Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Синтез и исследование микрочастичных силикагелей для обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии природных соединений

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Синтез и исследование микрочастичных силикагелей для обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии природных соединений"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ МОЛНШЯРНОЯ БИОЛОГИИ

На правах рукописи

УДК 577.113.6.088.3:543.544.42

УМЕРОВА Хайрия Фахриевна

СИНТЕЗ И ЖСЛВДОВАНИЕ МИКРОЧАСТЙЧНЫХ СИЛИКАГЕЛЕЙ

ДЛЯ 0БРАЩЕНН0-ФА30В0Й ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ ПРИРОДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ

Специальность 03.00.03 - иолекулярная биологии

- Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1988

Работа вшолнена на кафедре аналитической химии Самаркандского государственного университета им. Алишерэ Навои

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор Шмаков Ю.И. кандидат химических наук Гнучев Н.В.

Официальные оппоненты: член-корреспондент АН СССР Грачев М.А. доктор химических наук, профессор Даванков В.А.

Ведущая организация - Всесоюзньй научно-исследовательский институт биотехнологии Ыишедб копром а СССР

Защита состоится «¿Ь» IS68 г а /У часов

на заседании специализированного совета Д 002.79.01 при Институте молекулярной биологии АН СССР 'по адресу: II7984, Москва, В-334, ул. Вавилова, 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии АН СССР.

Автореферат разослан

Ученьй секретарь специализированного совета кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

. Актуальность работы. Одной из существенных задач при решении 'современных проблем аналитической химии, биотехнологии, медицины, фармацевтической промышленности, контроля окружающей среды является обеспечение надежного контроля состава различных объектов. Среди лабораторных методов очистки, фракционирования, выделения и анализа этих объектов центральное место занимает совокупность различных хроматографических методов. Наиболее перспективным направлением для решения вышеназванных задач является высокоэффективная жидкостная хроматография. По прогнозам на конец XX столетия среди инструментальных методов анализа хроматографические выйдут на первое место. На них будет приходиться до 40 % и более аналитических определений, тогда как сегодня эта доля приходится на спектроскопические методы. Уже сегодня мировой рынок производит жидкостных и газовых хроматографов вместе с принадлежностями и сорбентами на сумму около I млрд. долларов. Это объясняется исключительной универсальностью методов хроматографии, которые применимы к анализу практически любых растворимых веществ. При этом жидкостная хроматография, применима к 80-85 % от известных соединений, тогда как газовая хроматография - лишь к 15-20 %, поскольку необходимость перевода в паровую фазу ограничивает диапазон анализируемых веществ.

Из жидкостно-хроматографических методов в последние 10 лет наибольшее распространение получила высокоэффективная обращенно-фазо-вая хроматография на гидрофобных микрочастичных силикагелях. Этим методом в последние годы решается до 90 % определений, выполняемых на жидкостных хроматографах. Области применения обращенно-фазовой жидкостной хроматографии (00 ЕХ) исключительно многообразны: аминокислотный и углеводный анализ, разделение ферментов и пептидов и ряда других биологических объектов. В то же время OS КХ - метод весьма сложный не только в приборном отношении, но и требует больших усилий по созданию аналитических приемов и методик. До сих пор не решены вопросы как разработки и исследования чисто аналитических проблем разделения методами ОФ ЖХ, так и задачи создания современных высококачественных сорбентов для этого эффективного и универсального метода.

Цель работы. Исследование путей синтеза мелкодисперсных гидрофобных силикагелей для ОФ SX с длинноцепочечнымя привитыми по поверхности алкильными группами и возможностей применения их для разделения некоторых классов природных соединений.

Для реализации поставленной цели были намечены следующие задачи:

- разработать методы выбора и подготовки мелкодисперсных силика-гелай правильной (сферической) и неправильной формы размером частиц

5 и 10 ыкм, пригодных для использования как таковых в пряыофазовой ЕХ и для получения из них привитых силикагелей;

- исследовать методы получения высших (С^д, Сд) 1-октадецил-хлорсиланов и их прививки к поверхностным силанольным группам сили-кагеля, обеспечивающие высокую степень покрытия поверхности и прочность прививки;

- исследовать свойства полученных привитых Сд- и С^-силикаге-лей для ОФ ЕХ в сравнении с новейшими сорбентами того же типа и показать возможность применения их для аналитических разделений некоторых природных соединений, в том числе олигонуклеотидов, белков, аминокислот, гидролизатов полипептидов и ряда других объектов;

- установить возможности и пределы применения разработанных сорбентов и дать практические рекомендации для их аналитического использования.

Научная новизна. Развиты методы получения серии микрочастичных, в той числе ыикросферических привитых силикагелей - С^д и -С^ для высокоэффективной колоночной обращенно-фазовой жидкостной хроматографии, исследованы их гранулометрия, удельные поверхности, степень прививки и другие характерно гики.

Впервые показано, что в строго контролируемых условиях высшие алкилтрихлорсиланы и алкилдихлорсиланы прививаются по поверхности силикагеля без заметного образования полимерной фазы и получаемые силикагели-С^д для обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭКХ) не уступает более сложно получаемым сорбентам, для иодификации поверхности которых применяется алкилмонохлор-силан. Известно, что силикагели-С-^д, получаеиые с ионохлорсиланами до сих пор считаются наилучшими из-еа того, что теоретически в этом случае полностью исключена полимеризация на поверхности примененного моьохлорсилана. Нами установлено, что этот постулат экспериментально не подтверждается, тогда как прививка С-^д-монохлорсилана протекает менее активно, чем в случав С^д-дихлор- и С^д-трихлорси-ланов и нередко приводит к низкой степени прививки.

Разработаны методы "эндкепинга", т.е. окончательного блокирования силанольных групп, не вступивших в реакцию на стадии алхил-ли _

хлорсилирования. Выполнено сопоставительное изучение хроматографи-ческих характеристик разработанных в данном исследовании привитых пористых шосросферических силикагелей-С18 и-Сд (ПМСС-С18 и ПМСС-Сд),

а также пористых иикрочастичных силлкагелей-С^д и -Сд неправильной формы (ШЧС-С18) и лучших зарубежных аналогов: -Зорбакс-ОДС (Дюпон, США), Нуклеосил-С18 (Махерей-Нагель, ФРГ), Силасорб-С18(ЧССР). Установлено, что привитые силикагеля ПМСС-С^д и ПМЧС-С^д не уступают по степени прививки, емкостному фактору к'и гидролитической стабильности названный и другим зарубежным образцам. Полученные сорбенты успешно применены для аналитических разделений в режиме ОФ ВЭ2Х смеси дансилпроизводних аминокислот, смесей, содержащих модифицированные нуклеозиды, искусственных смесей-белков, смесей рацемических аминокислот. ШСС-С|д применены для контроля новокаина на всех стадиях его производства.

Практическая ценность. На основании полученных результатов осуществлен выпуск нескольких партий привитых силикагелей ШСС-С-^д и ПМСС-Сд в количестве 900 г, достаточных для заполнения 300-350 аналитических колонок, или 3-3,5 тысяч микроколонок. Рекомендовано использовать разработанную технологию синтеза микросферических силика-гелей-С^д с диаметром чэстнц 5 или 10 акм для изготовления крупных партий сорбента для использования на предприятиях биотехнологического профиля. Экономический эффект от использования ПМСС-С^ только вследствие освобождения от импорта составит до 35 тыс.руолей за I кг.

Апробация работы. Материалы по теме диссертации были предметом сообщения на I Всесоюзной конференции "Хроматография в биологии и медицине" (Москва, 1983), на Всесоюзном симпозиуме "Охрана окружающей среды в химической, нефтехимической промыаленностях.и промышленности по производству минеральных удобрений" (Самарканд, 1983), на Ш Всесоюзном симпозиуме по молекулярной жидкостной хроматографии (Рига, 1984), на Всесоюзном совещании "Применение хроматографии в химической и нефтехимической промышленности" (Пермь, 1985), на Международном зимпозиуме "Хроматография в биологии и медицине" (Москва, 1986).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Объем работы. Диссертационная работа объемом 154 страниц состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, списка литературы из 129 наименований и приложения, содержит 7 таблиц, 44 рисунка.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ОФ ВЗЖХ) позволяет производить разделение и анализ до 90 % от наи-

более часто разделяемых объектов типа нелетучих и лабильных особо сложных смесей природного происхождения: аминокислоты или их производные, белки, олигопептиды и др.

Для большей части разделений в режиме ОФ ЕХ до сих пор используются преимущественно привитые шгкрочастичные силикагели диаметром 3-10 мкм правильной сферической формы или неправильной формы ("дробленый" силикагель), содержащие химически связанные длинноцепочечные алкилсилильные групш (обычно С^-д, реже — Сд).

В литературных данных отсутствует прямое экспериментальное подтверждение преимуществ сферических частиц по сравнению с частицами неправильной формы, хотя в целом, в последние года чаще применяют сферические силикагели с диаметром отдельных частицЗ, 5 или 10 ыки (используют и частицы других размеров).

В выполненной работе для прививки использовались силикагели с частицами диаметром 3-5, 5-7 и 8-10 мкм как неправильной формы КСК-2 (СССР), Силасорб (ЧССР), так и иикросферичесхио силикагели Зорбакс ("Дюпон", США) и ПМСС - пористый никросферический силикагель, полученный нами известными способами из тетраэтоксисилана через полиэтоксиои локсаны по Колыгогтеру и Унгеру:

'*н20 °С2Н5 +Н20

п(С2Н50)^31 -- (C2H50)3Si -(O-Si-->^oi(OC2H5);

HCI 1

xSi02.yH20 (ШСС)

HCI ôc2H.

Силикагель KCK-2 зернением 8—Юмкм был получен дроблением сферического силикагеля Салаватского завода на твердосплавном дезинтеграторе (ГДР), классифицирован на классификаторе " Alpine" (ФРГ), освобожден от субмикроюшх частиц седиментацией в воде после обработки ультразвуком и обработан обычным способом концентрированной соляной кислотой для удаления следов железа. Известно, что следа железа (из дезинтегратора или металлической шаровой мельницы) делают силикагель непригодным для работы с пептидами и многими другими классами биологически активных веществ.

Силикагели Силасорб и Зорбакс использовались для прививки без какой-либо дополнительной обработки.

Свежеприготовленный силикагель ШСС после высушивания сепарировался на классификаторе " Alpine " с отбором фракций меньше 3 мкм, 3-6, 5-â, 8-12 мкм и вше, затем каждая фракция освобождалась от

субмикронных частиц и дополнительно сужалась по степени разброса диаметра сферических частиц на препаративных центрифугах после сус-пендирования каждой отдельной фракции в дистиллированной воде и обработки ультразвуком. В синтезах использовали сорбент с диаметром сфер 3-5, 5-7 и 8-10 ыкм.

На основании данных, полученных методом эксклюзионной жидкостной хроматографии полистиролышх стандартов, было установлено, что метод Колышоттера и Унгера позволяет получить достаточно универсальные силикагели со средним диаметром пор 60-100 А (6-10 нм) и удельной поверхностью 300-150 м2/г (удельная поверхность была определена методом газовой хроматографии, табл.1). При использовании допол-нительнойпразработки" пор из этих силикагелей были получены сорбенты со средним диаметром пор более 20 ни.

Таблица I

Удельные поверхности исходных и привитых силикагелей

пп Сорбент Удельная поверхность, Диаметр частиц,

и2/г мки

1. ПМСС 270 3-5

2. ПМСС 300 5-7

3. ПМСС 204 8-10

4. КСК-2 216 8-10

5. Зорбакс 270 8

6. ШСС-С18 190 5-7

7. ПМСС-С18 150 - 5-7

8. ПМСС-С18 170 5-7

9. ПМСС-С18 156 5-7

10. ПМСС-С^д 134 8-10

11. ПМСС-С18 130 8-Ю

12. Зорбакс-С18 165 8

Силикагели, изученные в данной работе, после соответствующей прививки пригодны для разделения как низкомолекулярных продуктов (аминокислоты или их производные), так и с молекулярной массой до 15-20 тыс., а в отдельных случаях - до 0,5 млн.Дальтон, в ток числе белков и полипептядов. Для успешного разделения последних вачсно отсутствие большого числа мелких пор из-за необратимой сорбции именно в мелких порах.

Выполненная нами работа имела целью разработку методов синтеза

алхилсилилированных силикагелей для 00 ЖХ, исходя из названных выше непривитых силикагелей. Целью данного раздела исследования было установить влияние на качество и полноту прививки строения 1-октадецилхлорсилана, а также разработать надежные к простые методы "эндкепинга", т.е. максимальной защити остаточных силаноль-ных групп низкомолекулярной триметилсилильной группой.

При исследовании методов получения мелкодисперсных силика-гелей с химически связанными по поверхностным скланолаи 1-окта-децилсилильныш* или 1-октилсилильными группами в качестве алкил-силилирущих реагентов применены соответствующие алкилтрихлорси-ланы, алкилметилдэтхлорстаны и алкилдиметихлорскланы. Синтез ряда из них был осуществлен реакцией гидросилилирования по схеме:

(СН,С0)о0

сн5<ск2)1бсн2он —^—сн3(сн2)16сн2ооссн3

480-500° катализатор

-- СН3-('СН2)15-СН=СН2

■ сн,

СН5(СН2)16СН231-С1

сн

3

сн3(сн2)16сн231 — 01

I-Октадецилтрихлорсилан использовался готовый.

Особенностью разработанных приемов получения привитых сили-кагелей-С|д и -Сд является проведение реакций прививки без каких-либо дегидрохлорирущих реагентов типа пиридина или других оснований, причем достигается высокая степень покрытия поверхности силнкагелевой матрицы алькилышми группами. Характерно, что наименее активно эта твердофазная реакция идет с алкилметилмонохлор-силанами С^д и Сд.

Оценка степени прививки была выполнена нами независимыми методами, в том числе элементным анализом содержания углерода и относительным удерживанием ближайших гомологов (на примере смеси толуола и п-ксялола) в условиях ОФ ВЗКХ (элюент - смесь воды и метанола). Эти два критерия достаточны в случае прививки 1-окта-децилдашетилхлорсилана или 1-октилдиметилхлорсилана, т.е. в тех случаях, когда заведомо исключается возможность образования поли-

парной фазы. За счет изменения условий синтеза (в основном варьируя избыток алкилхлорсилана) в данной работе были получены силлка-гели-С^д с различным содержанием октадецильных остатков на поверхности (остальное - триметилсилильные группы). Снижение концентрация С^д—групп приводит к уменьшению удерживания (меньшие значения к'),-что желательно при разделении, в частности, белков гидрофобного характера (табл.2, рис.1-4, II).

Таблица 2

Сравнительные характеристики силикагелеа-С^д

ш Сорбент к' С, % Алкилхлор-силан Диаметр чаотиц,мкм

I. шсс-с18 1,69 10,12 монохлор 5-7

2. пмсс-с18 3,26 18,63 трихлор 5-7

3. пмсс-с18 1,5 9,20 дихлор 3-5

4. КСК-2-С2д 3,05 14,50 монохлор 8-10

5. шсс-с18 3,00 16,70 монохлор 5-7

6. пмсс-с18 1,93 11,49 монохлор 5-7

7. пмсс-с18 2,30 13,29 монохлор 8-10

8. ШСС-С18 3,00 20,86 трихлор 8-10

При получении гидрофобных силикагелей с пониженной концентрацией С^д-групп при "эндкепинге" существенно возрастает концентрация триметилсилильных групп, что подтверждает наблкщающееся увеличение содержания углерода (например, 7,0 % С - до и 10,3 % С -после "эндкепинга").

. В работе развиты методы прививки 1-октадецилт рихлорснланоа и 1-октадецилметклдихлорсиланом в условиях, исключающих их полимеризацию на поверхности, с последующим мягким догидролизом непрореа-гировавших атомов хлора и: триметился.'илированием вновь образовавшихся силанольных групп, так называемый "экдкелннг".

При этом было найдено, что реакция прививки идет более активно, полученные сорбенты для ОФ КХ отличаются большим удерживанием и не дают затяжек пиков, свойственных для сорбентов с полимерными фазами. Характерно, что в строго контролируемых условиях прививки ионохлордаметил- и трихлороктадецилсиланы дают на одних и тех же образцах силикагеля одинаковые по основным характеристикам силика-

■

о 6 12 ТВ

БРВЙ УДЕРЖИВАНИЯ, (ПК.

Рис.1. Хроматограмма разделения тест-смеси

" Колонка: ПМСС-С18, 5-7 мкм, 4,6x125 мм; элюент: метанол.-врда »» 70:30 (по объему), скорость потока 0,5 м^ин, УФ-детектор (254 нм) N » 6500 т.т. к' - 3,0

I - толуол 2 - п-ксилол

вгааддаодш. кн.

Рис.2. Хроматограмма разделения тест-смеси

Колонка: Зорбакс-С18, 8 ики, 4,6x125 ми. Условия разделения см.на рис.1 и - 6350 т.т. V « 4.0

I - толуол 2 - п-ксилол

в

г

0 3 в 9 12 15 18

ЕРВЯ УДаТИМНИЯ, МЖ.

Рис.3. Хроматограмма разделения тест-смеси

Колонка: КСК-2-С18, 8-10 мкм; 4,6x125 мм. Условия разделения см.на рис.1' N - 4400 т.т. „ 3,0

I-толуол 2 - п-ксилол

врвн удгтавлния, мж.

Рис.4. Хроматограмма разделения тест-смеси

Колонка: Силасорб 300-С18, 10 ккы; 4,6x125 им Условия разделения см. на рис.1 N » 3100 т.т. к' » 3,7

' I'- толуол 2 - П-КСИЛОЛ

гели-Cjg (ШСО-Cjg).

"Эндкепинг"-протекает по следующей схеме:

он

- O-Si-0 R, i \ i1 0 Si + 2 CHj Cl-Si-CH, 1 J ' CH3

1 X 1 o-si-cr R2 сн3

он 3 i 3 0

г o-Hxb > 0 Si S 1 /> 5- o-si-o r2 + 2HCI

i

О

H,C-Si-CH 3 I

После исчерпывающе проведенного "эндкепинга" достигается исключение из механизма разделения непрореагировавшх силанольных групп на поверхности скликагелей-Cjg. Эти силанолькые группы могут, являясь достаточно кислыми центрами, участвовать в ЖХ-разде-лении по ионному механизму, что часто делает невозможный разделение смесей полярных соединений, в том числе пептидов, белков вследствие необратимой сорбции, и затрудяет интерпретацию механизма разделения. Кроме того, из-за оставшихся незакрытыми силанольных групп, силикателевая матрица становится менее устойчивой при значениях рН, пограничных для хроматографирования на привитых си-ликагелях (т.е. для рН ниже 4-4,5 и выше 8).

Матрица непривитых исходных микросферических силикагелей была изучена с использованием полистирольных стандартов методом экс-клюзионной жидкостной хроматографии.'Кроме того, было изучено несколько разделений методом прямофазовой ВЭНХ с целью убедиться в том, что полученные базовые силикагели соответствуют по основным характеристикам описанным аналогам и могут быть взяты для прививки к ним гидрофобных алкилсилильных остатков.

На колонке эффективностью 6500 т.т. (по нафталину) в диокса-не как элюенте было установлено, что предел эксклюзии для базового образца ПМСС составляет от 1000 до 100 000 Дальтон, т.е. он близок по своим свойствам к Лихросферу-si 100 со средним диаметром пор 10 ни. В то же время ПМСС обладает большим удельным объе-

иом пор по сравнению с Лихросфером-31 100 и существенно большей областью линейности. На ней была успешно'разделена искусственная смесь нафталина и полистиролов с молекулярной массой 3800, 9600, 20000, 36000, 49000 и 66500.

Силикагели с диаметром пор больше, чем 10 нм, были получены специальной обработкой базового силикагеля ПМСС (нами не изучались).

На колонке длиной 250 мм и внутренним диаметром 3,2 мм на непривитом ПМСС (диаметр частиц 8 мкм) в токе н-гексан:изо-пропанол (100:2 по объему) была полностью разделена сложная смесь, составленная из фенола и орто-заиещенных фенолов (метил-, этил-, изо-бутил-, вт.-бутил-, трет.-бутилфенол и др.).

В условиях прямофазовой ВЭЖХ на ПМСС были также успешно разделены низшие изомерные гомологи пиридина (смеси этил-, бутил- и фенилпиридинов). Эти разделения представляют собой непростую задачу, с трудом решаемую даже методом капиллярной газовой хроматографии. На колонках эффективностью всего 3-6 тыс.т.т., заполненных сорбентом ПМСС, с тем же элюентом (гексан и изо-пропанол в соотношении 100:2 по объему) удается полное разделение следующих искусственных смесей: (I) 2-трет.-, 3-н- и 4-н-бутилпиридина; (2) 2-, 3- и 4-этилпиридина, а также (3) 2-, 3- и 4-фенилпиридина. Характерно, что порядок выхода во всех случаях соответствует степени пространственных препятствий (первыми выходят стерически наиболее затрудненные 2-изомеры) и не связан с основностью разделяемых соединений.

Далее были исследованы свойства ШСС-С^д на различных сложных смесях органических соединений как синтетического, так и природного происхождения.

В качестве достаточно сложного примера низкомолекулярных веществ полярного характера были взяты такие лекарственные препараты как анестезин, новокаин, амидопирин, сульфомонометоксин и полупродукты при их производстве. Во всех случаях в сопоставимых условиях сорбент 1МСС-С18 по эффективности достигнутого разделения в условиях ОФ ВЭЖХ оказался заметно эффективнее Нуклеосила-С^д и Лихросорба-РП-18. В частности была показана эффективность применения ОФ ВЭ1Х на 1ШСС-С18.в аналитическом контроле производства новокаина на всех стадиях, в том числе при оценке качества готового продукта. Наибольший интерес представило сравнить разработанный нами микросферический сорбент для ОФ ВЭЖХ при разделениях биологически активных соединений природного происхождения.

Вполне успешно на ШСС-С18 (колонка эффективностью 4360 т.т., 4,6x125 мм)протекало полное разделение сиеси рацемических фенил-аланина и триптофана в элюенте метанол:вода (15:85 по объему) о добавкой ацетата меди и ь-пролина.

На микроколонке с ПМСС-С^д было достигнуто практически полное разделение сложной смеси аминокислот в виде их ДНС-производных (рис.5)

Рис.5. Хроматографическое разделение смеси ДНС-аминокислот. Колонка: HMCC-Cjg, 3-5 мки, 2x62 ми. элюент - градиент концентрации CHjCN (0-50 %) в 0,1 М трис-ТФУ, рН 7,2; скорость потока 100 цкл/мин, УФ-детектор (254 ни). Ш2— дне- HH2J di-1^3, .di-Tyr —'ДНС- 1уа(ДНС), ДНС- Туг(ДНС) соответственно. Трехбуквенный кодой обозначены ДНС-производные соответствующих аминокислот (.His, Его и т.д. - ДНС-гистидан, ДНС-пролин и т.д.).

Такая же колонка была применена для практического изучения продуктов кислотного гидролизатэ ДНС-брадикинина (рис.6).

Универсальные возможности сорбента ШСС-С^д видны из примеров применения их в ОФ ВЗКХ смесей, содержащих модифицированные нуклеозиды (рис.7). Они были применены также для подтверждения гомогенности одного из олигодезоксирибонуклеотидов (рис.8).

10

ITDA ДОПИШМ, ММ

U

о в 12 1е 24 эо эе

гтая тдгрмшяя, пня

Рис.6. Хроматографическое разделение кислотного гидро-

лизата ДНС-брадикинина. Колонка: ШСС-С^д, 5-7 мкы, 2x62. ми; элюент - градиент концентрации МеОН (0-80$) в 0,1 % ТФУ, скорость потока 50 мкл/кин, УФ-детектор (210, 330 ни).

Устойчивость к низким значениям рН (около 2) и отсутствие эффекта необратимой сорбции даже высокомолекулярных белков на тщательно "эндкепированном" ШСС-С^-д позволили выполнить разделение искусственных смесей как низкомолекулярных полипептидов (брадшш-нин), так й высокомолекулярных белков (вплоть до ферритина).

Разделение "с больший запасом" смеси инсулина, цитохрома С и альбумина бычьей сыворотки приведено на рис.9, а более сложной смеси брадикинина, РНКазы, инсулина быка, цитохрома С, альбумина бычьей сыворотки, миоглобина, химотрипсиногена и ферритина - на рис.10.

Последняя хроматограииа говорит о достаточно сложном механиз-мразделения в условиях ОФ ВЗЮС белков, и судя по.тому, что ккзко-молекулярный брадшсинин выходит первым, а наиболее высокомолекулярный ферритин и химотрипсиноген - последними, можно считать, что эксклюзионные эффекты в данном разделении практически не проявляются. По-видимому, определяющим фактором является степень гидрофоб-ности белков в условиях ОФ ВЗЖХ.

,1А

:о 20 эо ! гдвшашия. пин.

-Рис.7. Анализ реакционной смеси, содержащей Рис.8

2-дезоксиурвдин, модифицированный витамином Н (заштрихован пик, соответствующий продукту) Колонка: ПМСС-С^д, 5-7 мкм, 4,6x250 мм; режим элюирования: А - 100 % В, 20 мин (буфер А: 0,1 Ы нн^ОАс; буфер В: ОДМ НН^ОАс в 50 % СНзСгО;35°, УФ детектор 290 нм, скорость потока I мл/мйн

,-----—у ч

Г"-В-25 Я

враи тр&хвшт, юш.

Анализ гомогенности олигодезоксирябонуклео-тида ассссАйТСАССАССТ). Колонка: ШСС-С^, 5-7 икм, 4,6x250 ии; реким элшрования: А - 50 % В, 30 иин (буфер А: 0,1 Ы Ш4оас! буфер В: 0,1 И нн^ОАс в 60 % МеОН);35°, УФ детектор 254 .ни, скорость потока I ил/иин

к

ЕРЕИЯ ударишния, »0«.

Рис.9. Хроыатограмма снеси инсулин, цитохроы С, альбумин бычьей сыворотки. Колонка: ПМСС-С^д, 3-5 мкм, 2x62 мм; элюент - градиент концентрации СН3СМ (20-65 %) в 0,1 % ТФУ, скорость потока 50 икл/иин, УФ-детектор (210, 280 нм) I - примесь, 2 - инсулин, 3 - цитохром'С, 4 - альбумин бычьей сыворотки.

Была также исследована возможность применения ШСС-С^д для разделения низкомолекулярных белков - гистонов, отличающихся основным характером.

Характерно, что на Нуклеосиле-С^ (сферическом) не удалось получить в тех же условиях удовлетворительного разделения гистонов, тогда как на у-Бондапаке-С^д (несферическом) также имело место хорошее разделение. Эти данные соответствуют наблюдениям Ренье и сотр. (1982 г.) о том, что из нескольких изучзнных ишшромышленно выпускаемых силикагелей после прививки на них алкилсилильных групп и "эндкепинга" для разделения смеси рибонуклеазы А, инсулина, цитохро-ма С, овальбумина оказался пригодным только Вайдек-Сд, но не макропористый Лихросфер-Сд. Наиболее вероятным, хотя и не единственно возможным объяснением этих особенностей применения силикагелей-С^д и-Сд может быть то, что матрица исходного сяликагеля, примененного для синтеза из него силикагеля-С^д или -Сд, не должна содержать заметного количества мелких пор, даже если исходный силикагель в среднем является макропористым.

ЕГО« /доходит, ал

Рис.Ю.Хроыатографичеекое разделение сложной

смеси белков. Колонка: ПМСС-С^д, 5-7 мкм, 2x60 мм, элюент: градиент р-р А - 0,1 % ТФ>, р-р В - 0,1 % ТФУ в изо-пропаноле (10-60 %)í скорость потока 50 мкл/штн 1 УФ-детектор (210, 280 нм) I - брадиюшга» 2 - РШаза, 3 - инсулин быка, 4 - цитохром С, 5 - В-цепь инсулина быка, альбумин лошади, альбумин быка, 6 -миоглобин, 7 - химотрипсикоген, ферритин.

О 4 8 12 16

а>ои дачишн®, ют.

Рис.II. Хроыатограииа разделения сиеси гистонов ' Колонка: ШСС-С^д, 3-5 ыкы, 2x62 им; элю-ент: градиент концентрации сн^сн (20-65$) в 0.1 % ТФУ, скорость потока 50 икл/иин, УФ-детектор (210,280 ни) I'- гистон Н1, 2 - гистон Н5, 3 - гистон Н2В, 4 - гистон Н4, 5 - гистон Н2А, 6 -прииесь.

Полное разделение гистонов на 5 фракций из эритроцитов цыпленка было получено на колонке (2x67 мм), заполненной ПМСС-С^д, в линейной градиенте ацетонитрида (¡¿0-55 %). Хроиатограмиа данного разделения представлена' на рис.11.

ВЫВОДЫ

1. Развиты методы получения мелкодисперсных силикагелей, в том числе микросферических частиц 3-5, 5-7, 8-10 мкц с привитыми фазами

и Сд для высокоэффективной обращенно-фазовой жидкостной хроматографии смесей органических соединений.

2. Исследованы методы получения силикагелей с химически связанными по поверхностным силанолам октвдецилсилилышыи или октил-ишшльными группами:

а) в качестве алкилсилилярувдих реагентов применены алкилтря-хлорсиланы, алкилметилдихлорсиланн и алкилдиаетилхлорсилани, синтез которых осуществлен реакцией гидросилилирования соответствующих алкенов;

б) разработаны приемы получения привитых силикагелей-С^-д и -Сд действием названных алкилхлорслланов в отсутствие дегидрохло-рирующих реагентов;

в) найдено, что наименее активно реакция прививки идет с ионо-хлорсиланами С^д и Сд.

3. Оценка степени прививки выполнена независимыми нетодами: элементным анализом содержания углерода и относительным удерживанием толуола и п-ксилола (элюент - смесь вода и метанола) при ОФ ВЭ1Х. .

4. Показано, что в строго контролируемых условиях прививки ионохлордиметил-, дахлорметил- и трихлороктадецилсиланы дают на одних и тех же образцах силикагеля практически одинаковые по основным характеристикам ПМСС-С^.

5. Показана возможность использования колонок с ПМСС-С^д для успешного разделения в условиях ВЭЖХ различных сложных смесей органических соединений, в том числе:

а) для разделения и количественного анализа в производстве анестезина, новокаина и других синтетических лекарственных препаратов;

б) при разделении на антиподы смеси рацемических фенилаланина и триптофана (лигандообменная ВЭЮО;

1Т

в) для полного разделения ДНС-производных аминокислот, в той Числе в гидролизатах пептидов;

г) при анализах олигонуклеотидов;

д) для разделения смесей олигопептидов, пептидов и рада-белков.

S. Во всех случаях характер разделения (последовательность выхода компонентов проб, относительные времена удерживания и др.) соответствовали обычно наблюдаемому на хорошо изученных силикаге-лях-Cjg типа Зорбакса-ОДС, Нуклеосила-Cjg и др.

Основное содержание диссертации изложено в работах:

1. Чумаков Ю.И., Ажаев A.B., Гнучев Н.В., Стыскин Е.Л., Уме-рова Х.Ф. иинтез и исследование иикросферическях силикагелей для обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии природных соединений // Биоорган.химия. - 1986. - Т.12. - № 12.

- С.1682-1684.

2. Кабулов Б.Д., Заляяяева C.B., Ермольев А.П., Умерова Х.Ф., Афанасьева Н.Э. Анализ углеводородных соединений методами жид-' костной хроматографии // Тез.докладов Всесоюзного симпозиума "Охрана окружающей среды в химической, нефтехимической промыиленнос-тях и промышленности по производству минеральных удобрений". -Самарканд, 1983. - C.I34-I35.

3. Чумаков Ю.И., Умерова Х.Ф., Куликов А.И., Михайлов Н.И. Синтез и применение микросферических силикагелей различной пористости для обращенно-фазовой и эксклюзионной ЖХ // Тез. докладов

I Всесоюзной конференции "Хроматография в биологии и медицине".

- Москва, 1983. - С.294.

4. Умерова Х.Ф., Кабулов Б.Д., Камалова Т.А., Стыскин Е.Л., Чумаков Ю.И. Стерические эффекты в высокоэффективной SX // Тез. докладов I Всесоюзной конференции "Хроматография в биологии и медицине". - Москва, 1983. - С.17-18.

5. Умерова Х.Ф., Стыскин Е.Л., Чумаков Ю.И. Синтез и исследование привитых (Cjg) микросферическкх силикагелей для высокоэффективной жидкостной хроматографии природных соединений // Тез. докладов Ш Всесоюзного симпозиума по молекулярной жидкостной хроматографии. - Рига, 1984. - С.136-137.

6. Куклина М.А., Куклин В.М., Умерова Х.Ф., Чумаков Ю.И., Клименко В.Г. Разработка и применение метода'микроколоночной хроматографии для количественного анализа анестезина и полупро-

дуктов его производства на сорбенте miCC-Cjg // Тез. докладов Всесоюзного совещания "Применение хроматографии в химической и нефтехимической промышленности''. - Пермь, 1985. - С.59-60.

7. Уморова Х.Ф., Грачев С.А., Кабулов Е.Д., Чумаков Ю.И. Исследование возможностей применения сорбента ШСС-С^д в высокоэффективной жидкостной хроматографии пептидов и белков // Тез. докладов Международного симпозиума "Хроматография в биологии и медицине". - Москва, 1986. - С.195-196.

Т-02298 от 22.02.88 Формат 60x84 1/16 Объем 1,23 Заказ 1077 Тираж 100

Полиграфическое объединение 'Печатник' УЬравиздата Мосгорисполкома

ул. Н.-Краснохолмская, д.5