Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Энантиоселективные сорбенты с иммобилизованными макроциклическими гликопептидными антибиотиками

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Энантиоселективные сорбенты с иммобилизованными макроциклическими гликопептидными антибиотиками"

На правахрукопит

КУЗНЕЦОВ МИХАИЛ АЛЕКСАНДРОВИЧ

ЭНАНТИОСЕЛЕКТИВНЫЕ СОРБЕНТЫ С ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ МАКРОЦИКЛИЧЕСКИМИ ГЛИКОПЕПТИДНЫМИ АНТИБИОТКАМИ

03 00 23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

0034452 Ю

Москва - 2008

003445210

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета им М В Ломоносова

Научный руководитель

доктор химических наук, Староверов С М

Официальные оппоненты

доктор химических наук, профессор Ямсков И А доктор химических наук, Курганов А А

Институт физической химии и электрохимии им А H Фрумкина РАН,

диссертационного совета Д 501 001 59 по химическим наукам при Московском государственном университете им MB Ломоносова по адресу 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им M В Ломоносова

Автореферат разослан H апреля 2008 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

Ведущая организация

Москва

Защита состоится «ùf » jA&Jt 2008 года в

часов на заседании

кандидат химических наук

Сакодынская И К

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Одной из фундаментальных особенностей живой материи является оптическая молекулярная асимметрия главнейших компонентов организмов - белков и нуклеиновых кислот Определяя пространственную структуру этих основных биологических полимеров, она играет важную роль в специфичности действия ферментов и, таким образом, в основных реакциях живых систем

Бурное развитие биохимических исследований, возросшие требования Всемирной организации здравоохранения к оптической чистоте лекарственных препаратов и широкие возможности современной органической химии требуют разработки методов получения оптически чистых соединений Высокоэффективная жидкостная хроматография является мощнейшим инструментом решения задач аналитического контроля энантиомерного состава хиральных соединений и препаративного получения индивидуальных энантиомеров различных классов соединений Хроматографическое разделение энантиомеров принципиально возможно только в системах, содержащих хиральный селектор, способный различать пространственную конфигурацию оптических антиподов В связи с этим интерес к получению новых хиральных селекторов огромен

Отсутствие универсальных хиральных фаз для разделения оптических изомеров стимулирует разработку новых сорбентов Иммобилизованные макроциклические гликопептидные антибиотики, к которым относятся ванкомицин, тейкопланин, ристоцетин А, авопарцин и др, успешно зарекомендовали себя в качестве хиральных фаз для ВЭЖХ большого круга оптических изомеров лекарственных препаратов Высокая энантиоселективность этого класса сорбентов связана с наличием в их структуре различных по строению фрагментов, способных к многоточечным взаимодействиям с разделяемыми соединениями, как в полярных, так и неполярных растворителях Дополнительные возможности по изменению энантиоселективности этого класса сорбентов могут быть достигнуты путем иммобилизации новых антибиотиков, химическим изменением их структуры или оптимизацией методов иммобилизации

Актуальна проблема разделения аминокислот и их производных, так как они входят в состав белков в организме человека и играют большую роль в процессах питания Определение и разделение оптических изомеров фармацевтических препаратов профенов и Р-блокаторов необходимо вследствие их различного фармакологического действия в биологических системах

Цель работы заключалась в разработке группы новых хиральных селекторов на основе нового отечественного макроциклического гликопептидного антибиотика эремомицина, способа их иммобилизации на силикагеле, изучении хроматографических и энантиоселективных свойств

полученных сорбентов Для достижения этой цели были решены следующие задачи

- разработаны методики препаративного выделения новых хиральных селекторов на основе нового отечественного макроциклического гликопептидного антибиотика эремомицина,

- разработан метод иммобилизации макроциклических антибиотиков и селекторов, полученных на их основе, на силикагеле для получения хиральных ВЭЖХ сорбентов,

- разработан метод получения гибридного сорбента с иммобилизованным комплексом макроциклического гликопептидного антибиотика эремомицина и хирального полианилина, полученного в присутствии фермента - лакказы,

комплексом физико-химических методов изучена структура иммобилизованных на силикагеле хиральных селекторов

проведено систематическое изучение хроматографических и энантиоселективных свойств полученных сорбентов при разделении энантиомеров а- и Р-аминокислот и их производных, профенов и Р-блокаторов,

- изучены изотермы адсорбции L- и D-метионина на сорбенте с иммобилизованным эремомицином и продемонстрированы возможности применения данного сорбента для препаративного разделения энантиомеров метионина методом «симулированного движения стационарной фазы» (SMB -simulated moving bed)

Научная новизна Разработаны новые хиральные селекторы на основе гликопептидного антибиотика эремомицина Разработан и оптимизирован метод иммобилизации хиральных селекторов гликопептидной природы на силикагеле Получены новые хиральные ВЭЖХ сорбенты с иммобилизованным эремомицином, его производными, а также комплекса эремомицина с хиральным полианилином

Проведено систематическое изучение хроматографических и энантиоселективных свойств полученных ВЭЖХ сорбентов в разделении энантиомеров а- и р-аминокислот, профенов и p-блокаторов Изучены зависимости удерживания и энантиоселективности разделения энантиомеров аминокислот от структуры сорбата, значения рН элюента, концентрации органического растворителя в подвижной фазе и температуры

По изотермам адсорбции индивидуальных энантиомеров метионина оценены вклады в удерживание энантиоселективных и неселективных сайтов молекулы эремомицина, что позволило рассчитать и экспериментально подтвердить возможность использования данного сорбента в препаративных разделениях рацемических смесей методом SMB

Практическая значимость. Предложен простой метод иммобилизации селекторов гликопептидной природы на силикагеле, отличающийся проведением прививки из водно-органических смесей, при комнатной температуре Найдены условия разделения большого числа энантиомеров

различных классов соединений, в том числе и лекарственных препаратов, в условиях обращено-фазового и полярно-ионного режима ВЭЖХ

Хроматографические колонки, заполненные разработанными сорбентами, внедрены в производство и выпускаются предприятием ЗАО «БиоХимМак СТ»

На защиту выносятся следующие положения:

1 Метод иммобилизации хиральных селекторов на основе макроциклических гликопептидных антибиотиков на силикагеле

2 Методики получения и препаративного выделения дезэремозаминил-эремомицина, эремозаминилагликона эремомицина и полного агликона эремомицина

3 Метод получения гибридного сорбента на основе макроциклического гликопептидного антибиотика эремомицина и хирального полианилина

4 Закономерности удерживания и энантиоразделения энантиомеров аминокислот от структуры сорбата, значения рН элюента, концентрации органического растворителя в подвижной фазе и температуры, а также структуры хирального селектора

5 Данные по разделению энантиомеров профенов и (3-блокаторов и зависимости энантиоразделения от структуры хирального селектора

6 Данные по расчету изотерм адсорбции оптических изомеров метионина на сорбенте с иммобилизованным эремомицином и препаративному разделению энантиомеров метионина методом SMB

Апробация работы Результаты работы докладывались на следующих конференциях и симпозиумах Всероссийский симпозиум «Хроматография и хроматографические приборы» Москва 2004 15 - 19 марта, Международная конференция «Физико-химические основы новейших технологий XXI века» Москва 2005 30 мая - 4 июня, Всероссийская конференция «Теория и практика хроматографии Применение в нефтехимии» Самара 2005 3 -8 июля, 1st South East European Congress of Chemical Engineering Belgrade Serbia 2005 September 25 - 28, II Российский симпозиум по химии и биологии пептидов Санкт-Петербург 2005 6 - 8 июня, X Международная конференция «Теоретические проблемы химии поверхности, адсорбции и хроматографии» Москва 2006 24 - 28 апреля, Всероссийский симпозиум «Хроматография в химическом анализе и физико-химических исследованиях» Москва 2007 23 -27 апреля

Публикации По материалам диссертации опубликовано 6 статей и 7 тезисов докладов, получено 3 патента на изобретения

Патент на сорбент с иммобилизованным эремомицином получил золотую медаль на 59-й международной выставке «Идеи - изобретения - инновации», Нюрнберг, Германия, 2007

Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, 6 глав обсуждения результатов, общих

выводов, списка цитируемой литературы и приложения Материал диссертации изложен на 131 странице машинописного текста, содержит 51 рисунок и 19 таблиц, в списке цитируемой литературы 122 наименования

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Анализ литературных данных по исследованию энантиоселективности достаточно широкого круга сорбентов с иммобилизованными макроциклическими гликопептидными антибиотиками показывает существенное различие их хроматографических свойств Среди наиболее селективных, необходимо отметить сорбенты с привитыми тейкопланином и его агликоном, ристомицином и ванкомицином Значительное влияние на энантиоселективность способен оказывать способ и условия иммобилизации, а также длина и природа «спейсера», связывающего селектор с носителем

В связи с этими в работе была поставлена задача сравнить, разрабатываемый нами способ иммобилизации, с известными на примере изученных селекторов, в качестве которых, мы выбрали ванкомицин и ристомицин А

Даже незначительное изменение структуры хирального селектора может приводить к значительному изменению энантиоселективных свойств хиральной неподвижной фазы Это определило интерес изучить не только характеристики нового хирального селектора на основе отечественного гликопептидного антибиотика эремомицина, но и исследовать возможность создания на его основе группы селекторов, отличающихся по энантиоселективности

Существенно, что структура эремомицина наиболее близка к структуре ванкомицина, а уже первые исследования показали, что в отличие от ванкомицина, эремомицин проявляет высокую селективность к энантиомерам аминокислот

он но он но

Рис 1. Структуры ванкомицина (слева) и эремомицина

Сопоставление структур ванкомицина и эремомицина (рис 1) показывает, что основные структурные отличия сосредоточены в левом

* Эти сорбенты разрабатываются группой Д В Армстронга, начиная с 1994 г

макроцикле и его углеводном окружении Поэтому задача получения гликозидов и агликона эремомицина представлялась особенно существенной

Получение и очистка гликозидов и агликона эремомицина В связи с изложенным выше, была поставлена задача разработать удобный метод селективного отщепления моносахаридов от молекулы эремомицина и разработать препаративный хроматографический метод выделения и очистки гликозидов и агликона эремомицина в соответствии со схемой, представленной на рисунке 2

Эрсмомицин

■чА 'ч-1 О.О } ^ X / I'

; 1 I • » Т » I

" —I ° " ^ „"

I

Дезэрсмозаминилэрсмомицин

н2ч л__.сн1

О'ДАА "Дд

г

Эремозаминилагликон эремомицина

УД/'^Х""

АЛД^/Д^

о Н Г о н

А1ЛИЮН эремомицина

Рис. 2. Схема модификации эремомицинового селектора

Нами оптимизирован метод, основанный на гидролизе эремомицина соляной кислотой Снижение температуры обработки и увеличение времени гидролиза (0 2 н соляная кислота, 70°С, 40 мин) позволяют получить дезэремозаминилэремомицин с высоким выходом, практически свободный от побочных продуктов Для получения эремозаминилагликона и полного агликона эремомицина оптимальным является выдерживание эремомицина в концентрированной НС1 на холоду при 4°С (4 ч) Очистку полученных продуктов проводили методом ВЭЖХ на колонке Диасорб-130-С16Т, 10 мкм, 24^250 мм (ЗАО «БиоХимМак СТ») По данным ВЭЖХ, полученные гликозиды и агликон эремомицина имели чистоту 92 - 95% Структура всех выделенных продуктов доказана методом масс-спектроскопии

* Антибиотик эремомицин предоставлен проф Г С Катрухой (НИИ по изысканию новых антибиотков им Г Ф Гаузе РАМН)

Иммобилизация хиральных селекторов на силикагеле В настоящей части работы была поставлена задача разработки общего, простого и эффективного метода иммобилизации антибиотиков гликопептидной природы, обеспечивающего высокую плотность прививки селекторов Из ряда изученных нами методов был выбран и оптимизирован способ с использованием эпокси-активированного силикагеля (рис 3), с проведением иммобилизации в водно-органических средах при комнатной температуре (рН 8 5, 150 ч), что обеспечивает сохранение структуры антибиотика, исходя из известных его химических свойств

OSi—(СН2)3-0-СН2—СН-СН2 + NHR-A -

-^Х— OSi—(СН2)з— О— СН2— СН— СН2— NR— А

^ I ОН

Рис 3 Схема иммобилизации гликопептидных антибиотиков (R = Н или СН3)

Максимальная плотность прививки соответствует 0 3 мкмоль эремомицина на 1 м2 поверхности силикагеля с диаметром пор 10 нм Увеличение диаметра пор носителя приводит к увеличению плотности прививки, достигая 0 78 мкмоль/м2 для носителя с диаметром пор 30 нм

Эти данные свидетельствуют о том, что в порах диаметром менее 30 нм молекулы эремомицина испытывают стерические затруднения при иммобилизации Это может влиять на конформацию закрепленного селектора, а, следовательно, и на энантиоселективность

Получение гибридного сорбента с иммобилизованным эремомицином, модифицированным хиральным полианилином .

В настоящей части работы была поставлена цель совместить в гибридном хиральном селекторе наиболее перспективные к настоящему времени классы селекторов - хиральный полимер и гликопептидный антибиотик, что существенно может расширить возможности нового сорбента

Нами реализован подход и разработан метод синтеза полианилина непосредственно на поверхности сорбента в процессе протекания ферментативной полимеризации мономера В реакционную смесь, содержащую анилин и S-сульфокамфорную кислоту, добавляли сорбент с иммобилизованным эремомицином и лакказу для инициации процесса полимеризации Увеличение содержания углерода в привитом слое сорбента соответствует прививке двух элементарных звеньев хирального полианилина (4 молекулы анилина) на одну иммобилизованную молекулу эремомицина

* Эта часть работы проведена совместно с проф А И Ярополовым (Институт биохимии им А Н Баха РАН) в рамках государственного проекта № 02 467/11/3004

Характеристики синтезированных в работе сорбентов приведены в таблице 1 Из таблицы видно, что метод показывает высокую воспроизводимость (сорбенты №№ 1-4, табл 1) Молекула эремомицина имеет три аминогруппы, способные участвовать в процессе иммобилизации Представляло интерес получить информацию об основном направлении реакции прививки, так как место закрепления молекулы хирального селектора может существенно влиять на стерическую доступность различных хиральных сайтов эремомицина для разделяемых энантиомеров

Табл 1 Характеристики синтезированных в работе сорбентов

Плотность

№ Матрица Селектор иммобилизации

ммоль/г мкчоль/м

1 Кгоша81], 11 нм, 5 мкм Эремомицин 0,069 0,29

2 Кгоггсш!, 11 нм, 5 мкм Эремомицин 0,072 0,31

3 Кготаз11, 11 нм, 7 мкм Эремомицин 0,074 0,30

4 ЕигоэрИег, 11 нм, 15 мкм Эремомицин 0,072 0,28

5 Кгота811, 6 нм, 5 мкм Эремомицин 0,088 0,23

6 Кгота511, 20 нм, 5 мкм Эремомицин 0,077 0,49

7 Кгота$11, 30 нм, 5 мкм Эремомицин 0,069 0,78

8 Кгоггцш1, 11 нм, 5 мкм Дезэремозаминилэремомицин 0,015 0,05

9 Кгошаз11, 11 нм, 5 мкм Эремозаминилагликон эремомицина 0,05 0,19

10 Кгоша511, 11 нм, 5 мкм Агликон эремомицина 0,043 0,15

11 КСК-Г, 130 А, 6 мкм Ванкомицин 0,039 0,17

12 Кгота$11, 11 нм, 5 мкм Ристомицин А 0,054 0,23

13 Кгота511, 11 нм, 5 мкм Ванкомицин 0,049 0,19

14 Кготав!!, 11 нм, 5 мкм Эремомицин/Полианилин* 0,07/0,28 0,3/1,2

* в расчете на элементарное звено анилина

Физико-химические исследования полученных хиральных неподвижных фаз Традиционные физико-химические методы исследования, как правило, малоинформативны в случае изучения соединений закрепленных на силикагеле, вследствие значительного фонового влияния матрицы Только совокупность ряда методов может дать представление об особенностях закрепления привитых молекул

Спектроскопия диффузного отражения комплексов с тетрацианохинодиметаном

Одним из немногих методов, позволяющих определить присутствие на поверхности первичных, вторичных или третичных аминогрупп является метод, основанный на изучении спектров диффузного отражения комплексов аминогрупп с тетрацианохинодиметаном

Полученные нами спектры (рис 4) имеют значительные уширения, что не позволяет точно определить каким образом эремомицин прививается к поверхности Однако, все три сорбента имеют максимумы в области,

отвечающей за взаимодействие третичной аминогруппы с ТЦХДМ, что свидетельствует о том, что иммобилизация идет через вторичную аминогруппу эремомицина

Длина волны X, нм

Рис 4 Спектры диффузного отражения сорбентов с иммобилизованными эремомицином (сплошная линия), эремозаминилагликоном эремомицина (пунктирная линия) и полным агликоном эремомицина (прерывистая линия)

Эчектронная спектроскопия для химического анализа (ЭСХА)

Метод рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии (РФЭС) основан на явлении фотоэффекта и на том факте, что каждый атом имеет практически не совпадающие с другими атомами энергетические уровни Сдвиги в спектре атомов отражают изменение состояния атомов.

На рис 5 приведены спектры азота исследованных образцов Из рисунка видно, что правая ветвь спектра азота, отвечающая за состояние вторичной аминогруппы, для иммобилизованных селекторов одинакова и сдвинута вправо, относительно правой ветви спектра азота свободного эремомицина Это свидетельствует о том, что вторичная аминогруппа переходит в третичную и, следовательно, иммобилизация идет через взаимодействие вторичной аминогруппы селектора с эпокси-группой активированного силикагеля В левой части спектра картина более сложная Однозначно можно сказать о том, что обе первичные аминогруппы эремомицина не затрагиваются при прививке, так как левая ветвь спектра азота (отвечает за состояние первичных аминогрупп) исходного и иммобилизованного эремомицина абсолютно одинаковы Для полного агликона левая ветвь сильно сдвинута вправо, так как обе первичные

* Спектры получены А В Наумкиным (Институт элементоорганических соединений имени А Н Несмеянова РАН)

аминогруппы отсутствуют. На спектре азота силикагеля с иммобилизованным эремозаминилагликоном эремомицина также виден сдвиг вправо левой ветви, который обязан был наблюдаться, так как у этого селектора на одну первичную аминогруппу меньше, чем у эремомицина. Поэтому, однозначно сказать нельзя происходит ли взаимодействие первичной аминогруппы селектора с эпокси-группами при иммобилизации.

405 400 395

Энергия связи, эВ

Рис. 5. Сравниение спектров азота для эремомицина (черные точки) и иммобилизованных на силикагеле эремомицина (светлые точки), эремозаминилаагликона эремомицина (пуктирная линия) и полного агликона эремомицина (сплошная линия)

Таким образом, на основе проведенных физико-химических экспериментов можно с большой долей уверенности утверждать, что основной группой, участвующей в иммобилизации эремомицина, является вторичная аминогруппа.

Изучение полученных сорбентов в разделении оптических изомеров.

Разделение энантиомеров аминокислот. Основным классом объектов, изученных в разделении энантиомеров, стали а-ами но кислоты. Первоначально разделение их энантиомеров было изучено в 9 подвижных фазах обращенно-фазового состава на сорбенте с иммобилизованным эремомицином. Найдены условия разделения оптических изомеров практически для всех исследованных аминокислот (табл.2). Проведено систематическое изучение разделения энантиомеров аминокислот на разработанных сорбентах, изучены зависимости энантиоселективности разделения в зависимости от структуры аминокислот, температуры, рН и состава подвижной фазы. Показано, что метанол

содержащие элюенты обеспечивают более высокую энантиоселективность в сравнении с элюентами на основе ацетонитрила

Время удерживания, ш

Время удерживания, мин

Рис.6 Хроматограммы разделения энантиомеров ОЬ-ДОФА (слева) и ОЬ-метионина

Селективность разделения энантиомеров аминокислот падает в ряду циклические аминокислоты -ароматические и гидрофобные аминокислоты - аминокислоты с

кислыми и

функциональными боковой цепи хроматограмм

основными группами в Примеры разделения БЬ-

энантиомеров БЬ-ДОФА и метионина приведены на рис 6

Значение рН элюента определяет ионное состояние аминокислот и молекулы привитого антибиотика Присутствие

диссоциированных карбоксильных групп положительно сказывается на селективности разделения, и, наоборот, появление

депротонированных аминогрупп

подавляет

энантиомеров

концентрации

подвижной

увеличению

энантиомеров

указывает в

Табл 2 Значения энантиоселективности (а) разделения энантиомеров а-аминокислот на сорбенте с иммобилизованным эремомицином Элюенты

20% СН3ОН - 80% №Н2Р04 (0 1М), 'бО%СН3ОН - 40% СНзСООНЛу (рН 3,8), 'С1Ь0Н-Н20(1 1), 340% СНзОН - 60% Н20

распознавание Увеличение метанола в фазе приводит к удерживания обоих (рис 7А), что данном случае на

Соединение а

ОЬ-трнптофап1 2 33

Г)Ь-тирошн2 5 05

ВЬ-.м-фтортнрошн 3 11

ОЬ-фенилаланин 4 33

ОЬ-ДОФА3 2 63

ОЬ-фенилглицин2 3 09

1)Ь-(2-тиенил)-алаш1н 2 75

ОЬ-четионин 221

ОЬ-аланин 2 86

ОЬ-валин 3 29

ОЬ-норвалин 3 32

ОЬ-норлейцин 2 00

ОЬ-цитрулин1 1 63

ЭЬ-серин 1 50

ОЬ-треонин 1 35

ОЬ-а-аминомасляная кислота2 3 39

ОЬ-цистеин2 2 02

ОЬ-лизин2 1 58

ОЬ-пролин2 7 94

ОЬ-пипеколиновая кислота2 110

реализацию Н11ЛС-1ЕС механизма за счет гидрофильных и ионных взаимодействий При снижении температуры хроматографического эксперимента, происходит усиление взаимодействий сорбатов с привитым слоем, а различные конформации селектора становятся более жесткими, что проявляется в увеличении энантиоселективности разделения (рис 7Б)

Содержание метанола об %

Температура С

Рис 7 Зависимость удерживания оптических изомеров метионина къ (•), ко (V), энантиоселективности разделения а (■) и разрешения и (О) на сорбенте с иммобилизованным эремомицином от значения концентрации метанола в элюеите (А) и от температуры колонки (Б) Элюенты А-0 1ММаН:Р04 с переменным содержанием метанола, Б - 20% СН3ОН - 80% 0 1М НаН2Р04

Разработанный нами способ иммобилизации макроциклических гликопептидных антбиотиков существенно отличается от описанных в литературе Сравнение энантиоселективности сорбента, полученного нашим методом иммобилизацией известного селектора ристомицина А, с аналогичным, выпускаемым под маркой ОжоЬюИс Я, показало, существенное увеличение значений селективности (табл 3) Это свидетельствует о том, что разработанный нами метод иммобилизации гликопептидных антибиотиков не уступает, а во многих случаях превосходит способ, описанный в литературе

Табл 3 Влияние способа иммобилизации на характеристики сорбентов 1 - сорбент,

Соединение Ристомицин А1 Ристомицин А

а а Ъ

ДОФА 2 50 5 И 1 33 1 4

тирозин 2 66 4 50 1 30 1 52

триптофан 2 03 4 65 1 23 1 55

фенилглицин 3 78 8 25 1 23 1 52

аспарагин 1 53 2 35 1 17 1 56

метиошш 2 13 4 22 1 15 1 52

а-амнномасляная кислота 1 30 1 42 1 26 1 56

цнстенн 1 34 1 54 1 18 1 4

лейцнн 5 88 8 30 1 15 1 45

валин 3 48 5 58 1 23 1 55

норвалин 3 08 4 80 1 25 1 58

алаини 2 56 3 15 1 14 1 45

На рис 8 приведено сравнение разрешающей способности колонки с эремомицином в сравнении с промышленно выпускаемыми аналогами,

демонстрирующее преимущества разработанного сорбента

к

12 -,

О J-,-1-1-,-1-,-1-1-1-

Ser Leu Met Trp Ala Val Phe Pro Туг

Рис 8 Сравнение разрешающей способности в разделении энантиомеров аминокислот сорбента с иммобилизованным эремомицином (1) и промышленно выпускаемыми аналогами Chirobiotic TAG (2), Chirobiotic R (3), Chirobiotic T (4)

Известно, что незначительное изменение структуры хирального селектора зачастую значительно изменяют энантиоселективность получаемого сорбента Полученные результаты по разделению энантиомеров аминокислот на сорбентах, содержащих дезэремозаминилэремомицин, а также эремозаминил- и полный агликоны эремомицина показали, что сахарные остатки играют очень важную роль в хиральном распознавании энантиомеров аминокислот Однако, для различных аминокислот это влияние различно

Табл 4 Значения факторов удерживания (к^кв) , энантиоселективности (а) и разрешающей способности (R<¡) на сорбентах с иммобилизованными эремомицином и его эремозаминилагликоном Элюент метанол - вода (1 1)

Селекторы Эремомицин Эремозаминилагликон эремомицина

Аминокислота к, к» а Äs А, ко а Я?

Алании 0 26 0 62 2 37 2 94 0 14 0 39 2 78 2 95

Валин 0 20 0 67 3 35 4 09 0 09 0 53 5 89 4 58

Лейцин 0 22 0 56 2 54 3 64 0 27 0 99 3 48 5 20

Норвалин 0 26 0 69 2 65 3 76 0 22 0 99 4 50 6 34

Пролин 0 47 3 73 7 94 7 75 0 27 1 52 5 63 4 40

Метионин 0 28 0 62 2 21 4 60 0 14 0 62 4 43 661

Триптофан 2 47 4 28 1 73 4 86 231 2 61 1 13 0 95

Тирозин 0 71 3 36 4 73 10 97 0 90 0 96 1 07 0 45

л<-Фтортирозин 0 84 2 61 3 11 6 87 0 83 0 88 1 06 0 47

ДОФА 1 02 4 26 4 17 10 67 0 89 1 20 1 35 2 22

Фенилалашш 0 55 2 38 4 33 6 64 0 57 0 80 1 40 1 57

Так, удаление дисахаридной ветви эремомицина приводит к улучшению разделения энантиомеров аминокислот с неароматическим боковым радикалом и к ухудшению разделения ароматических аминокислот (табл 4) вплоть до полного исчезновения энантиоселективности в разделении энантиомеров фенилаланина на сорбенте с полным агликоном эремомицина (табл 5)

Табл 5 Значения факторов удерживания (к/, к„) , энантиоселективности (а) и разрешающей способности на сорбентах с иммобилизованными селекторами

дезэремозаминнлэремомицином и полным агликоном эремомицина Элюент метанол - вода

(1 О

Селекторы Дезэремозаминилремомицнн Агликои эремомицина

Аминокислота к, Ал а кг А„ а Й9

Метиошш 0 20 0 26 1 30 0 56 0 09 0 17 1 88 1 63

Триптофан 0 92 1 17 1 27 1 43 0 93 1 10 1 18 1 45

Тирозин 0 36 0 73 2 03 2 76 0 26 0 30 1 15 0 56

л|-Фтортнрозин 0 38 0 56 1 47 1 40 0 28 0 32 1 14 0 53

ДОФА 0 43 0 81 1 88 2 33 0 26 0 30 1 15 0 59

Фенилаланин 0 36 061 1 69 1 83 0 33 0 33 1 0

Этот эксперимент позволил сделать предположение о возможном механизме хирального распознавания ароматических аминокислот В программе НурегСЬет 5 0 оптимизирована по минимуму потенциальной эненргии структура эремомицина, рассчитаны расстояния между гидроксильной и аминогруппой эремозаминовых остатков, которое совпало с расстоянием между карбоксильной и аминогруппой аминокислоты Первичное электростатическое взаимодействие, по-видимому, происходит между аминогруппой эремозамина и карбоксильной группой аминокислоты, затем образуется водородная связь между аминогруппой аминокислоты и гидроксильной группой эремозамина В результате такого взаимодействия ароматический боковой радикал направлен либо внутрь молекулы и образует ля-связи с ароматическими кольцами, либо наружу и таких связей не образует -это зависит от пространственной конфигурации энантиомера Хиральное распознавание является суперпозицией таких взаимодействий

Для большинства исследованных аминокислот в результате дополнительной модификации эремомицина хиральным полианилином энантиоселективность увеличилась По-видимому, это привело к образованию новых сайтов или модифицированию существующих, обеспечивающих повышение энантиоселективности в отношении энантиомеров аминокислот

Оптически активные Р-аминокислоты являются в последнее время перспективным классов интермедиатов для промышленного синтеза антибиотиков и других лекарственных препаратов

Табл 6 Результаты разделения энантиомеров Р-фенилалнина и его производных на сорбентах с иммобилизованным эремомицином и его эремозаминилагликоном Элюент 20% - метанол- 80% №Н2Р04 0 1М, 0 7 мл/мин_

Селекторы Эремомицин Эремозамииилагликон эремомицина

Аминокислота к, к2 а д? к, к2 а л?

Р~фенилаланин 0 63 1 04 1 65 2 47 0 54 0 58 1 07 0 30

4К-р-фсш1лаланин 0 42 0 67 1 59 1 80 0 48 0 64 1 33 1 51

ЗЬ'-Р-фепилаланип 0 60 0 73 1 22 0 97 0 47 0 62 1 32 1 56

2Р-Р-феиилаланин 0 53 0 62 1 30 1 21 0 48 0 66 1 37 I 98

3,4С1-р-фенилалаиин 1 76 2 28 1 29 1 81 1 55 2 25 1 45 3 44

ЗС1-р-фенилаланин 091 1 13 1 24 1 28 081 1 11 1 37 2 55

2С1-Р-фенилаланин 1 21 1 50 1 24 1 46 0 83 1 31 1 58 3 46

ЗВг-Р-фенилаланип 1 19 1 45 1 22 1 19 1 03 1 42 1 37 2 36

ЗКОг-Р-феиилаллнин 1 10 1 51 1 37 1 98 0 94 1 32 1 40 2 79

4СРз-р-фенилаланин 0 72 0 72 1 00 0 00 0 68 1 04 1 53 2 87

4СРзО-Р-фенилаланин 0 66 0 66 1 00 0 00 0 67 0 95 1 42 2 15

Проведенные эксперименты по разделению энантиомеров производных Р-фенилаланина показали, что удаление дисахаридной ветви эремомицина приводит к более высоким значениям энантиоселективности разделения (табл 6)

Разделение энантиомеров Р-бчокаторов Р-Блокаторы - большая группа препаратов, основным свойством которых является способность обратимо блокировать Р-адренергические рецепторы Они широко используются в лечении сердечно-сосудистых заболеваний и круг их непрерывно расширяется Сорбент с иммобилизованным полным агликоном эремомицина единственный из изученных разделяет до базовой линии энантиомеры почти всех Р-блокаторов (табл 7)

Это позволяет сделать предположение о существенном вкладе освободившейся гидроксильной группы (в агликоне) в процессе хирального распознавания аминоспиртов и сделать предположение о возможном механизме хирального их распознавания

Для р-блокаторов главным распознающим сайтом селекторов выступает карбоксильная группа Она взаимодействует с аминогруппой Р-блокатора и затем происходит ориентация молекулы сорбата внутрь кармана с образованием л-л-связи между ароматическими кольцами В результате такой ориентации гидроксильная группа одного энантиомера направлена в сторону освободившейся после удаления эремозамина гидроксильной группы агликона и образует с последней водородную связь Для другого энантиомера эта группа

* Образцы производных р-фенилаланина предоставленны проф В К Швядасом (НИИ физико-химической биологии им А Н Белозерского МГУ

направлена в противоположную сторону и водородная связь не образуется, что приводит к хиральному распознаванию энантиомеров (3-блокаторов

Табл. 7 Хроматографические результаты по разделению энантиомеров р-блокаторов, полученные на сорбентах с иммобилизованными эремозамишшагликопом и полным агликоном эремомицина в элюенте метанол - 0 1 % триэтиламин - 0 1% уксусная кислота

Р-Блоклторы Эремозамнинлагликон эремомицина Агликон эремомицина

к, к2 а Я? к, к2 а

Салбутамол 0 08 0 16 2 00 1 14 0 80 091 1 14 1 29

Кленбутерол 0 09 0 16 1 78 1 09 0 84 0 96 1 14 1 59

Окспренолол 0 25 0 25 1 00 0 00 0 93 1 03 1 11 1 34

Алпренолол 0 15 0 19 1 27 0 55 0 95 1 10 1 16 1 73

Метопролол 0 17 0 22 1 29 0 57 1 06 1 21 1 14 1 82

Прометал ол 0 25 0 25 1 00 0 00 1 11 1 27 1 14 1 50

Пиндолол 0 28 0 34 1 21 0 56 1 18 1 33 1 13 1 61

Пропранолол 0 29 0 34 1 17 0 52 1 27 1 49 1 17 2 27

Соталол 031 0 39 1 26 0 88 1 43 1 63 1 14 1 92

Атенолол 0 80 0 80 1 00 0 00 1 86 2 09 1 12 1 77

Разделение энантиомеров профенов Разделение рацематов профенов изучали в водно-метанольных элюентах (обращенно-фазовый режим) и в полярно-ионном режиме с использованием в качестве элюента 100%-ного метанола с добавками триэтиламина и уксусной кислоты

——

] 15 20

МИН

и

Рис 9 Разделение энантиомеров ибупрофена (а, в), индопрофена (б) и фенопрофена (г) на колонках с привитым эремомицином (а-в) и эремозаминилагликоном эремомицина (г) Элюент 40%метанол - 60% О 1М фосфатный буфер, рН 6 5 (а, б) и 100% метанол с добавками 0 1% триэтиламина и 0 2% уксусной кислоты (в, г)

Анализ результатов свидетельствует о том, что среди изученных сорбентов оптимальным для разделения профенов является силикагель с привитым эремомицином

В обращеннно-фазовом режиме достигаются большие значения энантиоселективности и разрешения, однако в полярно-ионном варианте значительно меньше время анализа и лучше форма пиков (рис 9) Остальные сорбенты применимы лишь для разделения одного-двух сорбатов

Другие возможности разработанных сорбентов в разделении энантиомеров Помимо энантиомеров а- и Р-аминокислот, профенов и р-блокаторов проведено изучение возможности разделения рацематов дансил-производных аминокислот (табл 8 ) и решена задача аналитического контроля оптической чистоты синтетического мононуклеотида на разработанных хиральных селекторах

Тлбл 8 Результаты раделения дансил-производных а-аминокислот на сорбентах с

иммобилизованными эремомицином (Э) и его эремозаминил- (ЭА) и полным агликонами (А) в элюентах 100 %-метанол - 0 1 % триэтпламин - 0 1 % уксусная кислота (1) и 98 %-метанол - 1 % триэтиламин - 1 % уксусная кислота (2), 0 7 мл/мин__

Вещество селектор элюеит А, кг а Д*

Дансил-лейцнн Э 2 1 55 1 65 1 06 0 34

ЭА 1 32 42 1 31 1 69

А 1 0 84 1 43 1 70 1 94

Дансил-метионин Э 2 1 96 2 93 1 49 2 27

ЭА 1 441 7 38 1 67 3 34

2 0 74 1 08 1 46 1 19

А 1 1 41 2 55 1 81 2 55

2 0 62 0 74 1 19 061

Дансил-корлемцин Э 2 1 21 1 94 1 60 2 54

ЭА 1 2 65 3 51 1 32 1 63

А 1 0 34 0 75 2 20 2 27

Длнсил-фенилаланин Э 2 24 3 15 1 31 146

ЭА 1 7 79 8 14 1 04 0 29

А 1 1 47 1 96 1 33 1 49

Дансил-треонин Э 2 2 13 2 79 1 31 1 42

ЭА 1 4 24 7 14 1 68 2 96

2 0 83 1 09 1 31 0 92

А 1 1 15 2 55 2 22 3 04

2 0 62 0 73 1 18 I 25

Дансил-серии Э 2 2 61 4 26 1 63 271

ЭА 2 0 98 1 99 2 03 2 83

А 1 0 63 6 96 И 04 4 92

2 0 54 1 74 3 22 3 62

Дансил-валнн ЭА 1 2 04 3 18 1 56 22

А 1 1 21 1 42 1 17 09

Для разделения оптических изомеров этих соединений обращено-фазовый режим не подходит из-за сильного удерживания сорбатов на колонке в этих условиях Поэтому в качестве элюента использовали чистый метанол с добавками по 0 1% триэтиламина и уксусной кислоты

В более слабом полярно-органическом элюенте наилучшие разделения наблюдаются на сорбенте, содержащем полный агликон эремомицина (исключение дансил-валин) Однако, при увеличении содержания модификаторов элюента до 1% уже сорбент с эремомицином имеет наибольшие значения энантиоселективности, а эремозаминилагликон является предпочтительнее полного агликона для разделения оптических изомеров (исключение дансил-серин)

Одним из примеров использования полученных в работе сорбентов является разработка методики аналитического контроля энантиомерного состава получаемого химическим синтезом модифицированного мононуклеотида (рис 10), который последующей конденсацией образует

Благодаря своим физико-химическим и биологическим характеристикам ДНК-миметики нашли в настоящее время широкое применение в диагностике в качестве зондов, которые используются в микробиологии, цитогенетике, при создании биосенсоров и микрочипов В молекулярной биологии пептидно-нуклеиновые кислоты находят применение для выделения и очистки нуклеиновых кислот, специфического расщепления нуклеотидных последовательностей, определения генетических мутаций, Таким образом, аналитический контроль оптической чистоты синтетических мономеров такого

декамер пептидно-нуклеиновой кислоты - ДНК-миметика

о

Рис 10 Структура синтетического мононуклеотида, структурной единицы ДНК-миметика Звездочкой обозначен ассиметрический атом углерода

* Мононуклеотид предоставлен к х н Прохоровым Д И (кафедра биотехнологии Московской Государственной Академии тонкой химической технологии им М В Ломоносова)

ДНК-миметика является необходимой ступенью получения чистого продукта с контролируемыми свойствами

2 4 6 8 10 12 14 ерегул удер>ш ванна >11н

2 4 6 8 10 12 14 рремя удерживания, мин

2 4 6 8 10 12 14 Бремя удерем вания, шн

Рис. 11 Хроматограммы Ь-энантиомера (А), О-энантномера (Б) мононуклеотида и их искусственной смеси (В) Колонка 4^250 мм, сорбент с иммобилизованным эремомицином

Элюент 100 % метанол - 1 % триэтиламин - 1 % уксусная кислота, 0 7 мл/мин

В результате разработки методики контроля оптической чистоты мононуклеотида выяснилось, что как и для дансил-производных аминокислот, из-за сильного удерживания обращенно-фазовый вариант хроматографии не подходит для решения этой задачи Приемлемым является использование полярно-органического режима в элюенте 100 % метанол - 1 % триэтиламин -I % уксусная кислота, 0 7 мл/мин, на хиральной неподвижной фазе с иммобилизованным эремомицином

На рис 11 приведены хроматограммы Ь- и Э-энантиомеров данного мононуклкотида Видно что, данные оптические изомеры имеют различные времена удерживания, а целевой образец имеет 10%-ную примесь Б-антипода (рис ПА)

Изучение адсорбции Ь- и Э-Метионина на сорбенте с иммобилизованным эремомицином.

Препаративное разделение энантиомеров представляет исключительный интерес для изучения различия биологических свойств антиподов Наиболее

перспективной технологией препаративного разделения энантиомеров, является БМВ-процесс, обеспечивающий высокую производительность за счет возможности непрерывной подачи сырья

Расчет параметров 8МВ-процесса

9, =

аС,

1 +ЬС, 1+ ЬС, а,С а,С

' 1 + 6,С 1+ Ь2С Уравнения изотермы адсорбции

основывается на параметрах уравнения изотермы адсорбции обоих разделяемых энантиомеров

Нами изучены изотермы Ь- и О- метионина на сорбенте с привитым эремомицином и рассчитаны параметры (табл 9) двух уравнений адсорбции ЕСР-методом (расчет по тыловой десорбционной части перегруженного хроматографического пика)

Табл 9 Параметры уравнения изотермы адсорбции, рассчитанные в работе

Ь 9, а ь, <7,1 <7.2 <7

Параметры а (%) а2 (%)

(г/л) (г/л) (г/л) (г/л) (г/л) (г/л)

Ь-метионин 0 77 0 08 9 79 1 63 071 0 06 0 11 1 14 114 0 10 0 08

О-метиопин 2 00 0 17 120 3 91 1 88 0 14 0 19 1 78 13 3 0 11 0 07

Партия сорбента с иммобилизованным эремомицином (силикагель ЕигоБрЬег, 15 мкм) упаковали в препартивные колонки 8^60 мм и сопоставили расчетные и экспериментальные данные БМВ-процесса Из изотерм адсорбции рассчитаны параметры БМВ, которые хорошо совпали с экспериментальными результатами Показано, что сорбент позволяет получить как в линейных, так и в нелинейных условиях оба энантиомера метионина с высокой чистотой (90-98 %) и производительностью

После трех недель непрерывной работы в БМВ-условиях выявлены лишь незначительные изменения факторов удерживания Ь- и Б-метионина на всех колонках, что свидетельствует о высокой стабильности хиральной неподвижной фазы с иммобилизованным эремомицином, превышающей стабильность промышленного сорбента с привитым тейкопланином

Результат возможности эффективного применения разработанного сорбента в препаративном разделении Ь- и Б-метионина представляет и практический интерес вследствие потребности в Б-метионине В настоящее время идут разработки сопряженного процесса, включающего ферментативную рацемизацию, биотехнологически полученного Ь-метионина с последующим разделением смеси энантиомеров в БМВ-системах с непрерывной подачей сырья и возвращением Ь-изомера в сопряженный с хроматографической системой ферментер Нами продемонстрирована возможность эффективной реализации части этой задачи

Таким образом, проведенные эксперименты показали, что разработанный сорбент с иммобилизованным эремомицином перспективен не только для аналитического контроля, но и для препаративной очистки и получения оптически чистых соединений

* Экспериментальные исследования ЭМВ-процесса выполнены в лаборатории проф А Зайдель-Моргенштерна (Институт динамики сложных технических систем им Макса Планка, Магдебург, Германия)

ВЫВОДЫ

1 Передложена новая группа хиральных селекторов для хроматографии энантиомеров эремомицин, его полный агликон и эремозаминилагликон эремомицина Разработан способ препаративного получения и очистки полного агликона и эремозаминил агликона эремомицина путем кислотного гидролиза с последующей очисткой препаративной ВЭЖХ

2 Разработан и оптимизирован общий способ иммобилизации гликопептидных антибиотиков в водно-органических средах при умеренной температуре Показано, что способ обеспечивает более высокую энантиоселективность сорбентов в сравнении с известными Синтезирована группа новых энантиоселективных сорбентов, отличающихся природой хирального селектора и энантиоселективными свойствами

3 Разработан способ получения нового гибридного хирального сорбента путем ферментативной полимеризации лакказой анилина в присутствии хирального допанта на поверхности пористого силикагеля с иммобилизованным эремомицином Показано, что энантиоселективность гибридного сорбента, для ряда аминокислот выше в сравнении с иммобилизованным эремомицином

4 Комплексом физико-химических методов изучена химическая структура привитого слоя синтезированных сорбентов Установлено основное направление иммобилизации гликопептидных селекторов

5 Проведено систематическое изучение удерживания и разделения энантиомеров аминокислот на синтезированных сорбентах в условиях высокоэффективной жидкостной хроматографии Выявлены закономерности хирального распознавания оптических изомеров аминокислот в зависимости от их структуры, температуры, рН и состава подвижной фазы

6 Определены условия разделения энантиомеров лекарственных препаратов группы профенов и Р-блокаторов в обращено-фазовом и полярно-органическом вариантах хроматографии на разработанных сорбентах для всех изученных соединений

7 Выявлена высокая энантиоселективность синтезированных сорбентов для модифицированных а- и (3-аминокислот и их производных

8 Выявлены существенные отличия энантиоселективности изученных сорбентов, что позволило предложить модели хирального распознавания для ароматических а-аминокислот и |3-блокаторов

9 На основании изучения изотерм адсорбции Ь- и О-метионина на сорбенте с иммобилизованным эремомицином, проведены расчеты и получены экспериментальные доказательства эффективности применения синтезированого сорбента в препаративной хроматографии в режиме 8МВ Показана стабильность сорбента в условиях препаративной ВЭЖХ

10 Разработанные сорбенты внедрены в производство и выпускаются предприятием ЗАО «БиоХимМак СТ»

Список публикаций по теме диссертации:

1 S М Staroverov, М A Kuznetsov, Р N Nesterenko, G G Vasiarov, G S Katrukha, G В Fedorova New chiral stationary phase with macrocyclic glycopeptide antibiotic eremomycin chemically bonded to silica // J Chromatogr A 2006 V 1108 P 263-267

2 MA Кузнецов, П H Нестеренко, Г Г Васияров, С М Староверов Сорбенты с иммобилизованными макроциклическими гликопептидными антибиотиками для разделения оптических изомеров методом высокоэффективной жидкостной хроматографии // Прикладная биохимия и микробиология 2006 Т 42 № 6 С 615-623

3 М А Кузнецов, Г Г Васияров, С М Староверов Иммобилизованные на силикагеле эремомицин и его эремозаминилагликон в разделении оптических изомеров методом ВЭЖХ // Труды X Международной конференции «Теоретические проблемы химии поверхности, адсорбции и хроматографии» Москва 2006 24-28 апреля С 406-410

4 К Petrusevska, М A Kuznetsov, К Gedicke, V Meshko, S М Staroverov, А Seidel-Morgenstern Chromatographic enantioseparation of amino acids using a new chiral stationary phase based on a macrocyclic glycopeptide antibiotic // J Sep Sei 2006 V 29 P 1447- 1457

5 L Zhang, К Gedicke, M A Kuznetsov, S M Staroverov, A Seidel-Morgenstern Application of an eremomycin-chiral stationary phase for the separation of DL-methionine using simulated moving bed technology // J Chromatogr A 2007 V 1162 P 90-96

6 MA Кузнецов, П H Нестеренко, Г Г Васияров, С М Староверов Высокоэффективная жидкостная хроматография энантиомеров а-аминокислот на силикагеле с иммобилизованным эремомицином // ЖАХ 2008 Т 63 № 1 С 64-72

7 СМ Староверов, М А Кузнецов, Г С Катруха, Г Б Федорова, Г Г Васияров, П Н Нестеренко, Ю В Волгин Сорбент для разделения оптических изомеров и способ его получения // Патент РФ № 2255802 Опубликован 10 07 2005 Бюл № 19

8 А И Ярополов, И С Синякова, О В Морозова, С В Шлеев, С М Староверов, И Ю Сахаров, М А Кузнецов Способ получения оптически активного полианилина // Патент РФ № 2301262 Опубликован 20 06 2007 Бюл № 17

9 С М Староверов, М А Кузнецов, И Ю Сахаров, А И Ярополов, О В Морозова, Г П Шумакович Сорбент для хроматографии оптических изомеров и способ его получения // Положительное решение о выдаче патента РФ по заявке № 2006135760

ЮМА Кузнецов, ГС Катруха, Г Г Васияров, ПН Нестеренко, СМ Староверов Хроматографическое разделение аминокислот на сорбенте с иммобилизованным макроциклическим гликопептидным антибиотиком /

Всероссийский симпозиум «Хроматография и хроматографические приборы» Москва 2004 15- 19 марта С 219

11 М А Кузнецов, П Н Нестеренко, Г Г Васияров, Г С Катруха, С М Староверов Закономерности разделения энантиомеров аминокислот на сорбенте с иммобилизованным макроциклическим антибиотиком -эремомицином / Международная конференция «Физико-химические основы новейших технологий XXI века» Москва 2005 30 мая-4 июня С 194

12 М А Кузнецов, Г Г Васияров, Ю В Волгин, С М Староверов Влияние структуры хирального селектора и способа прививки на энантиоселективность ВЭЖХ сорбентов с иммобилизованными макроциклическими гликопептидными антибиотиками / Всероссийская конференция «Теория и практика хроматографии Применение в нефтехимии» Самара 2005 3 -8 июля С 219

13 К Petrusevska, MA Kuznetsov, К Gedicke, V Meshko, SM Staroverov, A Seidel-Morgenstern Enantioseparation of racemic mixtures of amino acids using high performance liquid chromatography / 1st South East European Congress of Chemical Engineering Belgrade Serbia 2005 September 25 - 28 P 211

14 С M Староверов, M А Кузнецов, Г С Катруха Новые хиральные сорбенты на основе гликопептидных антибиотиков для разделения оптических изомеров аминокислот и пептидов / II Российский симпозиум по химии и биологии пептидов Санкт-Петербург 2005 6-8 июня С 115

15 М А Кузнецов, ПН Нестеренко, Г Г Васияров, ЮВ Волгин, СМ Староверов Сорбенты с иммобилизованными гликопептидными антибиотиками для разделения оптических изомеров профенов методом ВЭЖХ / X Международная конеренция «Теоретические проблемы химии поверхности, адсорбции и хроматографии» Москва 2006 24 - 28 апреля С 296

16 М А Кузнецов, Ю В Волгин, Г Г Васияров, В С Карасев, И В Назимов, С М Староверов Новые хиральные сорбенты с иммобилизованными гликозидами и агликоном макроциклического гликопептидного антибиотика эремомицина / Всероссийский симпозиум «Хроматография в химическом анализе и физико-химических исследованиях» Москва 2007 23 - 27 апреля С 17

Заказ № 72/04/08 Подписано в печать 09 04 2008 Тираж 100 экз Уел п л 1,5

Л ООО "Цнфровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 \v\vw с/г ги , е-тш1 т/о@с/г т

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Кузнецов, Михаил Александрович

1. Введение.

2. Обзор литературы.

2.1. Энантиоселективность. Методы получения оптически чистых изомеров.

2.2. Метод ВЭЖХ для разделения энантиомеров. Типы хиральных неподвижных фаз.

2.3. Сорбенты с иммобилизованными макроциклпчсскими гликопептидпыми антибиотиками.

2.3.1. Макроциклические гликопептидные антибиотики и получаемые на их основе хиральные селекторы.

2.3.2. Способы иммобилизации макроциклических глнкопептидных антибиотиков на поверхности силикагеля.

2.4 Хроматографические свойства ХНФ с иммобилизованными хиральнымп селекторами на основе макроциклических глнкопептидных антибиотиков.

2.5. Влияние структуры селектора на хроматографические свойства сорбентов с иммобилизованными макроциклнчскими гликопептидпыми антибиотиками.

2.6 Влияние структуры разделяемых энаитиомеров на хроматографические свойства сорбеытов с иммобилизованными макроциклнчскими гликопептидными антибиотиками.

2.7. Возможные механизмы разделения на сорбентах с иммобилизованными макроциклическими гликопептидными антибиотиками.

2.8. Структура и свойства макроциклического гликопсптидного антибиотика эремомицина.

3. Экспериментальная часть.

3.1. Реагенты и растворители.

3.2.Методики синтеза гликозидов и агликона эремомицина.

3.3. Методики иммобилизации хиральных селекторов на силикагеле.

3.4. Хроматографический анализ.

4. Обсуждение результатов.

4.1. Получение и очистка гликозидов и агликона эремомицина.

4.2. Иммобилизация хиральных селекторов на силикагеле.

4.3. Получение гибридного сорбента с иммобилизованным эремомиципом, модифицированным хнральным полиапилином.

4.4. Физико-химические исследования полученных хиральных неиодвнжных фаз.

4.4.1. ИК-спектроскопия.

4.4.2.Спектроскопия диффузного отражения компелексов с тетрацианохинодиметаном.

4.4.3. Электронная спектроскопия для химического анализа (ЭСХА).

4.5. Применение полученных сорбентов для разделения оптических изомеров.

4.5.1. Применение сорбентов для разделения энантиомеров аминокислот и их производных.

4.5.1.1. Влияние структуры исследуемых аминокислот на энантиоселективность разделения.

4.5.1.2. Влияние условий разделения на энантиоселективность.

4.5.1.3. Хроматографические характеристики сорбента с иммобилизованными ристомицином А. Зависимость селективности от способа иммобилизации гликопептидных антбиотиков на силикагель.

4.5.1.4. Влияние структуры селектора на энантиоселективность разделения.

4.5.1.5. О структуре и локализации «центра хирального распознавания» аминокислот.

4.5.1.6. Разделение энантиомеров р-фенилаланина и его производных.

4.5.2. Применение сорбентов для разделения энантиомеров p-блокаторов.

4.5.3. Применение сорбентов для разделения энантиомеров профенов.

4.5.4. Другие возможности разработанных сорбентов в разделении энантиомеров.

4.6. Изучение адсорбции L- и D-Метионина на сорбенте с иммобилизованным эремомицином. Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Энантиоселективные сорбенты с иммобилизованными макроциклическими гликопептидными антибиотиками"

Актуальность темы. Одной из фундаментальных особенностей живой материи является оптическая молекулярная асимметрия главнейших компонентов организмов — белков и нуклеиновых кислот. Определяя пространственную структуру этих основных биологических полимеров, она играет важную роль в специфичности действия ферментов и, таким образом, в основных реакциях живых систем.

Бурное развитие биохимических исследований, возросшие требования Всемирной организации здравоохранения к оптической чистоте лекарственных препаратов и широкие возможности современной органической химии требуют разработки методов получения оптически чистых соединений. Высокоэффективная жидкостная хроматография является мощнейшим инструментом решения задач аналитического контроля энантиомерного состава хиральных соединений и препаративного получения индивидуальных энантиомеров различных классов соединений. Хроматографическое разделение энантиомеров принципиально возможно только в системах, содержащих хиральный селектор, способный различать пространственную конфигурацию оптических антиподов. В связи с этим интерес к получению новых хиральных селекторов огромен.

Отсутствие универсальных хиральных фаз для разделения оптических изомеров стимулирует разработку новых сорбентов. Иммобилизованные макроциклические гликопептидные антибиотики, к которым относятся ванкомицин, тейкопланин, ристоцетин А, авопарцин и др., успешно зарекомендовали себя в качестве хиральных фаз для ВЭЖХ большого круга оптических изомеров лекарственных препаратов. Высокая энантиоселективность этого класса сорбентов связана с наличием в их структуре различных по строению фрагментов, способных к многоточечным взаимодействиям с разделяемыми соединениями как в полярных, так и неполярных растворителях. Дополнительные возможности по изменению энантиоселективности этого класса сорбентов могут быть достигнуты путем иммобилизации новых антибиотиков, химическим изменением их структуры или оптимизацией методов иммобилизации.

Актуальна проблема разделения аминокислот и их производных, так как они входят в состав белков в организме человека и играют большую роль в процессах питания. Определение и разделение оптических изомеров фармацевтических препаратов профенов и p-блокаторов необходимо вследствие их различного фармакологического действия в биологических системах.

Цель работы заключалась в разработке группы новых хиральных селекторов на основе нового отечественного макроциклического гликопептидного антибиотика эремомицина, способа их иммобилизации на силикагеле, изучении хроматографических и энантиоселективных свойств полученных сорбентов. Для достижения этой цели были решены следующие задачи:

- разработаны методики препаративного выделения новых хиральных селекторов на основе макроциклического гликопептидного антибиотика эремомицина;

- разработан метод иммобилизации макроциклических антибиотиков и селекторов, полученных на их основе, на силикагеле для получения хиральных ВЭЖХ сорбентов;

- разработан метод получения гибридного сорбента с иммобилизованным комплексом макроциклического гликопептидного антибиотика эремомицина и хирального полианилина, полученного в присутствии фермента - лакказы и допирующего агента - сульфокамфорной кислоты;

- изучена структура иммобилизованных на силикагеле хиральных селекторов комплексом физико-химических методов: электронной спектроскопии для химического анализа (ЭСХА), ИК-спектроскопии, и спектроскопии диффузного отражения комплексов с тетрацианохинодиметаном;

- проведено систематическое изучение хроматографических и энантиоселективных свойств полученных сорбентов при разделении энантиомеров а- и (3-аминокислот и их производных, профенов и (3-блокаторов;

- изучены изотермы адсорбции L-и D-метионина на сорбенте с иммобилизованным эремомицином и выяснены возможности применимости данного сорбента для препаративного разделения энантиомеров метионина методом «симулированного подвижного слоя сорбента» (SMB).

Научная новизна. Разработаны новые хиральные селекторы, полученные путем кислотного гидролиза макроциклического гликопептидного антибиотика эремомицина. Разработан новый метод иммобилизации хиральных селекторов гликопептидной природы на силикагеле. Получены новые хиральные ВЭЖХ сорбенты на основе отечественного макроциклического гликопептидного антибиотика - эремомицина, его производных, а также комплекса эремомицина с хиральным полианилином.

Проведено систематическое изучение хроматографических и энантиоселективных свойств полученных ВЭЖХ сорбентов в разделении энантиомеров а- и (3-аминокислот, профенов и p-блокаторов. Изучены зависимости удерживания и энантиоселективности разделения энантиомеров аминокислот от структуры сорбата, значения рН элюента, концентрации органического растворителя в подвижной фазе и температуры.

По изотермам адсорбции индивидуальных энантиомеров метионина оценены вклады в удерживание энантиоселективных и неселективных сайтов молекулы эремомицина, что позволило рассчитать и экспериментально подтвердить возможность использования данного сорбента в препаративных разделениях рацемических смесей методом SMB.

Практическая значимость. Предложен простой метод иммобилизации селекторов гликопептидной природы на силикагеле, отличающийся проведением прививки из водно-органических смесей, при комнатной температуре. Найдены условия разделения большого числа энантиомеров различных классов соединений, в том числе и лекарственных препаратов, в условиях обратно-фазового и полярно-ионного режима ВЭЖХ.

Хроматографические колонки, заполненные разработанными сорбентами, внедрены в производство и выпускаются предприятием ЗАО «БиоХимМак СТ» под торговым названием Nautilus-E, Nautilus -R, Nautilus -V.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Метод иммобилизации хиральных селекторов на основе макроциклических гликопептидных антибиотиков на силикагеле.

2. Методики получения и препаративного выделения дезэремозаминилэремомицина, эремозаминилагликона эремомицина и полного агликоиа эремомицина.

3. Метод получения гибридного сорбента на основе макроциклического гликопептидного антибиотика эремомицина и хирального полианилина.

4. Закономерности удерживания и энантиоразделения энантиомеров аминокислот от структуры сорбата, значения рН элюента, концентрации органического растворителя в подвижной фазе и температуры, а также структуры хирального селектора.

5. Данные по разделению энантиомеров профенов и (3-блокаторов и зависимости энантиоразделения от структуры хирального селектора.

6. Данные по расчету изотерм адсорбции оптических изомеров метионина на сорбенте с иммобилизованным эремомицином и препаративному разделению энантиомеров метионина методом SMB.

7. Данные по физико-химическим свойствам синтезированных сорбентов, полученные методами ИК-спектроскопии, спектроскопии диффузного отражения и ЭСХА.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на следующих конференциях и симпозиумах: Всероссийский симпозиум «Хроматография и хроматографические приборы» Москва. 2004. 15-19 марта; Международная конференция «Физико-химические основы новейших технологий XXI века» Москва. 2005. 30 мая - 4 июня; Всероссийская конференция «Теория и практика хроматографии. Применение в нефтехимии» Самара. 2005. 3 - 8 июля; 1st South East European Congress of Chemical

Engineering. Belgrade. Serbia. 2005. September 25 - 28; II Российский симпозиум по химии и биологии пептидов. Санкт-Петербург. 2005. 6-8 июня; X Международная конференция «Теоретические проблемы химии поверхности, адсорбции и хроматографии» Москва. 2006. 24 — 28 апреля; Всероссийский симпозиум «Хроматография в химическом анализе и физико-химических исследованиях». Москва. 2007. 23 — 27 апреля; Всероссийский симпозиум «Хроматография и хромато-масс-спектрометрия». Москва. 2008. 14 — 18 апреля.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 статей и 8 тезисов докладов, получено 3 патента на изобретения.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, 6 глав обсуждения результатов, общих выводов и списка цитируемой литературы. Материал диссертации изложен на 131 странице машинописного текста, содержит 51 рисунок и 19 таблиц, в списке цитируемой литературы 122 наименования.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Кузнецов, Михаил Александрович

5. Выводы

1. Предложена новая группа хиральных селекторов для хроматографии энантиомеров: эремомицин, его полный агликон и эремозаминилагликон эремомицина. Разработан способ препаративного получения и очистки полного агликона и эремозаминилагликона эремомицина путем кислотного гидролиза с последующей очисткой препаративной ВЭЖХ.

2. Разработан и оптимизирован общий способ иммобилизации гликопептидных антибиотиков в водно-органических средах при умеренной температуре. Показано, что способ обеспечивает более высокую энантиоселективность сорбентов в сравнении с известными. Синтезирована группа новых энантиоселективных сорбентов, отличающихся природой хирального селектора и энантиоселективными свойствами.

3. Разработан способ получения нового гибридного хирального сорбента путем ферментативной полимеризации лакказой анилина в присутствии хирального допанта на поверхности пористого силикагеля с иммобилизованным эремомицином. Показано, что энантиоселективность гибридного сорбента, для ряда аминокислот выше в сравнении с иммобилизованным эремомицином.

4. Комплексом физико-химических методов изучена химическая структура привитого слоя синтезированных сорбентов. Установлено основное направление иммобилизации гликопептидных селекторов.

5. Проведено систематическое изучение удерживания и разделения энантиомеров аминокислот на синтезированных сорбентах в условиях высокоэффективной жидкостной хроматографии. Выявлены закономерности хирального распознавания оптических изомеров аминокислот в зависимости от их структуры, температуры, рН и состава подвижной фазы.

6. Определены условия разделения энантиомеров лекарственных препаратов группы профенов и p-блокаторов в обратно-фазовом и полярно-органическом вариантах хроматографии на разработанных сорбентах для всех изученных соединений.

7. Выявлена высокая энантиоселективность синтезированных сорбентов для модифицированных а- и р-аминокислот и их производных (дансилпроизводные, мононукл еотид).

8. Выявлены существенные отличия энантиоселективности изученных сорбентов, что позволило предложить модели хирального распознавания для ароматических а-аминокислот и Р-блокаторов.

9. На основании изучения изотерм адсорбции L- и D-метионина на сорбенте с иммобилизованным эремомицином, проведены расчеты и получены экспериментальные доказательства эффективности применения синтезированного сорбента в препаративной хроматографии в непрерывном режиме SMB (симуляция подвижного слоя сорбента). Показана стабильность сорбента в условиях препаративной ВЭЖХ.

10. Разработанные сорбенты внедрены в производство и выпускаются предприятием ЗАО «БиоХимМак СТ».

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Кузнецов, Михаил Александрович, Москва

1. W.H. Pirkle, J.M. Firm. Chiral high-pressure liquid chromatographic stationary phases. 3.

2. General resolution of arylalkylcarbinols. // J. Org. Chem. 1981. V. 46. №. 16. P. 2935 -2938.

3. W.H. Pirkle, D.W. House. Chiral high-performance liquid chromatographic stationary phases.

4. Separation of the enantiomers of sulfoxides, amines, amino acids, alcohols, hydroxy acids, lactones, and mercaptans. // J. Org. Chem. 1979. V. 44. №. 12. P. 1957 I960.

5. Y. Dobashi, S. Hara. Direct resolution of enantiomers by liquid-chromatography with thenovel chiral stationary phase derived from (R,R)-tartramide. // Tetrahedron Lett. 1985. V. 26. P. 4217-4220.

6. J.N. Akanya, S.M. Hitchen, D.R. Taylor. Chemically-bonded chiral column packings for highperformance liquid chromatography. // Chromatographia. 1982. V. 16. P. 224 227.

7. R. Dappen, V.R. Meyer, H. Arm. Chiral covalently bonded stationary phases for theseparation of enantiomeric amine derivatives by high-performance liquid chromatography. // J. Chromatogr. A. 1984. V. 295. P. 367 376.

8. T. Shibata, Y. Okamoto, K. Ishii. The resolution of enantiomers by liquid chromatography onchiral stationary phases. // J. Liquid Chromatogr. 1986. V. 9. № 2. P. 313 340.

9. Y. Okamoto, Y. Kaida. Resolution by high-performance liquid chromatography usingpolysaccharide carbamates and benzoates as chiral stationary phases. // J. Chromatogr. A. 1994. V. 666. P. 403-419.

10. D.W. Armstrong, W. Demond. Cyclodextrin bonded phases for the liquid chromatographic separation of optical, geometrical, and structural isomers. // J. Chromatog. Sci. 1984. V. 22. P. 411-415.

11. R.C. Helgeson, J.M. Timko, P. Moreau, S.C. Peacock, J.M. Mayer, D.J. Cram. Models for chiral recognition in molecular complexation. // J. Am. Chem. Soc. 1974. V. 96. №. 21. P. 6762-6763.

12. L.R. Sousa, G.D. Sogah, D.H. Hoffman, D.J. Cram. Host-guest complexation. 12. Total optical resolution of amino and amino esters salt by chromatography.// J. Am. Chem. Soc. 1978. V. 100. № 14. P. 4569 4576.

13. V.A. Davankov, S.V. Rogozhin. Ligand chromatography as a novel method for the investigation of mixed complexes: stereoselective effects in a-amino acid copper(II) complexes. // J. Chromatogr. 1971. V. 60. P. 284 312.

14. S.V. Rogozhin, V.A. Davankov. Ligand chromatography on asymmetric complex-forming sorbents as a new method for resolution of racemates. // J. Chem. Soc. D. 1971. №. 10. 490a

15. G. Gubitz, W. Jellenz, W. Santi. Separation of the optical isomers of amino acids by ligand-exchange chromatography using chemically bonded chiral phases. // J. Chromatogr. V. 203. 1981. P. 377-384.

16. B. Feibush, M.J. Cohen, B.L. Karger. The role of bonded phase composition on the ligand-exchange chromatography of dansyl-D,L-amino acids. // J. Chromatogr. 1983. V. 282. P. 3 -26.

17. L.R. Gelber, B.L. Karger, J.L. Neumeyer, B. Feibush. Ligand exchange chromatography of amino alcohols. Use of Schiff bases in enantiomer resolution. // J. Am. Chem. Soc. 1984. V. 106. P. 7729-7734.

18. K.K. Stewart, R.F. Doherty. Resolution of DL-tryptophan by affinity chromatography on bovine-serum albumin-agarose columns. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1973. V. 70. №. 10. P. 2850-2852.

19. T. Miwa, M. Ichikawa, M. Tsuno, T. Hattori, T. Miyakawa, M. Kayano, Y. Miyake. Direct liquid chromatographic resolution of racemic compounds: use of ovomucoid as a column ligand. // Chem. Pharm. Bull. 1987. V. 35. P. 682 686.

20. T. Miwa, T. Miyakawa, Y. Miyake. Characteristics of an avidin-conjugated column in direct liquid chromatographic resolution of racemic compounds. // J. Chromatogr. 1988. V. 457. P. 227-233.

21. P. Erlandsson, I. Marie, L. Hansson, R. Isaksson, G. Petterson, C. Petterson. Immobilized cellulase (CBH I) as a chiral stationary phase for direct resolution of enantiomers. // J. Am. Chem. Soc. 1990. V. 112. P. 4573 4574.

22. D. W. Armstrong, Y. Tang, S. Chen, Y. Zhou, C. Bagwill, J.R. Chen. Macrocyclic antibiotics as a new class of chiral selectors for liquid chromatography. // Anal. Chem. 1994. V. 66. P. 1473 1484.

23. P. Sensi, A. M. Greco, R. Balotta. Rifomycin. I. Isolation and properties of rifomycin В and rifomycin complex // Antibiot. Ann. 1959 60. P. 262 - 270.

24. J.F. Pagano, M.J. Weinstein, H.A. Stout, R. Donovick. Thiostrepton, a new antibiotic.I. In vitro studies. // Antibiot. Ann. 1955 56. 554 - 559.

25. R.S. Pittenger, R.B. Brigham. Streptomices orientalis, n. sp., The source of vancomycin. // Antib. & Chemo. 1956. V. 6. P. 642 647.

26. A. Berthod, U.B. Nair, C. Bagwill, D.W. Armstrong. Derivtized vancomycin stationry phases for LC chiral separations. // Talanta. 1996. V. 43. P. 1767 1782.

27. F. Parenti, G. Beretta, M. Berty, V. Arioli. Teicoplanin new antibiotics from actinoplanes teichomyceticus nov. sp. // J Antibiot. 1978. V. 11. P. 276 283

28. D.W. Armstrong, Y. Liu, K.H. Ekborg-Ott. A covalently bonded teicoplanin chiral stationary phase for HPLC enantioseparations // Chirality. 1995. V. 7. №. 6. P.474 497.

29. A. Berthod, X. Chen, J.P. Kullman, D.W. Armstrong, F. Gasparrini, I. D'Acquarica, C. Villani, A. Carrotti. Role of the carbohydrate moieties in chiral recognition on teicoplanin based LC stationary phases // Anal. Chem. 2000. V. 72. P. 1767 1780.

30. J. Lokajova, E. Tesarova, D.W. Armstrong. Comparative study of three teicoplanin-based chiral stationary phases using the linear free energy relationship model. // J. Chromatogr. A. 2005. V. 1088. P. 57-66.

31. A. Berthod, T. L. Xiao, Y. Liu, W.S. Jenks, D.W. Armstrong. Separation of chiral sulfoxides by liquid chromatography using macrocyclic glycopeptide chiral stationary phases. // J. Chromatogr. A. 2002. V. 955. P. 53 69

32. J.E. Philip, J.R. Schenck, M.P. Hargie Ristocetins A and В two new antibiotics. Isolations and properties. // Antibiot. Ann. 1956 - 57. P. 699 - 705

33. K.H. Ekborg-Ott, Y. Liu, D.W. Armstrong. Highly enantioselective HPLC separations using the covalently bonded macrocyclic antibiotic, ristocetin A, chiral stationary phase // Chirality. 1998. V. 10. P. 434-483.

34. K.H. Ekborg-Ott, J.P. Kullman, X. Wang, K. Gahm, L. He, D.W. Armstrong. Evaluation of macrocyclic antibiotic avoparcin as a new chiral selectors for HPLC // Chirality. 1998. V. 10. P. 627 660.

35. J.P.Waltho, D.H. Williams, E. Selva, P. Ferrari. Structure elucidation of the glycopeptide antibiotic complex A40926. // J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1. 1987. V. 10. P. 2103 2107.

36. D'Acquarica. New synthetic strategies for the preparation of novel chiral stationary phases for high-perfomance liquid chromatography containing natural pool selectors // J. Pharm. Biomed. Anal. 2000. V. 23. P. 3 13.

37. L.A. Svensson, P.K. Owens. Enantioselective supercritical fluid chromatography using ristocetin A chiral stationery phase. // Analyst. 2000. V. 125. P. 1037 1039.

38. D.W. Armstrong. Macrocyclic antibiotics as separation agents. // US Pat. US6669842. 2003.

39. G-S. Ding, Y. Liu, R-Z. Cong, J-D. Wang. Chirl separation of enantiomers of amino acids derivatives by high-perfomance liquid chromatography on a norvancomycin-bonded chiral stationary phase. // Talanta. 2004. V. 62. P. 997 1003.

40. A.Berthod, Y. Liu, C. Bagwill, D.W. Armstrong. Facile liquid chromatographic enantioseparation of native amino acids and peptides using a teicoplanin chiral stationary phase // J. Chromatogr. A. 1996. V. 731. P. 123 137.

41. A. Peter, E. Olajos, R. Casimir, D. Tourwe, Q.B. Broxterman, B. Kaptein, D.W. Armstrong. High-perfomance liquid chromatographic separation of the enantiomers of unusual a-amino acids analogues. //J. Chromatogr. A. 2000. V. 871. P. 105 113.

42. A. Peter, G. Torok, D.W. Armstrong. High-performance liquid chromatographic separation of enantiomers of unusual amino acids on a teicoplanin ehiral stationary phase. // J. Chromatogr. A. 1998. V. 793. P. 283 296.

43. A. Peter, G. Torok, D.W. Armstrong, G. Toth, D. Tourwe. High-perfomance liquid chromatographic separation of enantiomers of synthetic amino acids on ristocetin A chiral stationary phase. // J. Chromatogr. A. 2000. V. 904. P. 1 15.

44. G. Torok, A. Peter, D.W. Armstrong, D. Tourwe, G. Toth, J. Sapi. Direct chiral separation of unnatural mino acids by high-perfomance liquid chromatography on a ristocetin A-bonded sttionery phase. // Chirality. 2001. V. 13. P. 648 656.

45. M. Schlauch, A.W. Frahm. Enantiomeric and diastereomeric high-perfomance liquid chromatographic separation of cyclic (3-subtituted a-amino acides on a teicoplanin chiral stationary phase. // J. Chromatogr. A. 2000. V. 868. P.197 207.

46. A. Peter, L. Lazar, F. Ftilop, D.W. Armstrong. High-performance liquid chromatographic enantioseparation of P-amino acids. // J. Chromatogr. A. 2001. V. 926. P. 229 238.

47. E. Tesarova, Z. Bosakova, V. Pacakova. Comparison of enantioselective separation of N-tert.-butyloxycarbonyl amino acids and their non-blocked analogues on teicoplanin-based chiral stationary phase. // J. Chromatogr. A. 1999. V. 838. P. 121 129.

48. T. L. Xiao, B. Zhang, J.T. Lee, F. Hui, D.W. Armstrong. Reversal of enantiomeric elution order on Macrocyclic glycopeptide chiral stationary phases. // J . Liq. Chromatogr. Relat. Technol. V. 2001. V. 24. №. 17. P. 2673 -2684.

49. H.Y. Aboul-Enein, V. Serignese. Enantiomeric separation of several cyclic imides on a Macrocyclic antibiotic (vancomycin) chiral stationary phase under normal and reversed phase conditions. // Chirality. 1998. V. 10. P. 358 361.

50. E. Tesarova, K.Zaruba, M. Flieger. Enantioseparation of semisynthrtic ergot alkaloids on vancomycin and teicoplanin stationary phases. // J. Chromatogr. A. 1999. V. 844. P. 137 — 147.

51. F. РёЬошод, С. Jarry, В. Bannwarth. Chiral resolution of flurbiprofen and ketoprofen enantiomers by HPLC on a glycopeptide-type column chiral stationary phase. // Biomed. Chromatogr. 2001. V. 15. P. 217-222.

52. K.M. Fried, P. Koch, I.W. Wainer. Determination of the enantiomers of albuterol in human and canine plasma by enantioselective high-performance liquid chromatography on a teicoplanin-based chiral stationary phase. // Chirality. 1998. V. 10. P. 484 491.

53. H.Y Aboul-Enein, V. Serginese. Optimized enantioselective separation of clenbuterol on Macrocyclic antibiotic teikoplanin chiral sttionary phase. // J . Liq. Chromatogr. Relat. Technol. 1999. V. 22. №. 14. P. 2177-2185.

54. D.Mericko, J. Lehotay, I. Skacani, D.W. Armstrong. Effect of temperature on retention and enantiomeric separation of chiral sulfoxides using teicoplanin aglycone chiral stationary phase. // J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol. 2006. V. 29. P 623 638.

55. E. Peyrin, C. Ravalet, E. Nicolle, A. Villet, C. Grosset, A. Ravel, J. Alary. Dansyl amino acid enantiomer separation on a teicoplanin chiral stationary phase: effect of eluent pH. // J. Chromatogr. A. 2001. V. 923. P. 37 43.

56. P. Jandera, V. Backovska, A. Felinger. Analysis of the band profiles of the enantiomers of phenylglycine in liquid chromatography on bonded teicoplanin columns using the stochastic theory of chromatography. // J. Chromatogr. A. 2001. V. 919. P. 67 77.

57. Y.-C. Guilaume, T.-T. Truong, J. Millet, I. Nicod, C. Guinchard, J. F. Robert, M. Thomassin. Chiral discrimination of phenoxypropionic acid herbicides on teicoplanin phase: Effect of mobile phase modifier. // Chromatographia. 2002.V. 55. P. 143 148.

58. C. Andre, Y.-C. Guilaume. Reanalysis of chiral discrimination of phenoxypropionic acid herbicides on a teicoplanin phase using a bi-Langmuir approach. // Chromatographia. 2003. V. 58. P. 201-206.

59. А.Ю. Павлов, M.H. Преображенская. Химическая модификация гликопетидных антибиотиков. // Биоорг. Хим. 1998. Т. 24, №. 9. С. 644 662.

60. G.F. Gause, M.G. Brazhnikova, N.N. Lomakina, T.F. Berdnikova, G.B. Fedorova, N.L. Tokareva, V.N. Borisova, G.Y. Batta. Eremomycin new glycopeptide antibiotic: chemical properties and structure. // J. Antibiotics. 1989. V. 42. P. 1790 - 1799.

61. А.С. Тренин, Е.Н. Олсуфьева. Механизм резистентности к гликопептидным антибиотикам как основа создания новых производных, способных к преодолению резистентности. // Биоорг. Хим. 1997. Т. 23. №. 11. С. 851 567.

62. Н.Н. Ломакина, Н.Л. Токарева, Н.П. Потапова. Структура эремозамина — аминосахара из антибиотика эремомицина. // Антибиотики и химиотер. 1988. №. 10. С. 726 729.

63. Н.Н. Ломакина, Т.Ф. Бердникова, Н.Л. Токарева, Е.А. Абрамова, Н.Ю. Докшина. Структура эремомицина нового антибиотика группы полициклических гликопептидов. // Антибиотики и химиотер. 1989. Т. 34. №. 4. С. 254 - 258.

64. С.М. Harris, Н. Kopecka, Т.М. Harris. Vancomycin: structure and transformation to CDP-1. //J. Am. Chem. Soc. 1983. V. 105. №. 23. P. 6915-6922.

65. М.Б. Кобрин, Г.Б. Федорова, Г.С. Катруха. Исследование процесса дегликозилирования некоторых антибиотиков ванкомициновой группы. // Антибиотики и химиотер. 1988. Т. 33. №. 5. С. 331 335.

66. N. Tsuji, М. Kobayashi, Т. Kamigauchi, Y. Yoshimura, Y. Terui. New glycopeptide antibiotics. I. The structures of orienticins. // J. Antibiot. 1988. V. 41. №. 6. P. 819 822.

67. Е.Н. Олсуфьева, Т.Ф. Бердникова, Н.Ю. Докшина, Н.Н. Ломакина, Г.И. Орлова, И.В. Малкова, И.Н. Прозорова. Модификация эремомицина по аминным группам. // Антибиотики и химиотер. 1989. Т. 34. №. 5. С. 352 358.

68. А.Ю. Павлов, Т.Ф. Бердникова, Е.Н. Олсуфьева, Г.И. Орлова, М.Н. Преображенская. Восстановительное алкилирование гликопептидного антибиотика эремомицина и его производных. //Хим.-фармацевт. Журн. 1995. Т. 25. С. 46 -48.

69. A. Seidel-Morgenstern. Experimental determination of single solute and competitive adsorption isotherms. // J. Chromatogr. A. 2004. V. 1037. P. 255 272.

70. В.В. Кротов, С.М. Староверов, П.Н. Нестеренко, Г.В. Лисичкин. Гетерогенизация оптически активных органических оснований на кремнеземных носителях. // ЖОХ. 1986. Т. 56. №. 11. С. 2460-2467.

71. В.А. Малиновский, С.М. Староверов, Г.В. Лисичкин. Химическая прививка оптически активных аминокислот к поверхности кремнезема. // Вестн. Моск. Ун-та. Сер.2. Химия. 1984. Т. 25. №. 1. С. 80 85.

72. В.А. Малиновский, С.М. Староверов, Г.В. Лисичкин. Кремнеземы с химически привитыми энантиомерами а-аминокислот. //ЖОХ. 1985. Т. 55. №. 12. С. 2767-2772.

73. J. Anand, S. Palaniappan, D.N. Sathyanazayana // Prog. Polym. Sci. 1998. V. 23. № 6. P. 993-1018

74. M. Thiyagarajan, L.A. Samuelson, J. Kumar, A.L. CholH. Helical conformational specificity of enzymatically synthesized water-soluble conducting polyaniline nanocomposites.//J. Am. Chem. Soc. 2003. V. 125. №. 38. P. 11502-11503.

75. W. Li, H.-L. Wang. Oligomer-assisted synthesis of chiral polyaniline nanofibers. // J. Am. Chem. Soc. 2004. V. 126. №.8. P. 2278-2279.

76. А.Ю. Фадеев, С.М. Староверов, Г.В. Лисичкин. Свойства и применение ион-радикальных солей тетрацианохинодиметана, закрепленных на поверхности модифицированных кремнеземов. // Ж. Всес. Хим. О-ва. 1987. Т. 32. №. 3. С. 349.

77. P.G. Mingalyov, N.V. Orishchenko, A.Y. Fadeev. Study of correlations between fine structure of bonded layer and affinity properties of silicas with attached cyclic oligopeptides. // J. Chromatogr. A. 1997. V. 777. P. 249 259.

78. P.G. Mingalyov, A.Y. Fadeev. Activated silica supports for preparation of chromatographic sorbents. A comparative study of silicas containing attached epoxy, tosyloxy and halogen groups. // J. Chromatogr. A. 1996. V. 719. P. 291 297.

79. К. Зигбан, К. Нордлинг, А. Фальман, P. Нордберг, К. Хамрин, Я. Хегдман, Г. Йоханссон, Т. Бергмарк, С. Карлссон, И. Линдгрен, Б. Линдберг. Электронная спектроскопия. М.: Мир, 1971.

80. A.J. Alpert. Cation-exchange high-performance liquid chromatography of proteins on poly(aspartic acid)-silica. // J. Chromatogr. 1983. V. 266. P. 23 37.

81. A. Ghassempour, A. Abdollahpour, K. Tabar-Heydar, M.R. Nabid, S. Mansouri, H.Y. Aboul-Enein. Crystalline degradation products of vancomycin as a new chiral stationary phase for liquid chromatography. // Chromatographia. 2005. V. 61 №. 3/4. P. 151-155.

82. M.N. Preobrazhenskaya, E.N. Olsufyeva. Patents on glycopeptides of the vancomycin family and their derivatives as antimicrobials: January 1999 June 2003. // Expert Opin. Ther. Patents. 2004. V. 14. №. 2. P. 141 - 173.

83. L.A. Svensson, K.E. Karlsson, A. Karlsson, J. Vessman. Immobilized vancomycin as chiral stationary phase in packed capillary liquid chromatography. // Chirality. 1998. V. 10. P. 273 -280.

84. K.H. Ekborg-Ott, X. Wang, D.W. Armstrong. Effect of selector coverage and mobile phase composition on enantiomeric separations with ristocetin A chiral stationary phases. // Microchem. J. 1999. V. 62. P. 26-49.

85. M.E. Andersson, D. Asian, A. Clarke, J. Roeraade, G. Hagman. Evaluation of generic chiral liquid chromatography screens for pharmaceutical analysis.// J. Chromatogr. A. 2003. V. 1005. P.83-101.

86. F. Pehourcq, С. Jarry, В. Bannwarth. Chiral resolution of flurbiprofen and ketoprofen enantiomers by HPLC on a glycopeptide-type column chiral stationary phase. // Biomed. Chromatogr. 2001. V. 15. №. 3. P. 217-222.

87. K. Miyabe, S. Khattabi, D.E. Cherrak, G. Guiochon. Study on the accuracy of the elution by characteristic point method for the determination of single component isotherms. // J. Chromatogr. A. 2000. V. 872. №. 1 -2. P. 1 -21.

88. L. Ravald, T. Fornstedt. Theoretical study of the accuracy of the elution by characteristic points method for bi-Langmuir isotherms. // J. Chromatogr. A. 2001. V. 908. №. 1 2. P. 111-130.