Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Синтез и характеристика иммуносорбента для процедуры Au(a) афереза

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Синтез и характеристика иммуносорбента для процедуры Au(a) афереза"

?rß од

российская аклленяя иедишшсклх наук кардиологически* научны* центр нан экспериментальной карлюлогп

На правая рукописи

Афанасьева Ольга ваьмткша

СПТЕЭ ■ ХАРАКТЕР BCTS1A ЯЛНУНОООРВВНТА для шюшгдт! лжа) амереза.

05. оо. 04 - Бвохвхяя

Автореферат па соискаппе гченоа степепа кандидата бвоаогкчесхях «are

Посква 1993

Работа выполнена я группе аффинных сорбентов лял медицины ВИИ экспериментальной кардиологии Кардиологического научного центра РАИН.

Научны* руководят« ль : кандидат биологических наук. вед.н.сотр. ПокровсхяЯ Сергея Николаевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Ткачук Всеволод Арсеньевич; доктор биологических наук Валов ОряД Александрович.

Бедуиев учреждение - НИИ биомедицннсков химии РАМН

г.

Зашга^Лсандидатской диссертации состоится

■ ./..(. часев на заседании специализированного ученого совета X 001.33.03. в Кардиологическом научном центре РАМН по адресу: 131993. Москва, 3-я Черепковская уд., 15а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Кардиологического научного центра РАМН.

Автореферат разослан .Г7Г77ГК^ГЛ993 г.

Ученый секретарь специализированного сова кандидат биологических/" Т.И.Венгерова

хшт хпгятггнристикл работы

Актуальность проблемы, Липопротеия(а) [Лп(я)3 Сил открыт в Х963 г. шведским ученым Карлом Бергом (s^rg г. ХЗОЗ).

Лп{а) плазмы крови человека представляет собог? липоппотеидную частицу, соперкаау» уникальный апобелок f^rraia)] • ковалентно связанный дисулы&идной свчзью с молекулой ппчГ^оо ь' •истице, похояей на липоцротенд низкой плотности (ЛИП) (ffleao G.H. et.al. 1984, Gaubatz J.W. et.al. 1983).

В настоящее время доказано, что ypossm» 2п{а) в пли?«« гт~~:г чсяоиика положительно коррелирует с возникновением и развитием атеросклеротических поражений различных локализаций (Dahlen <з. et.al, 1971, Dohlen G. et д1. 1975, Albera J.J. et.al. 1934, Rhoada et.al. 1986). Полагают, что по сравнении с другими классами апоВ-содержащих липопротеидов (ЛП), Лп(а) овладеет более высоким атерогенным потенциалом (Kostner G.M. et.al. 1976, Ratii м. 1992), это может быть объяснено высокой степеньо гомологии первичной структуры белка ano(a) и молекул».' ШШЗМтгогена (Мс Lear» J.W., 4t. al. 19Э7, Haton D.I., ut.fti. 1337). Вследствии чего Лл(а) накапливаясь в стенках артерий, кокет тагсяе участвовать в процессе тромбообразования.

При концентрации в крови Лп(а) выяе 35-30 мг/дл к носи^яьяон уровне других ЛП вероятность возникновения атеросклеротических поражений сосудов увеличивается в 2-3 раза (Dahlen J.J., et.al. 1971). Имеются также данные о ток, что Лл(а) может служить одним из генетических маркеров атеросклероза (Зсдпи A.M. 1389).

Таким образом, на сегоднятшй день, многие автора склонии йясскзтривагь Лп(а) как независимый Фактор риска возникновения и развития атеросклероза. До настоящего времени практически не найдено эффективного способа снижения концентрации Лп{а) в плазме крови человека. Известно, что диета {Kostner о.Н. ot.al. 1904) я применение эффективных гиполипкяемячссглк препаратов практически не оказывают действия иа концентрацию Ли(а) а крови человека (Kostnar G.H,, et.al. lüBi, Savg R. et.al. 1989), f) последнее поемя появились сооОиенпп о том, что аасохие дозы i дк:-.х препаратов как: никотиновая кислота ¡Brealc» J.v. et.nl. 1992), ::~ацетнл-цистсин (Gaviah D et.al. 1990, Hansen Р.П. 1991) ц аскорбииовая кислота (Roth М, Pauling L. 1990, Rath М.- 1992).

могут несколько снижать повышенный уровень Ал(а). Однако все эти денные, за исключением данных о десствки никотиновой кислоты в больших дозах, весьма противоречивы и требуют дополнительного изучения. Таким образом, поиск новых эффективных способов снижения уровня Лп<&) является актуальное задачей.

Цель работы ; "Выяснить возможность коррекции уровня Хп(а> в плазме крови человека путем его удаления с помояьв яммуносорбеита, содерхажего в качестве яиганда моноспецифические полихлональные антитела (ПкАт) к Лп(а) человека. Задачи исследования:

1. Разработать метод выделения препаративных количеств Дп<а);

2. Получить к охарактеризовать моиоспециФическяе ПкАт барана к £п(а) плазм* крови человека;

3. Разработать метод количественного определения Дп(а);

4. Синтезировать и охарактеризовать кммумосорбент, содержания в качестве лиганда моиоспец;«бическне ПкАт к £п(а);

9. Изучить специфичность и эффективность такого сорбента в экспериментах 1с уХ^ео. подобрать условия для его клинического применения;

6. Показать безопасность в эффективность использован«* яммумосорбента в процедуре 1л(п> афереза:

7. Исследовать динамику восстановления уровня Дп(а) после его удаления из плазмы крови.

, Научная асвизна и практическая ценность работы. На основе момоспешифичесхих ПкАт подучен я охарактеризован сорбент, способный высохоспецийично и эффективно удалять Ап(а) из няаэии крови человека. Проведенная работа - первиЗ опыт в мировой практике по создания нового типа вСЗшшого иммуносорбента, позволявшего снижать уровень Ап(а) в крови Сольных с гяпер~Дп(а). практически не затрагивая при этом других компонентов крови.

Ограниченные хяиничеекке пепыташш созданного нммуиосорбенто прородадась в НИИ клинической кардкологни гл.Л.Л.Ияскикова КНЦ РАЩ в течение 1.5-2 лет. В иастояаее время начаты меадународиыэ йяинические испытания синтезированного сорбента в кдинмквя Германии я Англии.

Апробация работы. Диссертация апробирована ва межлабораторном семинаре Института эксперпмеитель эй кардиологвн

1ШЦ РЛНН (карт 1Э9Э).Натер*влм диссертации представлена

на: 7 меидународком липидном симпозиуме (Дрезден, ФРГ, 1531), 9 международном симпозиуме по атеросклероз« (Розекоия, СИЛ, 1991), 59 конгрессе Европейского Общества Атеросклероза (Кгаша, Франция, 1992), 4 меидународиои конгрессе Всемирной Ассоигаий^ А©ереза (Саппоро. Япония, 1992), на 2 кеядународиоЯ конференции по Лп(а> (НовыП Оряеаи, СШЛ, 1393).

Публнкацки. Основные результаты диссертация опубликован» г 17 печатных работах.

Структура и оОьем работы. Диссертация состоят яэ иведеаяв, , обэорз литературы, описания материалов и методов, результатов исследований и ия обсуждения, изложенных в б гдавак, заключения, выводов п списка используемой литературы. Работа пздояена на 128 страницах мааинопксного текста, включая 28 рисунков . 10 таблгш, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Выделение ЯП плазмы крови человека проводили по нетойпяг» описанной Ыпйдгвп, основанной кг якФЬеоеттальиок уяьто*-центриФУгкрованян в ступенчатом градиенте плотности нейтр&лькоЯ СОЛИ НаАг (Ыпйдгоп Г.Т. 1375), с НСКОТОРЫМП КОДВ&ПКаЦ.ШМ!.

УдьтрацентркЗуптропанкс плазмы, солеркаксп гспарич, 3.025 ИаИэ. 1 мМ тикера зол, 5 к!4 гнзг и ю мН ЭДТЛ, проводил« пря 15°С, 105000(3 В УГЛОВОЙ ротора Т1 45 ("ВзсЬпал", Австрия). Ян(а) выделяли из фяоткрушеЯ ерзкшт при покоя« гель-Окльтрзиш! яэ колонке с ЗарЬагоов С1.-40.

Икмуинзацш кнвотннх препаратом ¿л (а) проводили по общепринятой скеме. Для получения моноспецкфкчесггпт ¡штлтся антисыворотку, истощали на сорбенте с икмоСклнзовашшгя ЛИЯ до тех пор пока она не переставала пэзишдсйстовать с ЯНП. Эффективность истоиенип антисыворотхи по анти-апоВ антОТелаи проверяли методом двойной радиальной кммунодиффуэни (0ис1^ег1опу О. et.nl., 1933).

Фракции иммуноглобулинов класса О из НстояшшоЯ антисмпороткн получали путей сульфатного фракционирования.

*!ри получении аФФтшня сорбентов псподьзовяд® прсимупественно метод активации агароза бронцианон <Рога1Ь Д.. 1973) с модификациями. На активированную агарознур матрицу иммобилизовали моноспецифические ПкАт к Лп(а) и частВДЬ» ВШ.

Сорбцжмшув ёмкость тестируемых иммуносорбентов определяли : 1) методом хроматографии плазмы на колонке, содержащей 1-3 мл сорбента н/или 2) бетч методом, используя 100 или 200 мкл сорбента, в зависимости от целей эксперимента. Элюшао Лп(а) с сорбента проводили 0.2 М глициновым буфером с 0.15 М Vuci Рн э.0. В элюатах определяли концентрацию Лп(а), ano В и общего холестерина (ОХС). Количество Лп(а) составляющее разницу до и после инкубации плазмы с 1 мл сорбента определяло сорбционнув емкость тестируемого иммуносорбента.

Чистоту полученных препаратов Лп(а) тестировали такими методами, как : горизонтальный электрофорез в 0.5« геле агарозы, вертикальные электрофорез в полиакриламидном геле в денатурируюших условиях, иммуноэлектрофорез в 0.5% геле агарозы, радиальная им: унодиффузия.

Специфичность и чистоту выделенных антител исследовали методами : нммуноферментного анализа, кммуноблотинга. двойной радиальной иммунодиффузии, вертикального иммуноэлектрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях.

Иа основе полученных моноспецифических ПкАт к Лг 'а) была разработаны два метода его количественного определения : метод радиальной иммунодиффузии (РИД) и твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА).

Для определения титра вторых антител к иммуноглобулинам

барана в плазме крови пациентов, получавиих процедуры Лл(а) t

афереза, был специально разработан метод НФА.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Выделение и характеристика препарата Яп<а). Выделение Лп(а) плазмы крови человека с цель» получения антигена проводили, используя методику, включающую ультрацентрифугирование в ступенчатом градиенте плотности нейтральной соли НаВг с последующей гель-фильтрацией. Схема выделения Ли(а) представлена на рис. 1.

Первая стадия - ультрацентриФугирование плазмы в плотности 1.063 г/мл позволяла отделить фракцию апоВ~соя1'Р*амик липопротеидов, а именно ; хиломикроны, ЛОНП, ДНИ. На второй стадии ультрацентрифугирования в плотности 1.09 г/мл получали Лп(а) обогащенную фракцию, содержащую примесь ЛВП.

Плазма крови человека 240 мя

"НаВ г , ТГ1бТТТйл"

Х1ГЛОШ1КрОНЫ ЛОНП и ПШК

ультрацантрифугЕрованяз (105008 к, 24 Ч, *15°С)

Препарат плазмы без хклокикронов, ЛОНП я ЛНП

~«>15ТТ7мл**

плазма без хиломикронов, доад.лнп."п<а) я явп

Првнарят яп(а?

ультрацэнтрифугпровшше <Х05ааа а, 24 ч. *15°с>

'1НТ|'ИГ№||>|»^1. »■ — — ^ мз.« -.•' - • ГЧИТ-!*-*

ЛЕК

промежуточный слой 40 мл I

е* жаа«Э

Верхний сяой 1<э мл

Рис. 1. Схема выделения Лп(а) методом ультрацентрифугирования о градиенте плотности нейтральной соли НаЗг, с последующей гель-Фильтрацией.

Эту Фракцию разделяли гель-Фильтрацией на колонке, с БерЬагоЕе сь-'.3. Профиль гель-Фильтрации представлял из себя два пика, соответствующих частицам Лл(а) и ЛВП. Вследствии своей черезвычайно сильной гетерогенности частица Лп(а) , Флотирует в очень широком интервале плотности. Интервал Флотации различных йзоформ Лп(а) варьирует от 1.06 до 1.12 г/мл, однако ми использовали градиент плотности от 1.06 до 1,09 г/мл. Таким образом мы получали фракцию Лп(а>, представленную только частью общего пула Лп(а), однако только в таких условиях было возможно наиболее полное разделение частиц Лп{а) и ЛНП, а также уменьиение количества примеси ЛВП.

Препарат Лп<а) после гель-Фильтрации исследовали электрофоретическими и иммунологическими методами. Результаты данных исследований показали, что образец Лп{а>, используемый в дальнейшем в качестве антигена, представляет собой высокоочищенный препарат Лп(а), обладающий характерной для этой частицы злектроФоретической подвижностью и практически не содержит примесей каких-либо других классов ЛП и белков плазмы.

Получение и характеристика моаоспеют&яческих ПкАт барана к .л(а) человека. Антисыворатку к Лп(а> получали иммунизируя баранов препаратом Лп(а), выделенный как описано вше. Поскольку частица Лл(а) содержит два ков<-лентно связанных бедка апоВюо и ano (а). то. после иммунизации мы получали биепевдфйчнуо сыворотку, взаимодействующую с обоими ап ^елками. Схема получения антител приведена на рис.2.

Антитела к ano Вюо удаляли методом колоночной хроматографии на сорбенте с иммобилизованными ЛНП. Специфичность антисшзороткй контролировали методом РИД. В результате трех последовательных хроматография 50 мл антиеывороя было выделено 90, 30 и 10 мг белка антител к ЛНП соответственно, после чего антииыворотка практически не взаимодействовала с ЛНП.

Ккыувизация баранов препаратов Яв<е) человека

|

II'IIIII.......mi*................... ......... ■■■■■■- и i TI4I..—I.JI I.-I. и ч »IH>H I»~

Бзопецафичная азтиаыасротка • антитела ií Ш! —31Ш ьгсрозо

ff^l^H.» I I IHII.I. I, Jf.,.1 УМ1ЯЯУГ ir'l — ■ >4 I lililí .НИИ .............. I.I I II, m • . МШ**»' HDtlJ

I Ыокооп^инфн-теая антксызсротка I

Седа,к сыворо-.-хв с5арааа ---; фракпговдроваазм (MU^JjSO;, .

Фракция вьюококояакуляркьк баякоз, содврггйггл 1с5

бв ¡mu сыворотке Сарана

иокнооеыэнная храиатографзя

Фракция очищенных вымуноглобулшюд класса б

Рис.2. Схема выделения моноспецифических ПкАт бараке к Ял (а) человека.

Ряд авторов для истощения актясыворотки по антителам к апоВ^оо проводят преципитации ano В-специфичных антител, добавляя 0.5 - 1,0 мг белка ЛНП на 1 мл антисыворотки 6-кратно (Alberto J.J. at.al. 1974). Использование нами аффинной хроматографии на ЛНП сеФарозе позволило избежать постоянного выделения препаративных количеств ЛНП благодаря многократному использований аффинного сорбента.

а

Иммуногдобулинован фракция Cm ков _ была выделена Фракционированием сульфатом аммония. Дальнейшую очистку иммуноглобулинов G (igG) проводили путем ионнобменной хроматографии на ДЕ-52 целлюлозе (Watiimen, Англия). Для выделения XgS наносили 10 мг белка на 1 мл геля, что составляло не более 20% от номинальной сорбционной емкости данного типа ионообменника. Эти условия обеспечивали высокий вькая чистого препарата •IgG и отсутствие потерь при частичном падении сорбшкяшой емкости. Присутствие антител к Лп{а) определяли методом РИД. Фракция высокоочищенных igs, злюируемая с сорбента 150 мМ трис-HCl буфером рН 7.8. содержала ПкАт к Лл(а). Выход белка при очистке антител составлял 70*.

Результата РИД представлена на рис.3. Видно, что полученный

препарат антител дает одну полосу преципитации как с плазмой

крови человека, так и с Лп(а), и не взаимодействует с препаратами

ЛНП, ЙОБП, ЯВП и альбумином человека.

-------------Высокая гомология участков

с*. первичной структуры апобелка(а) с

О ^ молекулой плазминогена может

Гприводить к перекрестному

л Рис.3. Результаты двойной

р» ■ % Г) Л) Радиальной иммунодиффузии в 0.5ч

5» : Геле агароэы. ^

• 1-препарат ЛЯП; 2-препарат Л8П; 3

•4

препарат ЛОнП; 4.-препарат плгэмьс крови; э-препарат Лп(а);

б-препарат альбумина. В центральную

¿та. да™1 препарат антитея

взаимодействию ПкАт к апо(а) с плазминогеном. Изучение взаимодействия полученных ПкАт с плазминогеном было проведено методом ИФА. Для этого в плашку дли ИФА вносили по 100 мкл раствора препаратов Дп(а) и плазминогена человека из расчета 0.2 мгх/кл белка в одну яунку. Вторым слоем вносили препарат антитея, хонъюгированных с пероксидазой. Результаты ИФА приведены на рис.4.

Как : Видно ' из 'Приведенных данных полученные

моноспецифические ПкАт к Лп(а) практически не взаимодействуют с плазминогеном. = г

Таким образом нам удалось получить высокоочищенную фракцию Тяо. содержащую моноспецифические ПкАт против апобелка(а).

а280

Разработка методов определения концентрации Лп(а) в плазме и сыворотке кровк человека. Для определения концентрации Лп(в) нами были разработаны два иммунологических метода: радиальная иммунодиФФузия(РИД) и твердофа^лый иммунофешецтный анадиз(ИФА).

------ - . v -.....— х При разработке метода РИД Сила

взята методика, впервые описанная Mancini, основанная на образовании кольца преципитации, образующегося с результате взаимодействия антител заполимеризованньк в геле агарозы, с антигене' (Mancini G. , et.al. 1070). Для приготовления 15: геля исиодьзоваяи специальную агарозу, которая

полимеризуется при температуре не превышающей 45°С. Бремя диффузии со влажной камере при комнатной температуре составляло 48 часов. В качестве калибратора использовали Лп{а)-содерзтпуи плазму. Диапазон концентраций Лп(а>, измеряемых данным методом, составлял от

(f;> г

1.5 Г

1.6

в.5

G.Í

Титр антител

Рис. 4. №РА препарата ПкЛт к Лп(г>> 1-препарат плазминогена; ?.-препарат Лп{е

3 до 150 мг/дл. Нами также был разработан метод (ИФЛ). В качестве первого слоя использовались моноспецифические ПкАт барана зс Ял (а) человека, полученные ранее. Для блокирования неспецифической сорбции использовали is раствор альбумина в ФБ. Вторым слоем наносили образцы плазмы и препараты Лп(а), затем - ПкАт к Ли(а), ксыогированные с пероксидазоЛ Раствор г тыогата и образцы плазмы готовили тзкяе на основе is растпора альбумина.

Позже в иаиих совместных исследованиях с институтом Медицинской биологии и генетики человека Университета г. Инсбрук были проведены параллельные измерения уровня Лп(а) в образцах плазмы крови человека методами ИФА, разработанными в огон институте (Monzol H.J. et.al. 19Э0) и независимо п нааей лаборатории, с целью определения сходимости пояучаемт результатов. Методами статистической обработки было показано, что коэффициент корреляции значений, измеренных обоими методами, составлял 0.9529, р<о.соо1.

Синтез и характеристика сорбен:а с иммобилизованными моноспецифическими ПкАт к Лп(а) человека. Одним из важных вопросов, которые предстояло решить прежде, чем приступить к созданию иммукосорбента был вопрос о выборе матрицы и способе иммобилизации антител.

Широко известны примеры использования 5ер1югоее ст.-4 в как в мировой клинической практике ДЭ^^в! Н. е<:.а1. 1981, НИввоп в4.а1. 19в1, ВогЬегд н. et.nl. 19вз), так и в цаией стране (Рокгоувку 3. еЬ.а!. 19в7, КикЬагсЪик V. е*.а1, 1000), Такая матрица не токсична, не пирогенна, обладает достаточной химической стабильностью в кислотных и щелочных средах.. Поэтому в качестве матрицы для синтеза иммуносорбента была использована БерЬвгозе 0Ь-4В. Основываясь на опыте создания сорбентов для ЛНП-афереза (АдамоваИ.Ю. 1989) при иммобилизации .антител мы приняли решение использовать метод активации агароэной матрицы бромцианом.

Основной функциональной характеристикой иммуносорбента с иммобилизованными антителами является специфичность связывания антигена в присутствии других белков. Поэтому на следующем этапе мы изучали взаимодействие плазмы крови человека с иммобилизованными ПкАт против Лп(а).

Результаты аффинной хроматографии плазмы крови человека на иммуносорбенте представлены на рис.5. При воздействии кис пик значений рН материал, связавшийся с сорбентом, элюировался одним пиком. Исследование элюата методом вертикального электрофореза в ПААГе в денатурирующих условиях в отсутствии эи-реагента показало, что в элюате присутствует только одна высокомолекулярная . полоса, соответствующая комплексу белков [апо(а)-апоВюд], связанных дисульФидной связью, тогда как в присутствии реагента злюат был представлен двумя полосами, соответствующими апо(а> я апоВюо (рис.б)

Аналитическое ультрацентрифугирование и иммунохимичесхий анализ исследуемого препарата, проведенный методом иммуноэлектофореза. показали, что элюат с иммуносорбента содержит частицу идентичную по Физическим и антигенным свойствам частице

а280

Рис. 5. человека гноспецифически! сорбента (а) в. плазме

ООмм {на)

Профиль аффинной хроматографии плазмы

— --------- содержащем в. качеств

барана к апобедкуiai

--------.,---i* ... ({о;

________________________КР"ВЯ

на 'сорбенте, содержащем в. качестве лигьида

плазмы через

мл., объем плазмы 15 ил.

v плазме 43 i ~ ------ ----

колонку 0.9 кл/м1ш

мг/дл. скорость тока

Лп<а), выделенной методом ультрацентрифугирования с последую,---------------ШеЯ гель-Фильтрацией, и не содержит

примесей других компонентов плаэйы. -апо(а)-втлл ^алее проводили подбор оптимальных . 00 условий сорбции Дп(а> и регенерации

элюента был

12 3

-апо(а)

-апоВ

100'

сорбента. В

выбр н 0.2

Рис.6. полученш

качестве Н глициновый

буфер,

Электрофореграыи.4 эяюата, ого в результате проведения : хроматографии на анти-дп (а)

акриламида

Условиях.

- препарат

- препарат

з проводили

KOHU1 денат:

концентрацией ------урируадвх

ш:

отработанный S8-

§еагентом. __,

- препарат ЛНП.

содержащие 0.13 И Had рН 3.0 поскольку глициновый буфег является безопасной й удобной физиологической системой и только для данного буфера не происходило падения сорбциониой емкости в ряду хроматография и достигалось наиболее эффективная диссоциация комплекса антиген-антитело.

Яа следующем этапе работы мы исследовали характер

х*

зависимости сорбционной емкости от количества иммобилизованного лиганяа. Сорбционную емкость считали как разницу количества Лп(а) в плазме до и после инкубации с 1 мл геля. Поликлональные антитела барана иммобилизовали на Sepharoee СГ.-4В в концентрациях от 2 до 16 мг/мл геля. Хроматографию с 1 мл плазмы проводили "бетч" методом на 100 мкл сорбента. Время инкубации плазмы с сорбентом 1 я часа.

Похаэано, ~ что зависимость сорбционной емкости от

концентрации иммобилизованного лиганда носит нелинейный

характер, а также значительно меняется от времени инкубация

сорбента с плазмой (риг.7>. Такой характер зависимости можно

объяснить затрудненной диффузией крупкой частицы Лп<а) [более

260 Я) внутрь конических пор гранул сефарозы, и тем самым

лимитирующей процесс взаимодействия антиген-антитело,

____;____ ________ ;...........О том, что яиффузмояназ

процессы вносят значительный

вклад во взаимодейстие Лп*а) с

иммобилизованными антителами

свидетельствует, также,

зависимость сорбционной

емкости от времени инкубации с

плазмой. Количество Лп(а),

связавшееся за первые три часа

проведения » аффинной

хроматографии составляет 70«

Рис. 7. Зависимость Лп(а) связывающей активности от Лии иммобилизованного хроматогра-Зетч метом на 100 _ мкл сорбента. Время инкубации сорбента с плазмой составляло ЦТ - I и (2) - 24 часа при комнатной

температуре.

от максимального количества Лп(а), связавшегося за 24 часа. В условиях проведения клинической процедуры Лп(а) афереза такое снижение патогенного компонента позволяет надеяться на получение положительного клинического эффекта, по аналогии с данными полученными при использовании сорбента для специфического

удаления ЛНП (Kukharchuk V.V. et.al. 1988).

Выбор оптимального метода выделения препаративных количеств

йжееиеоещя

Смг/ия гадя)

ta (а). Планируя в дальнейшем необходимость в выделении значительных количеств препарата ta (а) в качестве антигена для получения препаративных количеств поляклокальных антител, мы попробовали различные методы выделения препаративных количеств На 1л).

Было проведено сравненье трех методов выделения ta (а) из плазмы крови человека. Метод 1 - стандартные метод, который подробно описан в разделе "Выделение и характеристика препарата Ли(а)". Количество чистого препарата Лп(а), получаемого этим методом в зависимости от исходной концентрации ta (а) в плазме (30-50 мг/дл) составляет в среднем окот 25 иг из 240 мч плазмы. Недостатками данного метода, на нав взгляд. является иыогостадийность и длительность, а также то, что все стадии накладывают ограничения на получение препаративных количеств Лп(а). Основные потери обусловлены тем, что при ультрацентрифугировании выделяются фракция плазмы более узкая (1.063-1.090 г/мл), чем диапазон плотностей флотации Лп(а). Однако это необходимо для полного удаления ЛИП. которые трудно отделить на стадии гель-Фильтрации.

Несомненным преимуществом этого метода является высохое хачество очистки препарата Лп(а) и сохранение нативности частицы этого ЛП.

Для уменьшения потерь была проведена модификация известных мётодов и разработан метод 2, включающий одну стадию ультрацентрифугирования с последующей аффинной хроматографией на сорбенте, содержащем в качестве лиганда ПкАт к ЛНП. При такой способе выделения на стадии уьтрацентрифугирования отделяли Фракцию апоВ-содержащих ta, а на стадии аффинной к оматограФни выделяли препарат Лп<а). Мы показали, что при этом Лп(а) полностью извлекается из плазмы. Однако при элюции буфером с очень низким значением рН наблюдается агрегация частиц Лп(а) и Формирование осадка, поэтому с точки зрения выхода Лп(а) метод 2 не имеет значительных преимуществ. Кроме того в нем сохраняется этап ультрацентрифугирования, соответствующий первой стадии метода 1, и связанные с ним недостатки, такие как длительность и ограничение в количестве получаемого на этой стадии материала. Вместе с тем, он включает на с дну стадию меньпе, что. несомненно.

является его достоинством.

Наиболее проспективным, на наи взгляд, является метод 3. Это одностадийный метод выделения Лп(а) путем аффинной хроматографии на иммуносорбенте с моноспецифическими ПкАт барана к ano(а). Количество Лп(а), связываемое иммуносорбентом, зависит от таких Факторов как: концентрация иммобилизованных антител, времени инкубации сорбента с плазмой, концентрации Лп(а) в плазме, температуры и гч. Наиболее эффективно сорбент связывает лп(а) в учение первого чеса взаимодейств! я. При концентации антител в геле 9.8 мг/мл, 1 мл сорбента связывает 1.5±0.3 мг Лп(а). Таким образом одностадийный метод выделения Лп(а) путем аффинной хроматографии на иммуносорбенте является простой методикой и позволяет быстро получать препаративные количества Лп(а) из больших объемов плазмы.

Клиническое применение синтезированного иммуносорбента в процедуре Лп(а} аФереза. Ограниченные клинические испытания Созданного нами иммуносорбента для удаления Ял (ai из плазмы крови человека методом иммуносорбции в системе экстракорпорального кровообращения были начаты в институте клинической кардиологии ЯНЦ РАМН в конце 1990 года. В клинические испытании был! включены три пациента с ангиографич ;ки подтвержденным коронарным атеросклерозом, имеющие повышенный уровень Лп(а), нормальный уровень ОХС, ХС-ЛНЛ и ЛВП (табл. 1)

ТаЗгазда а.

Основная хЛряиктврЕстггхг Зояьньк,

зшпгчвшшх » исслодоаажзя

Параметры Падаанты

п.п. I s.S. ».Н.

"ззреят 38 I 11 32

ЬоП и 1 Й и

яп<а) кг/дя 100 1 129 99

взнотяп Яв<а) 32/34 | 33 S2/S3 j

1 ОХС ыг.дя 169 i 219 217

I ХС-Л1Ш иг/дд ! leo 1 140

i мс-авп иг i яд I 38 1 4J ' 3 '

1S

В процедуре иммуносорбции в контур экстракорпорального кровообращения включали колонку. содержащую анти-Лп(а)-иммуносорбент, через которую протекала плазма крови пациентов в течение трех часов. После проведения процедуры колонка с

Рис.8. Профиль регенерации иммуносорбента после проведения процедуры лпТа) аФереза.

Для кажтого пациента были иэгоровяены 1-2 персональные колонки, которые использовались многократно.

Для определения эффективности и специфичности сорбции Лп(а) в условиях проведения клинической процедуры Яп(а) афереза измеряли динамику изменения концентрации Лп(а), апоВ и ОХС (рис.9). Показано, что в течение одной клинической процедуры Лп(а) может удаляться практически полностью, . также наблюдается незначительное снижение концентрации ОХС и апоВ в количествах, соответствующих содержанию ОХС и апоВ в составе частицы Лп(а).

Для определения специфичности работы сорбента в условиях глинического применения измеряли различные липидные параметры у пациентов до и после проведения процедуры Ли(а) афереза (данные приведены в табл.2.)

1

20

хс

а

•ла л»

ОйП Посла

колонки

Лп(а)

0.6 Г2 Га 2.4 3.0 3.6 4.2 Объем плазмы прошедшей через колонку (л)

обиего

120 „

60

концентрация

а)

Чтобы достоверно определить эффект специфичной сорбции на измеряемые параметры, исключить неспецифическую сорбцию и эффект разбавления, связанные с экстракорпоральным кровообращением, двум пациентам были проведены процедур' плацебо. В процедурах плацебо в экстракорпоральный контур включали аналогичную колонку содержащую только 8ер1иигове 01-48 без антител. Полученные результаты приведены в таблице 3.

Из сравнения результатов пределу» плацебо и Лп(а) аФереза. видно, что только - процедуре иммуносорбции происходит значительное снижение уровня Лп<а).. Незначительное снижение уровня ОХС соответствует количеству ОХС, входящего в состав частицы Лп(а>. Также наблюдалось значительное снижение уровня тпиглииерядов. составляющее почти 50* от исходного уровня, причем такой зФЛект был характере., как для собственно процедуры Лп(а) аФереза, так п д~я процедуры плацебо. По-видимому э^о можно объяснить активацией триглицерид липазы. происходящей при системной гепаринизаиии в процессе экстракорпорального кровообращения. Аналогично сильное снижение в обоих типах

Таблица 2.

Дииашоса уровня Яп(а> в яруг из: показателей лтптидограиыы а течение процедуры Лл<а> афереза.

Показатели (Н+м) Пациенты

Я.В. З.Е. О.И.

Лп(а> (иг/дл)* до после S удаления 91.0i«.l 33..¿1.7 61 93.3+16.9 28.7+2.1 69 76.4+2.7 13.112.) 83

ОХС(имоль/л>** до после X удаления 6.1+1.2 4.8+0.1 21 4.8+0.1 3.7+0.1 23 3.3+0.3 4.1+0.1 22

ТГ <ю«олъ(л) "* до после I удаления 1.0+0.0 0.5+0•0 48 2.0+0.2 1.2+0.2 44 2.710.1 0.810.0 68

хл-лвп*• до после X удаления в.9+0.0 0.7+0.0 12 1.0+0.0 0.8+0.0 11 0.9+0.0 0.7+0.0 13

* Для ie последних процедур, ** для всего курса.

Таблица 3.

Изменение концентрации талию» в плаэкияогева прв проведения процедур Лп(а> афереэа в плацебо.*

Параметр Лл<а)-афероэ плацебо

До После До После

Лп(а), нг/дя 86 3+3.0 23.8+2.3 114.6 136.9

охс. имолъ/л J Ц0.2 4.210.2 4.6 3.5

ХС лш, ииолыл г 7+0.2 3.110.2 3.3 2.6

ХС лвп. юголь/л 1 1+0.2 1.010.0 0.9 0.8

ТГ, кмолъ/л 1 110.1 0.7+0.1 1.4 0.3

плаэшшоген, * 118 1+7.4 91.214.9 113.0 96.0

* Приведены данные (Я+я) га процедур 1а(а> афереза в одной

процедуры плацебо дяя Сольного З.Е.

процедур наблэдалось и . для Фибряяогенч, приме;; птот " эффект не 'воспроизводился в экспериментах in vitro, это тагсяе может Снть сказано с особенностям экстракорпорального кровообращения, пои котором часто происходит выпадение оибриновых сгустков на ловушках воздуха, в магистралях и на Фильтрзх колонок, а ае со свойствами сорбента, т.к. вкатопттлнЯ эффект был замечен прк проведет«! процедуры плацебо.

Одним из сами;: острых вопросов, возникающих при использовании иммуносорбентоя я тлтеггсссхол арактике - г»то Rnrmr.^ - дш'ыдо. Чтобн ят»ея?гять sa возможным смывом

лигацда с матрицы пси проведении Лп(а) аФереза нами был разработан специальный метод ИФА на присутствие в крови пациентов вторнх антител против igs барана. Таким методом исследовали образцы плазм» пациентов, взятые до лечения и в течение длительного курса Лп(а) аФереза. Б качестве отрицательного контроля использовали пул плазм новорожденных и пул плазм здоровых доноров. Было покапано, что з течение плителького -ург-,

гс:: cyncCTHWHO""» T'iVÎM

i.; :: ;;-от"; Muie^Tor,, •_".":::':. :o с.:■::;-!о

• ■ "■: -о"'!'кст::о панин,- > топ, VTo ннгочии

yyo ■■ i"' лл/е! гы:;' не^'ил.с;':<1>лг';о;>

ni'...¡; .;,5 :ггоросклеротичцс,; ;ïk ¡юоауони i¡ ';ocy;..;;¡-

О;лл.,;о л:;<. лллуи умает;':'; Ч'лс -.ш- п атерогъ-ноое глн-лнл:*.'

:...... .. .!:;;• о ;rjy>;eif!i, лп(а) афереу, на ií.'jij иоглян, шмястсй

возможностью исследования in vivo некоторых , аспектов ыетаболилмя «яи«»» "гтт'т" oura;t..••;;<» чвлонкхз.

"': ..'■.."с :чл;"с««ос1 vpoí-:;íл ímíu) л> ллиллсо,

_____________ »¿уеле цровг-ения процедуры Лп(а) аФереза {рис. 10).

Диализ порученных данных показал, что возвращение концентрации Яп(а) -, исходному уровню происходит на 3-4 день после ппоя<?.пиуч» trewtrjiypy Л; и'« ; асегеза. Однако яри сразкешш «.рнвю : -о епт«'1 : • i лецзя Лп(а) и начале лечения я после цроведеци» 40 ироцетур наЯполчлось .остоверное замедление скорости восстановления Лп(") до 5-6 дней. Кроне того послр первых процедур Kit иа&шдади так называемый "Rebound phsnoraenon", когда уровень Лп(а) через некоторое время после проведения процедуры

значительно превосходил его исходный уровень. После 40 процедур Лп<а) афереза такого эффекта не наблюдалось.

Была посчитана константа к, отражающая Фракционную скорость катаболизма, выраженная формулоЖАгпи^гопд v.w. et.al. 1989).

с0 " с

1п --------

CD - СМ

- ** , где 0о - исходная концентрация Лл(а)

см - минимальная концентрация Лп(а) после проведения процедуры Лп(а) афереза.

/ с - концентрация Лп(а) в момент времен.; ? после процедуры.

180 г

48 96 144 192

Время после проведения процедуры (ч)

Рис. 10. Динамика восстановления уровня Лп(а) в плазме крови после его удаления в процессе экстракорпоральной иммуносорбции (пациент Ф,И.).(а)-после 1-ой процедуры ЛгКа) афереза; (б)-после 40-ой процедуры лп(а) афереза.

Как ¡¡и дно из значения констант, приведенных в табл.4 • кчрость возвращения Лп(а) к исходному уровню у всех трех нацистов меняется практически в 2-3 раза в процессе длительного курса Лп(а) афереза. Вероятно, это означает адаптацию организма к регулярному еженедельному удалению данного ЛП. • .

Совместно с институтом медицинской биологии и генетики человека, г. Иннсбрук, Австрия, было проведено. исследование скорости восстановления различных изоформ Лп<а) после проведения лр'-п;едуры Лп(а) афереза. " . ■

Таблица 4.

изменена« фракддончоа скорости катаболизма лп(а) в течения длительного лечения пациентов процедурами лп(а> афереэа

Количество

проведенных

процедур

Фрамшонная скорость катаболизма < Ui.SE)

а.в.

Пациенты З.Е.

в.И.

1

<9

« С.ао1+а.зв9

I 0.249+«.130 «

,9.339+0.041 0.261+0.034

1. 13 2 + 8. на в.347+9,854

Лия пациента З.Е. приведены данные полученнь» после га процедур Яп(а) * дереза.

Для этого использовали образца, плазмы крови гетерозигот1 ж пациентов (Ф.й. и Л.Н.), имеющих Фенотип Лп(а) з2/з3 и 52/34, соответственно. Фенотипирование проводили методом икмуноблотиига. Показано, что только у пациента Л.И. наб.толалось достоверное >_м!зл:г?;?е а скорости восстановления з2 и 2.4 изоФорм (рис.И). У пациента <?.й. зависимость соотношения различных изоформ от времени со дна проведения процедуры была менее вырагтенноЯ, яозмог.но пследствии того, что доля зэ изоФг~мы в общем пуде Лп(а) била черезвычайно мала.

75% 4

Ц- 50 %■

■

р 8 о

I

52

0 1 2 3 4 3 8

Время ПОСЛ» ПрсзЗДЙМЯ Процедуры (дай)

Рис. 11. Изменение соотношения различных изоформ при возвракении уровня Лп(аТ к исходному, проведения процедуры лп(а) афереза (пациент Л.Н.).

ю

Л-(а) п^сле

выводы

1. Разработан метод выделения препаративных количеств высокоочшценного препарата Лп(а). проведено сравнение трех методов выделения Лп(а);

3. Получены и охарактеризованы моноспецифические поликлоналыше антитела барана против Лп(а) человека;

3. На основании полученных антител разработаны два иммунохимичесхих метода определения концентрации Лп(а) в Физиологических жидкостях;

4. Синтезирован и охарактеризован иммуносорбент, содержащий в качестве лиганда моноспецифические поликлональные антитела барана к Лп(а);

5. В экспериментах 1в vitro и ex vivo подобраны условия для клинического применения иммуносорбента в процедуре Лп(а) афереза;

6. Исследована динамика восстановления уровня Лп(а) после проведения процедуры Лп(а) афереза. обнаружено, что при длительном курсе процедур происходит замедление скорости восстановления Лп(а) после его удаления;

7. Биохимическими методами в рамках ограниченных клинических испытаний показана безопасность и эффективность процедур Лп(а) афереза на примере еженедельного проведения псэиедур трем пациентам в течение 1.5-2 лет.

- Спясох ра'эт опубюзхоаатза по узуо дяссертацаа

1. Адамова И.Э., Афанасьева 0.3!., Беневоленская Г.Ф., Покровский С.Н,// Получение поянклональных антител, специфичных к липопротеиду (а) плазмы крови человека./ Иммунология.- 1990.». 4.- С. 71-73.

2. Афанасьева О.П., Адамова И.П., Беневоленская Г.О., Сусеков А.В., Покровский С.Н.// 1!;<муносорбент едя выделения и удаления из плазма крови человека липопротеида (а)./ Доклады / гпдснии ::ci<.:.~ i9S1.- Т. 318.- ч. 5.- С. 1422-1493.

3. Афанасьева О.И., Адамова И.О., Беневоленская Г.Ф., Покровский С.Н.//Сравнительное изучение методов выделения липопротеида(а) плазма крова человека./ Бюллетень экспериментальной биологии я медицины.- 1992.- Н. 3.- С. 368-270.

Л. Сусеков A.D., Афанасьева О.И.. Адамова И.О., Яякипев А.А., Кухарчук В.В., ПокроасяиЯ С.Н.// Применение иммунодорбента для селективного снидеиия уровня липопротеида (а) у болышх с sronortarMiri бтеросхлгрззом./ Кард иодогпн,- 19S3.-T. 32.-Н11-13,- С.52-56.

■Л . Pc'-irovsiiy О.!-!., Ada-iovci 3.Vu., AfcmrsEiieva O.I., B.-movolsnokayn С.У.// Imnnooorbent Joi t5.>.l<ictiV3 rooovul of lipoprotein (a) iron hur.cji plasnii: Jn SiA££fj utudy./ Artificial Огдипо.- 1991.-Vol. 13 (Я J . — 13C-146.

3. S.H.Pokrovoliy, I. Yu. ftrtiirjova, A.V.Suaekov, 0.2 .iiianaoicvn.// klpcprotaia (n)-ophcrooio fey idjuaoeiorbent. / Abntracto of tha 11th ESAO Congress, 2ologiiii.- 19ЙО.

7. S.H.Pokrovoiy, I.Yu.&fianovn, О. T. Airman Java, A.V.iSuoe&ov, V.V.Su-charchuk.// i.pin) -ajsheyoaio by icuiuncccrbent.

?«>1Ла1пагу clinical rasulte./ »batracta of the 18 ESAO Congress, Vienna, Austria. - 1D91:

0. Pokrovaky S.M., Adanova I.Vu., Afanaeieva O.I., Denevolenakaya <5.1?. , Susekov A.V., SuSdiarchuk V.V.// Affinity aorbento for cuiisction of lipid raothabolic dioordera./ Abotract of the IBtij Wurd Caagreoa of the International Sooiety for Artificial Organ-;, Monreal, Quebec, Canada. -1991.

S. Pokrovafcy 31!., Susckov A.V., Adaisova I.Yu., Afanaaleva 0.1. , Benevalenskaya G.»., Kukharchuk V.V.// Lp(a)-aphereala. Preliminary clinical results./ Abatract of the 18th Word

Congrtssa of tha Intgrnstiatiiil Sosi«ty for Artificial Organs, Monrsel, Quebec, Canada. - 1881.

10. S.N.Pokrovsky, X.Yu.Adoeov«. O.X.Afonasleva, A.V.fluaskov.// Selective renoval of lp|i) by extracorporeal luiunoadsorbtlon./ Abstracts of the 7th Dreoden Lipid Syajtosiun, - 1991.

11. S.H.Pokrovsky, X.Yu.Adcsova, O.I.Afanaeisva, A.V.Suaekov.// Immunosorbent for eolectivw rsaoval of Lp(a) froa husan blood plasaa./ Abstracts fith IntiraitiBms} Syaposiua of Atherosclerosis, Roooeond, Illinois 03A.- 1991,

12. Pokrovsky 8., Varskin Yu., Oochepkovo I., Skvornov A.// Afananleva O., Arabidss a.// Lp(e) in potionto ui.,t corvlccl atherosclerosis./ /"istracts 9th International SyapoaliuB of Atherosclerosis, Roseaond, Illinois 0SA. - 1991.

13. S.H.Pokrovsky, I.Yu.Adaaova, O.I.Afonasleva, A.V.Sueakov, V.V.Kukhafchuk.// Affinity ehroaatography In tho treotcant of lipid vsth«bolisa disorders. Abstracts 4th International Congress World ApberSsls Association, Sapporo, Japan. - 10£>2.

14. S, S«. Pokrovsky, Susakov A.V., I.Yu.Adaaova, 0.?.Afanasisva, V.V.Kukharchuk.// Lp(a)-apheresis. Preliminary clinical results./ Abstract 4th International Congraas World Apharesio Association, Sapporo, Japan. - 1992.

15. A.A.Lyakishev, V.V.Kukharchuk« O.I.Afanaslsva, A.V.Suaekov, V.V.Titov, ' Pokrovsky S.N.// Siochealcal hoeooatcBlo in CAP patients undordoing long-tarn l>p(a)-eph«resis./ Abstracts of the BSth European Atherosclerosis Society Congress, Mice, Fra&ca. - 1992.

18. Pokrovsky S.M., SusekovA.V., Afanaalsva A., Adaaova l.Yu., Kukfterchuk V.V.// Traatnent of patients with coronary athery disease by Lp(a) apheresis./ Abstract of 4th International Syaposlua. Treatnent of Severe Dyslipoproteineaia in the Prevention of Coronary Httat'tb Disease, Munich, Qcrsany, 1992.

17. Pokrovsky Suockov A., AZenasieva 0., tyaklshev A.,

Kukhsrchuk V.// lasunoepherttsis adsorption for lowering Lp(a)./ Abstract of 2nd International Conference on tlpoprotein(a), Hew Orlean, OSA.- 1992.