Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Система электрогенного транспорта ионов калия в митохондриях и ее участие в термогенезе бурой жировой ткани

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Система электрогенного транспорта ионов калия в митохондриях и ее участие в термогенезе бурой жировой ткани"

российская академия наук институт теоретической и экспериментальной биофизики

На правах рукописи

СКАРГА Юрий Юрьевич

УДК 541.132:546.41:591.1

СИСТЕМА ЭЛЕКТРОГЕННОГО ТРАНСПОРТА ИОНОВ КАЛИЯ В МИТОХОНДРИЯХ И ЕЕ УЧАСТИЕ В ТЕРМОГЕНЕЗЕ БУРОЙ ЖИРОВОИ ТКАНИ

03.00.02. - биофизика

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ПУЩИНО - 1994 г

Работа выполнена в лаборатории управления энергообеспечением физиологических функций Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Научные руководители: доктор биологических наук

Г.Д.Миронова кандидат биологических наук Н.М.Федотчева

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Ю.В.Евтодиенко

кандидат биологических наук А.А.Шарышев

Ведущая организация - Научно-исследовательский Институт физико-химической биологии им.А.Н.Белозерского

Защита состоится 1994 г в -/а час.

на заседании Специализированного совета Д200.22.01 при Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН (142292, Московская обл., г.Пущино, ИТЭВ РАН)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН.

Автореферат разослан 1994 г

Ученый секретарь Специализированного совета, //

кандидат биологических-наук^' П-А^3элип0вич

Актуальность проблема. До настоящего времени молекулярный механизм транспорта ионов К+ в митохондриях (MX) не выяснен. Предполагается, что в MX существует две системы транспорта ионов К+ : система электрснейтрального выхода ионов К+ в обмен на ионы Н+ (Chavez et al., 1977; Garlld, 1980.) и система электрогенного входа ионов К+ (Rottenberg, 1973; Brierley et al., 1977; Halestrap et al., 1987). Выход ионов К4" из MX осуществляется К+/Н+-антипортером, который представляет собой белок с молекулярной массой 82 кДа (Martin et al., 1984). Вопрос о том, какая транспортная система осуществляет электрогенный вход, остается до последнего времени невыясненным. Предполагается, что в транспорте ионов К+ в MX могут участвовать жирные кислоты (Wojtczak, 1974), липиды мембраны (Кудзина и др., 1974; Маршанский и др., 1983,1985), интегральные мембранные белки, в частности переносчик адениннуклеотидов (Panov et al., 1980; Le Quoc et al., 1988), Са2+-индуцированная пора (Crompton et al., 1988; Brockemelr- et al., 1989), либо специфические белки, которые образуют во внутренней мембране канал для электрогенного входа ионов К+ (Миронова и др., 1981; Diwan et al., 1988; Paucek et al., 1992). Кроме того, во внутренней мембране митохондрий печени крысы обнаружен > АТФ-чувствительный потенциалзависимый К+-канал (Inoue et al., 1991 ).

В нашей лаборатории из MX сердца быка и печени крысы был выделен белок, который индуцировал перенос ионов К+ через искусственную фосфолипидную мембрану (Миронова и др., 1981) и транспорт ионов К+ при реконструкции в MX (Федотчева, 1989). Исследование молекулярного устройства и механизма функционирования этой системы является необходимой частью изучения процессов, происходящих в клетке.

Актуальность проблемы связана также с тем, что физиологическая роль системы транспорта ионов К+ в MX не установлена. Предполагается, что одной из главных функций этой системы является регуляция объема матрикса MX (Garlld, 1980), что, в свою очередь, оказывает влияние на многие митохондриальные функции (Halestrap et al., 1987, 1990). Вероятно, изменение объема MX имеет важное значение и в регуляции митохондриальных процессов у зимоспящих животных. Было показано, что при адаптации животных к холоду (Nedergaard and Cannon, 1987) и вхождении в состояние зимней спячки (Бакеева и Брустовецкий, 1993) происходят изменения объема MX. В работах Халестрапа (Halestrap et al.,1987)

установлено, что In vivo глюкагон - гормон, участвующий в регуляции теплопродукции, вызывает низкоамплитудное набухание MX. Авторы предполагают, что это набухание MX является результатом активации системы электрогенного транспорта ионов К+. Другой гормон - тироксин, инициирующий пробуждение сусликов (Demeneix and Henderson, 1978), увеличивал скорость электрогенного входа и содержание ионов калия в MX (Shears and Brouk, 1980). В работах Федотчевой (Федотчева и др., 1984) и Мироновой (Миронова и др., 1986) на MX печени гибернирующего суслика показано, что активность системы электрогенного транспорта ионов К+ прямо коррелирует с интенсивностью термогенеза.

Особый интерес представляет исследование роли ионов К+ в процессах термогенеза в MX бурой жировой ткани (БЖТ), специфической функцией которой является образование тепла за счет рассеивания протонного градиента , образуемого дыхательной цепью (Nicholls, 1979; Nlcholls and Locke, 1984). Эти исследования способствуют выяснению регуляторных механизмов, лежащих в основе термогенной реакции БЖТ.

Целью настоящей работы являлось изучение молекулярного механизма электрогенного транспорта ионов К+ в MX и функциональной роли этой системы в тармогенезе. теплокровных животных.

В связи с этим были поставлены следующие задачи исследования:

1. Получить поликлональные антитела к К+-транспортирующему белку из MX печени крысы и гомогената сердца быка. Применить полученные антитела в качестве ингибитора ионов К+ в MX печени крысы для обоснования принадлежности выделенного белка к системе унипорта калия в MX. Использовать антитела для разработки метода очистки белка на иммуносорбентах.

2. Исследовать транспорт ионов К+ в MX БЖТ суслика в состояниях спячки, пробуждения и бодрствования и сравнить с транспортом ионов К+ в MX печени в этих же состояниях.

3. Провести анализ содержания ионов К+ и в MX печени и БЖТ суслика при разных уровнях термогенеза.

4. Исследовать функциональную связь между системой транспорта калия и термогенезом в MX БЖТ суслика.

Научная новизна работы.

Получены специфические поликлональные антитела к белку с М.м. 55 кДа из MX печени крысы и к К+-транспортирувдему "белку из

-г-

гомогената сердца быка. Показано, что антитела к 55 кДа белку ингибируют электрогенный транспорт ионов К+ в МХ печени крысы.

Впервые проведено исследование процессов транспорта калия и измерение содержания ионов К+ л М£г в МХ БЖТ при различных физиологических состояниях. На основании полученных данных высказано предположение о регуляторной роли системы транспорта калия в термогенезе теплокровных животных. Научно-практическое значение работы.

Приведенные в работе данные указывают на белковую природу системы электрогенного транспорта ионов К+ в МХ и могут найти практическое применение при исследовании механизмов Функционирования ионных каналов белкового происхождения.

Исследование транспорта калия в МХ БЖТ имеет существенное значение для понимания механизма регуляции термогенеза. Полученные результаты могут быть использованы для поиска метаболических триггеров гштометаболических состояний и найти практическое применение в криобиологии и криомедицине.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на рабочих совещаниях и школах "Механизмы зимней спячки" (г.Пущино, 1986, Г988, 1989 гг.); на Всесоюзных симпозиумах "Молекулярные механизмы и регуляция энергетического обмена" (г.Пущино, 1986), "Метаболическая регуляция физиологического состояния" (г.Пущино, 1984); 4-ой Европейской биоэнергетической конференции (Прага, 1986).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано восемь работ и одна находится в печати.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы ( ссылки). Работа изложена на страницах, включая 5 таблиц и рисунков.

Материалы и методы исследования.

Исследования проводили на МХ печени крыс линии Вистар и МХ печени и БЖТ сусликов СПеПиэ ипйиШиэ, содержащихся в условиях, приближенных к естественным. МХ гибернируюших сусликов выделяли в период глубокой спячки животных (декабрь - январь), пробуждающихся - в период самопроизвольного выхода животных из спячки (март - апрель) и активных - на протяжении всего цикла бодрствования животных.

МХ печени выделяли общепринятым методом дифференциального

центрифугирования с модификациями, разработанными в лаборатории (Кондрашова, 1973). Выделение MX БЖТ проводили этим же методом с добавлением в среду выделения 0,1% бычьего сывороточного альбумина (БСА), очищенного от свободных жирных кислот, и дополнительным переосаждением MX (Cannon, 1979).

Выделение К+-транспортирущвго белка из MX печени крысы и гомогената сердца быка проводили по разработанному в нашей лаборатории методу этанольной экстракции (Миронова и др., 1973, I9SI). Липида из супернатанта водного экстракта удаляли по методу Фолча (Folch et al., 1957). Дальнейшую очистку бежа проводили хроматографией на сефадексах '0-15 и G-50 и электрофорезом в 10%-ном ПААГ (Davis, 1964). Проверка гомогенности и определение молекулярного веса выделенного белка проводились в 10% ПААГ с 0,18 додецилсульфатом натрия (Fairbanks et al., 1971).

Антитела к ^-транспортирующему белку получали в процессе иммунизации кроликов весом 1,8-2,2 кг электрофоретически чистым белком с полным адъювантом Фрейда (Скарга и др., 1987). Наличие антител и специфичность антисыворотки проверяли методом двойной радиальной иммунодиффузии по Ухтерлони (Ouchterlony, 1958). Фракцию иммуноглобулинов получали с помощью высаливания 50%- и 33Ж-растворами сульфата аммония и очистки на колонках с ДЭАЭ-целлюлозой и CNBr-сефарозой, нагруженной белком А (Остерман, 1983). Иммунохимическую идентификацию К+-транспортирущего белка и термогенина (разобщающего белка) в митохондриях проводили методом иммуноблота (Towbin et al., 1979).

Дыхание митохондрий исследовали полярографическим методом при концентрации белка 2-3 мг/мл среды инкубации. Транспорт ионов К+ в митохондриях изучали с помощью К+-селективного электрода и набухания митохондрий в изотонических солях ацетата или нитрата калия. Набухание митохондрий оценивали по изменению оптической плотности суспензии митохондрий при длине волны 540 нм.

Концентрацию ионов К+ в суспензии MX определяли К+-селективным электродом с калибровкой 0,1 M KCl в каадом опыте. Содержание магния определяли на атомно-абсорбционном спектрофотометре 5100 фирмы Perkin Elmer в воздушно-ацетиленовом пламени.

Связывание ГДФ с MX БИ определяли изотопным методом с использованием [3Н1 ГДФ (Desautels et al., 1976). Значения коэффициентов связывания (Kd и Втах) рассчитывали с помощью

программы для линейных регрессивных уравнений ( метод наименьших квадратов) на компьютере.

Содержание Оелка определяли по методу Лоури (Lowry et al., 1951), используя бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта.

Результаты экспериментов и их обсуядение.

Получение и характеристика антител

к К+-транспортируицему белку.

В последнее время показано, что эффективным методом исследования транспортных систем является использование антител к выделенным белкам (Pantll et al., 1976; Ball et al., 1983.), особенно при отсутствии специфических ингибиторов данной системы транспорта. Для применения данного подхода в доказательстве принадлежности выделенного нами белка к системе транспорта калия в митохондриях, были получены антитела к этому белку.

Белок выделяли методом этанольной экстракции на холоду с дальнейшей очисткой на хроматографических колонках с сефадексом G-15 и G-50 (Миронова и др. 1984). На конечной стадии очистки методом препаративного электрофореза в 10% ПААГ К+-транспортирующей активностью обладали две белковые зоны (Рис. I). Эти белки имеют одинаковую электрофаретическую подвижность при электрофорезе в присутствии 0.1% ДСН. Молекулярная масса мономера составляла около 55 кДа.

Рис Л. Электрофоре граммы

»,„.„ — Z. •-! "и К+-транспортирующего бэлка

■ v .. я«а в 10%-ном ПААГ. А-препара-

- • j тивный электрофорез после

• ... • ■ ; хроматографии на колонке с

„ 1 »« сефадексом G-50. Б-злектро-

! г у форез в присутствии 1%-го

. ДСН: I-белковая полоса

Rf=0,37; 2-белковая полоса 1^=0,17; 3-метчики.

Для получения антител использовали электрофоретически гомогенный белок. Было проверено несколько способов иммунизации. Установили, что получить антитела с высоким титром и наименьшей затратой антигена позволяет схема иммунизации, при которой основной зоной инъекции являются подколенные лимфоузлы. В результате иммунизации были получены антитела к изучаемому белку,

выделенному как из печени крысы так и из сердца быка. Среднее значение титра антител составляло 1:512. Титр антител, полученных на белок из сердца быка, был выше, чем на белок из печени крысы.

Методом двойной радиальной иммунодиф$узии было установлено, что антисыворотка к белку из сердца быка образует полосу преципитации только с белком, выделенным из этой же ткани, и не взаимодействует с той же• концентрацией белка, выделенного из печени крысы. Такой же специфической активностью в отношении белка, выделенного из печени крысы, обладала антисыворотка к это^у белку (рис. 2).

2 'i

з - -.О б

' 4.5 г 5

В 'Г

Рис.2.Олредаление специфичности полученных антисывороток по Ухтерлони.

В центральных лунках - антисыворотки (А,Б- к белку из печени крысы; в,Г-к белку из сердца быка). В периферических лунках: (I-6)-последовательные двукратные разведения белка (А,В-белок из сердца быка; Б,Г-белок из печени крысы).

Кроме того, было обнаружено, что белок, выделенный из печени других видов животных (суслика, золотистого хомячка, голубя) специфически взаимодействует лишь с антисывороткой к К+-транспортирукнцему белку из печени крысы. Эти данные указывают на то, что выделенный белок имеет определенную тканевую специфичность.

Ингибироваше антителами транспорта калия

в митохондриях печени.

В связи с отсутствием специфического ингибитора унипорта К+ в МХ, полученные антитела использовали в качестве специфического ингибитора электрогенного транспорта калия в МХ печени крысы. Контролем служили очищенные иммуноглобулины 0 (1вС) сыворотки крови интактных кроликов и сыворотки животных,

иммунизированных белком, выделенным из гомогената сердца быка, а также антитела к белку печени крысы, которые потеряли способность взаимодействовать с антигеном.

Поскольку белок индуцирует электрогенный транспорт ионов К+ через бислойные липидные мембраны (Миронова и др., 1981), исследовали влияние антител на скорость выхода ионов К+ из деэнергизованных МХ в присутствии ДНФ и скорость энергозависимого входа ионов К+ в изотоническом растворе ацетата калия. После 1,52 минут преинкубации антител с МХ транспорт ионов К+ индуцировали соответственно ДНФ или субстратом дыхания. Для улучшения взаимодействия антител с суспензией МХ применяли термостагирование при 37°С и гипотонию.

Степень ингибирования зависела от концентрации антител и времени преинкубации. Максимальное ингибирование, наблюдаемое в данных экспериментах, составляло 47-50% (Рис. 3).

Рис.3. Ингибирование ДНФ-индуцируемого выхода калия из митохондрий печени крысы специфическими антителами к 55 кДа белку.

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 мг йвдха

Б таблице I приведены данные о влиянии специфических и контрольных антител на начальные скорости ДНФ-индуцируемого выхода ионов К+ из 'МХ и скорость набухания МХ в изотоническом ацетате калия. Ингибирующий эффект наблюдается только при добавлении к МХ Гей, содержащих неинактивированные специфические антитела.

Таблица I. Влияние очищенной фракции 105, содержащей специфические и неспецифические антитела, на скорость транспорта калия в митохондриях печени крысы.

Добавки Кол-во, мг ДНФ-индуцнр. выход калия нМ/мшьмг Ингибир. , % Набухание в К -ацет. :\/МИН-МГ Ингибир. %

- - 33,4-5,9 - 11,2-0,3 -

18« интактн. кроликов 0,3 ■ 0,6 34,1±5,1 33,7-4,3 0 0 К.Г^.З 0

1&, содержащие АТ к белку печени крысы 0,3 0,6 25,9x3,8 17,6±3,1 22 ' 47 12,1x1,3 5,74,7 0 49

содержащие АТ к белку из сердца быка 0,3 0,6 33,2^5,7 33,4±6,1 0 0 - -

103. содержащие инактив. АТ к белку печени кр. 0,3 » 0,6 33,5x6,2 31,1±5,9 0 7 - -

Полученные результаты свидетельствуют о специфическом взаимодействии антител к 55 кДа белку печени крысы с эндогенной системой транспорта ионов К+ в МХ. Неполное ингибирование связано, по-видимому, с использованием фракции общих относительной недоступностью антител к внутренней мембране МХ. Показано также, что антитела, ингибируя транспорт ионов не оказывают влияния на систему окислительного фосфорилирования. Эти данные указывают на принадлежность белка с М.м. 55 кДа к системе электрогенного транспорта ионов К+ в МХ.

Выделение и очистка 55 кДа белка с помощью антител.

На каждой стадии выделения и очистки была проведена количественна'- оценка выхода бежа. Установлено, что большие потери белка наблюдаются на стадии обработки смесью хлороформ-метанол-вода. Количество общего митохондриального белка уменьшалось примерно в 10 раз, в то ке время снижалась К+-транспортир./ющая активность белка. Кроме того, в процессе

очистки белка на сефадексах и в полиакриламидном геле происходит значительная потеря ¡^-транспортирующего белка и снижение его активности:, что связано, вероятно, с длительностью процедуры выделения и нестабильностью белка в растворе. В связи с этим, стадии выделения, на которых наблюдаются значительные потери белка и его активности, были исключены из процедуры выделения. Был разработан иммуноаффинный метод очистки этанольного экстракта на отечественных (на основе целлюлозного носителя в виде пористых шариков) и импортных (СЖг-сефароза 4В) носителях. Путем связывания антител с носителями были получены иммуносорбенты, которые позволяли очистить Оелок непосредственно из этанольного экстракта МХ или гомогената печени (Рис. 4).

Рис.4. Профиль элюции этанольного экстракта на колонке с иммуносорбентом, приготовленным путем ковалентного присоединения очищенных антител против К^-транппортирующего бежа к СШЗг-Сефарозе 4В. После выхода несвязавшихся белков (фракция А) колонку тщательно отмывали О,(ИМ фосфатным буфером (рН=7,2) с 0,ЗМ N801 (фракция Б). Специфически связавшиеся белки элюировали 0,2М ГЛИЦИН-НС1 буфером (рН=2,8), содержащим 0,5М ИаСЬ (фракция В), и анализировали с помощью электрофореза в присутствии 0,1% ДСН (I - маркеры; 2 - экстракт; 3 - фракция В).

Такая модификация метода очистки белка позволила ускорить процесс выделения и на порядок увеличить выход чистого препарата белка с высокой активностью.

Содержание и транспорт ионов К+ в митохондриях бурого жира и его роль в процессе термогенеза.

Сравнительный анализ содержания и параметров транспорта

калия в митохондриях печени и бурой жировой ткани.

Митохондрии бурой жировой ткани (МХ БЖТ) отличаются от МХ других тканей тем, что их основной функцией является не синтез АТФ, а генерация тепла. Эта специфичность обусловлена присутствием в МХ специфического белка - термогенина или разобщающего белка (РБ), который, являясь разобщителем окислительного фосфорилироваяия, осуществляет рассеивание энергии ДцН+ в форме тепла ( Неа(;оп а1., 1977). Предполагается, что разная активность термогенина, в зависимости от функционального состояния БЖТ, определяет уровень термогенеза.

На МХ печени гибернирущего суслика показано, что интенсивность термогенеза прямо коррелирует с активностью системы электрогенного транспорта ионов К"1" (Миронов;, и др., 1986; Федотчева, 1989). Наиболее высокая активность транспорта ионов К+ наблюдается в период пробуждения животного , когда усиливается теплообразование. Однако, печень не является типичным термогенным органом по сравнению с БЖТ. В этой связи исследовался транспорт ионов К+ в МХ БЖТ суслика для выяснения роли этой системы в тврмогенезе.

Сравнение содержания и скорости транспорта ионов К+ в изолированных МХ печени и БЖТ выявило значительные различия между ними. Как видно из таблицы 2, содержание ионов К+ в МХ БЖТ значительно ниже, чем в МХ печени. Однако, наблюдается общая закономерность в изменении содержания ионов К+ при смене физиологического состояния животного. В МХ печени и ВИ в период пробуждения количество ионов К+ увеличивается по сравнению с соответсвующими показателями в периоды спячки и бодрствования. Увеличение содержания калия в МХ может быть следствием.активации системы электрогенного входа ионов К+ в период пробуждения.

Таблица 2. Содержание и скорость транспорта калия в митохондриях бурого жира и печени сусликов в состояниях спячки, пробуждения и бодрствования.

Ткань Состояние животного Содержание калия нмоль/мг ДНФ-индуц. выход калия нмоль/мин-мг Набухание в К -ацетате А/мин«мг

Печень спячка пробужд. бодрств. 93,1x13,1* 168,1x3.7. 89,5-5,4 13,2x3,7* 67,5±8,9. 41,2-5,9 18,3x8,5* 45,9x7,8 32,8-8,7

БЖТ спячка пробужд. бодрств. 38,4x16,6 48,1x24,0 35,9-23,2 --- ---

* - Р<0,01 по сравнению с состоянием пробуждения.

Это предположение подтверждается данными об увеличении скорости транспорта калия и набухания МХ печени в период пробуждения животного (табл. 2 ). В отличие' от МХ печени, в МХ БКТ в тех же условиях инкубации транспорт ионов К+ и набухание не индуцируются. Это связано, по-видимому, с наличием в МХ БЖТ разобщающего белка, который осуществляет перенос протонов через мембрану. Следствием этого является снижение мембранного потенциала, необходимого для электрогенного транспорта ионов К+. Полученные данные указывают на то, что если в МХ БЖТ присутствует система электрогенного транспорта калия, то условия ее индукции и функционирования отличаются от условий, необходимых для МХ печени.

С помощью абсорбционной спектрофотометрии измеряли общее содержание ионов в МХ печени и БЖТ. Как видно из Рис.5.,

имеются незначительные различия в содержании ионов между МХ печени и БЖТ сусликов, находящихся в состоянии спячки, пробуждения и бодрствования. В отсутствие достоверных изменений концентрации магния при смене физиологических состояний наблюдается тенденция к уменьшению содержания ионов в начале выхода животного из спячки при температуре тела 14-20°С. Однако, эти данные требуют дальнейшего изучения, в частности, определения соотношения свободного и связанного магния в матриксе, поскольку предполагается, что транспорт калия регулируется свободным магнием (Саг11<1, 1980).

14-16 20-26

НраЗуьтешю

:.тгохо1лр."" 7 адроЕоИ '.у.ггл

ZVjC телй

Рис.5. Содержание магния в митохондриях печени и бурой жировой ткани суслика при различных температурах тела.

На основании данных о том, что MX БЖТ находятся в разобщенном состоянии (Nicholls et al., 1972) и что разобщенные MX теряют часть калия (Кудзина и др., 1979; Jung et al., 1982 ), низкое и вариабельное содержание ионов К+ в MX БЖТ может быть обусловлено разной степенью сопряжения этих MX In vivo и частичным выходом ионов К+ из MX в процессе их выделения.

Влияние факторов сопряжения и ионов Mgf+

на содержание калия в Ш БХТ.

Поскольку определяющую роль в разобщении MX БЖТ играет разобщающий белок (РБ), можно предположить, что физиологические регуляторы РБ будут влиять на содержание ионов К+ в матриксе MX. Известно, что активность РБ обратимо ингиб1руется пуриновыми нуклеотидами и активируется свободными жирными кислотами и ацил-КоА (Nicholls, 1979, 1983). Следовательно, можно ожидать, что при сопряжении MX БИТ путем добавления в среду выделения гуанозинтрифосфата (ГГФ) и БОА, который связывает свободные жирные кислоты (Nicholls, 1974), количество ионов К1" в матриксе должно возрастать.

В тай-тще 3 приведены данные, показывающие содержание ионов К+ в MX БЖТ, выделенных в присутствии или отсутствии ГТФ и БСА. Как видно из таблицы, ГТФ и БСА, добавленные порознь, незначительно увеличивают концентрацию ионов К+ в MX. Существенное увеличение содержания калия наблюдается при одновременном добавлении ГТФ и БСА. В последнем случае MX содержали в 2 раза больше ионов К+, чем MX, выделенные без ГТФ и БСА. Поскольку ГТФ и БСА увеличивали содержание ионов К+ в матриксе, выход этих ионов из MX связан, по-видимому, с процессом разобщения.

Таблица 3. Влияние ГТФ, БСА и магния на содержание ионов К+ в митохондриях бурой жировой ткани гибернирующего суслика.

» Добавки к среде выделения* Количество опытов Содержание калия нмоль/мг белка

I. -БСА - ГТФ п=8 36,0±8,3

2. -БСА + ГТФ п=4 42,3±5,2

3. +БСА - ГТФ п=4 53,1±3,1

4. +БСА + ГТФ п=8 82,5±6,2

5. -ГТФ -БСА + Mg2+ п=4 76,0±8,4

6. -ГТФ + БСА + tfg2+ п=4 98,1±12,0

*Среда выделения: 300 мМ сахароза, 10 мМ Трис-HCI (рН=7,4). Добавки: 1% БСА; 1мМ ГТФ; 10 мМ MgCLg.

Известно, что магний является одним из основных катионов клетки и играет важную роль в регуляции проницаемости мембран, в частности, ингибирует К+/Н1"-антшортвр MX (Martin et al., 1984; Garlld et al., 1986) и энергозависимый вход ионов К+ (Chavea et al., 1977). В ' следующих экспериментах было обнаружено, что добавление в среду выделения ионов приводило к значительному увеличению содержания ионов К+ в MX. В присутствии БСА влияние магния на содержание ионов К+ в матриксе возрастало: в этих условиях содержание калия было даже выше, чем в присутствии БСА и ГТФ. Механизм действия ионов Mg2"1* в MX БЖТ неясен. В некоторых работах показано, что магний участвует в регуляции активности РБ путем увеличения мест связывания для пуриновых нуклеотидов (Hennlngbleld and Swick, 1989 ). Однако, в работах Федотчевой (Фэдотчева и др., 1993) было показано, что ионы Mg2"1" не вызывают столь значительных изменений мембранного потенциала, чтобы они могли влиять на транспорт калия. Возможно, что действие магния непосредственно направлено на систему транспорта ионов К+ в MX.

На основании полученных данных можно предположить, что транспорт калия в MX БЖТ зависит от функционального состояния этой ткани и~ коррелирует с активностью разобщающего белка.

Возможные пути функциональной связи системы транспорта калия и РБ в MX EXT.

Механизм перехода разобщающего белка (РБ) из, низко- в высокоактивное состояние (и обратно) является одной из наиболее актуальных проблем регуляции термогенеза в MX БЖТ. Пуриновые

нуклеотиды и жирные кислоты служат эффективными регуляторами активности РБ.

Регулирующее действие пуриновых нуклеотидов на активность РБ в основном определяется числом мест связывания нуклеотидов (Вшах) и величиной константы связывания (К&). Соответственно, как стимуляция, так и ингибирование РБ отражается на изменении количества пуриновых нуклеотидов, связавшихся с РБ митохондрий. Ряд факторов могут влиять на изменение параметров Вшах и Kd, в частности, конформационное изменение белка (Cannon et al., 1987). Предполагается,что набухание Ж БЖТ обратимо переводит РБ в новое конформационное состояние. При этом активность РБ резко возрастает, уменьшается сродство к пуриновым нуклеотидам и в несколько раз падает чувствительность к ингибиторам.

В пользу этого механизма свидетельствуют полученные нами данные по связыванию [%] ГДФ с MX БЖТ в различных физиологических состояниях суслика. Математический анализ графиков Скэтчарда, которые были построены для каждого состояния на основании экспериментальных данных по связыванию меченного нуклаотида, показал существование двух типов участков связывания ГДФ - с высоким и низким сродством (Рис. 6).

В таблице 4 приведены средние значения Вшах и Кб. для участка связывания с высоким сродством в состояниях спячки, пробувдения и бодрствования. Из таблицы видно, что при переходе суслика из состояния спячки в состояние пробувдения и затем в активное состояние происходит изменение константы связывания (соответственно: КД=1,8 мкМ ; №5,27 мкМ; М=1,15 мкМ), в то время как число участков связывания практически не изменяется (соответственно: Втах=0,П9 нмоль/мг; Втах=0,105 нмоль/мг; Втах=0,108 нмоль/мг).

Рис.6. Концентрационная зависимость связывания [3Н]ГДФ митохондриями бурой жировой ткани в

координгтах Скэтчарда. А -

Бодрствование;

гибернация; X - пробуждение (Т=14-24°С);ф - пробуждение (Т=25-30°С).

Таблица 4. Зависимость параметров связывания [°Н] ГДФ от физиологического состояния суслика.

Состояние ' животного Температура тела Связывание 13Н1 ГДФ

К^ (мкМ) Втах (нмоль/мг белка)

Бодрствование 1 ■ 37°С 1,15*0,3 0,108*0,05

Гибернация 4-6°С 1,86*0,5 0,119*0,05

Пробуждение 14-24°С 2,98*0,5 0,114*0,06

. 25-30°С 5,27*0,8 0,105*0,05

Изменения не связаны с количественным изменением РБ, так как методом иммуноблоттинга было показано, что концентрация РБ не изменяется при переходе из одного состояния животного в другое (Рис. 7).

гтп- ЭГ5* г'пг'зп'очачт'тз' — т °с

Рис. 7. Определение концентраций разобщающего белка и АТФазы в митохондриях бурой жировой ткани в разных состояниях методом иммуноблота. В ДСН-ПААГ вносили одинаковую концентрацию МХ БЖТ (30 мкг). АТФазу и РБ идентифицировали после переноса на нитроцеллюлозу с помощью антител (ттзрвичные - кроличьи антитела против субъединицы АТФазы и РБ; вторичные - антитела против Iкролика, конъюгированные с пероксидазой) и окрашивания в 9-аминоэтилкарбазоле.

Из полученных данных следует, что регуляция термогенеза на уровне разобщающего бежа, вероятно, происходит за счет изменения конформации этого белка. Об этом свидетельствуют значительные измененеия К(1 при различных физиологических состояниях животного. Эти конформащюнные изменения могут быть следствием набухания МХ за счет входа ионов К+. Такой механизм регуляции термогенеза в бурой жировой ткани может существовать в условиях 1п 71то.

Выводы

1. Получены моноспецифические поликлональные антитела с высоким титром к 55 кДа белку, выделенному из МХ печени крысы.

2. Показано, что антитела к белку с М.м. 55кДа ингибируют электрогенный транспорт ионов К+ и не влияют на систему окислительного фосфорилирования, что указывает на принадлежность 55кДа белка к системе транспорта калия в митохондриях.

3. С использованием антител разработан иммуноаффинный метод очистки 55 кДа белка, позволяющий увеличить его выход и сохранить биологическую активность.

4. Показано, что содержание ионов К+ в изолированных МХ БЖТ значительно ниже, чем в МХ печени. Обнаружено, что в МХ БЖТ оно регулируется такими сопрягающими факторами как ГТФ и альбумин.

5. Обнаружено, что активация термогенеза связана с увеличением содержания ионов К+ в МХ БЖТ и печени. Концентрация ионов при этом не изменяется, однако 1п у1Лго ионы повышают содержание ионов К+ в МХ БЖТ до уровня, характерного для сопряженных митохондрий.

в.Показано, что при смене физиологического состояния суслика происходят конформационные изменения разобщающего белка, а не его концентрации.

7.Полученные данные об изменениях содержа-шя ионов К+ в МХ БЖТ под влиянием сопрягающих факторов и юно', и отсутсвие количественных изменений разобщаицего белка указывают на роль транспорта калия как процесса регулирующего термогенез в бурой жировой ткани.

Список работ, опубликованных по теие диссертации.

1.Скарга Ю.Ю., Долгачева Л.П., Федотчева Н.И., Миронова Т.Д. Влияние антител к митохондриальному К+-транспортирующему белку на транспорт К+ в митохондриях печени крысы. - Украинский биохимический журнал, 1987, 59, №6, 54-59.

2.Долгачева Л.П., Скарга Ю.Ю. Иммунохимическое изучение ткане- и видоспецифичности митохондриальных ион-транспортирующих белков. - В сб.: Метаболическая регуляция физиологического состояния. Пущино, 1984, с.55.

3.Миронова Г.Д, Федотчева Н.И., Скарга Ю.Ю., Кондрашова М.Н. Транспорт калия и дыхание митохондрий при выходе суслика из состояния зимней спячки. - Механизмы зимней спячки. Сб. трудов. Пущино, 1987, с.39-47.

4.Миронова Г.Д., Федотчева Н.И., Скарга Ю.Ю, Копецки Я., Хоуштек И. Сравнительный анализ термогенных систем митохондрий печени и бурой жировой ткани. - Механизмы природных гипометаболических состояний. Сб. трудов. Пущино, 1991, с.34-43.

5.Федотчева Н.И., Скарга Ю.Ю. Транспорт ионов К+ в митохондриях, модифицированных хинидином и дансилхлоридом. -Виол, мембраны, 1988, т.5,ЖЕ, с.13-17.

6.Федотчева Н.И., Скарга Ю.Ю. Влияние хинидина и дансилхлорида на транспорт К+ при различных функциональных состояниях митохондрий. - Молекулярные механизмы и регуляция энергетического обмена. Материалы Всес. симпоз. Пущино, 1986, с. 67-68.

7.Fedotcheva N.I., Mironova G.D., Skarga Yu.Yu. Mitochondrial K+-transporting systems during hibernation and arousal. - Living in the cold. 2-nd Intern. Strasburg, 1989. p.T.

8.Mironova G.D., Fedotcheva N.I., Skarga Yu.Yu., KopetsKy J., Houstek J. Comparative analysis of thermogenic systems ot mitochondria ol liver and adipose brown tissue ol ground squirrel. In: Mechanisms of natural hypometabolic states, Pushchino, 1992.

9.Федотчева Н.И., Скарга Ю.Ю., Фойгель А.Г. Влияние ГДФ и карбоксиатрактилата на транспорт калия в митохондриях бурого жира..- Биохимия (в печати).

14.12.93 г. Зак.б895Р. Тир. 50 экз. Уч-изд.л. 1.0

Отпечатано на ротапринте в ОНТИ ПНЦ РАН