Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Высокоэффективная жидкостная хроматография порфимидиновых оснований и нуклеозидов и их синтетических аналогов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Высокоэффективная жидкостная хроматография порфимидиновых оснований и нуклеозидов и их синтетических аналогов"

ордена ленина и ордена дружбы народов АКАДЕМИЯ НАУК украинской oop

шлйгн еолжйлйой шт. и mm вода им. а. а думашкого

йа правах рукописи ШИШЯА Ирина Павловка

Ш 643. 544

шхжоэмшинная жидкостная хрошограсо няшщгаюшх •

ОСНОВАНИЯ И НУКЛЗОЭЙДОВ И ЮС СИНТЕТИЧЕСКИХ АИШОГОВ

03?. 00.02 -апашггнчвоквч химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени канидидата химических раук

Киев -1990

Работа выполнена в отделе тонкого ор£ааичзского синтеза Института бвоорганнческой химии в нефгехртши АН УССР

Щучкца руководители - академик АН УССР, доктор химических наук, профессор Пилиценко А. Т. - кандидат хшшеских наук, старший научный сотрудник Галушка С.Е

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Ц. и. Тананайко кандидат химических наук, старший научный сотрудник О. С. Эульфигаров

Ведущая органиаациа: Институт алешнтоорганичэсюа соединений им. А. К. Кйсмеянсва АН СССР

Защита состоится "2Л " ноября 1990 г- в часов

на заседании специадаироганнаго Совета Д 016.65.01 при Институте коллоидной химии и хиш1 году им, А. В. Душнокого ¿Н УССР.

Адрес: 252630, Киев, ГСП, просп. Вернадского, 42.

С диссэртацией ыокно ознараетьоя в библиотеке Института коллоидной химии и теш ¿оды ш. Л. Е Душнского АН УССР. Автореферат разослан "Хсктября 1900 г. Ученый секретарь специализированного Совета, доктор химических наук, профессор ^ а В Третинник

Г13'

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность. Многие синтетические аналоги компонентов нуклеиновых кислот - пиримидиновые и пуриновые основания и нуклеозиды сбладапт-высокой биологической активностью. Соединения этого класса проявляют противораковую, противовирусную и имунодепрессивнуш активность. Для контроля синтеза, изучения молекулярных механизмов действия, выяснения метаболизма, скорости выведения, расправления в организме необходимы методы, позволяющие определять эти соединения в биологических объектах, реакционных смесях, готовых лекарственных препаратах. До настоящего времени основное внимание в ВЗЖХ компонентов нуклеиновых кислот уделялось разработке методов анализа смесей природных соединений. Гораздо меньше сведений по синтетическим аналогам этих соединений, фактически отсутствуют работы посвященные БЭЕЗС база- производных ппримндиновых оснований и нуклеозидов. Поскольку представители ртого класса соединений прояашягт выраженную противоопухолевую и противовирусную активность,, изучение хроматографичес-кого поведенгл имеет больше-практическое значении1 при разработке методов контроля синтеза' ^определения этих соединений в биологических объектах. Изучение- физика-химических свойств синтетических аналогов пиримидиновых оснований и нуклеозидов, их взаимодействия с поверхностью гидрофобных сорбентов, используемых в ВЭЖХ представляет самостоятельней" интерес. В настоящее время, дачные по влиянию етруктурыэгих соединений я'гиг-,ккслсттто-ос;;овньгх свойств на удерживание в услозтих обрашэнно-фазовой :"ВЗЖХ (СФ ВЭЖХ) весьма ограничены и чаггго противоревдгаы. №»приводилось оценки характеристик взаимодейотэяг как,природных так »-синтетических аналогов пиримид&зовых оснований -я ;к?клеозвдоа с гидрофобными сорбентами в рамкаэ.'сароко используемой вкастсгяш^ттремл сольвофобноЯ' теории удерхтшт' Отсутствует даннда-*л0'-'те>рж5дтщмичэским характеристи-1Ш"УДер)йШния этих соедин8ний"на' различных типах сорбентов. Очень мало данных по кислотво-основяш свойствам б-агалроизводных основа-. :шй и нуклеозидов.

Работа выполнялась в соответствии с: 1) координационным планом научно-исследовательских работ"АН СССР по проблемам "Биоорганическая химия" на 1986-1990 гг/> -'¿У Комплексной програш-яй научно-исследовательских работ АН СССРЧГ'АЯН СССР "Яугдачэнталърыэ науки -медицине" на 1936-1990 ГГ.;3);-1Шном научно-исследовательских работ по изучении компонентов нукязияових кислот для биологии и м&дтшы на-1996-19Э0 гг. по ГОстановлвяюо ТОП СМ СССР N30 от 31.03; Ей.

- Е -

Уэцъ работу, Еедьд настоящей работы являлось исследование поведения природных и синтетических аналогов пиримидиновых основания и нуклеоэидов в условиях: обращэнно-фазовойСОФ ЕЗЩ, ион-парной обращенно-фа-вовой ВЭЮС (КП ОФ ЕЗЕХ) и ионообменной хроматографии (ИП ВЭЖХ), на-хшдениа теиодинамкчаскнх параметров удерживания этих соединений на гидрофобных сорбентах, изучение взаимосвязи структура-удерживание; выбор оптимальных условий для разделения этих соединений в различных вариантах ВЗЖХ; разработка методов анализа противоопухолевых соединений в биологических объектах, разработка методов контроля их синтеза и чистоты.

Научная новизна. Изучены спектральные характеристики и кислотно-основные свойства ряда пиришдиновых и триазиновых оснований и нуклеоэидов. Исследованы закономерности хроматографаческо-го поведения лиримидиноаых и триазиновых оснований и нуклеоэидов в условиях ОФ, ИП ОФ, ИП ЕЭЯХ; получены термодинамические характеристики удерживания и селективности разделения этих соединений на октадецильных сорбентах.

Практическая ценность. На основании проведенных исследований найдены оптимальные условия хроматографичэского разделения пиримидиновых и триазиновых оснований и нуклеоэидов в~ условиях ОФ, ИП ОФ и ИП взязс Разработаны экспрессные методы контроля синтеза новых противоопухолевых и противовирусных соединений б-азацитидина и 6-азауридина. Разработаны методы анализа в крови противораковых препаратов 6-азацитидш, арабпнозинцитозин (Ара-С) и продуктов их фер-ыетативного дезашшироваши при помощи ВЭЖХ.

Разработанные методы используются для определен™ оптимальных режимов применения препаратов и контроля синтеза 6-азауридина и б-азацитидина.

ра ззпртгу выноаятсд:

1. Закономерности влияния состава подвижной фазы, природы и состояния в растворах природных и модифицированных пиришдиновх оснований к нуклеоэидов на удерживание и селективность их разделения!

2. Результаты изучения спектральных и кислотно-Основнш свойств пиришдиноеых и триазиновых оснований и нуклеовидов)

3. Результаты определенна термодинамических параметров удерживания и селективности разделения штришадиновых и триазиновых оснований

и нукшзозвдов в условиях обрыг^нно-фазовой и ион-йарной ЮЖХ.

4. Методы определения противоопухолевых соединений и продуктов их метаболизма.

5. Методы контроля чистоты В-азв-аналогов пиримидиновых нуклеозидоэ.

Апробация работы. Результаты проведенных исследований докладывались на конференции по биоорганичесгсзй химии Института биоорганической химии АН УССР(1984 г.),на заседании Киевского городского семинара ЕЖ) им. Д. й. Менделеева (1988,1990 гг.), Всесоиэнсм симпозиуме "Количественные аспекты химического воздействия в онкологии"( Ленинград, 1993), У1Н Всесоюзной симпозиуме "Компонента нуклеиновых кислот" (Рига,1989), Международном симпозиуме "Применение жидкостной хроматографии и электрофореза в биологии и'медицине"(Таллинн, 1990).

Публикации: по тепе диссертации опубликовано 10 статей и 2 тезисов докладов.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (1 глава), экспериментальной части ( 3 главы), выводов, списка литературы (125 наименований) и приложения (справки о внедрении методов контроля синтеза, и определения противоопухолевых препаратов и продуктов их метаболизма в крови). Диссертация изложена на страницах машинописного текста, содержит 29 рис унта и 18 таблиц.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ . Анализ литературы показал, что основноэ внимание уделяется разработке методов разделения смесей природных нукяеозидов и нук-леотидов, а также пуриновых и пиримидиновых оснований и нуклеози-дов. Число работ, посвященных высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) модифицированных пиримидиновых компонентов нуклеиновых кислот весвют ограничено. В основном, это работы в которых решались- практические задачи определения соединений в биологических? объектах. Имеется лишь несколько работ, посвяшрнных изучгняет природы взаимодействия компонентов нуклеиновых кислот (ЯННр с сорбентом в условиях ОФ ВЭЖХ . Практически отсутствует тютгственныэ оценки влияния строения и введения заместителей в молекулу пиримидиновых оснований и нуклэозидов на их хромзтогра-фическое поведение. Также шло исследований поспящано изучения хро-матографическсго поведения пиримидиновых KHK и их аналогов в уело-

виях ИП Оф ВЗЖХ. Работы по изучению хроыатографического поведешь и разработке методов анализа б-азапроизводных пиримидиковых оснований и нуклеозидов практически отсутствуют.

В работе изучались елодуищга соединения: природные пиримидина-вые основания - цитоэин, у.-ацид, тимин и нуклеоэиды - цитидин, уридин; ааапроиэводшз оснований - В-ааацитозин, б-азаурацил, В-аааткмин, нуклеозидов - б-азацитидин, 6-азауридин; 5-азацитидин, арабшюзшщитсзии( Ара-С), арабинозинурацил, N4- н 0'- аамзшэниыа б-аза-цитидина (ТаблЛ, 2), а также б-мэтилурацил и фторурация,

Е£ЗШ>ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА СИНТЕТИЧЕСКИХ АНАЛОГОВ Ю1РЮЩШЮВЫХ

ОСНОВАНИИ И НУКЛЕОЗИДОВ рпектраяьныэ свойства соединений. Определенна спектральных характеристик является необходимым предварительным исследованием, обеспечивающим оптимальный регаш ¡а детектирования в современной ЕЭЮС б-азапроигводнш пириыидиновых оснований и нуклеозидов обладают интенсивной полосой поглощения в области длин волн 240-280 нм. Значение коэффициента молярного погашения находятся в пределах б'Ю3 - 10 Ю3. Эти данные свидетельствуют о том, что погловднш обусловлено переходом зг-я^электронов молекулярных орбиталей. В спектрах соединений имеется также более коротковолновая полоса поглощения (220 - 230 нм), однако, использование зтой спектральной области для детектирования исследуемых соединений и биологических объектах нецелесообразно, ввиду больного числа примесей, поглошдкцих: в этой спектральной области и затрудняющих детектирование.

Введение дополнительного атома азота в гетероцикл при переходе от пиримэдиновога к триазиновому гетероциклу, как правило, сопровождается сдвигом полосы поглощения в коротковолновую область спектра, причем, для симметричного б-азацитидина этот сдвиг более значителен, чем для несимметричного б-азацитидина (¡Табл. 2). Введение арильньос заместителей в молекулу 8-ааацитиди-на приводит к вначитедяшк изменениям в спектре. Так, для М4 -арилаамэпэнных наблвдаигоя две интенсивные полосы поглодения -230-260 ни и 310-320 ни, с одновременным повышением значения ко-аффициета молярного погашения (Табл. 1). Такой характер спектра свидетельствует о сопряжении систем эл&ктронов триааинового и

№

ИИ-

л

И, " " "И

- б-ааацитадин

КГ) Таблица 1

ХАРАКТЕРИСТИКИ ПРОИЗВОДНЫХ 0-АЗАЦИТИДИНА

Соеди- нго £ г 10 з А

нения мах мах 265 260/280

11 с6н5соон Н н 248 9.3 8.6 0. 04

320 17. Б ' 78

III С6Н5С00СН, н н 255 . 0.87

32В

IV с6н5 Н н 235 9.6 9.6 0.97

У С6Н5СН^ н н 270 а 5 8.5 1.03

У1 н н С6Н5С" 230 18; 4 9.2 1.23

О 270 аг

УП н с6н5с- СбН5С-0 235 18*. 1 9.2 1.1

УШ снй-с- ННд н 270 9.2 9.2 1.0

0 0

IX сн-сн^он сбН5с- гз5 16.7 9.1 0.97

0 0

Таблица 2.

СПЕКТРАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ СОЕДИНЕНИЯ

Соединения Агах. е . гтз ймазс10 ^26 о/гао

Осшвэда

§-аэаурацил 2601- 3.4 2.7

6-ааацитозин 260' 7.2 1.3

б-ШгшЕураццд гев 12.8 •3.5

Фторурацизг 268' 4.1

б-азатамгаи гбо 4.4 \ 8

Нуклеоэиды

б-азауридин 262 7.2 ■ 2.0

б-азацитидин 263 6.8 1.2

Ара-С 276 7.6 1.8

5-ааацктидин 245 - 8.7

арильного циклов. Удобным для детектирования этих соединений является диапазон 276- 330 им. Протонизация пиримидиновых и триазино-вых оснований и нуклеозидов приводит к сдвигу полосы поглощения в длииоволнову» область спектра на 10 нм для пиримидиновых и на 27 нм для триазиковых соединений, диссоциация - в коротковолновую область на 10 нм.

Б случае применения мультиволяового спектрофотометрического для облегчения идентификации соединений в сложных смесях иди Биологических объектах удобно использовать отношения интенсивности при двух фиксированных длинах волн к>0./к, ьо , что является характеристической величиной для каждого соединения (Табл. 1,2). Кислотно-основные свойства пиримидиновых оснований и нуклеозидов определяются свойствами гетероцикла и углеводного остатка. Поскольку в ОФ ВЭЖХ сильношелочныэ Ш практически не используются, диссоциация гидроксильньс групп рибовы (рК > 12) не оказывает влияния на хро-матографическое поведение этих соединений. Для определения констант ионизации мы использовали спектрофотометрический метод Комаря (Табл. 3). Константа протонизации Б-азацотидина определялась при помощи ОФ ВЗЮС

Таблица 3

ЗНАЧЕНИЯ КОШТАНГ ИОНИЗАЦИИ ОСНОВАНИЯ И НШЮЭВДОВ

ОСНОВАНИЯ рКц рК& НУКЛЕОЗВДЫ рКа рК&

6-азацитозин 1.57-Ю. 02 6-азацитидин 1.410.05

6-азаурацил 7.00±0.03 б-'ааауридин 6.7+0.02

В-азатимин 7.16±0. ОН б-азацитидин 3,010.02

Ара-С 4.3+0.06

Для расчета рК для Б-азацитидина использовались соотношения, связываание константу диссоциации К с коэффициентом емкости к'с и к[ (ко-афшщиэнты емкости молекулярной и конвой формы, соответственно) и концентрацией ионов водорода СН*1:

к'- ( к'ь + ЕНМ к|/К4)/(1+ [НЧ/Ка)

(1)

Константа диссоциации соединения определялась как тангенс угла наклона прямой, построенной в координатах (к' , (к'- k't )/[Н']. Как видно из Табл. 3 замена группы СН в шестом положении пиримидиневого гетерсцикла на более электроотрицательной атом азота весьма значительно повышает кислотные и понижает основные свойства соединений, что по всей видимости вызвано уменьшением электронной плотности на атомах азота N3 . Гораздо меньшее влияние на кислотно-основные свой-стпа оказывает замена группировки -СН в пятом положении гетероцикла. Отличия в кислотно-основных свойствах могут быть использованы при поиске селективных условий разделения триазиновых оснований и нук-леозадов от природных соединений.

ИССЛЕДОВАНИЕ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО ГОЕЕДЕНИЯ ПИРШЩЖИШ ОСНОВАНИЯ И НШЕ03ИД0В И ИХ СИНТЕТИЧЕСКИХ АНАЛОГОВ Обращенно-фазоваа высокоэффективная' жидкостная хроматография. При выборе оптимальных условий разделения сложных смесей пиримидиноввх и триазиновых оснований и нуклеозидоп выбор сорбента может в значительной степени предопределить успех в решении- задачи, нами: Кцо проведено исследование удерживания соединений на сорбентах марки Силасорб с привитым» эгйльйыми, октадецильныии и фенилъными радгоса-лами. Все сорбенты имели одинаковый размер, форму зерен пловдь поверхности. Наибольшим«; коэффициентами емкости соединения обладают на сорбенте с октадецильными радикалами, причем разделение на этом' сорбенте характеризуется также и больней селективностью. Полученные результаты дают основание отдать предпочтение октадецильному сорбенту для- поиска оптимальных условий разделения природных и синтетических аналогов- пиримидиновых оснований и нуклеозидов.

В настоящее врем? цця описания механизма удерживания соединений на гидрофобных* сорбентах используется сольвофобяая теория удерживания (Синаноглу,. й}рвач). В рамках этой теории, получив зависимость ln( k') = f(j-) , где f- поверхностное натяжение 10, мы расчи-тали значения площади контакта соединений с поверхностью-гидрофобного сорб(даа( а Ф) для молекулярных форм соединений. Кислотность ГО в течение-експеримента поддерживалась постоянной, такой, при которой исследуемые соединения находилсь в незаряженной форме. Полученные значения приведены в Табл. 4. Ш результатам исследования зависимости In .L = f(j") , где Л -селективность, рассмотрено влияние поверхностного натяжения ПФ на селективность разделения соединений

- а - «

ТаЗх 4.

ХАРАКТЕРИСТИКИ ИОНГША СОЕДИНЕНИЯ С ГВДРОвОЕШИ СОРБЕНТОМ

Основания дФ,( Л1) -А^СН-гр) Куклаоэиды д кДл'Шдь 1сда/моль

Цитоаин 23 16. б Цитиднн 77 38.8

Урацид 33 19.9 Уридин 86 43.2

6-азацитоаик 11 10.4 б-азацитидиа 61 31.8

Тишга 85. В 42.7 б-азацитидин 69 35.6

6-азатииин 80.1 40.3 Ара-С 82 40.9

б-аааурацил 10,0 14.3 б-азауридш 63 32.8

к определены вклады в общре изменение свободной анэргии сорбции & (ь^) энергий вандервальсовскаго О и электростатического 8) взаимодействий (Табл. 4.

Шдученныэ результаты позволят сделать ряд выводов, касающихся природы взаимодействия изученных соединений с гидрофобным сорбентом и причины особенностей зсроматографического поведения некоторых из них. Введение атома азота 8 гетероцикд умзньшет пюещь гидрофобного контакта (дф) с углеводородным лнгандом сорбента, т.е. "схатие"гетероцикла при переходе от пкримидиновых к триазиновш гетероциклам сопровождается уменьшением величины &ф . Причем, несимметричный 0-азацитидин обладает меньшей площадью гидрофобного контакта, чем симметричный Б-азациткдин. Кроме того, изменение свободной знерггои сорбции при переходе от датвдина к 6- азацити-дину, гораздо больше, чем при переходе к Б-азацитидину. (Табл. Б). Это позволпэт сделать вывод о более значительном вкладе атома С(6) по сравнении с С(б) во взаимодействие с гидрофобным сорбантом. Площадь гидрофобного контакта с октадецильиш сорбентом тишна и 6-азатишна, содержащих «етильнув группу превосходит эту величину для немэтиллировадных урацила и В-азаурацила на>50 ¡и Эначешш(Аф) - БО А', соответствуйте вандерваальсовой пюпвди группы СН1 свидетельствует о том, что мат иль нал группа 6-азатишша и тимнна подросты? прошигаэг в поверхностный слой сорбента. Учитывая, что зна-чвниел$ кетшгьной группы гораздо больше значенийлФ немотшмрова-вных оснований, а также значительную величину изменения свободной анергии сорбции при введении группы -СН3в молекулу основания (2-3

Таблица 5

ВКЛАДЫ В ИЗМЕНЕНИЕ СВОБОДОЙ ЭНЕРГИИ СОРБЦИИ

Соединения д (дФ)-дСгЛЫ -¿ОЦ^) л(г> РМ1/) А* НлО 2. на0 +

кДж/М кДж/М кДк/М кде^м

Урацил-В-заа-

урацил 13 0.1 0.5В 5.6 -5.5

Цитозин-В-аза-

цитозин 12 0.01 0.45 5. г -5.19

Тгмин-В-ааатимия 0 1.1 1.3 2.6- -1.5

Цитидин-6-аза-

цитидин 16 2.1 г:г В. 9 -4.8

Уридин-В-азауридин 23 2.2 ЗЛ ' 9.9 -7.7

Цитидин-5-азаци-

тидшг 8 0.7 1/0 ' 2.8 -2.1

Цитидин-Ара-С - 5 - 0.9'а -11' -2.2 1.3

Цитидин-цитозин 54 гзр 4.4 23.3 -21.0

Уридин-урацил 53 4.4 22.8 -20.5

В-азацитидин-

В-азацитозин 50 0:1 > 2.1 21. В -21.5

В-азауридин-

В-азаурацил 43 0.1 . 1.7 18.6 -18.5

Ара-С - цитозин ' 3.6 5.98 25.4 -21.8

Тимин-урацил 553 2.0 4.2 ' 22.8 -20.8

В-азатинян-В-аза-

урацил 6ЕГ 1/2: З.В 25.9 -24.7

кДж/мольН>ожно сделать выгод, что основной вклад в удерживание метилированных соединений вносит именно эта группа. Обращает на себя внимание еще один факт: при переходе от тимина в 6-азатимшгу значение дФ изменяется лишь в незначительной степени в отличие от ве личины Для неметшшрованных оснований наблвдается противоположный эффект. Видимо, ориентация тимина и б-ааатимина относительно поверхности сорбента иная, нежели неметилированных оснований: _ метильная группа погружена в углеводородный слой сорбента, а гидрофильный гетероцикл, в основном, находится в ПЭ и весьма

незначительно контактирует с алкальшлш радикалами поверхности. Присоединение риСозного остатка к азотистому основанию проводит к повышению свободной энергии сорбции на 4 кДж/иоль для природных и на Е кДк/моль для е-ааапроизводных оснований. Изменение свободной анергии сорбции при переходе от природных к аза-проиаводным для нукдеогидон более чем на 2 кДж/ моль превышает аналогичные значения для оснований, т.е. переход от пиркмидинового к триазиновому гете-роцшслу приводит к изменению взаимодействия с поверхностью сорбента на только самого гетероцикла, ко и углеводной части молекулы. В польз, этого свидетельствует и большее увеличение плошади гидрофобного контакта при введении рибозы для нешдифицированного по ге-тероциклу соединений ( Б8 и 54 ) по сравнению с б-азапроизводнц-мн ( 43 и 50Х1).

Кислотно-основные свойства пиримидиновых и триаз!шовых оснований и нуклеозидов значительным образом сказываются на их хроматографи-ческом поведении в условиях 03 ВЭЖХ. Резкое уменьшение коэффициентов емкости 5 и б-азапроизводных связанное с переходом соединений из молекулярных в ионизированную форму наблюдается при более низких значениях. рН по сравнению с природными основаниями и нуклеози-дами. Зависишсти к'= Г(рН)( Рис. 1.) хорошо описываются соотношением (1) .

В литературе имеется ряд примеров изучения влияния рН ПФ на коэффициенты, емкости пиримвдинових оснований и нуклеозидов значительны).! образом отличающихся от полученных нами. Изучение атого явления позволило нам сделать вывод о том, что такие отклонения от предсказанных сольвофобной теорией возникают вследствие несоблюдения условия сохранения постоянного значения поверхностного натяжения и ионной силы Ш>. При использовании буферных растворов органических кислот-и их солей, как зачастую имеет место в ОФ ВЭЖХ .поверхностное натяжение и ионная сила растворов с различными значениями рН могут подвергаться значительным изменениям, что и приводит к отклонениям зависимости к' = Г( рН > от предсказанных теорией. Проведенное исследование влияния кислотности (К на удерживание соединений позволило оценить изменение анергии электростатического заимодёйетвнн с № при переходе иа молекулярной формы в ионизированную (Табл.б). Велич!ша термодинамического различия в распределении двух форм соединений для 6 - и 6- ааапроизводных превышает соответствующе значения для ^модифицированных соединений, что молет свидетельствовать как о меньших размерах , так и меньших ди-

- и -

новыг оснований (а) и нуклеоэидов (б). НЬ 511аэогЬ С 18 (15 мкм) ПЬ • 1'. ОМ'сулвфат аммония в 0.1 М фосфатном буферном растворе, а) I- В-азаткжы?1 2 -урацил, 3 -ццтозин, 4 - б-азацитоэин, 5-0-азаурацил.

С) 1 - уридин,, г - арабинозинцитозин, 3 - Б-азацитндпи, 4 -шгги-дин, 5 - ,6-азауридин, 0 - б-азацитидин.

Таблица 8

ИЗМЕНЕНИЕ СВОБОДНОЙ ЭНЕРГИИ ПЕРЕХОДА. ПИРИШЩИЮШ ОСНОВАНИЯ И НУКШЩДОВ ИЗ ЮЛЕКУЛЯРШЙ ФОРШ В ИОННУЮ

Основания -д(^^.а) Цукдеозиды -д( л

1. ОМ (МН^БО^ 1. ОМ (ИН^Я),,

кДж/модь кДж/юль

Цитозин 2.9 Цитидин 2.4

Урацил 2.2 Уридин 2.1

Б-метилурацил 2.2 Б-аэацитидин 4.8

6-азацитозин 4.7 В-азацитидин 4.2

б-азаурацил 3.8 6-ааауридин Е. 3

6-азатимин 2.9 Ара-С 2.0

дипольных моментах их молекул.

Проведенные исследования позволили определить оптимальные условия разделения смесей природных и модифицированных нуклеоаидов и оснований ( Рис. 1.). Для нуклеозидов оптимальными являются Ш с рН 4.8-5.3. В этой области, вследствие частичной протонизации цити-дина и Ара-С можно полностью разделить Сдизколехащка пики уридина, Ара-С, б-аэацитидина и цитидина. Для оснований оптимальной является ещэ более узкая область рН - 3.4 -3.6. как видно иа Табл. 5, повышение поверхностного натяжения путем увеличения концентрации соли в Ш является аффективным способом повышения селективности разделения соединений. Поэтому, для разделения смеси ва колонках с недостаточной эффективностью следует использовать подвижные фазы с поваженным поверхностным натяжением. При атом южно повысить селективность разделения пар для которых различие а площади гидрофобного контакта превышает 10 А2(Табл. 5). Разделение оснований, для которых величины невелики, требует использования высокоэффективных колонок-5-10-10 т. т. на колонку. Благодаря применению адвента о высоким содержанием сульфата аммония (1М и выше), рН »3,6 нам удалось полностью равделитьцитоаин с 6-азацитоаиаом и другими основаниями ( Рис. 2а).

На основании изучения влияния температуры колонки (ЕО-ВО°С) определены величины энтальпии' сорбции пиримидиновых и триавиновых

их производных.

а) №. Сопарон С 18 (16 мкм). ПФ-Л.ОЫ сульфата аммония в 0.1Ы фосфатном буферном раствора (рНЗ. 45). 1 - цитозин, 2 = 6-азацитозин, 3 - 6-азаурацил, 4 » урацил, 6 » 6-ааатимин, б = тишш:

б) ВЬ Бондапак С 18, (10 мкы). ПЪО. 1£бЫ сульфат аммония в 0.01Ц фосфатном буферном растворе(рН 6.1). 1 « В-азацитвдин, 2 = 6-аза-урвдид, 3 » цитвдин, 4 = Б-азацитадин, Б -Ара-С, 0 - уридин, 7 -* тимидин.

оснований и нуклвоаидов, а также вклады в относительное изменение свободно* анергии сорбции ( Табл. 7 ).

Установлено, что для щученных соединений наблюдается хорошая корреляция между д( дН ) и д( д 3). Параметры корреляции уравнения описываидего компенсационный аффект: д( д Н°) « 0.27 ( ± 0.64) х ¿(дБ0) - 1.05 (+0.22), близки к параметрам айалогичного уравнения для реакции комплексообрааования типа А + В^АВ . Таким образом, модель обращэнно-фазовой хроматографии как процесса комплексообразования удерживаемого соединения в поверхностным лигандом, принятая в оольвофобной теории адекватно описывает поведение изученных нами соединений.

В условиях ОФ ВЭИХ на огегадецильном сорбенте изучено влияние содержания метанола на удерживание N4- и О1- замэщенных В-азаци-тидина. Установлено, что для этих соединений имеет место линейная корреляция между 1п к' и поверхностным натяжением I®. Найдены пара-

/

_ 14 - Таблица 7

ВКЛАДЫ В ИЗМЕНЕНИЕ СВОБОДНОЙ ЭНЕРГИИ СОРБЦИИ ПИРИШДИ-ШВЫХ ОСЮВАНЯЯ И НУКЛЕОЗЛДОВ НА ОКГАДЕЦИЛЬЮЫ СОРБЕНТЕ ( П'Ь .11.! (№.,)., 50;< а 0.1 II фосфатном буферном растворе) Соединения -д(дВ) а(дН) л (л 5)

кДж/моль кДж/моль кДж/К- моль

Урацид - 6-аааурацил 0.46 -2.7 -7.6

Цитозин - В-азацитозин 1.1 -5.8 -16.0

Тимин - 6-азатимин 1.1 2.1 10.9

Цитвдин - В-аэацитидин 2.7 6.2 30.4

Уридин - Б-азауридин 2.8 9. Б 42.4

Ара-С - В-азацитидин 1.1 4.4 18.9

Цитидин - цитозин 2.3 12. Р 51.4

Уридин - урацил 2.4 11.0 46.0

В-азацитидин - 6-азацитоз1ш 0. 7В 1.6 8.2

б-азауридин - 6-азаурацил 0.71 -1.3 -2.0

Ара-С - цитозин 2.3 17.4 67.0

Тимин-урацо 3.7 5.8 32.0

В-азатимин - 6-аэаурацил 3.2 1.0 14.0

Б-метилурацил - урацил 3.5 7.4 37.2

метры корреляционных уравнений, описывающих удерживание этих соединений в водно-метанольных элюентах. Проведена оценка величины изменения плопщи гидрофобного контакта и свободной энергии сорбции при введении в N4- и 0'- положение различных заместителей. Показано, что введение в N4 положение арильных заместителей гораздо меньше сказывается на удерживание этих соединений по сравнению с введением аналогичных заместителей в 0' - положение рибозного фрагмента. Полученные результаты позволят сделать вывод о том, что в случае N4 -бензил и N4- фенил- азацитидинов нет полного контакта фенильных колец и метиленовой группы с сорбентом. Ш всей видимости, при Сорбции на окгадецильннх сорбентах изученные N4 и О'- замещенные б-азацити-" дина взаимодействуют с углеводородной поверхностью сорбенГЕГГлавным образом, углеводным остатком,и заместителями, связанными йлэтим остатком. Азотистый гетероцикл а основном ориентирован в ГО.-^даЖе при наличии достг-'очно крупных гидрофобных фрагментов й И4 - положении. На основании проведенных исследований определен{*ярсЖ>вия разделения

различных смесей N4- и 0'- замещенных 6-азацитндина. Для соедшганий, содержащих полярные группы в N4 - положении следует использовать подвижные фазы с содержанием метанола не более 3£, соедин-ния содержащие фенильную или метоксифенильную группу в N1 -положении, а также О*- монобензоил-замещенные элшруются ПФ с содержанием метанола 30-40Х , О' - триОензоильные производные хромзтографируютсл ПФ содержании 75-805 метанола.

Цон-парная высокоэффективная жидкостная хроматография. При использовании додецилсульфата натрия (ДЦС) в качестве ион-парного агента пиримидиновые основания и нуклеозиды, способные к протонизации в кислых средах (рН < 4) обладают значительный удержгаанием. Урацил и его производные, находящиеся в этих условиях в молекулярной форме практически не удерживаются, что позволяет их полностью отделить от основных соединений. Зависимость коэффициента емкости от кислотности элюента коренным образом отличается от наблюдаемой в ОФ ВЗЖХ (Рис. 3 ). Порядок выхода пиримидиновых оснований в условиях ион-парной жидкостной хроматографии отличается также и от порядка их выхода на сульфокатионитах. Для слабоосновных б-аэацитозина и б-азацитидина максимальное удерживание в изученной области кислотности ПФ не достигается. Для цитозина.цитидлна и Ара-С при рН < 3,5 коэффициенты емкости имеют постоянную величину, что объясняется достижением полной протонизации этих соединений. Переход от молекулярной к ионной форме протонируюпргсся соединений в присутствии ионов додецилсульфата сопровождается значительно большими изменениями свободной энергии сорбции, чем в ОФ ВЭЖХ (Табл.8.). В случае ион-парной ОФ ВЗЖХ го-

Таблица 8.

ХАРАКТЕРИСТИКИ УДЕРЖИВАНИЯ ИОНИЗИРОВАНИИ И ШЛЕКУЛЯРШХ ФОРЫ

ПИРШИДИНОВШС СОДЙНЕНИЯ В УСЛОВИЯХ ип И ОФ взах

Соединена к^ к^-д ( а <3ИП) к[ к'0 - д( лй^)

кДж/ноль кДж'моль

Цитозин 9.4 0.31 а 5 0.12 0. 40 3.00

Цитиднн 5.4 0.03 10.4 0.70 1.84 2.4

Ара-С 6.2 0.08 10.8 1.3 2.9 2.0

раздо выше величины изменения свободной энергии сорб!рш при переходе от природных к б-азаироизводным, что обусловлено различной сте-

на удерживание пиримидиновых и додецшгсульфата в П® на удержива-триазиыовых оснований и нуклео- пиримидиновых и триазиновых основа-видов. ннй и нуклеозидов.

Н& СиласорО С 18, 10 мкм. Вй Силасорб С 18, 10 мкм.

ПЬ 0.035 Ы додецилсульфата Ка Пй 0.111 Н^РО^, 0.02М N801. в 0.1Ы фосфатной буферном рас- с различным содержанием додецилсуль-творе. фата натрия.

1 цитозин, 2 -Ара-С, 3 - цитидин, 4 - б-азацитозин, Б - В-азаци-тидин, 6 = б-азаурацил, 7 - азауридин, уридин.

пеныо ионизации соединений. Наблюдаемые различия в удерживании и селективности в ИП ОФ ВЭЖХ и ОФ НЭП свидетельствугг'о различных механизмах удерживания. Так, при переходе от основания к нуклеозиду в ИП ОФ ЕЭЖХ удерживание уменьшается, в отличие от ОФ ВЭЖХ. Это дает возмояюсть сделать предположение, что в случае образования -ионной пары в контакт с сорбентом вступает лишь алкильная цетг до-' децилсульфата, в то время,как нуклеозид (основание) ориентированы в ПО. Более гидрофобные нуклеозиды отличатся большим взаимодействи-

ей с гидрофобной П5, содержащей ионы додецилсульфата, что приводит к меньшему, по сравнению с основанями, удерживанию. По всей видимости, возможно также включение хроматографируемых соединений в мицеллы додецилсульфата, существующее в условие хроматографирования. Значительное влияние на удерживание протонированных соединений оказывает концентрация додецилсульфата в ПФ ( Рис. 4 ). Маринуй удерживания достигается при концентрациях 2-3 -10" Ц ДЦС . При малых концентрациях ДЦС ( до 2 10'И ) в ПФ, коэффициент емкости резко возрастает, уравновешивание системы при згих концентпациях ДДС происходит медленно, результаты сильно зависят от небольших колебаний условий эксперимента. Положение максимума.на зависимостях козф£ици-щ!ента емкости от концентрации ДЦС соответствуют критической концентрацией шщелообразования (КНЫ) для додецилсульфата натрия. Уменьшение удерживания соединений после достижения ККЫ можно объяснить способностью ионной пары включаться в мицеллы или взаимодействием протонированных частиц с анионами додецилсульфата, входящими в ссстаз мицелл." Введение в состав ПЭ ацетонитрила или соли ( нес1 ) приводит к уменьшении удерживания всех протонированных соединения . Увеличение концентрации соли в элюенте приводит к повъшенив селективности разделения пары цитидин-цитозии и к понижению селек- ■ тивности разделения пары 6-азацитздш - б-азацитоаин. Поскольку разделение последней пары представляет болэа сложную задачу, содержание соли в ПЭ не должно превышать 1 - 4-гоА и . Проваданные исследования позволили найти оптималькш условия разделения смеси природных и 6-азапроизводных пиримидииовых оснований и вукаеозидов. Для^ этого следует использовать ПФ с рН < рК4,с содержанием ДЦС 2-5•МГЦ Использование ион-паркого варианта ОФ ВЭЖХ в случае разделения ци-тозина и его б-азааналога,"благодаря высокой селективности системы дает возможность применять менее-эффективные колонки, чем при -примэ-нении сбращенна-фаэовой хроматографии.

Ионообменная жидкостная хроматография. Различие в константах ионизации ппркмидиновшс и уриззиновых нуклеозидов - репаи^гй фактер в обг-спечэни селективности разделения этих соединений в условиях ионообменной ВЭЖХ. Проведено исследование хроматографичзского поведения о тик соединений на каТиокообшнникзх Аминекс и Ультрзлак.

Изменение кислотно-основных свойств заметно отражается на зависимостях удерживания от кислотности ПЗ. Для 6-азацитидина увеличение коэффициента емкости наблюдается при значительно меньших рН, чем дла

цитидина. Такое различие приводит к возможности селективного отделения б-азацитидина от цитидияа при рН < 5 , что весьма удобно при очистке болыних количеств нукле^эидов. Сметное удерживание неззряженных уридина и 6-азауридина при рН < б обусловлено по всей видимости, гидрофобными взаимодействиями этих соединений с арильными групшгровками матрицы ионообменника. При рН > 5 для 6-азауридина, проявлявшего свойства более сильной кислоты, чем уридин, наблюдается резкое уменьшение удерживания, связанной с диссоциацией. Положение точки перегиба зависимости к'= рН ) соответствует значению рК 6-агау"идина.

Использование катионообменкьк смол позволяет легко разделить смесь б-агауридина и уридина, что полезно при очистке 6-азауридина - исходного продукта для синтеза б-азацитидина - ог примеси уридина. Дополнительным резервом для увеличения селективности является ионная сила Гй. При ионной силе менее 0.3 (фосфатный буферный раствор) можно обеспечить необходимую селективность разделения смеси б-аза-уридина и 6-азацитндина.

Разделение анантиомеров (урацидил-И.))-^--аланкна (виллардина) методом лигандообманкой хроматографии.

Виллардин - природный алкалоид, пргявляющий противоопухолевые свойства. Молекулу виллардина можно рассматривать как аналог нуклеозида урядика,в котором углеводный остаток заменен остатком аминокислоты Ь-аланина, или как аналог аминокислоты фенилаланина в котором фенши-ное кольцо замешано урациловым остатком.

Для разделения анантиомеров виллардина нами применена лигакдсобмен-ная хроматография на сорбенте со связанными с поверхностью остатком аминокислоты пролинаШ.Ш служили растворы сульфата меди. Для поиска условий для оптимального разделения анантиомеров изучено влияние концентрации ионов мэди 2 10 м. Добавки метанола в ГО ( 0-30?.) практически не сказываются на удерживании и селективности разделения анантиомеров, что может свидетельствовать о незначительной роди гидрофобных взаимодействий в удерживании соединений. Проведена количественная оценка влияния замены остатка урацила в молекуле виллардина на атом водорода(аланин) и на фенильный радикал (фе-нилаланин) на селективность разделения знаятиомэров ( Табл. 9 ). Введение остатка урацила вместо атома водорода приводит к увеличению энергетического различия между авантиомерами на 330 Дж/моль, замена фенильного кольца на остаток урацила приводит к уменьшению этой ве-

личины на 1333 Дм/тль. При перехода от пролинового к гидрзкеипро-лшювому сорбенту(II)селективность разделения энантиошров виллар-дина полностью теряется. Наилучшее разделение на пролнновом сорбенте было получено при использовании в качестве ПФ раствора сульфата меди с концентрацией 5-10%

Таблица. 9 .

ПАРАМЕТРЫ РАЗДЕЛЕНИЯ АМИНОКИСЛОТ ( ПФ - 5-103 Ы Си 50^, т--25°с)

Разделяемые соединения Сорбент I Сорбент II

к'д Д| аС к-' £ оС

Виллардин Ь,0 1.62 1.3 570 4.8 1 0

Ь-фенилаланин-^виллардин 4.20 г. а 2366 3.7 7.4 4966

0- фенилаланш- Ю- виллардин 1.93 1. Б 1052 0.6 4.2 3563

I.-Виллардин- Ь-алания 1.62 1.5 1052 О.С 1 0 '

О-Еиллардин-О-апаяин 1.26 1.3 669 0.6 1.7 1265

ЫЕТОДН АНАЛИЗА СИНТЕТИЧЕСКИХ АНАЛОГОВ ПИРЮЩКНОВЦХ ОСНОВАНИЙ И НУК-ЛЕОЗИДОВ

На основании проведенных исследований разработаны методики: .

1. Определения уридина в В-азауридине при помощи ионообменной хроматографии; контроля полноты щелочного гидролиза бензошшрованных производных З-азацитидина при помог?! обраирнно-фазовой ЮЯХ; определения б-азауридина и цитидина в 6-азацитидине при помоещ обращзн-но-фазовой ион-парной ВЗНОС;

2. Определения противоопухолевого препарата б-азацитидина в крови при помощи ион-парной обралршо-фаэовой ВЭЖХ; определения противоопухолевых соединений 6-азацитидина, Ара-С и продуктов ихфёрмента-тивного дезамшшрования 6-ааауридина и арабинозинурацида а крови при помощи обращэнно-фазовой ВЗК2С;

3. анализа энаятиодарного состава виллардика при помощи лигандооб-менной хроматографии

Разработанные методики позволяет при помощи различных вариантов высокоэффективной жидкостной хроматографии проводить анализ содержания синтетических аналогов пнркмидшшеых оснований и нуклео-зидов в сложных смесях. Цри помощи разработанных методик совместно с Институтом проблем оакологйи была изучена Фармакокинэтика 6-аза-

цитидина при различных способах введения препарата в кровяное русло. Найдена модель, адекватно описывающая изменение концентрации препарата в крови, расчитаны фарглкокинет^.ческие параметры.

вывода

1. Получены спектральные характеристики и установлены оптимальные спектральные области детектирования ряда пиримидиновых и три-азиновых оснований и нуклеозидов.

2. Определены константы ионизации 5-азацитидина и 6-азапроизводных пиримидиновых оснований и нуклеозидов и Ара-С.

3. Определены параметры удерживания и селективности разделения пиримидиновых оснований и нуклеозидов и юс б-аза-производных на С„, С8 , С18 и фенильном сорбентах. Показано, что наиболее высокая селективность разделения этих соединений достигается на окгадецияьном сорбенте.

4. В рамках сольвофобной теории удерживания веществ на гидрофобной поверхности определены вклады в изменение свободной энергии сорбции соединений при различных изменениях структуры молекул оснований и нуклеозидов, определены пловвди взаимодействий пиримидиновых и три-азшовых оснований и нуклеозидов с октадецильным сорбентом. Шказано, что переход оснований и нуклеозидов из молекулярной в ионную форму соответствует изменению свободной анергии сорбции соединений на окгадецильном сорбенте на 2-4 кДж/моль.

б. Определены оптимальные условия полного разделения сложных смесей природных и б-азапронзводных нуклеозидов и нуклеиновых оснований в условиях обращанно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии.

6. Проведено изучение влияния состава подвижной фазы на хроматог-рафичесное поведение N4 - и О' - вамешрнных б-азацитидина. Оценены величины изменения свободной энергии сорбции при введении различных заместителей в N4 - и О'-положения. Определены условия для оптимального разделения N4 - и О * -замещенных в условиях ОФ ВЭЖХ.

7. Исследована влияние температуры на удерживание природных и б-аэа-прогаводных пиримидиновых нуклеозидов и оснований в ОФ ВЭЖХ. Определены величины энталыши сорбции этих соединений на октадецильном сорбенте, а также вкладов (д Н ) и (дБ ) в относительное изменение свободной энергии сорбции. Установлено, что параметры линейной зависимости между д ( д Н) и д(д 3 ) ( компенсационный эффект) Оливки параметрам вависимости, характерной для реакций комплексо-обрааования.

В. Исследовано влияние содержания конов додецшюулйфэта, кислотно-с!и подвижной фазы, присутствия хлорида натрия и ацэтонитрида в ПЗ на хроматографическш поведение пиримндшшвых оснований и нуклэози-дов. Установлено, что в ион-парной варианте ОФ ВЗЖС в отличие от обычной ОФ ВЗЖХ, нуклэоэиды обладают меньшим удерживанием, чем соответствуете основания. Проведено сравнаниз селегаивности в ИП и ОФ ВЗКХ. Установлено, что при переходе от нуклеоэзда к основанию изменение свободной энергии сорбции в ОФ ВЭЯХ превышает соответствующе значения для ИП О® ВЭ2Х. Ион-парная система обладает большей селекпшюстьп для разделения пириыидиновых и триазиновых оснований и нуклеозидов, чей обраг«знно-фааовая. Определен оптимальный состав подвижной фазы для разделения сложных смесей пиришдияоашс и триази-новых оснований и нуклеозидов.

9. Исследовано влияние кислотности и ионной силы ПЗ на удерживание 6-ааапроиаводнызс нуклеозидов в условиях ионообменной хроматографии.

10. Проведено исследование хро мат о г рафичз с ко г о поведения энэлтш-ыэров виллардина - (урацшшл- -) - оС -аланкна в условиях ли-гандообменной хроматографии. Определены условия для оптимального разделения энагшшров этого соединения.

11. Разработаны штоды, позволяющие контролировать чистоту исходных и конечного продуктов в условиях ионообменной и обралрнпо-фазозой хроматографии при синтезе противоопухолевого препарата 6-азацитидин .

12. Разработан метод определения противоопухолевого препарата 6-ааацитвдин в крови.

13. Разработан метод определения а крови противоопухолевых препаратов 8-азацитвдина, Ара-С и продуктов их мэтаболизз при совместном присутствии.

Основное содержание работы отражено в публикациях:

1. Галушко C.B., Шишкина И.П., Усатенко НИ., Алексеева И.В. Контроль синтеза б-азацитидина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. ИМ - 1985.- Т. 40 N5. -0. 926-930.

2. Qalushko S. V., Shishkina I. P. Reversed-Phases Ion-Paired HPLC Determination оГ 6-azacytidine in Blood.// J.Chromatogr.-1985.-V. 345.-P. 157-1Б1.

3. Галушко С. E , Вулкина 3. E , Шишкина И. П., Исследование фармака- . кинетики б-азацитидика. // Хим. -фарм. журнал. -i9S6. -Т. 11. -С. 13021305.

А. (Еаршкокинетика В-ааацитвдина в крови здоровых животных. 3. Е Бул-кина, С. И. Галушко, Е А. Петруша, 31 а Шишкина. Материалы Всесоюзного симпозиума "Количественные аспекты химических воздействий в онкологии. " Ленинград. 1985. С. 27-28.

Б. Галушки С. Е , Шишкина ЯIL , Шлипенко А. Т. Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография аномальных противоопухолевых нуклеозмдов. // MX -1987. -Т. 42, ИЗ. -С. 1684-1690.

6. Galushko S. V., Shishislna I. P., Pilipenko A. Т. Reversed-Phass HPLC of Pyrimidtne Bases and Nucleosides. Application of Sol-vophobio Theory. // J. Chraratogr. -1988. -V. 445. -P. 59-70.

7, Галушко С. E , Шишкина И. П., Шлипенко А. Т. Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография пиримидиновых оснований. //ШАХ -1989. -Т. 44, N5. -С. 923-927.

0. Галушко С. Е , Штша Я. Е , Шлипенко А. Г. ИЬя-парная обращрн-на-фазовая высокоэффективная г.щкостная хроматография некоторых природных и дадифицированных пиримидиновых оснований и нуклеози-0 дов. // КАХ - Т. 44., N 6. -С. 1094-1099.

9. Галутазд С. Е, Шишкина И. Е Обраиртю-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография Н4 и 0*-производных б-азацитидина.// IAX- 1990.-T. 45, N5. -С. 984-989.

10. Галудао С. Е , Шишкина И. Е Определение противоопухолевых соединений арабиюзянцитозина, б-азацитидина и продуктов их дезамшшро-вания в крови при помощи ЕЗЖХ // Хим. -Фарм. Щррнал. -1990. -Т. 1. -С.В5-86.

11. Галушко С. Е, Шиакина Й.Е Сравнение взаимодействия с гидрофобной поверхностью природных и модифицированных оснований и нуклеози-дов.// Материалы VIII Всесоюзного симпозиума йо целенаправленному изысканию лекарственных веществ. йоююяенты нуклеиновых кислот. Рига. 198Э. С. ВЗ.

12. Разделение анантиомеров виллардияа методом лигаядообмевной хроматографии. С. Е Галушко, И. П. Шишкина, А. Т. Шлипенко,. Л. Е Прикавчи-кова. П Ш. -1988. -Т. 43, N9. -С. 1719-1721.