Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние амилового эфира незамещенного годамина на транспорт ионов в митохондриях печени крыс

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние амилового эфира незамещенного годамина на транспорт ионов в митохондриях печени крыс"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛОЦИИ И ОРДБЯЛ ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕ! ШШ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. М. В.ЛОМОНОСОВА

Екологический факультет

На правах рукописи

КРАСНИКОВ Борис Федорович

ВЛИЯНИЕ АМИЛОВОГО ЭФИРА НЕЗАМЕЩЕННОГО ГОДАМЧНА НА ТРАНСПОРТ ИОНОВ В МИТОХОНДРИЯХ ПЕЧЕ1 и крис 03.00.04. - Биохимия

Автореферат диссертации на соискаш1в ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1992

Работа выполнена в лаборатории биоэнергетики Научно- ~ исследовательского института физико-химической биологии ни.А.Н.Белозерского МГУ им.М.В.Ломоносова.

Научшй руководитель : доктор биолопп'лжш р.аук, главный иьучний сотрудник Л.С.Ягужмнский.

Официальное оппонент : доктор биологических наук, профессор Ю.И.Ьвтодиышо

кандидат биологических наук, ст.н.с. В.К.Оланасенко

Ведущая организация : Гнститут биохимии ни.А.Н.Ьл«;) РЛ11

20

Защита состоится " 1992 г. h _J rtl_____ часов на

,. Я

заседании специализированного совета Д.05(3.05.82 по адресу î ÏI9899, Москва, Ленински» горы, Биологический факультет МРУ.

С диссертацией можьо ознакомиться в библиотека Пиолотческого факультета МГУ.

Автореферат разослан "_____ "___________________г.

Учоный секретарь сноцма-киэмр'икншого сомтя, , кандидат биологических наук

IMi.Jk'AKin

'••«•• ' ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Ак-^альпость_П£облеиу. В последнее время внимание исследо-г' вате^ей привлечено к изучению механизмов взаимодействия клеток и , . клеточных структур с органическими проникающими веществами. II разряда таких веществ относятся гидрофобные органические катионы ряда родамина. Известно, что эти агента, используемые в цитологии в качестве красителе!!, а в фотохемиоторатш как фотосенсибилизаторы - обладают рядом эффектов на живые системы : способностью накапливаться в энергопродуцирующих структурах клетки и длительное время в гак удерживаться: взаимодействовать с рядом ферментных систем: оказывать цнтотоксическое действие на неопластические образования и др. Имеется ряд предположений о механизмах действия таких веществ. Одно из них заключается в том, что эти вещества, аналогично природным агентам (например ионам кальция), могут оказывать влияние.на системы транспорта ионов в органеллах и клетках. Это в свою очередь приведет к изменению их ионного гомеостаза, в результате чего возможна индукция ряда специфических и неспецифических явлений.

Целью работа явилось проверить предположение, что механизм действия органических проникающих катионов ряда родамина аналогичен природным, Са^+-индуцируемым процессам, и провести болов детальное изучение их действия на митохондрии и их функции, а также исследовать как изд ;н*ятся энергетика .митохондрий при-обработке их амилродамином в условиях лазерного облучения.

Научная, новизна работа. Показано, что амилродамин в микро-молярннх концентрациях индуцирует две сйстеш разобщения мито-ховдртй : во-первых, проявляет себя как классический разобщитель - переносчик протона, и во-вторых," вызывает развитие 'процесса Са2+-зависимой вешэцифгсеской ионной проницаемости митохондри-альноЗ мембраны. Получены довода в пользу того, что индукция амилродамином неспецифической ионной проницаемости мембран митохондрий ' обусловлена его взаимодействием со специфическим мембранным рецептором, -тонко реагирующим не только на заряд" молекулы, но также на степень ее гидрофобности и структуру. Показано, что АЕ1г+ стимулирует Са2+/2Н^ обмен в митохондриях, активируя иа-независимый Са^+/2Н+ обменник, регулируемый ДрН. При облучении митохондрий лазером предположено усиление протоно-форной функции родаминового красителя и, следовательно,- разобца-

вдего действия на митохондрии.

Практическая значимость работы. Данная работа явилась частью исследований, посвященных изучению механизмов индукции ионных транспортных систем в митохондриях при действии внешних стимулов. В ходе исследований нами было, проведено более 400 экспериментов, в результате которых удалось определить Механизмы индукции ионного транспорта при действии органических йроййкаю-ида катионов и частично исследовать свойства этих /фоЦйСсов. Дашое исследова]ше дает новую информацию о механизме рования мембранного комплекса митохондрий, являющихся одйой из основных систем энергообеспечения клетки. Полученные результаты могут быть использованы для дальнейшего изучения меаанмзмов регуляции энергетики митохондрий в различных функциональных состояниях, а также в прикладных целях.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы докладывались на теоретических семинарах лаборатории биоэнергетики 11131 физико-химической биологии им.А.Н.Белозерского МГУ (Москва, 1989, 1990, 1991), Всесоюзных совещаниях "Молекулярные механизмы и регуляция энергетического обмена" (Пудшю 1990) в "Проблемы мембранной биоэнергетики" (Пущино 1991).

Публикации. По материалам исследования опубликована 1 статья.

Структура диссертации. Диссертация состойт из введения; обзора литературы, содержащего 3 главы; описания материалов в методов исследования; изложения результатов, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация иллюстрирована рисунками. -

- з -

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Мнтохон®от_п9чещ_крыс_щзэлялз1 методом дифференциал:. -ного центрифугирования (Grierr, Meyer, 1961). Среда выделения митохондрий содержала : 0,3 М перекристализованую сахарозу, 5 тМ HEP ES, 500 цМ EDTA (рН-7,5). Промывали митохондрии в среде, содержащей те же компонента, кроме edta.

2. Регистрацию.TO^öaemoHC^oEoaajBiToxoij^Hgira осуществляли полярографическим методом при помощи закрытого кислородного электрода типа Кларка и полярографа LP-7e (Чехословакия) при температуре 20°С. Перемеиивание среды инкубации и суспензии митохондрий производили при помощи магнитной мешалки.

3. . Сдаержагае_ионов_каль1щя^_калия в ячейке измеряли потенциометричесхим методом, при помощи кальцийселективного электрода фирмы "ORIOM" модель 93-20 (США) и К+-селективного стеклянного электрода собственной конструкции с крутизной в измеряемых пределах - 57 мВ.

4. Регастрацию^ембра™ осуществляли также потенциометрически по ' распределению проникащего катиона тетрафенилфосфония через мембранный фильтр с диаметром пор 5цл1, пропитанный раствором азолектина в декане (100 mg/1ml).

5. Изменение объема митохондрий регистрировали методом фотокалориметрии по рассеянию суспензией митохондрий светового луча длиной волны 660 нм. Угол между свето- и фотодиодами составлял 85°.

• 6. (^проницаемости фосфолипидной мембраны для родачипов и протона судили по изменению ее проводимости при постоянной разности потенциалов.

7. Регистрацию температуры в ячейке осуществляли при помощи терморезистора с чувствительностью 0.05°С._

8. Содержание белка в.пробе„митохондрий определяли биурото вым методом (Cornau et al., 1949). В качестве стандарта использовали бычий сывороточный альбумин фирмы "reaiial" (Венгрия).

9. Среаа_щ^бацги_митохон5рий содержала: 10 мМ HEP ES, 5 мУ сукцинат, 5 Ш трис-HCl, сахароза (очинённая от ионов кальция при помощи ионообменной смолы "DOWEX type 10x50" Uf* Форла) (¡щит "serva" (США)) количественно до необходимого уровня тонич-ности. При добавлении в среду икубации ионов калия, фосфата и других компонентов, тошпность среда до нухного значения доводи-

ли добавлением соответствующего количества очищенной сахарозы ; рИ да необходимых величин доводили при помощи трис-оН.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

По данным ряда авторов известно, что добавление к суспензии митохондрий красителей ряда родамина ( . структурные формул! приведены на рис.1-А,В)в концентрации от нескольких десятков, дс одиниц микромолей вызывает стимуляцию дыхания митохондрий, которая ингмбируется олигомицином, ионолом и Естл.

Н5СчААД

гч

: 4- :

Рис.1. Структурное формулы органических катионов : А - аынлродамик; Б - адамантилфосфоний; В - родамин бс; Г аурамин О.

Проведенная работа позволила показать, что на самом деле основе наблюдаемого эффекта стимуляции дыхания мптохондр] вызванного добавлением Ай1+, лежат два качественно различ:

- ь -

процесса. В определенных условиях эти процессы могут быть разделены во вримеки. При воздействии па митохондрии низких концентраций амилродачина удается наблюдать процесс „чиненного ускорени. дыхания на который затем накладывается второй процесс, характеризующийся постепенным нарастанием скорости дахания во времени (рис.2-А). Как видно из этого рисунка - первый процесс (I)

- второй процесс).

индуцируется сразу яе после добавления амилродамина; степень стимуляции дыхания на этой стадии относительно невелика, она прямо пропорционально зависит от концентрации добавленного АШг+, и не зависит от присутствия в среде инкубации ионов калия, кальция и неорганического фосфата.

Фактическим подтверждением наличия двух процессов в ускорении дыхания митохондрий от ань+ явились результаты ингибиторногс анализа (рис.З-Л). Так как ингибиторы транспорта рутениевыГ

Рис.3. Действие ингибиторов и модификаторов кальциевого транспорта на эффект АЮг (БцМ -а) на дыхание (А) и транспорт ис.:о-. Сг ^ (Б) в митохондриях (в среде инкубации 1С "Л К и БшМ Добавки :

01-олитомицин (1 .Б"- / 5 оелка), кн-рутениевый красны»- (О.бч.') С„аюе;.а>ин А (1(01.1)

красный, яотл (100цМ), циклоспорин А не предотвращали первой стадии эффекта стимуляции дцханкя при действии АЮг+, это говорит о том, что ионы кальция непосредственно не участвуют в процессе индукции линейной стадии дыхания гмилродамином. То, что первый процесс - линейная стимуляция дыхания не ингкбировалась олигоми-цином, оссв, л-этилмалеимидом (50ц.М), а также карбоксиатрактила-зидом (5Ср.Ч) и ионолом (5РаМ) - указывает на то, что этот процесс не связан ни с активностью АТФ-аяы, фосфатного переносчика или антипортера, ни с процессами перекисного окисления.

В дополнение к вышеизложенному вызывают интерес данные, касающиеся индукции ионами Са процесса, по ряда параметров сходного с первой фазой стимуляции дыхания, вызванной амилрода-мином (при отсутствии в среде инкубашш ионов калия и фосфата). В этих условиях ионы • кальция в концентрации 250 микромолей стимулировал? дыхание митохондрий без лаг-периода и его скорость в течение длительного времени не изменялась. Индукция дыхания при этом не подавлялась олигомлщипом и циклоспорином А, но полностью ингибировалась в присутствии еста или рутениевого красного. Это говорит в пользу того, что стимуляция дыхания в этом случае обеспечивается благодаря рециклизации ионов кальция и протона при совместном функционировании двух кальций-переносящих систем : электрогенного транспорта Са2+ в митохондрии через унипортер, и электронейтрального выхода' ионов кальция на Са2+/2Н+ обменнике; а т~кже протонной помпы, отрабатывающей падение Д<р при входе кальция в митохондрии.

В случае с амилродамином, • как отмечалось выше, система электрогенного транспорта ионов на линейной стадии дыхания существенно иная, чем при действии кальция, т.к. она не. подавляется последними двумя ингибиторами.. Вопрос о том, какая система осуществляет трансмембранный перенос протона в этом случае, оставался открытым. Вше было показано, что» транспорт Н+-иснов не сопряжен с транспортом таких ионов как К+ и Са2+. Он не сопряжен также и с транспортом анионов, т.к. стимуляция дыхания, митохондрий Аш+ наблюдается и в средах, не содержащих иных анионов, кроме сукцината. Дальнейшие опыты показали, что в этих условиях добавление АК1г+ к митохондриям приводило к падению их мембранного потенциала. В опытах на бислойной фосфоллпидной мембране были получены данные, показывающие увеличение проводи-

мости БЛМ для протона в присутствии л.чь.+ . Из' стих результатов было сделано прздполокениз. что линейная сткму'ляци" дыхания митохондрий амилродачином, вероятно, связана с его способностью к трансмембранному переносу протона, т.е. лш/ в микромолярных концентрациях выступает ,р качеству слабого рароОщптеля.

Второй - развивающийся во вромени процесс ускорения дыхания митохондрий, вызызашшй родамином. зависит от налитая в среде инкубации ионов кадия. фосфата и кальция. По результатам ингиби-торного анализа он, как оказалось, полностью идентичен ускорению дасания митохондрий, связанному с кальций-зависимым процессом индукции нэспецпфической ионной проницаемости, стимулируемой лопала! кальция ( рис.З-Б).

' II. ИЩШШ^ЛЖЛГО^

Проводимая параллельно с потреблением кислорода, регистрация транспорта ионов кальция и набухания показала, что добавле-1ше лкъ+ в присутствии ионов калия и неорганического фосфата вызывало выход ионов кальция из митохондрия, сопровождающееся сильным набуханием (рис.2-А,Б,В). Походя из кинетики регистрируемого выхода Са2+ было предположено наличие как минимум двух составляющих в этом процессе. В отсутствии К+ и Р1 выход ионов 0а~+, етимулнруомый ЛК)\+ имел иной вид фис-.'-Б). Действие ингибиторов и модификаторов транспорта ионов кальция в митохондриях на выход ионов Са2+ и процесс набухания, активируемые АВЬ. - оказалось сходным в том плане, что эти агенты полностью инги-бировали,развитие набухания и второй составляющей выхода Са2+ из митохондрий (рнс.З-Б). Сравнение полученных вкаэ результатов с действием 1шг::битороз на Са2+-индуцируемые выход ионов Са2+ и набухание митохондрий, позволило сделать вывод, что вторая составлявшая индукции кальциевого транспорта, а также набухание, вызванные ниэюмп концентрациями абл+ отражают процесс развития неспецпфическоЯ ионной прэыщаешсти мембран митохондрий, аналогичный активируемому высоки.« концентрациям! аснов кальция. Одной из отличительных черт развития этого процесса и дополни-тзльным гюдтверкде:п'.ем этого вывода является одновременность начала ускорягсегосл во времени Дыхания, массированный выброс коков кальция и высокоамплитудное набухание (рис.2-А,Б,В).

III. ШОТЕТИЧЬ'СКАЯМОДЕЛЬ_МШЩСМЛ

Синергизм з индукции этого процесса мо.:щу амилродамином и

Рис.4. Синергизм действия ионов кальция (20иШ и амнлро-дамина (5|оМ) в действии на дыхание (Л); транспорт Са (Б) и набуханиэ (В) имтохоадрвй в присутствии 10тМ ионов К и 5тМ Р1 в среде инкубации.

-■подругам проникают™ катионом - адамантилфосфонием (рис.5) служат дополнительным подтверждением этого предположения.

Рпс.5. Подавление пдаммгл'.л^осфокием (АО 15цМ) стинулиро-дамкой (аККт • ) дыхания (А); транспорта .-сальны (Б); и кабухажя (В) митоходд-. 1 в стеде присутствуют 10вА1 К и 5.т.М Р^>.

-нИз раОот, панее проводимых в группе Л.С.Ягужинского, известно, ~ что органические катионы' - адамантаны оказывают ингибиторное действие на дыхание и выход ионов кальция из митохондрий, активируемые высокими концентрациям! экзогенного Как видно из рисунков 5-А.Б.В, в присутствии в среде инкубации митохондрий ионов калия и фосфата адамантидфосфоний (А1>) (структурная форму- • ла приведена на рис.2-В) значительно ослаблял индукцию амилрода-мином процесса неспоцифическоЯ иошюй проницаемости. Феноменологически это тлеет вид развития данного процесса при действии более низкой концентрации лиг4, очень похоже, что здесь лэ действует как антагонист - конкурент ^¡лилродамина в реализации ?го эффекта; такие взаимоотношения мззду ионами имеют место только при их взаимодействии с рецептором. В качестве объяснения этого феномена предлагается следующее : исходя из того, что молекулы АО и - обе являются гидрофобными 'органическими катионами, то их конкурентные взаимоотношения можно отнести только за счет разницы ь химической структуре этих веществ (см.. рис.2-А и Б). Видимо, АИ1+ связывается с гидрофобной площадкой рецептора не только по заряду, но и благодаря структуречто необходимо для проховдения сигнала.

Сделав такое допущение, стало интересным углубить поиск в этом направлении, сузив его до выяснения структурной единицы этого агента, способной определять такие свойства. Были взяты синтетические вещества ароматического ряда (близкие по структуре к амилродамицу), то::е являющиеся проникающими катиона:,я, и такгв применяемые в цитологии в качестве красителей - это: Аурзмин О и Родамин 60. Сравнивая структуры этих вешеств (рис.2-А,В.Г) можно отметить следущее :

а), все они являются' аминами и имеют подв:;:шЛ! Н4" у молекулы азота,

б). Аурамин О (АО) - полярная молекула. Родамин еа и амнлродамин - гидрофобные соединения,

в).молекула Родамина 60 (Н60) более бифильна, чем молекула амилродамина.

В условиях отсутствия в среде инкубащя нсное калия фосфата - АМх+, АО и Р.бо, добавленные к ¡¿итохсндриям в конц-.н?-рации 10-5М, практически в равной степени приводили к .тающему ускорению дыхания митохондрий; процесс набухания в этск случае

Сил но выражен. В присутствуй! К+ г. Р1> при действии ЛИК*. вначале наблюдалось линейное ускорение дыхания митохондрий, которое затем ускорялось во времени (процесс индукции поры); от Кба -индукция поры была выракена слабее, а от АО - имела место только линейная стимуляция дыхания (рис.б-Л). Набухание в этих условиях

Рис.6. Влияние химической структура азотистых оснований ароматического ряда на характер стимуляции дыхания (Л) и набухания (.Б) митохондрии 1В среда IОтМ к и 5жМ Р1). Добавки: АНа' амилродамин 'ИфМ^; И60-

родамж (10цМ); АО- аурампн 0 (1ОцЫ).

наиболее интенсивно шло при действии АЮ1+, значительно слабее с-? иба, и слабо от АО (рис.6-Б). В присутствии кя и еста ускорение дыхания при действии этих красителей • тлело только линейшй характер, - ингибировалось.- Исходя из структурных

различий ак$»+, ко:;, АО и их действия на митохондрии оказалось возможным заключить, что молекулы, обладающие большей гидрофоб-кость» (ань+ и .чье), сильнее индуцируют процесс Са"+-зависимого разобщения митохондрий (пору): АО - более полярный агент -практически не оказывал влияния на развитие неспецифяческой проницаемости митохондрий, но ¡сколько сильнее, чем АНЬ.+ и К6С активировал процесс линейной сг . щ." дыхания.

Все эти данные не только подтверждали то. что .¡шейная стимуляция дыхания митохондрий и индукция неспецифической проницаемости при действии АНЬ* являются- самостоятельными, не зависящем друг от друга процессами, но, что на наш взгляд еще .более важно - это получены посылки на существование в мембране митохондрий специального рецептора неспецифической ионной проницаемости, активируемого гидрофобными полиаромзтическимл аминами,. имеющими подвихныя Н+.

IV. СТИМУЛЯЦИЯ СА2*/2Н* ОБМЕНА ПРИ ДЕЙСТВИЕМ ARh+

Как видно из рисунка 2-Б, в отсутствие в среде инкубации митохондрий ионов калия и неорганического фосфата, сразу же, после добавления ARh*" наблюдается выход ионов кальция из митохондрий. Кинетика этого процесса отличается от таковой в присутствии в среде Кт и Р.., но практически повторяет ее при действии в этих ' условиях ингибиторов кальциевых транспортных систем -рутениевого красного и циклоспорина А (рис.З-Б).

Как было показано Роттенбергом, в мембране митохондрий существует индуцируемый внешним кальцием, ма-независимкй. электронейтральный Са^/гН* обмен, активность ' которого зависит от ДрН.

Предположив, что СА и лн нечувствительный выход ионов кальция из митохондрий, стимулирований ARh+ связан с Са'"+/2Н4' обменом, были проведены исследования для проверки это." гипотезы. В присутствии в среде инкуб-лгии I0~~!.î и отсутствии ионов фосфата, после стимуляции амилродампком Са2+/2Н+ обмена добавление валиломицина, который при- наличии в среде ионов К+ увеличивает АрН. на митохондриальной мембране, привело к увеличении скорости выхода ионов кальция; добавление нигерииша, убираккго АрН в этих условиях, наоборот, обращало эФ1йкт ARh* (рис.7). Внесение к митохондриям валинсмплзша и н:1герпцина Ces ARh+ никак но влияло на пассивный выход ионов Са2+из митохондрий; То есть, тот градиент рН, который создался благодаря вал^ом/лжу - не активировал Са2+/2Н+ обчзнюас, но ьст на его активность после действия AKh+. Отработка ко АрН. возшащего к такой ситуации, вероятно, осуществлялось благодаря к+/Н* обменнику, активируемому при заяелачивании матрикса митохондо;й. Б ирпсутствк! ь сродо инкубации ?i скорость Еыхода ионов Са при действии АГ-К4" гамед-

- Го-

дилась, так как это приводило к уменьшению ДрН (рис.7). Катио! адамантмлфосфоний не оказывал никакого действия на Са2+/2Н'1 обмен. Из этих фактов мы заключили, что катион Ай1+ активируе'

не процесс Са2+/2Н+ обмена, регулируемый АрН, а сам Са2+/ обмекник в митохондриях.

Здесь интересно также рассмотреть феномен увеличения с рости Еыхода ионов кальция на Са2+/2Н+ обменнике под дейстЕ

АМг+ в присутствии в среде инкубации ионов калия и магния (рис.8). Однако, необходимо отметить, что добавление к митохонд-

Рис.8. Активация Са2/"Н обменжша. индуцированного ляь . (5^,1), ионами магния (Ма~ 2шМ) в присутствии 10.г».! ионов калия и отсутствии Р1. Добавки: СА- циклоспорин А (1рМ). ШЬ рутениевый красный (О.БцМ).

риям после СА и йй не вызывало дополнительней стимуляции выхода ионов Са2+ от. АМ1+. Это говорит, во-первых, о том, что вероятнее всего ионы поступают в митохондрии через электрогенный кальциевый канал (известно о способности ун.гпортйрг,' пропускать другие двухвалентные катионы : 5г2+, мп2+ и Вг^') и, во-вторых, то, что этот его ускоряющий эффект реализуется только' при действии магния с внутренней стороны мембраны. Из известгшх его действий с матриксной стороны митохондрий можно выделить ингибированиэ К+/Н+ обмённика, активируемого ЛрН. Видимо, поступление ионов магния в митохондрии приводит к сдвигу Лр|{ (за счет отработки Н+-помпой сброса Дер) и ингибированию К*7Н+ оОмл!-

1шка: создавшийся градиент рН снимается 6 эчгам случае Только после активирования Са2+/2Н* обмешшка амил^одаУлййо^ 'три этом его активность оказывается очень высокой).

Ш_Ь1'0_ЛКТИВАЦЩ_ЛЛЗКР0М

Проведение вышеизложенных исследований с цель») выяснезшя возможного поражающего действия родаминов на пластические клетки касалось только одного аспекта, а именно - "темнового" процесса уничтожения опухолевых клеток, который сводится, по нашему мнению, к поражению энергетики этих клеток через разобщение митохондрий и витекаювши из этого последствиями (например индукция неспецифической ионной проницаеиости меморан митохондрий).

Другой - "световой" процесс ликвидации новообразований при помощи родаминовых красителей, как фотосенсибилизаторов, в настоящее время используется в фотохемиотерагош. Для этого мы решили выяснить, как изменяется энергетика митохондрий клетки при действии флуоресцентных катионов в сочетании с лазерным облучением. Митохондрии облучали лучом аргонового лазера ' с длиной волны 4Ш и 514 пш в постоянном режиме; инфракрасная область спектра отсекалась при помощи специального фильтра, опыты ставились в присутствии циклоспорина А и рутениевого красного, и отсутствии в среде инкубации ионов К+ и Р^, т.е. когда от добавки рода!,ища реализуется только процесс линейной стимуляции дыхания. В контрольных пробах при облучении суспензии митохондрий без добавления анп+ не происходило никакого изменения в потреблении ими кислорода. Облучение митохондрий после того5 /как амилродамнн вызывал процесс линейного ускорения дыха-]шя ""Ходило к еще большему его ускорению; при прекращении облучения, скорость потребления кислорода митохондриями уменьшалась (рис.9).

С увеличением мощности лазерного излучения (при действии одинаковых концентраций АЛЬ+) отмечалось и усиление в 5-6 раз ускоренного ймилродампном дыхания; однако, оказалось, что при ?тсм происходил разогрев среды инкубации митохондрий. В режиме облучения митохондрий, прп котором температура среда оставалась постоянной, наблюдалось только 2-х кратное усиление лазером

1\<к*м

Рис.9. Стимуляция дыхакмя митохонрий, активированного АИЬ (3.5рМ) при действии лазерного излучения (в среде инкубации отсутствуют иош калия и фосфата). Добавки: СА- циклоспорин А (1цМ). ПК- рутениевый красный (0.5(11,1). ь- начало облучения, м- прекраце-ние облучения. (И-Ц0Н0Л 50цМ).

родамин-стимулируемого дыхания. Было предположено, что этот эффект обусловлен образова /лем под действием лазера возбужденной, а следовательно и высокореакционной молекулы ашлродамкна (по аналогии с гематопорфирином), зато екающей процессы перекис-ного окисления, которые в свою очередь приводят к поврезщениы мембран митохондрий. Однако, ловушка свободных радикалов ионол -не оказал ингйбирувдего действия на это? усиливаемый лазером процесс. Также не оказали действия и ингибитор АТР-азы - олиго-мицдн, и комплексон ионов кальция - еста.

Другие возмогшие механизмы сочетанного действия лкь+ и лазерного излучения на потребление кислорода митохондриями могут быть связаны с локальным "прожиганием" митохондриальной мембраны' лазерным лучом в местах, где встроены молекулы айп+, либо связаны с усилением протонофорной функции амилродамина, а следовательно и разобщения митохондрий, вызванной возбуждением молекулы а№+. На наш взгляд, наиболее вероятным представляется второй вариант.

-iS-

выводы

В результате проделанной работа мы пришли к следующим выводам:

1. Амиловый эфир незамещенного родамина в очень низких концентрациях проявляет себя как классический разобщитель -переносчик протона, оказывая слабое разобщающее действие на митохондрии печени крыс, - снижает потенциал на мембране интакт-ных митохондрий.

2. Получены доводы в пользу того, что индукция амилродами-ном неспецифической ионной проницаемости мембран митохондрий обусловлена его взаимодействием со специфическим мембранным рецептором.

3. АН11 активирует митохондриальный обменник, регулируемый ДрН.

4. Сочотанное действие лазерного излучения и родаминового красителя приводит к усилению его протонофорной функции, и как следствие к усилению разобщающего действия на митохондрии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТШЕ ДИССЕРТАЦИИ

Boris Р, Krasnikov, Avad S. Avad, Dmitry В. Zoiov, Lev 3. Yaguzhinaky// Elfeota of Amyl Eater of Urvsubtituted Rhodeuaiiio on reap ira t ion and Ca transport in rat liver mitoohondria. BBRO, 1991, Vol.175. P.1010-1016.