Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Содержание натрия и калия в бурой жировой ткани в постнатальном онтогенезе

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Елсукова, Елена Ивановна, Красноярск

МИНИСТЕРСТВО ОБЩЕГО И ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ КРАСНОЯРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ

УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

УДК 612.015.3-084:612.592

ЕЛСУКОВА Елена Ивановна

СОДЕРЖАНИЕ НАТРИЯ И КАЛИЯ В БУРОЙ ЖИРОВОЙ ТКАНИ В ПОСТНАТАЛЬНОМ ОНТОГЕНЕЗЕ

( 03.00.13 - физиология человека и животных )

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Красноярск - 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ ......................................... 5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Морфофункциональная характеристика

бурой жировой ткани.................... 13

1.2. Нейроэндокринная регуляция термогенеза

в БЖТ ................................. 19

1.3. Молекулярно-клеточный механизм термогенеза в БЖТ .......................... 21

1.4. Ионный гомеостаз БЖТ

1.4.1. Концентрации катионов К+ и Ыа+ в ади-поцитах БЖТ ......................... 30

1.4.2. Особенности мембранного транспорта катионов Ыа+ и К+ в адипоцитах БЖТ ... 33

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Экспериментальные животные ............ 41

2.2. Определение интенсивности энергообмена крысы................................. 41

2.3. Определение содержания воды, натрия и калия в тканях ........................ 42

2.4. Определение содержания кальция в тканях 43

2.5. Определение объема внеклеточного пространства ............................... 44

2.6. Определение интенсивности энергообмена тканей ................................ 44

2.7. Определение белка, РНК и ДНК .......... 45

2.8. Выделение фракции молодых адипоцитов .. 47

2.9. Введение Са2+-зависимого фотобелка обе-лина в адипоциты БЖТ .................. 48

2.10. Определение концентрации свободного

2 +

Са в цитоплазме клеток по их люми-

с

несценции............................ 50

2.11. Используемые реактивы............... 52

2.12. Статистическая обработка результатов исследования ........................ 52

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ ГЛАВА 3. СОДЕРЖАНИЕ КАТИОНОВ Ыа+ И К+ В БУРОЙ ЖИРОВОЙ ТКАНИ И ПЕЧЕНИ КРЫС В РАННЕМ ПОСТНА-ТАЛЬНОМ ОНТОГЕНЕЗЕ ...................... 53

3.1. Общая характеристика онтогенетического роста и развития животных ............ 53

3.2. Морфофизиологические показатели БЖТ и печени

3.2.1. Возрастная динамика весовых показателей БЖТ и печени ................. 53

3.2.2. Содержание ДНК в БЖТ крыс разного возраста ........................... 57

3.2.3. Содержание РНК и белка в БЖТ и печени крыс разного возраста............ 58

3.2.4. Содержание воды в БЖТ и печени крыс разного возраста ................... 62

3.3. Возрастная динамика содержания ионов

К+ и Ыа+ в БЖТ и печени ............... 63

3.4. Интенсивность потребления 02 бурой жировой тканью и печенью крыс ........ 7 6

3.5. Содержание ионов Са2+ в БЖТ и печени

крыс разного возраста ................ 7 9

ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ УРОВНЯ ГРУДНОГО ВСКАРМЛИВАНИЯ НА

СОДЕРЖАНИЕ Иа+ и К+ В БЖТ И ПЕЧЕНИ....... 8 4

4.1. Рост и энергообмен у крысят в редуцированных пометах ..................... 85

4.2. Морфофизиологические показатели БЖТ и печени у крысят в искусственно реду-

цированных пометах ................... 8 6

4.3. Внутриклеточные концентрации Na+ и К+ в БЖТ и печени животных из редуцированных пометов ....................... 8 8

ГЛАВА 5. СРАВНИТЕЛЬНО-ВИДОВОЙ АНАЛИЗ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ КАТИОНОВ К+ И Na+ В БЖТ ............. 91

ГЛАВА б. РАЗРАБОТКА МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО СВОБОДНОГО Са2+ В БУРОЙ ЖИРОВОЙ

ТКАНИ С ПОМОЩЬЮ ФОТОБЕЛКА ОБЕЛИНА....... 95

ГЛАВА 7. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

7.1. К+, Na+ и термогенный потенциал БЖТ.... 100

7.2. Диетиндуцированные изменения в БЖТ.... 113

ВЫВОДЫ ........................................... 118

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ................................ 120

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы: Бурая жировая ткань (БЖТ)

специализированный центр несократительного термогенеза, физиологически необходимого при адаптации к холоду (Foster, Frydman, 1979), гиперфагии (Rothwell, Stock,

1979, 1987) и на ранних стадиях постнатального онтогенеза

у многих млекопитающих, включая человека (Lean, 1989; Si-

dlo, Zaviacic, 1994) . Снижение функциональной активности

этой ткани приводит в случаях переедания, по крайней мере, у животных с небольшими размерами тела к быстрому развитию ожирения, а в отдаленный период - к инсулиндефи-цитному типу диабета (Himms-Hagen, 198 7; Spiegelman et

al., 1993; Trayhurn, 1995; Lower, Flier, 1997). Коррекция энергетического обмена в этих и ряде других случаев, по-видимому, должна включать активацию БЖТ, а для оптимальной реализации последней необходимо точное представление о термогенном механизме бурого жира.

Нет сомнений в том, что его ключевое звено представлено специфическим разобщающим белком термогенином, локализованным во внутренней мембране митохондрий (Nicholls,

1976; Trayhurn, Milner, 1987; Trayhurn 1989, 1996). Однако, с меньшей уверенностью можно указать косвенных участников термогенеза и описать события, предшествующие синтезу термогенина, совокупность которых обеспечивает адекватные по знаку и амплитуде ответы БЖТ на стимулы. Это прежде всего адренергический сигнал (Nedergaard et al. , 1989; Itsuro et al., 1994; Katsumi et al., 1995), система вторичных мессенджеров (Shih Mei-Fen, Taberner, 1995; Ni-soly et al., 1995; Kolvisto, Nedergaard, 1996), липолиз,

гликолиз и липогенез (Cooney, Newsholme, 1982), белковый синтез (Trayhurn, Milner, 1987) и клеточная пролиферация (Geloen et al., 1990) . Исходя из общих представлений о регуляции метаболизма в этот список следует включить минеральные вещества, в первую очередь катионы Na+, К+ и Са2+ (Данко и др./ 1984; Веренинов, Марахова, 198 6; Авдонин, Ткачук, 1994).

За время, прошедшее после открытия в адипоцитах БЖТ распределения Na+ и К+ (Girardier, Seydox, 1971), необычного для клеток, обладающих Na+, К+-насосом, во-первых, интенсивно исследовалась роль этих ионов в регуляции разных сторон метаболизма других клеток и тканей (Веренинов, Марахова, 1986; Авдонин, Ткачук, 1994; Асланиди и др., 1998), во-вторых, неуклонно накапливались данные о связи между этими катионами и термогенезом в самой БЖТ. Было обнаружено, что адренергическая стимуляция краткосрочных культур адипоцитов бурого жира обязательно сопровождается изменениями мембранного транспорта и внутриклеточных концентраций Na+ и К+ (Connoly et al., 1986; La Noue et al., 1986; Giovannini et al., 1988; Lucero, Pappone, 1990; Kolvisto, Nedergaard, 1996). Установлено in vivo, что при

разнообразных физиологических состояниях, сопровождаемых изменениями термогенного статуса БЖТ, сопряженные изменения испытывает активность Na+, К+-насоса (Horwitz, 1979; Rothwell et al., 1981; Rothwell et al., 1982; Zamora et al., 1991). Однако прямой вклад Na+, К+-насоса в термоге-нез, по-видимому, незначителен (Himms-Hagen, 1976). Поэтому предполагается, что Na+ и К+ являются необходимыми регуляторами термогенного ответа, возможно, на подступах

к митохондриальному аппарату, а Ыа+,К+-насос выступает в

качестве одного из механизмов, создающих оптимальное для термогенного ответа соотношение внутриклеточных концентраций [К+] / [Ыа+] (Медведев, Никольская, 1991). Для получения дополнительных аргументов "за" и "против" участия Ыа+

и К+ в термогенезе следовало бы иметь данные о сопряженности изменений между [К+] и [Ыа+] с одной и термогенезом бурой жировой ткани при физиологических ситуациях, положительно и отрицательно влияющих на функцию БЖТ - с другой стороны. Однако такая работа выполнена только для случая адаптации к холоду, причем, в основном, в сроки практически полного завершения процесса адаптации (Медведев и др., 1987). В этом отношении весьма ценным представлялось бы изучение раннего постнатального онтогенеза с его глубокими изменениями в энергетике бурого жира .

Кроме того, дополнительно необходим сравнительно-видовой анализ концентраций К+ и Ыа+, так как до настоящего времени они определены только для БЖТ лабораторных крыс.

Цель работы состояла в выявлении связи между балансом катионов Ыа+ и К+ и теплообразованием в БЖТ у животных

разных видов и на этапе раннего постнатального онтогенеза у крыс Вистар.

Для достижения поставленной цели требовалось решить следующие задачи:

- определить внутриклеточные концентрации К+, Ыа+ и отношение [К+] / [Ыа+] в буром жире разных видов животных;

- сравнить динамику внутриклеточных концентраций К+, Ыа+ и отношения [К+] /[Ыа+] в БЖТ и в термогенно неспециализиро-

ванном паренхиматозном органе - печени в раннем постна-тальном онтогенезе крыс Вистар;

- сопоставить возрастные изменения внутриклеточных концентраций К+ и Na+ в БЖТ и печени с динамикой скорости потребления 02 этими тканями in vitro, содержанием в них

2 +

воды, белка, РНК, ДНК, катионов Са

- определить влияние естественного перекорма в раннем по-стнатальном онтогенезе на внутриклеточные концентрации катионов К+ и Na+, потребление 02 БЖТ и печенью, содержание в них воды, белка, РНК и ДНК;

- разработать метод определения концентрации цитоплазма-тического Са2+ в адипоцитах БЖТ с помощью Са2+-зависимого фотобелка обелина и на его основе определить концентрацию свободного Са2+ в цитоплазме адипоцитов бурого жира крыс Вистар.

Положения, выносимые на защиту:

- Сочетание высокой концентрации Na+ (>7 0 ммоль/л Н20) и

низкого отношения [К+] / [Na+]«2 является специфическим признаком адипоцитов БЖТ. В постнатальном онтогенезе снижение внутриклеточного содержания Na+ и К+ в БЖТ в отличие

от термогенно неспециализированной печени коррелирует со снижением потребления 02 тканью.

Усиление питания в раннем постнатальном онтогенезе значительно увеличивает теплообразование в БЖТ и печени, при этом в БЖТ молодняка снижается темп пролиферации, содержание К+, Na+ и белка, соответствуя более поздней стадии возрастного развития.

- В буром жире в отличие от печени внутриклеточное содержание Na+ и К+ в раннем постнатальном онтогенезе поло-

жительно коррелирует с содержанием Са2+. Концентрация свободного Са2+ в адипоцитах, определенная с помощью Са2+-зависимого фотобелка обелина, составляет 1 мкмоль/л. Научная новизна работы^

В результате комплексного анализа внутриклеточного баланса Ыа+ и К+ в бурой жировой ткани установлено:

- Обнаруженная ранее у лабораторных крыс особенность ка-тионного гомеостаза адипоцитов бурого жира, проявляющаяся

в очень высокой концентрации Ыа+ (>7 0 ммоль/клеточной воды) наряду с типичной для клеток, обладающих Ыа+,К+-насосом, концентрацией К+ и низким отношением [К+] / [Ыа+] (<2), является специфичным признаком БЖТ и других видов животных. Уникально высокая концентрация Ыа+ (153 ммоль/л

Н20) , сопоставимая с концентрацией этого катиона в плазме, зарегистрирована в адипоцитах сусликов.

- В постнатальном онтогенезе максимальное содержание Ыа+

и К+ обнаружено в БЖТ новорожденных. По мере роста и развития животных содержание К+ и Ыа+ снижается, коррелируя с

онтогенетическим снижением потребления кислорода тканью. В термогенно неспециализированной печени связь между снижением содержания катионов и увеличением потребления 02 в онтогенезе отсутствует. В БЖТ животных, выращиваемых в искусственно уменьшенных пометах и получающих больше материнского молока, эта связь также не проявляется. Усиление грудного вскармливания предотвращает онтогенетическое снижение скорости дыхания, в то же время значительно ускоряя возрастное снижение внутриклеточного содержания Ыа+ и К+, общего белка и темпов пролиферации в буром жире.

Однонаправленная динамика минерального, белкового обмена

и пролиферации свидетельствует об участии катионов Ыа+ и К+ в регуляции трофических изменений термогенеза БЖТ.

- Динамика содержания К+ и Ыа+ в БЖТ в раннем постнаталь-

ном онтогенезе коррелирует с динамикой суммарного Са2+. Для оценки цитоплазматической концентрации свободного Са2+ в адипоцитах разработан метод, основанный на люминесценции Са2+-зависимого белка обелина. Концентрация свободного Са2+ в адипоцитах крысы составляет 1 мкмоль/л.

- Впервые доказано участие бурой жировой ткани и печени в диетиндуцированном термогенезе на ранних этапах постна-тального онтогенеза. Установлено, что у сосунков, получающих избыток грудного молока, усиление теплопродукции в БЖТ сочетается со снижением количества адипоцитов.

Научно-практическая значимость работы.

Результаты сравнительно-видового и онтогенетического исследования баланса катионов Ыа+ и К+ в адипоцитах бурого

жира, необычного для клеток млекопитающих с Ыа+,К+-

насосом, подтверждают гипотезу о регуляторной роли этих катионов в термогенной функции бурого жира и тем самым расширяют представления об их физиологическом значении.

Высокая внутриклеточная концентрация Ыа+ (>7 0 ммоль/л клеточной воды) наряду с низким отношением [К+] / [Ыа+] (<2)

может рассматриваться как тканеспецифичный признак бурого жира, который наряду с такими маркерами этой ткани, как

термогенин, 5'деиодиназа типа 2, может использоваться для идентификации этой ткани.

Разработан высокочувствительный, не влияющий на Са2+-буферную емкость цитоплазмы, метод определения концентрации свободного Са2+ в адипоцитах БЖТ, который может быть

использован в исследованиях механизмов Са2+-гомеостаза в этих клетках, участия этого катиона в срочном и трофическом термогенном ответе бурого жира на стимулы.

Несмотря на большое число исследований по диетиндуци-рованному термогенезу (ДИТ), онтогенетические особенности его становления изучены недостаточно. Это определяет значимость полученных в работе результатов по термогенному ответу бурой жировой ткани и печени у сосунков для фундаментальных и прикладных исследований в области возрастной физиологии. Предлагаемая новая идея об относительной выгодности ДИТ для организма на этом этапе онтогенеза, о конкуренции ДИТ с процессами роста и созревания функциональных систем позволяет рассматривать БЖТ в качестве мишени для направленных воздействий на скорость онтогенетического развития организма.

Результаты исследования внедрены в лекционные курсы кафедры биомедицинских основ жизнедеятельности человека Красноярского государственного педагогического университета и кафедры биохимии и физиологии человека и животных Красноярского государственного университета.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на конференции "Механизмы адаптации организма" (Томск, 1996); на 3-м съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 1997); на 9-м Всероссийском симпозиуме с международным участием "Реконструкция гомеостаза" (Красноярск, 1998).

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, семи глав, выводов и списка цитированной литературы. Объем диссертации составляет 145 машинописных страниц, включая 19 рисунков, 22 таблицы. Список цитированной литературы насчитывает 18 5 публикаций.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Морфофункциональная характеристика бурой жировой ткани

Первое описание бурой жировой ткани было выполнено Конрадом Геснером в 1551 г. у сурка (цит.по: Lean, Tray-

hurn, 1987). Позднее эту ткань обнаружили у большинства

представителей класса млекопитающих, включая человека (Sidlo, Zaviacic, 1994; Zancanaro et al., 1995). На сегодняшний день не идентифицирован бурый жир у домашних свиней и не решен вопрос о наличии бурого жира, эквивалентного млекопитающим, у птиц (Trayhurn, 1996).

По происхождению, цитологическим и биохимическим критериям БЖТ относится к жировой ткани, однако в силу целого ряда морфо-функциональных и метаболических особенностей ее выделяют в отдельную разновидность (Ricquier,

1993, Trayhurn, 1996, Klaus, 1997). В отличие от относительно диффузного распределения в организме клеток белого жира, БЖТ организована в глобулярные структуры, напоминающие типичные паренхиматозные органы (Nnodim, 1987).

Анализ топографии скоплений БЖТ в организме показывает, что она локализована вдоль магистральных кровеносных сосудов, идущих к жизненно важным органам, имея с последними прямую сосудистую связь. В связи с этим выделяют следующие места скопления БЖТ: межлопаточное, церви-кальное, аксиллярное, периренальное, перикардиальное депо. Распределение БЖТ между ними неодинаково у животных разных видов. У лабораторных грызунов, в частности, у

крысы 30% БЖТ сосредоточено в межлопаточной области, 47%

в аксиллярной области, 23 % в торакальном и периреналь-ном депо (Корниенко, 197 9). У хищников основное количество БЖТ распределено между цервикальным и периренальным депо (Loncar, Afzelius, 1989).

Своим названием БЖТ обязана темному, приближающемуся к бурому цвету, который обусловлен сильной васкуляризаци-ей и высоким содержанием дыхательных пигментов в ней. О плотности капилляров в буром жире и следовательно потенциальной метаболической активности этой ткани можно судить по тому факту, что в среднем 35 % поверхности ади-поцита БЖТ находится в контакте с эндотелием капилляров (Loncar, Afzelius, 1989). Другой характерной чертой БЖТ является достаточно плотная иннервация самих клеток БЖТ симпатическим отделом вегетативной нервной системы, в то время как в белом жире иннервация затрагивает только кровеносные сосуды. Недавно в БЖТ обнаружены капсаицинчувст-вительные нервные окончания (Gui, Himms-Hagen, 1992).

Диаметр адипоцитов БЖТ составляет около 2 0-4 0 мкм, что по сравнению с клетками белого жира - 60-100 мкм -существенно меньше. Адипоциты БЖТ имеют неправильную форму с многочисленными цитоплазматическими выростами особенно вдоль капилляров, многочисленные щелевые контакты друг с другом, мульти- а не унилокулярный тип запасания триглицеридов