 мл 2% соляной кислоты, охлаждаемой в смеси воды и льда.

Выпавшее масло при растирании твердело. Осадок отделяли фильтрованием, трижды растирали на фильтре с ледяной водой и сушили на воздухе. Получили 245 мг сырого вещества. Из 90% водного метанола вещество шло маслом. 200 мг неочищенного эфира (ЭТЭ-ГС) растворяли в 1мл ацетона и смешивали с 5мл сухого диэтилового эфира. Выпадали примеси грязного цвета. После фильтрации при перемешивании медленно прибавляли 14 мл гексана. После стояния в холодильнике при 4-5°С выпадало белое кристаллическое вещество (ЭТЭ-ГС), которое отделяли фильтрованием и далее сушили в вакуум-эксикаторе над пя-тиокисью фосфора.

Ход синтеза КМ-ЭТЭ контролировали методом ТСХ на пластинах с сили-кагелем марки «Силуфол» ИУ-254. В качестве подвижной фазы использовали смесь гексан/ бензол/ этилацетат (2:1:1). Хроматограммы проявляли путем опрыскивания 10% -ым раствором серной кислоты в метаноле с последующим нагреванием при 100-120°С до появления ярко окрашенных пятен синевато-красного цвета.

КМ-ЭТЭ синтезировали следующим способом. Раствор 29,6 мг (0,1 ммоля) 7

ЭТЭ в 0,4 см диметилсульфоксида (ДМСО) приливали при перемешивании к суспензии 22 мг (0,4 ммоля) порошкообразного едкого кали в 0,4 см3 ДМСО. Через 30 минут прибавляли раствор 22 мг (0,2 ммоля) метилового эфира хло-руксусной кислоты в 0,1см ДМСО, перемешивали 1 час, после чего добавляли 0,1см3 воды и продолжали перемешивание в течение 30 минут. Реакционную массу разбавляли 5см3 холодной воды (рН 9,0-9,5), переносили в делительную воронку, подкисляли 5% соляной кислотой и экстрагировали последовательно 2, 1 и 1см этилацетата. Объединенные этилацетатные вытяжки промывали 2 порциями по 5 см3 воды, встряхивали с 0,5 см3 насыщенного раствора соли, сушил над сульфатом натрия, осветляли активированным углем и упаривали в вакууме на водяной бане при 100°С. При охлаждении маслянистый остаток [19-нор-17а-этинил-17р-гидрокси-прегна-1,3,5(10)триен-3-ил]оксиуксусной кислоты (КМ-ЭТЭ) кристаллизовался.

2.1.1.3. Синтез карбоксипроизводных 17/3-тренболона(ТБ) - тренболон-17-гемисукцината (ТБ-ГС) и 17/3-тренболон-3(о-карбоксиметил)оксима (17/3-ТБ-КМО)

Ход синтеза ТБ-ГС и чистоту синтезированного продукта контролировали методом ТСХ на пластинах с силикагелем марки «Силуфол» ИУ-254. В качестве подвижной фазы для ТСХ использовали смесь хлороформ/ ацетон (10:1). Пластины просматривали в УФ-свете с длиной волны 253 нм или опрыскивали 0,1% спиртовым раствором бромфенолового синего.

Способ получения янтарного ангидрида описан в п. 2.2.1.2. При проведении синтеза использовали свежепрокаленный углекислый калий и сухие растворители, перегнанные в вакууме. Для синтеза использовали 17Р-ТБ (эстра-4,9,11-триен-17р-гидрокси-3-он) фирмы «Sigma» (США) с чистотой 98% после перекристаллизации из спирта, Т пл. 186-187°С.

ТБ-ГС синтезировали следующим способом. Смесь 135 мг (0,5 ммоля) 17р-ТБ, 200 мг (2 ммоля) янтарного ангидрида, 1,2 см ДМСО и 20 мг (0,15 ммоля) углекислого калия нагревали четыре часа при 80°С. Далее реакционную смесь охлаждали до 20°С и обрабатывали 10 см3 2% соляной кислоты. Выпавший осадок отделяли фильтрованием и растирали на стеклянном фильтре трижды с 3 см3 воды и сушили на воздухе. После перекристаллизации из метанола получали целевой продукт - ТБ-ГС.

В экспериментах использовали аминооксиуксусную кислоту -NH2OCH2COOH • 0,5НС1 • 0,5Н20 с Т пл. 155-156°С фирмы «Lancaster».

17Р-ТБ-КМО синтезировали следующим способом. 170 мг 17Р-ТБ и 170 мг гидрохлорида аминооксиуксусной кислоты растворяли в 4 мл этилового спирта. Реакционную смесь нейтрализовали прибавлением 1 мл раствора 4 % гидро-ксида натрия. Полученный раствор выдерживали пять часов при 20°С, выливали в 40 мл холодной воды, подкисленной 0,15 мл концентрированной соляной кислоты и оставляли на ночь в холодильнике при 2-3°С. На утро выпавший на стенках стакана осадок собирали при помощи стеклянной палочки и переносили в пробирку. Далее реакционную массу дважды растирали с водой, воду сливали, а остаток растирали с 2 мл смеси этилового эфира и этилацетата и переносили в чашку Петри. При стоянии постепенно кристаллизовался целевой продукт 17Р-ТБ-КМО.

2.1.1.4. Синтез карбоксипроизводных 17(3-19-нортестостерона (19-НТ) - 19-нортестостерон-17-гемисукцината (19-НТ-ГС) и 17/3-19-нортестостерон-3(о-карбоксиметил) оксима (17(3-19-НТ-КМО)

Ход синтеза 19-НТ-ГС и образование продукта контролировали методом ТСХ на пластинах с силикагелем марки «Силуфол» ИУ-254. В качестве подвижной фазы использовали смесь хлороформ/ изопропиловый спирт (7:1). Пластины просматривали после опрыскивания 0,1% спиртовым раствором бромфенолового синего.

Способ получения янтарного ангидрида описан в п. 2.2.1.2. При проведении синтеза использовали 19-НТ фирмы «Fluka» с чистотой 99%, свежепрокален-ный углекислый калий и сухие растворители, перегнанные в вакууме.

19-НТ-ГС синтезировали следующим способом. Смесь 27,4 мг (0,1 ммоль) 19-НТ, 15 мг (0,15 ммоль) янтарного ангидрида, 0,1 см3 диметилацетамида и 8мг

0,07 ммоль) углекислого калия нагревали 10-15 минут при 110°С. Далее реакционную смесь охлаждали до 20°С и обрабатывали 10см3 2% соляной кислоты. Выпавший осадок отделяли фильтрованием и растирали на стеклянном фильтре трижды с Зсм3 воды и сушили на воздухе.

17Р-19-НТ-КМО получали конденсацией 19-НТ с карбоксиметоксиламином в среде пиридина. Для этого к 20 мг 19-НТ добавляли 1мл сухого пиридина и 50мг карбоксиметоксиламина. Реакционную смесь перемешивали на магнитной мешалке при комнатной температуре в течение 5 часов и оставляли на ночь. Затем реакционную смесь упаривали досуха в вакууме. К сухому остатку добавляли 25 мл дистиллированной воды и доводили рН до 8,0 8%-ным раствором NaOH. Водный раствор экстрагировали бензолом (8 раз по 10 мл). Водную фазу подкисляли до рН 3,0 1н НС1 и экстрагировали этил ацетатом (8 раз по 10 мл). Экстракт упаривали досуха, сухой остаток 17Р-19-НТ-КМО взвешивали. 2.1.1.5. Синтез карбоксипроизводного 17-метилтестостерона (МТ) - 17-метилтестостерон-З(о-карбоксиметил) оксима (МТ-КМО)

Контроль за ходом реакции и образованием конечного продукта осуществляли методом ТСХ на пластинах с силикагелем марки «Силуфол» ИУ-254. В качестве подвижной фазы использовали смесь хлористый метилен/ метиловый спирт (95:5). Пластины просматривали в УФ-свете с длиной волны 253 нм или опрыскивали 2% раствором серной кислоты и анисового альдегида в метаноле с последующим прогреванием при 100-110°С в течение 2-3 минут.

Аминоуксусную кислоту синтезировали обработкой трет-бутилкарбонилгидроксиламина бромуксусной кислотой с последующим превращением полученного производного в аминоуксусную кислоту обработкой концентрированной соляной кислотой в течение 20 минут при 20°С.

Для синтеза использовали МТ «ACROC» с чистотой 97% после двух пере-кристаллизаций (Т пл. 163-164°С, чистота > 99%).

МТ-КМО получали путем конденсации МТ с аминоуксусной кислотой. Для этого раствор 0,5г МТ и 0,6 г аминооксиуксусной кислоты в 100 мл 95% этилового спирта подщелачивали до рН 8 с помощью 5% едкого натра (10 мл) и кипятили 1,5 часа. Далее реакционную смесь упаривали в вакууме, разбавляли 20 мл воды, экстрагировали двумя порциями (по 5 мл) диэтилового эфира и щелочную фазу подкисляли 20% соляной кислотой. Выпавший осадок экстрагировали смесью эфира и этилацетата в соотношении 1:1. Экстракт промывали небольшим количеством воды, сушили сульфатом натрия и упаривали в вакууме.

После двух перекристаллизаций из смеси бензола с гексаном получали целевой продукт (МТ-КМО) в виде белого кристаллического вещества. 2.1.1.6. Конъюгирование карбоксипроизводных анаболических стероидов и ДЭС с белками-носителями

Трибутиламин и диоксан, используемые для конъюгивования, сушили несколько суток над гидратом окиси калия. Изобутилхлорформиат сушили над прокаленным хлористым кальцием и перегоняли, как и диметилформамид при атмосферном давлении. В таблице 6 приведены физико-химические свойства соединений, используемых для получения коъюгатов карбоксипроизводных стильбенов и анаболических стероидов с белками.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Комаров, Александр Анатольевич, Москва

1. ГОСТ Р 8.563-96. Государственная система обеспечения единства измерений. Методики выполнения измерений.

2. Иммуноферментный анализ: Пер. с англ / Под ред. Т. Нго и Г. Ленхоффа. -М.: Мир, 1988.-446с.

3. Интенсивность роста, обмен азотистых веществ и энергии у бычков в переходный период выращивания под влиянием кленбутерола/ Каленюк В.Ф., Матвеев В.А., Комкова Е.Е., Купий СЛ., Тагиров Н.С. // Сельскохозяйственная биология. 1993. - №6. - С.68-72.

4. Лебедев, А.Т. Масс-спектрометрия в органической химии/ А.Т. Лебедев. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний. - 2003. - 493с.

5. Манухина, А.И. Влияние кленбутерола на морфофункциональное состояние эндокринных желез, скелетных мышц и жировых депо бычков/ Манухина А.И., Кальницкий Б.Д. // Доклады Россельхозакадемии. 2000. - №2. -С.40-43.

6. Матвеев, В.А. Гормональный статус и продуктивность бычков при применении Р-агониста кленбутерола / Матвеев В.А.// III-я международная конференция «Актуальные проблемы биологии в животноводстве». Тезисы докладов, Боровск. - 2000. - С.325-327.

7. Машковский, М.Д. Лекарственные средства / М.Д. Машковский. -Т.1. 14-е издание. М.: ООО «Издательство Новая Волна». - 2001. - С.230-243.

8. Метаболизм белков и липидов у молодняка крупного рогатого скота при добавлении в рацион кленбутерола / Кальницкий Б.Д., Аитова М.Д., Ерим-бетов К.Т., Матющенко П.В.// Доклады Россельхозакадемии. 1994. - №4. - С.36-37.

9. Обмен веществ и продуктивность бычков приприменении кленбутерола в переходный период выращивания / Каленюк В.Ф., Ниязов Н.С., Матвеев В.А., Тагиров Н.С. // Калужский центр научно-технической информации. -1992. -№1. -С.92.

10. Патент РФ № 2192408 Способ получения замещенной арилоксиуксусной кислоты / Комаров А.А., Панин А.Н., Писков В.Б. // Приоритет от 12.05.2000. Опубликован 10.11.2002 Бюл. №31.

11. Патент РФ № 2193566 Способ получения моноэфира янтарной кислоты из 17-оксистероида и янтарного ангидрида / Комаров А.А., Панин А.Н., Писков В.Б. // Приоритет от 12.03.2001. Опубликован 27.11.2002 Бюл. № 33.

12. Патент РФ № 2214995 Способ получения 0-арилгликолевых кислот / Комаров А.А., Панин А.Н., Писков В.Б. // Приоритет от 19.06.2002. Опубликован 27.10.2003 Бюл. №30.

13. Применение твердофазного конкурентного иммуноферментного анализа для определения фумонизинов группы В / Кононенко Г.П., Буркин А.А., Зотова Е.В., Соболева Н.А. // Прикладная биохимия и микробиология. -1999. Т.35. - №2. - С.206-211.

14. Розен, В.Б. Основы эндокринологии/ В.Б. Розен. М.: Изддательство МГУ. - 1994.-384с.

15. Руководство ЕВРАХИМ/СИТАК Количественное описание неопределенности в аналитических измерениях. 2-е издание, С.-Петербург: ВНИИМ им. Д.И. Менделеева, 2002. 149 с.

16. Руководство по выражению неопределенности измерения, С.-Петербург: ВНИИМ им. Д.И. Менделеева, 1999. 126 с.

17. Синтез омега-фенилениновых и омега-фенилендииновых эфиров. Тиоэфи-ров и аминов / Волков А.Н., Скворцов Ю.М., Данда И.И., Шостаковский М.Н. // Журнал органической химии. 1970. - т.6. - №5. - С.897-902.

18. Тагиров, Н.С. Гормональный статус у бычков в переходный период выращивания и при применении кленбутерола: Автореферат дис. канд. биол. наук: 03.00.13/ Н.С. Тагиров; ВНИИФБиП с.-х. животных. Боровск. -1994.-25с.

19. Указание Главного государственного ветеринарного инспектора по организации Государственного ветеринарного надзора за содержанием гормональных стимуляторов роста и тиреостатиков в продукции животного происхождения № 13-7-1/900 от 04.10.99г.

20. Фофана, Н.В. Влияние кленбутерола на морфофункциональное состояние мышечной и жировой тканей бычков/ Фофана Н.В. // Доклады Россельхо-закадемии. 1998. - №3. - С.33-34.

21. Чучалин, А. Г. Бронхиальная астма. Сальбутамол./ Под ред. А.Г.Чучалина, И.Хамида. М.,ФАРМЕДИНФО. - 1992 - С.98-117.

22. Abraham G.E. Radioimmunoassay of steroids in biological materials /Abraham G.E.//Acta Endocrinol. 1974.-V.75 (Suppl. 183). - P. 1-41.

23. Abraham G.E. Solid-phase radioimmunoassay of estradiol-17p/ Abraham G.E.// Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism.- 1969. V.29. - P.866-870.

24. Adam A. Detection of clenbuterol residues in hair/ Adam A., Gervais N., Panoyan A. et al.// The Analyst. 1994. - V.l 19. - P.2663-2666.

25. Adam A. Radioimmunoassay for albuterol using a monoclonal antibody: application for direct quantification in horse urine/ Adam A., Ong H., Sondag D. et al.// Journal of Immunoassay. 1990. - V.l 1. - P.329-345.

26. Adlercreutz H. Estrogen metabolism and excretion in oriental Caucasian women/ Adlercreutz H., Gorbach S.L., Goldin B.R. et al.// J. Natl. Cancer Inst. -1994. -V.86. P.1076-1082.

27. Amendola L. Determination of clenbuterol in human urine by GC-MS-MS-MS: confirmation analysis in antidoping control/ Amendola L., Colamonici C., Rossi F., Botre F.// Journal of Chromatography. 2002. - V.773. - P.7-16.

28. Andersson A.M. Exposure to exogenous estrogens in food: possible impact on human development and health /Andersson A.M. and Skakkebaek N.E.// European Journal of Endocrinology. 1999.- V.140.- P. 477-485.

29. Andre F. Developments in residue assay and metabolism study of growth-promoters by mass spectrometric analysis/ Andre F., Le Bizec В., Montrade M.-P. et al. // Analyst. 1994. - V.l 19. - P.2529-2535.

30. Anggard E. Derivatives of sympathomimetic amines for gas chromatography with electron capure detection and mass spectrometry/ Anggard E., Hankey A.// Acta Chem. Scan. 1969. - V.23. - P.3110-3119.

31. Anstead G.M. The estradiol pharmacophore: Ligand structure-estrogen receptor binding affinity relationships and a model for the receptor binding site/ Anstead G.M., Carlson K.E., Katzenellenbogen J.A. // Steroids.- 1997. V.62. - P.268-303.

32. Antignac J.-P. Conjugated analytes hydrolysis. Sample preparation. (Lecture)/ Antignac J.-P. // School for Advanced Residue Analysis in Food. Session 3 (6th-7th October 2003.) SARAF, Nantes.

33. Arts C.J.M. Oestrogen radioreceptor assay for multi-residue screening of bovine urine for oestogenic anabolic compounds/ Arts C.J.M., Kemperman P.T.W., Van Den Berg H.// Food Addit. Contam. 1989. - V.6. - P. 103-116.

34. Assessment of potential risks to human health from hormone residues in bovine meat and meat products. Opinion Of The Scientific Committee On Veterinary Measures Relating To Public Health. European Commission. - 1999. - 136 p.

35. Ayotte C. Testing for natural and synthetic anabolic agents in human urine/ Ay-otte C., Goudreault D., Charlebois A.// Journal of Chromatography B. 1996. -V.687. - P.3-25.

36. Baird D.T. Steroid dynamics under steady-state dynamics/ Baird D.T., Horton R., Longcope C., Tait J.F. // Rec. Prog. Hormone Res. 1969. - V.25. - P.611-664.

37. Ball P. Catechol oestrogens (2- and 4-hydroxyestrogens): Chemistry, biogenesis, metabolism, occurrence and physiological significance/ Ball P., Knuppen R. // Acta Endocrinol. 1980. - V.93(Suppl. 232) - P.l-127.

38. Banerjee S.K. Induction of chromosome aberrations in Syrian hamster renal cortical cells by various estrogens/ Banerjee S.K., Banerjee S., Li S.A. and Li J.J. // Mutat. Res. 1994. - V.311. - P. 191-197.

39. Barker S.A. Acetals and ketals of the tetritols, pentitols and hexitols/ Barker S.A., Bourne E.J. // Adv. Carbohydr. Chem. 1952. - V.7. - P.l37-245.

40. Barraud B. Determination of the binding of trenbolone and zeranol to rat liver DNA in vivo, as compared to 17p-oestradiol and testosterone/ Barraud В., Lugnier A. and Dirheimer G.// Food Addit. Contam. 1984. - V.l.- P.l47-155.

41. Batjoens P. Gas chromatography-mass spectrometric confirmation of anabolic compounds in injection sites/ Batjoens P. and De Brabander H.F. // Analyst. -1994.-V. 119.-2607-2610.

42. Batjoens P. Gas chromatographic-tandem mass spectrometric analysis of clen-buterol residues in faeces/ Batjoens P., Courtheyn D., De Brabander H.F., Ver-cammen J., De Wasch K., Logghe M.// Journal of Chromatography A. 1996. -V.750. - P.133-139.

43. Benoit E. Gas chromatographic/mass spectrometric analysis of 19-nortestosterone urinary metabolites in cattle/ Benoit E., Guyot J.L., Courtot D. and Delatour P. // Ann. Rech. Vet. 1989. - V.20. - P.485-491.

44. Bergink E.W. Metabolism and receptor binding of nandrolone and testosterone under in itro and in vivo conditions/ Bergink E.W., Geelen J.A.A. and Turpijn E.W. //ActaEndocrinologica. 1985. -Suppl. 271. -P.31-37.

45. Bernstein L. The epidemiology of breast cancer/ Bernstein L.// Women and Cancer.- 1998.-V.1.-P.7-13.

46. Bernstein L. Hormone levels in older women: a study of post-menopausal breast cancer patients and healthy population controls/ Bernstein L., Ross R.K., Pike

47. М.С., Brown J.B. and Henderson B.E. // Br. J. Cancer. 1990. - V.61. - P.298-302.

48. Berrino F. Serum sex hormone levels after menopause and subsequent breast cancer/ Berrino F., Muti P., Micheli A. et al.// J. Natl. Cancer Inst. 1996. -V.88. - P.291-296.

49. Bilbao-Garay J. Intoxicacion por Clenbuterol. Datos clinicos у analiticos en un brote en Mostoles/ Bilbao-Garay J., Hoyo-Jimenez J.F., Lopez-Jimenez M. et al. // Rev. Clin. Esp. 1997. -V.197. - P.92-95.

50. Birch A.J. Hydroaromatic steroid hormones. Part 1. Ю-Nortestosterone/ Birch A.J. // Journal of the Chemical Society. 1950. - V.44. - P.367-368.

51. Bocca B. Simultaneous determination of Zilpaterol and other beta agonists in calf eye by gas chromatography/tandem mass spectrometry/ Bocca В., Fiori M., Cartoni C. and Brambilla G.// Journal of AOAC International. 2003. - V.86 (1). - P.8-14.

52. Bocchinfuso W.P. Hormonal signaling pathways in mammary glands of ERKO/WNT-1 mice/ Bocchinfuso W.P., Couse J.F., Hively W.P., Varmus H.E., and Korach K.S. // Proc. 80Ih Annual Meeting Endocr. Soc. 1998. - P.5.

53. Boeseken J. The use of boric acid for the determination of the configuration of carbohydrates/ Boeseken J. // Adv. Carbohydr. Chem. 1949. - V.4. - P. 189210.

54. Both-Miedema R. 19-nortestosterone. Its metabolism in the rabbit/ Both-Miedema R., Van Groenestein T.J.A., De Groot W.C. et al.// Steroids Lipids Res.- 1972. V.3.-P.49-58.

55. Bouffault J.C. Anabolic activity of trenbolone acetate alone or in association with estrogens/ Bouffault J.C., Willemart J.P. In: Anabolics in Animal Production (by ed. Meissonnier E.). Office International des Epizootics, Paris. -1983. - P.155-192.

56. Bowers L. D. Separation and confirmation of anabolic steroids with quadrupole ion trap tandem mass spectrometry/ Bowers L. D., Borts D.J.// Journal of Chromatography B. 1996. - V.687. - P.69-78.

57. Boyd D. Matrix solid phase dispersion (MSPD) as a multiresidue extraction technique for p-agonists in bovine liver tissue/ Boyd D., O'Keeffe M. and Smyth M.R.// Analyst. 1994. - V. 119. - P. 1467-1470.

58. Boyd D. Matrix solid phase dispersion linked to solid phase extraction for beta agonists in liver samples: An update/ Boyd D., O'Keeffe M. and Smyth M.R.// Analytical Proceedings. 1995. - V.32. - P.301-303.

59. Boyd D. Methods for the determination of p-agonists in biological matrices/ Boyd D., O'Keeffe M. and Smyth M.R.// The Analyst. 1996. - V.21. - P.1R-10R.

60. Boyd D. Application of matrix solid-phase dispersion for the determination of clenbuterol in liver samples/ Boyd D., Shearan P., Hopkins J.P. et al. // Ana-lytica Chimica Acta. 1993. -V.275. -P.221-226.

61. Boyd D. Matrix solid phase dispersion linked to immunoassay techniques for the determination of clenbuterol in bovine liver samples/ Boyd D., Shearan P., Hopkins J.P., O'Keeffe M., Smyth M.R.// Anal. Proc. 1993. - V.30. - P. 156-157.

62. Boyd J. Molecular genetics analysis of clear cell adenocarcinomas of the vagina associated and unassociated with diethylstilbestrol exposure in utero/ Boyd J., Takahashi H., Waggoner S.E., Jones L.A. et al. // Cancer. 1996. - V.77. -P.507-513.

63. Bradlow H.L. Modified technique for elution of polar steroid conjugates from Amberlite-XAD-2/ Bradlow H.L. // Steroids. 1977. - V.30. - P.581-582.

64. Brambilla G. Food poisoning following consumption of clenbuterol-treated veal in Italy/ Brambilla G., Loizzo A., Fontana M. et al.// Journal American Med. Assoc.- 1997.-V.278.-P.635.

65. Brooks R.V. Detection of anabolic steroids by radioimmunoassay/ Brooks R.V., Firth R.G. and Sumner R.A.// British Journal of Sports Medicine. 1975. - V.9.- P.89-92.

66. Brooks R.V. Detection of anabolic steroid administretion to athletes/ Brooks R.V., Jeremiah G., Webb W.A. et al.// Journal of Steroid Biochemistry. 1979.- V.11.-P.913-917.

67. Calvarese S. Experimental administration of 19-nortestosterone and dexa-methasone in cattle: elimination of the two drugs in different biological matrices/ Calvarese S., Rubini P., Urbani G. et al. // Analyst. 1994. - V.119. -P.2611-2615.

68. Cao K. Covalent binding of catechol estrogens to glutathione catalyzed by horseradish peroxidase, lactoperoxidase or rat liver microsomes/ Cao K., Deva-nesan P.D., Ramanathan R. et al. // Chem. Res. Toxicol. 1998. - V.I 1. -P.917-924.

69. Carlstrom K. Low endogenous estrogen levels analytical problems and tissue sensitivity/ Carlstrom K. // Acta Obstet. Gynecol. Scand., Suppl. 163. - 1996. -V.75.-P.11-15.

70. Carraway K.K. Carbodiimide modification of proteins/ Carraway K.K., Kosland D.E. // Methods Enzymol. 1972. - V.25. - P.616.

71. Cartoni G.P. Capillary gas chromatographic-mass spectrometric detection of anabolic steroids/ Cartoni G.P., Ciardi M., Giarrusso A. et al. // Journal of Chromatography. 1983. - V.279. - P.515-522.

72. Castagnetta L.A. Gas chromatography/ mass spectrometry of catecholestrogens/ Castagnetta L.A., Granata O.M., Arcuri F.P., Polito L.M., Rosati F., Cartoni G.P. // Steroids. 1992. -V.57. - P.437-443.

73. Cavalieri E.L. Molecular origin of cancer: Catechol estrogen-3,4-quinones as endogenous tumor initiators/ Cavalieri E.L., Stack D.E., Devanesan P.D. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - V.94. - P.10937-10942.

74. Chan E.C.Y. Preparation and characterization of immunogens for antibody production against metanephrine and normetanephrine/ Chan E.C.Y., Ho P.C. // J. Immunol. Methods. 2002. - V.266. - P. 143.

75. Chang C. Androgen Receptor: an overview/ Chang C., Saltzman A., Yeh S. et al. // Crit. Rev. Eukaryotic Gene Expr. 1995. - V.5. - P.97-125.

76. Chu F.S. Ethylendiamine modified bovine serum albumin as protein carrier in the production of antibody against mycotoxins/ Chu F.S., Lau H.P., Fan T.S., Zhang G.S.// J. Immunol. Methods. 1982. - V.55. - P.73.

77. Cirimele V. Testing of the anabolic stanozolol in human hair by gas chromatog-raphy-negative ion chemical ionization mass spectrometry/ Cirimele V., Kintz P., Ludes B. // Journal of Chromatography. 2000. - V.740. - P.265-271.

78. Clouet A. Identification of endogenous 19-nortestosterone in pregnant ewes by gas chromatography-mass spectrometry/ Clouet A., Le Bizec В., Montrade M., Monteau F. and Andre F. // Analyst. 1997. - V.122. - P.471-474.

79. Codex Alimentarius. V. 3. Residues of Veterinary Drugs in Foods, 2nd ed. Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome, 1993.

80. Collins S. Multi-residue analysis for p-agonists in urine and liver samples using mixed phase columns with determination by radioimmunoassay/ Collins S., O'Keeffe M. and Smyth M.R. // The Analyst. 1994. V. 119. - P.2671 -2674.

81. Cooper J. Comparison of the efficiencies of enzymatic and chemical hydrolysis of (nortestosterone and diethylstilboestrol) glucuronides in bovine urine/ Cooper

82. J., Currie W., Elliott C.T.// Journal of Chromatography. 2001. - V.757. -P.221-227.

83. Courtheyn D. Multi-residue enzyme immunoassays for screening for beta-agonists in faeces and feeds/ Courtheyn D., Bakeroot V., De Voider F., Ver-cammen J.//J. Food Agric. Immunol.- 1994.-V.6.-P. 131-139.

84. Courtheyn D. Recent developments in the use and abuse of growth promoters/ Courtheyn D., Le Bizec В., Brambilla G. et al.// Analytica Chimica Acta. -2002. V.473. - P.71-82.

85. Courtheyn D. Beta-Agonists in animal feed II: optimization of the extraction/ Courtheyn D., Moermans R., Schilt R., Boenke A. // Food Addit. Contam. -1996. V. 13. - P.493-510.

86. Cristino A. Control of the illegal use of clenbuterol in bovine production/ Cris-tino A., Ramos F., da Silveira M.I.N. // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2003. - V.32. - P.311 -316.

87. Daeseleire E. Metabolism of 17p-19-nortestosterone in urine of calves after oral intake and intramuscular administration/ Daeseleire E., De Guesquiere A. and Van Peteghem C. // Analytica Chimica Acta. 1993. - V.275. - P.95-103.

88. Daeseleire E. Validation of multi-residue methods for the detection of anabolic steroids by GC-MS in muscle tissues and urine samples from cattle/ Daeseleire E., Vandeputte R. and Van Peteghem C. // Analyst. 1998. - V.l23. - P.2595-2598.

89. Daeseleire E. Multiresidue analysis of anabolic agents in muscle tissues and urines of cattle by GC-MS/ Daeseleire E., DeGuesquiere A., Van Peteghem C.H.// J. Chromatogr. Sci. 1992. - V.30. - P.409-414.

90. Damasceno L. Derivatization procedures for the detection of P2-agonists by gas chromatographic/mass spectrometric analysis/ Damasceno L., Ventura R., Or-tuno J., Segura J.// Journal of Mass Spectrometry. 2000. - V.35. - P. 12851294.

91. De Brabander H.F. Nortestosterone in Cattle/ De Brabander H.F., van Hende J., Batjoens P. // Analyst. 1994. - V.l 19. - P.2581-2585.

92. Debruyckere G. Detection of 19-nortestosterone and its urinary metabolites in miniature pigs by gas chromatography-mass spectrometry/ Debruyckere G. and Van Peteghem C.//Journal of Chromatography. 1991. - V.564. - P.393-403.

93. Degand G. Determination of clenbuterol in bovine tissues and urine by enzyme immunoassay/ Degand G., Bernes-Duyckaerts A. and Maghuin-Rogister G.// Journal of Agricultural and Food Chemistry. 1992. - V.40 - P.70.

94. Degroodt J.M. Immunoaffinity chromatography purification of salbutamol in liver and HPLC-fluorometric detection at trace residue level/ Degroodt J.M., Wyhowski-de-Bukanski В., Srebrnik S. // Z. Lebensm. Unters. Forsch. 1992. -V.195. - P.566-568.

95. Delahaut Ph. Development of a specific radioimmunoassay for the detection of clenbuterol residues in treated cattle/ Delahaut Ph., Dubois M., Pri-Bar I., Buchman O., Degand G. and Ectors F.// Food Additives and Contaminants. -1991.-V.8.-P.43-53.

96. Determination of beta agonists in tissue. / Canadian Food Inspection Agency. Centre for Veterinary Drug Residues. Health of Animals Laboratory. 2000. -Version BAGS-SP01. - 13 p.

97. Din N. An investigation of supercritical fluid extraction of trenbolone from beef/ Din N., Bartle K.D., Clifford A.A. // J. High Resolute. Chromatogr. 1996. -V.19.-P.465-469.

98. Donike M. Acylierung mit Bis(acylamiden). N-Methyl-bis(trifluoroacetamid) und bis(trifluoracetamid), zwei neue Reagenzien zur Trifluoracetylierung/ Donike M. // J. Chromatogr. 1973. - V.78. - P.273-279.

99. Duckett S.K. Effect of anabolic implants on beef musculature lipid content / Duckett S.K., Wagber D.G., Owen F.N. et al.// J. Anim. Sci. 1999. - V. 77. -P. 1100- 1104.

100. Dugal R. Radioimmunoassay of anabolic steroids: an evaluation of three antis-era for the detection of anabolic steroids in biological fluids/ Dugal R., Dupuis

101. С., Bertrand M.J.// British Journal of Sports Medicine. 1977. - V.l 1. - P. 162169.

102. Dumasia M.C. Screening and confirmatory analysis of P-agonists, P-antagonists and their metabolites in horse urine by capillary gas chromatography-mass spectrometry/ Dumasia M.C. & Houghton E.// J. Chromatogr. 1991. - V.564. -P.503-513.

103. Dumasia M.C. Studies related to the metabolism of anabolic steroids in the horse: the phase I and phase II biotransformation of 19-nortestosterone in man in the equine castrate/ Dumasia M.C. and Houghton E.// Xenobiotica. 1984. -V.14. - P.647-655.

104. Dumasia M.C. Steroids in equine testes: the identification of endogenous 19-hydroxy and 19-nor neutral steroids by gas chromatography-mass spectrometry/ Dumasia M.C., Houghton E. and Jackiw M. // Journal of Endocrinology. 1989. - V.120.-P.223-229.

105. Dumasia M.C. Studies related to the metabolism of anabolic steroids in the horse: the metabolism of 1-dehydrotestosterone and the use of fast atom bombardment mass spectrometry in the identification of steroid conjugates/ Dumasia

106. М.С., Houghton E., Bradley C.V. and Williams D.H.// Biomedical and Envi-ronmantal Mass Spectrometry. 1983. - V.l0. - P.434-440.

107. Dunn T.G. Metabolites of estradiol-17 and estradiol-17-3-benzoate in bovine tissues/ Dunn T.G., Kaltenbach C.C., Koritnik D.R., Turner D.L. and Niswender G.D. // J. Anim. Sci. 1977. - V.46. - P.659-673.

108. Durbeck H.W. Gas chromatographic and capillary column chromatographic-mass spectrometric determination of synthetic anabolic steroids/ Durbeck H.W., Buker I., Scheulen B. and Telin В.// Journal of Chromatography. 1978. -V.167. - P.117-124.

109. Ekins R. Towards immunoassays of greater sensitivity, specificity and speed: an overview. In: Monoclonal Antibodies and development in Immunoassay /by ed. A. Albertini and R. Ekins. Elsevier/North-Holland Biomedical Press, Amsterdam.-1981.

110. Elliott C.T. Development of a dual label time-resolved fluoroimmunoassay for the detection of P-agonists in cattle urine/ Elliott C.T., Baxter A., Haasnoot W. et al.// Food Agric. Immunol. 1996. - V.8. - P.219-227.

111. Elliott C.T. Observations on the effects of long-term withdrawal on carcass composition and residue concentrations in clenbuterol-medicated cattle/ Elliott C.T., Crooks S.R.H., McEvoy J.D.G. et al.// Vet. Res. Commun. 1993. - V.l7. - P.459-468.

112. Elliott C.T. Investigation of dissociation enhanced lanthanide fluoroimmunoassay as an alternative screening test for veterinary drug residues/ Elliott C.T., Francis K.S., McCaughey WJ. // Analyst. 1994. - V.l 19. - P.2565-2569.

113. Elliott C.T. Effective laboratory monitoring for the abuse of the beta-agonist clenbuterol in cattle/ Elliott C.T., McEvoy J.D.G., McCaughey WJ. and Shortt H.D. // The Analyst. -1993. V.l 18. - P.447-448.

114. Enmark E. Human estrogen receptor P-gene structure, chromosomal localization and expression pattern/ Enmark E., Pelto-Huikko M., Grandien K. et al. // J. Clin. Endocrinol. Metabol. 1997. - V.82. - P.4258-4265.

115. Ере B. Site-specific covalent binding of stilbene-type and steroidal estrogens to tubulin following metabolic activation in vitro/ Ере В., Hegler J. and Metzler M. // Carcinogenesis. 1987. - V.8. - P. 1271 -1275.

116. Eriksson H. Excretion of steroid hormones in adults. Steroids in urine from a pregnant woman/ Eriksson H. and Gustafsson J.-A.// European Journal of Biochemistry. 1970. - V. 16. - P.268-277.

117. Erlanger B.F. Principles and methods for the preparation of drug protein conjugates for immunological studies/ Erlanger B.F. // Pharmacol. Rev. 1973. -V.25. - P.271.

118. Erlanger B.F. The preparation of Antigenic Hapten-carrier conjugates: a survey/ Erlanger B.F. // Methods Enzymol. 1980. - V.70(A). - P.85.

119. Erlanger B.F. Steroid-protein conjugates. I. Preparation and characterization of conjugates of bovine serum albumin with testosterone and with cortisone/ Erlanger B.F., Borek F., Beiser S.M. and Lieberman S.// J. Biol. Chem. 1957. -V.228. -P.713-727.

120. Evrard P. In vitro metabolism of trenbolone: study of the formation of cova-lently bound residues/ Evrard P., Maghuin-Rogister G.// Food Addit. Contam. -1988.-V.5.-P.59-65.

121. Fahmy D. Some observations on the determination of Cortisol in human plasma by radioimmunoassay using antisera against cortisol-3-BSA/ Fahmy D., Read G.F., Hillier S.G.// Steroids. 1975. - V.26(3). - P.267-280.

122. Fara G.M. Epidemic of breast enlargement in an Italian school / Fara G.M., Del Corvo G., Bernuzzi S., Bigatello A., Di Pietro C., Scaglioni S., Chiumello G. // Lancet. 1979. - V. 11. - P.295-297.

123. Farjam A. Immunoafflnity pre-column for selective on-line sample pre-treatment in high-performance liquid chromatography determination of 19-nortestosterone/ Farjam A., de Jong G.J., Frei R.W. et al.// J. Chromatogr. -1988. V.452. - P.419-433.

124. Feigelson H.S. Estrogens and Breast cancer/ Feigelson H.S., and Henderson B.E.// Carcinogenesis. 1996. - V.17. - P.2279-2284.

125. Fodey T.L. The appraisal of an automated multi-immunoaffmity chromatography system to detect anabolic agents in bile and urine/ Fodey T.L., Elliott C.T., Crooks S.R.H., McCaughey W.J. // Food Agric. Immunol. 1996. - V.1996. -P. 157-167.

126. Fotherby K, Metabolism of synthetic steroids/ Fotherby K., James F.L.// Adv. Steroid Biochem. Pharmacol. 1972. - V.3. - P.67-165.

127. Frenkel K. Carcinogen-mediated oxidant formation and oxidative DNA damage/ Frenkel K. // Pharmac. Ther. 1992. -V.53. - P.127-166.

128. Fuentes M. Aldehyde-dextran-protein conjugates to immobilized amino-haptens cross-reactions in the immunodetection/ Fuentes M., Mateo C., Fernandez-Lafiiente R., Guisan J.M. // Enzyme Microb. Technol. 2005. - V.36. - P.510.

129. Gaillard Y. Detection of illegal clenbuterol use in calves using hair analysis-Application in meat quality control/ Gaillard Y., Balland A., Doucet F. and Pepin G.// Journal of Chromatography В. -1997. V.703. - P.85-95.

130. Gaskell S.J. Quantification of steroid conjugates using fast atom bombardment mass spectrometry/ Gaskell S.J. // Steroids. 1990. - V.55. - P.458-462.

131. Giguere V. Estrogen receptor P: Re-evaluation of estrogen and antiestrogen signaling/ Giguere V., Tremblay A., Tremblay G.B. // Steroids. 1998. - V.63. -P.335-339.

132. Ginsburg E.S. Half-life of estradiol in postmenopausal women/ Ginsburg E.S., Gao X., Shea B.F., Barbieri R.L. // Gynecologic and Obstetric Investigation. -1998. V.45. - P.45-48.

133. Gleixner A. Einmalapplikation, Mehrfachapplikation und Metabolitenmuster von Clenbuterol beim Menschen/ Gleixner A., Sauerwein H. and Meyer H.H.D.// Archiv fur Lebensmittelhygiene. -1996. V.47. - P.131-135.

134. Gower D.B. Steroid catabolism and urinary excretion/ Gower D.B. In Biochemistry of Steroid Hormones (by ed. H.L.J. Makin). Blackwell Scientific Puubli-cations, Oxford. - 1984. -P. 349-382.

135. Gowik P. Measurement of P-agonist residues in retinal tissue of food producing animals/ Gowik P., Julicher В., Ladwig M. and Behrendt D. // Analyst. 2000. -V.125.-P.1103-1107.

136. Greenwald P. Endometrial cancer after menopausal use of estrogens/ Greenwald P., Caputo T.A. and Wolfgang P.E. // Obstet. Gynecol. 1977. - V.50. - P.239-243.

137. Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement. ISO, Geneva, 1993. ISBN 92-67-10188-9.

138. Guyer C.G. Trace analysis of clenbuterol using supercritical fluid extraction and gas-chromatographic techniques/ Guyer C.G.// Dissertation Abstracts International. -1991.-V.52.-P.117.

139. Haasnoot W. Fast clenbuterol residue analysis in urine by HPLC with on-line automated sample processing using immunoaffinity chromatography/ Haasnoot W., Ploum M.E., Paulussen R.J.A. et al. // Journal of Chromatography. 1990. -V.519. - P.323.

140. Haasnoot W. Determination of fenoterol and ractopamine in urine by enzyme immunoassay/ Haasnoot W., Stouten P., Lommen A. et al.// Analyst. 1994. -V.l 19. - P.2675-2680.

141. Haasnoot W. A fast immunoassay for the screening of P-agonists in hair/ Haasnoot W., Stouten P., Schilt R. and Hooijerink D. // Analyst. 1998. - V.l23. -P.2707-2710.

142. Haasnoot W. Development of a tube enzyme immunoassay for «оп-site» screening of urine samples in the presence of Р-agonists/ Haasnoot W., Streppel L., Cazemier G. et al.// Analyst. 1996. - V. 121. - P.l 111-1114.

143. Haber E. Automated sample preparation and gas chromatographic-mass spec-trometric analysis of urinary androgenic anabolic steroids/ Haber E., Munoz-Guerra J. A., Soriano C. et al.// Journal of Chromatography B. 2001. - V.755. -P. 17-26.

144. Hahn B.N. Systemic Lupus Erythematosus/ Hahn B.N. In: Harrison s Principle of Internal Medicine (by ed. Fauci A.S.). MacGraw-Hill, New-York. - 1998. -P. 1874-1880

145. Hahnau S. Evaluation of commercially available ELISA test kits for the detection of clenbuterol and other p2-agonists/ Hahnau S. and Julicher В.// Food Additives and Contaminants. 1996. - V.l3. - P.259-274.

146. Hakomori S. A rapid permethylation of glycolipid, and polysaccharide catalyzed by methylsulfinyl carbanion in dimethyl sulfoxide/ Hakomori S.// J. Bio-chem. 1964. - V.55. - P.205-208.

147. Hamoir T. Comparison of purification procedures for the isolation and detection of anabolic residues in faeces using gas chromatography-mass spectrometry/ Hamoir Т., Courtheyn D., De Brabander H. et al. // Analyst. 1998. - V.123. -P.2621-2624.

148. Hampl R. Practical aspects of screening of anabolic steroids in doping control with particular accent to nortestosterone radioimmunoassay using mixed antis-era/ Hampl R. and Starka L. // Journal of Steroid Biochemistry. 1979. - V.l 1. - P.933-936.

149. Han X. DNA single strand breaks in the kidneys of Syrian hamsters treated with steroidal estrogens: hormone-induced free radical damage preceeding renal ma-lignancy\ Han X. and Liehr J.G. // Carcinogenesis. 1994a. - V.l5. - P.997-1000.

150. Handbook of Derivatives for Chromatography (by ed. K. Blau and G.C. King). -Heyden, London. 1977. - Ch. 2-6.

151. Hanly W.C. Review of Polyclonal Antibody Production Procedures in Mammals and Poultry/ Hanly W.C., Artwohl J.E. and Bennett B.T. // ILAR Journal. -1995.-V.37(3). -P.l-31.

152. Harrison L.M. Effect of extended use of single anabolic steroids on urinary steroid excretion and metabolism/ Harrison L.M., Martin D., Gotlin R.W. and Fen-nessey P.V. // Journal of Chromatography. 1989. - V.489. - P. 121-126.

153. Hartmann S. Simultaneous determination of anabolic and catabolic steroid hormones in meat by gas chromatography-mass spectrometry/ Hartmann S., Steinhart H. // Journal of Chromatography B. 1997. - V.704. - P. 105-117.

154. Hawkins R.A. Estimation of oestrone sulphate, oestradiol-17P and oestrone in peripheral plasma: concentrations during the menstrual cycle and in men/ Hawkins R.A., Oakey R.E. // J. Endocr. 1974. - V.60. - P.3-17.

155. Hayashi N. Estrogen-induced cell transformation and DNA adduct formation in cultured Syrian hamster embryo cells/ Hayashi N., Hasegawa K., Komine A. et al. // Mol. Carcinogenesis. 1996. -V.16. - P.149-156.

156. Hayes C.L. 17P-Estradiol hydroxylation catalyzed by human cytochrome P450 1В1/ Hayes C.L., Spink D.C., Spink B.C., Cao J.Q., Walker N.J., Sutter T.R.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - V.93. -P.9776-9781.

157. Helbo V. Development of a radioreceptor assay for P2 adrenergic agonists/ Helbo V., Vandenbroeck M., Maghuin-Rogister G.// Arch. Lebensmittelhyg. -1994. V.45. - P.57-61.

158. Henderson B.E. Hormonal chemoprevention of cancer in women/ Henderson B.E., Ross R.K. and Pike M.C.// Science. 1993. - V.259. - P.633-638.

159. Herbst A.L. Developmental Effects of Diethylstilbestrol (DES) in Pregnancy/ Herbst A.L., Bern H.A. New York, NY: Thieme-Stratton. - 1988.

160. Hernandez-Carrasquilla M. External contamination of bovine hair with p2-agonist compounds: evaluation of decontamination strategies/ Hernandez-Carrasquilla M.// Journal of Chromatography B. 2002. - V.767. - P. 235-243.

161. Hernandez-Carrasquilla M. Gas chromatography-mass spectrometry analysis of p2-agonists in bovine retina/ Hernandez-Carrasquilla M. // Analytica Chimica Acta. 2000. - V.408. - P.285-290.

162. Hernandez-Carrasquilla M. Gas chromatography-mass spectrometry analysis of anabolic compounds in bovine hair: evaluation of hair extraction procedures/ Hernandez-Carrasquilla M. // Analytica Chimica Acta. 2001. - V.434. - P.59-66.

163. Hertz R. The estrogen problem retrospect and prospest/ Hertz R. In: Estrogens in the environment: II influenced on development (by ed. J.A. McLachlan). -New York: Elsevier. 1985.-P. 1-11.

164. Hewitt S.A. Screening and confirmatory strategies for the surveillance of anabolic steroid abuse within Northern Ireland/ Hewitt S.A., Kearney M., Currie J.W., Young P.B., Kennedy D.G. // Analytica Chimica Acta. 2002. - V.473. -P.99-109.

165. Highman B. Osseous changes and osteosarcomas in mice continuously fed diets containing diethylstilbestrol or 17P-estradiol/ Highman В., Roth S.I., and Greenman D.L. // J. Natl. Cancer. 1987. - V.76. - P.653-662.

166. Hodgson A.V. Estrogen-induced microsatellite DNA alterations are associated with Syrian hamster kidney tumorigenesis/ Hodgson A.V., Ayala-Torres S., Thompson E.B. and Liehr J.G. // Carcinogenesis. 1998. -V.19. - P.2169-2172.

167. Hoffmann B. Anabolic agents with sex hormone-like activities: Problems of residues/ Hoffmann В., Evers P. In: Drug Residues in Animals (by ed. Rico A.G.). Academic Press, New York. - 1986. - P.l 11-146.

168. Hoffmann B. Metabolic fate of anabolic agents in treated animals and residue levels in meat/ Hoffmann В., Karg H. // Environ. Qual Safety Suppl. 1976. -V.5. - P.l81-191.

169. Hoogenboom L.A.P. Estrogenic activity of estradiol and its metabolites in the ER-CALUX assay with human T47D breast cells/ Hoogenboom L.A.P., de Haan L., Hooijerink D. et al. // APMIS . 2001. - V. 109. - P. 101-107.

170. Hooijerink H. Screening for gestagens in kidney fat using accelerated solvent extraction and liquid chromatography electrospray tandem mass spectrometry/ Hooijerink H., van Bennekom E.O., Nielen M.W.F. // Analytica Chimica Acta. 2003.-V.483.-P.51-59.

171. Houghton E. Studies related to the metabolism of anabolic steroids in the horse: the identification of some 16-oxygenated metabolites of 19-nortestosterone/ Houghton E. and Dumasia M.C. //Xenobiotica. 1980. - V. 10. -P.381-390.

172. Houghton E. Studies related to the metabolism of anabolic steroids in the horse: testosterone/ Houghton E. and Dumasia M.C.// Xenobiotica. 1979. - V.9. -P.269-279.

173. Houghton E. Some applications of chromatography to steroid analysis in the horse/ Houghton E., Dumasia M.C. and Teale P. // Analyst. 1988. - V.l 13. -P.l 179-1187.

174. Houghton E. The use of stable isotopes and gas chromatography/mass spectrometry in the identification of steroid metabolites in the equine/ Houghton E., Dumasia M.C., Teale P.// Steroids. 1990. - V.55. - P.433-439.

175. Houghton E. Detection of the administration of anabolic preparations of nan-droline to the entire male horse/ Houghton E., Ginn A., Teale P. et al. // Equine Veterinary Journal. 1986. - V.l8. - P.491-493.

176. Houghton E. Application of gas chromatography/mass spectrometry to steroid analysis in equine sports: problems with enzyme hydrolysis/ Houghton E., Grainger L., Dumasia M.C. et al. // Organic Mass Spectrometry. 1992. - V.27. -P.1061-1070.

177. Howell L. Melanin as an adsorbent for drug residues/ Howell L., Godfrey M., Sauer M.J. // Analyst. 1994. - V.l 19. - P.2691-2693.

178. Howells L. Extraction and clean-up of the p-agonist salbutamol from liver and its determination by enzyme immunoassay/ Howells L., Sauer M., Sayer R., Clark D.// Anal. Chim. Acta. 1993. - V.275. - P.275-278.

179. Huseby R.A. Demonstration of a direct carcinogenic effect of estradiol on Ley-dig cells of the mouse/ Huseby R.A.// Cancer Res. 1980. - V.40. - P. 10061013.

180. IARC monographs on the evaluation of the carcinogenic risk of chemicals to humans. Vol. 21. Sex hormones (II). International Agency for Research on Cancer, Lyon. - 1979. - P. 173.

181. IARC Monographs on the evaluation of the carcinogenic risks to humans. Volume 27. Sex Hormones. International Agency for Research on Cancer, Lyon. -1995.

182. IARC Monographs on the evaluation of the carcinogenic risks to humans. Volume 66. Some pharmaceutical drugs. International Agency for Research on Cancer, Lyon. - 1996.

183. IARC Monographs on the evaluation of the carcinogenic risks to humans. Volume 72. Some hormones, postmenopausal hormone therapy, and hormonal contraception. International Agency for Research on Cancer, Lyon. - 1998.

184. IARC Overall evaluations of carcinogenicity: an updating of IARC Monographs. Volumes 1 to 42. Supplement №7. International Agency for Research on Cancer, Lyon. - 1987.

185. International Vocabulary of Basic and General Terms in Metrology. ISO, Geneva, 1993. ISBN 92-67-10175-1.

186. Itoh S. Identification of estrogen-modified nucleosides from calf thymus DNA reacted with 6-hydroxyestrogen-6-sulfates/ Itoh S., Hirai Т., Tutsuka Y. et al.// Chem. Res. Toxicol. 1998. -V.l 1. - P. 1312-1318.

187. Jansen E.H.J.M. Comparison between spectrophotometric and chemilumines-cence detection in enzyme immunoassays for nortestisterone/ Jansen E.H.J.M., Bergman J.J., Van den Berg R.H., Zomer G.// Anal. Chim. Acta. 1989. -V.227. - P. 109-117.

188. JECFA-Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives. Fifty-second meeting. Summary and Conclusions. Rome 2-11 February. - 1999.

189. JECFA-WHO Evaluation of certain veterinary drugs residues in food. Thirty-second report of the Joint FAO/WHO Expert Commitee on Food Additives. WHO technical Report Series 763. World Health Organization, Geneva. -1988.

190. Jenster G. Coactivators and corepressors as mediators of nuclear receptor function: An update/ Jenster G. // Molec. Cell Endocrinol. 1998. - V.43. - P. 1-7.

191. Jiang W. Formaldehdye-mediated aggregation of proteins antigens: comparison of untreated and formalinized model antigens/ Jiang W., Schwendeman S.P.// Biotechnol. Biotechnol. 2000. - V.70. - P.5.

192. Jimenez-Carmona M.M. Ion-pair/supercritical fluid extraction of clenbuterol from samples/ Jimenez-Carmona M.M., Тепа M.T. and Luque de Castro M.D.// Journal of Chromatography. 1995. - V.711. - P.269-276.

193. Joffe M. Accidental gynecomastia in children- Discussion / Joffe M., Chiumello G., Thonneau P. et al.// APMIS. 2001. - V.109. - P. S207-S209.

194. Jondorf W.R. 19-Nortestosterone, a model for the use of anabolic steroid conjugates in raising antibodies for radioimmunoassay/ Jondorf W.R. // Xenobi-otica. 1977. - V.7.-P.671-681.

195. Jondorf W.R. Radioimmunoassay technique for detecting urinary excretion products after administration of synthetic anabolic steroids to the horse/ Jondorf W.R. and Moss M.S.// Xenobiotica. 1978. - V.8. - P. 197-206.

196. Jondorf W.R. On the raising of antibody to the synthetic anabolic steroid trien-bolone, its partial characterization and preliminary application for radioimmunoassay/ Jondorf W.R. // Experientia. 1980. - V.36. - P.394-395.

197. Joshi U.M. A sensitive and specific enzymeimmunoassay for serum testosterone/ Joshi U.M., Shah H.P. and Susheela P.S. // Steroids. 1979. - V.34. -P.35-42.

198. Jouquey A. Analytical methods for trenbolone/ Jouquey A., Mouren M., Salmon J. In: Anabolics in Animal Production (by ed. E. Meissonnier). Office International des Epizootics, Paris. - 1983. - P.423-441.

199. Kaijser M. In utero exposures and breast cancer: a study of opposite-sexed twins/ Kaijser M., Lichtenstein P., Granath F. et al. // J. Natl. Cancer Inst. -2001.-V. 93.-P. 60-62.

200. Kanzaki M. A sensitive, non-isotopic immunoassay for progesterone using the avidin-biotin system/ Kanzaki M., Iwasawa A.// Biomed. Res. 1995. - V.16. -P.381-386.

201. Key T.J.A. The dose-effect relationship between «unopposed» estrogens and endometrial mitotic rate: Its central role in explaining and predicting endometrial cancer risk/ Key T.J.A., Pike M.C. // Br. J. Cancer. 1988. - V.57. -P.205-212.

202. Kicman A.T. Radioimmunoassay for nandrolone metabolites/ Kicman A.T. and Brooks R.V. // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 1988. -V.6. - P.473-483.

203. Kicman A.T. Development of a radioimmunoassay for the synthetic anabolic steroid methenolone/ Kicman A.T. In: new Methods of Detection of Doping with Synthetic and Natural Androgens in Sport. PhD thesis, University of London.- 1989.- P.92-110.

204. Kinter M. Tandem mass spectrometry in drug-abuse testing exemplified for anabolic steroids/ Kinter M., Shipe J.P. and Savory J.// Clinical Chemistry. -1988.-V.34.-P.2176.

205. Kirkman H. Estrogen-induced tumorr of the kidney. III. Growth characteristics in the Syrian hamster/ Kirkman H.// Natl. Cancer. Inst. Monogr. 1959. -No.l. -P. 1-57.

206. Klein C.B. Are diethylstilbestrol and estradiol mutagenic?/ Klein C.B.// Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 1995. - V.36. - P.259.

207. Klein K.O. Estrogen levels in childhood determined by an ultrasensitive recombinant cell bioassay/ Klein K.O., Baron J., Colli M.J., McDonnell D.P., Cutler

208. G.B. // J. Clin. Invest. 1994. - V.94. - P.2475-2480.

209. Kopitar Z. Pharmakokinetik und Metabolitenmuster von Clenbuterol bei der Ratte/ Kopitar Z. and Zimmer A. // Arzneim.- Forsch. Drug Res. 1976. - V.26. - P.1435-1441.

210. Kramer P.M. Integration of Liquid Chromatogfaphy with Immunoassay: An Approoch Combining the Strength of Both Methods / Kramer P.M., Li Q.X. and Hammock B.D.// Journal of AOAC Int. 1994. - V.77. - P. 1275-1287.

211. Kuiper G.G.J.M. Cloning of a novel estrogen receptor expressed in rat prostate and ovary/ Kuiper G.G.J.M., Enmark E., Pelto-Huikko M., Nilsson S., Gustafsson J.-A. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - V.93. - P.5925-5930.

212. Kuiper H.A. Illegal use of p-adrenergic agonists: European Community/ Kuiper

213. H.A., Noordam M.Y., van Dooren-Flipsen M.M.H. et al.// Journal of Animal Science. 1998. - V.76. - P.195-207.

214. Kundu N. Production of antisera against contraceptive steroids/ Kundu N., Keenan S. and Slaunwhite W.R. // Steroids. 1977. - V.30. - P.85-96.

215. Larner J.M.The naturally occurring C-17 fatty acid esters of estradiol are long-acting estrogens/ Larner J.M., MacLusky N.J., Hochberg R.B. // J. Steroid. Bio-chem. 1985 . - V. 22. - P. 407-413.

216. Lasne C. Study of various transforming effects of the anabolic agents trenbolone and testosterone on Syrian hamster embryo cells/ Lasne C., Lu Y.P., Orfila L., Ventura L. and Chouroulinkov I.// Carcinogenesis. 1990. - V.l 1. - P.541-547.

217. Lau J.H.W. Determination of clenbuterol, salbutamol, and cimaterol in bovine retina by electrospray ionization-liquid chromatography-tandem mass spectrometry/ Lau J.H.W., Khoo C.S., Murby J.E.// Journal of AOAC International. -2004. -V.87. -P.31-38.

218. Lavigne J.A. The effects of catechol-O-methyltransferase inhibition on estrogen metabolite and oxidative DNA damage levels in estradiol-treated MCF-7 cells/ Lavigne J.A., Goodman J.E., Fonong T. et al. // Cancer Res. 2001. - V.61. - P. 7488-7494.

219. Le Bizec B. Endogenous nandrolone metabolites in human urine: preliminary results to discriminate between endogenous and exogenous origin/ Le Bizec В., Bryand F., Gaudin I. et al. // Steroids. 2002. - V.67. - P.105-110.

220. Le Bizec B. Le controle des anabolisants dans la viande / Le Bizec В., Mar-chand P., Andre F.// Ann. Toxicol. Anal. 2000. - Vol. XII. - No. 1. - p. 43-48.

221. Le Bizec B. Monitoring anabolic steroids in meat-producing animals. Review of current hyphenated mass spectrometric techniques/ Le Bizec В., Marchand P., Maume D., Monteau F., Andre F.// Chromatographia. 2004. - V.59. - P.S-3 -S-12.

222. Le Bizec B. Detection and identification of anabolic steroids in bovine urine by gas chromatography-mass spectrometry/ Le Bizec В., Montrade M.-P., Monteau F. and Andre F. // Analytica Chimica Acta. 1993. - P.275. - P. 123-133.

223. Le Bizec B. Detection and identification of anabolic steroids in bovine urine by gas chromatography-mass spectrometry/ Le Bizec В., Monrade M.-P., Monteau F. et al. // Analytica Chimica Acta. 1993. - V.275. - P.123-133.

224. Lee H.B. Perfluoro and chloro amide derivatives of aniline and chloroanilines. A comparison of their formation and gas chromatographic determination by massselective and electron capure detection/ Lee H.B.// J. Chromatogr. 1988. -V.457. - P.267-278.

225. Lee M.S. Rapid identification of drug metabolites with tandem mass spectrometry/ Lee M.S. and Yost RAM Biomedical and Environmental Mass Spectrometry. 1988. - V.l 5. - P. 193-204.

226. Leyssens L. Determination of p2-receptor agonists in bovine urine and liver by gas chromatography-tandem mass spectrometry/ Leyssens L., Driessen C., Jacobs A. et al.// Journal of Chromatography B. 1991. - V.564. - P.515-527.

227. Li J.J. Estrogen carcinogenesis in Syrian hamster tissues: Role of metabolism / Li J.J. and Li SAM Fed. Proc. 1987. - V.46. - P.1858-1863.

228. Li J.J. Estrogen carcinogenesis in the hamster kidney: A hormone-driven multistep process/ Li J.J. and Li S.AM Prog. Clin. Biol. Res. 1996. - V.394. -P.255-267.

229. Li J.J. Estrogen carcinogenesis in the hamster kidney: Role of cytotoxicity and cell proliferation/ Li J.J., Gonzalez S., Banerjee S.S., Li S.AM Environ. Health Perspect. 1993. - V.101 (Suppl. 5). - P.259-264.

230. Li K-M. Formation of the depurinating 4-hydroxyestradiol (4-OHE2)-l-N7Gua and 4-OHE2-l-N3Ade adducts by reaction of E2-3,4-quinone with DNA/ Li KM., Devanesan P.D., Rogan E.G., Cavalieri E.L. // Proc. Amer. Assoc. Cancer Res.- 1998.-V.39.-P.636.

231. Liehr J.G. Carcinogenicity of catechol estrogens in Syrian hamsters/ Liehr J.G., Fang W.E., Sirbasku D.A., Ari-Ulubelen A. // J. Steroid Biochem. 1986. -V.24. -P.353-356.

232. Liehr J.G. 4-Hydroxylation of estrogens as marker of human mammary tumors/ Liehr J.G., Ricci M.J. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - V.93. - P.3294-3296.

233. Liehr J.G. Mechanism of inhibition of estrogen-induced renal carcinogenesis in male Syrian hamsters by Vitamin С/ Liehr J.G., Roy D. and Gladek A. // Carcinogenesis. 1989. -V.10. -P.1983-1988.

234. Liehr J.G. Estrogen-dependent kidney tumors/ Liehr J.G., Sirbasku D.A. In: Tissue Culture of Epithelial Cells (by ed. Taub M.). -Plenum Press, New York. 1985. - P.205-234.

235. Lipschutz A. Structure and origin of uterine and extragenital fibroids induced experimentally in the guinea pig by prolonged administration of estrogens/ Lipschutz A., and Vargas L. Jr.// Cancer Res. 1994. - V.l. - P.236-248.

236. Loizzo A. Italian baby food containing diethylstilboestrol three years later/ Lo-izzo A., Gatti G.L., Macri A., Moretti G., Ortolani E., Palazzesi S. // Lancet. -1984. V.5.- P.1014-1015.

237. Lopez de Alda M.J. Review of analytical methods for the determination of estrogens and progestogens in waste waters/ Lopez de Alda M.J., Barcelo D. // Fresenius J. Anal. Chem. 2001. - V.371. - P.437-447.

238. Lowry O.H. Protein measurement with the Folin fenol reagent/ Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.G.// J. Biol. Chem. 1951. - V.l93. -P.265-275.

239. Machnik M., Due M., Parr М., von Kuk С., Schanzer W. Case study: doping substances in equestrian food supplements. Chromatographia. 2004. - V.59. -P.S-131 -S-139.

240. Maistro S. Beta blockers to prevent clenbuterol poisoning/ Maistro S., Chiesa E., Angeletti R. and Brambilla G.// Lancet. 1995. - V.346. - P. 180.

241. Marash S. Animals: chemical inputs for nutrition and health- overview/ Marash S., Oppenberg В., Takei N. CEN Marketing Research Report. -1999.-P.201.8004Q-201.8004R.

242. Marchand P. Ultra trace detection of a wide range of anabolic steroids in meat by gas chromatography coupled to mass spectrometry/ Marchand P., Le Bizec В., Gade C., Monteau F., Andre F.// Journal of Chromatography A. 2000. -V.867.-V.219-233.

243. Margard M.A. Determination of androsterone in pig fat using supercritical fluid extraction and gas chromatography-mass spectrometry/ Margard M.A., Berg H.E.B., Tagesson V. et al.// J. Agric. Food Chem. 1995 . - V.43. - P. 114-120.

244. Martinez-Navarro J.F. Food poisoning related to consumption of illicit P-agonist in liver/ Martinez-Navarro J.F.// Lancet. 1990. - V.336. - P. 1311.

245. Martlbauer E. Immunochemical detection of antibiotics and sulfonamides/ Martlbauer E., Usleber E., Schneider E., Dietrich R. // Analyst. 1994. - V.l 19. -P.2543-2548.

246. Martucci C.P. P450 Enzymes of estrogen metabolism / Martucci C.P., Fishman J.// Pharmac. Ther.- 1993. V.57. - P.237-259.

247. Masse R. Studies on anabolic steroids. III. Detection and characterization of stanozolol urinary metabolites in humans by gas chromatography-mass spectrometry/ Masse R., Ayotte C., Bi H. et al.// Journal of Chromatography. 1989. - V.497. - P. 17-37.

248. Masse R. Studies on anabolic steroids. VII Analysis of urinary metabolites of formebolone in man by gas chromatography-mass spectrometry/ Masse R., Bi H. and Du P.// Analytica Chimica Acta. 1991. - V.247. - P.211 -221.

249. Masse R. Gas chromatographic/mass spectrometric analysis of 19-nortestosterone. Urinary metabolites in man/ Masse R., Laliberte C., Tremblay L. et al.// Biomedical Mass Spectrometry. 1985. - V. 12. - P.l 15-121.

250. Maume D. N-Methyl-N-alkylsilyltrifluoroacetamide-I2 as a new derivatization reagent for anabolic steroid control/ Maume D., Le Bizec В., Marchand P., Montrade M.-P. and Andre F. // Analyst. 1998. - V.l23. - P.2645-2648.

251. Maxwell R.L. An SPE colum-teflon sleeve assembly for in-line retention during supercritical fluid extraction of analytes from biological matrices/ Maxwell R.L., Lightfield A.R., Stolker A.A.M.// J. High Resolut. Chromatogr. 1995. - V.l8. -P.231-234.

252. McLachlan J. Functional toxicology: a new approach to detect biologically active xenobiotics/ McLachlan J. // Environ. Health Perspect. 1993. - V.l01. -P.386-387.

253. McLachlan J.A. Morphological and neoplastic transformation of Syrian hamster embryo fibroblasts by diethylstilbestrol and its analogs/ McLachlan J.A., Wong A., Degen G.H., Barrett J.C.// Cancer Res. 1982. - V.42. - P.3040-3045.

254. Mena M.A. Early postnatal androgenization imprints selective changes in the action of estrogens in the rat uterus/ Mena M.A., Arriaza C.A., Tchernitchin A.N. // Biol. Reprod. 1992. - V.46. - P. 1080-1085.

255. Messeri G. Helix pomatia-induced conversion of some 3P-hydroxysteroids/ Messeri G., Cugneto G., Moneti G. et al.// Journal of Steroid Biochemistry. -1984. V.20. - P.793-796.

256. Metzler M. Metabolism and genotoxicity of the xenobiotic growth promoters zeranol, trenbolone acetate and melengestrol acetate/ Metzler M.//Critical Review.-1999.-V.213.-345-391.

257. Metzler M. Metabolism of some anabolic agents: toxicological and analytical aspects/ Metzler M.// Journal of Chromatography. Biomedical Applications. -1989. -V.489.-P.11-21.

258. Meyer H.H.D. The pharmacokinetics and residues of clenbuterol in veal calves/ Meyer H.H.D. and Rinke L.M. // Journal of Animal Science. 1991. - V.69. -P.4538-4544.

259. Meyer H.H.D. Development of a sensitive microtitration plate enzyme-immunoassay for the anabolic steroid trenbolone/ Meyer H.H.D., Hoffmann S.// Food Addit. Contam. 1987. - V.4. - P. 149.

260. Meyer H.H.D. Ruckstandsanalytik sexual-hormonwirksamer anabolika bei masttieren im ppt-Bereich mittels HPLC/RIA/ Meyer H.H.D., Rapp M., Funcke A.P. // GIT Labor-Medizin. 1987. - V.4. - P.127-132.

261. Mitchell G.A. Illegal use of P-adrenergic agonists in the United States/ Mitchell G.A. and Dunnavan G.// Journal of Animal Science. 1998. - V.76. - P.208-211.

262. Montessissa C. The use of cultured hepatocytes from goats and cattle to investigate xenobiotic oxidative metabolism/ Montessissa C., Anfossi P., Vant Klooster G. and Mengelers M. // Vet. Res. Comm.- 1996. V.20. - P.449-460.

263. Multi residue analysis IAC/GC-MS P-agonists./ Rijksinstitut voor Volksge-zondheid en Milieuhygiene (RIVM). S.O.P.: ARO/114. Revision 5. -1997.09.29,- 13p.

264. Multi residue analysis of anabolic agents./ Rijksinstitut voor Volksgezondheid en Milieuhygiene (RIVM). S.O.P.: ARO/113. Revision 6. 2001.04.26. - 12p.

265. Nagasawa H. Longterm effects of progesterone or diethylstilbestrol with or without estrogen after maturity on mammary tumorigenesis in mice/ Nagasawa H., Mori Т., Nakajima YJI Eur. J. Cancer. 1980. - V.l6. - P. 1583-1589.

266. Nebel R.L. Symposium: cowside tests. On-farm milk progestrone tests/ Nebel R.L. // J. Dairy Sci. 1988. - V.71. - P. 1682-1699.

267. Neeman M. Methylation of alcohols with diazomethane/ Neeman M., Caserio M.C., Roberts J.D., Johnson W.S.// Tetrahedron. 1959. - V.6. - P.36-47.

268. Newbold R.R. Induction of uterine adenocarcinoma in CD-I mice by catechol estrogens/ Newbold R.R., Liehr J.G.// Cancer Research. 2000. -V.60. -P.235-237.

269. Nielen M.W.F. Value of alternative sample matrices in residue analysis for stanozolol/ Nielen M.W.F., Hooijerink H., Essers M.L. et al.// Analytica Chimica Acta. 2003. - V.483. - P.l 1-17.

270. Noble R.L. The development of prostatic adenocarcinoma in Nb rats following prolonged sex hormone administration/ Noble R.L. // Cancer Res. 1977. -V.37. - P.1929-1933.

271. Noonan J.S. A method for detecting amphetamine using gas chromatography of a halogenated derivative/ Noonan J.S., Murdick P.W., Ray R.S. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1969. - V. 168. - P.205-209.

272. Nutter L.M. Characterization of DNA damage induced by 3,4-estrone-o-quinone in human cells/ Nutter L.M., Ngo E.O., Abul-Hajj Y.J.// J. Biol. Chem. 1991. -V.266. - P. 16380-16386.

273. Nutter L.M. An o-quinone form of estrogen produces free radicals in human breast cancer cells: Correlation with DNA damage/ Nutter L.M., Wu Y-Y., Ngo E.O., Sierra E.E., Gutierrez P.L., Abul-Hajj Y.J. // Chem. Res. Toxicol. 1994. - V.7. - P.23-28.

274. O'Keeffe M. Analytical methods for р-agonists/ O'Keeffe M. In: Methods for Veterinary Drug Residue Analysis in Food. The National Food Centre. Research Report No. 9. -Dublin. 1999. - P.2-13.

275. O'Keeffe M. Analytical methods for resorcylic acid lactones/ O'Keeffe M. In: Methods for veterinary drug residue analysis in food. The National Food Centre. Research Report No. 9. Dublin. - 1999. - P. 13-15.

276. O'Keeffe M.J. Supercritical fluid extraction(SFE) as a multi-residue extraction procedure for P-agonists in bovine liver tissue/ O'Keeffe M.J., O'Keeffe M. and Glennon J.D.// The Analyst. 1999. - V.124. - P. 1355.

277. O'Keeffe M.J. Supercritical fluid extraction of veterinary drug residues from meat/ O'Keeffe M.J., O'Keeffe M. The National Food Centre. Research Report No. 19. -Dublin.- 1999.- 18p.

278. O'Keeffe M.J. Supercritical fluid extraction of clenbuterol from bovine liver tissue/ O'Keeffe M.J., O'Keeffe M., Glennon J.D. et al. // The Analyst. 1998. -V.123. - P.2711.

279. Odell V.D. In: Margoulies M. (ed) Protein and Polypeptide Hormones. Ex-cerpta Med., Amsterdam. - 1971.

280. Ogawa S. The complete primary structure of human estrogen receptor p and its heterodimerization with Eralpha in vivo and vitro/ Ogawa S., Inoue S., Wata-nabe T. et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. -V.243. -P.122-126.

281. Olah G.A. Iodotrimethylsilane a versatile synthetic reagent/ Olah G.A. and Narang S.C.// Tetrahedron. - 1982. - V.38. - P.2225-2277.

282. Oriundi M.P. Screening of calf urine for 19-nortestosterone: matrix effect in some immunoassays/ Oriundi M.P., Angeletti R., Bastiani E. et al. // Analyst. -1995. V.120. - P.577-579.

283. Paisley S.I. Effects of implants of daily gains of steers wintered on dormant native tallgrass prairie, subsequent performance, and carcass characteristics/ Paisley S.I., Horn G.W., Ackerman C.J. et al. // J. Anim. Sci. 1999. - V. 77. - P. 291-299.

284. Parkin D.M. Cancer incidence in five continents/ Parkin D.M., Whelan S.L., Ferlay J., Raymond L., Young J. Volume VII. IARC Scientific Publications № 143. International Agency for Research on Cancer, Lyon. - 1997.

285. Parks O.W. Determination of melengestrol acetate in supercritical fluid-solid phase extracts of bovine fat tissue by HPLC-UV and GC-MS/ Parks O.W., Shadwell R.J., Lightfield A.R., Maxwell R.J. // J. Chromatogr. Sci. 1996. -V.34. - P.353-357.

286. Pasquino A.M. Transient pseudo-precocious puberty by probable oestrogen intake in 3 girls/ Pasquino A.M., Balducci R., Manca Bitti M.L., Spadoni G.L., Boscherini B. // Archiv Dis. Child. 1982. - V.57. - P.954-956.

287. Pauillac S. An improved method for the production of antibodies to lipophilic carboxyl hapten using small amount of hapten-carrier conjugate/ Pauillac S., Naar J., Branaa P., Chinain M. //J. Immunol. Methods.- 1998.- V.220.- P. 105.

288. Perez-Comas A. Premature sexual development in Puerto Rico/ Perez-Comas A. // Boletin Asociacion Medica de Puerto Rico. 1988. - V.80. - P.85-90.

289. Petit C.R. In vivo covalent binding of 17a-OH- and 17f3-OH-trenbolone to rat liver DNA/ Petit C.R., Fournier P.A., Rico A.G. et al. //Ann. Rech. Vet. 1989. - V.20. - P.319-326.

290. Pham-Huu-Trung M.T. A direct determination of plasma aldosterone/ Pham-Huu-Trung M.T. and Corvol P.// Steroids. 1974. - V.24. - P.587-598.

291. Pike M. Exogenous hormones and breast cancer risk/ Pike M., Bernstein L., Spicer D. In: Current Therapy in Oncology (by ed. J. Neiderhuber).- St. Louis, B.C. Decker.- 1993.-P.292-302.

292. Ploum M.E. Test strip enzyme immunoassays and the fast screening of nortes-tosterone and clenbuterol residues in urine samples at the part per billion level/ Ploum M.E., Haasnoot W., Paulussen R.J.A. et al.// J. Chromatogr. 1991. -V.564. - P.413-427.

293. Polettini A. Bioanalysis of f32-agonists by hyphenated chromatographic and mass spectrometric techniques/ Polettini A. // Journal of Chromatography B. -1996. V.687. - P.27-42.

294. Polettini A. Determination of p2-agonists in hair by gas chromatography/mass spectrometry/ Polettini A., Montagna M., Segura J. and de la Torre X.// Journal Mass Spectrom. 1996. - V.31. - P.47-54.

295. Polettini A. Clenbuterol and beta-adrenergic drugs detected in hair of treated animal by ELISA/ Polettini A., Segura J., Gonzalez G. et al.// Clin. Chem. -1995. V.41. - P.945-946.

296. Potischman N. Reproducibility of laboratory assays for steroid hormones and sex hormone-binding globulin/ Potischman N., Falk R.T., Laiming V.A., Siiteri P.K., Hoover R.N. // Cancer Res. 1994. - V.54. - P.5363-5367.

297. Pottier J. Plasma kinetics, excretion in milk and tissue levels in the cow following implantation of trenbolone acetate/ Pottier J., Busigny M., Grandadam J.A. // J. Anim. Sci. 1979. - V.41. - P.962-968.

298. Pottier J. Differences in the biotransformation of a 17p-hydroxylated steroid, trenbolone acetate, in rat and cow/ Pottier J., Cousty C., Heitzman R.J., Reynolds I.P.// Xenobiotica. 1981. - V. 11. - P.489-500.

299. Pulce C. Collective human food poisonings by clenbuterol residues in veal liver/ Pulce C., Lamaison D., Keck G. et al. // Veterinary and Human Toxicology. -1991. V.33. - P.480-481.

300. Rajah T.T. The mutagenic potential of antiestrogens at the HPRT locus in V79 cells/ Rajah T.T., Pento J.T.// Res. Commun. Molec. Path. Pharmacol. 1995. -V.89. - P.85-92.

301. Ramos F. Clenbuterol food poisoning diagnosis by gas chromatography-mass spectrometric serum analysis/ Ramos F., Cristino A., Carrola P. et al.// Analytica Chimica Acta. 2003. - V.483. - P.207-213.

302. Rao P.N. Metabolites of estradiol-17 in bovine liver: Identification of the 17-D-glucopyranoside of estradiol-17/ Rao P.N., Purdy R.H., Williams M.C. et al. // Journal Steroid Biochem. 1979. - V. 10. - P. 179-185.

303. Rapp M. Determination of hormone contaminants in milk replacers by high-performance liquid chromatography and immunoassay/ Rapp M. and Meyer H.H.D. // Journal of Chromatography. Biomedical Applications. 1989. -V.489. - P.l81-189.

304. Rapp V.M. Nachweismoglichkeiten des trenboloneinsatzes in der rindermast: radioimmunologische bestimmung und validierung der ergebnisse mittels HPLC/RIA/ Rapp V.M. und Meyer H.H.D. // Archiv fur Lebensmittelhygiene. 1985. - V.36. - P.25-48.

305. Remy R. Residues of growth promoting substances in meat/ Remy R. and De-beuckelaere W. Association des Consommateurs- Test-Achats S.C. Contract No. B5-1050/93/006893 1994. - P.71.

306. Report on Assessment of Risks of Hormonal Growth Promoters in Cattle with Respect to Risks Arising from Abusive Use and Difficulties of Control. EEC, April. - 1999.

307. Residue Analysis in Food. Principles and Applications (by ed. M. O'Keeffe). -Harwoor Academic Publishers. 2000. - 308 p.

308. Residue analysis of 17a- and 17p-trenbolone in bovine urine, meat and liver. Rijksinstitut voor Volksgezondheid en Milieuhygiene (RIVM). S.O.P.: ARO/443. Revision 0. 2000.04.10. - 14p.

309. Richold M. The genotoxicity of trenbolone, a synthetic steroid/ Richold M. // Arch. Toxicol. 1988. - V.61. - P.249-258.

310. RIDASCREEN® 19-Nortestosterone // Enzyme immunoassay for the quantitative analysis of 19-nortestosterone. Art. No.: R 2801.- R-Biopharm AG, Darmstadt, Germany. 28-01-1997. 24 p.

311. RIDASCREEN® Clenbuterol Fast // Enzyme immunoassay for the quantitative analysis of Clenbuterol and other P-agonists. Art. No.: R 1701.- R-Biopharm AG, Darmstadt, Germany. 02-02-06. 28 p.

312. RIDASCREEN® DES // Enzyme immunoassay for the quantitative analysis of diethylstilbestrol. Art. No.: R 2701.- R-Biopharm AG, Darmstadt, Germany. 99-07-19.-24 p.

313. RIDASCREEN® Ethinylestradiol // Enzyme immunoassay for the quantitative analysis of ethinylestradiol. Art. No.: R2501.- R-Biopharm AG, Darmstadt, Germany. 99-07-26. 24 p.

314. RIDASCREEN® Methy{testosterone // Enzyme immunoassay for the quantitative analysis of methyltestosterone. R-Biopharm AG, Darmstadt, Germany. 17-02-94.-23 p.

315. RIDASCREEN® Trenbolon // Enzyme immunoassay for the quantitative analysis of trenbolone. Art. No.: R 2601.- R-Biopharm AG, Darmstadt, Germany. 98-05-05.-28 p.

316. Robins M.J. Catalytic monomethylation of the cis-glycol system by diazome-thane. Effects of novel inorganic catalysts on isomer ratios/ Robins M.J., Lee A.S.K, Norris F.// Carbohydr. Res. 1975. - V.41. - P.304-307.

317. Roda A. Development of a sensitive, direct luminescent enzyme immunoassaay for plasma 17(3-estradiol/ Roda A., Girotti S., Piacentini A.L., Preti S., Lodi S.// Anal. Biochem. 1986. - V.156. - P.267-273.

318. Rosenfield R.L. Role of androgens in growth and development of the fetus, child and adolescent/ Rosenfield R.L.// Adv. Pediatr. 1972. - V.19. - P. 172213.

319. Rossi S.A. Short-column gas chromatography/tandem mass spectrometry for the detection of underivatized anabolic steroids in urine/ Rossi S.A., Johnson J.V. and Yost R.A.// Biological Mass Spectrometry. 1994. - V.23. - P. 131-139.

320. Roy D. Temporary decrease in renal quinone reductase activity induced by chronic administration of estradiol to male Syrian hamsters/ Roy D., Liehr J.G. // J. Biol. Chem. 1988. - V.263. - P.3646-3651.

321. Rumsey T.S. Performance and digestibilities of beef cattle diets supplemented with either soybean meal or roasted soybeans and implanted with Synovex/ Rumsey T.S., Elsasser Т.Н., Kahl S. // J. Anim. Sci. 1999. - V. 77. - P. 16311637.

322. Ryann J.J. Trenbolone acetate: experiences with bound residues in cattle tissues/ Ryann J.J., Hoffmann B. // Journal Assoc. Offic. Anal. Chem. 1978. - V.61. -P.1274-1279.

323. Salleras L. Epidemiologic study of an outbreak of clenbuterol poisoning in Catalonia, Spain/ Salleras L., Dominguez A., Mata E. et al. // Public Health Rep. -1995. V.l 10. - P.338-342.

324. Sample R.H.B. Gas chromatography/mass spectrometry screening for anabolic steroids/ Sample R.H.B. and baenziger J.C. In: Analytical Aspects of Drug Testing (by ed. D.G. Deutsch). John Wiley& Sons Inc., London. - 1989. -P.247-272.

325. Sasco A.J. Epidemiology of breast cancer: an environmental disease? / Sasco

326. A. J.// APMIS. 2001. - V. 109. - P.321-322.

327. Sasco A.J. Migrations et cancers / Sasco A.J.// Revue de Medecine Interne. -1989.-V.10.-P. 341-348.

328. Sauer M.J. P-Agonist abuse in food producing animals: studies of in vitro liver metabolism to evaluate potential target residues/ Sauer M.J., Graham P.J., Lake

329. B.G., Howells L. & Coldham G. In: Proceedings of the EuroResidue III Conference on Residues of Veterinary Drugs in Food (by ed. N. Haagsma and A. Ruiter). Veldhoven, The Netherlands. - 1996. - P.844-847.

330. Sauer M.J. Determination of clenbuterol residues in bovine liver, urine and eye by enzyme immunoassay/ Sauer M.J., Pickett R.J.H., MacKenzie A.L. // Anal. Chim. Acta. 1993. - 275. - P. 195-203.

331. Sauer R.O. Derivatives of the methylchlorosilanes. I. Trimethylsilanol and its simple ethers/ Sauer R.O.// J. Am. Chem. Soc. 1944. - V.66. - P. 1707-1710.

332. Saugy M. Test methods: anabolics/ Saugy M., Cardis C., Robinson N., Schweizer C. // Bailliere's Clinical Endocrinology and Metabolism. 2000. -V.14. - P.l 11-133.

333. Schanzer W. Metabolism of boldenone in man: gas chromatographic/mass spectrometric identification of urinary excreted metabolites and determination of excretion rates/ Schanzer W. and Donike M. // Biological Mass Spectrometry. -1992.-V.21.-P.3-16.

334. Scheutwinkel M. Studies on the genotoxicity of the anabolic drugs trenbolone and zearanol/ Scheutwinkel M., Hude W.V.D., Basler A. // Arch. Toxicol. -1986.-V.59.-P.4-6.

335. Schiffmann D. Trenbolone induces micronucleus formation and neoplastic formation in Syrian hamster embryo fibroblasts but not in mouse C3H10T1/2 cells/ Schiffmann D., Hieber L., Schmuck G. et al. // Arch. Toxicol. 1988. - V.62. -P.49-53.

336. Schilt R. Beta-agonists in animal feed I: first intercomparison of clenbuterol in animal feed materials/ Schilt R., Hooijerink H., Courtheyn D., Boenke A // Food Addit. Contam. 1996. - V.l3. - P.477-492.

337. Schilt R. Screening of cattle urine samples for the presence of beta-agonists with a functional test: some preliminary results/ Schilt R., Hooijerink H., Huf F.A., Zuiderveld O.P., Bast A. // Analyst. 1994. - V.l 19. - P.2667-2670.

338. Schmid J. Biotransformation of clenbuterol/ Schmid J., Prox A., Zimmer A., Keck J. and Kaschke S.// Fresenius J. Anal. Chem. 1990. - V.337. - P. 121

339. Schmidt N.A. Steriod profiling- an update/ Schmidt N.A., Borburgh H.J., Pend-ers T.J. and Weykamp C.W. // Clin. Chem. 1985. - V.31. - P.637-639.

340. Schnitzler R. Induction of micronuclei by stilbene-type and steroidal estrogens in Syrian hamster embryo and ovine seminal vesicle cell in vitro/ Schnitzler R., Foth J., Degen G.H., Metzler M.// Mutat. Res. 1994. - V.311. - P. 85-93.

341. Schoene C. Preliminary study of the metabolism of 17a-methyltestosterone in horses utilizing gas chromatography-mass spectrometric techniques/ Schoene C., Nedderman A.N.R. and Houghton E.// Analyst. 1994. - V.l 19. - P.2537-2542.

342. Schwartz N.N. Silicon derivatives/ Schwartz N.N., O'Brien E., Karlan S., Fein M.M. Carboranes. V. // Inorg. Chem. 1965. - V.4. - P.661-664.

343. Scippo M.L. Control of the illegal administration of natural steroid hormones in the plasma of bulls and heifers/ Scippo M.L., Degand G., Duyskaerts A., Maghuin-Rogister G.I I Analyst. 1994. - V.l 19. - P.2639-2644.

344. Scippo M.-L. Receptor-based screening assays: new perspectives in anti-doping control/ Scippo M.-L., Willemsen P., Danyi S. et al.// Chromatographia. 2004. - V.59. - P.S-23 - S-28.

345. Scippo M-L. Detection of illegal growth promoters in biological samples using receptor binding assays/ Scippo M-L., Van De Weerdt C., Willemsen P. et al.// Analytica Chimica Acta. 2002. - V.473. - P. 135-141.

346. Seegers J.C. The cytotoxic effects of estradiol-170, catecholestradiols and meth-oxyestradiols on dividing MCF-7 and HeLa cells/ Seegers J.C., Aveling M.-L., Van-Aswegen C.H. et al.// Journal Steroid Biochem. 1989. - V.32. - P.797-809.

347. Segura J. Hair analysis and detectability of single dose administration of androgenic steroid esters/ Segura J., Pichini S., Peng S.H., De la Torre X // Forensic Science International. 2000. - V.l07. - P.347-359.

348. Segura J. Derivatization procedures for gas chromatographic determination of xenobiotics in biological samples, with special attention to drugs of abuse and doping agents/ Segura J., Ventura R., Jurado C. // J. Chromatogr. B. 1998. -V.713. - P.61-90.

349. Service R.F. New role for estrgen in cancer? / Service R.F.// Science. 1998. -V. 279.-P. 1631- 1633.

350. Shackleton C.H.L. Use of Sep-pak® cartridges for urinary steroid extraction: evaluation of the method for use prior to gas chromatographic analysis/ Shackle-ton C.H.L. and Whitney J.O. // Clinica Chimica Acta. 1980. - V.l07. -P.231-243.

351. Shelver W.L. Evaluation of commercial immunoassays for cross-reactivity to clenbuterol stereoisomers and bovine metabolites/ Shelver W.L. and Smith D.J.// Food Additives and Contaminants. 2000. - V.l7. - P.837-845.

352. Shimizu H. Serum oestrogen levels in postmenopausal women: comparison of American whites and Japanese in Japan/ Shimizu H., Ross P.K., Bernstein L., Pike M.C., Henderson B.E. // Br. J. Cancer. 1990. - V.62. - P.451-453.

353. Siiteri P.K. Hormonal basis of risk factors for breast and endometrail cancer/ Siiteri P.K., Nisker J.A., Hammond G.L. In: Hormones and Cancer (by ed. S. Iacobelli, R.J.B. King, H.P. Lindner, M.E. Lippman). New York, Raven Press. - 1980. - P.499-505.

354. Simonella A. Solid-phase extraction and HPLC determination of anabolic hormones in bovine biological samples/ Simonella A., Torreti L.// Lab. 2000. -V.4. - P.38-39.

355. Sioufi A. Gas chromatographic determination of amantadine hydrochloride (Symmetrel) in human plasma and urine/ Sioufi A., Pommier F. // J. Chroma-togr. 1980. - V. 183. - P.33-39.

356. Smith D.J. Distribution, Elimination, and Residues of 14C.Clenbuterol HCL in Holstein Calves/ Smith D.J. and Paulson G.D. // Journal of Animal Science. -1997. V.75. - P.454-461.

357. Smith D.J. The pharmacokinetics, metabolism, and tissue residues of adrenergic agonists in livestock/ Smith D.J.// Journal of Animal Science. 1998. - V.76. - P. 173-194.

358. Smith D.J. Identification of ractopamine hydrochloride metabolites excreted in rat bile/ Smith D.J., Giddings J.M., Feil V.J. and Paulson G.D. // Xenobiotica. -1995. V.25. - P.511-520.

359. Smith J.L. Implant sequence effects in intact male Holstein veal calves: live and slaughter traits/ Smith J.L., Wilson L.L., Swanson D.L. // J. Anim. Sci. 1999. -V. 77. - P. 3125-3132.

360. Sofroniew M.V. A method for the consistent production of high quality antisera to small peptide hormones/ Sofroniew M.V., Madler M., Muller O.A., Sciba P.C. // Fresenius Z. Anal. Chem. 1978. - V.290. - P. 163-164.

361. Soldin S.J. Receptor assays in the clinical laboratory/ Soldin S.J. // Clinical Biochemistry. 1996. - V.29. - P.439-444.

362. Sonderfan A.J. Regulation of testosterone hydroxylation by rat liver microsomal cytochrome Р-450/ Sonderfan A.J., Arlotto M.P., Dutton D.R. et al. // Arch. Biochem. Biophys. 1987. - V.255. - P.27-41.

363. Sporano V. Clenbuterol residues in non-liver containing meat as a cause of collective food poisoning/ Sporano V., Grasso L., Esposito M., Oliviero G., Brambilla G., and Loizzo A.// Veterinary and Human Toxicology. 1998. - V.40. -P.141-143.

364. Spranger B. Disposition of 17p-trenbolone in humans/ Spranger В., Metzler M. // J. Chromatography. 1991. - V.564. - P.485-492.

365. Stack D. Molecular characteristics of catechol estrogen quinines in reactions with deoxyribonucleosides/ Stack D., Byun J., Gross M.L., Rogan E.G., Cava-lieri E. // Chem. Res. Toxicol. 1996. - V.9. - P.851-859.

366. Stan H.-J. Determination of residues of anabolic drugs in meat by gas chromatography-mass spectrometry/ Stan H.-J. and Abraham B. // Journal of Chromatography. 1980. - V.l 95. - P.231 -241.

367. Stanker L.H. Introduction to immunoassays for residue analysis/ Stanker L.H., Beier R.C. In: Immunoassays for Residue Analysis-Food Safety (by ed. R.C. Beier and L.H. Stanker). ACS Symposium Series 621 - 1996. - P. 16-27.

368. Stephany R.W. Results of hormone residue analyses of bovine meat and liver imported into the EU and originating from the ASU «Hormone Free cattle Program»/ Stephany R.W., Andre F. Fist interim report to the European Commission.- 1999.

369. Stoffel B. Effects of the P-adrenergic agonist clenbuterol in cows: lipid metabolism, milk production, pharmacokinetics and residues/ Stoffel B. and Meyer H.H.D.// Journal of Animal Science. 1993. - V.71. - P. 1875-1881.

370. Stolker A. A.M. Analytical strategies for residue analysis of veterinary drugs and growth-promotingagents in food-producing animals- a review/ Stolker A.A.M., Brinkman U.A.Th.// Journal of Chromatography A. 2005. - V.1067. - P.15-53.

371. Su L. Molecular mechanisms of gene inactivation by different mutagens/ Su L., Klein C.B.// Proc. Am. Ass. Cancer Res. 1999. - V.40. - P.546-547.

372. Su L. Mechanisms of gene inactivation by estrogens/ Su L., Zinaman R., Klein C.B.// Proc. Am. Ass. Cancer. Res. 1998. - V.39. - P.93.

373. Sutter T.R. Complete cDNA sequence of human dioxin-inducible mRNA identifies a new gene subfamily of cytochrome P450 that maps to chromosome 2/ Sutter T.R., Tang Y.M., Hayes C.L. et al.// J. Biol. Chem. 1994. - V.269. -P.13092-13099.

374. Tang P.W. A new method for hydrolyzing sulfate and glucuronyl conjugates of steroids/ Tang P.W. and Crone D.L. // Analytical Biochemistry. 1989. -V.l82. -P.289-294.

375. Teale P. The development of a gas chromatographic/mass spectrometric screening procedure to detect the administration of anabolic steroids to the horse/ Teale P. and Houghton E.// Biological Mass Spectrometry. 1991. - V.20. -P.109-114.

376. The reproductive system. In: Pharmacology (by ed. H.P. Rang and M.M.Dale).-Churchill Livingstone, Edinburgh. 1987. - P.413-432.

377. Thibodeau P.A. Induction by estrogens of methotrexate resistance in MCF-7 breast cancer cells / Thibodeau P.A., Bissonnette N., Kocsis Bedard S., Hunting D., Paquette B. // Carcinogenesis. 1998. - V. 19. - P. 1545-1552.

378. Thieme D. An Improved Method for Clenbuterol Screening using High resolution Selected Ion recording/ Thieme D., Kingston R., Ordsmith N., Williams E. // Application Note No. AN38/ICA Version 2. Micromass Limited, September.- 1999, 8p.

379. Toniolo P.G. A Prospective study of endogenous estrogens and breast cancer in postmenopausal women/ Toniolo P.G., Levitz M., Zeleniuch-Jacquotte A., Banerjee S., Koenig K.L. et al. // J. Natl. Cancer. Inst. 1995. - V.87. - P. 190197.

380. Traynor I.M. Detection of multi-P-agonist residues in liver matrix by use of a surface plasma resonance biosensor/ Traynor I.M., Crooks S.R.H., Bowers J., Elliott C.T. // Analytica Chimica Acta. 2003. - V.483. - P. 187-191.

381. Tsui P.T. Д9 Tetrahydrocannabinol - Protein Conjugates/ Tsui P.T., Kelly K.A., Ponpipom M.M., Strahilevitz M. and Sehon A.H.// Can. J. Biochem. -1974.-V.52.-P. 252-258.

382. Tsuji A. Synthesis of corticosteroid haptens/ Tsuji A., Smulowtiz M., Liang J.S., Fukushima D.K.// Steroids. 1974. - V.24. - P.739-751.

383. Tsutsu Т. Aneuploidy induction in human fibroblasts: comparison with results in Syrian hamster fibroblasts/ Tsutsu Т., Suzuki N., Maizumi H., Barrett J.C.// Mutation Research. 1990. - V.240. - P.241-249.

384. Tsutsui T. Aneuploidy induction and cell transformation by diethylstilbestrol: a possible chromosomal mechanism in carcinogenesis/ Tsutsui Т., Maizumi H., McLachlan J.A. and Barrett J.C. // Cancer Research. 1983. - V.43. - P.3814-3821.

385. Tsutsui T. 17P-Estradiol-induced cell transformation and aneuploidy of Syrian hamster embryo cells in culture/ Tsutsui Т., Suzuki N., Fukuda S. et al. // Carcinogenesis. 1987. - V. 11. - P. 1715-1719.

386. Tsutsui T. Alteration in diethylstilbestrol-induced mutagenicity and cell transformation by exogenous metabolic activation/ Tsutsui Т., Suzuki N., Maizumi H., McLachlan J.A., Barrett J.C.// Carcinogenesis. 1986. - V.7. - P. 14151418.

387. Vaitukaitis J.L. A method for producing specific antisera with small doses of immunogen/ Vaitukaitis J.L., Robbins J.B., Nieschlag E. & Ross G. T. // J. Clin. Endocrinol. Metab. 1971. - V.33. - P.988-991.

388. Van der Vies J. Implications of basic pharmacology in the therapy with esters of nandrolone/ Van der Vies J. // Acta Endocrinologica. 1985. - V.l 10, suppl. 271,-P. 38-44.

389. Van Eenoo Criteria in chromatography and mass spectrometry- a comparison between regulations in the field of residue and doping analysis/ Van Eenoo, Delbeke F.T.// Chromatographia.- 2004. V.59. - Suppl.l. - P. S39-S44.

390. Van Ginkel L.A. Review: Immunoaffinity chromatography, its applicability and limitations in multi-residue analysis of anabolizing and doping agents/ Van Ginkel L.A.// Journal of Chromatography. 1991. - V.564. - P.363-403.

391. Van Ginkel L.A. Development and validation of a multiresidue method for beta-agonists in biological samples and animal feed/ Van Ginkel L.A., Stephany R.W., van Rossum H.J.// J. AO AC Int. 1992. - V.75. - P.554-560.

392. Van Ginkel L.A. Effective monitoring of residues of nortestosterone and its major metabolites in bovine urine and bile/ Van Ginkel L.A., Stephany R.W., van Rossum H.J. et al.// Journal of Chromatography. 1989. - V.489. - P.95-104.

393. Van Hoof N. Norchlorotestosterone acetate: an alternative metabolism study andл

394. GC-MS analysis in kidney fat, urine, and faeces/ Van Hoof N., De Wasch K., Poelmans S. et al.// Chromatographia. 2004. - V.59. - P.S-85 - S-94.

395. Van Nie. A carcinogenic action of testosterone, provoking uterine tumors in mice/ Van Nie// Nature. 1961. - V.l92. - P. 1303.

396. Van Peteghem C.H. A comparison of chemiluminescence immunoassay and radio immunoassay for the detection of nortestosterone residues in meat/ Van Peteghem C.H., Van Look L.J. // Anal. Chim. Acta. 1988. - V.205. - P.223-228.

397. Van Puymbroeck M. Identification of selective metabolites to reveal the abuse of some synthetic anabolic steroids in cattle/ Van Puymbroeck M. // Doc-toraatsproefschrift. 2000. - 21 Op.

398. Van Puymbroeck M. Identification of some important metabolites of boldenone in urine and feces of cattle by gas chromatography-mass spectrometry/ Van Puymbroeck M., Kuilman M.E.M., Maas R.F.M. et al.// The Analyst. 1998. -V.123. - P.2453-2456.

399. Vandenbroeck M. Identification and characterization of 19-nortestosterone in urine of meat-producing animals/ Vandenbroeck M., Van Vyncht G. and Gaspar P.// Journal of Chromatograpgy . 1991. - V.564. - P.405-412.

400. Vanluchene E. Conversion of free 3p-hydroxy-5-ene steroids by incubation with Helix pomatia / Vanluchene E., Eechaute W. and Vanderkerckhove D. // Journal of Steroid Biochemistry. 1982. - V.16. - P.701-703.

401. Vogt K. Radioimmunologische Bestimmung von Trenbolon in Muskel, Leber, Nieren, Fett sowie Leber- und Nierenzellsaft von Mastkalbern nach subkutaner Implantation von Revalor/ Vogt K. // Archiv fur Lebensmittelhygiene. 1984. - V.35. - P.121-148.

402. Vree T.B. Enterohepatic cycling and pharmacokinetics of oestradiol in postmenopausal women / Vree T.B., Timmer C.J.// J. Pharm. Pharmacol. 1998. -V.50. - 857-864.

403. WHO Food Additives Series 43. Toxicological evaluation of certain veterinary drug residues in food. Prepared by the 52nd meeting of the joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives JECFA. 2000.

404. WHO. Evaluation of certain foodadditives and contaminants. Twenty-seventh report of the Joint FAO/WHO Expect Committee on Food Additives. technical report Series, No. 696. - 1983.

405. Williams K.R. Metabolism of anabolic agents in the racing greyhound/ Williams K.R., Anderson R.A. and Grey P.J. // Analytica Chimica Acta. 1993. - V.275. -P. 163-172.

406. Wong S.S. Preparation of immunotoxins and other drug conjugates for targeting therapeutics/ Wong S.S. In: Chemistry of Protein Cinjugation and Cross-Linking. CRC Press, Boston, USA. 1993. - Chap.l 1.

407. Workshop Beta-Agonists in Retina. 15-16 May 2000, Berlin // Organizing laboratory: EU Reference Laboratory for Residues of Veterinary Drugs (Berlin). -2000,136p.

408. Wynne P.M. An Improved method for the extraction of anabolic steroids from equine urine/ Wynne P.M., Batty D.C., Vine J.H. and Simpson N.J.K. Varian Application Note. M 2763. - 2000. - 18p.

409. Yamamoto I. Enzyme immunoassay for clenbuterol, a p2-adrenergic stimulant/ Yamamoto I. and Iwata K.// Journal of Immunoassay. 1982. - V.3. - P. 155171.

410. Yamazaki H. Progesterone and testosterone hydroxylation by cytochromes P450 2C19, 2C9 and 3A4in human liver microsomes/ Yamazaki H., Shimada T.// Arch. Biochem. Biophys. 1997. - V.346. - P. 161-169.

411. Yoon J.M. Gas chromatographic and mass spectrometric analysis of conjugated steroids in urine/ Yoon J.M. and Lee K.H.// J. Biosci.- 2001. V.26. - P.627-634.

412. Yoshioka N. Determination of a- and p-trenbolone in bovine muscle and liver by liquid chromatography with fluorescence detection/ Yoshioka N., Akiyama Y., Takeda N.// Journal of Chromatography B. 2000. - V.739. - P.363-367.

413. Zalko D. Metabolic fate of clenbuterol in calves/ Zalko D., Bories G. and Tulliez J. // Journal Agric. Food Chemistry. 1998. - V.46. - P. 1935-1943.

414. Zalko D. Evidence for a New and Major Metabolic Pathway of Clenbuterol Involving in Vivo Formation of an N-Hydroxyarylamine/ Zalko D., Debrauwer L., Bories G. and Tulliez J.// Chem. Res. Toxicol. 1997. - V.l0. - P. 197-204.

415. Zalko D. Comparative Metabolism of Clenbuterol by Rat and Bovine Liver Microsomes and Slices/ Zalko D., Perdu-Durand E., Debrauwer L. et al. // Drug Metabolism and Disposition. 1998. - V.26. - P.28-35.

416. Zhu B.T. Functional role of estrogen metabolism in target cells: review and perspectives / Zhu B.T., Conney A.H. // Carcinogenesis. 1998. - V.l9. - P. 1-27.

417. Zhu B.T. The carcinogenic activity of ethinyl estrogens is determined by both their hormonal characteristics and their conversion to cathechol metabolites/ Zhu B.T., Roy D„ Liehr J.G. // Endocrinology. 1993. -V.132. - P.577-583.

418. Zimmer A. Einmalapplikation, Mehrfachapplikation und Metabolitenmuster von Clenbuterol beim Menschen/ Zimmer A. // Arzneim.- Forsch./Drug Res. -1976.-V.26.-P.1446-1450.

419. Zimmer A. Pharmakokinetik und Metabolitenmuster von Clenbuterol beim Kaninchen und bein Hund / Zimmer A. //Arzneim.- Forsch./ Drug Res. 1976. -V.26. - P. 1442-1445.

Информация о работе

Комаров, Александр Анатольевич
доктора биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.23

Диссертация

Система обеспечения безопасности продукции животноводства при использовании анаболических стероидов, производных стильбена и β-адреностимуляторов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы