Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Система электрогенного транспорта ионов кальция в митохондриях и ее функционирование при различных физиологических состояниях

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Система электрогенного транспорта ионов кальция в митохондриях и ее функционирование при различных физиологических состояниях"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОФИЗИКИ КЛЕТКИ

На правах рукописи

ДОЛГАЧЕВА Людмила Петровна

УДК 541.132:546.41:591.1

СИСТЕМА ЭЛЕКТРОГЕННОГО ТРАНСПОРТА ИОНОВ КАЛЬЦИЯ В МИТОХОНДРИЯХ И ЕЕ ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЯХ

03.00.02. - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ПУВДНО - 1992

Работа выполнена в лаборатории управления энергообеспечение физиологических функций Института биологической физики I СССР и лаборатории биофизики клетки Института биофизш клетки РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук,

Г.Д.Миронова

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Р.А.Звягильская доктор биологических наук, профессор Ю.В.Евтодиенко Ведущая организация - Научно-исследовательский инстит$ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского

Защита состоится " " 1992 г в час.

на заседании Специализированного совета при

Институте биофизики клетки РАН (Московская обл., г. Пущино).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики клетки РАН.

Автореферат разослан " " 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

Т.И.Смолихина

•стуальнооть проблемы. Мо-леку.пнрнмУ. механизм электрогенного

-нспортч исследуется Солее лет. Активный транспорт Са2+

ляется одним из путей трансформации энергии

лслительно-восстановительных превращений, протекающих в

гохондриях. Этот процесс катализирует электрогенная

экспортная система, активность которой специфически

гиоируется низкими концентрациями лантанидов и рутениевого

асного. Б 1971 г. Моор установил очень важный факт, что 2+

эргозэвисимый вход Са в митохондриях ингибируется рутениевым асннм - специфическим индикатором соединений гликопротеидной ироды. Это послужило основанием для целенаправленного поиска 2+-связывающих соединений гликопротеидной природы.

С тех пор в нескольких лабораториях были выделены из тохондрий углетод-содержащие соединения, способные связывать ны Са2+ с высоким Кд=0,1-9 мкМ и низким Кд=9,5-700 мкМ одством. Выделенные соединения отличались по молекулярной массе 50кД, 67кД, 51кД, '4СЖД, 32кД, 14кД, 5кД, ЗкД) и подразделялись водорастворимые и прочно связанные с мембраной (Бо-Ь-Ьосава et . ,1972 , ЪесЬп:тсЗ©зг е-Ь-а1. ,1971 ,1972, Евтодиенко и др. ,1971, гельганс и др.,1971, СагаГоИ et а1.,1974, Азарашвили и .,1978, 1978, Нарре1,1979, Миронова и др.,1980, РапГШ

а1.,1983, ВеЪап е! а!.,1985).

Дальнейшее исследование функциональной роли митохондриальных единений гликопротеидной природы с м.М. 150кД, 67кД, 5кД одолжено не было. В последние несколько лет продолжаются следования митохондриальных Са2+-связывающих белков с м.М. -32 кД и 14 кД. С 1975 по 1980гг. в МБФ АН СССР было тановлено, что способностью селективно транспортировать Са рез бислойные липидные мембраны обладают лишь прочносвязанный с мбраной гликопротеид *с м.М. 40кД из митохондрий печени крысы и дорастворимый гликопротеид с м.М. 40кД из митохондрий сердца ка (Азарашвили и др.,1978, Миронова и др.,1980).

Однако до сих пор не было получено однозначных данных об астии этих компонентов в селективном транспорте Са2+ в тоховдриях.

Целью настоящей работы являлось исследование мунохимическими методами функциональной роли гликопротеида с М. 40кД в системе электрогенного транспорта Са2* в митохондриях активности этой системы в различных физиологических состояниях.

Задачи исследования:

I. Получение моноспецифических антител на Са2+-связывающий

гликопротеид с м.М. 40кД, выделенный из митохондрий сердца быка.

2. Разработка иммунохимического способа очистки препаративного выделения Са^+-связываюцего гликопротеида.

3. Иммунохимический анализ распределения Са2+-связывающег гликопротеида с м.М. 4СЖД в митохондриях.

4. Исследование роли Са2+-связыващего водорастворимого прочносвязанного гликопротеида с м.М. 40кД в систем электро-генного транспорта Са2+.

5. Исследование количественных изменений Са2+-связывающег гликопротеида с м.М. 40кД и активности системы электогенног транспорта Са2+ в митохондриях в различных физиологически состояниях.

Научная новизна работы. Получены моноспецифические антител

Ол.

на Са -связывающий гликопротеид с м.М. 40кД из митохондри сердца быка.

Установлено, что гликопротеид с м.М. 40кД локализован как мембранах, так и в межмембранном пространстве митохондрий.

Показано, что моноспецифические антитела на Са2+-связывающи

2+

гликопротеид с м.М. 40кД ингибируют электрогенный транспортСа но не ингибируют Na+/Ca2+ обмен и нечувствительный к рутениевом; красному выход Са24".

Обнаружено, что как мембранный, так и межмембранныз гликопротеид с м.М. 40кД участвуют в системе электрогенного вход Са2+ в митохондриях.

Показано физиологическое значение Са2+-связываицег< гликопротеида на модели первичной описторхозной инвазии.

Обнаружена корреляция между количеством Са2+-связывающегс гликопротеида с м.М. 40кД и активностью электрогенного транспорт; Са2+ в митохондриях печени сусликов, находящихся в гибернирующеи и активном состояниях.

Научно-практическое значение работы. Исследование функциональной роли митохондриального Са2+-связывающегс гликопротеида с м.М. 40кД в оистеме электрогенного входа Са2+ i митохондриях имеет существенное значение для изучения i управления механизмом этого процесса.

Результаты, полученные в работе, могут быть использованы дл? поиска криопротекторов и метаболических триггероЕ гипометаболичэских состояний.

о .

Увеличение количества Са -связывающего гликопротеида в ходе инвазионного процесса свидетельствуют о роли системы транспорте Са2+ и могут послужить основой слежения за ходом инвазионного

щесса.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на союзных 'симпозиумах "Молекулярные - механизмы и регуляция ргетического обмена" (г.Пущино,1986), "Метаболическая 'уляция физиологического состояния" (г.Пущино,1984), "Биохимия холеной клетки" (г.Минск,1990), на 3-м выездном пленуме 'матосенсорная и кинестетическая чувствительность в норме и ■ологии" (г.Иркутек,1985), Международном симпозиуме "Molecular ;anization of the eleotrogenous Ca¿+ transport system in animal, ochondria" (Москва,1989).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, 2 .одятся в печати.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, opa литературы, описания материалов и методов, изложения ученных результатов и их обсуждения в пяти главах, заключения, одов и списка цитируемой литературы (185 ссылок. Работа шена на 103 страницах, включая 6 таблиц и 19 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Электрофоретически чистый Са2+-связывающий гликопротеид из охондрий сердца быка выделяли по методу спиртовой экстракции ронова и др.,1973), и использовали для восстановления системы ктрогенного Са2"1"-входа в митохондриях печени крысы и для унизации животных.(Скарга и др.,1987). Содержание белка еделяли по методу Лоури (ь<жгу,1951 ).

Чистоту препарата глккопротеида с М.м. 40кД . анализировали с ощью SDS-электрофореза в полиакриламидном геле (baemmli,l970). сутствие белковых зон в геле контролировали в результате ашивания 0,25% раствором Кумасси R-250 ярко-синим, а вводный компонент - реактивом Шиффа (Zachariue et al.,1969).

Для иммунизации использовали кроликов массой 1,8-2,2 та', отных иммунизировали в подколенные лимфоузлы смесью ктрофоретически чистого глккопротеида с полным адъювантом йнда, используя на курс иммунизации 400-600 мкг бежа".

Наличие антител в сыворотке кроликов и специфичность исыворотки проверяли методом двойной радиальной иммунодиффузии Ухтерлони.

Обогащенную фракцию иммуноглобулинов получали с помощью аливания 50% и 33% растворами сульфата аммония и очистки на онках с ДЭАЭ- целлюлозой и CNBr-сефарозой, иммобилизованной ком А (0стерман,1983).

Очистку гликопротеида иммунохимическим методом проводили на

колонке с CNBr-сефарозой, иммобилизованной антителами на гликопротеид.

Определение ткане- и видоспецифичности гликопротеидов с м.М 40 кД из митохондрий печени крысы, суслика и хомяка осуществлял с помощью методов Ухтерлони и электроблота (Towbin et al.,1984).

Митохондрии печени крысы выделяли методом дифференциального центрифугирования с модификациями, разработанными в лаборатории (Кондрашова.1973). Митопласты получали в результате дигитониново] обработки митохондрий (Schnaitman and. Greenawalt.1968).

Для проведения количественного анализа содержани; Са^+-связывающего гликопротеида с мЖ 40 кД в мембранны; фракциях митохондрии подвергали осмотическому шоку и обработю ультразвуком.

Суммарную фракцию мембран разделяли с помощы центрифугирования в градиенте сахарозы. Три ступени градиента сахарозы соответствовали концентрации: 55%, 46%, 36%. Тако! градиент позволяет отделить друг от друга внутренние мембраны контакты и внешние мембраны. Степень чистоты этих препарата определялась с помощью ферментного анализа (Ohlendieck е-al.,1986).

Содержание гликопротеида с м.М. 40 кД во внутренней мембране, контактах и внешних мембранах контролировали на аналитическом SDS-электрофорезе и измеряли с помощью иммунодота.

При проведении экспериментов с гипотонической обработко! митохондрии трижды промывали средой выделения и переосаждали, конечная суспензия митохондрий содержала 50-60 мг белка/мл. Дш гипотонической обработки митохондрий использовали среды, содержащие Трис-оксалоацетат, ЭГТА, ДТТ, Hepes, уменына} осмомолярность суспензии митохондрий в 2 раза. Восстанавливал! осмомолярность суспензии раствором сахарозы (Behan.1985).

Скорость поглощения кислорода измеряли Кларковским электродам в полярографической ячейке объемом I мл. Скорость поглощеню кальция измеряли специальным Са2+-селективным электродом и с помощью индикатора арсеназо III (конц. - 25 мкМ, длина волны -685-665 нм).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Получение и характеристика антител на гликопротеид.

Для разработки иммуноселективного метода выделенш гликопротеида с М.М.4СЖД и изучения его функциональной роли i митохондриях была поставлена задача получения антител на это-] белок.

1ля иммунизации использовали гомогенный препарат шротеида, чистоту которого контролировали с помощью 1Т1{ческого Бюз-электрофореза.

Зыло опробовано несколько вариантов иммунизации.Как видно из щы I, максимальный титр антисыворотки при одном и том же 10СТВ9 антигена позволяет получить схема иммунизации, при эой основной зоной инъекции являются подколенные лимфоузлы.

пица I. Влияние способа иммунизации на максимальный титр зыворотки.

Зпособ Максимальный

иммунизации титр антисыворотки

внутримышечно 1:100

подкожно 1:500

лимфоузлы 1:2000

Как видно из рис. I, антисыворотка, полученная на опротеид, моноспецифична, т.к. дает одну полосу преципитации взаимодействии с антигеном.

Рис. I Титрование антисыворотки: В центре - гликопротеид, в периферических лунках - I - исходная антисыворотка, 2 - антисыворотка, разведенная физ.р. в 5 раз, 3 - антисыворотка, разведенная в 100 раз, 4 - антисыворотка, разведенная в 500 раз, 5 - антисыворотка, разведенная в 2000 раз, 6 - в 4000 раз.

Проверка ткане- и видоспецифичности гликопротеида.

Иммунологическую идентичность гликопротеидов с м.М. 40 кД из )Хондрий печени крысы, суслика и хомяка определяли с помощью Ыой радиальной диффузии по Ухтерлони. На рис.2 видно, что ш преципитации, образованные в результате взаимодейсвия 1тел на гликопротеид с М.м.40 кД из митохондрий сердца быка и сопротеидов из митохондрий печени крысы, печени суслика, >ни хомяка и печени быка, полностью сливаются с линиями дшитации, образованными исходным гликопротеидом и антителами него. Этот 'факт говорит о наличии общих детерминант у эупомянутых гликопротеидов.

б Ъ

(оя

г- - ф

Рис.2 Анализ иммунологической идентичности гликопротеидов:в центре лунок антитела на гликопротеид из МХ печени быка. 1-ГП из МХ сердца быка; 2-ГП из МХ печени крысы; 3-ГП из МХ сердца быка; 4-ГП из МХ печени_суслика; 5-физ. р. 6-физ. раствор; 7-ГП из МХ сердца быка; 8-ГП из МХ печени хомяка; 9-ГП из МХ сердца быка; 10-физ.р-р.

Установленную методом Ухтерлони идентичность гликопротевдов с. м.М. 40 кД из мигоховдрий сердца быка, печени крысы, печеь хомяка и печени суслика подтверждали с помощью иммуноблоттшга.

Как видно из'рис.3, митохондриальные белки из печени суслю хомяка и крысы, разделенные на БОБ-электрофорезе по молекулярнс массе и транслированные на нитроцеллюлозу, обладают одним и те же и обнаруживают только одну полосу при взаимодействии" с АТ ГП 40 кД из МХ сердца быка. Это свидетельствует, об одном и том г молекулярном весе гликопротевдов и наличии общих детерминант.

6 5 *'I

Рис.3. Определение иммунологическс идентичности и молекулярной масс гликопротеидов: 1-ГП 40 кД из Ж сердца Сыке > 2-ю: печени суслика, 3-МХ печени крысы, 4-й 234 печени хомяка.

Разработка щщунозшшческого метода очистки глинопротевда.

С целью сохранения нативной конформацщ

увеличения выхода и ускорения очистки гликопротеида Об разработан иммунохимический метод очистки на СНВг-сефарозе иммобилизованной антителами к ГП 40 кД. Как видно из рис. 4 пик I представляет собой белки, не связавшиеся "с колонкой, а пи 2 и 3 содержат гомогенный препарат ГП (электрофореграмма 2а, За;

ко анализ сродства этих ГП к антителам показал, что нность пика 2 выше, т.к. глшимальное количество ГП, зующее преципитат, соответствует 0,15 мкг, а для пика 3 -г.

Рис.4 Очистка ГП 40 кД на колонке с СКВг-сефарозой, Зилизованной АТ к ГП.

шрование не связавшихся белков, 2-ГП, элюироварный 10 мМ с 0,15 М НаС1; 3-ГП, элюированный 4,5 М М§С10. з-электрофореграыми 2 и 3 пиков, 26 и Зб-преципитаты 3 пиков с АТ к ГП.

Результат сравнения эффекта выделения ГП из МХ различными эбзми приводен в таблице 2. Из таблицы 2 видно, что ючение из процесса выделения гликопротеида стадии очистки на грофорезе приводит к увеличения выхода ГП с высокой нностыо в два раза, а препарата без учета аффинности в 5 раз. ючение из процесса выделения гликопротеида процедур обработки элчу и разделения на электрофорезе приводит к увеличению ца ГП с высокой аффинностью в 10-12 раз, а гликопротеида без а аффинности в 16 раз.

- а -

Таблица 2. Сравнение конечного выхода ГП, выделяемо различными методами из 100 г сердца быка.

Метод очистки Сродство Количество

ГП к АТ ГП (мкг)

Исходный метод 100

ГП с высокой

Без электрофореза аффинностью 200

ГП с низкой

аффинностью 520

Без обработки ГП с высокой

по Фолчу и аффинностью 1200

электрофореза ГП с низкой

аффинностью 1600

Таким образом, использование иммуноаффинных методов выделеь гликопротеида позволяет увеличить количество Сели экстрагируемого из.одного и того же количества митохондрий, также сохранить его иммунохимическую активность, что важно х проведения экспериментов по выяснению функциональной роли ГП.

Распределение гликопротеида в митохондриях.

В ранних работах было установлено, что Са2+-связываю11 гликопротеид локализован во внутренней мембране и межмембрань пространстве митохондрий (Зоиосава,1972, Азарашвили,197£ Сообщалось также, что прочносвязанный с внутренней мембраной Са2+-связывающий ГП с м.М. '40 кД содержится олигомицин-чувствительной Н^-АТФазе (Евтодиенко,1978).

Однако авторы не использовали для этой цели иммунохимическ методы, что не позволяло дать точную оценку распределен гликопротеида с м.М. 40 кД в митохондриях.

Более того, было показано (НаскепЬгоок et а1.,1983), что меа внутренней и внешней мембраной митохондрий возникают иррегулярь взаимодействия, так называемые контакты, количество кото^ увеличивалось на стадии окислительного фосфорилирования.

Результаты анализа содержания Са2+-связывающего ГП 40 методом иммунодота представлены в таблице 3. Как видно таблицы, наибольшее количество этого белка содержится внутренних мембранах, а наименьшее - во внешних мембранах МХ.

Таблица 3. Количественный анализ содержания Са -связывающего 40 кД в мембранах MX.

Характер мембран Количество

ГП {%)

Внутренние мембраны 55

Внешние мембраны 15

Контакты 30

зможно, содержание гликопротеида в контактах является ременной величиной, но этот вопрос заслуживает отдельного ссмотрения.

2+

ИнгиОирование электрогенного транспорта Са в митохондриях антителами к гликопротеид? с м.М. 40 кД.

Молекулярный механизм, опосредующий вход-Са24" в митохондрии механизму унипорта, до настоящего времени окончательно не тановлен. Весьма вероятно, что митохондриальный 24-связывающий гликопротеид с м.М. 40 кД, который индуцирует 2+-селективные каналы на бислойных липидных мембранах, вствительные к рутениевому красному (Азаращвнли и др.,1978, ронова и др.,1980), причастен к транспорту Са2+ в митохондриях.

В данном разделе проведен анализ действия антител к ГП 40 кД вход Са2+ в митопласты (МП) по механизму унипорта (рис.6). На с.6(1) показан транспорт Са2+ в контрольных МП. Из рис.6(3) дно, что добавка антител к ГП 4Q кД к митопластам приводит к гибированию входа Са2+. Максимальная величина ингибирования евншала 80%. Слабое ингибирование входа Са2+ фракцией нтрольных иммуноглобулинов показано на кривой 2, вероятно, это зультат неспецифических взаимодействий МП с белком. Как выход 2+, нечувствительный к рутениевому красному (RR), так и +/Са2+ обмен не ингибировались.

Известно, что при низких концентрациях Са2+ спермин является 'Тенциальным стимулятором унипорта (Niochitta et al.,1984, lshire et al.,1986, Kroner,1988).

Подтверждение этого факта мы видим на рис.7: скорость >анспорта Са2+ в митопластах при добавке спермина (кривая 3) :ше скорости транспорта Са2+ в контрольных МП (кривая I). |бавка антител к ГП 40 кД к митопластам, транспорт 0а2+ которых ■имулирован спермином, приводит к снижению скорости входа Са2+ :ривая 4).

Рис.6. Ингибирование унипорта антителами к ГП 40 кД. 1-Ш со средой инкубации, 2-МП (7,2 мг белка/мл) с фракцией контрольных иммуноглобулинов (4,7 мг), 3-МП (7,2 мг белка/мл) с антителами к ГП 40 кД (4,7 мг). Состав среды (мМ): 200 сахарозы, 20 КС1, 10 Нерее, рН 7,4, I КН^РО^ 2 сукцината, 0,008 ротенона. В ячейке: 0,3 мг белка/мл, 5 мкМ Са2+, I мкМ Ш, Ю тМ Иа+.

Рис.7. Ингибирование Са -входа, стимулированного спермином, антителами к ГП 40 кД.

1-МП контрольные, 2-МП с добавкой антител к ГП 40 кД, 3-МП с добавкой спермина (0,5 мМ), 4-МП с добавкой спермина и антител к ГП 40 кД.

Приведенные данные подтверждают принадлежность ГП 40 кД г. системе транспорта Са2+ по механизму унипорта.

' Реконструкция скстаиа электрэгенного транспорта Са2* в штохондршп:.

Одним из подходов для доказательства участия гликопротеидов в системе электрогенного транспорта Са^4" в митохондриях является их экстракция-" и последующая реконструкция этой . системы непосредственно в мембране митохондрий. Авторы использовали такой подход для определения функциональной роли Са2+-связывающего гликопротеида с м.М. 32 кД и • Са^-связывающего калвектина с М.М.14 кД (Бапйг! et а!.,1979, Вейап ег а!.,1985). Функциональная роль мекмембранного гликопротеида с м.М. 40 кД не была

^следовала, как и не был определен э№кт экстракции и ¡следующего добавления Са -связывающих соединений на сислительное фосфорилирование. По нашему мнению это ¡стоятельство весьма существенно, т.к. может иметь место ¡специфическое угнетение или активация как системы транспорта 1льция, так и системы окислительного фосформирования. В связи с 'им з настоящей работе предпринята попытка провести фрагментацию реконструкцию Са2+-транспортирующей системы митохондрий путем ютичного удаления и последующего добавления Са^+-связывающего [икопротеида с м.М. 40 кД или суммарного белкового . экстракта, держащего ГП, к суспензии митохондрий. При этом одновременно с .енкой активности Са^-транспортирущей системы, контролировали орость и степень сопряжения окислительного фосфорилирования.

На рис.8 показано изменение скорости дыхания митохондрий чени крысы при добавлении АДФ или- СаС^ к интактшм тохсндриям и митохондриям после гипотонической обработки. В нтроле скорость потребления кислорода митохондриями в исутствш СаС12 примерно в два раза выше по сравнению со орсстью потребления кислорода в присутствии АДФ, что характерно, я нативных митохондрий печени крысы ( рис.8А).

Как видно из рисунка, скорость окислительного сформирования в митохондриях после гипотонической обработки актически не изменилась, а скорость транспорта Са2+ уменьшилась 2 раза.

Была предпринята попытка реконструировать

^-транспортирующую систему митохондрий после гипотонической работки добавлением сконцентрированного супернатанта тотошческого экстракта (рис.8 В). При этом скорость транспорта льция увеличивалась незначительно, в большинстве опытов это эличение оыло в пределах 10-20%, а скорость окислительного сформирования не изменялась.

Добавление ГП 40 кД к митохондриям после гипотонической эаботки приводило к заметному увеличению скорости транспорта практически до уровня скорости транспорта Са2+ з нативных

(рис.8 г).

Проведение гипотонической обработки Ж, при которой БСА ;утствует на всех стадиях обработки, приводило, примерно, к гиратнсму снижению как скорости окислительного

¡форилирования так и транспорта кальция (рис.8 Д). Как видно из ;.8 3,'добавление к Ж ГБ 40 кД споссбствовало восстановлению

о 1

¡темы Са -входа, но не окислительного фосфоридировашш.

•А1

ш 1 —

В

Г п д

га I

ДО (

и* }

,2+

МХ, подвергнутыми

Рио.8 Изменение скорости поглощения Са гипотонической обработке.

А-митохондрии контрольные; Б - МХ, подвергнутые гипотонической обработке, состав среды для набухания (мМ):10 Нерев, 2 ДТТ, I ■ЭРГА, рН 7.4; после возвращения к исходному объему МХ промывали средой выделения с БСА в конц. 0.5 мг/мл); В - МХ, восстановленные добавлением 150-200 мкг экстракта/мг МХ белка. Г -МХ, восстановленные добавлением 6-7 мкг ГП/мг МХ белка, Д-МХ после гипотонической обработки, но без промывки с БСА, Е-МХ, восстановленные добавлением ГП 40 кД.

р I

Результаты анализа содержания Са •-связывающего ГП 40 кД в митохондриях и в суммарном водорастворимом гипотоническом экстракте представлены на рис.9- и в таблице 4. Оценка распределения ГП в процессе экстракции, выполненная методом иммунодота, показала, что в исходных МХ ГП составляет 0.5Ж от общего митохондриального белка, после гипотонической обработки содержание ГП уменьшается до 0,43%. В гипотоническом экстракте ГП составляет &% от общего белка, что свидетельствует о повышенной экстрагируемости ГП по сравнению с другими белками. Возможно, именно поэтому гипотонический экстракт способен вызывать восстановление электрогенного транспорта Са2+.

Таблица 4. Содержание ГП 40 кД.

Объект Общий белок (%) Содержание ГП 40 кД (%)

МХ-контр.. 100 0,5

МХ-опыт 76 0,43

2 белков 7,2 6

Рис.9. Денситограмма геля аналитического электрофореза с додецилсульфатом натрия.

а) митохондрии печени крысы;

б) водорастворимый гипотонический суммарный экстракт;

в) гликопротеид с м.М. 40 кД из МХ сердца быка.

)им.:'2б - суммарный водорастворимый белковый экстракт.

Функциональная система транспорта кальция в митохондриях печени активных и гибернирующих сусликов.

В состоянии зимней спячки, несмотря на значительное снижение [тенсивности метаболизма, сохраняются основные регуляторные ¡ханизмы, поддерживающие клеточный гомеостаз (Willis,1982). К голу таких механизмов относится и транспорт ионов кальция в [тохондриях, который принимает участие в поддержании весьма ;зкой концентрации кальция в цитоплазме CFlskum,i980). Важное :ачение данного механизма обусловлено тем, что ионы кальция лолняют роль вторичного мессенджера для многих ферментных :стем в клетке и в митохондриях (Azzi.,1975; Carafoli,l977; ,itfield,1979).

Исходя из этого, несомненный интерес представляет ¡следование изменений системы электрогенного входа Са2+ и ределения количества Са2+- транспортирующего гликопротеида в тохондриях печени активных и гибернирующих сусликов.

Результат такого исследования представлен в таблице 5. бавление Са2+ к суспензии митохондрий печени активных животных иводило к быстрой его аккумуляции, сопровождающейся увеличением :орости дыхания митохондрий. У гибернирующих животных скорость кумуляции Са2+ митохондриями печени в четыре раза меньше, чем у' :тивных. Поскольку скорость входа кальция связана со степенью вргизации' митохондрий, можно предположить, что в условиях

резкого угнетения митохондриального дыхания при зимней спячке (1ШЗ 1в,1982 ,Б«уап, 1974) происходит пропорцианальное снижение скорости поглощения Са2+.

Однако- не только деэнергизация митохондрий может быть причиной такого изменения функциональной активности Са2+-транспортирушцей системы. Определение количества са2+-транспортирующего гликопротеида показало, что у активных животных его содержание выше в 6 раз, чем у сусликов в состоянии зимней спячки.

Таблица 5. Са2+-стимулируемое дыхание, скорость аккумуляции Са2+ и количество Са2+-связывающего ГП в митохондриях активных и гибернирующих сусликов.

Группы животных уСа Ч (нг-ат 0„/мин.мг белка) Скорость аккумуляции Са2+ (нг-ион/мин мг белка) Определение колич. ГП в Юг ткани мкг по скан. иммун.

Активн. Гиберн. 386,0-15,9 116,7-15,7 1410-164 350^113 14,2-3,8 12,3-2,7 .0,0 2,1-0,3

Таким образом, снижение функциональной активности Са2+-транспортирующэй системы митохондрий печени гибернирующих животных определяется, по-видимому, не только деэнергизацией митохондрий, но и уменьшением количества гликопротеида, способствующего входу кальция в митохондрии.

Изменение содержания Са2+-связывзщего гликопротеида в печени золотистых хомяков при описторхозе.

Известно, что заражение описгорхозом приводит к изменению пролиферативных, органогенетических и ультраструктурных свойств дуктулярного эпителия печени и прогрессивному замещению ее паренхимы стромой .Ранее было показано, что активация пролиферации клеток эпителия печени сопровождалась значительным увеличением количества двух белков в зоне быстродвижущихся

полипептидов с М.м.40-44 кД, т.е. с М.м. близкой к М.м. ГП

р 1

(Гиновкер,1Э84). Кроме того, Са -связывающий митохондриальный ГП 40 кД обладает способностью активировать пролиферацию (Миронова, 1985). В связи с этим в настоящей работе была предпринята попытка определить содержание ГП 40 кД в ткани печени в процессе развития

писторхоза.

Как видно из таблица 6 и рис. 10, уже в первые дни после эражения животного наблюдается значительное увеличение эличества ГП в печени. Количество ГП достигает максимума на 7-й знь после заражения животного, а к 22-му дню содержание ГП ззвращается на исходный уровень.

р.

Таблица 6. Содержание Са -транспортирующего ГП в печени хлотистого хомяка в зависимости от стадии заражения.

ш после эражения Количество исследуемых животных Количество ГП в I г ткани (мкг)

по Ухтерлони по Манчини

7 5 15,1±1,1 16,74,1

22 3 1,04-0,03 1,1-0,05

97 3 1,1-0 ,'03 I,3-0,04

>нтроль б 1,02*0,04 1,1^0,03

Изменения, вероятно, направлены на увеличение скорости вктрогенного входа Са2+ в ЫХ, т. к. обнаружено увеличение в тохондриях печени количества Са2+-транспортирующего ГП.

Рис.10. Динамика содержания Са -связывающего ГП в печени гатистого хомяка в зависимости от стадии заражения животного.

Полученные в работе данные позволяют объяснить нарушения в >траструктуре' МХ, наблюдаемые при описторхозе и выражающиеся в ¡личении размеров МХ, просветлении- и набухании. Увеличение

количества Са"+-транспортирующего ГП в митохондриях приводит, по-видимому, к накоплению кальция в матрнксе.

ВЫВОДЫ:

I .Получены- моноспецифические антитела с высоким титром к Са2+-связывамцему гликопротеиду с м.М. 40 кД, выделенному из митохондрий сердца быка. Установлено, что данные антитбла являются ткане- и видо-неспецифическими.

2.Разработан иммунохмммческий способ препаративного выделении и очистки Са24-связывающего гликопротеида с М.м.40 кД, позволяющий увеличить выход белка с сохранением его функциональных свойств.

3.Получены данные о количественном распределении Са2+"-связывающег гликопротеида с М.м. 40 кД в митохондриях с помощью иммунохимических методов. Показано, что Са2+-связывающий ГП 40 кД локализован не только во внутренней мембране, но и во внешней мембране и в межмембранном пространстве.

4.На основании данных по ингибированию транспорта Са2+ в митохондриях антителами к гликопротеиду с М.м. 40 кД и реконструкции митохондриальной Са2+-транспортирущей системы показана принадлежность прочносвязанного с внутренней мембраной ГП 40 кД и.межмембранного ГП 40 кД к системе транспорта Са2+ пс механизму унипорта в митохондриях.

5.Показано, что в митохондриях печени при различных физиологических состояниях происходят количественные изменения содержания Са2+-связывающего гликопротеида с м.М. 40 кД: увеличение при описторхозной инвазии и уменьшение при гибернации, которое коррелирует с активностью системы электрогенногс транспорта Са2+ в митохондриях.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ. 1-Долгачева Л.П., Миронова Г.Д., Утешева Ж.А. Высокочувствительный метод определения Са2+-транспортирующегс гликопротеида. - В сб.: Молекулярные механизмы и регуляци? энергетического обмена, Пущино, 1986, с. 54-55.

2.Сирота Т.В., Долгачева Л.П., Сирота Н.П., Миронова Г.Д.

Ох

Са -связывающие свойства гликопротеида, выделенного иг митохондрий сердца быка, и его структурная аналогия с другиш Са2+-связывающиш белками. - В сб.: Соматосенсорная 1 кинестетическая чувствительность в норме и патологии, Иркутск,1985, с. 164-165.

3.Скарга Ю.Ю., Долгачева Л.П., Федотчева Н.И., Миронова Т.Д.

ияние антител к митохондриальному Kt-транспортирущему белку на анспорт К+ в митохондриях печени крысы. - Украинский охимический журнал, 1987, 59, N.6, 54-59-

Долгачева Л.П., Скарга Ю.Ю. Иммунохимическое изучение ткане- и доспецифичности митохондриальных ион-транспортирующх белков. -сб.Метаболическая регуляция физиологического состояния. 1984, 55.

Сирота Т.В., Утешева Ж.А., Долгачева Л.П. Влияние

тохондриального Са2+-транспортирующего Са2+-связывамцего

икопротеида на развитие асцитной карциномы эрлиха. - В сб.:

охимия опухолевой клетки, 1990, Минск,БГУ, с.91-92.

Долгачева Л.П., Гиновкер А.Г., Миронова Г.Д. Динамика

льцийсвязывамцего белка печени золотистых хомяков при

исторхозе. - Паразитология, 1990, 24, 6, с.523-528.

Mironova G.D., Utesheva G.A., Sirota T.V., Dolgachova L.P.

2-f

lecular organization oí the eleotrogenous Ca transport system animal mitochondria. - In: Molecular organization of ological structures, Moscow, 1989.7,1, p.25-Мальцев A.B., Миронов Г.П., Долгачева Л.П., Кайдаулова Н.В. особ хранения стерильных агаровых гелей для иммунодиффузной акции преципитации, авторское свидетельство N1168205 от .3.1985.

Saris N-E.L., Sirota T.V., Virtanen I., Niva К., Penttila T., lgachova L.P., Mironova G.D. Inhibition of the mitochondrial loium uniport by antibodies against the 40 kD ycoprotein.-Bioohem. (in press)

'.Долгачева Л.П., Сирота Т.В., Теплова В.В. Участие 2+-связывающ8го гяикопротеида с М.м. 40 кД в системе вктрогенного транспорта Са2+ в митохондриях. - Укр. биохим. рнал. (в печати).

15.05.92 г. Затс.бОПР Тир. 125 эка. Уч.-изд.л. 1.0

Отпечатано на ротапринте в ОНТИ ПНЦ РАН