Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Синтез и характеристика иммуносорбента для процедуры Лu (а) афереза

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Синтез и характеристика иммуносорбента для процедуры Лu (а) афереза"

РОССЮКХЛЯ ЛКЛДЕННЯ НЕДИШШСКЯХ НАУК НАРДЮ/ЮГИЧЕСКИИ НАУЧИ» ЦЕНТР НШ1 ЭКСПЕРННЕИТАЛЬНОЯ КАРДИОЛОГИЯ

Афанасьева Ольга Кяышхчва

СЖНТКЗ Я ХАРАКТЕРИСТИКА НИНУНОСОРБЕНТА ДЛЯ ПРОСЕДУРЫ /Тп(а) АМРЕЭА.

03.00.04 - Б10ПШ

Автореферат

па сонсканве учено* степевв кандидата биологических паук

На правах рлсоошся

Носква 1993

Работа выполнена а группе аффинных сорбентов джл медицины НИИ экспериментальной кардиологии Кардиологического научного центра РАМН.

Маучннв руководите ль t кандидат биологических наук, вед.ц.сотр. Покровский Сергей Николаевич

Официальные оппоненты:

^кандидат химических наук Мишарин япексзндр Юрьевич-

доктор биологических наук laxos СркД Александрович. Ведущее учреждение - НИИ биомедицинской химии РАМН

J

Заяхта ^кандидатской диссертации состоится "...." УггУ.игг1.. 1993 г. в .V.I. часов на заседании специализированного ученого совета К 001.32.02. в Кардиологическом научном центре РАМН по адресу:

131S52, Москва. 3-я Черепковская ул., 15а. »

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Кардиологического научного центра РАМН.

М.

Автореферат разослан "....". .чтгда^лг. .1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

".И.Венгерова

J

шдая характеристика работы

Актуальность проблемы. Липопротеид(а) 1Лп(а)] был открыт в 1963 г. шведским ученым Карлом Бергом (Berg к. 1Эвэ),

Лп(а) плазмы крови человека представляет собой липопротеидную частицу, содержаиую уникальный апобелок tano(a)], ковалентно связанный дисульФидной связью с молекулой апоВцзо в частице, похожей на лилопротеид низкой плотности (лнш (Fleao G.M. et.ol. 1984, Gaubatz J.W. et.al. 1933).

В настоящее время доказано, что уровень Лп{а) в плазме крови человека положительно коррелирует с возникновением и развитием атеросклеротических поражений различных локализаций (Dahlen G. et.al. 1971, Dahlen G. et Л. 197S, Albera J.J. et.al. 1994, Rhqads et.al. 1986). Полагают, что по сравнению с другими классами апоВ-содержащих липопротеидов (ЛП), Лп(а) обладает более высоким атерогенным потенциалом (Kostner G.M. et.al. 1976, RoUi M. 1992), это может быть объяснено высокой степенью гомологии первичной структуры белка апо(а) и молекулы плаэминогена (Мс Lean J.W., et.al. 19В7, Eaton D.L. ot.nl. 1937). Вследствии чего Лп(а) накапливаясь в стенках артерий, мояет такяе участвовать в процессе тромбообразования.

При концентрации в крови Лп(а) выше 25-30 мг/дл и нормальном уровне других ЛП вероятность возникновения атеросклеротических поражений сосудов увеличивается в 2-3 раза (Dahlen J.J., et.al. 1971). Имеются также данные о том, что Лп<а) может служить одним из генетических маркеров атеросклероза (Scanu A.M. 1909).

Таким образом, на сегодняшний день, многие авторы склонны рассматривать Лп(а) как независимый фактор риска возникновения и развития атеросклероза. До настоящего времени практически не найдено эффективного способа снижения концентрации Лп(а) в плазме крови человеха. Известно, что диета (Koetner О.Н. ot.nl. 190«) н применение эффективных гиполипидемических препаратов практически не оказывают действия на концентрацию Лп(а) в крови человека (Kostner G.M., et.al. 1904, Зегд R. et.al. 1909), В ПОСЛВДНеС время появились сообщения о том, что высокие дозы таких препаратов как: никотиновая кислота (Вговюи J.Г.. et.al. 1993), N-ацеТИЛ-ЦИСТеШ (Ge.vish D et.al. 1390, Hansen P.R. 1991) n аскорбиновая кислота (Rath M, Pauling Г.. 1990, Rath Н. ■ 1992).

могут несколько снижать повыаенныя уровень Лп(а). Однако все эти денные, за исключением данных о действии никотиновой кислоты в больших дозах, весьма противоречивы и требуют дополнительного изучения. Таким образом, поиск новых эффективных способов сикжения уровня Лп(е) является актуальное задачей.

Цель работы : "Выяснить возможность коррекции уровня Дл(а) в плазме кровн человека путем его удаления с помовыа иммуносорбента, содержащего в качестве лиганда моноспецифические поликлональные антитела (ЯкАт) к Лп(а) человека. Задачи исследования:

1. Разработать метод выделения препаративных количеств Лп(а); 3. Получить и охарактеризовать моноспецифические ПкАт барана к Дп(а) плазмы крови человека;

3. Разработать метод количественного определения 1п(а):

4. Синтезировать и охарактеризовать иммунасорбент, содержание о качестве яиганда моноспецдфическяе ПкАт к На (а);

5. Изучить специфичность и эффективность такого сорбента в экспериментах Ав vitro, подобрать условия для его клинического применения;

6. Показать безопасность и эффективность использования иммуносорбента в процедуре An(а) аСерсзо:

7. Исследовать динамику восстановления уровне Ли(о) после era удаления из плазмы крови.

Научная аовизна и практическая ценность работы. На основе ыоыоспецмфических ПкАт подучен и охарактеризован сорбент, способны® высокоспецкФично и зЗ&естивно удалять An(а) йэ пдазаы крови человека. Проведенная работа - перзиЗ опыт о мировое практике по создания нового типа еезашого иммуносорбента. позводяищаго снижать уроаепь Лл<а) в ксоом Сольных с гипер-AiHc). практически не затрагивая при этом другкй компонентой крови.

Ограниченные клинические испытания созданного иммуносорбента прогюдщшсь □ НИН клшическоа кардкодопш ш.А.И.Ипсивкова îCitLl РАЩ в течение 1.5-2 лет. В иастосзее время иачаты меадународныз йлйничеекке испытания синтезированного сорбента в клиниках Гесмсшш и Англии.

Апробация работы. Диссертаций апробирована ка

ысхлабораторном семинаре Института зкспериисатаяь эй кардиологии

« .

КНЦ РАМН (март 1993). Материалы диссертации бит представлены на: 7 международной ляпидном симпозиуме (Дрезден, ФРГ. 1991), 9 международном симпозиуме по атеросклерозу (Роземонд, США, 1991), 59 конгрессе Европейского Обвества Атеросклероза (Ницца, Франция, 1992), 4 международном конгрессе Всемирной Ассоциации Афереза (Саппоро. Япония, 1992), на 2 международной конференция по Лп(а) (Новый Орлеан, США, 1992).

Публикации. Основные результата диссертации опубликована в 17 печатных работах.

Структура и объем работы. Диссертация состоят яз введения. , обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, язлояенных в б главах, заклпченпя. выводов и списка используемой литературы. Работа изложена на 130 страницах мэпиноппсиого текста, вюшчая 28 рисунков . 10 табдкц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выделение ЛП плазмы крови человека проводили по методики, описанной ьдпйдгеп, основанной на дивФеренциальном уяьтса-цеитрийугированпи в ступенчатом градиенте плотности нейтральной соли паЗг (Ыпйдгеп Р.т. 1973), с некоторикй кодификациями.

Ультрацеитрифугкрованиз плазмы, содержащей гепаргаь 0.02-4 !!аИэ, 1 кМ ТИИерзЗОЛ, 5 !-гЛ ?МЗР Ц Ю КН ЭДГА, ПРОВОДИЛ» при 15°С, 1050000 В УГЛОБОН роторе Т1 43 рвескагш", Австрия). ат(3) выделяли из Олоткруотей фракции при помоан гель-фтгьтрацкя на колонке С ЗсрПпгаяо СЬ-4В.

Иммунпзашзз гисотгшх препаратом Лп(а) проводили по оСаепринлтой схеме. Для получения коиоспецпЗкческих антлтсл антисиворотку, кстотали на сорбенте с »{мобилизованными ЛИВ до тех пор пока она не переставала взаимодейстовать с ЛПП. Эффективность истопения антисиворотки по анти-апоВ антйгслвн проверяли «втолок двойной радиальной имнуцодкффуэпн (0ись*сг1опу О. et.nl., 1993).

Фракция. иммуноглобулинов класса о из «стоаснной антисыворотки получали путем сульфатного Фракционирования.

При получении аффинных сорбентов использовояэ поегшупественно метод активации агарозы брокцианон (Рога^ Д., 1973) с модификациями. На активированную агарознуя матрицу иммобилизовали шноспециоические ПкАт к Лп(а) и частив ДКП.

з

CopCUEOiajya емкость тестируемых кммуносорбентов определяли : 1) методом хроматографии плазмы на колонке, содержащей 1-3 мл сорбента и/или 2) бетч методом, исполъзуя 100 или 200 мкл сорбента, в зависимости от целей эксперимента. Зданию Лл(а) с сорбента проводили 0.2 М глициновым буфером с 0.15 М Naсi рН з.О. В эяаатах определяли концентрацию Лп(а), ano В и общего холестерина (0XC). Количество Лп(а) составляющее разницу до и после инкубации плазмы с 1 мл сорбента определяло сорбционную емкость тестируемого иммуносорбента.

Чистоту полученных препаратов Лп(а) тестировали такими методами, как : горизонтальный электрофорез в 0.5* геле агарозы, вертикальный электрофорез в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях, иммуноэлектрофореэ a 0.5* геле агарозы, радиальная им: людиффузия.

Специфичность и чистоту выделенных антител исследовали методами : иммуноферментного анализа, иммуноблотиига, двойной радиальной иммунодиффузии, вертикального иммуноэлектроФореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях.

На основе полученных моноспецифических ПкАт к Лг'а) были разработаны два метода его количественного определения : метод радиальной иммунодиффузии (РИД) и твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА).

Для определения титра вторых антител к иммуноглобулинам барана в плазме крови пациентов, получавших процедуры Ли(а) афереза, был специально разработан метод ИФА.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Выделение и характеристика препарата Лп(а). Выделение. Лп(а) плазмы крови человека с целью получения антигена проводили, используя методику, включающую ультрацентрифугирование в ступенчатом градиенте плотности нейтральной соли НаВг с последующей гель-фильтрацией. Схема выделения Лп(а) представлена на рис. 1.

Первая стадия - ультрацентрифугирование плазми в плотности 1.063 г/мл позволяла отделить фракцию впоВ-соя»ч'*а«ик липопротеидов, а именно ; хиломикроны, ЛОШ, ЛНН. ha второй стадии ультрацентрифугирования в плотности 1.09 г/мя получали Дп(а) обогащенную фракцию, содержащую примесь ЛВП.

Плазма крови человека 240 мл

ГЗбТгТьиз

хилошпсроны лонп а лши-

г. 1.

ультрацентрифуткрованна

4 (105000

24 ч, + 15"с)

Препарат плазмы без хилоьяпсронов, ЛОНП и ЛНП

г7ил°™™~™"

ультрадентрифугкроваииа

плазма без хилокякронсв.^г— ЛОШГ.ЛНП, яп(а) я ЛВП

Л <135303 'г

Рис. 1. Схема выделения Лп{а) методом ультрацентсифугиропания в градиенте плотности нейтральной соли наэг, с последувдей гель-фильтрацией.

Эту фракции разделяли гель-Фильтрацией на колонке, с ЗерЬагосс сь—.з. Профиль гель-Фильтрации представлял из себя два пика, соответствуютих частицам Лп(а) и ЛВП. Вследствии своей черезвычайно сильной гетерогенности частица Лп(а) , Флотирует в очень потоком интервале плотности. Интервал флотации различных изоформ Лп(а) варьирует от 1.06 до 1.12 г/мл, однако мы использовали градиент плотности от 1.06 до 1.09 г/мл. Таким образом ма получали фракцию Лп(а), представленную только частью обиего пула Лп(а), однако только в таких условиях было возможно наиболее полное разделение частиц Лл(а) и ЛНП, а также уменьшение количества примеси ЛВП.

Препарат Лп(а) после гель-Фильтрации исследовали злектроФоретическими и иммунологическими методами. Результаты данных исследований показали, что образец Лп(а), используемый в дальнейшем в качестве антигена, представляет собой высокоочииешшй препарат Лп(а), обладающий характерной для этой частицы электрофоретической подвижностью и практически не содержит примесей каких-либо других классов ЛП и белков плазмы.

Получение и характеристика моноспецифических ПкАт барана к .л(а) человека. Антисыворотку к Лп(а) получали иммунизируя баранов препаратом Лл(а), выделенным как описано вше. Поскольку частица Лп(а) содержит два ков^лентно связанных белка апоВюо и ano (а), то после иммунизации мы получали биспецифйчцую сыворотку, взаимодействующую с обогата ап белками. Схема получения ацтнтед приведена на рис.2. "

Антитела к ano Вюо удаляли методом колоночной хроматографии на сорбенте с иммобилизованными ЛНП. Специфичность антисыпоротки контролировали методом РИД, В результате трех последовательных хроматография 50 мл антисыворот! было выделено 90, 30 и 10 мг белка антител к ЛНП соответственно, после чего антииыворотка практически не взаимодействовала с ЛНП.

Кхнувизация Яедаяо» препаратов Лп<е) чаяовека

яииг iwiwiTmit m» ir rw

Езодоцгфнчная актисызоротки аитетела к ЛЕЕ j хроматография па ИНД егорезв

ЫокоспацЕфэтная антнсьсз^ротка

йот'Ж сыворотке Ыараяа ->-1 фракцаонзроваки^

Фракция высококолвкуляриьос беякоз, coaspswekx I cG ^б'его^ сьторотак'баразш wiiaoaSus^ian'^^^Qi

.......... ■! m ■ ............. «m.....................................«и»»..................

брокция очещоннш: гаошюглаагдатов класс» 6

Рис.2. Схема выделения моноспсц;:Оическ;с: ПкАт барана к Дп ( a ) человека.

Ряд авторов для истощения антисызоротки по антителам к апоВ^оо проводят преципитацию апо В-специФичных антител, добавляя 0.5 - 1.0 мг белка ЛНП на 1 мл антисыворотки 6-кратно (Alberto J.J. et.al. 1974). Использование нами аффинной хроматографии на ЛНП сеФарозе позволило избежать постоянного выделения препаративных количеств ЛНП благодаря многократному использования аффинного сорбента.

Лммуноглобулиновая фракция Сэлков - была выделена фракционированием сульфатом аммония. Дальнейшую очистку иммуноглобулинов s (igG) проводили путем ионнобменной хроматографии на ДЕ-52 целлюлозе (Wathman, Англия). Для выделения IgG наносили 10 мг белка на 1 мл геля, что составляло не более 20 °s от номинальной сорбционной емкости данного типа ионообменника. Эти условия обеспечивали высокий выход чистого препарата -IgS и отсутствие потерь при частичном падении сорбционной емкости. Присутствие антител к Лп(а) определяли методом РИД. Фракция высохоочищенных igo, злшруемая с сорбента. 150 мН трис-SCl буфером гН 7.8. содержала ПкАт к Лп(а). Выход белка при очистке антител составлял 70*.

Результаты РИД представлены на рис.3. Видно, что полученный препарат антител дает одну полосу преципитации как с плазмой крови человека, так и с Лп{а), и не взаимодействует с препаратами ¿НП, ЛОНП, ЯВИ и альбумином человека.

—!—■■ ——-.....-. Высокая гомология участков

а первичной структуры апобелка(а) с молекулой плазминогена может

. V/

■ • приводить к перекрестному

5 ЧО ^ л Рис.3. Результаты двойной

.■-X ГУ /в радиальной иммунодиффузии в 0.5» ; ■ Геле агарозы. „ „„„

. . ■ 1-препарат.ДЙ}; 2-препарат ЛВП; 3-• »О. препарат ЛОНП; 4.-препарат плгэми крови; э-препарат Лп<а>; ----------ьбумина. В --------

4 6-препарат альбумина. В центральную

------ лунку .вносили препарат антител

против Лп(а>.

взаимодействию ПкАткапо(а) с. плазминогеном. Изучение Взаимодействия полученных ПкАт с плазминогеном было проведено методом ИФА. Для этого в плашку для ИФА вносили по 100 мкл раствора препаратов Яп(а) и плазминогена человека из расчета 0.2 мгк/мл белка в одну лунку. Вторым слоем вносили препарат антител, кокъогированных с пероксидаэой. Результаты ИФА приведены на рис.4.

Как видно из приведенных данных полученные

моноспецифические ПкАт к Лп(а> практически не взаимодействуют с плазминогеном.

Таким образом нам удалось получить высокоочиденную фракцию 1да, содержаиую моноспецифические ПкАт против апобелка(а).

э

Л280

Разработка методов определения концентрации Лп(а) в плазме и сыворотке крови человека. Для определения концентрации Ли(а) нами были разработаны два иммунологических метода: радиальная иммунодиФФузия(РИД) и твердоФа~.шй иммуноферментиый анализ(ИФА).

-— -- 7 ------ ■ ' При разработке метода РИД была

взята методика, впервые описанная МапсДпД. основанная на образовании кольца преципитации, образующегося в результате взаимодействия антител заполимеризованньк в геле агарозы, с антигене' (МапсДла С., еЪ.аД. 1070). Для приготовления 1Я геля исаользовали специальную агарозу, которая

полимеризуется при температуре не превышающей 45°С. Бремя диффузии во влажной камере при комнатной температуре составллло 48 часов. В качеств? калибратора использовали Лп(а)-содержащую плазму. Диапазон концентраций Лп(а), измеряемых данным истодом, составлял от

1.5

1.0

е.з

0.0

А ^ ^

Титр аштхгел

Рис. 4. ИФА препарата ПкЛт к Лп{а). 1-препарат плазкиногена; 2-лрепарат Лп(а)

3 до 150 мг/дл. Нами также был разработан метод ШТ-А) . В качестве первого слоя использовались моноспецифические ПкАт барана к Лп(а) человека, полученные ранее. Для блокирования неспецифичесхой сорбции использовали раствор альбумина в ФБ. Вторым слоем наносили образцы плазмы и препараты Лп(а), затем - ПкАт к Дя{а), кс-ьюгированные с пероксидазой Раствор г чъюгата и обрасти плазмы готовили также на основе 1« раствора альбумина.

Позже в наших совместных исследованиях с институтом Медицинской биологии и генетики человека Университета г. Инсбрук были проведены параллельные измерения уровня Лп(а) в образцах плазмы крови человека методами ИФА, разработанными в отом институте (Memeoi H.J. et.al. 19Э0) и независимо в напей лаборатории, с целья определения сходимости получаемых результатов. Методами статистической обработки бияо показано, что коэффициент корреляции значений, измерении: обоими методами, составлял 0.9529, p<o.oooi.

Синтез и характеристика сорбен:а с иммобилизованными моноспецифическими ПкАт к Лп(а) человека. Одним из важных вопросов, которые предстояло решить прежде, чем приступить к созданию иммуносорбента был вопрос о выборе матрицы и способе иммобилизации антител.

Широко известны примеры использования Sepharooe CL-4B как в мировой клинической практике (Stoffel w. et.el. 1981, Mileeon et.al. 1981, Borberg H. et.al. 198Э), так и в напей стране (Pokrovsky S. et.al. 1967, Kukhorchuk V. et,al, 1988), Такая матрица не токсична, не пирогенна, обладает достаточной химической стабильностью в кислотных и щелочных средах.. Поэтому в качестве матрицы для синтеза иммуносорбента была использована Sepharoae CL-4B, Основываясь на опыте создания сорбентов для ЛНП-аФереза (АдамоваИ.Ю. 1989) при иммобилизации антител мы приняли решение использовать метод активации агарозной матрицы бромцианом.

Основной функциональной характеристикой иммуносорбента с иммобилизованными антителами является специфичность связывания антигена в присутствии других белков. Поэтому на следующем этапе мы изучали взаимодействие плазмы крови человека с иммобилизованными ПкАт против Лп(а).

Результаты аффинной хроматографии плазмы крови человека на иммуносорбенте представлены на рис.5. При воздействии кислых значений pH материал, связавшийся с сорбентом, элюировался одним пиком. Исследование элюата методом вертикального электрофореза в ПАДГе в денатурирующих условиях в отсутствии SH-реагеита показало, что в элюате присутствует только одна высокомолекулярная полоса, соответствующая комплексу белков [апо(а)-апоВюоЬ связанных дисульфидной связью, тогда как в присутствии sh реагента элюат был представлен двумя полосами, соответствующими ano (а) и апоВ^О (рис.б)

Аналитическое ультрацентрифугирование и иммунохимический анализ исследуемого препарата, проведенный методом иммуноэлектофореза, показали, что элюат с иммуносорбента содержит частицу идентичную по Физическим и антигенным свойствам частице

а280

Профиль аффгашой хроматографии плазмы kd^bk на сорбент?. содерхаием в^ качестве лиганяа

Рис. 5.

моноспециФйческйе ~ ПкАт ба6ан£Гк~ап9белку<а). человека. Qo^en сорбента З^ш.^.объеи плазмы Í5 г~ ----------------

Лп<а) в. плазме холонху 0.5 мл/ниц.

мл. тока

Концентрация плазмы через

1 2 3

ыг/дл. Скорость

Лп<а), выделенной методой ультрацентркфугирования с последую—------------------цей гель-фильтрацией, и не содержит

примесей других компонентов плазмы. -*-апо(а)-Втлп Далее проводили подбор оптимально« условия сорбции Лп(а) и регенерации качестве элвента был М глициновый буфер,

Рис.6. ЭлектроФореграм..а эязоата, полученного в результате проведении

—--------------------------- антитдп(а>

водили в

. _ ______________ концентрацией

акриламида в яеиатурируюаях условиях. ... I" препарат

апо(а)

100*

сорбента. В выбр н 0.2

отработанный SH-

2- препарат

SeareiiTOM,___

- препарат ЛШ.

содержащие 0.15 И Nací рН 3.0 поскольку глициновый буОег является безопасной и удобной физиологической системой я только для данного буфера не происходило падения сорбционной емкости в ряду хроматограФий и достигалось наиболее эффективная диссоциация комплекса антиген-антитело.

На следующем этапе работы мы исследовали характер

зависимости сорбционной емкости от количества иммобилизованного лиганда. Сорбционную емкость считали хах разницу количества Лп(а) в плазме ло и после инкубации с 1 мл геля. Поляклональные антитела барана иммобилизовали на ЗерЬагоае сь-4В в концентрациях от 2 до 16 мг/мл геля. Хроматографию с 1 мл плазмы проводили "бетч" методом на 100 мкл сорбента. Время инкубации плазма с сорбентом 1 и 34 часа.

Показано, ' что зависимость сорбционной емкости от концентрации иммобилизованного лиганда носит нелинейный характер, а также значительно меняется от времени инкубации сорбента с плазмой (риг-.7). Такой характер зависимости можно объяснить затрудненной диффузией крупной частицы Лп(а) (более 260 X] внутрь конических пор гранул сефарозы, н тем самым-лимятируюлей процесс взаимодействия антиген-антитело.

_____ __ ________О том, что диФФузкотш

процессы вносят значительный

вклад во взаимодейстие ЛлШ с

иммобилизованными антителами

свидетельствует, также,

зависимость сорбционной

емкости от времени инкубации с

плазмой. Количество Лп(а),

связавшееся за первые три часа

проведения аффинной

хроматографии составляет 70*

Рис. 7. Зависимость Лп(а) связывающей активности от

о в 1С» Ю0 "мкл сорбента. Время

Кошзпрада пзгюваиюшззгав «тлея инкубации сорбента с плазмой - ,составляло ц) — 1 и — от/ш гея» чада ПрИ комнатной

температуре.

от максимального количества Лп(в). связавшегося за 24 часа. В условиях проведения клинической процедуры Лп(а) афереза такое снижение патогенного компонента позволяет надеяться на получение ■положительного клинического эффекта, по аналогии с данными полученными при использовании сорбента для- специфического удаления ЛНП (КикЬагсЪик У.У. е!.в1. 1988).

Выбор оптимального метода выделения препаративных количеств

Лп(а). Планируя в дальнейшем необходимость в выделении значительных количеств препарата До(а) в качестве антигена для получения препаративных количеств поликлокальных антител, иы попробовали различные методы выделения препаративных количеств Лп(а).

Было проведено сравненье трех методов выделения Лп(а) из плазмы крови человека. Метод 1 - стандартные метод, который подробно описан в разделе "Выделение и характеристика препарата Лп(а)". Количество чистого препарата Лп(а), получаемого этим методом в зависимости от исходное концентрации Лп(а) в плазме (30-50 мг/дл) составляет в среднем около 25 мг из 240 t't плазмы. Недостатками данного метода, на наш взгляд, является мыогостадийность и длительность, а также то. что все стадии накладывают ограничения на получение препаративных количеств Лп(а). Основные потери обусловлены тем, что при ультрацентрифугировании выделяются фракция плазмы более узкая (1.063-1.090 г/мл), чем диапазон плотностей Флотации Лп(а). Однако это необходимо для полного удаления ЛНП. которые трудно отделить на стадии гель-фильтрации.

Несомненным преимуществом этого метода является высокое качество очистки препарата Лп(а) и сохранение нативности частицы этого ЛП.

Для уменьшения потерь была проведена модификация известных мётодов и разработан метод 2, включающий одну стадия ультрацентрифугирования с последующей аффинной хроматографией на сорбенте, содержащей в качестве лиганда ПкАт к ЛНП. При таком сг^собе выделения на стадии уьтрацентриФтирования отделяли Фракцию апоВ-содержаиих Лп, а на стадии аффинной г оматограФии выделяли препарат Лп(а). Мы показали, что пои этом Лп(а) полиостью извлекается из плазмы. Однако при эладии буфером с очень низким значением рН наблюдается агрегация частиц Лп(а) и Формирование осадка, поэтому с точки зрения выхода Лп(а> метод 2 не имеет значительных преимуществ. Кроме того в нем сохраняется этап ультрацентрифугирования, соответствующий первой стадии метода 1, и связанные с ним недостатки, такие чак длительность и ограничение в количестве получаемого на этой стадии материала. Вместе с тем, он включает на сдну стадию меныве. что, несомненно.

является его достоинством.

Наиболее преСпективным, на нав взгляд, является метод 3. Это одностадийный метод выделения Лп(а) путем аффинной хроматографии на иммуносорбенте с моноспецифическими ПкАт барана к ano(а). -Количество Лп(а), связываемое иммуносорбентом, зависит от таких Факторов как: концентрация иммобилизованных антител, времени инкубации сорбента с плазмой, концентрации Лп(а) в плазме, температуры и г~>. Наиболее эффективно сорбент связывает Лп(а) в .-•чение первого часа взаимодейству я. При концентации антител в геле 9.8 мг/мл, 1 мл сорбента связывает 1.5±0.2 мг Лп(а). Таким образом одностадийный метод выделения Лп(а) путем аффинной хроматографии на иммуносорбенте является простой методикой и позволяет быстро получать препаративные количества Лп(а) из большое объемов плазмы.

Клиническое применение синтезированного иммуносорбенте в Процедуре Лп(а) аФереза. Ограниченные клинические испытания Созданного нами иммуносорбеита для удаления Лл(а) из плазмы крови Человека методом иммуносорбции в системе экстракорпорального геровообрашения были начаты в институте , клинической кардиологии КНЦ РАМН в конце 1990 года. В клинические испытания бьш включены три пациента с ангиографич ски подтвержденным коронарным атеросклерозом, имеющие повышенный уровень Лп(а), нормальный уровень ОХС, ХС-ЛНП и ЛВП (табл. 1)

Таóizmxjx jl .

Оспоааая характеристике; зольных, впдвчеявьее а веслояоаяппэ

Параметры Падститы

Л.П. в.Н.

Воореот 38 1S 32

БОЯ U и м

лп(а> иг/да 109 12« 90

евнотяп Яп(а> S2/S4 33 S2/S3

ОХС мг,дя 11) 210 217

КС-ЛОТ иг/дя !«• 140 140

кс-лзп МГ/ДД 38 43 3 •

1S

В процедуре иммуносорбции в контур экстракорпорального кровообращения включали колонку, содержащую анти-Лп(а)-иммуносорбент, через которую протекала плазма крови пациентов в течение трех часов. После проведения процедуры колонка с

Рис.8. Профиль регенерации иммуносорбента после проведения процедуры лп(а) аФереза.

Для кажтого пациента были изгоровлены 1-2 персональные колонки, которые использовались многократно.

Для определения эффективности и специфичности сорбции Лп(а) в условиях проведения клинической процедуры Лд(а) афереза измеряли динамику изменения концентрации Лп(а), апоВ и ОХС (рис.9). Показано, что в течение одной клинической процедуры Лп(а) может удаляться практически полностью, . также наблюдается незначительное снижение концентрации ОХС и апоВ в количествах, соответствующих содержанию ОХС и апоВ в составе частицы Лп(а).

Для определения специфичности работы сорбента в условиях глинического применения измеряли различные липидные параметры у пациентов до и после проведения процедуры Ли(а) афереза (данные приведены в табл.2.)

60

А в"00

»3

40

Щ ОАО А» ОДО После

КОЛОНКИ

Лп(а)

120

60

ф 0 I

0.6 1.2 >.в 2.4 3.0 3.6 4.2 ООъем плазмы прошедшей через колоику (л)

I

Рис. 9. апоВ и афереза. концентрация

шшмика изменения уровня

-(а) — ------- --------

о бае го

(а) во время^ проведения процедуры -концентрация ОХС; 2-кониентрация а) я ЛпТа) .

холестерина,

"^поГП:

Чтобы достоверно определить эффект специфичной сорбции на измеряемые параметры, исключить неспециФкческую сорбцию и эффект разбавления, связанные с экстракорпоральным кровообращением, двум пациентам были проведены процедур' плацебо. В процедурах плацебо в экстракорпоральный контур включали аналогичную колонку содержащую только верЬогоэе» С1-4П без антител. Полученные результаты приведены в таблице 3.

Из сравнения результатов процедур плацебо и Лп(а) афереза, вняло. что только - процедуре иммуносорбции происходит значительное снижение уровня Лп(а).. Незначительное снижение уровня ОХС соответствует количеству ОХС, входящего в состав частицы Лп(а). Также наблюдалось значительное снижение уровня тпиглотеридов, составляющее почти 50* от исходного уровня, причем такой зФФект был характере., как для собственно процедуры Лп(а) афереза, так п д~я процедуры плацебо. По-видимому эт> можно объяснить активацией триглицерид липазы, происходящей при системной гепаринизацик в процессе экстракорпорального кровообращения. Аналогично сильное снижение в обоих типах

Таблица 2.

Динамика уровня Пп(а) и других показателей; явоидогракмы -в течвнно процедуры Лп(&> вфарвза.

Показатели <М+м) Пациенты

л.н. Э.Е. в.И.

Лп(а) {мг/дл)* до после X удаления 91.0+6.1 33..¿1. 7 61 93.3+16.9 28.712.1 69 76.412.7 13.112.3 83

ОХ^ммоль/я)** ДО после X удаления 6.1+1.2 4.8+0.1 21 4.8+0.1 3.7+0.1 25 5.3+0.3 4.Ц9.1 22

ТГ (М1(0ЛЬ/Л)** ДО после X удаления 1.0+0.0 0.5+6.0 48 2.0+0.2 1.2+0.2 44 2.7+0.1 0.8+0.0 68

ХЛ-ЛВП'* до после X удаления 0.9+0.0 0.7+0.0 12 1.0+0.0 0.8+0.0 11 0.910.0 0.7+0.0 13

* Для 1в последних процедур, ** для всего курса.

Таблкда 3.

Изменение концентрация лшшдов п плазщшогена прп проведения процедур Лп(а) афереза и плацобо.*

Параметр Ла(а>-афереэ Плацебо

До После До Поело

Лп(а>. мг/дл ОХС. нмоль/л ХС ЛНП. ШОЛ&/Л ХС ЛВП, ММОЛЬ/Я ТГ, имояь/л плаэииноген, % 86.3+3.0 5.1+0.2 3.7+0.2 1.1+0.2 1.1+0.1 118.1+7.4 23.8+2.3 4.2+0.2 3.1+0.2 1.010.0 0.710.1 91.214.9 114.6 4.6 3.3 0.9 1.4 113.0 136.6 3.5 2.6 0.8 0.5 96.0

* Приведены даякыэ (К+я> гв процедур :п(а> афереза и одноС

процедуры плацебо для больного Э.Е.

процедур наблюдалось и для Фибриногена, причем этот эффект не воспроизводился в' экспериментах Да vitro. Это такие мояет быть связано с особенности"! экстракорпорального кровообращения, при которой часто происходит вшадение Оибриновых сгустков на ловушках воздуха, в магистралях и на ¿ильтрах колонок, а не со свойствами сорбента, т.к. аналогичный эФФект был замечен при проведении процедуры плацебо.

Одним из сама: острых вопросов, возникающих при использовании иммуносорСентов в клинической практике - это вопрос о смыве лиганяа. Чтобы проследить за возможным смывом лигакда с матрицы пси проведения Лп{а) аФереза нами бия разработан специальный метод ИФД на присутствие в крови пациентов вторых антител против igG барана. Таким методом исследовали образцы плазма пациентов, взятые до лечения и в течение длительного курса Лл(а) аФереза. Б качестве отрицательного контроля использовали пул плазм новорожденных и пул плазм здоровых доноров. Было показано, что в течение длительного курса Лл(а) аФереоа не наблюдается существенного увеличения титра вторых антител в крови пациентов.

Исследование некоторых аспектов метаболизма Лп(а) in vivo. Накоплено значительное количество данньа. з том, что высокий уровень Лп(а) может рассматриваться как независимый Фактор риска возникновения и развития атеросклеротических поражений сосудов. Однако механизм участия этой час- щи в атерогенезе и вопроси ее метаболизма мало изучены. Лп(а) аферез, на наст взгляд, является уникальной возможностью исследования in vivo некоторых ^спектоз метаболизма г'"эй частицы в организме человека.

¡in исследовали зависимост. уровня Лп(а) or времени, прсл'Лдкего после проведения процедуры Яп<а) афереза (рис. 10) . Анализ порученных данных показал, что возвращение концентрации Дп(а) :с исходному уровня происходит на 3-4 день после проведения процедуры Ля(а) афереза. Однако при сравнении кривых восстановления Лп(а) в начале лечения и после проведения 40 процедур наблюдалось .остоверное замедление скорости восстановления Лл(") до 5-6 дней. Кроме того после первых процедур МЫ наблюдали так называемый "Rebound phenomenon", когда уровень Лп(а) через некоторое время после проведения процедуры

значительно превосходил его исходный уровень. После 40 процедур Лп (а) афереза такого эффекта не наблюдалось.

Была посчитана константа к, отражающая Фракционную скорость катаболизма, выраженная Формулой(Агл^гопд V.». еъ.а!. 1989),

1п _£о_:_с_

= - «

где Сс

исходная концентрация Ли(а)

СИ - минимальная концентрация Дп(а) после проведения процедуры Лп(а) афереза, '

о - концентрация Лп(а) в момент времен.; £ после процедуры.

48 96 144 1Э2

Время после проведения процедуры (ч)

240

Рис. 10. Динамика восстановления уровня Лп(а) в плазме крови после его удаления в процессе экстракорпоральной иммуносорбции (пациент Ф.И.).(а)-после 1-ой процедуры Ли(а) афереза: (б)-после 40-ой процедуры дп(а) афереза.

Как г, и дно из значения констант, приведенных в табл.4

скорость возвращения Лп(а) к исходному уровню у всех трех

каииенюв меняется практически в 2-3 раза в процессе длительного

курса Лп(а) афереза. Вероятно, это означает адаптацию организма к

регулярному еженедельному удалению данного ЛП. ^

Совместно с институтом медицинской биологии и генетики

человека, г. Иннсбрук, Австрия, было проведено. исследование

скорости восстановления различных изоформ Лп(.а) после проведения

пр-цедуры Лп(а) афереза. .' ,

• Таблица 4.

Нзиеновав фракщгончой скорости катаболизма Лп(а) а течение длительного лечения паяиектов процедурами Лп(а> афереэа

Количество проведанных процедур Фракционная скорость катаболизма <Mi.SE)

Пацпэпты Л.Н. | З.Е. И.

| а.801+0.369 1.0.389+0.041 0.249+0.100 | 0.261+0.054 1.13 2+8.116 3.347+0.034

процедур Лп<а> »;®реза.

Для этого использовали образш.. плазмы крови гетероэигот1 ж кациентов (О.ц. иЛ.Н.), имеющих Фенотип Лп(а) з2/з3 и ,

соответственно. Фенотипирование проводили методом иммуноблотинга. Покатано, что только у пациента Л.Н. наблюдалось достоверное различие в скорости восстановления и изоФорм (рис.11). У Пациента О.К. зависимость соотношения различных изоФорм от времени со дня проведения процедурь ■ была менее выраженной, ¿зозкохно вследетвии того, что доля изойг-чы в общем пуле Лп(а)

была черезвычайно мала.______ ______ _

75%-'

N

0- 50%

о

;5% •

с

3 о

52

¿>2

"54

вг

э4

32

З4

62

Э4

0 12 3 4 8 в

Время гасло проведения процедуры (Я»м)

Рис. 11. Изменение соотношения различных изоФорм при возвраиении уровня Лп(аТ к исходному проведения процедуры Лп(а) афереза (пациент Л.Н.).

ю

Л~ (а) После

4

выводы

1. Разработан метод выделения препаративных количеств високоочищеиного препарата Лп(а), проведено сравнение трех методов выделения Jin (а);

2. Получены и охарактеризованы моноспецифические поликлональныа антитела барана против Лп(а) человека;

3. На основании полученных антител разработаны два иммунохикических метода определения концентрации Лп(а) в Физиологических жидкостях;

4. Синтезирован и охарактеризован иммуносорбент, содержаний в качестве лиганда моноспецифические поликлональные антитела барана к Лп(а) ;

5. В экспериментах In vitro и ex vivo подобраны условия для клинического применения икмуносорбента в процедуре Лп(а) афереза;

6. Исследована динамика восстановления уровня Лп(а) после проведения процедуры Лп(а) афереза, обнаружено, что при длительном курсе процедур происходит замедление скорости восстановления Лп(а) после его удаления;

7. Биохимическими методами в рамках ограниченных клинических испытаний показана безопасность и эффективность процедур Лп(а) афереза на примере еженедельного проведения пе эцедур трем пациентам в течение 1.5-2 лет.

Список работ опубликованных по теме диссертации

1. Адамова И.О., Афанасьева О.И., Беневоленская Г.Ф., Покровский С.Н.// Получение поликлональных антител, специфичных к липопротеиду (а) плазмы крови человека./ Иммунология.- 1990.-Н. 4.- С. 71-73.

2. Афанасьева О.И., Адамова И.О., Беневоленская Г.Ф., Сусеков А.В., Покровский С.Н.// Кммуносорбент для выделения я удаления из плазмы крови человека липопротеида (а)./ Доклады /садемии наук,- 1991.- Т. 318.- Н. 6.- С. 1492-1495.

3. Афанасьева О.И., Адамова И.О., Беневоленская Г.Ф., Покровский С.Н.//Сравнительное изучение методов выделения липопротеида(а) плазмы крови человека./ Бюллютень экспериментальной биологии и медицины.- 1992.- Н. 3.- С. 268-270.

4. Сусеков А.З., Афанасьева О.И.. Адамова И.О., Лякиоев А.А., Кухарчук В.В., Покровский С.Н.// Применение иммунооорбента для селективного снижения уровня липопротеида (а) у больных с коронарным атеросклерозом./ Кардиология.- 1993.-Т. 32.-N11-12,- С.52-56.

D.Pokrovsky S.H., Adaaova I."u., Afanasleva O.I., Benevolenakaya G.?.// Ioaunoaorbent for selective removal of lipoprotein (а) from human plasaa: la уЦ:го study./ Artificial Organs.- 1991.-Vol. 13(3).- P. 136-14«.

0. S.X.Pokrovaky, X.Yu.Adasova, A.V.Susekov, O.I.Afanaaleva.// Lipoprotein (a)-apheresie by ipuaunosorbent. / Abetracts of the 17tti ES&O Congress, Bologna.- 1990.

7. S.H.Pokrovaky, I.Yu.Adasova, O.I.Afanaaleva, A.V.Susekov, V.V.Kukharchuk.// tp(aj-aphereale by isuaunoaorbent. Preliminary clinical results./ Abetracts of the 18 ESAO Congress, Vienna, Austria. - 1991*

8. Pokrovsky S.H., Adasova I. Yu., Afanasleva 0.1., Benevolenskayn G.V,, Susekov A.V., Kukharchuk V.V.// Affinity sorbenta for correction of lipid cethabolic disorders./ Abstract of the 18tli Word Congress of the International Soslety for Art^iclal Organ», Monreal, Quebec, Canada. -1991.

9. Pokrovsky З.И., Suaekov A.V., Adaaova Х.Уи., Afanasleva 0.1., Benevolenakaya G.F., Kukharchuk V.V.// tp(a)-aphereala. Prelininary clinical results./ Abstract of the 18th Word

Conor«»» of the International Soalaty for Artificial Organe, Monreal, Quabeo, Canada. - 1691.

10. S.H.Pokrovaky, I.Yu.Adasovc, 0.1.Afanaaieva, A.V.Suaekov.// Selective removal of £p(a) by extracorporeal iaaunoadaorbtion./ Abatraota of tha 7th Dreaden Lipid Syapoalua, - 1991.

11. S.N.Pokrovaky, X.Yu.Adaaova, O.I.Afanaalava, A.V.Suaekov.// lawunoaorbant for «elective reaoval of tp(a) fron hunan blood plaana./ Abatracta 9th Xnternation*) Synpoalua of Atheroacleroaia, Hoaesond, Illinois OSA.- 1991.

12. Pokrovaky 8., Varakin Yu., OachepkQVa E., Skvorzov A.// Afanaslevs 0., Arabidze Q.// Lp(a) In patients wi.A cervical atherosclerosis./ fiatracta Sth International Syapooluo of Athnrosclerosia, Itooeaond, Illinois Ü3A. - 1091.

13. S.N.Pokrovaky, I.Yu.Adaaova, D.I.Afanaaieva, A.V.Suoekov. V.V.Kukhafchuk.// Affinity chromatography in thw trentnent of lipid asihsbolloni disorders. Abstracto 4th International Congress World Apheresis Association, Sapporo, Japan. - 10S2.

14. 3.$i.5*okrovoky, SuaekovA.V., I.Yu,Adasovs, 0.?.Afanaaieva, V.V.Kukharchuk.// Lp(o)-aphoreoia. Prcliainary clinical results./ Abstract 4th International Congress World Aphoreslti Association, Sapporo, Japan. - 1992.

15. A.A.Lyakishov, V.V.Kukharchuk« 0.1.Afanaaieva, A.V.Susekov, V.V.Titov, ' Pokrovsky S.If.// Biochemical honcostcöio in CAD patients underdoing long-term Lp(a)-aphsrosia./ Abstracts of the 0&th European Atherosclerosis Socioty Congress, Nice, 2?r«aca. - 1992.

16. Pokrovsky S.U., Suookov A.V., Afanaaieva A., Adaaovo I.Yu., Sukhcrchuk V.V.// TreatKent of patients »Ith coronary nthery disease by Lp(a) aphereala./ Abstract of 4th International Symposium. Trentnent of Severe Dyolipoprotoinenia in the Prevention of Coronary HSeftfr Disease, Munich, Gersuny, 1992.

17. Pokrovsky , Öusokov A., Afenosievo 0., Lyaklshcv A., JCukhaychuk V.// Iaaunoaphe fvala adsorption for lowering Lp(u)./ Abstract of 2nd International Conference on Zlpoprotoln(a), Hew Orloan, USA.- 1992.